Новые возможности мицеллярной и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии при определении катехинов и катехоламинов в природных объектах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ГАНЖА ОЛЕСЯ ВЛАДИМИРОВНА

г^Р

НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МИЦЕЛЛЯРНОЙ и МИКРОЭМУЛЬСИОННОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ КАТЕХИНОВ И КАТЕХОЛАМИНОВ В ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТАХ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

003066587

Сан кч-Петер бу р г 2007

У

003066587

Работа выполнена на кафедре органической химии, химического факультета Санкт-Петербурге кого государственного университета и я ЦКП «Аналитическая спектромегрия » Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор химических наук, профессор Карпова Людмила Алексеевна

Доктор технических наук, профессор Воронцов Александр Михайлович

Кандидат химических наук, Сляднев Максим Николаевич

Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова

Зашита состоится 25 октября 2007 г. в 15.00 ч.

на заседании диссертационного совета Д 2J2.232.37 по зашито диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Средний проспект В.О„ д. 41/43.

Большая физическая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан J^g_2007 Г.

Ученый секретарь S

Диссертационного совета /А,Г. Папсуева/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы.

В последние годы методы капиллярного электрофореза (КЭ) широко используются для определения биологически активных соединений в природных объектах Варианты микроэмульсионной и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ и МЭКХ) с обращенной полярностью наименее изучены При этом использование их для гидрофобных соединений должно было бы привести к росту эффективности, сокращению времени анализа и снижению пределов обнаружения аналитов

Интересными и информативными моделями для выяснения возможностей малоизученных вариантов КЭ - мицеллярного режима с обращенной полярностью и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии - являются следующие системы

1 Природные антиоксиданты полифенольного типа ((-)-эпикатехин, (-)-эпикатехин галлат, (-)-эпигаллокатехин, (-)-галлокатехин галлат, (-)-эпигаллокатехин галлат и (+)-катехин) и кофеин, обладающие антиаллергенными и радиопротекторными свойствами и являющиеся основными компонентами зеленого чая

2 Биогенные амины (дофамин, норадреналин, адреналин) и их метаболиты (метанефрин и норметанефрин) - диагностические маркеры различных заболеваний с нарушением работы центральной нервной системы

В молекулах указанных веществ содержатся легко ионизируемые и способные к комплексообразованию с органическими и неорганическими соединениями 1,2-фенольные гидроксилы (катехольный фрагмент)

Логически обоснованная стратегия выбора условий электрофоретического разделения (рН рабочего буфера, природа и концентрация комплексообразующих агентов, режим on-line концентрирования и т д) с учетом специфики аналитов могла бы позволить предложить высокоселективный и чувствительный способ их определения и выявить новые возможности обсуждаемых вариантов капиллярного электрофореза

Работа поддержана Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере («СТАРТ 2005», проект № 5911)

Цель работы. Вьмвить новые возможности и получить оценочные характеристики различных вариантов метода капиллярного электрофореза с УФ-детекгированием (зонного капиллярного электрофореза (КЗЭ), мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной

полярностью (ОП МЭКХ), микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (мээкх)) для определения катехинов и катехоламинов в природных объектах В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи

1 Установить закономерности одновременного электрофоретического разделения полифенолов и кофеина в режимах капиллярного электрофореза (КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ) с УФ-детектированием

2 Выяснить доминирующие факторы (состав и рН рабочего электролита, органические модификаторы, макроциклические агенты), определяющие селективное разделение катехинов чая и кофеина методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ)

3 Выявить критерии, определяющие стабильность микроэмульсионной системы, и установить закономерности разделения полифенольных антиоксидантов в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ)

4 Изучить возможности обсуждаемых электрофоретических вариантов для определения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях

5 Предложить электрофоретический способ селективного определения полифенольных соединений и кофеина в реальных объектах растительного происхождения (различные образцы зеленого и черного чая)

Научная новизна

Выявлены доминирующие факторы (состав и рН буферного электролига, концентрация додецилсульфата натрия), влияющие на электрофоретическое разделение органических соединений, содержащих в своей структуре фрагмент вицинапьных дигидрокси-групп (катехины и катехоламины) методами МЭКХ с нормальной и обращенной полярностью Показано, что последний вариант предпочтителен

Впервые, обнаружен эффект влияния комплексообразующих добавок (р-циклодекстрина, сульфо-Р-циклодекстрина, лимонной кислоты) в составе рабочего электролита на увеличение селективности разделения полифенолов в МЭКХ с обращенной полярностью и сокращение времени анализа

Определены возможности микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (рН рабочего буфера 2,0) для электрофоретического разделения смеси, содержащей природные антиоксиданты (эпикатехин, эпигаллокатехин, эпикатехин галлат, галлокатехин галлат и эпигаллокатехин галлат, ПО ~ 0,5 мг/л, N=1000 103 -2000 !03 тт/м

Впервые предложен способ определения кагехоламинов и их метаболитов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ), и показано, что эффективность и селективность разделения в данном режиме выше в 1,5 раза, чем в традиционно используемом для этой цели методе капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ)

Выявлено влияние комплексообразукяцих добавок (18-краун-6, 4ДЗ-диаза-18-краун-6), смешанных мицелл (додецилсульфат натрия/октансульфонат натрия) и первичных аминов в составе рабочего электролит на элекгрофорегические характеристики кагехоламинов в режиме МЭКХ с обращенной полярностью

Установлено, что при рН рабочего электролита < 7 азотсодержащий макроцикл, взаимодействуя с мицеллой, увеличивает селективность разделения и общее время анализа, 18-краун-б изменяет элекгрофорегические характеристики аналитов, образуя с ними комплексы разной устойчивости

Предложен новый вариант оп-1те-концентрирования для биогенных аминов и их метаболитов в режиме ОП МЭКХ свипинг с добавкой 18-краун-6 (4 мМ) и циклогексиламина (5 мМ) в матрицу пробы Факторы концентрирования составил 900 -1500

Практическая значимость-работы

Предложены варианты определения полифенольных антиоксидантов и кофеина в различных образцах зеленого й черного чая методами традиционной мицеллярной электрокинетической хроматографии и МЭКХ с обращенной полярностью с УФ-детектированием Пределы детектирования полифенолов составили ~ 0,3 - 1 мг/л

Показана возможность электрофоретического определения биогенных аминов (дофамин, адреналин, норадреналин, метанефрин, норметанефрин) методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (буферный электролит содержит ацетат натрия и муравьиную кислоту, рН 2,0) в биологических жидкостях (моча) после твердофазной экстракции на модифицированном додецилсульфагом натрия сорбенте Си

Предложен вариант электрофоретического определения стероидных гормонов (прогестерон, 17-гидроксипрогестерон, 11-дегидрокортикостерон, 11-дезокси-кортикостерон, кортизон, кортизол, тестостерон, кортикостерон, кортизон ацетат, дексаметазон) методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (рН 2,0) Пределы обнаружения составили 0,8 - 1 мг/л без стадии концентрирования и 0,04 - 0,06 мг/л с использованием ол-/ше-концентрирования (свипинг, 30 мбар, 100 с)

Разработаны варианты оп-/ше-концентрирования (свипинг с добавкой 4 мМ 18-краун-6 и 5 мМ циклогексиламина в матрицу пробы) биогенных аминов в режиме

мицеллярной электрокинетической хроматографии (ОП МЭКХ), позволяющие концентрировать пробу в 900-1500 раз Предел обнаружения составил 20 - 30 нг/мл

Положения, выносимые иа защиту

1 Результаты исследования влияния состава, концентрации и рН буферного электролита, концентрации мицеллообразукяцего реагента (додецилсульфат натрия), органических модификаторов (ацетонитрил, метанол, изопропиловый спирт, мочевина) в составе рабочего электролига на одновременное электрофоретическое определение полифенолов и кофеина методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ) с УФ-детектированием

2 Влияние и количественная оценка комплексообразующих добавок ((5-циклодекстрина, сульфо-3-циклодекстрина, 18-краун-6 и 4,13-диаза-18-краун-6) в мицеллярных системах на эффективность и селективность электрофоретического разделения катехииов и катехоламинов методом МЭКХ с обращенной полярностью

3 Влияние температуры, типа и концентрации поверхностно-активного вещества, природы «масла» на стабильность микроэмульсии и на электрофоретические подвижности флаван-3-олов и стероидных гормонов в режиме микроэмульсионной элекгрокинетической хроматографии (МЭЭКХ)

4 Сравнение возможностей и обоснование преимуществ использования различных вариантов мицеллярного и микроэмульсионного электрофоретаческого определения кагехинов и капгехоламинов в природных объектах

5 Практические приложения выявленных закономерностей

- одновременное определение основных полифенольных антиоксидантов и кофеина в зеленом и черном чае методами мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) с разными вариантами полярностей и микроэмульсионной элекгрокинетической хроматографии (МЭЭКХ),

- определение катехоламинов и их метаболитов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ) в моче с ои-/оте-концентрированием (свипинг) и пределом детектирования катехоламинов и их метаболитов 20 - 30 нг/мл

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 1 статье и 15 тезисах докладов Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромата графические приборы» (2004, Клязьма), Ш Научной сессии УНЦХ СПбГУ (2004, Санкт-Петербург), V Международной конференции по реабилитологии (2004, Москва), The 8-th

Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry "Stress and Behavior" (2004, St-Petersburg, Russia), The XXIXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" (2005, Katowice — Szczyrk, Poland), International conference "Analytical chemistry and chemical analysis" (2005, Kiev, Ukraine), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» (2005, Краснодар, Россия), 29th International Symposium on capillary chromatography and 3rd GCxGC Symposium (Fiere Congressi Spa, Riva del Garda, Italy, May 29 - June 2, 2006), Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, 23-27 апреля, Клязьма), EUROANALYSIS-XIV conference (2007, Antwerp, Belgium), 30th International Symposium on Capillary Chromatography (2007, Dalian, China), XVIII Менделеевский съезд о общей и прикладной химии (2007,23 - 28 сентября, Москва)

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав с обсуждением полученных результатов, экспериментальной части, практического применения, приложения, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (173 наименования) Работа изложена на 207 страницах машинописного текста, содержит 2 схемы, 29 таблиц и 69 рисунков

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования Отмечена перспективность использования мицеллярной и микроэмульсионной элекгрокинетической хроматографии при совместном определении природных антиоксидантов полифенольного типа и кофеина в природных и биологических объектах

1-я глава (Обзор литературных данных) состоит из разделов, в которых обсуждаются разные варианты капиллярного электрофореза, селективность, эффективность и механизмы разделения в режиме МЭКХ с нормальной (положительной) и обращенной (отрицательной, в отсутствии ЭОП) полярностями, особенности электрофоретического анализа органических соединений методом микроэмульсионной элекгрокинетической хроматографии (МЭЭКХ), физико-химические методы исследования полифенолов и кофеина, подготовка объектов природного происхождения к электрофоретическому анализу

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов и методов исследования (капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматография с нормальной и обращенной полярностью, микроэмульсионная

электрокинетическая хроматография и обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детешрованием)

В 3-й главе предметом обсуждения является изучение закономерностей электрофоретического поведения флаван-3-олов и получение оценочных характеристик методами МЭКХ с нормальной и обращенной полярностью и микроэмульсионной электрокинетической хроматографией (МЭЭКХ) с УФ-детектированием

В качестве модельной системы взяты катехины (катехин, эпикатехин, эпигаллокатехин, эпикатехин галлат, галлокатехин гаплат, эпигаллокатехин галлат) и кофеин - основные биологически активные компоненты зеленого чая (Рис 1)

(-)-эпикатехин Ко*е"" «->-эк> '

(Коф)

но

Рис. 1 Структурные формулы полифенольных соединений и кофеина - основных компонентов зеленого чая

(-)'ЭГ.

