Определение витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в премиксах, биологически активных добавках и пищевых продуктах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Шелеметьева, Ольга Владимировна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Томск
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2009
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
ШЕЛЕМЕТЬЕВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ПРЕМИКСАХ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВКАХ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
02.00.02 - аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Томск-2009
003481833
Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Томского политехнического университета
Научный руководитель
Доктор химических наук, старшин научный сотрудник Слеиченко Галина Борисовна
Официальные оппоненты:
Доктор технических на}«, профессор Знбарев Павел Викторович
Кандидат химических наук Мордвинова Инна Михайловна
Ведущая организации:
ГОУ ВПО «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности»
Защита состоится «18» ноября 2009 г. в 16 час. 30 мин. на заседании
совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.269.04 при Томском политехническом университете по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Томского политехнического университета по адресу: 634050, г. Томск, ул. Белинского 53.
Автореферат разослан «_ октября 2009 г.
Ученый секретарь совета по защите докторских н кандидатских диссертаций кандидат химических наук С ^/'
Гнндуллнна Т.М.
Актуальность
Водорастворимые и жирорастворимые витамины - незаменимые органические вещества, биологические катализаторы химических реакций, протекающих в организме человека; они активно участвуют в обмене веществ и поступают в организм человека практически полностью из внешней среды.
Для поддержания баланса витаминов в организме широкое применение нашли витаминизированные продукты и биологически активные добавки к пище (БАД). Одним из важнейших показателей потребительского качества продукции подобного рода является соответствие содержания биологически активных веществ согласно заявленной рецептуре. Для восстановления качества продуктов питания был принят документ «Основы государственной политики в области здорового питания граждан Российской Федерации на период до 2020 года», пришедший на смену «Концепции здорового питания населения России до 2005 года».
Разработка и совершенствование методов определения витаминов является актуальной задачей, от решения которой зависит качество и безопасность подобной продукции. Выбор инструментального метода анализа для определения водо- и жирорастворимых витаминов в пищевых продуктах обусловлен рядом общих соображений, например: пределами обнаружения метода в зависимости от определяемых содержаний, требованием многоэлементности, допускаемой погрешностью, временными затратами, стоимостью анализа. Безусловно, предпочтение отдается методам, требующим минимальной подготовки пробы к анализу при максимальной информативности. Таким требованиям максимально удовлетворяет метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Современное развитие метода ВЭЖХ расширило аналитические возможности определения витаминов в обогащенных пищевых продуктах. Необходимая подготовка пробы образца весьма проста относительно других методов, что связано прежде всего с исключительной универсальностью, высокой эффективностью разделения, благоприятными условиями анализа (низкая температура, инертный растворитель, отсутствие контакта с кислородом).
Однако, несмотря на интенсивное развитие этого метода в последние 10 лет, в литературных источниках практически отсутствуют методики определения витаминов в таких объектах, как БАД. Трудности в создании методик во многом обусловлены сложностью объектов анализа, таких как обогащенные продукты, в состав которых входят лекарственное растительное сырье (ЛРС), растительные экстракты (РЭ), различные минеральные добавки, красители и другие наполнители; низкими концентрациями витаминов в объектах анализа и высокой чувствительностью к термическому, фотоокислительному и химическому воздействиям. Поэтому разработка экспрессных методик одновременного количественного определения водо- и жирорастворимых витаминов в БАД является актуальной задачей.
Цель диссертационной работы
Исследование параметров хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В, выбор оптимальных условий их определения и разработка экспрессных методик аналитического контроля БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание жиро- и водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи: • исследовать хроматографическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола, провести оценку коэффициентов емкости^/ асимметрии и разрешения пиков витаминов; I
• установить параметры хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В;
• оптимизировать основные стадии и предложить алгоритм пробоподготовки для определения витаминов в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах;
• разработать и метрологически аттестовать методики количественного химического анализа БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание витаминов.
Научная новизна
• впервые исследовано хроматографическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола и установлены условия определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
• показана применимость универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимодействий сорбат-сорбент, модификатор-сорбент в хроматографической системе и проведен расчет параметров хроматографического разделения: коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков водорастворимых витаминов;
• проведена оценка мешающего влияния водорастворимых витаминов группы В при их совместном присутствии, рассчитаны предельные соотношения водорастворимых витаминов в пробе при заданной систематической погрешности и оценены основные составляющие органической матрицы при определении витаминов методом ВЭЖХ;
• впервые установлены и оптимизированы условия ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения водорастворимых витаминов и разработан алгоритм подготовки проб БАД, пищевых продуктов и премиксов для последующего определения содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
• впервые разработаны методики количественного химического анализа проб БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание водо- и жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Практическая значимость работы
• на основании проведенных исследований проведена метрологическая аттестация методик количественного химического анализа водорастворимых витаминов (ВРВ) и жирорастворимых витаминов (ЖРВ) для широкого круга объектов: премиксов, БАД и витаминизированных продуктов пищевой промышленности. Методики позволяют экспрессно (в течение 45-60 минут) проводить определение 6 водорастворимых витаминов в сложной матрице БАД;
• разработанные методики: «Биологически активные добавки, пищевые продукты, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод определения массовой концентрации водорастворимых витаминов Вь В2, Вз (никотинамид, никотиновая кислота ), В5, В6 и фолиевой кислоты» и «Биологически активные добавки, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод определения массовой концентрации жирорастворимых витаминов А, Е и Дз» метрологически аттестованы и внесены в государственный Федеральный реестр методик выполнения измерений, допущенных к применению в сфере государственного метрологического контроля и надзора под номерами ФР.1.31.2005.01917, МУ 08-47/185 и ФР.1.31.2005.01810 МУ 08-47/184 и используются в практике аналитических лабораторий ЗАО «Эвалар» (г. Бийск), ЗАО «Алтайвитамины» (г. Бийск), ООО «Внешторгфарма» (г. Москва) и НИИ фармакологии (г. Томск), что подтверждается соответствующими актами о внедрении.
Положения, выносимые на защиту
1. Описание удерживания водорастворимых витаминов с позиций теории универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ.
2. Закономерности удерживания водорастворимых витаминов группы В в условиях градиентной обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и выбор рабочих условий хроматографического определения водорастворимых витаминов.
3. Условия пробоподготовки БАД, пищевых продуктов, премиксов и алгоритм оптимизации стадии УЗ-экстрагирования при определении витаминов.
4. Методики хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов.
Апробация работы
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на международном симпозиуме «Федеральный и региональный аспекты политики здорового питания» (Кемерово, 2002), международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), региональной научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), II Всероссийской конференции по аналитической химии» с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова) (Краснодар, 2007), международной выставке и научно-практической конференции «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности» (Москва, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2008» (Уфа-Абзаково, 2008), II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж , 2008), VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008), IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Публикации Основные результаты работы изложены в 13 публикациях, в том числе 3 статьи в научных журналах, тезисы 10 докладов в трудах симпозиумов и конференций.
Объем и структура работы
Диссертационная работа изложена на 138 страницах машинописного текста; состоит из введения, 5 глав, включая литературный обзор, выводов, списка цитируемой литературы (180 назв.) и 8 стр. приложения; содержит 25 рисунков, 27 таблиц.
Основное содержание работы
Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цель и задачи исследования, дана структура работы.
Глава 1. Представлен обзор литературы по физико-химическим методам исследования и определения витаминов в различных объектах, в котором рассмотрены основные свойства жирорастворимых (ЖРВ) и водорастворимых витаминов (ВРВ), аналитические возможности физико-химических методов и особенности высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при анализе ЖРВ и ВРВ, сформулированы задачи исследования.
В главе 2 приведены сведения об используемом оборудовании и реактивах, дана характеристика объектов анализа. Работа была выполнена на жидкостном хроматографе фирмы «Waters» с детектором с диодной матрицей. Использованы стальные колонки размером 3,9x150 мм, заполненные ОФ сорбентом Symmetry Ci8 с размером частиц 5 мкм. На стадии пробоподготовки анализируемых образцов использовано фильтровальное оборудование и микрофильтры с размером пор 0,45 мм (Millipor) и ультразвуковая баня «САПФИР» с рабочей частотой излучателей 35 кГц и температурным режимом от 20 до 75 В качестве растворителей применены ацетонитрил, тетрагидрофуран и метанол. В качестве стандартных образцов использованы водорастворимые витамины Bi, В2, Вз
(никотинамид, никотиновая кислота), В5, Вб, РР и фолиевая кислота, А, Е, D3 (Sigma) с содержанием основных компонентов не менее 98, 0 % по массе. В качестве объектов исследования использованы многокомпонентные сухие витаминизированные смеси (премиксы), биологически активные добавки (БАД), обогащенные пищевые продукты быстрого приготовления: кисели, каши, супы.
В главе 3 экспериментально подобраны рабочие условия определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ и оценено мешающее влияние органической матрицы при определении водорастворимых витаминов.
Было исследовано влияние состава подвижной фазы (ПФ) на хроматографическое разделение ВРВ. В качестве объектов исследования использованы водорастворимые витамины фармакопейной чистоты: тиамина мононитрат (В]), рибофлавин (В2), никотинамид (В3), кальция D -пантотенат (В5), пиридоксина гидрохлорид (Вб) и фолиевая кислота (В9). Удерживание водорастворимых витаминов было изучено на различных сорбентах: Atlantis-Cie, Simmetry-Ci8, Wakosil II Cíe. Наилучшее разделение было достигнуто на сорбенте СФ Simmetry-Cig, поэтому в качестве неподвижной фазы выбран сорбент Simmetry-Ci8, для которого зависимость удерживания сорбата от состава бинарной подвижной фазы описывается уравнением Снайдера: lg k - a-n lg NB (1)
где к'- коэффициент емкости (удерживания) сорбата; Nb - мольная доля компонента В в подвижной фазе;
п - отношение площадей пиков сорбата и наиболее сильно адсорбирующегося компонента В в подвижной фазе;
а -эмпирический коэффициент. В состав хроматографической системы входили: сорбат (S) и двухкомпонентная подвижная фаза, включающая основной компонент - растворитель (L) и модифицирующую добавку (М). В нашем случае L - вода, М - органический растворитель (метанол, ацетонитрил, тетрагидрофуран). Таким образом, мы имели дело с адсорбцией из трехкомпонентного раствора (S, М, L), причем концентрация сорбата S на 3-4 порядка меньше концентрации модификатора Л/и растворителя L.
Количественное описание зависимости удерживания водорастворимых витаминов от мольной доли модификатора в бинарной подвижной фазе для обращенно-фазовой ВЭЖХ дается с применением универсальной квазихимической модели, учитывающей межмолекулярные взаимодействия компонентов хроматографической системы.
В хроматографической системе могут наблюдаться следующие виды взаимодействий: сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, сорбат-модификатор модификатор-модификатор.
Если в системе преобладают взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, то зависимость коэффициента удерживания от мольной доли модификатора Мт описывается соотношением (2):
i [\+(ки-\)-мт}_
<P-KS
а0 + а[Мт (2)
Когда в системе преобладают взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, сорбат-модификатор, указанная зависимость имеет следующий вид:
^=Ык„-1)-м,МикпГЮ= (3)
к1 Ф-К5 0 т 1
В случае, когда в системе преобладают взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, модификатор-модификатор - зависимость коэффициента удерживания от мольной доли модификатора передается соотношением (4):
1 [l + (Ки - Q- Л/т - 2КММ ■ М2„ ] _ ,
. i ~ . — аа + "1
гМ.+Ъ'К (4)
где к - коэффициент емкости; Ф - фазовое отношение (отношение объемов стационарной фазы (СФ) к ПФ); А"? и Км - константы адсорбционного равновесия сорбата и модификатора, Кьм и Кмм ~ константы, отражающе процессы сольватации молекул сорбата и ассоциации молекул модификатора в растворе, Мт- мольная доля модификатора в подвижной фазе, индексы М и 5 относятся к подвижной и неподвижной фазам. Поскольку сорбаты имеют одну природу, а состав элюента в каждой серии опытов оставался неизменным, изменение удерживания водорастворимых витаминов обусловлено взаимодействиями сорбат-сорбент и модификатор-сорбент (уравнение 2). Функциональная зависимость по типу доминирующих в системе межмолекулярных взаимодействий сорбат-сорбент и модификатор-сорбент и изменению закономерностей удерживания сорбатов, связанных с составом бинарного элюента, адекватно описывается полиномом первой степени.
Этот тип зависимости свидетельствует о том, что удерживание сорбатов на поверхности сорбента осуществляется за счет непосредственного контакта неполярного сорбента и полярных функциональных групп молекул сорбатов.
Как видно из таблицы 1 увеличение содержания модификатора в ПФ (ацетонитрила, метанола и тетрагидрофурана) приводит к примерно одинаковому уменьшению удерживания витаминов, следовательно, селективность разделения витаминов зависит, в основном, от концентрации модификатора. При элюировании витаминов метанолом и тетрагидрофураном наблюдается формирование размытых в тыловой области асимметричных хроматографических пиков А.,>1,5. Размывание и перекрывание хроматографических зон определяемых витаминов затрудняет их количественную идентификацию и, как следствие, эффективность разделения малая (Я8<0,13), тогда как при элюировании ацетонитрилом, особенно, при содержании модификатора 5 об %, эффективность разделения очень высока (Я8=0,13), а фактор асимметрии приближается к оптимальным значениям 0,7<А5<1,5.
Таким образом, нами показано, что хроматографическая система вода-ацетонитрил - вштейу-Сю обладает высокой избирательностью сорбента и хорошей эффективностью разделения витаминов.
Таблица 1
Зависимость коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов от природы и мольной доли органического модификатора ___в бинарной водно-органической подвижной фазе__
Модификатор к1 А5
Конц ентра ЦИЯ, С(%) Мольн ая доля, Мга 102 В, в2 Вз в5 в6 в9 В1 в2 Вз в5 в6 В, Вз/ В, В,/ Вб Вб/ в5 Вз/ в9 в9/ в2
Ацетонитрил-вода
0,1 0,26 15,9 95,3 10,0 70,5 62,8 86,3 3,9 3,7 4,1 4,0 3,2 2,1 8,5 14,6 9,4 14,0 15,3
0,6 1,61 11,6 81,7 7,8 51,7 43,5 51,5 3,6 3,1 3,2 3,3 2,9 1,8 3,7 8,5 7,0 13,2 11,9
2,0 5,20 9,5 65,5 5,6 42,1 31,2 40,3 2,5 2,7 2,3 2,8 1,8 1,6 2,5 2,9 5,9 9,4 6,1
5,0 13,00 5,7 50,7 3,7 31,5 20,2 27,1 1,3 1,5 1,1 1,3 1,1 1,2 1,3 1,3 4,9 1,7 2,8
8,0 20,80 3,0 31,0 2,1 19,8 8,6 16,0 1,1 1,2 1,0 1,1 0,9 1,1 0,4 0,8 2,8 1,1 1,6
Тетрагидрофуран-вода
0,1 0,16 3,2 86,1 2,0 67,0 57,9 72,0 3,6 3,9 4,6 4,7 3,2 2,5 0,09 0,1 0,03 0,06 0,09
0,6 0,94 2,5 73,2 1,5 35,2 28,7 51,5 2,5 3,3 4,1 4,3 2,9 1,9 0,03 0,08 0,08 0,03 0,07
2,0 3,10 2,4 59,7 1,2 26,3 20,6 31,2 2,1 2,5 3,3 3,8 2,1 1,3 0,02 0,05 0,07 0,02 0,05
5,0 7,73 1,2 41,8 0,9 19,9 15,1 20,9 1,9 1,7 2,9 2,6 1,5 1,1 0,01 0,02 0,02 0,01 0,03
8,0 12,40 1,0 24,2 0,5 4,6 3,9 15,5 1,2 1,1 1,5 1,7 0,9 0,7 0,03 0,02 0,01 0,00 0,01
Метанол-вода
0,1 0,15 14,4 92,5 12,0 58,0 47,9 69,2 3,7 3,5 4,2 4,7 3,1 2,0 0,36 0,91 0,36 0,61 0,59
0,6 0,60 10,2 81,4 9,5 43,7 18,5 48,8 2,2 2,9 3,9 4,3 2,7 1,5 0,23 0,54 0,23 0,48 0,41
2,0 3,00 8,1 67,8 7,2 31,2 12,7 29,6 1,8 2,6 2,9 3,8 1,9 1,3 0,16 0,26 0,15 0,32 0,23
5,0 7,50 6,5 52,6 5,9 19,1 9,7 20,2 1,5 1,1 2,6 2,6 1,2 1,1 0,08 0,12 0,09 0,19 0,15
8,0 12,00 4,3 32,4 3,5 6,1 5,8 9,7 0,9 0,9 1,3 1,8 0,8 0,8 0,05 0,08 0,05 0,11 0,09
Проверка правильности расчетов проведена независимым методом с использованием программы ACD-Lab/Log Р Version 1.0, позволяющей по химическим формулам соединений рассчитывать логарифмы коэффициентов удерживания витаминов Вг, Вэ, В?. В таблице 2 представлены значения коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов, рассчитанные по уравнению (2), по программе и литературные данные.
Таблица 2
Значения логарифмов коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов
Витамин Значения логарифмов удерживания
Рассчитанные по уравнению (2) По программе ACD-Lab/Log Р Version 1.0 Литературные данные [1]
Bi 0,76 - 0,95
B2 1,71 -3,26 ±0,72 -
Вз 0,57 0,82 ± 0,23 -
B5 1,49 - -
B6 1,31 - 1,32
В, 1,43 -2.29 ± 0.50 -
Как видно из таблицы 2, рассчитанные по уравнению 2 коэффициенты сопоставимы с литературными данными, но имеются отличия со значениями рассчитанными программой. Это, видимо, объясняется тем, что программой ACD-Lab/Log Р Version 1.0 не учитывается влияние растворителя и модификатора.
Нами были выбраны условия хроматографического определения водорастворимых витаминов (таблица 3).
Таблица 3
Условия хроматографического определения водорастворимых витаминов
Колонка 5штеИу-С18 0 3,9x150 мм с сорбентом, размер зерна которого равен 5 мкм
Подвижная фаза водно-ацетонитрильная
Скорость потока подвижной фазы 1 см^/мин
Температура термостата колонки 30 °С
Объем вводимой пробы 20 мкл
Детектирование в диапазоне длин волн 200-400 нм
Бьио изучено взаимное влияние водорастворимых витаминов (В|, Вг, Вз, В5, Вб, В9) и проведен расчет предельно допустимых их соотношений, при которых мешающее влияние не сказывается.
Изучение взаимодействия в работе выполнено в двух вариантах: построение градуировочного графика одного витамина при постоянной концентрации в растворе всех остальных и наоборот: при постоянной концентрации одного и изменении концентрации всех остальных водорастворимых витаминов группы В.
Концентрационные зависимости В2, Вз, В5, В6, В9 в рабочем диапазоне концентраций в присутствии витамина Bi представлены на рисунке 1. Концентрации витаминов изменяли от 1,0 мг до 7,0 мг на 100 мл. Концентрация витамина Bi составляла 1,0 мг в 100 мл.
'An optimized method for the simultaneous determination of vitamins Bi, B6, Bi2, in multivitamin tablets by high performance liquid chromatography// Markopoulou C.K., Kagkadis K.A., Koundourellis J.E.//J. Pharm. and Biomed. Anal.-2002-Vol.30-N 4.-P. 1403-1410.
5 6
Сш . р.р,, мг/100 мл
Рис. 1. Концентрационные зависимости водорастворимых витаминов Вг, В3, В5, Вб, В? в присутствии витамина В)
Из графика видно, что концентрационные зависимости сохраняют линейность в рабочем диапазоне концентраций, при этом аналитический сигнал витамина В) уменьшается при увеличении содержания отдельных компонентов в пробе. Линейный характер зависимостей подтверждается результатами корреляционного анализа.
Нами проведена оценка систематической погрешности определения витаминов методом ВЭЖХ.
Выражение для систематической погрешности можно записать как: С,-С, ...
Р = ~(5) Ч>
С, - определяемое содержание витамина В, в присутствии сопутствующих витаминов,
С0 - содержание витамина В; в пробе. Зависимость изменения погрешности определения витамина В| от соотношения содержания витаминов указывает на необходимость проведения процедуры оценки предельных соотношений водорастворимых витаминов при заданном значении систематической погрешности.
При взаимодействии компонентов в многокомпонентном концентрате оценка предельных соотношений водорастворимых витаминов проведена на основе экспериментальных зависимостей хроматографического сигнала определяемого витамина от его содержания в растворе и от содержания сопутствующих витаминов. На рис. 2 представлены номограммы зависимостей концентрации витамина В, от соотношения витаминов в растворе при заданной погрешности определения р = 0,15. На номограмме четко выделяется область предельных соотношений концентраций от 0,03 до 0,20, в которой возможно с погрешностью р = 0,15 уверенно определять заданные содержания витаминов.
С«!»,,
Рис. 2. Зависимость концентрации витамина В( от соотношения витаминов в растворе при заданной погрешности определения р = 15%
Таким образом, получены предельные соотношения водорастворимых витаминов для одновременного их определения методом ВЭЖХ, которые удовлетворяют содержанию их в реальных пробах БАД.
На основе проведенных исследований и расчетов предельных соотношений водорастворимых витаминов в пробе разработан алгоритм методики количественного определения водорастворимых витаминов группы В в БАД, пищевых продуктах и премиксах.
Глава 4 посвящена исследованию влияния рН раствора при подготовке проб модельных смесей, содержащих витамины В], В2 - 0,025 %, Вз - 0,1 %, В5, В<; - 0,05 % и В9 - 0,002 % на результаты определения витаминов. Полученные результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4
Результаты содержания определяемых витаминов при различной кислотности среды на стадии пробоподготовки
рН 3 4 5 6 7 8 9 10
Содержание,
В, 0,025 0,0235 0,023 0,02 0,019 0,018 0,018 0,017
в2 0,025 0,024 0,0235 0,015 0,013 0,014 0,016 0,015
Вз 0,11 0,10 0,09 0,08 0,08 0,07 0,07 0,06
в5 0,049 0,048 0,048 0,042 0,039 0,038 0,036 0,035
в6 0,051 0,05 0,049 0,044 0,039 0,037 0,036 0,037
В, 0,0019 0,0018 0,0017 0,0016 0,0015 0,0016 0,0018 0,002
Зависимость определяемой концентрации витаминов от рН раствора представлена на рис. 3-4.
23456789 10 11 23456789 10 11
рНр-р. РНр-к
Рис. 3. Зависимость определяемой концентрации витаминов В1,В2,Вз,В5,Вб,В9 от рН раствора
Как видно из результатов, представленных в таб. 4, графика, аналитический сигнал витаминов В2, В9 в нейтральной среде уменьшается. Максимальное значение отклика для витаминов В1,В2,Вз,В5,В6 наблюдается при рН =3. При рН 8-10 лучше всего переходит в раствор витамин В9. При рН 3 наблюдается незначительное занижение содержания витамина В9. Наиболее благоприятной для определения витамина В9 является среда с рН от 8 до 10. Однако, при рН=3 величина аналитического сигнала уменьшается не более, чем на 5%.
Таким образом, оптимальным значением рН раствора для определения витаминов Вь Вг, Вз, В5, Вб и Вч является 3, при котором все шесть водорастворимых витаминов максимально переходят в раствор в процессе пробоподготовки.
Было изучено поведение витаминов на модельных смесях с разной органической матрицей, состав модельных смесей был приближен к реальным объектам. В качестве
матрицы использовали соевый протеин, сахар, рыбий жир и яблочный пектин. Графики зависимости относительного стандартного отклонения содержания витамина от его концентрации представлены на рис. 4.
Витамины в жире (рыбий жир)
-•-витамин В1 витамин В2 -*- витамин ВЗ -и-витамин В5 -*- витамин В6 -•— витамин В9
Витамины в сахаре
Витамины в клетчатке (яблочный пектин)
-витамин В1 -витамин В2 -витамин ВЗ -витамин В5 -витамин В6 - витамин В9
Витамины в белке
Рис. 4. Оценка мешающего влияния органической матрицы при определении ВРВ и оценка предела обнаружения определяемых содержаний витаминов
Как видно из графиков, стандартное отклонение определяемого содержания большинства водорастворимых витаминов не превышает 20 %. Значительное отклонение (40 %) для витамина В9 объясняется влиянием органической матрицы. Поэтому на примере витамина В9 была проведена оптимизация условий подготовки проб при определении водорастворимых витаминов.
Предложена схема алгоритма оптимизации пробоподготовки БАД при определении водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ:
• Выбор композиционных факторов и параметров оптимизации планирования эксперимента
• Математическое планирование проведения эксперимента
• Проведение хроматографического эксперимента в соответствии с выбранным объектом
• Построение расширенной матрицы планирования
• Проверка адекватности выбранной математической модели эксперимента
Поиск оптимальных условий пробоподготовки проведен с помощью факторного планирования эксперимента на примере определения фолиевой кислоты (витамин В9) в витаминизированном премиксе 1-03. В качестве параметра оптимизации выбрано значение содержания витамина В? в пробе. Варьируемыми факторами выбраны: объем соляной кислоты (Х1), концентрация соляной кислоты (Хг), температура УЗ-ванны и время УЗ-обработки. Исследуемые факторы на основном и двух уровнях представлены в таблице 5.
Таблица 5
Условия факторного планирования эксперимента_
№ Фактор Основной уровень Интервал варьирования Верхний уровень Нижний уровень
X! Х(М Дх| Х(М+ДХ| хи-Лх|
1 Объем соляной кислоты (X,), см3 10 5 15 5
2 Концентрация соляной кислоты (Хт), М 0,1 0,05 0,15 0,05
3 Температура УЗ-ванны, °С 65 10 75 55
4 Время УЗ-обработки, мин. 20 15 35 5
После проверки значимости коэффициентов по критерию Стьюдента и адекватности модели по критерию Фишера, получено уравнение регрессии, адекватно описывающее поведение исследуемой системы (уравнение 5):
У* = 0,196+ 0,018X1 + 0,0198Х3 + 0,1144 Х4"Ю,016 Х,Х2+0,016 Х,Х3-Ю,0098 Х,Х4+0,012 Х2Х4 (6)
Для поиска оптимума функции отклика нами применен метод крутого восхождения, исследование поверхности отклика в районе экстремума проведено с использованием центрального ортогонального композиционного планирования. Обработка опытных данных для получения математической модели проведена методами классического регрессионного и корреляционного анализа, в результате нами выбраны оптимальные условия пробоподготовки:
■ Объем соляной кислоты -10 см3
■ Концентрация соляной кислоты - 0,1 М
■ Температура УЗ-ванны - 65 °С
■ Время УЗ-обработки - 20 мин.
При определении водорастворимых витаминов группы В в пробах БАД, обогащенных пищевых продуктов и премиксов методом ВЭЖХ альтернативой способу подготовки проб по ГОСТ Р 50929-96 и НД является предложенный нами алгоритм, показанный на рис.5.
Рис. 5. Схема подготовки пробы на содержание водорастворимых витаминов в пробах БАД, премикса, пищевой продукции
Этапы процесса пробоподготовки с УЗ - интенсификацией для определения витаминов в различных объектах представлены в табл. 6.
Таблица 6
№ Содержание этапов пробоподготовки Условия
1 Взятие навески образца Масса навески до 1,0 г
2 Гидролиз на водяной бане Время гидролиза - 20 минут, объем 0,1 М НС1 -10 см
3 Экстрагирование в УЗ-ванне Время экстрагирования - 20 минут, 1=65 С, частота 35 кГц
4 Отделение экстракта от матрицы пробы фильтрованием Фильтр с размером пор 0,45 мкм
Для оценки эффективности предложенного способа пробоподготовки результаты определения витамина Вб в ряде объектов были сопоставлены с данными, полученными с использованием пробоподготовки по ГОСТ Р 50929-96.
Таблица 7
Влияние УЗ- воздействия на время пробоподготовки и выход витаминов пробах БАД,
обогащенных пищевых продуктов и премиксов методом ВЭЖХ (п=3, Р=0,95)
Объект Масса, г Содержание витамина Вб, % Время УЗ-обработ ки, мин Время проведсни: анализа, мин
Подготовка по ГОСТ Р 5092996 Подготовка с УЗ-воздействием без УЗ с УЗ
БАД «Дискавери» 0,32 0,09 0,11 20 60 45
Витаминные премикс 1-03 0,13 1,07 1,08 20 60 45
Суп «Гороховый» 1,87 0,0035 0,0050 20 60 45
Субстанция витамина В6 0,01 99,0 99,0 10 45 30
Как видно из табл. 7, применение УЗ-воздействия на стадии растворения пробы ускорило разложение БАД, супа и премикса (быстро достигается гомогенизация пробы). Таким образом, применение УЗ-воздействия позволило сократить в целом время анализа на 15 % с улучшением метрологических характеристик.
Глава 5. На основе проведенных исследований был предложен алгоритм методики определения водорастворимых витаминов В|, В2, Вз (никотинамид, РР), В5, Вб, и В? (фолиевая кислота).
В качестве элюента (подвижной фазы) выбрана смесь водных растворов гептансульфоната натрия и калия фосфорнокислого однозамещенного (1,0 г гептансульфоната натрия и 3,40 г калия фосфорнокислого однозамещенного на 1000,0 см3 воды). Оптимальное значение кислотности раствора устанавливали с помощью ортофосфорной кислоты до значения рН 2,5-3,0. Растворы дегазировали и фильтровали через фильтр с размером пор 0,45мкм.
При выполнении анализа навеску анализируемого образца переносили в мерную колбу вместимостью 50 см3, прибавляли 10 см3 0,1 М соляной кислоты и обрабатывали смесь на ультразвуковой бане в течение 20 минут при температуре 65°С. Охлаждали смесь до комнатной температуры, прибавляли 30-35 мл подвижной фазы в соотношении А:В 80:20
(раствор А-смесь водных растворов гептансульфоната натрия и калия фосфорнокислого однозамещенного; раствор В-ацетонитрил) и помещали в ультразвуковую баню на 5 минут, после чего доводили раствор подвижной фазой до метки и фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм.
При использовании выбранных условий хроматографического определения была экспериментально получена линейная зависимость аналитического сигнала от концентрации витаминов в растворе в широком диапазоне концентраций. Достигнуто четкое разделение витаминов в градиентном режиме для водорастворимых витаминов и изократическом - для жирорастворимых витаминов. Количественное определение витаминов проводили в пробе методом внешнего стандарта (рис. 6,7).
Рис. 6. Хроматограмма витаминного премикса. Время удерживания витамина Вз (никотинамид)- 3,621 мин., В] - 4,807 мин., В6 - 6,512 мин., В9 - 9,680 мин.,Вг - 11,521 мин., Bs (пантотенат кальция)- 7,775 мин.
Рис. 7. Хроматограмма витаминного премикса. Время удерживания витамина А - 2,780 мин., Рз - 4,609 мин., Е - 6,368 мин.
Полученные характеристики хроматографического разделения (время удерживания, критерий разделения) и длины волн витаминов представлены в таблице 8.
Таблица 8
Характеристики хроматографического разделения и детектирования витаминов
(п=6; Р=0,95)
Витамин Время удерживания, мин. Критерий разделения Длина волны, нм
1 2 3 4
в, 4,81 ±0,07 4,8 246
в2 11,52±0,07 5,2 267
Вз 3,62±0,09 6,3 261
в5 7,78±0,08 6,3 200
1 2 3 4
В* 6,51 ±0,07 7,5 291
Вч 9,68±0,09 7,5 283
Л 2,78±0,08 6,2 325
Е 6,37±0,07 4,9 284
о, 4,61 ±0,09 7,5 265
На основе проведенных исследований были разработаны методики одновременного количественного определения водорастворимых витаминов (В:, В2, Вз, В5, Вб, В9) в градиентном режиме и жирорастворимых (А, Е, Рз) в изократическом режиме хроматографирования и достигнуто четкое разделение витаминов. Полученные результаты представлены в таблице 9.
Таблица 9
Результат определения водорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых
продуктах (Р=0,95, п-15)
Объект анализа Кол-во в, в2 Вз в5 в6 в9
ВМ премикс 5-03 Заложено по рецептуре, % 0,374 0,345 3,235 - 0,408 0,032
Определено, % 0,40± 0,06 0,36± 0,06 3,20 ± 0,24 - 0,41+ 0,05 0,028: 0,006
В премикс 103 Заложено по рецептуре, % 0,627 0,627 0,715 - 0,77 0,23
Определено, % 0,65± 0,11 0,64± 0,09 0,72± 0,05 - 0,74 ± 0,09 0,20 Ъ 0,05
БАД «Глазорол» Заложено по рецептуре, % 0,1 0,23 1,0 0,6 0,2 0,02
Определено, % 0,098± 0,007 0,231 0,04 1,08 ± 0,11 0,71 ± 0,13 0,21 ± 0,04 0,025 0,006
БАД «Мемори райз» Заложено по рецептуре, % 0,1 - 1,0 0,5 0,2 0,02
Определено, % 0,11± 0,03 - 0,98 ± 0,04 0,482 ± 0,038 0,20 ± 0,05 0,019 0,002
Каша пшеничная Заложено по рецептуре, % 0,0016 - - - 0,0017 -
Определено, % 0,0015± 0,0002 - - - 0,0015± 0,0002 -
Проверка правильности разработанной методики определения витаминов подтверждена сравнением с другими методами определения витаминов, результаты представлены в таблице 10.
Таблица 10
Сравнение различных методов количественного определения витаминов, %
Проба Определяемый витамин вэжх ив СФМ
1 2 3 4 5
Витаминно-минеральный премикс 5-03 Вб 0,39±0,05 - 0,35±0,04
БАД «Мемори райз» В1 0,104±0,015 0,098±0,029 -
1 2 3 4 5
Витаминный премикс 1-03 А 0,98±0,01 - 1,12±0,34
БАД «Супер шилд» Е 2,35±0,19 2,29±0,19 -
На основании проведенных исследований разработаны многоэлементные методики КХА БАД на содержание водо- и жирорастворимых витаминов, которые прошли метрологическое согласование и аттестацию в аккредитованной метрологической службе Томского политехнического университета и внесены в государственный федеральный реестр методик выполнения измерений, допущенных к применению в сфере государственного метрологического контроля и надзора.
Определены диапазоны измеряемых концентраций витаминов, а также диапазоны приписанных характеристик погрешности витаминов группы В и жирорастворимых витаминов (таблица 11).
Таблица 11
Диапазон измеряемых концентраций и приписанные характеристики погрешности
Компонент Диапазон измеряемых концентраций, % масс. Показатель повторяемости (среднеквадратическое отклонение повторяемости), % Показатель воспроизводимости (среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), %
Витамин В] от 0,005 до 5,0 4 7
Витамин В2 от 0,005 до 5,0 5 7
Витамин Вз от 0,10 до 10,0 2 4
Витамин В5 от 0,05 до 5,0 4 8
Витамин Вб от 0,05 до 5,0 3 6
Витамин Вч от 0,002 до 0,5 7 12
Витамин А от 0,03 до 0,2 3 5
Витамин Е от 0,1 до 1,0 2 4
Витамин Оз от 0,01 до 0,1 11 15
Сравнение нормативных документов по определению водорастворимых витаминов (таблица 12) позволило выявить достоинства разработанной методики.
Таблица 12
Параметры ГОСТР 50929-96 нд 42-11946-01 Руководство Р 4.1.1672-03 ФР.1.31.2005.0191 7, МУ 08-47/185
1 2 3 4 5
Виды продукции Премиксы Премиксы БАД БАД, премиксы, пищевые продукты
Определяемы е витамины В„В2,В3 В,, В2, В3, В5, В6, В, В], В2, Вб ВЬВ2,В3, В5, Вб, В9
Диапазон определяемых концентраций, % В ,-0,005-0,05 В2-0,1-0,2 Вз-0,02-0,40 В,-0,452-0,576 В2- 0,396-0,484 Вз-3,960- 4,840 В5-2,250-2,750 В6-0,483-0,590 Вд-0,090 -0,115 Не указаны Вг 0,005-5,0 В,- 0,005-5,0 Вз-0,10-10,0 В5-0,05-5,0 В6-0,05-5,0 В„-0,002-0,5
Время пробоподгото вки 45 минут 45 минут 35 минут 25 минут
1 2 3 4 5
Наличие Отсутствуют Отсутствуют 8, aR Д , Д с, 8, oR
характеристик
погрешности
Наличие нормативов контроля Отсутствуют Отсутствуют Кд Rn, Кд
Как видно из таблицы, разработанная и аттестованная методика позволяет определять водорастворимые витамины во всех группах продукции (премиксы, БАД, пищевые продукты), расширен спектр определяемых витаминов и диапазоны их концентраций, сокращено время пробоподготовки и, тем самым, улучшены метрологические характеристики.
Разработанные методики используются для оптимизации и усовершенствования технологии производства продукции компании «Артлайф», что позволяет одному из самых крупных российских производителей БАД и пищевых продуктов, обогащенных биологически активными веществами (БАВ) подтверждать высокое качество своей продукции.
Выводы
1. Исследованы условия определения водорастворимых витаминов группы В методом ВЭЖХ при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола. Рассчитаны коэффициенты емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов с применением универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ. Установлено, что оптимальное значение параметров удерживания витаминов наблюдается при содержании модификатора - 5 об. %.
2. Сделана сравнительная оценка коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов, рассчитанных различными методами: по программе ACD-Lab/Log Р Version 1.0 и с применением универсальной квазихимической модели и проведено их сопоставление с литературными данными. Выбраны условия хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В: колонка Simmetry-Cig, водно-ацетонитрильный элюент.
3. Исследовано мешающее влияние водорастворимых витаминов и проведен расчет их предельных соотношений при определении методом ВЭЖХ с систематической погрешностью не более 15 %.
4. Изучено влияние органической матрицы в модельных системах на основе белка, сахара, жира и пектина при определении водорастворимых витаминов и проведена оценка предела обнаружения витаминов Bi, В2, В3, В5, Вб, В9 при совместном определении их методом ВЭЖХ. Установлено, что стандартное отклонение определяемого содержания большинства водорастворимых витаминов не превышает 20 %, а для витамина В9 - 40 %.
5. Разработан алгоритм пробоподготовки, предложена дополнительная стадия УЗ-экстрагирования и проведена ее оптимизация на примере витамина В9 в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах.
6. Разработаны методики количественного химического определения Bi, В2, В3, В5, Вб В9, А, Е и D3 в биологически активных добавках, премиксах и пищевых продуктах. Методики метрологически аттестованы и внесены в Федеральный Реестр МВИ, что подтверждается свидетельствами об аттестации и внедрением в ряде аналитических лабораторий.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Слепченко Г. Б., Вековцев A.A., Шелеметьева О.В.//Инверсионно-вольтамперометрический метод контроля качества и безопасности в производстве БАД// Материалы международного симпозиума «Федеральный и региональный аспекты политики здорового питания». Кемерово, -2002. - С.84-85
2. Панова И.И., Шелеметьева О.В., Новикова И.К., Скрынникова Е.В., Даньковых J1.A.// Физико-химические и микробиологические методы контроля качества и безопасности производства БАД// Материалы международного симпозиума «Федеральный и региональный аспекты политики здорового питания». Кемерово, -2002.-С. 85-87.
3. Шелеметьева О.В., Слепченко Г.Б.//Особенности хроматографического определения биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье, БАД и пищевых продуктах на их основе//Материалы международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». Томск, -2006.-Т.2-С.152-153
4. Шелеметьева О.В., Сизова Н.В., Слепченко Г.Б.//Проведение сличительных испытаний в растительных экстрактов определения биологически активных веществ методами инверсионной вольтамперометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии//Материалы региональной научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве». Томск, -2007.-С.57
5. Шелеметьева О.В., Слепченко Г.Б.// Возможности хроматографического контроля биологически активных добавок и пищевых продуктов на содержание биологически активных веществ// Материалы II Всерос. конф. По аналитической химии» с междунар. участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова). Краснодар, -2007. - С. 483.
6. Шелеметьева О.В. //Определение флавоноидов в биологически активных добавках к пище методом ВЭЖХ//Сборник материалов Международной выставки и научно-практической конференции «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности». Москва, - 2007.-С. 183-186
7. Шелеметьева О.В., Слепченко Г.Б., Австриевских А.Н.// Контроль содержания водорастворимых витаминов в биологически активных добавках, пищевых продуктах и премиксах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии// Журнал «Заводская лаборатория»-2008.- №6.-С. 6-9
8. Мартынюк O.A., Шелеметьева О.В., Щукина Т.Н.// Сравнительный анализ грудного молока на содержание витаминов группы В методами инверсионная вольтамперометрия (ИВ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)// Материалы VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2008». Уфа-Абзаково. - 2008. -С. 72
9. Слепченко Г.Б., Мартынюк O.A., Шелеметьева О.В.// Разработка методик определения водорастворимых витаминов// Известия Томского политехнического университета. - 2008. -Т 312,- №3.-С.58-61
10. Шелеметьева О.В., Слепченко Г. Б. // Расчет предельно допустимых соотношений водорастворимых витаминов в методе ВЭЖХ и его реализация на примере анализа БАД// Рефераты докладов II Международного Форума «Аналитика и аналитики». Воронеж ,-2008,- С. 613.
11. Пикула Н.П., Шелеметьева О.В. // Особенности разработки и аттестации методик анализа на содержание биологически активных веществ//Материалы VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока». Томск, - 2008. - С. 242
12. Шелеметьева О.В., Сизова Н.В., Слепченко Г.Б.//Определение содержания витаминов и биологически активных веществ в растительных экстрактах различными методами// Химия растительного сырья-2009.-№1. С. 113-116
13. Шелеметьева О.В., Макаренко М.А.// Особенности производства и
стандартизации экстракта коры ивы// Материалы IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Барнаул. - 2009. -С. 93-94
Соискатель выражает благодарность д.т.н., профессору, директору ООО «Артлайф» Австриевских А.Н. за предоставленную возможность выполнения работы на базе лаборатории предприятия и огромную признательность научному руководителю д.х.н., с.н.с. Слепченко Г.Б., к.х.н., доценту Пикула Н.П. и другим сотрудникам кафедры физической и аналитической химии Томского политехнического университета за постоянное внимание к работе, консультации и помощь в обсуждении результатов.
ГЪаписэно к печати 13. (0.2009. Формат 60x84/16. Бумага -Снегурочка«. Печать XEROX. Усл.печ.л. 8,84. ft.-издл. 8,0. _Заказ 969 09. Тираж ЮОэкз._
Томский политехнический университет Система менеджмента качества Томского политехнического университета сертифи1*1р0взна NATONAL СШ.ПУ ASSURANCE по стандарту ISÛ 9001:2000
ИИ
auwutaWm, 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30.
Введение
Глава 1 Литературный обзор.
1.1. Основные свойства витаминов.
1.2. Аналитические возможности физико-химических методов определения витаминов.
1.3. Современное состояние определения витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Экспериментальная часть
Глава
2.1. Приборы, оборудование и методика выполнения эксперимента.
2.2. Растворители и реактивы.
2.3. Объекты исследования.
Глава
3.1. Выбор рабочих условий для определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
3.2. Изучение взаимного влияния водорастворимых витаминов и расчет их предельно допустимых соотношений в методе ВЭЖХ.
Глава
4.1. Исследование влияния рН среды при пробоподготовке исследуемых объектов.
4.2. Изучение мешающего влияния органической матрицы при определении водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
4.3. Оптимизации условий подготовки пробы при определении витаминов методом ВЭЖХ.
4.4. Алгоритм пробоподготовки при определении водорастворимых витаминов методом
ВЭЖХ.
Глава 5 Методики определения витаминов методом
ВЭЖХ.
5.1. Методика определения водорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ.
5.2. Методика определения жирорастворимых витаминов в премиксах, БАД и пищевых продуктах методом ВЭЖХ.
5.3. Расчет массовых концентраций витаминов.
5.4. Метрологическое обеспечение хроматографического анализа.
Обсуждение результатов.
Выводы.
Актуальность. Водорастворимые и жирорастворимые витамины -незаменимые органические вещества, биологические катализаторы химических реакций, протекающих в организме человека; они активно участвуют в обмене веществ и поступают в организм человека практически полностью из внешней среды.
Для поддержания баланса витаминов в организме широкое применение нашли витаминизированные продукты и биологически активные добавки к пище (БАД). Одним из важнейших показателей потребительского качества продукции подобного рода является соответствие содержания биологически активных веществ согласно заявленной рецептуре. Для восстановления качества продуктов питания был принят документ «Основы государственной политики в области здорового питания граждан Российской Федерации на период до 2020 года», пришедший на смену «Концепции здорового питания населения России до 2005 года».
Разработка и совершенствование методов определения витаминов является актуальной задачей, от решения которой зависит качество и безопасность подобной продукции. Выбор инструментального метода анализа для определения водо- и жирорастворимых витаминов в пищевых продуктах обусловлен рядом общих соображений, например: пределами обнаружения метода в зависимости от определяемых содержаний, требованием многоэлементности, допускаемой погрешностью, временными затратами, стоимостью анализа. Безусловно, предпочтение отдается методам, требующим минимальной подготовки пробы к анализу при максимальной информативности. Таким требованиям максимально удовлетворяет метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Современное развитие метода ВЭЖХ расширило аналитические возможности определения витаминов в обогащенных пищевых продуктах. Необходимая подготовка пробы образца весьма проста относительно других методов, что связано прежде всего с исключительной универсальностью, высокой эффективностью разделения, благоприятными условиями анализа (низкая температура, инершый растворитель, отсутствие контакта с кислородом).
Однако, несмотря на интенсивное развитие этого метода в последние 10 лет, в литературных источниках практически отсутствуют методики определения витаминов в таких объектах, как БАД. Трудности в создании методик во многом обусловлены сложностью объектов анализа, таких как обогащенные продукты, в состав которых входят лекарственное растительное сырье (JIPC), растительные экстракты (РЭ), различные минеральные добавки, красители и другие наполнители; низкими концентрациями витаминов в объектах анализа и высокой чувствительностью к термическому, фотоокислительному и химическому воздействиям. Поэтому разработка экспрессных методик одновременного количественного определения водо- и жирорастворимых витаминов в БАД является актуальной задачей.
Целью работы являлось исследование параметров хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В, выбор оптимальных условий их определения и разработка экспрессных методик аналитического контроля БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание жиро- и водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
• исследовать хромато графическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола, провести оценку коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов;
• установить параметры хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В;
• оптимизировать основные стадии и предложить алгоритм пробоподготовки для определения витаминов в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах; разработать и метрологически аттестовать методики количественного химического анализа БАД, пищевых продуктов и премиксов на содержание витаминов
Научная новизна:
• впервые исследовано хроматографическое поведение водорастворимых витаминов при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола и установлены условия определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
• показана применимость универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимодействий сорбат-сорбент, модификатор-сорбент в хроматографической системе и проведен расчет параметров хроматографического разделения: коэффициентов емкости, асимметрии и разрешения пиков водорастворимых витаминов;
• проведена оценка мешающего влияния водорастворимых витаминов группы В при их совместном присутствии, рассчитаны предельные соотношения водорастворимых витаминов в пробе при заданной систематической погрешности и оценены основные составляющие органической матрицы при определении витаминов методом ВЭЖХ;
• впервые установлены и оптимизированы условия ультразвуковой обработки проб для интенсификации стадии экстракционного извлечения пищевых продуктов и премиксов для последующего определения содержания водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ;
• впервые разработаны методики количественного химического анализа проб Б АД, пищевых продуктов и премиксов на содержание воДО" и жирорастворимых витаминов методом ВЭЖХ.
Практическая значимость работы состоит в том, что:
• на основании проведенных исследований проведена метрологи:^©01^51 аттестация методик количественного химического анализа водорастворимых витаминов (ВРВ) и жирорастворимых витаминов (ЖРВ) для широкого крУга объектов: премиксов, БАД и витаминизированных продуктов пиидевои промышленности. Методики позволяют экспрессно (в течение 45-60 ivhHHут) проводить определение 6 водорастворимых витаминов в сложной матрице БАД;
• разработанные методики: «Биологически активные добавки, пиисхевые продукты, премиксы. Хроматографический (ВЭЖХ) метод опреде.л©ния массовой концентрации водорастворимых витаминов Вь В (никотинамид, никотиновая кислота ), В5, В6 и фолиевой кислотен» и «Биологически активные добавки, премиксы. Хроматографический
ВЭ^Х) метод определения массовой концентрации жирорастворимых витамин: cz>& ^ Е и Д3» метрологически аттестованы и внесены в государстве^^113111 Федеральный реестр методик выполнения измерений, допущеннь»х^< к применению в сфере государственного метрологического контроля и надх^з°Ра под номерами ФР. 1.31.2005.01917, МУ 08-47/185 и ФР.1.31.2005.0181 О 3VH/ 08-47/184 и используются в практике аналитических лабораторий «Эвалар» (г. Бийск), ЗАО «Алтайвитамины» (г. Бийск),
ООО
Внешторгфарма» (г. Москва) и НИИ фармакологии (г. Томск), подтверждается соответствующими актами о внедрении.
Положения, выносимые на защиту:
1. Описание удерживания водорастворимых витаминов с позиций теории универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ.
2. Закономерности удерживания водорастворимых витаминов группы В в условиях градиентной обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и выбор рабочих условий хроматографического определения водорастворимых витаминов.
3. Условия пробоподготовки Б АД, пищевых продуктов, премиксов и алгоритм оптимизации стадии УЗ-экстрагирования при определении витаминов.
4. Методики хроматографического определения водо- и жирорастворимых витаминов.
Апробация работы.
Основные материалы диссертации докладывались и обсуждались на международном симпозиуме «Федеральный и региональный аспекты политики здорового питания» (Кемерово, 2002), международной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2006), региональной научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), II Всероссийской конференции по аналитической химии» с международным участием (к юбилею академика Ю.А.Золотова) (Краснодар, 2007), международной выставке и научно-практической конференции «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности» (Москва, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием «ЭМА-2008» (Уфа-Абзаково, 2008), II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж , 2008), VIII научной конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Томск, 2008), IV Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).
Структура и объем диссертации.
Работа изложена на 138 страницах, иллюстрирована 25 рисунками и содержит 27 таблиц. Диссертация состоит из введения и пяти глав, включая литературный обзор. Список цитируемой литературы содержит 180 библиографических названий работ отечественных и зарубежных авторов. Во введении обоснована актуальность проблемы, определены цели и задачи исследования. Первая глава представляет собой обзор литературы по физико-химическим методам определения водорастворимых и жирорастворимых витаминов в различных объектах. На основании литературного обзора формируются задачи исследования. Описание используемого оборудования, растворителей, реактивов и объектов исследования приведены во второй главе. Третья глава посвящена выбору рабочих условий определения водорастворимых витаминов методом ВЭЖХ, изучению взаимного влияния водорастворимых витаминов и расчету их предельно допустимых соотношений в методе ВЭЖХ. В четвертой главе проведены исследования по влиянию рН среды при подготовке проб, изучено влияние органической матрицы при определении водорастворимых витаминов, изложены результаты оптимизации условий подготовки проб и алгоритм пробоподготовки при определении витаминов методом ВЭЖХ. В пятой главе представлены методики определения водо- и жирорастворимых витаминов и метрологическое обеспечение хроматографического анализа. Анализ полученных экспериментальных данных приведен в обсуждении результатов. В заключении сделаны выводы. В приложении представлены таблицы обобщенных данных по определению показателей повторяемости (сходимости) и показателей внутрилабораторной прецизионности,
Выводы
1. Исследованы условия определения водорастворимых витаминов группы В методом ВЭЖХ при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами на основе ацетонитрила, тетрагидрофурана и метанола. Рассчитаны коэффициенты емкости, асимметрии и разрешения пиков витаминов с применением универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ. Установлено, что оптимальное значение параметров удерживания витаминов наблюдается при содержании модификатора - 5 об. %.
2. Сделана сравнительная оценка коэффициентов удерживания водорастворимых витаминов, рассчитанных различными методами: по программе ACD-Lab/Log Р Version 1.0 и с применением универсальной квазихимической модели и проведено их сопоставление с литературными данными. Выбраны условия хроматографического определения водорастворимых витаминов группы В: колонка Simmetry-Ci8, водно-ацетонитрильный элюент.
3. Исследовано мешающее влияние водорастворимых витаминов и проведен расчет их предельных соотношений при определении методом ВЭЖХ с систематической погрешностью не более 15 %.
4. Изучено влияние органической матрицы в модельных системах на основе белка, сахара, жира и пектина при определении водорастворимых витаминов и проведена оценка предела обнаружения витаминов Вь В2, Вз, В5, Вб, В9 при совместном определении их методом ВЭЖХ. Установлено, что стандартное отклонение определяемого содержания большинства водорастворимых витаминов не превышает 20 %, а для витамина В9 - 40 %.
5. Разработан алгоритм пробоподготовки, предложена дополнительная стадия УЗ-экстрагирования и проведена ее оптимизация на примере витамина В9 в БАД, обогащенных пищевых продуктах и премиксах.
6. Разработаны методики количественного химического определения В], В2, В3, В5, Вб В9, А, Е и D3 в биологически активных добавках, премиксах и пищевых продуктах. Методики метрологически аттестованы и внесены в Федеральный Реестр МВИ, что подтверждается свидетельствами об аттестации и внедрением в ряде аналитических лабораторий.
1. Сенов П.Л. Фармацевтическая химия// М.: Медицина -1978. С. 431-448.
2. НД 42-10173-99 Тиамина гидрохлорид//Фармакопейный Государственный комитет.- М.:-1999. 10 с.
3. НД 42-10207-01 Рибофлавин// Фармакопейный Государственный комитет.- М.-.-2001.- 14 с.
4. НД 42-10360-99 Никотинамид// Фармакопейный Государственный комитет.- М.:-1999.-7 с.
5. НД 42-7050-97 Ниацин// Фармакопейный Государственный комитет.-М.:-1997. -9 с.
6. НД 42-10171-99 Кальция D-пантотенат// Фармакопейный Государственный комитет,- М.:-1999.-9 с.
7. НД 42-7593-97 Пиридоксина гидрохлорид// Фармакопейный Государственный комитет.- М.:-1997.- 7 с.
8. НД 42-10174-99 Фолиевая кислота// Фармакопейный Государственный комитет,- М.:-1999,- 10 с.
9. Мелентьева Г.А. Фармацевтическая химия// М: Медицина. 1976. - 828 с.
10. ГОСТ 7047-55. Витамины А, С, Д, Вь В2 и PP. Отбор проб, методы определения витаминов и испытания качества витаминных препаратов// М.: -Госстандарт России. -1981. -45 с.
11. Колосова И.Ф., Филимонов В.Н., Балятинская JI.H. Разделение синтетических витаминов группы В методом ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографии// Ж. физ. химии 1994. - Т. 68. - N 10. - С. 1832-1834.
12. Государственная фармакопея СССР, XI изд., вып.2// М.: Медицина.- 1998. -397 с.
13. Sane R.T., Ghorpade U.A. Colorimetric estimation of vitamin B, pharmaceutical preparations //Acta vitaminol et enzymol. 1983. - V.5, №1.-P. 29-34.
14. Abdel-Hamid M., Baraiy M., Hassan E. Spectrophotometry determination of ascorbic acid and thiamine hydrochloride in pharmaceutical products using derivative spectrophotometry//Analyst. 1985. - V.110, №7. -P. 831-835.
15. Lopez Gimenez J. M., Bosch Serrat Y.F. Nuevo metodo colorimetrico dedeterminacion de vitamina B. en medicamentos//An. Real. Acad. Farm. -1987. -V.53, №2. -P. 261-268.
16. Viswanan M.V. A colorimetric method for the estimation of vitamin B, in some pharmaceutical dosage forms//Indian J. Pharm. Sci. 1986. - V.48, №3.-P. 80-82.
17. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов// Под ред. И.М. Скурихина, В.А. Тутельяна.-М'.: Брандис, Медицина, 1998.-324 С.
18. Bognar A. Bestimmung von Riboflavin und Thiamin in Lebensmittel mit Hilfe Hochdruch Flussigkeits - Chromatografie (HPLC)//Detsch. Lebensmittel Rasch. - 1981. - V. 77, №12. - P. 431-436.
19. Fellman J.K., Artz W.E. Simultaneous determination of thiamin and riboflavin in selected foods by high-performance liquid chromatography.// J. Food Sci. -1982. V.47, №6. -P. 2048-2050.
20. Augustin Y. Simultaneous determination of thiamin and riboflavin infoods by liquid chromatography//!. Assoc. Offic. Anal.Chem. 1984. - V.67, №5. -P. 1012-1015.
21. Arella F., Lahely S. Liquid chromatography determination of vitamins B, and B2 in foods// Food Chem. 1996. - V.56, №1.-P. 81-86.
22. Halmingh O., Kerkdijk H., Supel H. Automated determination of vitamin A and E in serum by on-line SPE-HPLC// Pittsburg Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. Atlanta. - 1997. P1TTC097: Book Abstr. - P. 561.
23. Amin ML, Reusch J. High-performance liquid chromatography of water-soluble vitamins. Simultaneous determination of vitamins Bb B2, B6 and Bi2 in pharmaceutical preparations//!. Chromatogr. 1987. - V.390, №2. - P. 448-453.
24. Maeero D.Y., Wetzel D.L. Simultaneous determination of thiamin and riboflavin in enriched cereal based products by high-performance liquid chromatography using selective detection// J. Chromatogr. 1984. - V.29, №1.- P. 281-287.
25. Chase G.W., Landen O., Errenmitter R.R., Soliman A.G. Liquid chromatographic determination of thiamine, riboflavin and pyridoxine in infanl formula// J. AO AS. Int. 1992. - V.75, №3. - P. 561-565.
26. Vandenberg H., Vanschaik F., Finglas P. 3rd EuMat intercomparison on methods for the determination of vitamins Bb B2 and B6 in food// Food Chem. -1996. V.57, №L- P. 101-108.
27. ГОСТ 26573-93. Премиксы. Методы определения витамина А// М.: -Госстандарт России. 1993.- 50 с.
28. Государственная фармакопея СССР, X изд.// М.: Медицина.-1998. -397 с.
29. Walkers М.С., Carpenter В.Е., Cooper E.L. Simultaneousdetermination of thiamin and riboflavin in multivitamin product by high-performance liquid chromatography/Л. Pharm Sci. 1981. - V.70, №1. -P. 99-101.
30. Vedrina-Dragojevic Irena, Sebecic Blazenka. Modifid lumiflavin procedure for determination of riboflavin in soyabeat// Z. Lebensm.-Untersuch. und Forsch.-1986.-V. 182,№2.-P. 127-13 0.
31. Ahmad Jgbal, Rapson David H. Multicomponent spectrophotometry assay of riboflavine and photoproducts// J. Pharm. And Biomed. Anal. 1990. -V.8,№>3.-P. 217-223.
32. Olmedilla В., Granado F., Blanco I., Rojas-Hidalgo E. Determination of nine carotenoids, retinol, retinyl palmitate and a-tocopherol in control human serum using two internal standards// Food Chem. 1992. - V.45, №3. - P. 205-213.
33. Gamache P.H., Acworth I.N. Simultaneous analysis of fat-soluble carotenoids, retinoids, tocopherols, vitamin К and coenzyme Qio in plasma// Pittsburg Conf. Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. New Orleans. - 1998. РГГКХЖ98: Book Abstr. - P. 1619.
34. Abd El- Gawad LA., El-Abd M.M., Kagab F.H. Study on vitamin B2 in milk and some milk products// Egypt. J. Food. Sci. 1998. - V.16, №1-2. - P. 175-192.
35. Артемченко С.С, Петренко В.В. Способ количественного определения тиамина бромида// А.С. 1163225. СССР. - 1985. - МКИ G 01 N 21/78.
36. Barua А.В., Furr Н.С., Jamickbuckner D., Olson J.A. Simultaneous analysis of individual carotenoids, retinol, retinyl esters and tocopherols in serum by isocratic nonaqueous reversed-phase HPLC// Food Chem. 1993. - V.46, №4.-P. 419-424.
37. Будников Г.К., Улахович H.A., Медянцева Н.П. . Основы электрохимической химии// Из-во Казанского ун-та. -1986. -288 с.
38. ФР. 1.31.2004.01071, МУ 08-47/141 «Биологически активные добавки. Вольтамперометрический метод определения массовых концентраций витаминов С, В., В2 и кверцетина». -2004. -55 с.
39. Тенчева Ж. и др. Способы количественного определения витаминов В. В2, В6, РР в препаратах В-комплекса методом жидкостной хроматографии// Фармация. 1990. - Т.40, №3. - С. 6-11.
40. Ульянова С.В., Щавлинский А.Н., Морев С.Н., Дмитренко Т.С., Финкельштейн Е.И. Анализ водорастворимых витаминов В., В2, Вб и никотинамида в драже "Гексавит" методом ВЭЖХ// Фармация. 1993. - Т. 42. -N3. - С. 50-51.
41. Лутцева А.И. и др. Анализ и стандартизация водорастворимых витаминов// Фармация. 1998. - Т.47, №5. - С. 22-29.
42. Филимонов В.Н., Сирицо С.И. Хроматографическое разделение при аналитическом контроле водорастворимых витаминов и физиологически активных кислот в многокомпонентных рецептурах// Сорбц. и хроматогр. процессы 2005. - Т. 5. - N 2. - С. 188-201.
43. Староверов В.М., Дейнека В.И., Григорьев А.М1, Прохода Е.Ф., Покровский М.В., Иванов В.В. ВЭЖХ-анализ водорастворимых витаминов в составе поливитаминного сиропа "Олиговит"// Хим.-фармац. ж. 2004. - Т. 38.-N3.-C. 54-56.
44. Голубицкий Г.Б. Одновременное количественное определение водо- и жирорастворимых витаминов и консервантов и использованием колонки нового типа Chromolith// Заводская лаборатория 2008. - Т. 74. - N 3. - С. 10-14.
45. Власова И.В., Масякова Е.Н., Богданова Л.А., Пермякова НЛО. Определение водорастворимых витаминов в премиксах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии// Заводская лаборатория -2007.-Т. 73.-N9.-С. 25-27.
46. Лутцева А.И., Маслов Л.Г., Евтушенко Н.С., Середенко В.И. Анализ и стандартизация водорастворимых витаминов// Фармация 1998. -Т. 47,-N5.-С. 22, 27-29.
47. J. Microniet. Chase G. William, Soliman A. M. Analysis of thiamin and riboflavin, pyridoxine and niacine in multivitamin premixes and supplemens by high-performance liquid chromatography// Anal.- 1990. V.7, №1. -P. 15-25.
48. Сапрыкин JI.B., Гусаров A.A., Киселева H.B. Определение витамина В6 и полупроводников его синтеза методом ВЭЖХ в ион-парном варианте и с применением динамически модифицированного силикагеля// Ж. анал. химии 1992. - Т. 47. - N 12. - С. 2066-2071.
49. Vails Felicidad, Sancho M.Teresa, Fernandez-Muino Miguel A., Checa Martin A.Determination of vitamin B6 in cooked sausages.//Oпpeдeлeниe витамина B6 в вареной колбасе// J. Agr. and Food Chem. 2001. - Vol. 49. - N 1. -P. 38-41.
50. НД 42-11946-01. Поливитаминная смесь// Фармакопейный Государственный комитет.- М.-.-2001. -29 с.
51. Ang Catharina Y.W., Moseley Frederick A. Determination of thiamin and riboflavin in meat products by high-pressure liquid chromatography// J.Agr. and Food Chem. 1980. - V.26, №3. - P. 483-486.
52. Lumley I.D., Wiggins R.A. Determination thiamin and riboflavin in foodtuuffs using high performance liquid chromatography// Analyst. 1981. -V.106, №1267.-P. 1103-1108.
53. Bognar A. Bestimmung von Riboflavin und Thiamin in Lebensmittel mit Hilfe Hochdruch Flussigkeits - Chromatografie (HPLC)// Lebensmittechen und gerichte Chem. - 1982. - V. 36, №2. - P. 33-34.
54. Wimmalasiri P., Wilis R. Simultaneous analysis of thiamin and riboflavin in foods by high-performance liquid chromatography.// J. Chromatogr. -1985.-V.32, №18. P. 412-416.
55. Vails Falicidad, Sancho M. Teresa, Fernandez-Muino Migel. Determination of thiamin and riboflavin in cooked sausages// J. Agr. and Food Chem. 1999. -V.47, №3.-P. 1067-1070.
56. Ujile Takashi, Tsutake Yukiko, Morita ICohei// Vitamins. 1990.1. V.64, №7.-Р. 379-385.
57. Motoe К// Vitamins. 1994. - V.68, №7. - P. 379-384.
58. Vails Felicidad, Checa Martin A// J. Agr. and Food Chem. 1999. -V.47, №1.-P. 170-173.
59. Hurst W. Jeffrey, Mekim J.M. The HPLS analysis of thiamin in milk chocolate// Int. J. Vitam. and Nutr Res. 1983. - V.53, №3. - P. 239-242.
60. Vidal-Valverde Conception, Reche Angelina. An improved high performance liquid chromatographic method for thiamine analysis in foods// Z. Lebensm.-Untersuch und Forsch. 1990. - V.191, №4-5. -P. 313-318.
61. Whitworth Vivienne A., Metcalfe Lorraine. A rapid method for the determination of thiamine in various foods using high-pressure liquid chromatography// Can. Inst. Food. Sci. and Technol. J. 1985. - V.18, №3.
62. Ishiguro Kozo. The determination of thiamine and ascorbic acid contents in sweet potato by high performance liquid chromatography// Bull. Fac. Educ. Kanazawa Unit. Nat. Sci. 1987. - №36. - P. 1-5.
63. Nicolas Edgar C, Peender Kathleen A. Fast and simple liquid chromatographic determination of thiamine in infant formula, milk and other foods// J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 1990. - V.73, №5. - P. 792-798.
64. Ofles Semik. Analysis of thiamin in foods by high-pressure liquid chromatography// 35th IUPAC Congr. Istambul. - 1995 - P. 15.
65. Blanco D., Laneza M.B., Gutternez M.D. A paired ion liquid chromatographic method for thiamine determination in selected foods// J. Lig. Chromatogr. andRelat. Technol. 1996. - V. 19, №13. -P. 2155-2164.
66. J. Assoc. Ashoor Samy H., Knox Michael J. Improved liquid chromatographic determination of riboflavin in milk and dairy products// Offlc. Anal. Chem. 1985. - V.68, №4. - P. 693-696.
67. Stancher В., Zonta F.J. High performance liquid chromatographic analysis of riboflavin with visible absorbance detection in Italian cheeses// Food Sci. -1986.-V.51 ,№3.-P. 857-858.
68. Moll N. Reversed phase high-performance liquid chromatography determination of riboflavin in alcoholic beverages// J. Assoc. Offic. Anal. Chem. -1988. V.66, №3. - P. 753-769.
69. Арбатский А.П., Афоньшин Г.Н., Востоков В.М. Определение витаминов в кормовых и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии// Ж. анал. Химии 2004.Т.59.- N 12. - С. 13041307.
70. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок// М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России.- 2004.-240 с.
71. Sampson D.A., Wen Q.B., Lorenz K. Vitamin B6 and pyridoxine glucoside content of wheat and wheat flours// Содержание витамина Вб и глюкозида пиридоксина в зерне пшеницы и пшеничной муке// Cereal Chem. -1996. Vol. 73. - N 6. - P. 770-774.
72. Kocs Е., Fekete J. Bres, В2.- vitamin meghatarozasa premixben hagyhatekonysaqy folyadekkromatograflaval// Magy kern folyorirat. 1988. -V.94,№ 311.-P. 505-510.
73. Щукина О.Г., Моргун B.A., Левицкий Ю.А. Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности// Материалы Всес. конф. Геленжик. - 1990.
74. Fernando Sharma M., Murphy Patricia A. HPLC determination of thiamin and riboflavin in soyeans and tofu/7 J.Agr. and Food Chem. 1990. - V.38, №1.-P. 163-167.
75. Кожанова JI.А., Барам Г.И., Федорова Г.А. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в премиксах методом ВЭЖХ// Всерос. конф. "Хим. анал. веществ и матер.", Москва, 16-21 апр., 2000. М.: Изд-во ГЕОХИ РАН, 2000. - С. 70.
76. Tabekha М.М., El-Bastawesy М.А. A modified method for analysis thiamine, riboflavin and niacin content in rise and product by HPLC// Food.Chem. 1995. - V.12,№5. - P. 34-37.
77. Panijapan Bhinyo, Kimura Mieko, Itokawa Yoshihori. Separation and determination of thiamine by reversed-phase high performance liquid chromatography// J. Chromatogr. 1983. - V.258, №2. - P. 307-309.
78. Bontemps Jose, Bettendorff Lucien, Lombet Jacques.// J. Chromatogr. -1984. V.295, №2. - P. 486-491.
79. Bomtemps J., Bettendorff L., Dandrifosse G. Sensitization of thiamine analysis by the peak compression technique// J. High Resolut. Chromatogr. And Chromatogr. Commun. 1984. - V.7, №8. - P. 490-491.
80. Utecht Ronald E. Identification and quatitation of riboflavin in vitamin tablets by total luminescence spectroscopy// J. Chem. Educ. 1993. - V.70, №8.-P. 673.
81. Sastiy C.S.P., Singh N.R., Reddy M.N. New spectrophotometric metods of for the determination of riboflavin// Analysis. 1986. - V.14, №7. - P. 355-356.
82. Бекжанова E.E., Тахиров M.T. Определение рибофлавина в воде водоемов флуоресцентным методом// Гигиена и санитария. 1993. - № 6, -С. 72-73.
83. Barary М., AbdeJ-Hamid М., Hassan Е. Simultaneous spectrofluorimetric determination of thiamine in pharmaceuticals multivitamin preparations// Pharmazie. 1986. - V.41, №7. - P. 483-485.
84. Racegly A. S., Eryilmaz H. Determination of vitamin Bi by the thiochrome reaction using copper (II)// Fen bilimler derg. Marmara Univ. 1987. -№4. - 125-129.
85. Gonsales V., Rubio S., Gomes-Hens A. Fluorimetric determination of thiamine and cocarboxylase by a differential rate method// Anal. Lett. 1988. -V.21, №6.-P. 993-1008.
86. Ay din A., Goksel F. Thiamine determination with hypobromide by the thiochrome reaction// Chim. acta turc. 1988. - V.16, №3. - P. 313-325.
87. Saracogly A.S., Kunduz N. A new reagent for the conventional thiochrome reaction// Fen bilimler derg. Marmara Univ. 1988. - №5. - P. 159-167.
88. Marquez M., Silva M., Perez-Bendito D. Performance of the continuous addition of reagent technique in fluorimetric reaction-rate methods. Determination of thiamine at the nanamolar level//Anal. Lett. 1989. -V.22, №112.-P. 2485-2500.
89. Takasuka S., Kawahara A., Wakida S// Бунсэки катаку. 1991. -V.40, №3.-P. 115-118.
90. Jie N., Yang J., Zhang Z. Fluorimetric determination of thiamine with cobalt (II)// Anal. Lett. 1993. - V.26, №10. - P. 2283-2289.
91. Goksin A., Goksel F., Ibis С Thiamine determination// 35th IUPAC Congr. -Istambul.-1995.-P. 686.
92. Mellurray C.H., Blanchflower W.J., Rice D.A. Influence of extraction techniques on determination of a-tocopherol in animal feedstuffs//J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 1980. - V.63, № 6. -P. 1258-1261.
93. Полянский K.K., Рудаков О.Б. Современные методы контроля качества и безопасности молочных продуктов// 41 Отчетная научная конф. за 2002 год., Воронеж, 2002 Изд-во ВГТА, 2003. -257 с.
94. Gliszczynska-Swiglo A., Sikorska Е. Simple reversed-phase liquid chromatography method for determination of tocopherols in edible plant oils// J. Chromatogr. 2004. Vol. 1048. - N 2. - P. 195-198.
95. Макаров В.Г., Краснов К.А., Пименов A.E., Северцев В.А., Габидова А.Э., Косенко Н.В. Исследование химического состава масла шиповника// 5-й Рос. нац. конгр. "Человек и лекарство", Москва, 21-25 апр.,1998.: М.- Фармединфо, 1998. 659 с.
96. ГОСТ P 50928-96. Премиксы. Методы определения витаминов А, D, Е// М.: -Госстандарт России. 1996,- 11 с.
97. В.Н. Скурихин, С.В. Шабаев. Методы анализа витаминов А, Е, D и каротина// М.: Химия, 1996. 95 с.
98. Филимонов В.Н., Балятинская JI.H., Колосова И.Ф. Определение жиро- и водорастворимых витаминов в промышленных водах методом ВЭЖХ// Тез. докл. 1 экол. симп. "Анал. вод", 26-28 июня, 1990 Воронеж, 1990.-С. 134.
99. Стыскин E.JL, Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография// М.: 1986. 214 с.
100. Современные методы анализа и оборудование в санитарно-гигиенических исследованиях// М.:- Министерство здравоохранения Российской Федерации. 1999.-495с.
101. Finglas P.M., Faulks R.M. The HPLC analysis of thiamin and riboflavin in potatoos// Food.Chem. 1984. - V.15, №1. - P. 37-44.
102. ГОСТ P 50929-96. Премиксы. Методы определения витаминов группы В// М.: -.Госстандарт России. 1997.-35 с.
103. Яшин Я.И., Яшин А.Я. Анализ пищевых продуктов и напитков методами высокоэффективной жидкостной и ионной хроматографии с электрохимическими детекторами// Ж. анал. химии 2004. - Т. 59. - N 12. - С. 1237-124.
104. Филимонов B.H., Сирицо С.И., Макрушин H.A. Особенности хроматографического разделения водорастворимых витаминов в изократической ОФ ВЭЖХ// Сорбц. и хроматогр. процессы 2006. - Т. 6. - N 2.-С. 191-197.
105. Zhang Yantu, Zhang Zhujun, Yang Weiping, Tian Suikang// Определение тиамина и рибофлавина методом высокоэффективными хроматографиями с обращенным детектированием// SepuChin. J. Chromatogr. = Chin. J. Chromatogr. 2003. - Vol. 21. - N 4. - P. 391-393.
106. Huang Xiang-dong, Li Zhen-yu. Разделение и определение водорастворимых витаминов в комплексной таблетке витаминов В с помощью ВЭЖХ ионных пар на обращенной фазе// Chin. Pharm. J. 1991. -Vol. 26.-Nl.-P. 34-36.
107. С.Н.Ланин, Ю.С.Никитин. Прогнозирование удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Межмолекулярные взаимодействия в подвижной фазе// Ж. анал. химии 1991. - Т. 46. - N 10. - С. 1971-1980.
108. Замуруев О.В. Нормально-фазовая изократическая ВЭЖХ жирорастворимых витаминов: закономерности удерживания, оптимизация состава подвижной фазы и разработка аналитических методик// Автореф. дис. канд. хим. Наук. М., 2003. 21 с.
109. Филимонов В.Н.,Замуруев О.В., Балятинская Л.Н. Интерпретация закономерностей удерживания жирорастворимых витаминов с позиций квазихимической модели.// Сорбционные и хроматографические порцессы-2004. Т. 4. - N 3. - С. 263-272.
110. Матусова C.M., Брыкина Г.Д., Шпигун О.А. Изучениемеханизмов взаимодействия сорбатов с новой неподвижной фазой на основе фталоцианата цинка// Теория и практика хроматографии. Применение в нефтехимии. Самара: Универс-групп, 2005. - С. 74.
111. Демидова О.А. Оценка содержания водорастворимых витаминов в лекарственных препаратах и биологических жидкостях методом ВЭЖХ// Автореф. канд. фармацевт, наук. М., 2002. 26 с.
112. Степанова E.H., Сапожникова Г.А., Нефедова P.C. Сравнительное изучение различных методов определения рибофлавина в пищевых продуктах//Вопросы питания. 1969. - Т.28, № 5. - С. 14-18.
113. Адлер Ю.П., Маркова Е.В., Грановский Ю.В. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий. М.: Наука, 1976. -280 с.
114. Короткова Е.И. Планирование и организация эксперимента// Учебное пособие, Томск: Изд-во ТПУ, 2003, 92 с.
115. Румшинский JI.3. Математическая обработка результатов эксперимента// М: Наука, 1971.-192 с.
116. НД 42-11946-01. Поливитаминная смесь// Фармакопейный Государственный комитет.- М.:-2001. -29 с.
117. В заключение выражаю огромную благодарность д.т.н., профессору, директору ООО «Артлайф» Австриевских А.Н. за предоставленную возможность выполнения работы на базе лаборатории предприятия.
