Обращенно-фазовая изократическая ВЭЖХ для аналитического контроля водорастворимых витаминов в многокомпонентных рецептурах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

СИРИЦО Светлана Игоревна

ОБРАЩЕННО-ФАЗОВАЯ ИЗОКРАТИЧЕСКАЯ ВЭЖХ ДЛЯ АНАЛИТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ В МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ РЕЦЕПТУРАХ

02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

□ □34Б 1927

Москва 2008

003461927

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Новомосковского института Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева

Научный руководитель: кандидат химических наук,

доцент Филимонов В.Н.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор О.М. Петрухин доктор химических наук, профессор В.Ф. Селеменев

Ведущая организация: Белгородский государственный техноло-

гический университет им. В.Г. Шухова

Защита состоится 15 января 2009г. на заседании диссертационного совета Д 212.204.07 в РХТУ им. Д. И. Менделеева (125190 г. Москва, Миусская пл., д. 9) в в конференц-зале

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ имени Д.И.Менделеева.

Автореферат диссертации разослан / Ь2008 г.

Ученый секретарь диссертационного

совета Д 212.204.07,

к.х.н. Сенаторова C.B.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Витамины - низкомолекулярные биологически активные органические соединения различной химической природы, необходимые в небольших количествах организму для нормального функционирования и роста, сопротивляемости инфекциям, синтеза белков и жиров. По растворимости подразделяются на жирорастворимые и водорастворимые (ВРВ). Последние представлены широким рядом представителей, сильно различающихся по своим физико-химическим свойствам и относящихся к разным классам соединении - витамин С, витамины группы В: тиамин (Врибофлавин (В2), никелиновая кислота (ниацин, РР), амид никотиновой кислоты (ниацинамвд, РРамид), пиридоксин (В6), фешиевая кислота (Вс), цианокобаламин (В 12). Дефицит витаминов провоцирует возникновение авитаминозов, изменение физиологических процессов в организме, предотвращение которых возможно посредством применения фармацевтических рецептур, содержащих синтетические витамины.

Увеличивающаяся активность выпуска поливитаминных препаратов фармацевтическими предприятиями Белгородского региона требует проведения кошроля их аутентичности и качества Однако, методики качественного и количественного их анализа, рекомендуемые в настоящее время нормативно-техническими документами, основаны главным образом на методах спеюро-фотометрии. Эта методы не достаточно селективны, трудоемки и требуют больших затрат вре-, мени, связанного с предварительным выделением компонентов, входящих в состав препаратов и наличием большого числа вспомогательных операций, при подготовки пробы к анализу. Поэтому актуальной задачей аналитической химии витаминов является разработка экспрессных и высокоточных методик количественного определения содержания ВРВ в многокомпонентных смесях.

Эффективным способом решения данной проблемы может стать применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), которая характеризуется высокой чувствительностью, селективностью, разрешающей способностью и быстротой получения конечных результатов. Растворимость ВРВ в полярных растворителях обусловливает целесообразность решения подобных аналитических задач в рамках обращено-фазовой (ОФ) ВЭЖХ. В практической деятельности аналитических служб предприятий Белгородского региона методики с применением данного варианта ВЭЖХ не нашли широкого распространения, что связано с необходимостью использования: высокоэффективных дорогостоящих сорбентов; многокомпонентных подвижных фаз с токсичными модификаторами (например, метанолом), требующих дополнительных лицензий для работы; детектирующих систем (например, диодно-матричных), ограниченно применяемых в настоящее время.

Кроме этого, для достижения эффективного разделения смесей ВРВ, различающихся по химическим свойствам, как правило, предлагается применение градиентного режима элюирования, который, характеризуется (по сравнению с изократическим) меньшей воспроизводимостью коли-

чественных характеристик пиков, более высоким уровнем «шумов», увеличением длительности и стоимости серийных анализов, а также дополнительными расходами на реактивы и оборудование. В связи с этим применение градиентного режима не всегда целесообразно, а возможности разделения смеси ВРВ при фотометрическом детектировании в изократическом режиме элюиро-вании до конца не выявлены.

Цель работы - разработка экспрессных методик количественного кошроля содержания водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецегпурах на основе изо-кратической обращено-фазовой ВЭЖХ, реализуемых на доступном отечественном хроматогра-фическом оборудовании с фотометрическим детектированием. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

1. проведение систематических исследований хроматографичсского поведения водорастворимых витаминов на сорбентах нерегулированной формы в различных вариантах обращено-фазовой ВЭЖХ при изократическом режиме элюировании водосодержащими бинарными подвижными фазами;

2. выбор модели адекватно описывающей удерживание водорастворимых витаминов в варианте ОФВЭЖХ;

3. разработка схемы анализа водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах.

Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2005 - 2009 г.г. Секция «Ионообменное хроматографирование», тема «Высокоэффективная жидкостная хроматография, высокоэффективная ионная хроматограт фия биологически активных веществ», код 2.15.11.4x70.

Научная новизна. Систематизированы и обобщены результаты исследования хромагогра-фического поведения витаминов: С, Вь В*, Вп, Вс, РР, РРамид алкильными сорбентами нерегулированной формы при изократическом элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами в режиме ОФ и ион-парной ОФ ВЭЖХ.

В рамках полуэмперического метода установлено распределение электронной плотности в молекулах ВРВ, рассчитаны энергии их взаимодействия с неподвижной фазой и водой. Проведена оценка гидрофобносги водорастворимых витаминов с помощью критериев Шатца (И) и Ганча-Jleo (logP) и сопоставление их с энергиями взаимодействия «витамин - Silasorb С|8», «вигамин-вода», параметрами удерживания аналигов.

Показана перспективность применения уравнения универсальной квазихимической модели для оценки роли межмолекулярных взаимодействий водорастворимых витаминов в ОФ ВЭЖХ.

Впервые опробовано и рекомендовано в качестве ион-парного реагента применение четвертичных фосфониевых соединений для разделения смеси ВРВ в ходе комплексного исследования влияния состава подвижной фазы в варианте ион-парной (ИП) обращено-фазовой ВЭЖХ.

Обосновано примените многомерного хромагографирования, сочетающего варианты ОФ и ион-парной ОФ ВЭЖХ для эффективного разделения полного набора смеси исследуемых ВРВ.

Практическая значимость. На основании комплексного исследования хромагографического поведения юдорасгворимых витаминов в обращено фазовой и ион-парной ОФ ВЭЖХ:

- разработана схема рационального выбора состава подвижной фазы, исходя из априорной информации об анализируемом объекте;

- оптимизирован режим работы схемы многомерного хромагографирования;

- разработаны экспрессные методики количественного кошроля содержания водорастворимых витаминов, реализуемые на отечественных хроматографах с фотометрическим детектором при многомерном хромагографировании в изокрашческом режиме. Методики прошли промышленную апробацию на прсдпрюттах г. Белгорода.

Установленные в работе закономерности хромагографического поведения ВРВ в условиях ОФ и ИП ОФ ВЭЖХ при изокрашческом элюировании сорбатов могут бьпь включены в хромаю графические базы данных и использованы при разработке методов аналитического кошроля водорастворимых витаминов в продуктах пищевой и косметической промышленности. Положения, выносимые на защиту:

1. Закономерности хромагографического поведения юдорасгворимых витаминов на сорбентах нерегулированной формы (БПазогЬ С)8) при элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами.

2. Анализ роли межмолекулярных взаимодействий в удерживании ВРВ с позиции теории универсальной квазихимической модели.

3. Влияние состава (природы и концентрации ион-парного реагента, органического модификатора, рН среды) элюенга на удерживание ВРВ в варианте ИП ОФ ВЭЖХ. Результаты оценки применения в качестве ион-парных реагентов четвертичных аммониевых и фосфониевых солей.

4. Многомерная техника гаократического элюирования аналига, содержащего полный набор исследуемых водорастворимых витаминов.

5. Методики хромагографического определения водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на- XI конференции «Поверх-носгно-активные вещества - наука и производство» (Шебекино, 2003 г.), X Межрегиональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Тамбов, 2003 г.), I, П, Ш Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах «Фагран - 2002», и «Фагран - 2004» и «Фагран - 2006» (Воронеж, 2002, 2004 и 2006г.г.), V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналига-

ка - 2003». (Санкт-Петербург, 2003г.), VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004 г.), Ш Международной конференции «Экстракция органических соединений «ЭОС - 2005» (Воронеж, 2005 г.), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002 г.), П Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), П всероссийской конференции «Аналитика России» (Краснодар, 2007 г.), П международный форум «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей (в том числе обзор) в периодических изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования научных трудов и 12 тезисов докладов.

Cipyjfiypa и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, экспериментальная часть, три главы обсуждения полученных результатов), выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает в себя 35 рисунков и 37 таблиц. Список лигерапуры содержит 207 наименований работ зарубежных и отечественных авторов.

Основное содержание работы В обзоре литературы (глава 1) представлены основные физико-химические свойства водорастворимых витаминов и существующие методы их определения в различной продукции. Применяемые методы анализа не позволяют определять полный спектр ВРВ одновременно. Требуется проведение многостадийных процедур пробоподготовки, что ухудшает метрологические характеристики аналитических методик и увеличивает время анализа. Показано, что альтернативу традиционным количественным методам контроля составляют ОФ и ИП ОФ варианты ВЭЖХ. Обобщены литературные сведения о способах аналитического разделения ВРВ в этих вариантах и показаны преимущества изократического элюирования. Рассмотрены модели удерживания и факторы, влияющие на удерживание

Экспериментальная часть

Объектами исследования являлись свежеприготовленные растворы водорастворимых витаминов Вь В* Bfo В12, Be, С, РР, РРамид фармакопейной чистоты.

Работа выполнена на жидкостном хроматографе «Цвет -304» (ОАО «Цвет», г. Д зержинск, Россия) с фотометрическим детектором (254нм). Разделение витаминов проведено в изокрагиче-ском режиме элюирования на стальных колонках (150x4,6 мм), заполненных неподвижной фазой (НФ) неретулированной формы Silasorb-Ci8 (7,5 мкм, «Lachema», г.Брно, Чехия).

Подвижные фазы (ПФ) - смесь изопропанола и воды, ацегонтрила и воды (содержание органического реагента модификатора 1-50об.%), а также подвижные фазы, содержащие ион-парный реагент (бромиды тетрабутиламмония, цетилтриметиламмония и тетрадиэтиламинофосфония),

фосфат-ацстатсодержащие растворы (pH 4-9), кислотность которых регулировали добавлением кислот (фосфорная, хлороводородная, уксусная) и оснований (гидроксвд натрия). Измерения проводили на рН-метре рН-673М.

В качестве меры удерживания сорбагов в хроматографических системах, отличающихся составом подвижных фаз применяли: коэффициенты емкости (к 0, меры эффективности разделения - критерий Rs, отклонение профиля хроматотрафической зоны анализируемого вещества от формы гауссовой кривой оценивали с помощью коэффициента ассиметрии As. Эффективное разделение компонентов пробы регистрировали при Rs >1; 0,5<к '<20; 0,7<As<l,5.

Квангово-химические расчеты геометрического и электронного строения молекул ВРВ осуществляли на персональном компьютере в программном пакете «HypetChem 7.0» полуэмпирическим методом РМЗ. Оптимизацию геометрических параметров молекул проводили по алгоритму Polak-Ridber.

Гидрофобносгь ВРВ рассчитывали согласно: 1) критерию гидрофобное™ Шатца (Н): Н =nh- 4 JnJ , где: nh - число углеродных атомов, л/ - число полярных групп.

2) логарифму коэффициента распределения в системе окганол - вода (logP) - в программном пакете «HyperChem 7.0».

Расчет параметров молекул, их гндрофобносги н энергии межмолекулярного взаимодействия

Для оценки влияния строения молекул сорбата на удерживании в условиях ОФ ВЭЖХ рассчитаны элеюронные и структурные параметры водорастворимых витаминов, представленные в табл.1. Сопоставление критериев гидрофобносги Н и bgP водорастворимых витаминов показало отсутствие корреляции меду шши для изучаемых аналигов, что препятствует сравнительному описанию ВРВ, относящихся к разный классам. Установленные противоречия не позволяют сделать однозначный вывод о прогнозировании сродства к неполярному сорбенгу всех ВРВ на основании только данных гидрофобносги. Поэтому, нуждаются в дополнительной корректировке.

Таблица 1.

Критерий гидрофобносги и энергии межмолекулярных взаимодействий ВРВ с неподвижной

фазой AEfapsi и водой АЕ^

витамин logP Я энергия взаимодействия молекул витаминов

с сорбентом, /МЦссрб), кДж/моль с водой, ДЕ«, кДж/моль

Гидрохлорид тиамина, В1 -0,05 5,06 -83 -14

Рибофлавин, Вг -1,46 8,06 -564 -31

Пиридоксин, Вб -0,77 1,07 -91 -19

Цианкобаламин, В12 - >20 -2253 -21

Фолиевая кислота, Вс 0,36 9Л -190 -24

Аскорбиновая кислота, С -1,85 -2,0 -3 -30

Никотиновая кислота, РР 0,29 0,3 -45 -25

Никотин амид, РРамид -0,37 0,3 -62 -21

Расчеты энергетических характеристик позволяют оценил, преобладающие межмолекулярные взаимодействия в простейших системах и сопоставить их с критериями гидрофобности. Так, энергии взаимодействия молекул витаминов В2, Вс и В12 (молекулярная масса более 300 г/моль) с сорбентом характеризуются высокими значениями (по модулю) и согласуются с высокими Н (табл. 1.). Для витаминов РРамид, РР, В, и В6 характерна сопоставимость энергий взаимодействия их молекул с водой и с неподвижной фазой, что позволяет предполагать незначительное преобладание межмолекулярного взаимодействия «витамин - неподвижная фаза», которое подтверждается средними значениями Я (согласно Н витамины РРамид, РР, В, и Вб относятся к низкогидрофобным.

При элюировании ВРВ бидистиллированной водой порядок выхода сорбагов С, РР, РРам, В6 (к! которых соответственно равны 2,74,2,97,4,39,5,46), согласуется с уменьшением (по модулю) энергии взаимодействия их с ПФ. Отсутствие хромагографического сигнала при элюировании витаминов В,, Вь В12, Вс (Д>4) связано с межмолекулярными взаимодействиями гидрофобной части молекулы с НФ, преобладание которых выявлено квангово-химическими расчетами (табл. 1). Зависимости между !ogP и к' для водорастворимых витаминов, относящихся к различным классам соединений, не установлено.

Влияние природы и концентрации органического модификатора. Уменьшение сродства ВРВ к сорбенту, снижение к', повышение симметрии профилей хромагографических пиков могут быть достигнуты введением в водную ПФ органических модификаторов, усиливающих специфические взаимодействия «сорбаг - элюеш». Подобными свойствами обладают растворители, относящиеся к VI (диоксан, ацетонитрил) и П (спирты) группам в классификации Снайдера. Выполнена сравнительная оценка экспериментальных данных в рамках моделей Хорвата, Снайдера, Мураками и универсальной квазихимической вьггеснигельной. Наиболее достоверно полученные результаты описывает уравнение квазихимической модели, которое учитывает наряду с конкурентной сорбцией и межмолекулярные взаимодействия в объеме подвижной фазы:

где Бщ, Ц Мт - мольные доли сорбага (8), наименее (Ь) и наиболее (М,,,) сорбционно-акгивного компонента подвижной фазы (т); К5, Км, Кяц, К^м - константы равновесий квазихимических реакций сорбции и ассоциации сорбага и модификатора; Ф - фазовое отношение хромагографи-ческой колонки.

Преобразование уравнения (1) позволило получить полиноминальные уравнения первой, второй и третьей степени, характеризующие доминирующие межмолекулярные взаимодействия в

Обращено-фазовая хроматография при элюировании водными и водно-органическими растворами

(1)

хроматографической системе. Установлено, что вне зависимости от природы модификатора, удерживание витаминов адекватно описывается полиномами второй степени

= +ахМт +агм1, учитывающими взаимодействия сорбаг-сорбенг, модификатор-сорбат,

Рис. 1. Завюсиость Чк' водорастворимых витаминов (а, б) от мольной доли (Mm) изопропилового спирта в ПФ модификатор-сорбент.

На рис. 1 и 2 приведены графические зависимости llk-j{Mm) при элюировании подвижными

фазами состава «вода - изопропанол» и «вода - ацетонигрил». Введение в водную ПФ изопропанола (И групп) вызывает формирование кривых различного наклона (рис.1). Кривые зависимости \lk-j(Mm) при элюировании ПФ с добавками ацегонитрила (VI группа классификации Снайдера), характеризуются преимущественно выпуклым наклоном для всех сорбатов (рис. 2). При содержании ацетошлрила не более 0,0264 мол. долей, преобладают взаимодействия сорбах - сорбент, вызывающие формирование размытых профилей пиков витаминов

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Mm

Рис. 2. Зависимость I/к' от мольной доли (Mm) ацегонитрила в ПФ

и отсутствием хроматограф ического сигнала витаминов В], В12 и В2 (№4). Нелинейные зависимости (рис. 2), имеющие выпуклый характер, свидетельствуют об усилении межмолекулярных взаимодействий и образовании ассоциагов между молекулами модификатора при увеличении его содержания (более 0,026 моль, долей) в ПФ. О преобладании межмолекулярных взаимодействий модификатор - модификатор в объеме ПФ при содержании изопропанола в ПФ более 0,1 мол. долей свидетельствует формирование выпуклой кривой 1/к^{Мт) для витаминов Вг, С, РР, Вс и В6 (рис. 1).

Вогнутых кривые 1 /к^Мт) д ля витаминов В|2 и В1 (рис. 16) характеризуют усиление межмолекулярных специфических взаимодействий сорбат - модификатор при возрастании органического модификатора в бинарном элюенге; взаимодействия между молекулами изопропанола проявляются слабо. Образование ассоциагов между молекулами модификатора и сорбата приводи к итенстному уменьшению удерживания витаминов Вц и В1.

Хромагографическая система с изопропанолом в качестве модификатора ПФ не обеспечивает условия эффективного разделения смеси всех ВРВ. Регистрируются качественные разрешения (Д£1>1) отдельных комбинаций аналигов. Хромагографическая система с водно-ацегонигрильным алюенгом показала меньшую селективность разделения смеси водорастворимых витаминов. Таким образом, определяющую роль в удерживании полярных ВРВ играют межмолекулярные взаимодействия сорбата в объеме ПФ. Эти взаимодействия для полярных молекул витаминов С, РРамид, РР, Вб (Н<4), максимальны и значительно уменьшают их удерживание сорбентом,

Влияние кислотности и ионной силы элюента. Способность к ионизации в водных растворах позволяет изменять характер удерживания водорастворимых витаминов варьированием рН и ионной силы элюента.

Увеличение рН водной ПФ вызывает уменьшение удерживания витаминов С, РР и РРамид. (табл. 2). Наилучшее разделение витаминов С, РРамид, РР и Вй достигается при рН элюента, равном 5. Изменение рН не влияет на удерживание витаминов более сложной структуры: Вс, В2 и В12. Они удерживаются сорбентом практически необратимо за счет многочисленных дисперсионных взаимодействий неполярных функциональных групп сорбагов с сорбентом.

Таблица2

Хроматограф ические параметры ВРВ

Элюенг Время! сдерживания, 1ц Коэффициент асимметрии, Аз

В6 В, С РРамид РР В6 В, С РРачкд РР

рН4,0 5,41 00 3,42 8,85 1,94 - 1,29 1,29 -

рН5,0 8,49 00 2,75 10,02 4,87 1,39 - 1,40 3,24 5,61

рН6,0 7,60 оо 2,54 9,13 2,87 2,17 - 1Д8 1,50 1,50

рН 8,65 6,99 6,98 2,58 8,71 3,00 2,72 1,62 2,0 1,88 1,61

ФБсрН8,65 5,49 16,32 2,30 11,81 2,60 1,43 1,59 1,43 1,88 1,54

Ас (рН 8,65) 5,37 7,37 3,89 6,40 8,50 1,30 1,58 1,20 1,11 1,40

Для злгоекгов на основе фосфатных и ацетатных буферных растворов, характерно уменьшение параметров удерживания витаминов С и РР, при этом максимальное удерживание регистрируется при рН=рКа (рис. 3).

Тенденция увеличения удерживания витаминов Вь Вб, с ростом рН элюента сохраняется при элгоировшши как ПФ с ацетат-ионами (рис.3 а), так и с фосфат-ионами (рис.3 б). При этом, более низкие к' для ПФ с фосфат-ионами, вызваны, вероятно, большей ионной силой элюента.

8

7 -6 -5 -4 -3 -2

РРамнд

рН

6.5

8,5 9.5

рН

№с. з. Шияние рН элюента на коэффициент емкости водорастворимых витаминов в присутствии а) ацетат-ионов; б) фосфат-ионов.

Изменение ионной силы и рН элюента позволяет разделил, смеси витаминов С, В& РРамид и В1 (значения Яз для пар С/В6; В</РРам; РРам/В! соответственно равны 2,08; 3,45; 2,15) Отсутствие хромагографических сигналов витаминов В]2> Вь Вс, обладающих более разветвленной структурой с большими молекулярными массами, свидетельствует о преобладании роли неспецифических взаимодействий с неполярным сорбентам. Уменьшение удерживания этой группы витаминов возможно при усилении роли специфических межмалекулярных взаимодействий с модифицированным алюенгом.

Совместное влияние кислотности и концентрации органического модификатора на удерживание витаминов. Применение в качестве ПФ водных растворов как с добавками ацего-нитрила, так и с ацетат-ионами, не перспективно, из-за установленной низкой селективности хромагографических систем, в состав которых они входят. Поэтому не целесообразно проведение дополнительного исследования элюенгов, одновременно содержащих эти компоненты. Введение ацетошлрила в ПФ с фосфат-ионами сопровождается образованием осадка

Увеличение концентрации изопропанола в ПФ с введенными фосфат-ионами, характеризуется уменьшением удерживания витаминов (рис. 4). При этом для витаминов Вь С, РРач РР установлено формирование выпуклых кривых 1/к~ЛМт), что свидетельствует об образовании устойчивых ассоциатов между молекулами модификатора Вогнутые кривые \/к^Мт) для витаминов

Вс и В1 - об образовании комплексов между молекулами модификатора и витаминов.

Элюирование фазой, содержащей изопропанола свыше 0,008мол. долей (более 0,4 моль/л) сопровождалось потерей селективности разделения витаминов (Дз«1). Не линейные зависимости, в соответствии с универсальной квазихимической моделью, свидетельствуют о соизмеримости вклада специфических взаимодействий молекул витаминов с молекулами ПФ и неспецифических взаимодействий молекул сорбагов с гидрофобной поверхностью НФ.

Таким образом, удерживание ВРВ определяется пространственным строением их молекул, числом возможных точек контакта с поверхностными сорбционными цешрами, влиянием природы функциональных групп ВРВ на характер сорбции, и на возникающие межмолекулярные взаимодействия. Элюирование водно-спиртовыми ПФ, проявляющими протоно-донорно-акцепторные свойства, позволяет осуществлять разделение только витаминов Вс, Вь В12> В> Введение буферных растворов, вызывающих ионизацию витаминов С, РР, РРамид, В& приводит к увеличению 115 и селективности разделения. Варьирование концентрацией изопропанола в элюенге позволило выбрать оптимальный состав ПФ (фосфатный буферный раствор с 0,4 об.% изопропанола (или 0,001 мол. дол.), обеспечивающий эффективное разделение шггикомпоненгной смеси витаминов: С, РРамид, В6, Вь Вс. Хромагографические параметры витаминов С, РРамид, В1 близки к оптимальным (£* соответственно равны 0,72, 1,72, ЗД1, 7,86 и Ив для пар ОВ^ЦЗЗ; Вб/РРамиягО,97; РРа-мид/В|=1,72).

Иов-парная обращено-фазовая хроматография витаминов

Наибольшую эффективность разделения ВРВ (по проведенным предварительным исследованиям в режиме ИП ОФ ВЭЖХ) обеспечивает хроматографическая система с содержанием модификатора (изопропанола) в ПФ 0,6об.% и рН подвижной фазы 8,65. В этих условиях достигается частичное разделение ВРВ.

Влияние природы н концентрации ион-парных реагентов. Сравнение влияния четвертичных фосфониевых и аммониевых соединений на удерживание аналишв осуществляли при добавлении в ПФ 1,5 мМ растворов бромидов тегграбутиламмония (БТБА), цетилтриметиламмония (БЦГМА) и тетрадиэтипаминофосфония (БТДАФ).

О 0,002 0,004 0,006 0,008

Рис.4. Зависимость коэффициентов емкости от мольной доли (менее 0,007 мол. дол) изопропанола в фосфатном буферном растворе с рН 8,65

Хроматографическая система с БТБА, характеризуется относительно слабым удерживанием ВРВ и отсутствием хромагографического сигнала для витаминов В2ИВ12.

Элюирование ПФ с более гидрофобным БЦГМА сопровождается слабым удерживанием ка-тионных и нейтральных форм витаминов группы В и РРамид и ростом ¿'для анионных форм С, РР, Вс. При этом Вс оорбируется практически необратимо.

Введение в подвижную фазу БТДАФ позволяет регистрировать хроматографический сигнал всех витаминов; с ростом концентрации ИПР (рис. 5) удерживание витаминов кислотного характера и витамина В6 возрастает за счет образования ионной пары Зависимость к' витаминов от концентрации БТДАФ проходит через максимум и для гидрофобного Вс.

Максимальное удерживание витаминов В1Ь В^ В,, присутствующих в виде катионов, наблюдается при наименьшем содержании БТДАФ, так как удерживание сорбагов, по-видимому, осуществляется за счет конкурентной сорбции гидрофобной части молекулы сорбаха и ИПР. Увеличение концентрации ТДАФ+в ПФ вероятно приводит к формированию на поверхности НФ однородного положительного заряда. Удерживание кагионных и нейтральных форм витаминов группы В уменьшается (рис. 5 б).

Оптимальная концентрация БТДАФ находится в пределах 5-8 ммоль/л. Значения вита-

2,5 "

1,5

6)

10 12 БТДАФ. мМ

10 12 БТДАФ, мМ

Рис. 5. Влияние концентрации добавленного БТДАФ на коэффициент емкости ВРВ. Элюент: (1,5-н10)мМ БТДАФ в ФБ (рН 8,65): 0,6 об.% изопропиловый спирт.

.чинов максимально приближены к оптимальным при концентрации БТДАФ 7,5 ммоль/л. Элюент состава 7,5 мМ БТДАФ в ФБ с рН 8,65 : 0,6об.% изопропанол может быть применен для разделения и дифференциального определения как витаминов группы В, так и некоторых ВРВ кислотного характера

Схемы выбора оптимального состава. Проведенные исследования позволили рекомендовать схему выбора состава подвижной фазы по априорной информации о составе анализируемой сме-

си. Предлагаемая схема (рис. 6) позволяет выбрать состав элюента, обеспечиваю ий наилучшее разделение смеси витаминов.

В случае одновременного присутствия в анализируемом объекте всех ВРВ для их разделения можно рекомендовать многомерное хромагографирование. Вариант схемы подключения колонок представлен на рис.7. Предлагаемая схема включает две колонки 6'и 7', заполненные

сорбентом ЗиаяэгЬ С]8 по методу сбалансированной плотности. В каждую из колонок отдельным насосом У'и 2'постоянно подагтсязлюенг. Насос/'подает ЭЛЮЕНГЗ ФБс

рН 8,65 : 0,6об.% изопропанол), позволяющий разделять на колонке 7' витамины С, В& РРам (РР), В,. Насос 2' подает на колонкуб' ЭШОЕНТ 4 обес-

печивающий разделение и витаминов Вь В^ Вц, Вс (Н>4).

Анализ смеси ВРВ включает двукрашый ввод пробы и выполняется в два этапа На первом этапе краны 3 'и 5' находятся в положении А. В данном случае ЭШОЕНТ 3 постоянно кондиционирует ячейку детектора 8', а ЭЛЮЕНТ 4 после кондиционирования колонки 6' покидает хроматограф ическую систему. Введенная проба потоком ЭЛЮЕНТА 3 направляется в колонку

Рис. 7. Схема хроматографической системы. Обозначения: /2'- насосы, 35' - шести- и восьмиходовые краны, 4' — ввод пробы, 6', 7' - аналитические колонки I и II, 8' - детектор.

колонка 7 «-х4

колонка 6

„ 2 С+Вб+РР«м+В1

Я I » 1

свод 1

в* 1 &

РРЫ,

в,

1А

и

Вс

10 15 20 25 30 35 *0

55 60 65 70

Рис. 8. Хроматограмма модельной смеси ВРВ. Элюирование в режиме переключения колонок. Колонка 7-ЭЛЮЕНТ 3: Колонка 6 - ЭЛЮЕНТ 4

Сильно удерживаемые витамины Вс, В2, В12 (Н>4) остаются в колонке Т. После регистрации хромагографического сигнала витамина В1 (1в=12,49мин) через 15 мин после ввода пробы одновременным поворотом кранов 3' и 5' в положение Б поток ЭЛЮЕНТА 4 с колонки 6' направляется в детектор. В течение 3-4 минут соединительные узлы хроматотрафической системы и ячейка детектора промываются ЭЮЕНТОМ 4 (об окончании этой процедуры свидетельствует установление на хромаю грамме «нулевой» линии).

На втором этапе производится повторный ввод пробы смеси витаминов, которые потоком ЭЛЮЕНТА 4 направляются в колонку 6'. Витамины С, РР, Вб, РРам (#<4) в данных условиях имеют низкие к1, выходят одним пиком (1^<1) и не мешают разделению Вс, Вь В2, В,2 (№4). Хроматотрамма разделения смеси ВРВ представлена на рис. 8. Затрачиваемое время разделения ВРВ на колонке б' достаточно для регенерации колонки 7' ЭЛЮЕНТОМ 3. По окончании разделения витаминов с Н>4 колонка 7' вновь готова к работе.

Предлагаемая схема не требует дополнительных временных затрат для перевода хроматотрафической системы в исходный режим. Схема обладает универсальностью, позволяет проводить анализы различных комбинаций витаминов и может быть рекомендована для разработки методик аналитического контроля витаминосодержащей продукции.

Практическое применение разработанной схемы элюирования сорбагов было испытано на фармацевтических препаратах, содержащих ВРВ.

Пределы обнаружения водорастворимых витаминов

Предел обнаружения (ПрО) (табл.3.) рассчитывали по высоте пика, трехкратно превышающей уровень шумов (Зэ-кригерий, средняя высота шумов нулевой линии 2,5 мм).

Таблица 3

Пределы обнаружения водорастворимых витаминов, т,,^ мкг в пробе (п=5, Р=0,95)

Состав подвижной фазы витамин

С РРам РР Вс В, в2 Вб В,2

ЭЛЮЕНТ 3 9,0 0,3 0,1 - 13 - 5,0 -

ЭЛЮЕНТ 4 2,0 1,0 0,7 2Д 0,7 1,3 0,8 0,06

Контроль содержания витаминов в растворах для инъекций

Анализ индивидуальных витаминов проводили введением в колонку исходного или разбавленного инъекционного раствора. Необходимость в разбавлении определяется исходной концентрацией витамина и его пределом обнаружения.

Согласно разработанной схеме (рис. 6) при хроматографировании инъекционных препаратов «Никотиновая кислота», «Витамин В1», «Витамин Вб» возможно применив обоих элюенгов: ЭЛЮЕНТ 3 и ЭЛЮЕНТ 4. При анализе растворов для инъекций «Цианкобаламин» и «Мильгам-

ма» препараты непосредственно вводили в хроматограф; в качестве ПФ может быть только ЭЛЮЕНТ4 (рис. 6).

Правильность методик определения витаминов оценивали сравнением с заявленным изгото-

вителем. Относительное стандартное отклонение определения не превышая 5 % (табл.4).

Таблица4

Метрологические характеристики методик определения ВРВ в инъекционных препаратах (п=5, Р=0,95)

Препарат Регламентированное содержание витамина ЭЛЮЕНГ4 ЭЛЮЕНТЗ

*,мг ±5 Я х,мг ±5 8,

Никотиновая кислота РР 1 %масс 9,84 ±0,12 0,01 9,82 ±0,16 0,01

Витамин В | В, 5 %масс 49,12 ±0,79 0,01 48,58 ±0,90 0,02

Витамина Вб Вб 5 % масс 48,98 ±0,84 0,01 48,92 ±0,89 0,02

Цианкобаламин В,2 0,2, мг 0,196 ±0,005 0,02 — — —

Мильгамма Вб 100,0 мг 989,8 ±13,54 0,01 — — —

В, 100,0 мг 988,9 ±17,12 0,01 — — —

в,2 1,0 мг 0,989 ±0,017 0,01 — — —

Кошроль содержания витаминов в таблетированных фармацевтических препаратах

Для анализа разработан общий алгоритм пробоподготовки таблетированных препаратов (рис. 9). С целью облегчения читаемости приведенной схемы витамины объединены в группы: /- С, В|, РРамид, РР. В,2; Я-В2,Вс.

Разработка методики определения смеси ВРВ осуществлялась на поливитаминных таблетированных препаратах «Нейромультивит», «Пентовит» и «Декачевит». Проверку правильности методики осуществляли введением стандартных добавок ВРВ, с нахождением содержания стандарта и исходного содержания ВРВ по градуировочным зависимостям (табл. 5).

Таблица5

Оценка правильности методики определения ВРВ в витаминных препаратах (п=5, Р=0,95)

Витамин Введено стандарта, мг/мл Б, мМ* Найдено стандарта, С+8, мг/мл &

исходной пробы с добавкой

Пентовит

Вб 0,5 134,0 175,4 0,49±0,02 0,04

0,4 664,1 735,1 0,38 + 0,038 0,08

В! 1,0 230,4 345,6 1,01±0,(М 0,04

В.2 0,006 411,7 495,8 0,006 ±0,0006 0,09

Вс 0,45 57,9 133,5 0,44±0,039 0,07

Декамевит

С 2,62 214,8 234,2 2,61 ±0,03 0,01

РРамид 0,85 659,1 729,0 0,85±0,02 0,02

в, 2,0 181,1 293,5 2,01±0,08 0,03

в,2 0,006 239,2 323,0 0,006±0,0007 0,09

в2 0,50 381,4 501,0 0,49+0,02 0,03

Вс 0,45 76,5 196,5 0,44±0,01 0,03

ковднхж

Рис. 9. Схема выбора процедуры подготовки пробы и техники хроматографирования на базе предварительной информации о составе препарата.

Метрологические характеристики методик анализа представлены в табл. 6.

Таблица 6

Метрологические характеристики методик определения ВРВ в препаратах (п=5, Р=0,95)

Препарат Регламентированное содержание витамина, мг Найдено х, мг ±5, мг £

Пентовиг В6 5,0 4,88 ±0,41 0,07

РРамкд 20,0 19,39 ±0,80 0,03

В, 10,0 9,39 ±1,21 0,10

в,2 0,05 0,049 ±0,008 0,07

Вс 0,4 0,038 ±0,035 0,07

Декамевиг С 200,0 198,4 ±2,30 0,01

50,0 49,05 ±0,69 0,01

В, 20,0 19,25 ±0,78 0,04

В2 10,0 9,93 ±0,21 0,02

В,2 0,10 0,095 ±0,011 0,12

Вс 2,0 1,98 ±0,13 0,06

Нейромультивит Вб 200,0 198,62 ±7,13 0,03

в. 100,0 99,22 ±2,65 0,02

в,2 0,20 0,19 ±0,009 0,04

Описание всех разработанных методик с подробным регламентом выполнения измерений приведены в тексте диссертации.

Представленные методики характеризуются универсальностью, простотой в выполнении, не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов, характеризуются минимальной пробоподготов-кой. Разработанная схема двойного хроматограф ирования с переключением колонок расширяет возможности методик и прибора. Это позволяет рекомендовать метод ики для количественного контроля ВРВ в фармацевтических препаратах в аналитических службах предприятий. Проведенные исследования могут быть положены в основу базовых методик определения витаминов в косметических товарах и пищевых продуктах.

Выводы

В целях разработки экспрессных методик количественного контроля содержания водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах на основе кзократи-ческой обращено-фазовой ВЭЖХ:

1. Проведено систематическое исследование и обобщение результатов хромагографического поведения водорастворимых витаминов: хлорида тиамина (витамин В1), рибофлавина (В2), гидрохло-рвда пиридоксина (В^), циагокобаламина (В12), аскорбиновой кислоты (С) никотиновой кислоты (РР), амида никотиновой кислоты (РРамвд), фолиевой кислоты (Вс) на сорбенте нерегулирован-ной формы ЗЦааэгЬ С,8 при элюировании водосодержащими бинарными подвижными фазами.

2.Изучено влияние на хромагографическое разделение витаминов в ОФ ВЭЖХ состава подвижной фазы: природы и концентрации модификатора, рН и ионной силы элюенга. Установлен оптимальный состав ПФ (ФБ с рН 8,65 : 0,4об.% изопропанол), обеспечивающий эффективное разделение пятикомпоненгной смеси витаминов - С, РРамид, В^ В], Вс. Показана возможность ингер-

претации результатов хромагографического поведения ВРВ с помощью универсального квазихимического уравнения.

3. Проведены квангово-химические расчеты: электронного строения и энергии взаимодействия водорастворимых витаминов в хромагографической системе «Silasorb Си - вода»; характеристик гидро фобносга Шаща (Н) и Ганча-JIeo (log Р). Установлена взаимосвязь параметров удерживания исследованных соединений и критерия Шаща 4Лроведено комплексное исследование влияния состава подвижной фазы (природы и концентрации ИПР, рН элюенга, количества органического модификатора) на хроматограф ическое разделение ВРВ в условиях ион-парной обращено-фазовой ВЭЖХ при изократическом элюировании. Показана перспективность примене1шя в качестве ион-парного реагента фосфониевых солей. Достигнуто разделение с Rs>l витаминов кислотного характера- С, РР, Вс,либо-Вь В^ Вб,В12,Вс при элюировании ПФ состава- 7,5 мМ БТДАФ в ФБ с рН 8,65 :0,6об.% изопропанол. 5.Состаачена рациональная схема выбора хромагографической системы для анализа различных сочетаний смесей витаминов. Охарактеризованы эффективность, селективность и время анализа смесей. бЛредлюжена схема многомерного хроматографирования, сочетающая ОФ и ион-парную ОФ ВЭЖХ в режиме кзократического элкяфования, которая обеспечивает эффективное разделение всего спектра исследованных витаминов, одновременно присутствующих в аналиге. Оптимизирован режим ее работы.

7.Разрабатаны методики определения ВРВ в сложных многокомпонентных фармацевтических ре-цешурах (инъекционные препараты и таблеггированные формы). Достоинством предлагаемых методик являются возможность одновременного качественного и количественного контроля водорастворимых витаминов, отсутствие сложного алгоршма пробоподгоговки, высокая точность и экспрессность, ншкая стоимость серийных анализов. Методики прошли испытания на предприятиях г. Белгорода (технические акты внедрения включены в приложение диссертации).

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1.Филимонов В.Н., Сирицо С.И. Хроматографическое разделение при аналитическом контроле водорастворимых витаминов и физиологически акшвных кислот в многокомпонентных рецешу-рахУ/ Журн. «Сорбционные и хромагографические процессы». - 2005. -Т..5, №2. - С.180 - 201.

2.Филимонов В.К, Сирицо С.И. Экологический контроль физиологически активных веществ методом ВЭЖХУ/Журн. «Веспшк БГТУ им В.Г.Шухова».-2005- №12.-С. 77- 79.

3.Филимонов В.Н., Сирицо С.И., Дмифиева Р.П. Математическое плашфование эксперимента при выборе хромагографической системы для ион-парной ВЭЖХ физиологически активных ве-щесгвУ/Журн. «Весшик БГТУ им В.Г.Шухова».-2005.-№12.- С. 74-77.

4. Филимонов В.Н., Сирицо С.И., Макрушин. НА. Особенности хромагографического разделения водорастворимых витаминов изократической ОФ ВЭЖХУ/Журн. «Сорбционные и хромагографические процессы».-2006,-Т 6, №2.-С. 191-197.

5.Филимонов B.R, Сирию СМ., Балятнская JIH. Регулирование сорбцио!шых процессов в системе «Сорбент - эдюент - сорбит» при хроматогра}>ировании водорастворимых витаминов ОФ ВЭЖХ //Изв. Тульского Государственного университета. Сер. «Химия». 2006, Вып.6. - С 78 - 84.

6.Филимонов В.Н., Сирицо С.И, Баляптнская Л.Н. Ионная и ион-парная ВЭЖХ дам разделения физиологически активных кислот и водорастворимых в многокомпоненшых препара-•гахУМатериалы XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Казань, 2003. - С. 555.

7.Филимонов В.Н., Сирицо С.И Кагаонно-аетивные ПАВ как ион-парные реагенты при разделении физиологически активных веществ в ВЭЖХ//Магериалы XI конф. «Поверхносшо-акгавные вещества- наука и производство». Шебекино, 2003. - С. 19 - 20.

8.Филимонов В.Н., Сирицо С.И, Замуруев О.В, Баляпшская ЯН. Экохимический мониторинг витаминосодержащих лекарственных препаратов методом ВЭЖХ//Материалы V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналигика - 2003». Санга^ ПегербургДЮЗ. - С. 133

9.Филимоюв В.Н, Сирицо С.И. Самоорганизация хромагографической системы при разделении водорастворимых витаминов методом ион-парной ВЭЖХУ/Матсриалы П Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах» («Фагран - 2004»), Воронеж, 11-15 октября 2004. - С. 345.

10. Филимонов В.Н, Сирицо СЛ., Балятинская ЛЛ. Внеколоночное образование ионной пары для разделения смеси карбоновых и оксикислот методом ион-парной ВЭЖХУ/Гезисы VII конференции «Анатигика Сибири и Датьнего Востока», Новосибирск, 11-16 октября 2004. - С. 274.

11. Филимонов В.Н, Сирицо С.И. Возможности изократического элюирования для разделения смеси водорастворимых витаминов методом ОФ ЮЖХ// Разделение и концешрирование в аналитической химии иё радиохимии: матер П Междунар.симпоз,- Краснодар, 2005. - С. 91.

12. Филимонов В.Н, Сирицо С.И. Алкиламинофосфониевые соединения как ион-парные реагенты для разделения водорастворимых витаминов методом ион-парной ОФ ЮЖХ// Разделение и концешрирование в аналитической химии и радиохимии: матер П Междунар.симпоз.- Краснодар, 2005.-С. 279.

13. Филимонов В.Н, Сирицо С.И. Экстракционное выделение и концентрирование витамина В12 при хромагографическом котроле поливитаминных препараговШ1 Международная конференция «Экстракция органических соединений»; каталог докл., - Воронеж, 17-21 октября 2005. -С. 321.

14. Филимонов В.Н, Сирицо С.И. Оценка распределения межмолекулярных взаимодействий в системе: «Силасорб С18 - водорастворимый витамин - элюент» по данным ОФ ВЭЖХ// Ш международный симпозимум «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазовых границах. «Фагран - 2006» Воронеж. 2006. Т.2 - С. 255 -258.

15. Филимонов В.К, Сирицо С.И. Экологический мониторинг фармацевтических препаратов методом обращено-фазовой ВЭЖХ [Электронный ресурс]//Магер.Ш Международная научно-пракгаческая конференция Проблемы экологии: промышленность, образование. 25-27 октября 2006. Белгород.

16. Филимонов B.H., Сирицо С.И. Применение вариантов ВЭЖХ на неполярной фазе при контроле содержания водорастворимых витаминов фармацевтических препаратах// П Всероссийская конференция «Аналитика России»: тездокл., Краснодар. -2007, -С.468.

17. Филимонов В.Н, Сирицо С.И. Разделение смеси водорастворимых витаминов методами обращенно-фазовой и ион-парной ВЭЖХ//П Междунар. форум «Аналитика и аналишки»». Рефераты докладов. Воронеж, 2008. - С. 524.

Заказ № Объем 1.4 п.л._Тираж 100 экз.

Редакционно /здательский центр НИ (филиал) ГОУ ВПО РХТУ им. Д.И. Менделеева

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Классификация и физико-химические свойства водорастворимых витаминов

1.2. Методы аналитического определения водорастворимых витаминов

1.2.1. Физические, химические, биологические методы

1.2.2. Оптические методы 16 1.2.3 .Электрохимические методы 18 1.2.4. Хроматографические методы

1.3. Обращенно - фазовая и ион-парная обращенно - фазовая ВЭЖХ

1.3.1. Аналитические определения в изократическом и градиентном режимах

1.3.2. Модели и механизмы удерживания 27 1.3.2.1 Свойства сорбатов. Гидрофобность

1.3.2.2. Свойства сорбатов. Полярность

1.3.2.3. Элюенты в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ

1.3.2.4. Удерживание на неполярных сорбентах в обращенно-фазовой ВЭЖХ

1.3.2.5. Ион-парная ОФ ВЭЖХ. Модели удерживания и факторы, влияющие на

1.4. Задачи и этапы исследования

2. Экспериментальная часть

2.1. Объекты и методы исследования

2.2. Растворители, фазы и реактивы

2.3. Приборы и оборудование

2.4. Расчет параметров хроматографического разделения

2.5. Квантово-химические расчеты строения сорбатов и их гидрофобность

3. Расчет параметров молекул, их гидрофобность и энергии молекулярного 48 взаимодействия

3.1. Квантово-химические расчеты строения витаминов и их ориентация при 48 сорбции

3.1.1. Влияние структуры и гидрофобности сорбатов

3.2. Гидрофобность витаминов и энергия межмолекулярных взаимодействий в 54 хроматографируемых системах

4. Обращенно - фазовая хроматография при элюировании водными и водноорганическими растворами

4.1. Хроматографирование ВРВ водными растворами

4.2. Влияние природы и концентрации органического модификатора

4.3. Влияние кислотности и ионной силы элюента на параметры хроматограмм

4.3.1. Элюирование водными буферными растворами

4.3.2. Элюирование водно-органическими буферными растворами

4.4. Ион-парная обращенно - фазовая хроматография витаминов

4.4.1. Влияние рН и состава элюента

4.4.2. Влияние природы и концентрации ион-парных реагентов 82 5. Аналитическое определение водорастворимых витаминов

5.1. Выбор рациональной схемы разделения витаминов

5.2. Техника выполнения анализа смеси водорастворимых витаминов

5.3. Пределы обнаружения интервала определения и уравнения регрессии при 96 анализе индивидуальных витаминов

5.4. Контроль содержания витаминов в растворах для инъекций

5.5. Контроль содержания витаминов в таблетированных фармацевтических 104 препаратах

Выводы

Актуальность темы. Витамины - низкомолекулярные биологически активные органические соединения различной химической природы, необходимые в небольших количествах организму для нормального функционирования и роста, сопротивляемости инфекциям, синтеза белков и жиров. По растворимости подразделяются на жирорастворимые и водорастворимые (ВРВ). Последние представлены широким рядом представителей, сильно различающихся по своим физико-химическим свойствам и относящихся к разным классам соединений - витамин С, витамины группы В: тиамин (В)), рибофлавин (Вг), никотиновая кислота (ниацин, РР), амид никотиновой кислоты (ниацинамид, РРамид), пиридоксин (Вб). фолиевая кислота (Вс), цианокобаламин (В12) [1, 2]. Дефицит витаминов провоцирует возникновение авитаминозов, изменение физиологических процессов в организме, предотвращение которых возможно посредством применения фармацевтических рецептур, содержащих синтетические витамины [2].

Увеличивающаяся активность выпуска поливитаминных препаратов фармацевтическими предприятиями Белгородского региона требует проведения контроля их аутентичности и качества [3]. Однако, методики качественного и количественного их анализа, рекомендуемые в настоящее время нормативно-техническими документами, основаны главным образом на методах спектрофотометрии. Эти методы не достаточно селективны, трудоемки и требуют больших затрат времени, связанного с предварительным выделением компонентов, входящих в состав препаратов и наличием большого числа вспомогательных операций, при подготовки пробы к анализу. Поэтому актуальной задачей аналитической химии витаминов является разработка экспрессных и высокоточных методик количественного определения содержания ВРВ в многокомпонентных смесях.

Эффективным способом решения данной проблемы может стать применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), которая характеризуется высокой чувствительностью, селективностью, разрешающей способностью и быстротой получения конечных результатов [4]. Растворимость ВРВ в полярных растворителях обусловливает целесообразность решения подобных аналитических задач в рамках обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ. В практической деятельности аналитических служб предприятий Белгородского региона методики с применением данного варианта ВЭЖХ не нашли широкого распространения, что связано с необходимостью использования: высокоэффективных дорогостоящих сорбентов; многокомпонентных подвижных фаз с токсичными модификаторами (например, метанолом), требующих дополнительных лицензий для работы; детектирующих систем (например, диодно-матричных), ограниченно применяемых в настоящее время.

Кроме этого, для достижения эффективного разделения смесей ВРВ. различающихся по химическим свойствам, как правило, предлагается применение градиентного режима элюи-рования, который, характеризуется (по сравнению с изократическим) меньшей воспроизводимостью количественных характеристик пиков, более высоким уровнем «шумов», увеличением длительности и стоимости серийных анализов, а также дополнительными расходами на реактивы и оборудование [4, 5]. В связи с этим применение градиентного режима не всегда целесообразно, а возможности разделения смеси ВРВ при фотометрическом детектировании в изократическом режиме элюировании до конца не выявлены.

Цель работы - разработка экспрессных методик количественного контроля содержания водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах на основе изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ, реализуемых на доступном отечественном хроматографическом оборудовании с фотометрическим детектированием.

Для достижения этой цели решались следующие задача:

1. проведение систематических исследований хроматографического поведения водорастворимых витаминов на сорбентах нерегулированной формы в различных вариантах обращенно-фазовой ВЭЖХ при изократическом режиме элюировании водосодержащими бинарными подвижными фазами;

2. выбор модели адекватно описывающей удерживание водорастворимых витаминов в варианте ОФ ВЭЖХ;

3. разработка схемы анализа водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах.

Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2005 - 2009 г.г. Секция «Ионообменное хроматографи-рование», тема «Высокоэффективная жидкостная хроматография, высокоэффективная ионная хроматография биологически активных веществ», код 2.15.11.4x70.

Научная новизна. Систематизированы и обобщены результаты исследования хроматографического поведения витаминов: С, Вь Вг, Вб, В]2, Вс, РР, РРамид алкильными сорбентами нерегулированной формы при изократическом элюировании бинарными водосодержащими подвижными фазами в режиме ОФ и ион-парной ОФ ВЭЖХ.

В рамках полуэмперического метода установлено распределение электронной плотности в молекулах ВРВ, рассчитаны энергии их взаимодействия с неподвижной фазой и водой. Проведена оценка гидрофобности водорастворимых витаминов с помощью критериев

Шатца (Н) и Ганча-Лео (^Р) и сопоставление их с энергиями взаимодействия «витамин -ЗПаБОгЬ С18», «витамин-вода», параметрами удерживания аналитов.

Показана перспективность применения уравнения универсальной квазихимической модели для оценки роли межмолекулярных взаимодействий водорастворимых витаминов в ОФ ВЭЖХ.

Впервые опробовано и рекомендовано в качестве ион-парного реагента применение четвертичных фосфониевых соединений для разделения смеси ВРВ в ходе комплексного исследования влияния состава подвижной фазы в варианте ион-парной (ИП) обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Обосновано применение многомерного хроматографирования, сочетающего варианты ОФ и ион-парной ОФ ВЭЖХ для эффективного разделения полного набора смеси исследуемых ВРВ.

Практическая значимость. На основании комплексного исследования хроматографи-ческого поведения водорастворимых витаминов в обращенно-фазовой и ион-парной ОФ ВЭЖХ:

- разработана схема рационального выбора состава подвижной фазы, исходя из априорной информации об анализируемом объекте;

- оптимизирован режим работы схемы многомерного хроматографирования;

- разработаны экспрессные методики количественного контроля содержания водорастворимых витаминов, реализуемые на отечественных хроматографах с фотометрическим детектором при многомерном хроматографировании в изократическом режиме. Методики прошли промышленную апробацию на предприятиях г. Белгорода.

Установленные в работе закономерности хроматографического поведения ВРВ в условиях ОФ и ИП ОФ ВЭЖХ при изократическом элюировании сорбатов могут быть включены в хроматографические базы данных и использованы при разработке методов аналитического контроля водорастворимых витаминов в продуктах пищевой и косметической промышленности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Закономерности хроматографического поведения водорастворимых витаминов на сорбентах нерегулированной формы (БПазогЬ С18) при элюировании бинарными водосо-держащими подвижными фазами.

2. Анализ роли межмолекулярных взаимодействий в удерживании ВРВ с позиции теории универсальной квазихимической модели.

3. Влияние состава (природы и концентрации ион-парного реагента, органического модификатора, рН среды) элюента на удерживание ВРВ в варианте ИП ОФ ВЭЖХ. Результаты оценки применения в качестве ион-парных реагентов четвертичных аммониевых и фосфониевых солей.

4. Многомерная техника изократического элюирования аналита, содержащего полный набор исследуемых водорастворимых витаминов.

5. Методики хроматографического определения водорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: XI конференции «Поверхностно-активные вещества - наука и производство» (Шебекино, 2003 г.), X Межрегиональной конференции «Проблемы химии и химической технологии» (Тамбов, 2003 г.), I, II, III Всероссийской конференции «Физико-химические процессы в конденсированном состоянии и на межфазных границах «Фагран - 2002», и «Фагран - 2004» и «Фагран - 2006» (Воронеж, 2002, 2004 и 2006г.г.), V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика - 2003». (Санкт-Петербург, 2003г.), VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока» (Новосибирск, 2004 г.), III Международной конференции «Экстракция органических соединений «ЭОС - 2005» (Воронеж, 2005 г.), Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (Краснодар, 2002 г.), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), II всероссийской конференции «Аналитика России» (Краснодар, 2007 г.), II международный форум «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей (в том числе обзор) в периодических изданиях, рекомендованных ВАК для опубликования научных трудов и 12 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, экспериментальная часть, три главы обсуждения полученных результатов), выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста, включает в себя 35 рисунков и 37 таблиц. Список литературы содержит 207 наименований работ зарубежных и отечественных авторов.

Выводы

В целях разработки экспрессных методик количественного контроля содержания водорастворимых витаминов в многокомпонентных фармацевтических рецептурах на основе изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ:

1. Проведено систематическое исследование и обобщение результатов хроматографического поведения водорастворимых витаминов: хлорида тиамина (витамин В]), рибофлавина (В2), гидрохлорида пиридоксина (Вб), цианокобаламина (В 12), аскорбиновой кислоты (С) никотиновой кислоты (РР), амида никотиновой кислоты (РРамид), фолиевой кислоты (Вс) на сорбенте нерегулированной формы БПазогЬ С18 при элюировании водос о держащими бинарными подвижными фазами.

2. Изучено влияние на хроматографическое разделение витаминов в ОФ ВЭЖХ состава подвижной фазы: природы и концентрации модификатора, рН и ионной силы элюента. Установлен оптимальный состав ПФ (ФБ с рН 8,65 : 0,4об.% изопропанол), обеспечивающий эффективное разделение пятикомпонентной смеси витаминов - С, РРамид, Вб, В|, Вс. Показана возможность интерпретации результатов хроматографического поведения ВРВ с помощью универсального квазихимического уравнения.

3. Проведены квантово-химические расчеты: электронного строения и энергии взаимодействия водорастворимых витаминов в хроматографической системе «ЗПаБогЬ С18 - вода»; характеристик гидрофобности Шатца (Н) и Ганча-Лео (log Р). Установлена взаимосвязь параметров удерживания исследованных соединений и критерия Шатца.

4. Проведено комплексное исследование влияния состава подвижной фазы (природы и концентрации ИПР, рН элюента, количества органического модификатора) на хроматографическое разделение ВРВ в условиях ион-парной обращенно-фазовой ВЭЖХ при изократическом элюировании. Показана перспективность применения в качестве ион-парного реагента фосфониевых солей. Достигнуто разделение с Кв>1 витаминов кислотного характера - С, РР, Вс, либо - Вь В2, Вб, В 12) Вс при элюировании ПФ состава: 7,5 мМ БТДАФ в ФБ с рН 8,65 : 0,6об.% изопропанол.

5. Составлена рациональная схема выбора хроматографической системы для анализа различных сочетаний смесей витаминов. Охарактеризованы эффективность, селективность и время анализа смесей.

6. Предложена схема многомерного хроматографирования, сочетающая ОФ и ион-парную ОФ ВЭЖХ в режиме изократического элюирования, которая обеспечивает эффективное разделение всего спектра исследованных витаминов, одновременно присутствующих в аналите. Оптимизирован режим ее работы.

7. Разработаны методики определения ВРВ в сложных многокомпонентных фармацевтических рецептурах (инъекционные препараты и таблетированные формы). Достоинством предлагаемых методик являются возможность одновременного качественного и количественного контроля водорастворимых витаминов, отсутствие сложного алгоритма пробоподготовки, высокая точность и экспрессность, низкая стоимость серийных анализов. Методики прошли испытания на предприятиях г. Белгорода (технические акты внедрения включены в приложение диссертации).

1. Березовский В. М. Химия витаминов. - М.: Пищепромиздат, 1959. 600 с.

2. Витамины / Под ред. М. И. Смирнова. М.: Наука, 1988, т.8, С.5-8.

3. Лутцева А.И., Маслов Л.Г. Методы контроля и стандартизации лекарственных препаратов содержащих водорастворимые витамины.//Хим.-фармац. журнал. 1999. - №9. - С.ЗО - 61.

4. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир, 1980. 248с.

5. Кисилев А.В., Пошкус Д.П. Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия. 1986. С.

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т.2. М.: Медицина, 1972.- С. 343.

7. Миндел Э. Справочник по витаминам и минеральным веществам. Пер. с англ. М.: Медицина и питание, 2000. 432 с.

8. Методы определения витаминов (химические и биологические). Под ред. В.А. Девяткина. М: Пищепромиздат, 1954 с.

9. Государственная Фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.2.М.:Медицина.1990.

10. United States Pharmacopeia, 23-th Ed., Rockville, United States Pharmacopeial Convention, Inc. 1994.

11. Мазор Л. Методы органического анализа. М.: Мир, 1986. — 584 с.

12. Дейкина В.П., Помелова П.И., Соболева Н.С. О содержании витаминов группы В в кормовых дрожжах различных предприятий.// Гидролиз и лесохим. пром-ть. 1984. -№1. - С. 11-12.

13. Стачинский А.Н., Арчинова Т.Ю., Шомахонова С.Н. // Фармация. 1988. -Т.37. №3. - С. 29-31.

14. Hassan S.S.M, Elnemma Е. Thiamine reineckate liquid membrane electrode for the selective determination of thiamine (vitamin Bi) in pharmaceutical preparations// Talanta. - 1989. - V.36.№ 10. - P. 1011-1015.

15. British Pharmacopeia CD 1998 v2.0, System Simulation Ltd.

16. Varma Krishna K., Jain Archana, Rawat Rameshwar. Titrimetric determination of ascorbic acid using chloranil.//J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 1984. -V. 67, № 2. -P. 262-265.

17. Srivastova A., Abbi R., Gupta A., Bindra S., Singh S.K. Definition of ascorbic acid and medicines of sulfamid in mixes at interaction with N- N-chlorisuccenilamid.//Microchim. acta. 1989. - V.3, № 1-2. - P. 81 - 89.

18. ГОСТ 7047- 55. Витамины А, С, Д, В,, В2 и PP. Отбор проб, методы определения витаминов и испытания качества витаминных препаратов. М.Изд-во стандартов. 1994. - 48с.

19. Juan Bai, Xu Hun, Qing Liu, Jianchun Chen, Li Bai. Capillary electrophoresis detection scheme for vitamin Bi and vitamin B2 based on the potassiumhexacyanoferrate(III) chemiluminescence system// Microchim Acta. 2007. 10.-P. 108-112.

20. Li Xiangjun, Zhang Yuping, Yuan Zhuobin. Simultaneous determination of vitamins С and PP in tablets by capillary electrophoresis. //Fenxi nuaxue=Anal. Chem. -2002 V. 30,№7.-P. 815-818.

21. Jenkins M.A., Guerin M.D. Analysis of thiamin and niacin in multivitamin premixes by capillary electrophoresis.//J.Cromatogr. B.Biomed. Appl. 1996. - V.682, № 1,-P. 23 - 24.

22. Lehmann R., Liebich H.M., Voelter W. Determination of water soluble vitamins by capillary electrophoresis // J.Capillary Electrophor. 1996. - V.3, № 2. - P. 89110.

23. ГОСТ P 52741-2007. Определение свободных форм водорастворимых витаминов в премиксах, витаминных добавках, концентратах и смесях. МВИ М 04-41-2005

24. Веселков А.Н., Ландушенко А.О., Чубаров А.С., Веселков Д.А., Дэвис О.Б. ЯМР-анализ самоассоциации рибофлавин-мононуклеотида и его комплексообразования с РРамидом в водном растворе.//Журн. физ. химии. -2002. Т.76, №8. - С. 1495 - 1502.

25. Беликов В.Г. Анализ лекарственных веществ фотометрическими методами. Опыт работы отечественных специалистов//Рос.хим.ж. (Ж.Рос.хим.об-ва им. Д.И.Менделеева). 2002. - Т.66, №4. - С. 52 - 56.

26. Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ. Пер. с анг. М.: Мир, 1987. С. 284-360.

27. Международная фармакопея. Изд. 3-е. Женева: ВОЗ, 1981 1995. Т. 1-4.

28. Ferreira S.L.C., Bandeira M.L.S.F., Lemos V. A. et al. Spectrophotometric determination of ascorbic acid // Fresenius'J.Anal. Chem. 1997. - V.357, №8. — P.l 174- 1178.

29. Sharma S.C., Saxena R.C., Talwar S.K. Simultaneous spectrophotometeric analysis of a ternary mixture of pharmaceuticals assay for meclozine hydrochloride, pyridoxine hydrochloride and caffeine //J.Pharm.Biomed.Anal. -1989. -V. 7, №3 -P. 321 - 327.

30. Srividya K., Balasubramanian N. Sensitive spectrophopotometric determination of ascorbic acid in pharmaceutical samples and fruit extracts. //Chem anal. 1999. -V. 44, №4. - P.689-695.

31. Martinez Lisstte Sordo, Soto Mulet Laritza, Gonzalez Hernander Ropando. Determinación de vitamina B12 en una formulaction multivitamica por espectrofotonetria de derivada de primer orden//Acta farm, bonaerense. 1999. -V.18, №2.-P. 135- 139.

32. Nirmalchandar V., Balasubramanian N. Spectrophotometric determination of thiamine //Indian Drugs. 1989. - V.26, №5. - P.233 - 237.

33. Hua-Bin Li. Feng Chen. Determination of vitamin B12 in pharmaceutical preparation by a highly fluorimetrical method //J. Anal. Chem. 2000. - V. 268, №8. P.836 - 838.

34. Chatterjce P.K., Kumar Yogender. Simultaneous spectrophotometric determination of vitamin Bi and B6 in presence of B12 in formulations.// Indian J. Pharm Sci. -1985. V.47, №3. - P.118-119.

35. Baker Warren 1., Lowe Trevol. Sensitive ascorbic acid assay for the analysis of pharmaceutical products and fruit juices. //Analyst. 1985. - V. 110, № 10. - P. 1189-1191.

36. Barbas Pardillo M., Peris Martinez V., Gimeno Adelantado J.V., Reig F.B. Spectrophotometric determination of vitamin C with using of system Cu(II) -niocsim- ascorbic acid//Microchem. J. 1989. - V.40, №1. P. 109-114.

37. Фарайзаде М.А., Нагизаде С. Простой и надежный спектрофотометрический метод определения аскорбиновой кислоты в фармацевтических препаратах// Журн. аналит. химии. 2003. - Т.58, №10. - С. 1037-1043.

38. Srividya K., Balasubramanian N. Spectrophotometry determination of vitamin B6.//J. Assoc. Off. Anal. Chem. Int. 1997. - V.80, №6. - P. 1368 - 1376.

39. Nirmalchandar V., Balasubramanian N. Spectrophotometric determination of pyridoxine hydrochloride in pharmaceutical samples//Analyst (London). 1988. -V.l 13, №7. -P. 1097- 1099.

40. Perez-Ruiz Т., Martinez-Lozano C., Tomas V., et al Spectrophotometric determination of folic acid.//Anaiyst (London), 1994. - V.l 19, №6. - P. 11991203.

41. Экспериментальная витаминология: Справочное руководство./Под ред. Ю.М. Островского. Минск: Наука и техника. 1979. 552с.

42. Милентьева Г. А., Антонова JI. А. Фармацевтическая химия. М.: Медицина, 1985. 480 с.

43. Vamos Karolyne. Fluorometrias ejaras C-vitamin tartalom meghatarorasara.//Elelmeri. 1989. - 43, №1. - P. 16-20.

44. ГОСТ P 50929-96 Премиксы. Методы определения витаминов группы В. -М.Изд-во стандартов. 1997. - 35с.

45. Дубцов Г.Т., Тимошкин Е.Г. Использование метода люминесцентного анализа для контроля процесса витаминизации хлебных процессов.// Хим. проблемы пищ. технологий. Сб. тез. докл. регион н-техн совещ. Краснодар. -1990.-С. 47-48.

46. Liuxin. Huang Hanguo. Fluorimetric determination of folic acid in pharmaceutical samples // Fenxi huaxue = Anal. Chem. 2000. - V.28, №11.- P. 1406-1409.

47. Ollilainen V., Finglas P. M., H. Van den Berg, I. de Froidmont-Gortz. Certification of B-group vitamins (Bi, B2, Вб, and B12) in four food reference materials.// J. Agric. FoodChem. 2001.-V. 49, №.1 - P. 315-321.

48. Zhang Zhujun., Qin Wei., Liu Haajun. Chemilumines cence flow gensor for the determination of vitamin Bi2//Anal. chem. acta. 1997. - V. 357, №1-2. - P. 127 -132.

49. Сахаров А.А. Амперометрическое определение аскорбиновой кислоты в таблетках //Хим-фармац. ж. 1989. - Т.23, №10. - С. 1274 - 1276.

50. Chen Hong-Yuan, Han Ji-Lin, GaO (H.Kao) Hong. Study adsorption inversion VAM in running system for determination ultra amount of the folic acid // Fresenius7 J. anal. Chem. 1989. - V.334, №7. - P. 621-622.

51. Анисимова JI.C., Михеева E.B. Слипченко В.Ф. Определение рибофлавина в витаминизированных подкормках вольтамперометрическим методом //Журн. анал. химии. 2001. - Т.56, №7. - С.739 - 744.

52. Mostafa G. А. Е. Potentiometric Membrane sensors for the selective determination of pyridoxine hydrochloride (Vitamin Вб) in some pharmaceutical formulations// J. of Anal. Chemistry. -2003.-V. 58, №.11. P. 1073-1077.

53. Peter Tomcik, Craig Е. Banks, Trevor J. Davies, Richard G. Compton. A self-catalytic carbon paste electrode for the detection of vitamin B|2//Anal. Chem. -2004. №76. - P. 161-165.

54. Турсунова P.H., Арзамасцев А.П. Анализ таблеток «Декамевит».// Результаты и перспективы науч. исслед. по биотехнол. и фармации: Тез. докл. Всесоюзн. конф. 29 июня 1 июля. 1989. - С.74-75.

55. Srinivas В., Srinivasly К. Separation of some water-soluble vitamins by thin layer chromatography using heulandite as an adsorbent.// J. Indian Chem. Sol. 1992. - V.69, №10.-P.669-670.

56. Илларионова E.A., Сыроватский И.П. Исследование качества ксантинола никотината с использованием тонкослойной хроматографии.// Зав. лаб. Диагностика материалов. 2003. Т. 69. №4 - С 16 — 18.

57. Карпова Л. А., Королева О. А., Совместное определение водо- и жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии с использованием водно-мицеллярной подвижной фазы./Журн. аналит. химии. 2007. - Т.62, №3. - С. 281 - 286.

58. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965. 508 с.

59. Березкин В.Г. Одновременное определение водо- и жирорастворимых витаминов в различных режимах высокоэффективной тонкослойной хроматографии. // Сорбционные'и хроматографические процессы. 2007. - Т.7, Вып. 6.-С. 909-916.

60. Farias С.М., Bhate V.R. Determination of traces of niacin in niacinamide by pyrolytic methylation gas chromatography.//Indian J. Pharm. Sci. 1983. - V.45, №2. - P. 278-280.

61. Echols Pichard E., Miller Robert H., Winrer Willie, Carmen Darrell J., Ireland Yonetta R. Gas chromatographic determination of thiamin in meats, vegetables and cereals with a nitrogen-phosporus detector.//J. Cromatogr. 1983. - V. 262. -P.257 - 623.

62. Слижов Ю.Г., Гавриленко M.A, Лосев А.Г.// Тезисы VII конференции «Аналитика Сибири и Дальнего Востока», Новосибирск, 11-16 октября 2004. С. 200.

63. Kienzl Elisabeh, Riederer P., Washiittl J. Methodological problems in vitamin Вб estimation. //Recent Dev. Food Anal. Proc. 1 Eur. Conf. Food Chem. (EURO FOOD CHEM l)Vienna, 17-20 Febr.,1981, Wienheim e.a. 1982. P. 132-136.

64. Практическая газовая и жидкостная хроматография. Учебн. пособие/Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Витенберг и др. СПб.: Изд-во С.-Петербург. Ун-та. 1998.-612 с.

65. Хроматография. Практическое приложение метода. В 2-х ч. 4.1.Пер. с англ./ Под ред Э. Хефтмана.-М.: Мир, 1986. С. 262-265. ,

66. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии: Пер. с англ./

67. Под ред. Хеншен и др. М.: Мир. 1988. 688с.

68. David J. Anderson. High-performance liquid chromatography in clinical analysis//Anal. Chem. 1999. -№71. - P. 314R-327R

69. Лутцева A.M., Маслов Л.Г., Евтушенко Н.С., Середенко В.И. Анализ и стандартизация водорастворимых витаминов. //Фармация. 1998. - №5 - С. 22 - 29.

70. Ульянова С.В., Щавлинский А.Н., Морев С.Н., Дмитренко Т.С., Финкелыптейн Е.И. Анализ водорастворимых витаминов Bj В2, Вб и никотинамида в драже "Гексавит" методом ВЭЖХ.// Фармация. 1993. -Т.42. — №3. - С.50-51.

71. Григорьев A.M., Высочина Л.А., Староверов В.М., Дейнека В.И., Высочин А.П., Белова В.М. Высокоэффективная жидкостная хроматография синтетического витамина В. // Журн. аналит. химии. 1992. - Т. 47, №10-11. -С. 1904-1908.

72. Lim K.L., Young R.W., Driskell J.A. Separation of vitamin Вб components by high-performance liquid chromatography. // J.Chromatogr. 1980. - V.188, №1. -P.285 -288.

73. Vandersilce J.T., Higgs D.J. HPLC analysis with fluorometric detection of vitamin С in food samples.// J.Chromatogr. 1984. - V.22, № 11 - P. 485 - 489.

74. Chu Kai-On, Tin Kam-Chung. Analysis of commercial multi-vitamin preparation by HPLC with diod array detector// Anal. Lett. 1998. - V.31, №15. - P. 2707 -2715.

75. Кожанова Л.А., Федорова Г.А. Барам Г.И. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии// Журн. аналит, химии. — 2002. Т.57, №1. - С. 49-54.

76. Vails Felicidad, Sancho М. Teresa, Fernondes-Muito Miquel A., Checa Martin A Determination of vitamin Вб in cooked sausages // J. Agr. and Food Chem. 2001. - V.49,№8.-P.38-41.

77. Lumley I.D., Wiggins R.A. Determination of riboflavin and flavin monucleotide in foodstuffs using high-performance liquid chromatography and a column-enrichment technique.//Analyst. 1981. - V.106, №12. - P.l 103 - 1108.

78. Majiors Ronald E., Barth Howard G., Lochmuller Charles H. Column liquid chromatography //Anal. Chem. 1984. - V.56. - P.300 - 349.

79. Киселев А. В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: Высшая школа, 1986. - 360 с.

80. Li Xiaoning, Liu Xiaoling. Determination of folic acid in enriched milt for baby feeding by method HPLC // HHWi03dao=Acta. Nutr. Sin. 1988. - V.10, №4. P. 354-359

81. Hudson Thomas S., Subramanian Shyamala, Allen Rebecca I. Determination of pantotheic acid, biotin, and vitamin B12 in nutritional products. //J. Assoc. Offic. Chem. 1984. - V.67, - №5. P.994-998.

82. Филимонов B.H. Колосова И.Ф., Балятинская Л.Н., Скопцова Л.А.//Тезисы докладов: Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности. Материалы Всесоюзн. конф. Геленджик, 8 -12 октября, 1990.-М. 1990.-С. 41.

83. Филимонов В.Н., Колосова И.Ф., Балятинская Л.Н. Хроматографическое поведение водорастворимых витаминов//Ж. аналит. химии. 1991. - Т. 46, №4. - С. 758-761.

84. Arbatskii P., Afon'shin G. N., Vostokov V. М. Determination of Vitamins in Feed and Foodstuffs by High-Performance Liquid Chromatography// J. of Anal. Chemistry. 2004. - V. 59, №.12.-P. 1186-1 189.

85. Bui-Nguyen Mai-Huong, Blanc. Measurement of vitamin Bi in milk and cheese by means of high pressure liquid chromatography (HPLC)//Experimentia. 1980,-V. 36, №3.-P. 374-375.

86. Casol S., Oliveira N.B., Ferreira M.A. Development of an HPLC/diode-array detector method for simultaneous determination of trigoneline, nicotinic acid and caffeine in coffee// J. Liq. Chromatogr. and Relat Technol. 1998. - V.21, №20. -P. 3187 - 3195.

87. Wang W. Determination of the vitamin С in strawberry with using highperformance liquid chromatography // Shipin kexue= Food Sci. 1993. - №8. -P.61-63.

88. Ishiguro Kozo. The determination of thiamine and ascorbic acid contens in sweet potato by high performance liquid chromatography //Канадзава дайгаку кёику гакубу кне.Сндзэн кагаку-хэн. Bull. Fac. Eduk. Kanarawa Unit.Nat Sci. 1987. -№36.-P. 1-5.

89. Титкова Н.Ф., Ярков С.П., Помазанва B.B. Хроматографический анализ витамина В12 в кормовом препарате// 4 Всесоюзн. симпозиум по молекулярной -жидкостной хроматографии. Тезисы докладов. М. Ин-т физ-ой химии. АН СССР. 1987.

90. Староверов В.М., Дейнека В.И., Григорьев A.M. и др. Анализ водорастворимых витаминов в мультивитаминном сиропе «Олиговит» методом ВЭЖХ//Хим.-фарм. журн. 2004. - Т. 38, №3. - С.54-56.

91. Felicidad Vails, Marti'n A. Checa, Miguel A. Ferna'ndez-Muin. M. Teresa Sancho. Determination of thiamin in cooked sausages// J. Agric. Food Chem. 1999. -№47.- P.170- 173.

92. Голубицкий Г.Б. Одновременное количественное определение водо- и жирорастворимых витаминов и консервантов с использованием колонки нового типа Chromolith//3aB. лаб. Диагн. мат. 2008. - Т.74, №3. - С. 10-14.

93. Hiroshi Iwase. Ultramicrodetermination of cyancobalamin in elemental diet by soild phase extraction and high-performance liquid chromatography with visible detection//.!. Cromatogr. - 1992 - № 590. - P.359 - 363

94. Higasa S., Takamura К., Tsujimura M., Sugahara T. Quantitative determination niacin in food-stuffs by method HPLC// Bitamin=Vitamines. 2000. - V.74, №7.- P.347-355.

95. Lim Chun Ryop, Li Min Suk, Li Yong Choi. Separation of water-soluble vitamins by high-performance liquid chromatography // Пунсок-Analysis. 1989.- №1. P. 8-14.

96. Ebel S., Bender R., Schneider N., Wuthe W. Prazisionsanalytik in der IR

97. Spectroskopic über externen standard.// Fresenius Z. Anal.Chem. 1985. - V.320,i7 P.675 - 676.

98. Яшин Я.И. Физико-химические основы хроматографического разделения. -M.: Химия, 1976.-216 с.

99. Wills R.B. Shaw C.G., Day W.R. Dependence of keeping of water soluble vitamins //J. Cromatogr. Sci. 1977. - №.15. - P.262.

100. Арзамасцев А.П., Коротков M. П., Михалев А.В., Янотовский М.Ц. Использование ВЭЖХ в контроле качества аскорбиновой кислоты.// Рез-ты и перспективы научн исслед. по биотех. и фармации.: Тез. докл. Всес конф., 29 июня 1 июля. 1989. Л. 1989. - С 88 - 89.

101. Tsuge Haruhito, Toukairin-Oda Toshikatsu, Shoik Yalkako, Sakamoto Eiko, Mori Mitsuaki, Suda Hiroyuki. Fluorescence enchancement of PLP for application to HPLC//Agr. and Biol. Chem. 1988. - V.52, № 4. - P. 1083-1086.

102. Hewavitharana A.K. Method for the extraction of riboflavin for high-perfomance liqud chromatography and application to cosein. //Analyst (London). -1996. -V. 121, №11.-P. 1671 1676.

103. Esteve Mariá-José, Farré Rosaura, Frígola Ana, García Catabella José -Manuel. Simultaneous determination of thiamine and riboflavin in mushrooms by liguid chromatography.//Agric. Food Chem. - 2001. - V.49, №3. - P. 1450 -1454.

104. Fumio Watanabe, Katsuo Abe, Shigeo Takenaka, Tomoyuki Fujita, Yoshihisa Nakano Method for quantitation of total vitamin В12 in foods using a highly fluorescent vitamin B12 derivative//J. Agric. Food Chem. 1997. - №45. - P. 4661 -4663.

105. Tsuge Haruhito, Hirose Naoyuki. Determination of vitamer B6 by HPLC //BHTaMHH=Vitamins. 1989. - V. 62, № 8. - P. 349-360.

106. Jonvel P., Andermann G., Barthelemy J.F. Determination of calcium pantothenate in multivitamine preparations by high-performance liquid chromatography. //J. Chromatogr. 1983. №281. - P. 371-376.

107. Hou W., Ji H., Wang E. Liquid chromatography of vitamin Вб with electrochemical detection using a carbon fibre electrod.// Anal. chim. acta. 1990. - V.230.-№1. 207-211.

108. Ayi Benjamin K., Yuahas David A., Deangelis Nicholas J. Simutaneous defermination of vitamins B2 (riboflavin) and Вб (pyridoxine) in infant formula products by reverse phase liquid chromatography. //Offic. Anal. Chem. 1986. -V.69. - №1. - P.56-59.

109. Gregory Jesse F, Feldstein Delra. Determination of vitamin Вб in foods and materials by paired-ion high-performance liquid chromatography //J.Agr. and Food Chem. 1985. V.33, №3. -P.359-363.

110. R. A. Torres-Sequeiros., M. S. Garda-Falcon., J. Simal-Gondara. Analysis of fluorescent vitamins riboflavin and pyiridoxine in Beverages with added Vitamins//Chromatographia Suppl. 2001. - Vol. 53. - P. S236 - S239.

111. Osten David W., Kowalski Bruce R. Multivariate curve resolution in liquid chromatography. //Anal. Chem. 1984. - V.56, №6. - P.991-995.

112. Pachla Lawrence A., Kissinger PeterT. Determination of ascorbic acid in foodstuffs, pharmaceuticals, and body fluids by liquid chromatography with electrochemical detection. //Analit. Chem. 1976. - №48. - P.364 - 367.

113. Аналитическая хроматография/ Сакодынский К. И., Бражников В.В, Волков С.А. и др.- М.: Химия, 1993. 464 с.

114. Рудаков О.Б., Востров И.А., Федоров С.В. и др. Спутник хроматографиста. Методы жидкостной хроматографии. Воронеж: Изд-во «Водолей», 2004. -528 с.

115. Власова И.В., Масякова Е.Н., Богданова Л.А., Пермякова Н.Ю. Определение водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.//Зав. лаб. Диагн. матер. 2007. - Т.73, №9. - С. 25 - 27.

116. Стыскин Е.А., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 288 с.

117. Филимонов В.Н., Колосова И.Ф., Балятинская Л.Н. Разделение синтетических витаминов группы В методом ион-парной ВЭЖХ //Журн. физ. химии. 1994. - Т. 68, №10. - С. 1832 - 1835.

118. Via М.А.М., McNair Н. A simple HPLS assay for vitamin B6 in foods.// Pittsburgh Conf., Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. Chicago. 14 Febr. 27 March. 1994: Abstr.- (Chicago). 1994. P. 187.

119. Kitada Yoshimi, Sasaki Michiko, Yamazo Yutaka, Maeda Yumie, Yamamoto Masatoshi, Nakazawa, Hiroyuki. Determination of water soluble vitamins, sodium benzoate and caffeine in beverage by НРЬС//Бунсэки-кагаку. 1988. - V.37, №11.- 561-565.

120. Felicidad Vails, M. Teresa Sancho, Miguel A. ,Ferna'ndez-Muin, Marti'n A. Checa. Determination of total riboflavin in cooked sausages.// J. Agric. Food Chem. 1999. №47. - P. 1067 - 1070.

121. Bitsch Roland, Möller Jörg Analysis of Вб vitamers in foods using a modified high-performance liquid chromatographic method //J. Cromatogr. 1989. V.463. -№1. - P.207-211.

122. Michael W. Dong. Factor's affecting the ion-pair chromatography of water-soluble vitamins// Journal of Cromatography. 1988 -. №12. - P. 81 - 95 .

123. Chan Mo Cho, Joung Но Ко, Won Jo Cheong. Simultaneous determination of water-soluble vitamins excreted in human urine after eating an overdose of vitamin pills by a HPLC method coupled with a solid phase extraction.// Talanta. 2000. -№51.-P. 799-806.

124. Blanco D., Sanchez L. A., Gutierrer M.D. Determination of water soluble vitamins by liquid chromatography with ordinary and narrow bore columns.//J. Liq. Chromatogr. 1994, -V.17, №7.-P. 1525 - 1539.

125. Chase G. William, Soliman A. M. Jr. Analysis of thiamin, riboflavin, pyridoxine and niacin in multivitamin premixes and supplements by highperformance liquid chromatography //J. Lucronutr. Anal. 1990. - V7, №1. - P. 15-25.

126. Кисилев A.B., Пошкус Д.П. