Совершенствование электрофоретического и хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербурге кий государственный у ниве ренте!

На правах рукописи

ХМЕЛЬНИЦКИЙ ИВАН КОНСТАНТИНОВИЧ

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЭЛ ЕКТРО ФО РЕТИ Ч Е С КОГО И X1' О М АТОГРА ФИЧЕ С К ОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОДО- И ЖИРОРАСТВОРИМЫХ

ВИТАМИНОВ

Специальность02,00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических на™

□озоввбвв

Сан кт-11 стер бу р г 2007

У

003066586

Работа выполнена Fia кафедре органическом химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Карпова Людмила Алексеевна

Официальный оппоненты:

доктор химических наук, профессор Калинкип Игорь Петрович

доктор химических наук, профессор Яшин Яков Иванович

Ведущая организация:

Российская Boei и го-меди пинская академия им. С.М. Кирова

Зашита состоится 25 октября 2007 г. в 16 ч 30 мин

на заседании диссертационного совета Д 212,232.37 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, Большая физическая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан С й W t j< j 2007

г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

/А.Г. Папсуева/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

Контроль содержания витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и 5иологических жидкостях крайне важен, т к нарушение регуляции процессов обмена и развитие различных патологий (гипо- и гипервитаминозы) часто связаны с недостаточным или «быточным их поступлением в организм

Для обнаружения витаминов наибольшее распространение получили хроматографические, шектросколические и иммунологические методы, а в последние годы - и электрофоретические

Несмотря на значительное количество опубликованных работ в этом направлении, ряд проблем остается нерешенным определение водо- и жирорастворимых витаминов из одной гробы в одном аналитическом цикле, выяснение возможностей капиллярного зонного »лектрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе для решения данной задачи, гоиск и характеристика сорбентов для капиллярной электрохроматографии при определении зитаминов, использование различных путей on-line концентрирования при их совместном определении

Ответы на эти вопросы позволили бы определить стратегию выбора аналитического метода при анализе витаминов в природных объектах в зависимости от конкретно решаемой вдачи Этому и посвящено диссертационное исследование

Работа поддержана грантом «Развитие научного потенциала высшей школы» [подпрограмма «Исследование новых сорбционных материалов для хроматографии и иекгрохроматографии методом твердофазной микроэкстракции») и гранта РФФИ № 07-03-D1001-a

Цель работы Выяснение возможностей и ограничений новых вариантов кроматографического и электрофоретического определения водо- и жирорастворимых витаминов

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи

1 На модельных смесях водо- и жирорастворимых витаминов установить закономерности их раздельного и совместного хроматографического (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ, ЭОТСХ) и электрофоретического (КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ) определения

2 Выявить влияние мицелл додецилсульфата натрия (ДЦСН) на селективность разделения витаминов методами мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и обращенно-фазовой ВЭЖХ

3 Осуществить on-line концентрирование для снижения пределов обнаружения водорастворимых витаминов при их групповом определении методом МЭКХ

4 Исследовать возможности капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и капиллярной

электрохроматографии (КЭХ) на микрочипе с флуориметрическим детектированием для селективного определения рибофлавина и его производных

5 Получить сорбционные характеристики неподвижных фаз для капиллярной электрохроматографии методом твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ)

6 Предложить схемы хроматографического и электрофоретического определения водо-и жирорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах (соки, пиво) и биологических объектах (моча) методами МЭКХ, ВЭТСХ и ВЭЖХ

В работе использовались следующие методы газовая хроматография (ГХ) и обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ), высокоэффективная и электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ), капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и капиллярная электрохроматография (КЭХ), в том числе на микрочипе, а также мицеллярная (МЭКХ) и микроэмульсионная электрокинетическая хроматографии (МЭЭКХ)

Научная новизна

Установлены закономерности хроматографического и электрофоретического определения водо- и жирорастворимых витаминов, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий разделения сложных смесей этих соединений в режимах мицеллярной ОФ ВЭЖХ и ВЭТСХ, а также мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ)

Разработан вариант мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии с денситометрическим детектированием с использованием фракционного элюирования для совместного определения водо- (Вь В2, В3, Be, В12 и С) и жирорастворимых (А и Е) витаминов

Предложена методика селективного определения рибофлавина и его производных в режиме капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе с флуориметрическим детектированием (пределы обнаружения 12-21 нг/мл)

Исследованы возможности метода электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭОТСХ) при разделении водорастворимых витаминов

Предложен вариант одновременного определения водорастворимых витаминов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с использованием on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля и динамический скачок рН), позволяющий снизить пределы обнаружения в 40-100 раз

Практическая значимость работы

Предложен способ определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах (соках, пиве) методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (боратный буфер, рН 9,18; 80 мМ ДДСН) с УФ-детектированием (предел обнаружения - 5 - 57 нг/мл)

Разработан вариант совместного определения водо- (Вь В2, В3, В6, В!2 и С) и жирорастворимых витаминов (А и Е) в фармацевтических препаратах методом мицеллярной ВЭТСХ с использованием водно-органического (ацетонитрил) растворов додецилсульфата натрия (ДЦСН) с концентрацией последнего 10 мМ

Отработана методика селективного определения рибофлавина и его производных методом КЗЭ на полимерном микрочипе с флуориметрическим детектированием

Положения, выносимые на защиту

1 Результаты исследования влияния органических растворителей (метанол, ацетонитрил) и поверхностно-активного вещества (додецилсульфата натрия) в качестве составляющих рабочего буфера и подвижной фазы на эффективность и селективность электрофоретического и хроматографического разделения водо- и жирорастворимых витаминов в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), мицеллярной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)

2 Способы электрофоретического и хроматографического определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и ОФ ВЭЛСХ с УФ-детектированием

3 Обоснование возможностей и преимуществ высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ) с использованием фракционного элюирования для одновременного определения водо- и жирорастворимых витаминов

4 Методика селективного определения рибофлавина и его производных в режиме капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе с флуориметрическим детектированием.

5 Одновременное определение водорастворимых витаминов в пищевых продуктах и моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с различными вариантами online концентрирования (стэкинг с усилением поля и с высокопроводящей матрицей, использование «водной пробки» и динамического скачка рН)

6 Стратегия выбора метода при определении водо- и жирорстворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях, хроматографическими и электрофоретическими методами

Публикации и апробация работы Материалы диссертации опубликованы в 1 статье и 11 тезисах докладов Результаты исследований докладывались на III Международном Симпозиуме

«100 лет хроматографии» (2003, Москва), Всероссийском симпозиуме «Хроматография хроматографические приборы» (2004, Москва), 29,h Int Symposium on Capillary Chromatograph; (2006, Riva del Garda, Italy), III научной сессии УНЦХ СПбГУ (2004, С-Петербург) Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химическю исследованиях» (2007, Москва); 30'h Int Symposium on Capillary Chromatography (2007, Dahan China), Научно-прикладном семинаре "Аналитические методы и приборы для химическогс анализа" (2007, Санкт-Петербург), XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химга (2007, Москва)

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, трех глав с обсуждением полученных результатов и практическим применением, выводов, приложения, списка сокращений и списка цитируемой литературы (221 наименование) Работа изложена на 182 страницах машинописного текста, содержит 19 таблиц и 58 рисунков

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования Отмечена перспективность использования мицеллообразующих добавок при определении водо- и жирорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях электрофоретическими и хроматографическими методами

1-я глава (Обзор литературных данных) включает разделы, обсуждающие биологические функции витаминов, физико-химические методы их исследования (иммунологические, хроматографические и электрофоретические)

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов и методов исследования.

В 3-й главе предметом обсуждения является оптимизация хроматографического и электрофоретического разделения водорастворимых витаминов (рис 1) при определении их методами МЭКХ и КЗЭ, ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и ЭОТСХ с УФ-детектированием

Рис. 1. Структурные формулы определяемых водорастворимых витаминов

Bi - тиамин хлорид, Вг - рибофлавин, Вз - никотинамид, В6 - пиридоксин, В12 - цианокобаламин, С -аскорбиновая кислота

После серии экспериментов в нормально-фазовом режиме с использованием элюирующих систем вода/метанол или вода/ацетонитрил были разделены все витамины этой группы Оптимальное содержание органического компонента составило 50% Однако уменьшить взаимодействие молекул витамина В1 с силанольными гидроксилами сорбента в этих условиях не удалось

Введение в состав элюента анионного ПАВ - додецилсульфата натрия (ЮмМ), способного

образовывать дополнительную

псевдостационарную фазу, позволило решить эту задачу (рис 2) Количественный анализ витаминов Вь В2, Вз, В6 и С выполнялся на видеоденситометре «Сорбфил» (ООО «Имид», Краснодар) Значения пределов обнаружения (поглощение X = 254нм) В1 - 0,2 мкг, В2 - 0,3 мкг (0,001 мкг флуоресценция X =365 нм), Вб - 0,5 мкг, В12 - 0,2 мкг и С - 0,2 мкг

Увеличения эффективности и сокращения времени анализа можно было бы достичь, приложив высокое напряжение к ТСХ-пластине (т н электроосмотическая тонкослойная хроматография, ЭОТСХ), что и было реализовано В этих условиях зоны витаминов группы В движутся с различной скоростью к катоду, а витамин С - к аноду (подвижная фаза - ацетонитрил/вода 8 2, по объему)

Как и предполагалось, общее время анализа оказалось меньше, а эффективность - выше (9000-7000 тт), чем в случае традиционного варианта высокоэффективной тонкослойной хроматографии (5000-7000 т т ) Тем не менее, предпочтение при решении этой задачи мы все-таки отдаем последней благодаря простому аппаратурному оформлению

Обнадеживающие результаты, достигнутые в мицеялярной ТСХ, инициировали и постановку серии экспериментов в мицеллярной ВЭЖХ этот метод характеризуется более низкими пределами обнаружения и большей пиковой емкостью Отметим, что возможности мицеллярного варианта ВЭЖХ для определения витаминов практически не исследованы

В серии предварительных экспериментов в изократическом режиме с использованием элюирующих систем, выбранных ранее, с добавкой 0,1 %-ного раствора муравьиной кислоты, но в отсутствии ПАВ, достичь приемлемого разрешения не удалось

Введение додецилсульфата натрия (8 мМ) увеличило сродство наиболее гидрофильных

Рис 2 Зависимость факторов удерживания витаминов группы В от концентрации ДЦСН в системе вода/ацетонитрил (1 1)

компонентов к обращенной фазе и привело к полному их разделению (Рис 3 )

Рис. 3.. Хроматограмма стандартной смеси водорастворимых витаминов Условия анализа хроматограф «Gilson», УФ-детектор (254 им), колонка Supelco С18 150x3 мм (3 мкм), подвижная фаза метанол/0,1 %-ный раствор муравьиная кислота (10 90) с добавкой 8 мМ ДДСН, скорость элюирования 1 см/мин, объем вводимой пробы 20 мкл

При электрофоретическом разделении водорастворимых витаминов наличие мицелл в составе рабочего буфера также оказалось принциальным От зонного варианта при необходимости определения всех важнейших витаминов нам пришлось отказаться, т к никотинамид (витамин В3) элюируется вместе с электроосмотическим потоком

Переход к мицеллярному режиму (МЭКХ) обеспечил полное разрешение как ионных, так и нейтральных компонентов (Рис 5а) Изучена зависимость подвижностей

водорастворимых витаминов от концентрации ДДСН в рабочем буфере (Рис 4) Электрофоретическая подвижность витамина В1 с ростом концентрации детергента заметно снижается благодаря большому сродству к мицеллам Эта же тенденция, но в меньшей степени, наблюдается для пиридоксина и никотинамида, что

Концентрация ДДСН, мМ Рис 4. Зависимость подвижностей водорастворимых витаминов от концентрации мицеллообразующего агента (ДДСН) в режиме МЭКХ

позволило отделить последний от ЭОП Изучены возможности метода микроэмульсионной электрокинетической хроматографии при разделении водорастворимых витаминов (МЭЭКХ) (рис 56)

МЭЭКХ (б) «Капель 1ОЗР» Гидродинамический ввод пробы ЗОмбар, 20 с Напряжение 25 кВ Буферный электролит а) 30 мМ тетраборат натрия, рН 9,18,80 мМ ДДСН, б) 1,36 % - гептан, 3,0 % - ДЦСН, 9,72 % - бутанол, 86 % - 5 мМ тетраборат, рН 9,2) УФ-детекгор (к = 254нм) Ьмй, = 60 см, L.,44,=50 см

Пределы обнаружения витаминов (Bj - 92 нг/мг, Вз - 45 нг/мг, Вз - 140 (никотинамид) и 64 нг/мг (никотиновая кислота), Be - 460 нг/мг и С - 48 нг/мг) в режиме КЭ с УФ-детектированием оказались недостаточными для анализа реальных объектах (табл 2 )

Поэтому были апробированы следующие варианты on-line концентрирования стэкинг с усилением поля, стэкинг с высокопроводящей матрицей, использование «водной пробки» и динамический скачок рН В основе каждого лежит определенный механизм концентрирования, обусловленный различием свойств раствора пробы и рабочего электролита

Наименьшие пределы обнаружения получены при использовании стэкинга с усилением поля (ввод пробы 6000 мбар*с, достигнутая степень концентрирования - 42-54) При понижении рН пробы до 5 0 удалось еще в 1,5-2 раза снизить эту величину для витаминов ЕЬ, В$ и С (Табл 1)

Рибофлавин (РФ) Флавин мононуклеотид (ФМН) Аденин-флавин динуклеотид (ФМН)

Рис. 6. Структурные формулы флавинов

Таблица 1. Факторы концентрирования (ЭЕР,,) и пределы обнаружения водорастворимы;

витаминов в режиме МЭКХ (п=5, Р=0,95)

Вариант концентрирования Определяемые компоненты

в, В2 В3 амид ВзКИСЛ В« С

Стэкинг с усилением поля ЭЕРь 45±1 42±2 50±2 54±2 42±3 47±2

ПО, нг/мл 20±0,5 11±0,5 28±1,1 12±0,7 110±3 10±0,4

Матрица пробы - 5 мМ борат, рН=9,18 Ввод пробы - 6000 мбар*с

Стэкинг с высокопрово дядей матрицей ЭЕРь 23±1 25±2 19±1 22*3 76*2 21 ±1

ПО, нг/мл 40±2 18±1 74±4 29±3 177±7 23±3

Матрица пробы - 30 мМ борат рН=9,18,50 мМ ЫаС1 Ввод пробы - 2000 мбар*с

Стэкинг с «водной пробкой» ХЕР), 32±3 25±2 26±1 27±3 32±2 30±1

ПО, нг/мл 29±3 ]8±1 54*2 24*3 144±9 16±1

Матрица пробы - 30 мМ борат, рН=9,18 Ввод пробы - 3000 мбар*с

Динамический рН скачок «ЕЯь 40±2 98±1 46*3 61±2 81±1 74±2

ПО нг/мл 23±1 5,3±0,2 30±2 10±0,3 57±1 6Д±0,2

Матрица пробы -10 мМ фосфат, рН=5,0 Ввод пробы - 6000 мбзр*с

5ЕР = - • Д где йяиь - высота пика при концентрировании, Ьа. - высота пика при обычных условиях

' К

ввода пробы (2с), Д - доля разбавления

Наряду с одновременным определением всей группы водорастворимых витаминов в биологических жидкостях, фармацевтических препаратах и пищевых продуктах весьма актуальной остается задача поиска высокоселективного метода обнаружения индивидуальных компонентов Это в существенной степени относится к рибофлавину (витамину В2) и его производным (флавин мононуклеотиду и флавин-аденин динуклеотиду) (рис б) Указанные соединения являются факторами роста, антиоксидантами, участвуют в тканевом дыхании, обмене АТФ и нейротрансмиттеров, и при этом содержатся в природных объектах в низких концентрациях Существенно и то обстоятельство, что флавины и продукты их метаболизма в отличие от других биологически активных соединений (включая витамины) флуоресцируют при Ь=470 нм, что позволяет обеспечить их количественное определение в составе сложных матриц природного происхождения Именно поэтому для выяснения возможности вариантов КЗЭ и КЭХ в чип-формате с флуоресцентным детектированием была выбрана эта модель

Использовался макет микрофлюидной аналитической системы (разработанный в ЦМИД СПбГЭТУ), в которой реализован метод высокоэффективного капиллярного электрофореза на

пленарном полимерном микрочипе. Для регистрации результатов электрофоре] ического разделения использовался детектор, основанный на принципе флуоресценции. Излучение сверхярко! о светоднода {к = 470 нм) достигало детектируемой области с помощью оптоволокна.

Ввод пробы осуществлялся с помощью инжекционного креста. Разделение осуществлялось в сепарационном капилляре (1000 В) (рис. 7).

микрочипа.

1. Подложка из 11ММА. 2. Отверстие в подложке 3, Фоторезист, 4.Резервуары а фоторезисте. 5. Каналы в фоторезисте. б. Канал аля позиционировали» отоволокна. 7. Углеродный композитный материал. 8. Крышка из I 1ММА. 9. Резервуары в крышке. 10. Оргто волоки о.

Рис. 8. Разделение ф л ami нов в режиме КЗЭ на микрочипе

Условна электрофорстичеокого разделения 10 мМ боратншй буфер с рН й.5, напряжение приложенное к сил ара иконному каналу 10Ш В. рН пробы 5,0. Флуоресцентное детектирование а = 470 ни),

При снижении pll пробы ид 3-4 единицы меньше, чем рН буферного электролита заметно возрастает эффективность н селективность разделения благодаря концентрированию анали зов на границе зоны пробы н буферного электролита за счет градиент а рН (динамический скачок рН) (Рис 8). Пределы обнаружения лля рибофлавина, ФМН и ФАД составили i2, 16 и 21 иг/мл, соответственно, что сопоставимо с данными, полученными н режиме ВЭЖХ и М'ЖХ с использованием on-line концентрирования.

На згой же модельной системе были выяснены возможности метода капиллярной электрохроматографии (КЭХ), сочетающей достоинства Ю и ВЭЖХ. В связи с этим одной из важнейших задач явился выбор сорбентов для электрохром атографин, обеспечивающих электроосмотический поток.

В режиме проточной твердофазной микроэкстракции ( !ФМ1) получены еорбционные характеристики серии сорбентов (сил и нагеля, обращенно-фазового сорбента (С! К); ДБ-24-К-8; фуллерсна С«,; фуллерена, мо дн ф и инрованнога ДБ-24-К-8 и акриламидного монолита) на примерах стандартных смесей простейших ароматических углеводородов и фено лов (Рис. 9).

Рис 7. Конструкция полимерного

CQ О

И

С

этнпбенэол — о-*вв»л

Пропускаемый объем, мл

CQ 2оо йй г

i:

Пропускаемый объем, мл

m

ж г

m §

s

3 40 о

s w

t-o-KcwKyj

д

Пропускаемый объем, мл

«а

2

I "

ё *

—•—бензол

Пропускаемый объем, мл

Рис. 9. Достижение равновесного режима сорбции паро-газовой смеси, содержащей бензол, толуол, этилбензол, о-ксилол при использовании микроконцентратора, заполненного а) 10% Cm на Инертоне N-AW, б) 10% ДБ-24-К-8 на Инертоне N-AW, в) 10% ДБ-24-К-8 + 10% С<» на Инертоне N-AW, г) С18, д) силикагелем, е) акриламидным монолитом

Силикагель, обращенно-фазовый сорбент и акриламидный полимер, способные наряду с достаточной сорбционной емкостью обеспечивать и электроосмотический поток, были испытаны в качестве сорбентов для электрохроматографии

Сорбционные материалы на основе С60 и краун-эфира могут быть использованы как для концентрирования, так и в качестве неподвижных фаз для газохроматографического определения

органических веществ, содержащих ароматические и гидрокси-группы, что было проиллюстрировано нами на примере количественного определения никотинамида и никотиновой кислоты в водных растворах (Рис 10) Пределы их обнаружения составили ~ 0 1 мг/л, что на порядок уступает соответствующим значениям, полученным для тех же соединений в режимах КЭ (с on-line концентрированием) и ОФ ВЭЖХ

Рис. 10. Хроматограмма десорбата никотинамида и никотиновой кислоты с использованием плоского концентратора, заполненного 10 % мае ДБ-24-К-8 на инертоне N-AW Колонка 10% С<» на инертоне N-AW Ткодоикй ~ 180, Тиспарителя — 250, Tnew = 200 °С Детектор ионизационно-пламенный

&4mV I I I I ВЗамид ВЗкислота

rhl

* in is »

Колонки для электрохроматографии на основе силикагеля (Кготазй-НО, 5 мкм> и

обращенно-фазового сорбента (Диасфер-110-С18, 5 мкм) получали различными способами в

сепарационном канале полимерного микрочипа.

^лл Другое решение - использование

ил нн монолитных колонок, получаемых ж /

н/ ^<хон непосредственно в капилляре Полимеризация

2-(акрилоипамино)-3- велась из гомогенного раствора мономера и

метилбутановая кислота сшивателя в водном спирте В качестве Пентаэритрш-

триакрилат

мономера использовался 2-(акрилоиламино)-3-метилбутановая кислота (акрилоилвалин), а в качестве сшивателя - пентаэритрит отрисакрилат

Таблица 2. Параметры электрохроматографического разделения

Дивна колонки, см Эффективность (N), число т.т Разрешение (Rs) Время анализа, с

РФ ФАД ФМН РФ/ФАД ФАД/ФМН

КЗЭ 65500 82900 121100 2,7 1,5 3

Силикагель 1,9 7900 15100 24100 1,2 0,9 6

C18 1,7 15000 26900 38300 1,6 1,2 9

Акриламидный монолит 2,5 53400 54900 76500 2,7 1,9 10

Состав рабочего буфера (10 мМ боратный буфер с рН 8,5) для КЭХ был тот же, что и в случае КЗЭ При переходе от КЗЭ к КЭХ для всех сорбентов увеличилось время анализа, а

13

лучшей разрешающей способностью характеризуется акриламидный монолит (табл 2)

В 4-ой главе обсуждаются результаты хроматографического и электрофоретического определения жирорастворимых витаминов (рис И) (ВЭТСХ, ВЭЖХ и КЭ), а также выяснение возможностей их совместного определения с водорастворимыми витаминами

СКа <¡"3

« «

Ретинол (Витамин А)

Ретинил ацетат (Витамин А) Ретинил пальм итат (Витамин А)

а-токоферол (Витамин Е) а-токоферол ацетат (Витамин Е) Холекальциферол (Витамин 03)

Рис 11. Структурные формулы жирорастворимых витаминов

В результате предварительных экспериментов по оптимизации условий разделений витаминов (ретинола, ретинил ацетата, а-токоферол, а-токоферил ацетата, холекальциферола и ретинил пальмитата) методом ОФ ВЭЖХ удалось достигнуть приемлемого разрешения в градиентном режиме с использованием элюирующей системы метанол/ацетонитрил (Рис 12)

Рис 12. Хроматограмма стандартной смеси

а §

А

< Ы

и

J

и

жирорастворимых витаминов в режиме ВЭЖХ Условия анализа хроматограф «Gilson», УФ детектор (289 нм), колонка Supelco С18 150x3 мм (3 мкм), подвижная фаза А - метанол, В - ацетонитрид Режим градиента: 1-5 мин - 100 % А, 5- 25 мин до 40 % А , скорость элюирования 1 см/мин, объем вводимой пробы 20 мкл

При электрофоретическом определении жирорастворимых витаминов, существенно отличающихся по своей гидрофобности от водорастворимых, был выбран режим с обращенной полярностью (ввод пробы с катодного конца) в кислой среде (рН 2 0), определяемые компоненты элюировались в порядке снижения гидрофобности Однако полного разделения в этих условиях достичь не удалось Для этой цели был выбран метод микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) - метода, рекомендованный, в первую очередь, для гидрофобных

аяалитов. С ¡»став микроэмульсии: 1,36 % - гептан, 3,0 % - ДДСН, 9J2 % - бутанол, 86 % 10 мМ фосфат, рМ 2.0. Эффективность разделения и разрешение в этом случае оказались значительно выше, чем в М'ЖХ (Рис, i 3}.

N.

т.г./ч

мэкх

мээкх

а)

Рис 13. Значения (а) эффективности (N) и (б) факторов разрешения (Rs> При разделении жирорастворимых витаминов в режимах МЭКХ к МЭЭКХ (т.т,/ч\.

Специальной задачей, решаемой в данной работе, явилось выяснение возможности совместного хромато графического и/ или чдектрофоретическо) о определения подо- и жирорастворимых витаминов- Сильное различие химических структур затрудняет одновременное определение этих соединений в одной элюирующей системе. Для этой цели нами был предложен вариант фракционного эяюирования методом ВЭТСХ. Первой Подвижной фазой служил хлороформ. в качестве второго элюента исадльаоваяи систему вода-ацетонитрнл (1.1) с добавкой мшеллообразующего аг ента -' 10 мМ ДДСН (Рис 14),

Разделение большею ассортимента витаминов (тиамин, рибофлавин, флавин мононуклеотид, irn коти нам ид, пиридоксин, аскорбиновая кислота, фодневаи кислота, ретинол, ретин ил ацетат, токоферол, токоферил ацетат, холекальциферол) удалось выполнить методом ОФ ВЭЖХ (рис. 15) в градиентном режиме. Первыми - выходят наиболее гидрофильные (водорастворимые витамины), а затем уже с увеличением элюирующей силы - гидрофобные (жирорастворимые) компоненты.

Имеются сообщения о перспективности метода мнкроэмудьсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) для определения водо- и жирорастворимых витаминов. В случае МЭЭКХ при разделении использовали те же условия, что и для водорастворимых витаминов (положительная полярность и рИ 9,18). Несмотря на то, что эффективность оказалась выше, чем н режиме ОФ ВЭЖХ, время анализа составило почти I ч (рис, ¡6),

вз

©

В2

®

В1

®

В12

Рис. 14 Совместное определение водо- (Вь В2, В3> В6, В12 С) и жирорастворимых витаминов (А и Е) методом ВЭТСХ Первый аяюент хлороформ Второй элюент вода-ацетонитрил (1 1) + 10 мМ ДДСН

Рнс 15. Хроматограмма стандартной смеси витаминов в режиме градиентной ОФ ВЭЖХ

Условия анализа хроматограф «СЬкоп», УФ-детектор (289 нм), колонка .$ире1со С18 150x3 мм (3 мкм), подвижная фаза А -метанол, В - 0,1 %-ный раствор муравьиной кислоты Режим градиента 1-2 мин - 5 % А, 3 - 10 мин до 15 % А, 10 -18 мин до 100 % А, 18 - 30 мин 100 % А, скорость элюирования 1 см/мин, объем вводимой пробы 20 мкл

вз

Вб

В1

ш

Результаты по

оптимизации условий

разделения водо- и

жирорастворимых витаминов и их количественному

определению позволили

сопоставить используемые в данной работе методы (табл 3)

При разделении

водорастворимых витаминов МЭКХ превосходит другие методы (ВЭЖХ, МЭЭКХ, ТСХ) по эффективности и характеризуется наименьшим временем анализа. В случае ОФ ВЭЖХ максимален линейный диапазон и самый низкий предел обнаружения (5-10 нг/мл) Использование оп-1те концентрирования в МЭКХ позволяет получить пределы обнаружения для витамины В2 и С, сопоставимые с ОФ ВЭЖХ

Метод ВЭТСХ, обеспечивая возможность совместного определения водо- и

'а * 4 а м и ими* и м » м « « « N « » о **

Рис 16 Элеетрофореграмма модельной смеси водо- и жирорастворимых витаминов в режиме МЭЭКХ «Капель 130Р» Гидродинамический ввод пробы 30 мбар, 20 сек Напряжение 25 кВ Буферный электролит 1 36 % - гептан, 3,0 % - ДДСН, 9,72 9> - бутанол, 86 % -10 мМ тетраборат, рН 9 18 Положительная полярность

жирорастворимых витаминов, может быть рекомендован для их обнаружения в фармацевтических препаратах

КЗЭ с флуоресцентным детектированием на микрочипе при определении витамина Вг и его производных характеризуется наименьшим временем анализа, а по пределам обнаружения сопоставим с ВЭЖХ и КЭ с on-line концентрированием

При анализе жирорастворимых витаминов предпочтителен метод ОФ ВЭЖХ, который характеризуется наименьшим временем анализа, максимальным линейный диапазоном и самыми низкими пределами обнаружения

Методы ОФ ВЭЖХ, МЭЭКХ и ВЭТСХ позволяют одновременно определять водо- и жирорастворимые витамины Наименьшим временем анализа и низкими пределами обнаружения характеризуется метод ОФ ВЭЖХ, а микроэмульсионный режим (МЭЭКХ) -наибольшей эффективностью

Таблица 3. Оценочные характеристики методов (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ), используемых при определении водо- и жирорастворимых витаминов

Параметр МЭКХ МЭЭКХ КЗЭ на чипе ОФВЭЖХ ВЭТСХ эотсх

Эффективность (т т) 200000250000 50000-150000 10001500 15000-20000 1000-7000 600010000

Линейный диапазон определяемых концентраций (мкг/мл) 0,05-5000 - 0 05500 0,005-5000 0,2-5000 -

Предел обнаружения (нг/мл) 5-15 - 15 5 1000 1000

Объем пробы 20 нл 20 нл 1 нл 20 мкл 1-50 мкл 1-50 мкл

Скорость потока (мкл/мин) 0,3 0,3 0,3 1000 - -

Время анализа (мин) 15 20 3 30 20-40 10-20

Вспомогательные процедуры (мин) 20 20 20 20 20 40

Возможность одновременного анализа нескольких образцов - - - - + -

Возможность одновременного анализа водо- и жирорастворимых витаминов - + - + + -

В 5-ой главе представлены возможности практического применения разработанных вариантов хроматографического и электрофоретического разделения водо- и жирорастворимых

витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях

Экстракция водорастворимых витаминов из тщательно измельченных фармацевтических препаратов осуществлялась 5-ти кратным объемом ОД М раствора НС1; супернатант фильтровали и дегазировали Количественный анализ витаминов (В1, Вз, Вз, В^ и С) выполнялся на высоэффективных пластинах с использованием видеоденситометра «Сорбфил» (производство ООО «Имид», Краснодар) УФ-детектирование при X = 254нм (Табл 4).

Таблица 4. Результаты количественного определения водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах (п=4, Р=0,95)

В1 В2 ВЗ В6 С

«Аэровит» В* 2,0 2 10,0 100 15

ВЭТСХ 2,1±03 1,96±0,07 10,0+0,1 94±7 13,7±0,3

МЭКХ 2,0±0,1 2,0±0,1 10,4+0,2 99±2 14,7±0,3

«Компливит» В 1 1,27 5 50 7,5

ВЭТСХ 1,02±0,07 1,2±0,1 5,96±0,1 53±6 7,6±0,6

МЭКХ 1,01±0,06 1,29+0,04 4,2+0,1 49+3 7,5+0,3

«Супрадин» в 20 5 10 150 50

ВЭТСХ 20,5±0,8 4,9+0,2 10,8±0,1 145±9 45±б

МЭКХ 19,4±0,7 5,1 ±0,3 10,8+0,1 152+6 49±3

«Гравитус» В 2 2 2 75 20

ВЭТСХ 1,98+0,04 2,04+0,05 1,97+0,07 73±4 19+3

МЭКХ 1,96+0,08 2,1+0,1 2,04±0,07 76±2 22±3

«Нейромультивит» В 100 - 200 - -

ВЭТСХ 97±5 - 193±5 - -

МЭКХ 102+3 - 201+2 - -

*В - указано производителем

Предложен вариант определение флавинов в моче пациента после приема препарата,

содержащего рибофлавин, методом ВЭТСХ с денситометрическим окончанием (>^=365 нм) (Табл 5).

Таблица 5. Результаты количественного определения рибофлавина в моче (п=4,

Р=0,95)

Время после приема препарата 1 ч Зч 6ч

Концентрация рибофлавина в моче, мкг/мл 9,6 + 0,8 3,1 ±0,5 1,2± 0,6

Методом МЭКХ осуществлено количественное определение водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах, соках и пиве (25 мМ боратный буфер (рН 9,18), содержащий 80

мМ ДДСН) (рис 17) В качестве референтного использовался метод ВЭЖХ с УФ-детектированием СГабл 6)

Таблица 6. Результаты количественного определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах (п=4, Р=0,95)

Содержание витамина, мкг/мл

в, в2 В3амид Вз кисл в6 С

Пиво «Туборг» МЭКХ - 9,4+1,2 12,4+1,2 - - -

ВЭЖХ - 10,4±0,5 12,4±1,2 - - -

Нектар из лесных ягод «Нектарника» МЭКХ - - 27 ±2 - 3±0,7 77±4

ВЭЖХ - - 25 + 4 - 2,4+0,6 72±3

Апельсиновый сок «Нико» МЭКХ - - - 2,1±0,5 - 453+12

ВЭЖХ - - - 2,9+0,7 - 431+23

Банановый сок «Нико» МЭКХ - 1,1±0,3 - 4,1±0,7 3,6±0,7 43±1

ВЭЖХ 1,2±0,7 - 4,3±0,8 3,3+0,4 49±8

Томатный сок «Нико» МЭКХ - - - 2,3±0,5 0,7±0,1 230±10

ВЭЖХ - - - 2,6±0,4 0,8+0,3 255*12

Количественное определение жирорастворимых витаминов в пищевом маргарине проводили методом ОФ ВЭЖХ с градиентным элюированием (рис 18, табл 7 )

Рис 18. Хроматограмма экстракта пищевого маргарина в режиме ВЭЖХ Условия анализа хроматограф «акоп», УФ детектор (289 нм), колонка 8ире1со С18 150x3 мм (3 мкм), подвижная фаза. А - метанол, В -ацетонигрил Режим градиента 1-5 мин - 100 % А, 5- 25 мин до 40 % А, скорость элюирования 1 ем/мин, объем вводимой пробы 20 мкл

Таблица 7. Результаты количественного определения жирорастворимых витаминов (А, Е, Из) в пищевых продуктах методом ВЭЖХ (п=4, Р=0,95)

А Е о3

Масло Уоишх, мкг/кг Н 7600±300 130±4 53±6

В 8000 120 50

Масло Каша, мкг/кг н 7900±200 420±20 68±3

в 8000 400 80

Масло МгшЬаМа, мкг/кг н 7800+200 28±3 96+7

в 8000 30 100

В — указанно производителем, Н — найдено

Выводы

1 Показана возможность совместного определения водо- (Вь Вз, Вз, В« и С) и жирорастворимых (А, Е) методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) в одном хроматографическом цикле при использовании фракционного элюирования первая подвижная фаза - хлороформ, вторая - вода/ацетонитрил с добавкой 10 мМ ДДСН

2 Установлено, что наличие мицелл додецилсульфата натрия в составе буферного электролита или подвижной является доминирующим фактором, определяющим селективность электрофоретического и хроматографического разделения водорастворимых витаминов в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ)

3 На основании полученных характеристик методом ТФМЭ сорбционные материалы на основе С« и ДБ-24-К-8 были использованы для концентрирования и газохроматографического анализа, а силикагель, обращено-фазовый сорбент и акриламидный монолит - в качестве неподвижных фаз для капиллярной электрохроматографии при определении витаминов

4 Отработана методика селективного определения рибофлавина и его производных в

режиме капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе с флуориметрическим детектированием (пределы обнаружения 12-21 нг/мл)

5 В соответствии с установленными закономерностями предложены схемы

• экспресс-определения водорастворимых витаминов (Вь В 2, В3, В6 и С) в фармацевтических препаратах методом ВЭТСХ

• электрофоретического определения водорастворимых витаминов в соках и пиве в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с использованием on-lme концентрирования,

• хроматографического определения жирорастворимых витаминов (А, Е и D3) в пищевом маргарине в режиме ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием,

6 Рекомендована стратегия выбора аналитического метода при определении витаминов различной природы в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях для определения водорастворимых предпочтителен вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с on-line концентрирование, жирорастворимых - ОФ ВЭЖХ, для совместного определения - градиентная ОФ ВЭЖХ и ВЭТСХ с фракционным элюированием

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Хмельницкий, И.К. Исследование сравнительных сорбционных характеристик фуллерена С® и дибензо-24-крауна-8 методами газовой хроматографии и твердо-фазной микроэкстракции [Текст] / И К Хмельницкий, Е Д Макаров, Л А Карцова // ЖПХ - 2006 - Т 79 - В 4 - С 578-582

2 Khmelnitskiy, I.K. Investigation of phenols sorption on sorbents contained crown ethers [Text] / LA Kartsova, ED. Makarov, IK Khmelmtsky H «100 Years of chromatography» 3rd International Symposium on Separations in Bio-Sciencies -Moscow, 13-18 May 2003 - P 185

3 Хмельницкий, И.К. Исследование сорбционных свойств углеродистых материалов и дибензо-24-краун-8 на твердых носителях и применение в микротвердофазной экстракции (тезисы доклада) [Текст] / Л А Карцова, Е Д Макаров, И К Хмельницкий // Всероссийский симпозиум" Хроматография и хроматографические приборы". - Москва, Клязьма, марта 2004 -С 143

4 Хмельницкий, И.К. Исследование сравнительных сорбционных характеристик фуллерена С60 и дибензо-24-крауна-8 методами газовой хроматографии и твердо-фазной микроэкстракции [Текст] / И К Хмельницкий, Е Д Макаров, Л А Карцова // Труды III научной сессии УНЦХ СПбГУ - С-Петербург, 2004 - С 224

5 Khmelnitskiy, I.K. Investigation of sorbtion properties of fullerene and silica sorbents using SPME [Text]/IK Khmelnitskiy, L A Kartsova, NA Pohkarpov // 29th International Symposium on Capillary Chromatogiaphy - Riva del Garda, Italy, May 29 - June 2 2006 - D11

6 Хмельницкий, И.К. Монолитные колонки для капиллярной электрохроматографии [Текст] / И К Хмельницкий, ИМ Зорин, ЕА Бессонова, ЛЛ Карцева // Всероссийский симпозиум "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях" -Москва, Клязьма, 23 - 27 апреля 2007 - С 89

7 Хмельницкий, И.К. Электрофорез на микрочипе для определения рибофлавина и его производных [Текст] / И К Хмельницкий, ТМ Зимина, В А Волкова, JIA Карцова // Всероссийский симпозиум "Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях" - Москва, Клязьма, 23 - 27 апреля 2007. - С 160

8 Khmelnitskiy, I.K. Determination of flavin in farmaceutical preparations and biological liquids by high performance thm-layer chromatography [Text] /LA Kartsova, IК Khmelnitskiy // 30th International Symposium on Capillary Chromatography - Dalian, China, - 5 - 7 June 2007 - P16-113

9 Khmelnitskiy, I.K. Determination of water-soluble vitamins by capillary electrophoresis m farmaceutical preparations [Text] / LA Kartsova, IK Khmelnitskiy, TV Pechenko // 30th International Symposium on Capillary Chromatography - Dalian! China, 5-7 June 2007 - P30-98

10 Хмельницкий, И.К. Одновременное определение водо- и жирорастворимых витаминов в пищевых продуктах и биологических жидкостях человека [Текст] / И К Хмельницкий // Научно-прикладной семинар "Аналитические методы и приборы для химического анализа" - С -Петербург, 29-31 августа 2007 - С 85-90

11 Хмельницкий, И.К. Разделение синтетических пищевых красителей в режиме электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭОТСХ) [Текст] / Л А Карцова, И К Хмельницкий, В Г Березкин, А В Алексеева, Т В Печенко // XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии - Москва, сентябрь 2007 - С 158

12 Хмельницкий, И.К. Разделение водорастворимых витаминов методами высокоэффективной тонкослойной хроматографии и электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭОТСХ) [Текст] / Л А Карцова, И К Хмельницкий, Березкин В.Г, Алексеева А В, Печенко ТВ// XVIII Менделеевский съезд по общей и прикладной химии - Москва, сентябрь2007 -С 157

Подписано к печати 18.09.2007. Формат 60x80 1/16 Бумага офсетная. Печать ризографическая Усл. печ л 1,0 Тираж 100 экз Отпечатано в Цифровом копировальном центре "Восстания-1 191036, Санкт-Петербург, ул Восстания, 1

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Общая характеристика витаминов.

1.2. Методы определения водо- и жирорастворимых витаминов.

1.2.1. Газохроматографическое определение витаминов.

1.2.2. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при определении витаминов.

1.2.2.1. ВЭЖХ определение жирорастворимых витаминов.

1.2.2.2. ВЭЖХ определение водорастворимых витаминов.

1.2.3. Определение витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

1.2.3.1. Методы детектирования в высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

1.2.3.2. Инструментальное оформление количественного анализа в ВЭТСХ.

1.2.3.3. Параметры удерживания в ТСХ, эффективносъ и селективность разделения.

1.2.3.4. Мицеллярная тонкослойная хроматография (МТСХ)

1.2.3.5. Определение жирорастворимых витаминов методом тонкослойной хроматографии.

1.2.3.6. Определение водорастворимых витаминов методом тонкослойной хроматографии.

1.2.3.7. Электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ).

1.2.4. Определение витаминов электрофоретическими методами.

1.2.4.1. Способы концентрирования при вводе проб ("стэкинг", "свипинг") в методах капиллярного электрофореза.

1.2.4.2. Эффективность, разрешение и селективность

разделения в МЭКХ.

1.2.5. Капиллярная электрохроматография.

1.3. Пробоподготовка биологических объектов при хроматографическом определении витаминов.

1.3.1. Пробоподготовка при определении жирорастворимых витаминов.

1.3.2. Пробоподготовка при определении водорастворимых витаминов.

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Аппаратура.

2.2. Вспомогательные устройства и материалы.

2.3. Подготовка стандартных растворов к анализу.

2.4. Методы исследования.

2.4.1. Капиллярный электрофорез с УФ-детектировапием.

2.4.2. Высокоэффективная жидкостная хроматография с УФ-детектированием.

2.4.3. Электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ).

2.4.4. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ).

2.4.5. Проточная твердофазная микроэкстракция с последующим газохроматографическим анализом.

2.4.6. Капиллярный электрофорез и капиллярная электрохроматография на микрочипе.

2.4.6.1. Процедура изготовления полимерного микрочипа.

2.4.6.2. Изготовление колонок для электрохроматографии па микрочипе.

2.4.6.3. Получение монолитных акриламидных сорбентов в канале микрочипа.

ГЛАВА 3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ.

3.1. Определение водорастворимых витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

3.2. Разделение водорастворимых витаминов в режиме электроосмотической тонкослойной хроматографии (ЭОТСХ).

3.3. Определение водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

3.4. Определение водорастворимых витаминов методоми капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетнческой хроматографии.

3.4.1. On-line концентрирование водорастворимых витаминов при их электрофоретическом определении.

3.5. Определение рибофлавина и его коэнзимов методом капиллярного зонного электрофореза на мнкрочнпе с флуоресцентным детектированием.

3.5.1. Сорбенты для капиллярной электрохроматографии.

3.5.2. Капиллярная электрохроматография на микрочипе.

3.6. Проточная твердофазная микроэкстракция никотннамида и никотиновой кислоты с последующим газохроматографическнм анализом.

ГЛАВА 4. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ.

4.1. Определение жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

4.2. Определение жирорастворимых витаминов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).

4.3. Определение жирорастворимых витаминов мицеллярной электрокинетнческой (МЭКХ) и мицеллярной микроэмульсионной хроматографией (МЭЭКХ).

4.4. Одновременное определение водо- и жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.

4.5. Сравнительный анализ методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ при определении водо- н жирорастворимых витаминов.

ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ.

5.1. Количественное определение водорастворимых витаминов (В(,

В2, В3, В6 и С) в фармацевтических препаратах методом ВЭТСХ.

5.2. Количественное определение водорастворимых витаминов (Bi,

В2, В3, В6 и С) в пищевых продуктах методом МЭКХ.

5.3. Количественное определение жирорастворимых витаминов (А,

Е, D3) в пищевых продуктах методом ВЭЖХ.

ВЫВОДЫ.

Контроль содержания витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях крайне важен, т.к. нарушения регуляции процессов обмена и развитие различных патологий (гипо- и гипервитаминозы) часто связаны с недостаточным или избыточным их поступлением в организм.

Для обнаружения витаминов наибольшее распространение получили хроматографические, спектроскопические и иммунологические методы, а в последние годы - и электрофоретические.

Несмотря на значительное количество опубликованных работ в этом направлении, остается нерешенным ряд проблем:

• определение водо- и жирорастворимых витаминов из одной пробы в одном аналитическом цикле;

• выяснение возможностей капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии в чип-формате для решения этой задачи;

• поиск и характеристика сорбентов для капиллярной электрохроматографии при определении витаминов;

• использование различных путей on-line концентрирования при их совместном определении.

Ответы на эти вопросы позволили бы определить стратегию выбора аналитического метода при анализе витаминов в природных объектах в зависимости от конкретно решаемой задачи. Этому и посвящено диссертационное исследование.

Работа поддержана грантом «Развитие научного потенциала высшей школы» (подпрограмма «Исследование новых сорбционных материалов для хроматографии и электрохроматографии методом твердофазной микроэкстракции») и гранта РФФИ № 07-03-01001-а.

Цель работы: Выяснение возможностей и ограничений хроматографического и электрофоретического определения водо- и жирорстворимых витаминов.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. На модельных смесях водо- и жирорастворимых витаминов установить закономерности их раздельного и совместного хроматографического (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ, ЭОТСХ) и электрофоретического (КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ) определения.

2. Выявить влияние мицелл додецилсульфата натрия (ДДСН) на селективность разделения витаминов методами мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и обращенно-фазовой ВЭЖХ.

3. Осуществить on-line концентрирование для снижения пределов обнаружения водорастворимых витаминов при их групповом определении методом МЭКХ.

4. Исследовать возможности капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и капиллярной электрохроматографии (КЭХ) на микрочипе с флуориметрическим детектированием для селективного определения рибофлавина и его производных.

5. Получить сорбционные характеристики неподвижных фаз для капиллярной электрохроматографии методом твердофазной микроэкстракции (ТФМЭ).

6. Предложить схемы хроматографического и электрофоретического определения водо- и жирорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах (соки, пиво) и биологических объектах (моча) методами МЭКХ, ВЭТСХ и ВЭЖХ.

В работе использовались следующие методы: газовая хроматография (ГХ) и обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ ВЭЖХ); высокоэффективная и электроосмотическая тонкослойная хроматография (ЭОТСХ), капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) и капиллярная электрохроматография (КЭХ), в том числе на микрочипе, а также мицеллярная (МЭКХ) и микроэмульсионная электрокинетическая хроматографии (МЭЭКХ).

На защиту выносятся следующие положения:

1. Результаты исследования влияния органических растворителей (метанол, ацетонитрил) и поверхностно-активного вещества (додецилсульфата натрия) в качестве составляющих рабочего буфера и подвижной фазы на эффективность и селективность электрофоретического и хроматографического разделения водо- и жирорастворимых витаминов в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), мицеллярной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

2. Способы электрофоретического и хроматографического определения водорастворимых витаминов в пищевых продуктах методами мицеллярной электрокинетической хроматографии и ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием.

3. Обоснование возможностей и преимуществ высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ) с использованием фракционного элюирования для одновременного определения водо- и жирорастворимых витаминов.

4. Методика селективного определения рибофлавина и его производных в режиме капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе с флуориметрическим детектированием.

5. Одновременное определение водорастворимых витаминов в пищевых продуктах и моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с различными вариантами on-line концентрирования (стэкинг с усилением поля и с высокопроводящей матрицей, использование «водной пробки» и динамического скачка рН).

6. Стратегия выбора метода при определении водо- и жирорстворимых витаминов в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях, хроматографическими и электрофоретическими методами.

выводы

1. Показана возможность совместного определения водо- (Вь В2, В3, В6 и С) и жирорастворимых (А, Е) методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) в одном хроматографическом цикле при использовании фракционного элюирования: первая подвижная фаза -хлороформ; вторая - вода/ацетонитрил с добавкой 10 мМ ДДСН

2. Установлено, что наличие мицелл додецилсульфата натрия в составе буферного электролита или подвижной является доминирующим фактором, определяющим селективность электрофоретического и хроматографического разделения водорастворимых витаминов в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) и высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

3. На основании полученных характеристик методом ТФМЭ сорбционные материалы на основе Сбо и ДБ-24-К-8 были использованы для концентрирования и газохроматографического анализа, а силикагель, обращено-фазовый сорбент и акриламидный монолит - в качестве неподвижных фаз для капиллярной электрохроматографии при определении витаминов.

4. Отработана методика селективного определения рибофлавина и его производных в режиме капиллярного зонного электрофореза и капиллярной электрохроматографии на микрочипе с флуориметрическим детектированием (пределы обнаружения 12-21 нг/мл).

5. В соответствии с установленными закономерностями предложены схемы:

• экспресс-определения водорастворимых витаминов (В], В2, В3, Вб и С) в фармацевтических препаратах методом ВЭТСХ.

• электрофоретического определения водорастворимых витаминов в соках и пиве в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с использованием on-line концентрирования;

• хроматографического определения жирорастворимых витаминов (А, Е и D3) в пищевом маргарине в режиме ОФ ВЭЖХ с УФ-детектированием;

6. Рекомендована стратегия выбора аналитического метода при определении витаминов различной природы в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах и биологических жидкостях: для определения водорастворимых предпочтителен вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с on-line концентрирование; жирорастворимых - ОФ ВЭЖХ; для совместного определения - градиентная ОФ ВЭЖХ и ВЭТСХ с фракционным элюированием.

1. Морозкина, Т. С. Витамины Текст.: Краткое руководство для врачей и студентов медедицинских, фармацефтических и биологических специальностей / Т. С. Морозкина, А. Г. Мойсеёнок. Мн.: ООО «Асар», 2002. - 112 с.

2. Березовский, В.М. Химия витаминов Текст. / В.М. Березовский. М: «Пищевая промышленность», 1973. - 634 с.

3. Eitenmiller, R. R. Vitamin analysis for the health and food sciences Text. / R. R. Eitenmiller, W. O. Landen. New York: CRC Press LLC, 1999. - p.

4. De Leenheer, A. P. Modern Chromatographic Anaylsis of the Vitamins Text. / A. P. De Leenheer, W. E. Lambert, M. G. M. DeRuyter. New York: Marcel Dekker, 1985.-p.

5. Davidek, J. Gas-liquid chromatography of vitamins in foods: the fat-soluble vitamins Text. / J. Davidek, J. Velisek. // J. Micronutr. Anal. 1986. - V. 2. -P. 81.

6. Smidt, C. R. Gas chromatography of retinol and a-tocopherol without derivatization Text. / C. R. Smidt, A. D. Jones, A. J. Clifford. // J. Chromatogr. 1988. - V. 434. - P. 21.

7. Ulberth, F. Simultaneous determination of vitamin E isomers and cholesterol by GLC Text. / F. Ulberth / /J. High Res. Chromatogr. 1991. - V. 14. - P. 343.

8. Liebler, D. C. Gas chromatography-mass spectrometry analysis of vitamin E and its oxidation products Text. / D. C. Liebler, J. Aburr, J. L. H. Amy. // Meth. Enzymol. 1999. - V. 299. - P. 309-318.

9. Silva, F. O. Total ascorbic acid determination in fresh squeezed orange juice by gas chromatography Text. / F. O. Silva // Food Control. 2005. -V. 16. -I. l.-P. 55-58.

10. Indyk, H. E. Simplified saponification procedure for the routine determination of total vitamin E in dairy products, foods, and tissues by highperformance liquid chromatography Text. / H. E. Indyk. // Analyst. 1988. -V. 113.-P. 1217.

11. Brinkmann, E. Separation of geometrical retinol isomers in food samples by using narrow bore-high-performance liquid chromatography Text. / E. Brinkmann, L. Dehne, H. B. Oei, R. Tiebach, W. J. Baiters. // Chromatogr. A.- 1995. V. 693.-P. 271.

12. Wyss, R. Use of direct injection precolumn techniques for the high-performance liquid chromatographic determination of the retinoids, acitretin and 13-cw-acitretin in plasma Text. / R. Wyss, F. Bucheli. // J. Chromatogr.- 1992. V. 593.-P. 55.

13. Altria, K. D. Analysis of Pharmaceuticals by Capillary Electroforesis Text. / K. D. Altria. Weisbaden: Vieweg Press, 1998. - p.

14. Hagen, J. J. Determination of retinoids by reversed-phase capillary liquid chromatography with amperometric electrochemical detection Text. / J. J. Hagen, K. A. Washco, C. A. Monnig. // J. Chromatogr. B. 1996. - V. 677. -P. 225.

15. Wills, R. В. H. Determination of carotenoids in Chinese vegetables Text. / R. В. H. Wills, A. Rangga. // Food Chem. 1996. - V. 56. - P. 451.

16. Konings, E. J. M. Evaluation and validation of an LC method for the analysis of carotenoids in vegetables and fruits Text. / E. J. M. Konings, H. H. S. Roomans. // Food Chem. 1997. - V. 59. - P. 599.

17. Khachik, F. Identification, quantification and relative concentrations of carotenoids and their metabolites in human milk Text. / F. Khachik, C. J. Spangler, J. C. Smith, Jr. // Anal. Chem. 1997. - V. 69. - P. 1873.

18. Piironen, V. Stability of tocopherols and tocotrienols during storage of foods Text. / V. Piironen, P. Varo, P. Koivistoinen. // J. Food Сотр. Anal. 1988.-V. l.P. 124.

19. Sarzanini, С. Determination of plasma tocopherols by high-performance liquid chromatography with coulometric detection Text. / C. Sarzanini, E. Mentasti, M. Vincenti, M. Nerva, F. Gaido // J. Chromatogr. 1993. - V. 620.-P. 268.

20. Arnaud, J. Simultaneous determination of retinol, a-tocopherol and (3-carotene in serum by isocratic high performance liquid chromatography Text. / J. Arnaud, I. Fortis, S. Blachier, D. Kia, A. Favier. // J. Chromatogr. -1991.-V. 572.-P. 103.

21. Mattila, P. Cholecalciferol and 25-hydroxycholecalciferol contents in fish and fish products Text. / P. Mattila, V. Piironen, E. Uusi-Rauva, P. Koivistoinen. // J. Food Сотр. Anal. 1995. - V. 8. - P.232.

22. Aksnes, L. A simplified high-performance liquid chromatographic method for determination of vitamin D3, 25-hydroxyvitamin D2 and 25-hydroxyvitamin D3 in human serum Text. / L. Aksnes // Scand. J. Clin. Lab. Invest.- 1992.-V. 52.-P. 177.

23. McCarthy, P. T. Assay of phylloquinone in plasma by high performance liquid chromatography with electrochemical detection Text. / P. T. McCarthy, D. J. Harrington, M. J. Shearer. // Meth. Enzymol. 1997. - V. 282.-P. 421.

24. Ivanovic, D. Reversed-phase ion-pair HPLC determination of some water-soluble vitamins in pharmaceuticals Text. / D. Ivanovic, A. Popovic, D. Radulovic, M. Medenica. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. - V. 18. — I. 6. —1. P. 999-1004.

25. Chen, P. LC/UV/MS-MRM for the simultaneous determination of water-soluble vitamins in multi-vitamin dietary supplements Text. / P. Chen, W. R. Wolf. // Anal. Bioanal. Chem. 2007. - V. 387. -1. 7. - P. 2441-2448.

26. Ollilainen, V. The HPLC determination of total thiamin (vitamin Bl) in foods Text. / V. Ollilainen, V. Vahteristo, L. A. Uusi-Rauva, P. Varo, P. Koivistoinen, J. Huttunen. // J. Food Сотр. Anal. 1993. - V. 6. - P. 152.

27. Blanco, D. A paired ion liquid chromatographic method for thiamine determination in selected foods Text. / D. Blanco, M. B. Llaneza, M. D. Gutierrez. // J. Liq. Chrom. Rel. Technol. 1996. - V. 19. - P. 2155.

28. Herve, P. Comparison of erythrocyte transketolase activity with thiamine and thiamine phosphate ester levels in chronic alcoholic patients Text. / P. Herve, P. Beyne, Ph. Lettiron, E. Delacoux. // Clin. Chim. Acta. 1995. - V. 234. -P. 91.

29. Ollilainen, V. The HPLC determination of total riboflavin in foods Text. / V. Ollilainen, P. Matilla, P. Vara, P. Koivistoinen, J. Huttunen. // J. Micronutr. Anal. 1990. - V. 8. - P. 199.

30. Vidal-Valverde, C. Reliable system for the analysis of riboflavin in foods by high performance liquid chromatography and UV detection Text. / A. Vidal-Valverde, A. Reche. // J. Liq. Chromatogr. 1990. - V. 13. - P. 2089.

31. Barna, E. Determination of thiamine (vitamin Bl) and riboflavin (vitamin B2) in meat and liver by high-performance liquid chromatography Text. / E. Barna, E. Dworschak. // J. Chromatogr. A. 1994. - V. 668. - P. 359.

32. Chase, G. W. Method modification for liquid chromatographic determination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in medical foods Text. / G. W. Chase, W. O. Landen, Jr., A. G. M. Soliman, R. R. Eitenmiller. // J. AOAC Int. -1993.-V. 767.-P. 1276.

33. Hewavitharna, A. K. Method for the extraction of riboflavin for high performance liquid chromatography and application to casein Text. / A. K. Hewavitharna. // Analyst. 1996. - V. 121. - P. 1671.

34. Batey, D. W. Identification of FAD, FMN, and riboflavin in the retina by microextraction and high-performance liquid chromatography Text. / D. W. Batey, C. D. Eckhart. // Anal. Biochem. 1990. - V. 188. - P. 164.

35. Ang, C. Y. Determination of thiamin and riboflavin in meat and meatproducts by high pressure liquid chromatography Text. / C. Y. Ang, F. A. Moseley. // J. Agric. Food Chem. 1980. - V. 28. - P. 483.

36. Hamano, T. Simultaneous determination of niacin and niacinamide in meats by high-performance liquid chromatography Text. / T. Hamano, Y. Mitsuhashi, N. Aoki, S. Yamamoto, Y. Oji. // J. Chromatogr. 1988. - V. 457.-P. 403.

37. Hirayama, S. Determination of a small amount of niacin in foodstuffs by highperformance liquid chromatography Text. / S. Hirayama, M. Maruyama. //J. Chromatogr.-1991.-V. 588.-P. 171.

38. Chase, G. W. Jr. Liquid chromatographic analysis of niacin in fortified food products Text. / G. W. Chase, Jr., W. O. Landen, Jr., A. M. Soliman, R. R. Eitenmiller. // J. AOAC Int. 1993. - V. 76. - P. 390.

39. Balschukat, D. Use of column switching for the determination of niacinamide in compound feed Text. / D. Balschukat, E. Kress // J. Chromatogr. 1990. - V. 502. - P. 79.

40. Tsuge, H. Determination of vitamin B-6 vitamers and metabolites in a biological sample Text. / H.Tsuge. // Meth. Enzymol. 1997. - V. 280. - P. 3.

41. Ubbink, J. B. Vitamin B-12, vitamin B-6 and folate nutritional status in men with hyperhomocysteinemia Text. / J. B. Ubbink, W. J. H. Vermaak, A. van der Merwe, P. J. Becker. // Am. J. Clin. Nutr. 1993. - V. 57. - P. 47.

42. Dalbacke, J. Determination of vitamin B12 in multivitamin-multimineral tablets by high performance liquid chromatography after solid-phase extraction Text. / J. Dalbacke, I. Dahlquist. J. Chromatogr. 1991. - V. 541. -P. 382.

43. Wang, S. Determination of plasma ascorbic acid by HPLC: method and stability studies Text. / S. Wang, I. M. Schram, R, B. Sund. // Eur. J. Pharm. Sci. 1995. -V. 3. - P. 231.

44. Behrens, W. A. Ascorbic and dehydroascorbic acid contents of canned food and frozen concentrated orange juice Text. / W. A. Behrens, R.Madere. // J. Food Сотр. Anal. 1990. - V. 3. - P. 3.

45. Margolis, S. A. Liquid chromatographic measurement of L-ascorbic acid and D-ascorbic acid in biological samples Text. / S. A. Margolis, R. M. Schapira. // J. Chromatogr. B. 1997. - V. 690. - P. 25.

46. Leubolt, R. Determination of sulphite and ascorbic acid by high-performanceliquid chromatography with electrochemical detection Text. / R. Leubolt, H. Klein. // J. Chromatogr. 1993. - V. 640. - P. 271.

47. Vanderslice, J. T. Quantitative determination of ascorbic, dehydroascorbic, isoascorbic, and dehydroisoascorbic acid by HPLC in foods and other matrices Text. / J. T. Vanderslice, D. J. Higgs. // J. Nutr. Biochem. 1993. -V. 4.-P. 184.

48. Vinci, G. Ascorbic acid in exotic fruits: a liquid chromatographic investigation Text. / G. Vinci, F. Botre, G. Mele, G. Ruggieri. // Food Chem. 1995. - V. 53.-P. 211,

49. Holler, U. Quantification of biotin in feed, food, tablets, and premixes using HPLC-MS/MS Text. / U. Holler, F.Wachter, C. Wehrli, C. Fizet. // J. Chromatogr. B.-2006.-V. 831.-I. 1-2.-P. 8-16.

50. Zempleni, J. Identification of biotin sulfone, bisnorbiotin methyl ketone and tetranorbiotin-l-sulfoxide in human urine Text. / J. Zempleni, D. B. McCormick, D. M. Mock. // Am. J. Clin. Nutr. 1997. - V. 65. - P. 508.

51. Vahteristo, L. Application of an HPLC assay for the determination of folate derivatives in some vegetables, fruits and berries consumed in Finland Text. / L. Vahteristo, K.Lehikoinen, V. Ollilainen, P. Varo. // Food Chem. 1997. -V. 59.-P. 589.

52. Pfeiffer, С. M. Determination of folate in cereal-grain food products using trienzyme extraction and combined affinity and reversed-phase liquid chromatography Text. / С. M. Pfeiffer, L. M. Rogers, J. F. Gregory. // J.

53. Agric. Food Chem. 1997. - V. 45. - P. 407.

54. Jacoby, В. T. Liquid chromatographic determination of folic acid in infant formula and adult medical nutritionals Text. / В. T. Jacoby, F. T. Henry. // J. AOAC Int. 1992. -V. 75. - P. 891.

55. Shimoda, M. Simultaneous determination of tetrahydrofolate and N5-methyltetrahydrofolate in pig plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection Text. / M. Shimoda. // J. Vet. Med. Sci. 1992. - V. 54. - P. 249.

56. Iwase, H. Determination of pantothenic acid in an elemental diet by column-switching highperformance liquid chromatography with ultraviolet detection Text. / H. Iwase. Ill Anal. Sci. 1993. - V. 9. P. - 149.

57. Romera, J. M. Determination of pantothenic acid in infant milk formulas by high performance liquid chromatography Text. / J. M. Romera, M. Ramirez, A. Gil. // J. Dairy Sci. 1996. - V. 79. - P. 523.

58. Moreno, P. Determination of eight water- and fat-soluble vitamins in multivitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography Text. / P. Moreno, V. Salvado. // J. of Chromatogr. A. -2000.-V. 870.-P. 207-215.

59. Li, H. B. Simultaneous determination of twelve water- and fat-soluble vitamins by high-performance liquid chromatography with diode array detection Text. / H. B. Li, F. Chen // Chromatographia 2001. - V. 54. - I. 3-4.-P. 270-273.

60. Красиков В.Д. Современная планарная хроматография Текст. / Красиков В.Д. // Журн. Аналит. Хим. 2003. - Т. 58. - №. 8. - С. 792807.

61. Ларионов, О. Г. Руководство по современной тонкослойной хроматографии Текст. / О.Г.Ларионов. М. - 1994. - 312 с.

62. Златкис, А. Высокоэффективная тонкослойная хроматография Текст. / А. Златкис, Р. Кайзер. М.: «Мир», 1979. - 245 с.

63. Pelizzetti, Е. Analytical applications of organazed molecular assemblies. Text. / E.Pelizzetti, E.Pramauro. // Analytica Chimica Acta. 1985. - V. 169. -P. 1-29.

64. Weinberger, R. Liquid chromatographic phosphorescence detection with micellar chromatography and postcolomn reaction modes Text. / R.Weinberger, P.Yarmchuk, L.J.Cline // Analit. Chem. 1982. - V.54. -P.1552-1558.

65. Сумина, Е.Г. Поверхностно-активные вещества в тонкослойной хроматографии Текст. / Е.Г. Сумина, С.Н. Штыков, Н.В. Тюрина // Журн. Аналит. Хим. 2003. - Т. 58.

66. Штыков, Е.Г. Применение мицеллярных подвижных фаз для разделения производных флуоресцеина методом ТСХ Текст. / Е.Г. Штыков, Е.Г. Сумина, Е.В. Паршина, С.С. Лопухова // Журн. Аналит. Хим. 1995. - Т. 50. - №. 7. - С. 747-751.

67. Armstrong, D.W. Thin layer chromatographic separation of pesticides, decachlorobihenil and nucleosides with micellar solutions. Text. / D.W.Armstrong, R.Q.Terrill. // Anal. Chem. 1979. - V. 51. - I. 13. - P. 2160-2162.

68. Сумина, Е.Г. Применение поверхностно-активных веществ для модификации подвижных и неподвижных фаз при определении пищевых красителей методом ТСХ Текст. / Е.Г. Сумина, Е.В.

69. Ермолаева, Н.В. Тюрина, С.Н. Штыков // «Заводская лаборатория. Диагностика материалов». 2001. - Т. 67. - №. 5. - С. 5-8.

70. Armstrong, D.W. Selectivity in pseudophase liquid chromatography. Text. / D.W.Armstrong, G.Y.Stine. // Anal. Chem. 1983. - V.55. - P. 2317-2320.

71. Peteghem, C. Ion-pair extraction and ion-pair chromatography for rapid identification of ionic food dyes. Text. / C. Van Peteghem and J.Bijl. // J. of Chromatogr. 1981. - V.210. - P .113-120.

72. Wilson, I.D. Ion-pair reversed-phase thin-layer chromatography of organic asid. Text. / I.D.Wilson. // J. of Chromatogr. 1986. - V.354. - P.99-106.

73. Szepesi, G. Optimization of reversed-phase ion-pair chromatography by over-pressured thin-layer chromatography. Text. / G.Szepesi, Z.Vegh, Zs.Gyulay and M.Gazdag. // J. of Chromatog. 1984. - V.290. - P. 127-134.

74. Kocjan, B. Chromatographic and spectroscopic comparison of the hydrophobicity of vitamins D2. and D[3] [Text] / B. Kocjan, J. Sliwiok // J. Planar Chromatogr. Mod. TLC. 1994. - V. 7. - P. 327-328.

75. Sliwiok, J. Text. / J. Sliwiok, B. Kocjan. // Fat. Sci. Technol. 1992. - V. 94.-P. 157-159.

76. Strohecker, R. Vitamin Assay, Tested Methods Text. / R. Strohecker, H. M. Henning. Weinheim: Verlag Chemie, 1966.

77. Ranny, M. Thin-Layer Chromatography with Flame Ionization Detection

78. Text. / M. Ranny. Prague, 1987.

79. Linnell, J.C. Hydrophilic vitamins Text. / J.C. Linnell // Handbook of Thin-Layer Chromatography; eds. J. Sherma, B. Fried. Chromatographic Science Series V. 55. - New York: Marcel Dekker. - 1991. - P. 1048-1054.

80. Ziporin, Z.Z. Thin-layer chromatography for the separation of thiamine, N'-methylnicotinamide, and related compounds. Text. / Z.Z. Ziporin, P.P. Waring // Methods Enzymol. 1970. -1. 18A. - P. 86-87.

81. Funk, W. Characterization and quantitative HPTLC determination of vitamin B1 (thiamine hydrochloride) in a pharmaceutical product. Text. / W. Funk, P. Derr // J. Planar Chromatogr. 1990. - V. 3. - P. 149-152.

82. Diaz, A. Thin-layer chromatography and fibre-optic fluorimetric quantitation of thiamine, riboflavin and niacin Text. / A. Diaz, A. Paniagua, F. Sanchez. // J. Chromatogr. A. 1993. - V. 655. - P. 39-43.

83. Bhushan, R. Text. / R. Bhushan, I. Ali. // Arch. Pharm. 1987. - V. 320. -P. 1186-1187.

84. Gliszczynska, A. Chromatographic determination of flavin derivatives in baker's yeast Text. / A. Gliszczynska, A. Koziolowa. // J. Chromatogr. A.1998.-V. 822.-P. 59-66.

85. Gliszczynska-Swiglo, A. Chromatographic determination of riboflavin and its derivatives in food Text. / A. Gliszczynska-Swiglo, A. Koziolowa. // J. Chromatogr. A.-2000.-V. 881.-P. 285-297.

86. Gliszcznska, A. Chromatographic identification of a new flavin derivative in plain yogurt Text. / A. Gliszcznska, A. Koziolowa. // J. Agric. Food Chem.1999.-V. 47.-P. 3197-3201.

87. Matyska, M. Chromatographic analysis of water-soluble vitamins by thin-layer chromatography in sandwich-type chambers Text. / M. Matyska, E.

88. Soczewinski. I I Farm. PoL. 1985. - V. 41. - P. 386-389.

89. Bhushan, R. Text. / R. Bhushan, I. Ali. // Arch. Pharm. 1987. - V. 320. -P. 1186-1187.

90. Nag, S. Identification and quantitation of panthenol and pantothenic acid in pharmaceutical preparations by thin- layer chromatograpgy and desitometry Text. / S. Nag, S. Das. // J. AOACInt. 1992. - V. 75. - P. 898-901.

91. Ahrens, H. Pyridoxine chemistry: XXI. Thin-layer chromatography and thin-layer electrophoresis of compounds in the vitamin B6 group Text. / H. Ahrens, W. Korytnyk. // Anal. Biochem. 1969. - V. 30. - P. 413^20.

92. Yin, P. Text. / P. Yin, H. Li, C. Yan. // Chin. J. Chromatogr. 1994. - V. 12. -P 35.

93. Frappier, F. Biotin Text. / F. Frappier, M. Gaudry. // Modern chromatographic analysis of the vitamins; eds. A. DeLeenheer, W. Lambert, G. DeRuyter. New York: Marcel Dekker, 1985. - 477. p.

94. Shimada, K. Polymorphism of d-biotin Text. / K. Shimada, Y. Nagase, U. Matsumoto. // Yakugaku Zasshi. 1969. - V. 899. - P. 436.

95. Krzek, J. Densitometric determination of impurities in drugs: Part IV. Determination of N-(4-aminobenzoyl)-L-glutamic acid in preparations of folic acid Text. / J. Krzek, A. Kwiecien. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. -V. 21. -P. 451-457.

96. Beljaars, P. R. Assay of L(+)-ascorbic acid in buttermilk by densitometric transmittance measurement of the dehydroascorbic acid Text. / P. R. Beljaars, W. V. S. Horrock, Т. M. M. Rondags. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1974. - V. 57.-P. 65-69.

97. Linnell, J. . Chromatographic and bioautographic estimation of plasmacobalamins in various disturbances of vitamin В12 metabolism Text. / J. C. Linnell, A. Hoffbrand, T. J. Peters, D. M. Matthews // Clin. Sci. 1971. - V. 40.-P. 1-16.

98. Okamura, M. Distribution of ascorbic acid analogs and associated glycorides in mushrooms Text. / M. Okamura. // J. Nutr. Sci. Vitaminol. 1994. - V. 40.-P. 81-94.

99. Roomi, M.W. Thin-layer chromatographic separation of isomers of ascorbic acid and dehydroascorbic acid as sodium borate complexes on silica gel and cellulose plates Text. / M. W. Roomi, C. S. Tsao. // J. Agric. Food Chem. -1998.-V. 46.-P. 1406-1409.

100. Aburjai, T. Second derivative ultraviolet spectrophotometry and HPTLC for the simultaneous determination of vitamin С and dipyrone. Text. / T. Aburjai, В. I. Amro, K. Aiedeh, M. Abuirjeie, S. Al-Khalil. // Pharmazie. -2000.-V. 55.-P. 751-754.

101. Di Mattio, J. A comparative study of ascorbic acid entry into aqueous and vitreous tumors of the rat and guinea pig Text. / J. Di Mattio. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1989. -V. 30. - P. 2320-2331.

102. Diaz, A.N. Thin-layer chromatography and fibre-optic fluorimetric quantitation of thiamine, riboflavin and niacin Text. / A. N. Diaz, A. G. Paniaqua, F. G. Sanchez. // J. Chromatogr. A. 1993. - V. 655. - P. 39^3.

103. Bhushan, R. Improved separation of vitamin В complex and folic acid using some new solvent systems and impregnated TLC Text. / R. Bhushan, V. Parshad. // J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 1999. - V. 22. - P. 16071623.

104. Bauer-Petrovska, B. Mineral and water soluble vitamin content in the Kombucha drink Text. / B. Bauer-Petrovska, L. Petrushevska-Tozi. // Int. J. Food Sci. Technol. 2000. - V. 35. P. 201-205.

105. Postaire, E. Simultaneous determination of water-soluble vitamins by overpressure layer chromatography and photodensitometric detection Text. / E. Postaire, M. Cisse, M.D. Le Hoang, D. Pradeau. // J. Pharm. Sci. 1991. - V.80.-P. 368-370.

106. Nurok, D. Planar electrochromatography Text. / D. Nurok. // J. Chromatogr. A. 2004. - V. 1044. -1. 1-2. - P. 83-96.

107. Pretorius, V. Electroosmosis: A new concept for high-speed liquid chromatography Text. / V. Pretorius, B. J. Hopkins, J. D. Schieke. // J. Chromatogr. 1974. V. 99. - P. 23-30.

108. Pukl, M. Planar electrochromatography Part 1. Planar electrochromatography on non-wetted thin-layers Text. / M. Pukl, M. Prosek, R. E. Kaiser. // Chromatographia. 1994. - V. 38. - P. 83-87.

109. Malinowska, I. Planar Electrochromatography on Nonwetted Layers with Binary Mobile Phases Text. / I. Malinowska. // J. Planar Chromatogr. -2000.-V. 13.-P. 307-313.

110. Malinowska, I. The effect of electric fields on solute migration and mixture separation in TLC Text. / I. Malinowska, J. K. Rozylo, A. Krason. // J. Planar Chromatogr. 2002. - V. 15. - P. 418-424.

111. Howard, A. G. Electroosmotically driven thin-layer electrochromatography on silica media Text. / A. G. Howard, T. Shafik, F. Moffatt, I. D. Wilson. // J. Chromatogr. A. 1999. - V. 844. - P. 333-340.

112. Nurok, D. Role of buffer concentration and applied voltage in obtaining a good separation in planar electrochromatography Text. / D. Nurok, J. M. Koers, M. A. Carmichael. // J. Chromatogr. A. 2003. - V. 983. - P. 247253.

113. Dzido, Т. H. Application of a horizontal DS chamber to planar electrochromatography Text. / Т. H. Dzido, R. Majewski, B. Polak, W. Golkiewicz, E. Soczewinski. // J. Planar Chromatogr. 2003. - V. 16. - P. 176-182.

114. Nurok, D. The performance of planar chromatography using electroosmotic flow Text. / D. Nurok, M. C. Frost, C. L. Pritchard, D. M. Chenoweth. // J. Planar Chromatogr. 1998. - V. 11. - P. 244-246.

115. Nurok, D. Separation using planar chromatography with electroosmotic flow

116. Text. / D. Nurok, M. C. Frost, D. M. Chenoweth. // J. Chromatogr. A. -2000.-V. 903.-P. 211-218.

117. Nurok, D. Variables that affect performance in planar chromatography with electroosmotic flow Text. / D. Nurok, J. M. Koers, D. A. Nyman, W.- M. Liao. //J. Planar Chromatogr. -2001. -V. 14. P. 409-414.

118. Nurok, D. The performance of planar electrochromatography in a horizontal chamber Text. / D. Nurok, J. M. Koers, M. A. Carmichael, T. A. Dzido. // J. Planar Chromatogr. 2002. - V. 15. - P. 320-323.

119. Morzunova, T. G. Capillary electrophpresis in pharmaceutical analysis (a review) Text. / T. G. Morzunova. // J. Pharm. Chem. 2006. - V. 40. -1. 3. -P. 158-170.

120. Руководство по капиллярному электрофорезу Текст. / Под ред. A.M. Волощука. М. - 1996. - 112.

121. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. Текст. В 3 ч. Ч. 1. / СПб: Мир и семья, 2002. 964 с.

122. Altria, K. D. Analysis of Pharmaceuticals by Capillary Electroforesis Text. / K. D. Altria. // Weisbaden: Vieweg Press, 1998.-285 p.

123. Ward, С. M. The application of capillary electrophoresis to the determination of total niacin in concentrated yeast spreads Text. / С. M. Ward, V. C. Trenerry, I.Pant.//FoodChem.- 1997.-V. 58.-I. l.-P. 185-192.

124. Schiewe, J. Application and optimization of capillary zone electrophoresis invitamin analysis Text. / J. Schiewe, Y. Mrestani, R. H. Neubert. // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 717. -1. 1-2. - P. 255-259.

125. Fotsing, L. Determination of six water-soluble vitamins in a pharmaceutical formulation by capillary electrophoresis Text. / L. Fotsing, M. Fillet, I. Bechet, P. Hubert, J. Crommen. // J. Pharm. Biomed. Anal. 1997. - V. 15. -I. 8.-P. 1113-1123.

126. Mrestani, Y. Thiamine analysis in biological media by capillary zone electrophoresis with a high-sensitivity cell Text. / Y. Mrestani, R. H. Neubert. // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 871. -1. 1-2. - P. 351-356.

127. Le, Т. H. Application of micellar electrokinetic chromatography for the separation of retinoids Text. / Т. H. Le, J. C. Kraak, W. Т. Kok. // J. Pharm. Biomed. Anal. 2000. - V. 22. -1. 5. - P. 879-885.

128. Profumo, A. Micellar electrokinetic capillary chromatography of three natural vitamin A derivatives Text. / A. Profumo, V. Profumo, G. Vidali. // Electrophoresis.- 1996.-V. 17.-I. 10.-P. 1617-1621.

129. Hsieh, Y. Z. Separation of retinoids by micellar electrokinetic capillary chromatography Text. / Y. Z. Hsieh, K. L. Kuo. // J. Chromatogr. A. 1997. -V. 761.-1.1-2.-P. 307-313.

130. Fujivvara, S. Analysis of water-soluble vitamins by micellar electrokinetic capillary chromatography Text. / S. Fujiwara, S. Iwase, S. Honda. // J. Chromatogr. 1988. - V. 447. - P. 133-140.

131. Blanco Gomis, D. Micellar electrokinetic capillary chromatography analysis of water-soluble vitamins Text. / D. Blanco Gomis, L. L. Gonzalez, D. G. Alvarez. // Anal. Chim. Acta. 1999. - V. 396. -1. 1. - P. 55-60.

132. Tjornelund, J. Separation of neutral substances by non-aqueous capillary electrophoresis through interactions with cationic additives Text. / J. Tjornelund, S. Honore Hansen. // J. Chromatogr. A. 1997. - V. 792. - P. 475-482.

133. Boso, R.L. Microemulsion electrokinetic chromatography with different organic modifiers: separation of water- and lipid-soluble vitamins Text. / R.L. Boso, M. S. Bellini, I. Miksik, Z. Deyl. // J. Chromatogr. A. 1995. - V. 709.-I. l.-P. 11-19.

134. Altria, K.D. Application of microemulsion electrokinetic chromatography to the analysis of a wide range of pharmaceuticals and excipients Text. / K.D. Altria. // J. Chromatogr. A. 1999. - V. 844. -1. 1-2. - P. 371-386.

135. Hempel. G. Strategies to improve the sensitivity in capillary electrophoresis for the analysis of drugs in biological fluids Text. / G. Hempel. // Electroforesis. 2000. - V. 21. - P. 691-698

136. Wu, Ch. -H. Determination of aminopyrine and metabolite by capillary electrophoresis-electrochemical detection Text. / Ch. -H. Wu, M.-Ch. Chen, A.-K. Su, P.-Y. Shu, Sh.-H. Chou, Ch. -H. Lin. // J. Chromatogr. B. 2003. -V. 785.-P. 317-325

137. Quirino, P. Exceeding 5000-fold concentration of analytes in micellar electrokinetic chromatography Text. / P. Quirino, S. Terabe. // Science. -1998. -V. 282 (5388). P. 465-468

138. Osbourn, D. M. On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis Text. / D. M. Osbourn, D. J. Weiss, С. E. Lunte. // Electrophoresis. 2000. - V. 21. - P. 2768 - 2779

139. McGrath, G. Large-volume sample stacking of selected drugs of forensic significance by capillary electrophoresis Text. / G. McGrath, W.F. Smyth. // J. Chromatogr. B. 1996. - V. 681. - P. 125-131

140. Britz-McKibbin, P. On-line preconcentration strategies for trace analysis of metabolites by capillary electrophoresis Text. / P. Britz-McKibbin, S. Terabe. // J. Chromatogr. A. 2003. - V. 1000. - P. 917-934

141. Quirino, J. P. On-line concentration of neutral analites for micellar electrokinetic chromatography. 3. Stacking with reverse migrating micelles Text. / J. P.Quirino, S. Terabe. // Anal. Chem. 1998. - V. 70. - P. 149 -157

142. Britz-McKibbin, P. Velocity difference induced focusing of nucleotides in capillary electrophoresis with a dynamic pH-junction Text. / P. Britz-McKibbin, G. M. Bebault., D. D. Y. Chen. // Analytical Chemistry. 2000. -V. 72.-№8.-P. 1729-1735.

143. Pretorius, V. Electroosmosis: A new concept for high-speed liquid chromatography Text. / V. Pretorius, B.J. Hopkins, J.D. Schieke. // J. Chromatogr. 1974. - V. 99. - P. 23-30.

144. Euerby, M. R. Capillary electrochromatography in the pharmaceutical industry. Practical reality or fantasy? Text. / M. R. Euerby, С. M. Johnson, K. D. Bartle, P. Myers, S. C. P. Roulin. // Anal. Commun. 1996. - V. 33. -P. 403-405.

145. Simal-Gandara, J. The Place of Capillary Electrochromatography Among Separation Techniques-A Review Text. / J. Simal-Gandara. // Crit. Rev. Anal. Chem. 2004. - V. 34. - P. 85-94.

146. Tang, Q. Column technology for capillary electrochromatography Text. / Q. Tang, M. L. Lee. // Trends Anal. Chem. 2000. V. 19. №. 11. P. 648-663.

147. Colon, L. A. Packing columns for capillary electrochromatography Text. / L. A. Colon, T. D. Maloney, A. M. Fermier. // J. of Chromatogr. A. 2000. -V. 887-№ 1-2.-P. 43-53.

148. Jinno, K. Recent trends in open-tubular capillary electrochromatography Text. / K. Jinno, H. Sawada. // Trends Anal. Chem. 2000. - V. 19. - № 11. -P. 664-675.

149. Svec, F. Design of the monolithic polymers used in capillaryelectrochromatography columns Text. / F. Svec, E. C. Peters, D. Sykora, J. M. J. Frechet. // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 887. - № 1-2. - P. 3-29.

150. Colon, L. A. Packing columns for capillary electrochromatography Text. / L. A. Colon, T. D. Maloney, A. M. Fermier // J. of Chromatogr. A. 2000. -V. 887.-№1-2.-P. 43-53.

151. Robson, M. M. Capillary electrochromatography using columns packed with a supercritical-fluid carrier Text. / M. M. Robson, S. Roulin, S. M. Shariff et al. //Chromatographia. 1996. -V. 43. -№ 5-6. - P. 313-321.

152. Yan, C. Electrokinetic packing of capillary columns C. Yan. // U.S. Patent. 5453163.- 1993.

153. Maloney, T. D. A drying step in the protocol to pack capillary columns by centripetal forces for capillary electrochromatography Text. / T. D. Maloney, L. A. Colon. // Electrophoresis. 1999. V. 20. - № 12. - P. 2360-2365.

154. Jiskra, J. Stationary and mobile phases in capillary electrochromatography Text. / J. Jiskra, H. A. Claessens, C. A. Cramers. // J. Sep. Sci. 2003. - V. 26.-P. 1305-1330.

155. Li, Y. Capillary electrochromatography of peptides and proteins Text. / Y. Li, R. Xiang, J. A. Wilkins, C. Horvath // Electrophoresis. 2004. - V. 25. -P. 2242-2256.

156. Zhang, S. Rapid separation of peptides and proteins by isocratic capillary electrochromatography at elevated temperature Text. / S. Zhang, J. Zhang, Cs. Horvath. // J. Chromatogr. A. 2001. - V. 914. - P. 189-200.

157. Yu, C. Fabrication of porous polymer monoliths covalently attached to the walls of channels in plastic microdevices Text. / C. Yu, F. Svec, J. M. J. Frechet. // Electrophoresis. 2000. - V. 21. - P. 120-127.

158. Jia, L. Pressurized capillary electrochromatographic analysis of water-solublevitamins by combining with on-line concentration technique Text. / L. Jia, Y. Liu, Y. Du, D. Xing. // J. Chromatogr. A. 2007. - V. 1154. - P. 416-422.

159. Fanali, S. Separation of 8-, y- and a-tocopherols by CEC Text. / S. Fanali, P. Catarcini, M. G. Quaglia, E. Camera, M. Rinaldi, M. Picardo // J. Pharm. Biomed. Anal. 2002. - V. 29. - P. 973-979

160. De Vries, E. J. Dried skimmed milk determination of vitamin A -colorimetric and liquid chromatographic methods Text. / E. J. de Vries, Ch. C. J. Oiling, U. Manz, E. Tagliaferri. // Int. Dairy Fed. - 1993. - V. 285. - P. 53.

161. Blott, A. D. Rapid determination of a-tocopheryl acetate in animal feeds by high performance liquid chromatography Text. / A. D. Blott, D. C. Woollard. // J. Micronutr. Anal. 1986. - V. 2. - P. 259.

162. McGeachin, R. B. Determination of carotenoid pigments, retinol, and a-tocopherol in feeds, tissues, and blood serum by normal phase high performance liquid chromatography Text. / R. B. McGeachin, C. A. Bailey // Poultry Sci. 1995. - V. 74. - P. 407.

163. Got, L. Simultaneous determination of retinyl esters and retinol in human livers by reversed-phase high-performance liquid chromatography Text. / L. Got, T.Gousson, E. Delacoux. // J. Chromatogr. B. 1995. - V. 668. - P. 233.

164. Shimada, K. Quantitative determination of 25-hydroxy-vitamin D3 3-sulphate in human plasma using high performance liquid chromatography

165. Text. / К. Shimada, К. Mitamura, N. Kitama. // Biomed. Chromatogr. -1995.-V. 9.-P. 229.

166. Fox, J. B. Fluorometric determination of thiamin vitamers in chicken Text. / J. B. Fox, S. A. Ackerman, D. W. Thayer. // J. AOAC Int. 1992. - V. 75. -P. 346.

167. Vanderslice, J. T. Liquid chromatographic analysis of thiamin and its phosphates in food products using amprolium as an internal standard Text. / J. T. Vanderslice, M. H. A. Huang. // J. Micronutr. Anal. 1986. - V. 2. - P. 189.

168. Gerrits, J. Determination of thiamin and thiamin phosphates in whole blood by reversed-phase liquid chromatography with precolumn derivatization Text. / J. Gerrits, H. Eidhof, J. W. I. Brunnekreeft, J. Hessels. // Meth. Enzymol. 1987. -V. 279. P. 74.

169. Cann-Moisan, C. Determination of flavin adenine dinucleotide in biological tissues by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection Text. / C. Cann-Moisan, J. Caroff, F. Girin. // J. Chromatogr. -1988.-V. 442.-P. 441.

170. Tyler, T. A. Liquid chromatographic determination of total niacin in beef, semolina and cottage cheese Text. / T. A. Tyler, J. A. Genzale. // J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1990. -V. 73. - P. 467.

171. Vidal-Valverde, C. Determination of available niacin in legumes and meat by high performance liquid chromatography Text. / C. Vidal-Valverde, A. Reche. // J. Agric. Food Chem. 1991. - V. 39. - P. 116.

172. Stein, J. High-performance liquid chromatographic determination of nicotinic acid and nicotinamide in biological samples applying post-column derivatization resulting in bathmochrome absorption shifts Text. / J. Stein,

173. A. Hahn, G. Rehner. // J. Chromatogr. B. 1995. - V. 665. - P. 71.

174. Reynolds, Т. M. A simple internally-standardised isocratic HPLC assay for vitamin B-6 in human serum Text. / Т. M. Reynolds, A. Brain. // J. Liq. Chromatogr. 1992. - V. 15. - P. 897.

175. Vanderslice, J. T. Quantitative determination of ascorbic, dehydroascorbic, isoascorbic, and dehydroisoascorbic acid by HPLC in foods and other matrices Text. / J. T. Vanderslice, D. J. Higgs // J. Nutr. Biochem. 1993. -V. 4.-P. 184.

176. Stachowiak, Т.В. Chip electrochromatography Text. / Т.В. Stachowiak, F. Svec, J.M.J. Frechet // J. Chromatogr. A. 2004. - V. 1044. - P. 97-111.

177. Berezkin, V.G. Electroosmotic thin-layer chromatography Text. / V.G. Berezkin, E.F. Litvin., A.O. Balushkin, J.K. Rozylo, I. Mainovska. // Chem. Anal. (Warsaw). 2005. - V. 50. - P. 359.

178. De Fatima Alpendurada, M. Solid-phase microextraction: a promising technique for sample preparation in environmental analysis Text. / M. De Fatima Alpendurada. // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 889. - № 1-2. - P. 314.

179. Lord, H. Evolution of solid-phase microextraction technology Text. / H. Lord, J. Pawliszyn. // J. Chromatogr. A. 2000. - V. 885. - № 1-2. - P. 153193.