Для оптимизации условий электрофоретического детектирования предварительно были получены спектры поглощения катехинов и кофеина (рис 2)

От зонного варианта (боратный буфер, рН 9,0) пришлось отказаться из-за недостаточной селективности разделения Добавка в состав рабочего буфера Р-циклодекстрина позволила разделить смесь полифенолов на гаплатированные и негаллатированные компоненты (Рис 3), что может оказаться полезным при групповом анализе, но определение всех важнейших антиоксидантов зеленого чая не достигается К тому же в этих условиях невозможно определение нейтрального компонента - кофеина

"Хх^

'-)-эп игалло катехин он

(О ЭГЮ (-)-эпикатехин галлат

<(-)-эт

-да

* 'Чс ' ^ос

ОМ он

шгаллокатехин галлат (-)-галлокатехин галлат

в-эпсг а-гкг

Рис. 2. УФ-Спектры кофеина, эпикатехина, эпигаллокатехин галлата Условия слектрофометр вЫтабги иУ-1700,

длина отитаого щи = 1 см шдащщии

водных растворов Коф ЭК, ЭГКГ - 2 10 5 М

С этой целью изучены возможности мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ) (Рис 4) В качестве мицеллообразующего агента взят додецилсульфат натрия (25 -120 мМ) Использование режима МЭКХ с

обращенной полярностью (рН < 2,5, Рис.3. Электрофореграмма модельной

смеси катехинов в КЗЭ электроосмотический поток отсутствует,

КАПЕЛЬ 105Р, Ь„бЩ=60 см, 1,^=50 см, И0Низация полифенолов подавлена) долж-

а[шу1р=М) мкм,А. = 200 нм Рабочий электролит

12,5 мМ тетрабората натрия, рН 9,0, 8 мМ р- но было бы привести в случае исследу-циклодекстрина

Проба 1 - катехин (К), 2 - эк, з - эгк 4 -ЭКГ, емой нами системы к изменению порядка 5 -ГКГ, 6 -ЭГКГ ,

элюирования (наиболее гидрофобные

аналиш элюируются первыми с большей эффективностью) и сокращению времени

анализа К тому же приходилось учитывать и то обстоятельство, что при рН > 7,0

возможно частичное окисление полифенолов Поэтому было решено апробировать

кислые буферные системы, в которых определяемые полифенолы стабильны и более

гидрофобны После серии предварительных экспериментов полное разделение

модельной смеси катехинов и кофеина методами МЭКХ и ОП МЭКХ (рис 5)

осуществлено с использованием следующих буферных электролитов

Рис. 4. Схема разделения аналитов в режимах А) мицеллярнан электрокинетическая хроматография (МЭКХ) и Б) мнцеллярная электрокинетическая хроматография с обращенной полярностью (ОП МЭКХ)

Рис 5 Электрофореграмма модельной смеси полифенолов и кофеина (катехин (1), ЭГК (2), ЭГКГ (3), ЭК (4), ГКГ (5), ЭКГ (6), Коф (7)) в режиме а) МЭКХ и б) ОП МЭКХ;

КАПЕЛЬ 105Р, 1.Лш=60 см, Ьэфф=50 см, а,н>гр=50 мкм, >. = 200 нм, а) 25 кВ, б) -25 кВ

Рабочий электролит а) 25 мМ фосфатного буфера, рН 7,0, 15 мМ ДДСН и б) 10 мМ ацетатно-цтратный буфер и 120 мМ ДДСН, рН 2 0

> рН 7.0: МЭКХ с нормальной полярностью: 25 мМ фосфатный буфер (рН 7,0). 20 мМ

ДЦСИ, 10 мМ мочевины: У рН 2,0 МЭКХ с обращенной полярностью (ОП МЭКХ): 10 мМ буферного электролита, содержащего ацетат натрия и лимонную кислоту (рИ 2,0) и 120 мМ

додецалсупъфата натрия Изучены закономерности влияния концентрации мииеллообразующего агента на Миграционную скорость анаггитоИ- эффективность и селективность их разделения в режиме МЭКХ (рис.б). Порядок миграции определяемых соединений в режиме 011 М'ЖХ соответствует уменьшению степени их гндрофобности.

Установлено, 'по время анализа тголнфенеяюв в эффективность в МЭКХ с отрицательной полярностью меньше, чем в традиционном режиме.

б) -

.«

a эс 2.10 1*>

1.10 а.» о.ш

aJMGOj ?7сю0э гднюо

1ТШИЮ SJ0MD гоми

Put. 6. Влияние концентрации ДДСН ш селективность разльпеинн ноли фенолов и ^офенмз iu' i ;:i](im МЭКХ с ial полижи rtvi i.hoh :р!I 7,0) и (й) отрицательной полярностью

(рН 2,0)

На j.n е к'трофо ргтич ески е характеристики акадкта (подвижность (|i), разрешение (Rs), эффективность (N) и селективность (а) разделения) помимо рН буферного электролита и концентрации мицеллообраоуюшей добавки (рис, 7) влияет состав рабочего буфера, природа органических растворителей (ацето нитрил, .метанол, изопропиловый спирт. 5 % добавок (3-вдклодексгрнн, еульфо-linn*.'юдекстрин, лимонная кислота), что летально изучено на примере разделения пар чпикатсхнн г1 ал лат/галл окатехин галлат н эпикатехин/эпипплокатехин, отличающихся между собой пространственным строением, количеством в молекуле гидрокси-групп и наличием галлат фрагмента.

Органические растворители, модифицируя мицеллу, изменяют характер распределения аналитов .между мыпелиярмой и водной фазами. При использовании иэопропи.тоаого спирта {5 %) наблюдается повышение селективности разделения практически для всех компонентов (рис.8)

эгк эти-

РиС. 7. Зависимость эффективнее iff разделе ния | N) полифенольных соединений 11 кофеина в ОП МЭКХ от концентрации ДДСЯ в рабочем электролите

(объем и))

ко мплексоо бразу нощих

Введение лимонной кислоты, способной к комппекоообрезоадкию с подифенопа-ми, оказало существенное влияние на коэффициент разрешения пары эпикэтехин галлаг /галлоюггехин галла! лишь при небольшой концентрации додецилсул ьфэта натрия (60 мМ) (табл. 1), При высоки* концентрациях мицелл ообрязующего агента доминирующим остается взакмодейст вне апатитов с мицеллами.

Увеличение концентрации ЦД-моднфицирОвШщьйс мицелл я рабочем электролите сопровождается ростом эффективности (рис.9), при этом селективность разделения для заряженною сульфо-р-циклодскстрина - выше. Это, по-видимому, связано с тем, что гидрофобность гаялокатехин галл эта при образовании ни комплекса

Рнс.Я. Зависимое I ь ССН'К I ивност и разделения кате* и до в н кофеина от НаЛИ^НЯ 0р[ЛННЧеСКОГО раСГВОрН ТСЛН % (о&ъемн)) в бу^рматф

I ..к I |ч> шта

и. (« мм/л даст Н, 020 нМ/л ДДСН)

РАТДЫЙЕМЬЛС к« с С

йнй.1ктк1 лимонкой лимонной лимошюй лимонной

кислоты кнешпой кислоты кислотой

ЭКГ/Г КГ 2,18^0.03 л.п±о,ол 2.16x0.03 2,5*110,02

эк/эгкг 3,07±0,03 з.з ид. о.оз 2,3510,02 2,46±0,01

Гашиша 1. Илнннне лимонной кислот ьд в составе |и6о'К1 о тлектролнта на котффнмиенгы разрешении аналиюв

С |3-ЦД снижается, и сто сродство к гидрофобной мицелле ослабляется.

Таким обратим, установлено, что в условиях М'ЖХ с отрицательной полярностью (рЛ буферного электролита 2,0), когда диссоциация аналитов кислотного характера подавлена и гидрофоб нос ть их возрастает, обеспечивается существенно большая эффективность и меньшие значения пределов обнаружения.

Рис. 9. Зависимость тффекгнвности разделения )К'1 , Ж <1 >ГК при нснольюванин ;*-ИД-чи днфицнрованных мицелл в (Ш М'ЖХ

Усл. см. рис. 5 (1))

Дополнительные ре) ер вы в этом направлении могли бы обнаружиться при использовании метода микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ), который а основном используется ДЛЯ определения гидрофобных органических соединений.

Нами изучены возможности использования данного режима КЭ при разделении катехинов (ЭКГ, ГКГ, ЗГКГ, ЭК и ЭГК) в микроэмульсионном буферном электролите.

2.502 -3 00 3.50 -4 ею 450 ■5 00 5.50 ■6 00 •6.50

рН 2,0 (обращение полярности) Для образования устойчивой микроэмульсии

необходимо определенное соотношение гидрофобного растворителя, поверхноегно-

активного вещества и спирта, стабилизирующего микроэмульсию

Известно, что концентрация ПАВ (додецилсульфата натрия) влияет на элек-трофоретические характеристики ана-литов При концентрации ДДСН < 2 % (масс/объемн) микроэмульсии вообще не

Рис 10 Зависимость электрофоретической ^разуются, а при ее увеличении электроподвижности полифенолов от концентрации форетические подвижности уменьшаются додецилсульфата натрия (%), образующего

микроэмульсию в режиме мээкх (общее время анализа сокращается) (рис

10)

Окончательный состав микроэмульсии 3,0 % ДДСН, 1,36 % гептан, 9,72 % бутанол-1 и 86 % буферный электролит, содержащий ацетат натрия и лимонную кислоту (рН 2,0)

Поскольку изменение температуры влияет на растворимость аналитов в микроэмульсии, в специальных экспериментах выявлена зависимость электрофоретического разделения в МЭЭКХ от температуры (рис 11) При проведении анализа с повышением температуры (от 20 до 30 °С) элестрофоретические подвижности аналитов и общее время анализа уменьшаются, но при этом растет сила тока (рис 11, б)) Оптимальной по данным эксперимента оказалось значение температуры 25 °С

& , 1 "

Рис И Влияние температуры на а) электрофоретические подвижности полифеиольных соединений и б) силу тока в микроэмульсии состава: 1,36 % (масс/объемн) гептан, 3,5 % (масс/объемн) доаецилсульфат натрия, 9,72 % (масс/объемн) бутанол-1, 86,5 % (объемн/объемн) 10 мМ буферного раствора, содержащего ацетат аммония и муравьиную кислоту, рН 2,0

Отметим, что проведение микроэмульсионного анализа при использовании «длинных» кварцевых капилляров СЦфф=50) нецелесообразно Тяжелые капли эмульсии двигаются медленнее по сравнению с мицеллами, что заметно увеличивает время анализа (рис 12) Однако »ш эффШТШОШ рШС.ШШ, МЖРОЭМРШЮШШ система превосходит ОП МЭКХ

В результате проведенных исследований установлено, что по эффективности и селективности разделения многокомпонентной смеси кофеина и полифеноль-ных соединений, присутствующих в экстракте зеленого чая, традиционный и наиболее изученный режим МЭКХ заметно уступает МЭКХ и МЭЭКХ с обращенной полярностью рН < 2,5) (табл 2)

Высокая эффективность метода МЭЭКХ и применение в основном для гидрофобных соединений позволяет рекомендовать этот режим для таких диагностических маркеров эндокринных патологий, как стероидные гормоны, существенно превосходящие полифенолы по гидрофобности (рис 13, табл 3)

Таблица 2. Сравнение эффективности разделения катехинов и кофеина в режимах МЭКХ и ОП МЭКХ (п=3, Р=0.95)

Аналит МЭКХ ОПМЭКХ МЭЭКХ

М^тт/м ПО NI©3, т т./м ПО М^.тт^м ПО

Коф 287±3 — 1мг/л 311±4 ~ 1мг/л - ~ 0,5 мг/л

ЭК 269±3 349±5 1063±80

ЭКГ 52±1 13 мин 251±4 Цш И мин 910±10 (общ 40 мин

ЭГКГ 165+4 288±6 1085±12

ГКГ 36±1 221±3 2573±20

Показано, что микроэмульсия (МЭ), образованная более гидрофобным растворителем (гептан), способствует большей селективностью разделения и эффективности, чем с гептанолом-1 (табл 4)

Кортюоп (Г) Прогестерон (Рг) Па-гидрпксипрогестерпп (17-ОН-Рг)

Рис. 13. Струю-урные формулы стероидных гормонов

Рис 12. Электрофореграмма модельной смеси полифенолов в режиме МЭЭКХ

Условия см рис 5 Т=25 °С

Микроэмульсия 1,36 % (в/об) гептан, 3,5 % (в/об) додецилсульфат натрия, 9,72 % (в/об) бутанол-1 85,5 % (об/об) 10 мМ буферного раствора, содержащего ацетат аммония и муравьиную кислоту, рН 2,0 1 - ЭКГ, 2 - ГКГ, 3 - ЭГКГ, 4 - ЭК, 5 ЭГК

Таблица 3 Значения критериев гидро-фобности полифенолов и стероидных гормонов

Полифенолы Н* Стероидные гормоны Н*

ЭГК 4 42 Е 12 06

ЭК 5 20 А 13,00

ЭГКГ 9,35 DOC 14,07

ГКГ 9,35 17-ОН-Рг 14,07

ЭКГ 10,00 Рг 15 34

* Критерий гидрофобносги рассчитывался по формуле где пН — число атомов углерода и галогенов в молекуле, пГ число функциональных групп

Проведена серия специальных экспериментов в условиях МЭЭКХ с рН=2,0 и рН =9,2

Установлено, что эффективность аналитов в режиме МЭЭКХ с нормальной (положительной) полярностью и в присутствии электроосмотического потока заметно снижается, а общее время анализа увеличивается (рис 14)

Пределы обнаружения стероидных гормонов составили -0,8-1 мг/л, что

недостаточно, для анализа биологических жидкостей (моча и сыворотка крови),

концентрация гормонов в которых не превышает 20 - 25 мкг/л

Используя вариант свшгинга Таблица 4. Эффективность микроэмульсионной системы с различной природой

растворе пробы) с большим объемом вводимой пробы, удается сконцентрировать пробу в 600 - 1000 (ввод 30 мбар, 100 с, ПО 40 - 80 мкг/л) и 1500 - 2800 раз (ввод 30 мбар, 200 с, ПО 20 - 30 мкг/л)

Аналит N10J, т.т./м

МЭ с гептаном МЭ с гептанолом-1

Рг 2896±83 183&±49

А 3581*110 1918±63

Б 1964±70 1900±59

F 3958±И7 2206±55

21 Н И 25

Лии»

12 М М Я

Рнс.14. Электрофореграммы модельной смеси стероидных гормонов в МЭЭКХ с использованием буферных электролитов с а) рН 2,0 и б) рН 9,2

Условия КАПЕЛЬ 103Р, L^ = 65 см, 1^фф =55 см, 4^^=50 мкм, Я. = 254 нм, напряжение а) - 20 кВ, б) +20 кВ Микроэмульсия 1,36 % гептана, 3,0 % ДДСН, 9,72 % бутанола-1, 8 % ацетошприла, 78 % а) 10 мМ рабочего буфе-pa, содержащего аиста? натрия и лимонную кислоту рН 2,0, б) 5 мМ раствора тетрабората натрия рН 9 2, Проба смесь стероидов разбавлена рабочими электролитами и содержит 8 % ацетошприла, Е - кортизон, F - хоргазол, А - 11-дегвдрокортикостерон, DOC - 11-дезокси-кортикостерон, 17-ОН-Рг- 17-гвдроксипрогестерон, Рг- прогестерон

Установленные закономерности электрофоретического разделения биологически активных соединений, в молекулах которых присутствует фрагмент о-дигидрокси-фенольных групп, позволили перейти к другим объектам, содержащим подобный фрагмент кагехола, а именно сформулировать и, в конечном итоге, решить весьма важную задачу - выяснение возможностей количественного определения в этих условиях катехоламинов и их метаболитов (норадреналин (НА), адреналин (А), дофамин

(ДА), метанефрии (МН), норметанефрин (НМ)) в биологических жидкостях (рис 15), что является предметом обсуждения 4-ой главы

При рН 2,0 аминогруппа в молекулах биогенных аминов протонируется, и аналиты разделяются в катионной форме Изучено влияние ион-парных добавок, комплексообразующих агентов и аминов в составе рабочего электролита на электро-форетические характеристики биогенных аминов

Концентрация додецилсульфата натрия заметно увеличивает скорость миграции норадреналина и адреналина (рис 16), что сопровождается ростом эффективности (табл 5) Полученные в сериях предварительных экспериментов результаты показали, что в этих условиях селективность разделения пары

Норадреналин (НА)

он

Метанефрин (МН)

но____________

НО'

Адреналин (А)

он

Норметанефрин (НМ)

Рис. 15, Структурные

формулы катехолами- дофамин/метанефрин недостаточна

Дофамин нов и их метаболитов _

(ДА) При этом важно отметить, что для

таких заболеваний как шизофрения, болезни Паркинсона и Альцгеймера, где необходимо контролировать, в первую очередь, содержание дофамина, надо гарантировать его полное отделение от других компонентов

Было высказано предположение, что введение в состав буфера различных агентов, способных образовывать ионные пары или комплексы с протонированной аминогруппой молекул катехоламинов, помогут поставленную задачу решить

Для повышения селективности

«ддомим ЯМетмафрм

Норнетаиефрт .^Адреналин ЖНоравреналт

Рис. 16. Зависимость времени миграции биогенных аминов от концентрации разделения пары дофамин/метанефрин в додецилсульфата натрия в буферном

электролите в режиме ОП МЭКХ

раствор рабочего электролита одновременно

с мицеллами вводились ион-парная добавка (октансульфонат натрия, 0-20 мМ, комплексообразующие агенты - 18-краун-6 и его азотсодержащй аналог - 4,13-диаза-18-краун-6

Введение в мицеллярную систему анионного ПАВ повышает эффективность и коэффициенты разделения (1*5) всех пар аналитов (рис 17)

N К^тт./м

Концентрация ДДСН, мМ ДА МН НМ А НА

40 17315 21614 17413 16615 16014

120 2!7±5 26416 25918 26415 29519

Таблица 5. Влияние концентрации ДДСН в рабочем электролите на эффективность при разделении биогенных аминов

Ион-парный реагент влияет на элекгрофоретические подвижности всех аналитов, молекулы которых содержат первичную и вторичную аминогруппы, но при этом полного разделения пары ДА/МН не достигается

Рис. 17. Влияние различных добавок на коэффициенты разрешения компонентов смеси в 10 мМ ацетатно-цитратном буферном электролите и 100 мМ ДДСН: а) октансульфонат натрия (ОСН), б) 18-краун-6

Введение же 18-К-6 (6 мМ), изменяющего, в первую очередь, элекгрофоретические подвижности первичных аминов, позволило эту проблему решить, однако при этом снизилась селективность разделения других пар соединений метанефрин/норметанефрин и адреналин/норадреналин (рис 176) Электрофоретическая подвижность дофамина (в отличие от другого первичного амина - норадреналина) изменилась в существенно меньшей степени (рис 18)

Присутствие в рабочем электролите другого 18-ти членного макроцикла-4,13-диаза-18-К-6 (6 мМ) - позволило добиться полного разделения, но общее время анализа возросло (18-К-6 - 11мин, диаза-18-К-6-15 мин) Поэтому в окончательном варианте была использована добавка в рабочий буфер 18-краун-6 (2 мМ) с циклогексиамином (8 мМ) (рис 19)

Такое различное поведение 18-тичленных кислород- и азотсодержащих макроциклов оставалось не совсем понятным Было высказано предположение, что механизм их влияния различен В кислой среде краун-соединения ведут себя по-разному в случае диаза-18-К-6 имеет место протонирование атомов азота макроцикла, и он, скорее всего, взаимодействует не с разделяемыми аналитами, а образует ион-парные гидрофобные ассоциаты с мономерами додецилсульфата натрия и с отрицательно заряженными мицеллами

Для подтверждения или опровержения высказанных соображений нами были рассчитаны константы устойчивости комплексов! 8-краун-6 и 4,13-диаза-18-краун-6 с мо-

■0,25 1

Рис. 18. Зависимость электрофоре-тическон подвижности аналитов от концентрации 18-К-б в 10 мМ ацетатно-цитратном буферном электролите, рН 2,0, 80 мМ ДДСН

Рис. 19. Электрофореграмма модельной смеси катехоламинов в оптими-

лекулами биогенных аминов (табл 6)

Из полученных данных следует, что с

первичным амином (норадреналином)

макроцикл образует более устойчивый

комплекс, чем со вторичным (адреналином),

что согласуется и с временами миграции

данных аналитов Однако в подобную

логику не «вписывается» поведение зированных условиях

Уел См рис 5 Рабочий электролит 10 мМ дофамина, являющегося также соединением раствор, содержащий ацетата аммония и

муравьиной кислоты, 80 мМ ДДСН, 2 мМ 18-с первичной аминогруппой Это связано с к-6 и 8 мМ цшигогексишшин, рн 2 о

отсутствием в его молекуле спиртового гидроксила в а-положении, что уменьшает его

основность и увеличивает гидрофобность Данные рассуждения находятся в соответст-

Таблица 6. Константы устойчивости вии с рассчитанными значениями комплексов биогеиных амИнов с 18-краун-

критерия гидрофобносга Н (ДА - 1,07, 6 и 4,13-диаза-18-К-б в буфере,

содержащем 10 мМ ацетат аммония, НМ и А - 1,0 НА - 0) и порядком муравьиная кислота, 80 мМ ДДСН (рН

миграции биогенных аминов в режиме

МЭКХ с обращенной полярностью Таким

образом, дофамин имеет по сравнению с

другими аналигами большее сродство к

гидрофобным мицеллам, а не макроциклу

Кед, М-

ДА А

18-К-6 11,80 58,62

4,13-диаза-18-К-6 -73,88 -35,85

НА НМ

18-К-6 116,83 30 12

4,13-диаза-18-К-б -40,16 -53,36

Предел детектирования в оптимизированных условиях составил 0,8 мг/л для дофамина и метанефрина и 0,5 мг/л для норадреналина, адреналина и норметанефрина, что ниже по сравнению с традиционно используемым зонным вариантом с УФ-детектированием (~ 1 мг/л, соответственно)

В 5-ой главе представлены возможности практического применения разработанных вариантов электрофоретического разделения и определения полифенольных антиоксидантов, кофеина и биогенных аминов

Обнаруженные на модельных смесях закономерности позволили предложить схему определения кофеина, ЭГКГ, ЭК и ЭГК в водном экстракте зеленого чая и получения электрофоретических характеристических профилей реального объекта в разных условиях (Рис 20)

Проведение специальной пробоподготовки для полифенолов и кофеина не требовалось, поскольку данные аналиты легко извлекаются из чайного листа (например, декофеинизация проводится именно таким способом) (рис 21), а высокое содержание их в объекте (до 30 % (масс)) не требуют дополнительного концентрирования пробы (табл 7)

»fji

Zj*

6 7 8 9 18 1

12 13 14 15 16 17 »

Рис 20 Электрофореграмма водного экстракта зеленого чая в режиме а) МЭКХ и б) ОПМЭКХ Рабочий электролит а) 25 мМ фосфатный буфер, рН 7,0, 25 мМ ДДСН, 3% ацетонитрила, б) 10 мМ буферная система, содержащая ацетат натрия и лимонную кислоту рН 2,0, 120 мМ ДДСН Экстракция проводилась горячей водой (~85-90°С), навеска чая 200 мг, экстракция 20 мин Перед электрофоретическим анализом экстракт разбавляли а) в 2 раза, б) в 5 раз

Таблица 7 Количественный анализ различных сортов чая, % масс. (Р = О 95, п = 3)

Анапит Коф ЭГКГ ЭКГ

Черный чай «Ришехат» (Дарджилинг, Индия) 1,21 ±0,07 1,74 ±0,15 0,10 ±0,04

Зеленый чай «Кольца Джейц» (Китай) 2,81 ±0 U 3,33 ± 0,27 2,89 ±0 30

Белый чай «Серебряные иглы» (Китай) 2,43 ±0,11 4,30 ±0 30 3,28 ±0,30

| .

С 43 2

В 30

ё 20

I «

S „

5™f»

жстрахци экстракт эксграхци

Рис. 21 Зависимость площади пика ЭГКГ от числа последовательных экстракций

Напротив, для злектрофоретического определения биогенных аминов и их метаболитов необходимо предварительное выделение их из реального объекта Пробоподготовка биологического объекта (моча) твердофазной экстракцией на модифицированном додецилсульфатом натрия сорбенте См (ТФЭ) осуществлялась по разработанной ранее нами методике в лаборатории (ООО «ЦЮТ «Аналитическая

Рис. 22. Электрофореграмма мочи больного гипертензией в режиме МЭКХ с обращенной полярностью

Рабочий электролит 10 мМ буферная система, содержащая ацетат аммония и муравьиную кислоту, рН 2,0, 80 мМ ДДСН, 8 мМ циклогексиламиыа Экстракт содержит 25 % метанола, 10 мМ раствор, содержащий ацетат аммония и 150 мМ муравьиной кислоты, рН 2,0,4 мМ 18-краун-6

С целью снижения пределов детектирования биогенных аминов в режиме ОП МЭКХ были изучены возможности on-line концентрирования (сеипинг) (табл 8) В МЭКХ концентрирование аналита осуществляется псевдостационарной фазой, которая проникает в зону образца, не содержащую мицелл Предложен вариант свигшнга биогенных аминов в виде комплексов их с 18-краун-6 (рис 23)

спектрометрия») (рис 22)

Зоне Пробы

Рабочий электролит

С -

* •—

fflssi

Сч»ивнтр«рсв8ниг w îwe го<5вы

[ЩЭЙ

¡Iammtiv

А: ввод пробы, содержащей 38-К-б н растворенной в рабочем буфере с такой же проводимостью, что н у рабочего электролита, заполнившего кяярцсвыи капилляр; выходной коней капилляра опушен ■ раствор рабочего иогпнпн га {мищдллрная буферная система. рН 2.0). В: при подаче напряжении на концы квариеаого капилляра, заполненного мнцелцтярным буфером, мн1(еляы проникают в зону ггробы и концентрируют вч&лнты; Сз окончательное концентрирование пробы проискодит. когда янцеллы полностью заполняют зону пробы

Рис. 23. Схема свипинга в режиме МЭКХ с обращенной пал арностью

Оценку степени концентрирования проводили по значениям факторов

эффективности концентрирования (SEFh) (табл. 8):

h, где h, - высота Пика, полученного при концентрировании, hic -

= Л~* высота пика, полученного при обычных условиях ввода пробы (2 с), к Л - доля разбавления.

Предел обнаружения составил - 20 - 30 иг/мл.

Таблица 8. Факторы концентрирования свипинга в режиме ОП МЭКХ при определении биогенных ямннов_

Вил Фактор кон цент пнроклння SEFh

пробы, мбар'с Дофячнн Адреналин Норкдреналин Метанефрнн I top чета н еф рн и

Mbtdhi» пооби: 10 мМ йуфеоный злектаолнт. содеожаший AcNRi и nvMiumwo кислоту. рН 2,0, 4 мМ lft-K-б Рабочий буфер: 10 мМ раствор, содержащий АсМН, и муравьиную кислоту. рН 2,0. 80 мМ ДДСН

3000 1239*43 1053*36 1202±42 763±2б 1745±61

Матпнш иоойц: 10 мМ раствоо. солержаткй AcNHj н муравьиную кислоту. ПН 7 0. 4 мМ L8-K-6, 5 мМ цнкяогекскламин. Рабочий буфеп 10 мМ раствор, содержащий AcNtti и муравьиную кислоту, рН 2,0, ВО мМ ДДСН. & мМ циклогекенламин

3000 ПТГШ 1044и5 12м±46 940*32 UttMl

ВЫВОДЫ

!. Выявлены доминирующие факторы (рН и состав буферного электролита, концентрация анионного детергента, природа органического модификатора), влияющие на электрофоре™ ческ не характеристики полифенолов и кофеина в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной и обращенной полярностью. Показано, что последний вариант по эффективности, селективности разделения и общему времени анализа предпочтителен.

2. Обнаружено влияние комплексообрязующнх агентов (гидроксикислот, заряженных и нейтральных цнклодекстринов, краун-соединений - 18-К-б и 4,13-Диаза-18-К-6) в составе мицемярной фазы на селеугттаиость разделения кятехояамииог и полифенолов методом ОП МЭКХ и проведена количественная оценка этого влияния Для системы «макроцикл - аналит».

3 Установлены факторы, определяющие устойчивость микроэмульсии и изменяющие электрофоретические характеристики полифенольных антиоксидантов и стероидных гормонов температура, тип и концентрация поверхностно-активного вещества, природа «масла»

4 Проведена сравнительная оценка возможностей и обоснованы преимущества различных вариантов мицеллярного и микроэмульсионного электрофоретического определения природных антиоксидантов полифенольного типа и кофеина в составе различных образцов чая

5 Разработан новый вариант on-ltne концентрирования (свипинг) катехоламинов и их метаболитов с добавлением в матрицу пробы 18-К-6 (4 мМ) и циклогексиламина (5 мМ) методом мицеплярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью, позволяющий концентрировать зону пробы в 900 - 1500 раз

6 Предложены схемы анализа реальных объектов

• Одновременное определение важнейших полифенолов (катехин, эпикатехин, эпикатехин галлат, эпигаллокатехин галлат, эпигаллокатехин, галлокатехин галлат) и алкалоида кофеина в различных образцах зеленого и черного чая методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с УФ-дегектированием с нормальной и обращенной полярностью, с пределом обнаружения ~ 1 мг/л,

• Определение биогенных аминов и их метаболитов в моче методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью с использованием on-line концентрирования и добавлением в состав анализируемой пробы 18-краун-6, ПО 20-30 мкг/л

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Ганжа, О. В. Электрофоретическое разделение чайных флавоноидов в режиме капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии [Текст] / Л А Карцева, О В Ганжа // Журнал прикл Химии -2006 -Т 79 -Вып 7 -С 1120-1124

2 Ганжа, О. В. Оптимизация процедуры пробоподготовки при определении нейротрансмттеров в структурах мозга методами масс-спектрометрии и капиллярного электрофореза [Текст] /ДА Карцева, А А Сидорова, О В Ганжа О В // Тезисы Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы" M -2004 -С.229

3 Ganzha, О. V. The détermination of neurotransmitters m rat brain structures by capillary electrophoresis and mass spectrometry [Text] / Kartsova LA, Sidorova A.A, Ganzha

О V , Nikolaev S V , Shabanov P D // Тезисы Психофармакология и биологическая наркология (Psychopharmacology & Biological narcology) - 2004 - T 4 - № 2-3 -С 710

4 Ганжа, О. В Определение важнейших нейротрансмиттеров в структурах мозга методами капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии [Текст] / А А Карцова, О В Ганжа, А А Сидорова // Труды III научной сессии УНЦХ СпбГУ -2004 -С 223

5 Ганжа, О. В. Использование возможностей капиллярного электрофореза для диагностики эндокринных и онкологических заболеваний [Текст] / JIА Карцова, Е А Бессонова, А А Сидорова, О В Ганжа. // Тезисы V Международная конференция по реабилитологии -2004 -С 116

6 Ganzha, О. V. Determination of polyphenol« enantiomers m green tea extract by capillary zone electrophoresis [Text] / Ganzha О V , Kartsova L A , Sidorova A A // Books of abstracts International conference «Analytical chemistry and chemical analysis (AC&CA-05)» - Kiev - Ukraine -2005 - P 114

7 Ганжа, О. В. Определение катехина и эпикатехина в экстракте зеленого чая методом зонного капиллярного электрофореза [Текст] / Ганжа О В , Карцова А А, Сидорова А А // Материалы II Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» Краснодар - 2005 - С 339-340

8 Ганжа, О. В. Разработка алгоритма пробоподготовки биологических объектов (сыворотка и плазма крови, моча, ткани мозга) при электрофоретическом определении нейротрансмитгерных аминокислот и биогенных аминов [Текст] / Сидорова А А, Карцова Л А, Ганжа О В, Иванова АС // Материалы И Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» - Краснодар - 2005 - С 259

9 Ganzha, О. V. The determination of flavan-3-ols containing m nanolcoholic and strong drinks by capillary electrophoresis [Text] / Ganzha О V, Kartsova LA// Books of abstracts International Congress of Analytical Sciences (ICAS-2006) Moscow - 2006 -P 436

10 Ganzha, О. V. Determination of flavan-3-ols, caffeine and gallic acid in green tea extract by micellar electrokinetic chromatography [Text] / Kartsova LA, Ganzha OV, Alekseeva A V // Abstract of 29th International Symposium on capillary chromatography and 3rd GCxGC Symposium Fiere Congressi Spa Riva del Garda Italy,May29-June2 - 2006 - CD-ROM

11 Ganzha, О. V. The electrophoretical profiles of biological active compounds from different matrixes [Text] /LA Kartsova, A A Sidorova, EG Strelnikova, OV Ganzha.// Thesis ХХХЛ Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" Katowice Poland -2006 -P 72

12 Ганжа, О. В. Электрофоретическое определение полифенольных природных антиоксндантов в составе различных сортов зеленого и черного чая [Текст] / А В Алексеева, Л А Карпова, О В Ганжа // Тезисы Всероссийский симпозиум «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» 2007 -Москва.-23-27 апреля С 155

13 Ganzha, О. V. Micellar electrokmetic chromatography of catechms and caffeine conventional mode and reversed-flow MEKC [Text] / Kartsova L A, Ganzha О V, Alekseeva A V // Abstract of 30th International Symposium on Capillary Chromatography Dalian China. - 2007. - 3-8 June -P30-149

14 Ganzha, О. V. Reversed-flow micellar electrokmetic chromatography for the determination of the catechms and caffeine [Text] / Ganzha О V, Kartsova LA// Thesis EUROANALYSIS-XIV conference - Antwerp Belgium - 2007 - 9-14 September -S7 №122521

15 Ганжа, O.B. Мицеллярная электрокинетическая хроматография с обращенной полярностью Факторы, влияющие на селективность разделения природных антиоксидантов [Текст] / Ганжа О В, Карпова Л А // Тезисы докладов XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии - Москва - 2007 - С 113

16 Ганжа, О.В. Влияние различных добавок на эффективность и селективность разделения биогенных аминов в режиме миделлярной элеетрокинетической хроматографии с обращенной полярностью [Текст] / Карпова Л А, Ганжа О В // Тезисы докладов XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии -Москва -2007 -С 154

Подписано к печати 18.09.2007 Формэт 60*80 1/16. Бумага офсетная. Печать рюографическая, Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Отпечатано в цифровом копировальном центре «Восстания-]» 191036, Санкт-Петербург, ул. Восстания, д.1

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

11.1. Основы метода капиллярного электрофореза

II. 1.1. Способы ввода пробы.

II. 1.2. Методы детектирования в капиллярном электрофорезе.

II. 1.2.1. УФ- детектирование в КЭ.

II. 1.2.2. Флуоресцентное детектирование

II. 1.2.3. Масс-спектрометрическое детектирование.

11.2. Различные варианты капиллярного электрофореза.

11.2.1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ).

11.2.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография.

11.2.2.1. МЭКХс положительной полярностью

МЭКХ).

11.2.2.2. МЭКХс обращенной полярностью (ОП

МЭКХ).

11.3. Микроэмульсионная электрокинетическая хроматография (МЭЭКХ).

11.3.1. Способы образования микроэмульсии.

11.3.2. Механизм разделения в МЭЭКХ.

11.3.3. Факторы, влияющие на разделение в МЭЭКХ. 34 II.3.3.1. Природа поверхностно-активного вещества.

II.3.3.2. Влияние рН буферного электролита на селективность разделения.

II. 3.3.3. Влияние органических растворителей на электрофоретические характеристики аналитов.

II.3.3.3.1. Гидрофобные растворители, образующие фазу «масла».

II. 3.3.3.2. Органические растворители стабилизаторы микроэмульсии.

II. 3.3.3.3. Гидрофильные органические модификаторы элюента.

11.3.4. Способы приготовления микроэмульсии.

11.3.5. Применение МЭЭКХ.

11.4. Эффективность, разрешение и селективность разделения в методе капиллярного электрофореза.

11.5. Макроциклические реагенты, используемые в капиллярном электрофорезе.

11.6. Определение констант комплексообразования в капиллярном электрофорезе.

11.7. Использование различных режимов капиллярного электрофореза для определения полифенольных антиоксидантов и кофеина в зеленом чае.

II. 7.1. Общая характеристика полифенольных компонентов чая.

II.7.2. Определение биологической активности полифенолов.

II. 7.3. Пробоподготовка реальных объектов для определения полифенолов.

II. 7.3.1. Жидкостная экстракция.

II. 7.3.2. Твердофазная экстракция.

II. 7.4. Хроматографические и электрофоретические методы определения полифенольных антиоксидантов.

11.7.4.1. Определение полифенолов в жидкостной хроматографии.

11.7.4.2. Электрофоретическое определение основных биологически активных компонентов чая.

11.7.4.3. Определение полифенольных антиоксидантов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ).

III.

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

111.1. Аппаратура.

111.2. Реагенты.

111.3. Методы исследования.

111.3.1. Оптимизация условий электрофоретического детектирования.

111.3.2. Использование капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) для разделения полифенов.

111.3.3. Определение катехинов и кофеина в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии.

111.3.4. Мицеллярная электрокинетическая хроматография с обращенной полярностью (ОПМЭКХ) при одновременном определении полифенолов и кофеина.

III. 3.5. Построение градуировочных зависимостей аналитов для количественного анализа реальных объектов.

111.3.6. Расчет констант комплексообразования.

111.3.7. Определение полифенолов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии.

III. 3.7.1. Приготовление микроэмульсии.

111.3.8. Использование метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) для определения полифенолов и кофеина.

111.3.9. Пробоподготовкареальных объектов к электрофоретическому и хроматографическому анализу.

111.3.10. Определение хроматографических и электрофоретических характеристик аналитов (параметров удерживания, эффективности и факторов селективности разделения и разрешен ия).

IIL3.11. Электрофоретическое разделение биогенных аминов в режиме ОП МЭКХ.

III. 3.11.1. On-line концентрирование в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии.

IV. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ И КОФЕИНА В РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ КАПИЛЛЯРНОГО

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА.

IV.1. Определение полифенолов в капиллярном зонном электрофорезе.

IV.2. Факторы, определяющие закономерности одновременного электрофоретического определения полифенолов и кофеина в мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).

IV.3. Электрофоретическое разделение полифенолов и кофеина в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ).

IV.3.1. Влияние органических растворителей на

разделение катехинов и кофеина в режиме ОП МЭКХ.

IV.3.2. Влияние комплексообразующих агентов на селективность разделения в ОП МЭКХ.

IV.3.2.1. Роль гидроксикислоты в составе рабочего буфера как конкурирующего комплексообразующего агента.

IV. 3.2.2. Влияние нейтрального и заряженного /3-циклодекстринов на селективность разделения полифенолов.

IV.3.3. Исследование возможностей микроэмульсионной электрокинетической хроматографии

МЭЭКХ) для определения полифенолов.

VI.3.4. Сравнительные оценочные характеристики режимов МЭКХ, ОП МЭКХ и МЭЭКХ с УФ-детектированием при электрофоретическом определении катехинов и кофеина в природных объектах.

IV.3.4.1. Использование микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) для определения стероидных гормонов.

V. РАЗДЕЛЕНИЕ БИОГЕННЫХ АМИНОВ МЕТОДОМ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ОТСУТСТВИИ

ЭЛЕКТРООСМОТИЧЕСКОГО ПОТОКА (ОП МЭКХ).

V.I. Влияние комплексообразующих и ион-парных агентов на селективность разделения биогенных аминов методом ОП МЭКХ.

VI. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ.

VI.!. Электрофоретическое определение полифенолов в зеленом и черном чае.

У1.2. Определение катехоламинов в моче методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

В последние годы методы капиллярного электрофореза (КЭ) широко используются для определения биологически активных соединений в природных объектах. Варианты микроэмульсионной и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ и МЭКХ) с обращенной полярностью наименее изучены. При этом использование их для гидрофобных соединений должно было бы привести к росту эффективности, сокращению времени анализа и снижению пределов обнаружения аналитов.

Интересными и информативными моделями для выяснения возможностей малоизученных вариантов КЭ - мицеллярного режима с обращенной полярностью и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии - являются следующие системы:

1. Природные антиоксиданты полифенольного типа ((-)-эпикатехин, (-)-эпикатехин гаплат, (-)-эпигаллокатехин, (-)-галлокатехин галлат, (-)-эпигаллокатехин галлат и (+)-катехин) и кофеин, обладающие антиаллергенными и радиопротекторными свойствами и являющиеся основными компонентами зеленого чая.

2. Биогенные амины (дофамин, норадреналин, адреналин) и их метаболиты (метанефрин и норметанефрин) - диагностические маркеры различных заболеваний с нарушением работы центральной нервной системы.

В молекулах указанных веществ содержатся легко ионизируемые и способные к комплексообразованию с органическими и неорганическими соединениями 1,2-фенольные гидроксилы (катехольный фрагмент).

Логически обоснованная стратегия выбора условий электрофоретического разделения (рН рабочего буфера, природа и концентрация комплексообразующих агентов, режим on-line концентрирования и т.д.) с учетом специфики аналитов могла бы позволить предложить высокоселективный и чувствительный способ их определения и выявить новые возможности обсуждаемых вариантов капиллярного электрофореза.

Работа поддержана Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере («СТАРТ 2005», проект №5911).

Цель работы. Выявить новые возможности и получить оценочные характеристики различных вариантов метода капиллярного электрофореза с УФ-детектированием (зонного капиллярного электрофореза (КЗЭ), мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ), микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ)) для определения катехинов и катехоламинов в природных объектах. В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Установить закономерности одновременного электрофоретического разделения полифенолов и кофеина в режимах капиллярного электрофореза (КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ) с УФ-детектированием.

2. Выяснить доминирующие факторы (состав и рН рабочего электролита, органические модификаторы, макроциклические агенты), определяющие селективное разделение катехинов чая и кофеина методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОПМЭКХ).

3. Выявить критерии, определяющие стабильность микроэмульсионной системы, и установить закономерности разделения полифенольных антиоксидантов в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ).

4. Изучить возможности обсуждаемых электрофоретических вариантов для определения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях.

5. Предложить электрофоретический способ селективного определения полифенольных соединений и кофеина в реальных объектах растительного происхождения (различные образцы зеленого и черного чая).

Научная новизна

Выявлены доминирующие факторы (состав и рН буферного электролита, концентрация додецилсульфата натрия), влияющие на электрофоретическое разделение органических соединений, содержащих в своей структуре фрагмент вицинальных дигидрокси-групп (катехины и катехоламины) методами МЭКХ с нормальной и обращенной полярностью. Показано, что последний вариант предпочтителен.

Впервые, обнаружен эффект влияния комплексообразующих добавок ф-циклодекстрина, сульфо-)3-циклодекстрина, лимонной кислоты) в составе рабочего электролита на увеличение селективности разделения полифенолов в МЭКХ с обращенной полярностью и сокращение времени анализа.

Определены возможности микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (рН рабочего буфера 2,0) для электрофоретического разделения смеси, содержащей природные антиоксиданты (эпикатехин, эпигаллокатехин, эпикатехин галлат, галлокатехин галлат и эпигаллокатехин галлат; ПО ~ 0,5 мг/л; К=1000'103 - 2000-Ю3 т.т./м.

Впервые предложен способ определения катехоламинов и их метаболитов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ), и показано, что селективность разделения и эффективность в данном режиме выше в 1,5 раза, чем в традиционно используемом для этой цели методе капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).

Выявлено влияние комплексообразующих добавок (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6), смешанных мицелл (додецилсульфат натрия/октансульфонат натрия) и первичных аминов в составе рабочего электролита на электрофоретические характеристики катехоламинов в режиме МЭКХ с обращенной полярностью.

Установлено, что при рН рабочего электролита < 7 азотсодержащий макроцикл, взаимодействуя с мицеллой, увеличивает селективность разделения и общее время анализа; 18-краун-6 изменяет электрофоретические характеристики аналитов, образуя с ними комплексы разной устойчивости.

Предложен новый вариант on-line концентрирования для биогенных аминов и их метаболитов в режиме ОП МЭКХ: свипинг с добавкой 18-краун-6 (4 мМ) и циклогексиламина (5 мМ) в матрицу пробы. Факторы концентрирования составили 900- 1500.

Практическая значимость работы

Предложены варианты определения полифенольных антиоксидантов и кофеина в различных образцах зеленого и черного чая методами традиционной мицеллярной электрокинетической хроматографии и МЭКХ с обращенной полярностью с УФ-детектированием. Пределы детектирования полифенолов составили: ~ 0,3 -1 мг/л.

Показана возможность электрофоретического определения биогенных аминов (дофамин, адреналин, норадреналин, метанефрин, норметанефрин) методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (буферный электролит содержит ацетат натрия и муравьиную кислоту, рН 2,0) в биологических жидкостях (моча) после твердофазной экстракции на модифицированном додецилсульфатом натрия сорбенте C|g.

Предложен вариант электрофоретического определения стероидных гормонов (прогестерон, 17-гидроксипрогестерон, 11-дегидро-кортикостерон, 11-дезокси-кортикостерон, кортизон, кортизол, тестостерон, кортикостерон, кортизон ацетат, дексаметазон) методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (рН 2,0). Пределы обнаружения составили 0,8 - 1 мг/л без стадии концентрирования и 0,04 - 0,06 мг/л с использованием on-line концентрирования {свипинг, 30 мбар, 100 с).

Разработаны варианты on-line концентрирования {свипинг с добавкой 4 мМ 18-краун-6 и 5 мМ циклогексиламина в матрицу пробы) биогенных аминов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (ОП МЭКХ), позволяющие концентрировать пробу в 900 -1500 раз. Предел обнаружения составил 20-30 нг/мл.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты исследования влияния состава, концентрации и рН буферного электролита, концентрации мицеллообразующего реагента (додецилсульфат натрия), органических модификаторов (ацетонитрил, метанол, изопропиловый спирт, мочевина) в составе рабочего электролита на одновременное электрофоретическое определение полифенолов и кофеина методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ) с УФ-детектированием.

2. Влияние и количественная оценка комплексообразующих добавок (p-циклодекстрина, сульфо-р-циклодекстрина, 18-краун-6 и 4,13-диаза-18-краун-6) в мицеллярных системах на эффективность и селективность электрофоретического разделения катехинов и катехоламинов методом МЭКХ с обращенной полярностью.

3. Влияние температуры, типа и концентрации поверхностно-активного вещества, природы «масла» на стабильность микроэмульсии и на электрофоретические подвижности флаван-3-олов и стероидных гормонов в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ).

4. Сравнение возможностей и обоснование преимуществ использования различных вариантов мицеллярного и микроэмульсионного электрофоретического определения катехинов и катехоламинов в природных объектах.

5. Практические приложения выявленных закономерностей:

- одновременное определение основных полифенольных антиоксидантов и кофеина в зеленом и черном чае методами мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) с разными вариантами полярностей и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ);

- определение катехоламинов и их метаболитов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ) в моче с on-line концентрированием (свипинг) и пределом детектирования катехоламинов и их метаболитов 20-30 нг/мл.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ

выводы

1. Выявлены доминирующие факторы (рН и состав буферного электролита, концентрация анионного детергента, природа органического модификатора), влияющие на электрофоретические характеристики полифенолов и кофеина в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной и обращенной полярностью. Показано, что последний вариант по эффективности, селективности разделения и общему времени анализа предпочтителен.

2. Обнаружено влияние комплексообразующих агентов (гидроксикислот, заряженных и нейтральных циклодекстринов, краун-соединений -18-К-6 и 4ДЗ-диаза-18-К-6) в составе мицеллярной фазы на селективность разделения катехоламинов и полифенолов методом ОП МЭКХ и проведена количественная оценка этого влияния для системы «макроцикл - аналит».

3. Установлены факторы, определяющие устойчивость микроэмульсии и изменяющие электрофоретические характеристики полифенольных антиоксидантов и стероидных гормонов: температура, тип и концентрация поверхностно-активного вещества, природа «масла».

4. Проведена сравнительная оценка возможностей и обоснованы преимущества различных вариантов мицеллярного и микроэмульсионного электрофоретического определения природных антиоксидантов полифенольного типа и кофеина в составе различных образцов чая.

5. Разработан новый вариант on-line концентрирования (свипинг) катехоламинов и их метаболитов с добавлением в матрицу пробы 18-К-6 (4 мМ) и циклогексиламина (5 мМ) методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью, позволяющий концентрировать зону пробы в 900 - 1500 раз.

6. Предложены схемы анализа реальных объектов

• Одновременное определение важнейших полифенолов (катехин, эпикатехин, эпикатехин галлат, эпигаллокатехин галлат, эпигаллокатехин, галлокатехин галлат) и алкалоида кофеина в различных образцах зеленого и черного чая методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с УФ-детектированием с нормальной и обращенной полярностью, с пределом обнаружения ~ 1 мг/л;

• Определение биогенных аминов и их метаболитов в моче методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью с использованием on-line концентрирования и добавлением в состав анализируемой пробы 18-краун-6; ПО 20-30 мкг/л.

1. Руководство по капиллярному электрофорезу Текст. / Под ред. А. М. Волощука // М. 1996. 231 с.

2. Система капиллярного электрофореза «Капель-ЮЗР». Руководство по эксплуатации Текст. / ООО «Люмэкс». С.-Петербург. 2001. 99 с.

3. Степанов, К. В. Идентификация электрофоретических пиков фенилтиогидантоиновых производных аминокислот Текст. / К. В. Степанов, А. В. Пирогов, О. А. Шпигун // Журнал аналит.химии. -2006.- Т. 61.-№. 1.-С. 10-18.

4. Пирогов, А. В. Определение оптических отбеливателей (белофоров) в составе писчей бумаги методом капиллярного электрофореза Текст. / А. В. Пирогов, А. В. Юрьев, О. А. Шпигун // Журнал аналит.химии. -2006. Т. 61. - №. 2. - С. 184 - 192.

5. Terabe, S. Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries Text. / S. Terabe, K. Otsuka, K. Itchikawa, A. Tsuchiya, T. Ando // Anal. Chem. 1984. - V.56. - P.l 11-113.

6. Muijselaar, P.G. Micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography Text. / P.G. Muijselaar, K. Otsuka, S. Terabe // J. Chromatogr. A. 1997. - V.780. - P.41-61.

7. Göttlicher, B. Aplication of particles as pseudo-stationary phases in electrokinetic chromatography Text. / B. Göttlicher, K. Bächmann // J. Chromatogr. A. 1997. - V.780. - P. 63-73.

8. Janini, G. M. Micellar electrokinetic chromatography in zero-electroosmotic flow environment Text. / G. M. Janini, G.M. Muschik, H.J. Issaq // J. Chromatogr. B. 1996. - V.683. - P.29-35.

9. Chien, R.L. Sample stacking of an extremely large injection volume in higt-performance capillary electrophoresis Text. / D.S. Burgi // Analyt. Chem. 1992. - V.64. - P. 1046-1050.

10. Pirogov, A.V. Application of polyelectrolyte complexes as novel pseudo-stationary phase in micellar electrokinetic chromatography Text. /

11. A.V. Pirogov, A.V.Shpak, O.A. Shpigyn. // Analyt. Bioanal. Chem. 2003. -V.374.-P. 1199-1203

12. Ahuja, E.S. Anionic-zwitterionic mixed micelles in micellar electrokinetic chromatography: sodium dodecyl sulfate N-dodecyl-N,N-dimethylammonium-3-propane-l-sulfonic acid Text. / E.S. Ahuja,

13. B.P. Preston, J.P. Foley // J. Chromatogr. B. 1994. - V.657. - P.271-284.

14. Corstiens, H. Equation for the description of the resolution of charged solutes in micellar electrokinetic vapillary chromatography Text. /

15. H. Corstiens, H.A.H. Billiet, J. Frank, K. Ch.A.M. Luyben // J. Chromatogr. A. 1996. - V.753. - P. 121-131.

16. Baur, L. Electroosmotic flow variations caused by the volatility of buffer components: diagnosis and therapy Text. / L. Baur, C. S.-van de Griend, H. Watzig // J. Chromatogr. A. 2002. - V.979. - P. 97-103.

17. Aucamp, J.P. Simultaneous analysis of tea catechins, caffeine, gallic acid, theanine and ascorbic acid by micellar electrokinetic capillary chromatography Text. / J.P. Aucamp, Y. Hara , Z. Apostolides // J. Chromatogr. A. 2000. - V.876. - P. 235-242.

18. Katsuta, S. Control selectivity in micellar electrokinetic chromatography by modification of the micellar phase with solubilized organic compounds Text. / S. Katsuta, K. Saitoh // J. Chromatogr. A. 1997. - V.780. - P. 165178.

19. Gotti, R. Modifier micellar electrokinetic chromatography in the analysis of catechins and xanthines in chocolate Text. / R. Gotti, J. Fiori, F. Mancini, V. Carvini // Electrophoresis. 2004. - V.25. - P. 3282-3291.

20. Atrai, Kevin D. Background theory and applications of microemulsion electrokinetic chromatography Text. / Kevin D. Atrai // J. Chromatogr. A. -2000.-V.892.- P.171-186.

21. Klampfl, Ch. W. Solvent effects in microemulsion electrokinetic chromatography Text. / Ch. W. Klampfl // Electrophoresis. 2003. - V.24. - P. 1537-1543.

22. Shelton, Chris M. Enhanced selectivity for capillary zone electrophoresis using ion-pair agents Text. / С. M. Shelton, J. T. Koch, N. Desai and J. F. Wheeler // J. Chromatogr. A. 1997. V. 792. P. 455-462.

23. Сумм, Б.Д. Основы коллоидной химии. Текст. / Б.Д. Сумм // М.: «Академия». 2006. 240 с.

24. Watarai, Н. Microemulsion in separation science Text. / H. Watarai // J. Chromatogr. A. 1997. - V.780. - P. 93 - 102.

25. Furumoto, T. Migration mechanism of bases and nucleosides in oil-in-water microemulsion capillary electrophoresis Text. / T. Furumoto, T. Fukumoto, M. Sekiguchi, T. Sugiyama, H. Watarai // Electrophoresis. -2001.-V.22.-P. 3438-3443.

26. Terabe, S. Microemulsion electrokinetic chromatography: comparison with micellar electrokinetic chromatography Text. / S. Terabe, N. Matsubara, Y. Ishihama, Y. Okada // J. Chromatogr. A. 1992. - V.608. - P. 23-29.

27. Hancen, S.H. Microemulsion electrokinetic chromatography or solvent modified micellar electrokinetic chromatography Text. / S.H. Hancen, C. Gabel-Jensen, D. Т. M. El-Sherbiny, S. Pedersen-Bjergaard // Trends in Anal. Chem. - 2001. - V.20. - P. 614-619.

28. Miksik, I. Microemulsion electrokinetic chromatography of fatty acids as phenacyl esters Text. / I. Miksik, Z. Deyl // J. Chromatogr. A. 1998. -V.807.-P. 111-109.

29. Boso, R. L. Microemulsion electrokinetic chromatography with different organic modifiers: separation of water- and lipid-soluble vitamins Text. / R. L. Boso, M. S. Bellini, I. Miksik, Z. Deyl // J. Chromatogr. A. 1995. -V.709.-P. 11-19.

30. Altria, K. D. Background and operating parameters of microemulsion electrokinetic chromatography Text. / K. D. Altria, P.-E. Mahuzier,

31. B.J. Clark // Electrophoresis. 2003. - V.24. - P. 315-324.

32. Song, L. Separation of six phenylureas and chlorsulfuron standards by micellar, mixed micellar and microemulsion electrokinetic chromatography Text. / L. Song, Q. Ou, W. Yu, G. Li // J. Chromatogr. A. 1995. - V.699. -P. 371-382.

33. Gluck, S. J. Indirect determination of octanol-water partition coefficients by microemulsion electrokinetic chromatography Text. / S. J. Gluck, M. H. Benkö, R. K. Hallberg, K. P. Steele // J. Chromatogr. A. 1996. -V.744.-P. 141-146.

34. Gabel-Jensen, C. Separation of neutral compounds by microemulsion electrokinetic chromatography: Fundamental studies on selectivity Text. /

35. C. Gabel-Jensen, S. H. Hansen, S. Pedersen-Bjergaard // Electrophoresis. -2001.-V.22.-P. 1330-1336.

36. Pedersen-Bjergaard, S. Selectivity in microemulsion electrokinetic chromatography Text. / S. Pedersen-Bjergaard, C. Gabel-Jensen, S. H. Hansen // J. Chromatogr. A. 2000. - V.897. - P. 375-381.

37. Fu, X. Microemulsion elektrokinetic chromatographic separation of antipyretic analgesic ingredients Text. / X. Fu, J. Lu, A. Zhu // J. Chromatogr. A. 1996. - V.735. - P. 353-356.

38. Szücs, R. Micellar and microemulsion electrokinetic chromatography of hop bitter acids Text. / R. Szücs, E. Van Hove, P. Sandra // J. High Resolut. Chromat. 1996. - V. 19. - P. 189-192.

39. Miksik, I. Microemulsion electrokinetic chromatography of diphenylhydrazones of dicarbonyl sugars Text. / I. Miksik, J. Gabriel, Z. Deyl // J. Chromatogr. A. 1997. - V.772. - P. 297-303.

40. Altria, K. D. Application of microemulsion electrokinetic chromatography to the analysis of a wide range of pharmaceuticals and excipients Text. / K. D. Altria // J. Chromatogr. A. 1999. - V.844. - P. 371-386.

41. Krismann, U. Separation of hydroxylated polycyclic aromatic hydrocarbons by micellar electrokinetic capillary chromatography Text. / U. Krismann, W. Kleiböhmer // J. Chromatogr. A. 1997. - V.774. -P.193-201

42. Cherkaoui, S. Micellar and microemulsion electrokinetic chromatography of selected anesthetic drugs Text. / S. Cherkaoui, J.-L. Veuthey // J. Sep. Science. 2002. - V. 25. - P. 1073-1078.

43. Fu, X. Microemulsion elektrokinetic chromatographic separation of antipyretic analgesic ingredients Text. / X. Fu, J. Lu, A. Zhu // J. Chromatogr. A. 1996. - V.735. - P. 353-356.

44. Pomponio, R. Microemulsion electrokinetic chromatography of corticosteroids. Effect of surfactants and cylodextrins on the separation selectivity Text. / R. Pomponio, R. Gotti, J.Fiori, V. Varvini // J. Chromatogr. A. 2005. - V. 1081. - P. 24-30.

45. Namera, A. Direct extract derivatization for determination of amino acids in human urine by gas chromatography and mass spectrometry Text. / A. Namera, M. Yashiki, M. Nishida, T. Kojima // J. Chromatogr. A. 2002. -V.776.-P. 49-55.

46. Москвин, JI.H. Понятие «селективность» и его содержание в методах разделения веществ Текст. / Л.Н. Москвин, И.Г. Зенкевич, Л.А. Карцова // Журн. Аналит. химии. 2004. - Т.59. - №7. - С. 697703.

47. Пирогов, А. В. Изменение электрофоретической подвижности фенолов при использовании ионенов в качестве добавок в буферный электролит Текст. / А. В. Пирогов, К. В. Степанов, О. А. Шпигун // Журнал аналит.химии. 2003. - Т. 58. - №. 5. - С. 534 - 542.

48. Shen, H.-J. Comparison of the use of anionic and cationic surfactants for the separation of steroids based on MEKC and sweeping-MEKC modes

49. Text. / H.-J. Shen, Ch.-H. Lin // Electrophoresis. 2006. - V. 27. - P. 1255 -1262.

50. Карцова, JI.A. Молекулярное распознавание в хроматографии Текст. / Л.А. Карцова, О.В. Маркова // СПб.: СПбГУ. 2004. 140 с.

51. Пожарский, А.Ф. Супрамолекулярная химия. Часть I. Молекулярное распознавание Текст. / А.Ф. Пожарский // Соросовский образовательный журнал. 1997. - №9. - С. 32-39.

52. Male, К. В. Derivatization, stabilization and detection of biogenic amines by Cyclodextrin-modified capillary electrophoresis laser induced fluorescence detection Text. / К. B. Male, J.H.T. Luong // J. Chromatogr. A. - 2001. - V.926. - P. 309-317.

53. Chiou, C.-S. Application of crown ethers as modifiers for the separation of amines by capillary electrophoresis Text. / C.-S. Chiou, J.-S. Shih // Anal. Chim. Acta. 1998. - V.360. - P. 69-76.

54. Nelson, В. C. The separation of green tea catechins by micellar electrokinetic chromatography Text. / В. C. Nelson, J. B. Thomas, S. A. Wise, J. J. Dalluge // J. Microcol. Sep. 1998. - V.10(8). - P. 671679.

55. Хираока M. Краун-соединения Текст. / M. Хираока // М.: Мир. 1986. -356 с.

56. Janos, P. Determination of equilibrium constants from chromatographic and Electrophoretic measurements Text. / P. Janos // J. Chromatogr. A. -2004.-V. 1037.-P. 15-28.

57. Rundlett, K. L. Methods for estimation of binding constants by capillary electrophoresis Text. / K. L. Rundlett, D. W. Armstrong // Electrophoresis. 1997.-V.18.-P. 2194-2202.

58. Rundlett, K. L. Examination of origin, variation and proper use of expressions for the estimation of association caonstants by capillary electrophoresis Text. / K. L. Rundlett, D. W. Armstrong // J. Chromatogr. A. 1996. - V.721. - P. 173-186.

59. Bose, S. Guidelines in selecting ligand concentrations for the determination of binding constants by affinity capillary electrophoresis Text. / S. Bose, J. Yang, D. S. Hage // J. Chromatogr. A. 1997. - V.797. - P. 77-88.

60. Liu, J. Chiral recognition and racemic resolution of drug enantiomers by electrophoresis based on host-guest complexation Text. / J. Liu, H. Coffey, D. J. Detlefsen, Y. Li, M. S. Lee // J. Chromatogr. A. 1997. - V.763. -P. 261-269.

61. Shakalisava, Y. Determination of association constants of inclusion complexes of steroid hormones and cyclodextrins from their electrophoretic mobility Text. / Y. Shakalisava, F. Regan // Electrophoresis. 2006. -V.27.-P. 3048-3056.

62. Blahova, E. Sample preparation and HPLC determination of catechins in green tea Text. / E. Blahova, J. Lehotay // Chem. Anal. 2006. - V.51. -P. 795-807.

63. Aucamp, J.P. Simultaneous analysis of tea catechins, caffeine, gallic acid, theanine and ascorbic acid by micellar electrokinetic capillary chromatography Text. / J.P. Aucamp, Y. Hara, Z. Apostolides // J. Chromatogr. A. 2000. - V.876. - P. 235-242

64. Larger, P.J. Separation of tea polyphenols using micellar electrokinetic chromatography with diode array detection Text. / P.J. Larger, A.D. Jones, C. Dacombe // J. Chromatogr. A. 1998. - V.799. - P. 309-320

65. Stach, D. Decrease in concentration of free in tea over time determined by micellar electrokinetic chromatography Text. / D. Stach, O.J. Schmitz // J. Chromatogr. A. 2001. - V.924. - P. 519-522.

66. Arce, L. Determination of anti-carcinogenic polyphenols present in green tea using capillary electrophoresis coupled to a flow injection system Text. / L. Arce, A. Rios, M. Valcarcel // J. Chromatogr. A. 1998. - V.827. -P. 113-120.

67. Nwuha, V. Solubility study of green tea extracts in pure solvents and edible oils Text. / V. Nwuha, M. Nakajima, J. Tong, S. Ichikawa // J. of Food Engineering.- 1999.-V.40.- P. 161-165.

68. Horie, H. Analysis of tea component by high-performance liquid chromatography and high-performance capillary electrophoresis Text. / H. Horie, K. Kohata // J. Chromatogr. A. 2000. - V.881. - P. 425-438.

69. Weiss, D.J. Determination of catechins in matcha green tea by micellar electrokinetic chromatography Text. / D.J. Weiss, C.R. Anderton // J. Chromatogr. A. 2003. - V. 1011. - P. 173-180

70. Horie, H. Application of capillary electrophoresis to tea quality estimation Text. / H. Horie, K. Kohata // J. Chromatogr. A. 1998. - V.802. - P. 219223.

71. Horie, H. Simultaneous determination important components in green tea infusions using capillary electrophoresis Text. / H.Horie, T. Mukai, K. Kohata // J. Chromatogr. A. 1997. - V.758. - P. 332-335

72. Khokhar, S. Iron binding characteristics of phenolic compounds: some tentative structure-activity relations Text. / S. Khokhar, R. K. Owusu Apenten // Food Chemistiy. 2003. - V.81. - P. 133-140.

73. Sano, M. Simultaneous determination of twelve tea catechins by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection Text. / M. Sano, M. Tabata, M. Suzuki, M. Degawa, T. Miyase, M. Maeda-Yamamoto // Analyst. 2001. - V. 126. - P. 816-820.

74. Dalluge, J.J. Determination of tea catechins Text. / J.J. Dalluge,

75. B.C. Nelson // J. Chromatogr. A. 2000. - V.881. - P. 411-424

76. Vovk, I. Separation of eight selected flavan-3-ols on cellulose thin-layer chromatographic plates Text. / I. Vovk, B. Simonovska, H. Vuorela // J. Chromatogr. A. 2005. - V.1077. - P. 188-194.

77. Maiani, G. Application of a new high-performance liquid chromatographic method for measuring selected polyphenols in human plasma Text. / G. Maiani, M. Serafini, M. Salucci, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi // J. Chromatogr. A. 1995. - V.692. - P. 311-317.

78. Zuo, Y. Simultaneous determination of catechins, caffeine and gallic acid in green, Oolong, black and pu-er teas using HPLC with photodiode array detector Text. / Y. Zuo, H. Chen, Y. Deng // Talanta. 2002. - V.54. -P. 307-316.

79. Huang, H.-Y. Comparison of microemulsion electrokinetic chromatography and micellar electrokinetic chromatography methods for the analysis of polyphenolic compounds Text. / H.-Y. Huang, W.-C. Lien,

80. C.-W. Chiu // J. Separ. Science. 2005. - V.28. - P. 973-981.

81. Van Nedrkassel, A.M. Prediction of total green tea antioxdant capacity from chromatograms by multivariate modeling Text. / A.M. van Nedrkassel, M. Daszykowski, D.L. Massart, Y.V. Heyder // J. Chromatogr. A. 2005. - V. 1096. - P. 177-186.

82. Arts, M.J.T.J. Masking of antioxidant capacity by interaction of flavonoids with protein Text. / M.J.T.J. Arts, G.R.M.M. Haenen, H.-P. Voss, A. Bast // Food and Chem Toxic. 2001. - V.39. - P. 787-791.

83. Gu, X. Analysis of resveratrol in wine by capillary electrophoresis Text. / X. Gu, Q. Chu, M. O'Dwyer, M. Zeece // J. Chromatogr. A. 2000. -V.881. -P.471-481.

84. Bovanova, L. Direct analysis of food samples by high-performance liquid chromatography Text. / L. Bovanova, E. Brandsteterova // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 880. - P. 149-168.

85. Kumamoto, M. Enhanced separation and elution of catechins in HPLC using mixed-solvents of water, acetonitrile and ethyl acetate as mobile phase Text. / M. Kumamoto, T. Sonda, K. Takedomi, M. Tabata // Analytic. Sciences. 2000. - V.16.-P. 139-144.

86. Suarez, B. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders Text. / B. Suarez, A. Picinelli, J.J. Mangas // J. Chromatogr. A. 1996. -V.727.-P. 203-209.

87. Tsuchiya, H. High-performance liquid chromatographic analysis of polyhydroxyflavones using solid-phase borate complex extraction Text. / H. Tsuchiya // J. Chromatogr. B. 1998. - V.720. - P. 225-230.

88. Lee, B.-L. Comparative analysis of tea catechins and theaflavins by highperformance liquid chromatography and capillary electrophoresis Text. / B.-L. Lee, C.-N. Ong // J. Chromatogr. A. 2000. - V.881. - P. 439-447.

89. Tsuchiya, H. Simultaneous determination of catechins in saliva by highperformance liquid chromatography Text. / H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, T. Okubo, L.R. Juneja, M. Kim // J. Chromatogr. B. 1997. - V.703. -P. 253-258.

90. Tsuchiya, H. Nanoscale analysis of pharmacologically active catechins in body fluids by HPLC using borate complex extraction pretreatment Text. / H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, H. Kureshiro, N. Takagi // Talanta. 1998. -V.46.-P. 717-726.

91. Vaher, M. Separation of polyphenolic compounds extracted from plant matrices using capillary electrophoresis Text. / M. Vaher, M. Koel // J. Chromatogr. A. 2003. - V.990. - P. 225-230.

92. Pazourek, J. Separation of polyphenols in Canary Islands wine by capillary zone electrophoresis without preconcentration Text. / J. Pazourek, G. González, A.L. Revilla, J. Havel // J. Chromatogr. A. 2000. - V.874. -P. 111-119.

93. De Villiers, A. Development of solid-phase extraction procedures for the simultaneous determination of polyphenols, organic acids and sugars inwine Text. / A. de Villiers, F. Lynen, A. Crouch, P. Sandra // J. Chromatogr. A. 2004. - V.59. - P 403-409.

94. Fernandez, P.L. HPLC determination of catechins and caffeine in tea. Differentation of green, black and instant teas Text. / P.L. Fernandez, M.J. Martin, A.G. Gonzalez, F. Pablos // Analyst. 2000. - V. 125. - P. 421425.

95. Zuo, Y. Simultaneous determination of catechins, caffeine abd gallic acid in green, Oolong, black and pu-er teas using HPLC with photodiode array detector Text. / Y. Zuo, H. Chen, Y. Deng // Talanta. 2002. - V.54. -P. 307-316.

96. Kotani, A. Optimization of HPLC-ECD of catechins with precision and efficiency based on FUMI theory Text. / A. Kotani, Y. Hayashi, R. Matsuda, F. Kusu // Analytic. Science. 2003. -V.19. - P. 865-869.

97. ПО. Яшин, Я.И. Анализ пищевых продуктов и напитков хроматографическими методами. Обзор Текст. / Я.И. Яшин, А.Я. Яшин // Партнеры и конкуренты. 2003. - №8.

98. Яшин, Я.И. Хроматографические методы анализа химического состава чая Текст. / Я.И. Яшин, А.Я. Яшин // Партнеры и конкуренты. -2004.-№4.

99. Piñeiro, Z. Determination of catechins by means of extraction with pressurized liquids Text. / Z. Piñeiro, M. Palma, C.G. Barroso // J. Chromatogr. A. 2004. - V. 1026. - P. 19-23

100. Barroso, M. B. Determination of green and black tea composition by capillary electrophoresis Text. / M. B. Barroso, G. van de Werken // J. High Resol. Chrom. 1999. - V.22(4). - P. 225-230.

101. Pomponio, R. Analysis of catechins in extract of Cistus species by microemulsion electrokinetic chromatography Text. / R. Pomponio, R. Gotti, N. A. Santagati, V. Cavrini // J. Chromatogr. A. 2003. - V.990. -P. 215-223.

102. Wörth, C.C.T. Analysis of catechins and caffeine in tea extracts by micellar electrokinetic chromatography Text. / C.C.T. Wörth, M. Wießler, O.J. Schmitz // Electrophoresis. 2000. - V.21. - P. 3634-3638.

103. Huang, H.-Y. Analyses of phenolic compounds by microemulsion electrokinetic chromatography Text. / H.-Y. Huang, W.-C. Lien // Electrophoresis. 2005. - V.26. - P. 3134-3140.

104. Huang, H.-Y. Sample stacking for the analysis of catechins by microemulsion EKC Text. / H.-Y. Huang, I.-Y. Huang, H.-H. Liang, S. Lee // Electrophoresis. 2007. - V. 28. - P. 1735 - 1743.

105. Досон, P. Справочник биохимика Текст. / P. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К.-М. Джонс // Мир. Пер. с англ. 1991. С. 355.

106. Horie, Н. Rapid determination of caffeine in tea leaves Text. / H. Horie, A. Nesumi, T. Ujihara, K. Kohata // J. Chromatogr. A. 2001. - V.942. -P.271-273.

107. Эндокринология Текст. / под ред. Н. Лавина // 1999. 1128 с.

108. Руководство по лабораторной клинической диагностике Текст. / под ред. В.В. Меньшикова // М.: Медицина. 1982. 576 с.

109. Quirino, J. P.Sweeping: concentration mechanism and applications to high-sensitivity analysis in capillary electrophoresis Text. / J. P. Quirino , J.-B. Kim, S. Terabe // J. Chromatogr. A. 2002. - V.965. - P. 357-373.

110. Shihabi, Z. K. Stacking in capillary electrophoresis Text. / Z. K. Shihabi // J. Chromatogr. A. 2000. - V.902. - P. 107-117.

111. Erdemoglu, S.B. Selective determination of aluminium bound with tannin in tea infusion Text. /S.B. Erdemoglu, S. Guser // Analytic. Science. -2005.-V.21.-P. 1005-1008.

112. Costa, L.M. Comparison of heating extraction procedures for Al, Ca, Mg and Mn in tea samples Text. / L.M. Costa, S.T. Gouveia, J.A. Nobrega // Analytic. Science. 2002. - V.18. - P. 313-318.

113. Карцова, JI. А. Электрофоретическое разделение чайных флавоноидов в режиме зонного капиллярного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии Текст. / Л.А. Карцова, О.В. Ганжа // Журн. приклад, химии. 2006. - №7. -Т.79.-С. 1120-1124.

114. Шатц, В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография: Основы теории. Методология. Применение в лекарственной химии Текст. / Шатц В. Д., Сахартова О. В. // Рига: Зинатне. 1988. С. 276 - 293.

115. Карцова, JI.A. Определение стероидов в биологических объектах методом мицеллярной электрокинетической хроматографии Текст. / JI.A. Карцева, Е.А. Бессонова // Журнал аналит.химии. 2007. - Т. 62. -№. 1.-С. 76-85.

116. Huang, H.-Y. Analyses of tobacco alkaloids by cation-selective exhaustive injection sweeping microemulsion electrokinetic chromatography Text. / H.-Y. Huang, S.-H. Hsieh // J. Chromatogr. A. 2007. Article inpress

117. Puig, P. Sample stacking for the analysis of penicillins by microemulsion electrokinetic capillary chromatography Text. / P. Puig, F. Borrull, C. Aguilar, M. Calull // J. Chromatogr. B. 2006. - V.831. - P. 196-204.

118. Huang, H.-Y. Anion-selective exhaustive injection-sweeping microemulsion electrokinetic chromatography Text. / H.-Y. Huang, W.-C. Lien, I-Y. Huang // Electrophoresis. 2006. - V. 27. - P. 3202 -3209.

119. Vuoresola, K. Determination of urinary catecholamines with capillary electrophoresis after solid-phase extraction Text. / K. Vuoresola, H. Siren // J. Chromatogr. A. 2000. - V.895. - P. 317-327.

120. Siren, H. Study of catecholamines in patient urine samples by capillary electrophoresis Text. / H. Siren, U. Karjalainen // J. Chromatogr. A. 1999. -V.853.-P. 527-533.

121. Bergquist, J. Catecholamines and methods for their identification and quantitation in biological tissues and fluids Text. / J. Bergquist, A. Sciubisz, A. Kaczor, J. Silberring // J. Neuriscience Methods. 2002. -V.113.-P. 1-13.

122. Siren, H. Capillary electrophoresis in the determination af anionic catecholamines metabolites from partients' urine Text. / H. Siren,

123. M. Mielonen, М. Herveli // J. Chromatogr. A. 2004. - V.1032. - P. 289297.

124. Kagedal, B. Catecholamines and metabolites Text. / B. Kagedal // J. Chromatogr. B. 1988. - V.429. - P. 117-233.

125. Розен В.Б. Основы эндокринологии Текст. / В.Б. Розен // М. 1994. -384 с.

126. Chen, D.-C. Determination of urine catecholamines by capillary electrophoresis with dual-electrode amperometric detection Text. / D.-C. Chen, D.-Z. Zhan, C.-W. Cheng, A.-C. Liu, C.-H. Chen // J. Chromatogr. B. -2001. V.750.-P. 33-39.

127. Nikolajsen, R.P.H. Analytical methods for determining urinary catecholamines in healthy subjects Text. / R.P.H. Nikolajsen, A.M. Hansen // Anal. Chim. Acta. 2001. - V.449. - P. 1 -15.

128. Hatumi, T. Simultaneous determination of serotonin, N-acenylseratonin and melatonin in the pineal gland of the juvenile golden hamster by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection Text. /

129. Т. Hatumi, Н. Akutsu, Sh. Matsushima // J. Chromatogr. B. 1996. - V.675. -P. 152-156.

130. Ummadi, M. Use of capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence for attomole detection of amino acids Text. / M. Ummadi, B.C. Weimer // J. Chromatogr. A. 2002. - V.964. - P. 243-253.

131. Volin, P. Determination of free urinary catecholamines by highperformance liquid chromatography with electrochemical detection Text. / P. Volin //J. Chromatogr. B. 1994. - V.655. - P. 121-126.

132. Shen, Z. Rapid method for the determination of amino acids in serum by capillary electrophoresis Text. / Z. Shen, Z. Sun, L. Wu, K. Wu, S. Sun, Z. Huang // J. Chromatogr. A. 2002. - V.979. - P. 227-232.

133. Su, S.C. Determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning by micellar electrokinetic chromatography Text. / S.C. Su, S.S. Chou, P.C. Chang, D.F. Hwang // J. Chromatogr. B. 2000. - V.749. -P. 163-169.

134. Krizek, M. Determination of seven biogenic amines in foods by micellar electrokinetic chromatography Text. / M. Krizek, T. Pelikanova // J. Chromatogr. A. 1998. - V.815. - P. 243-250.

135. Chiu, T.-Ch. Analysis of biologically active amines by CE Text. / T.-Ch. Chiu, Y.-W. Lin, Y.-F. Huang, H.-T. Chang // Electrophoresis.2006. V. 27. - P. 4792 - 4807.

136. Карцова, Л.А. Электрофоретическое определение биогенных аминов в биологических жидкостях Текст. / Л.А. Карцова, А.А. Сидорова, А.С. Иванова // Журнал аналит.химии. 2007. - Т. 62. - №. 10. -С. 1066-1072.

137. Riggin, R.M. Determination of catecholamines in urene by reversed-phase liquid chromatography with electrochemical detection Text. / R.M. Riggin, P.T, Kissinger // Analytic. Chem. 1997. - V.49. - P. 2109-2 111.

138. Chan, E.C.Y. HPLC assay for catecholamines and metanephrines using fluorimetric detection with pre-columne 9-fluorenylmethyloxy-carbonyl chloride derivatization Text. / E.C.Y. Chan, P.Y. Wee, O.Y. Ho // J. Chromatogr. B. 2000. - V.749. - P. 179-189.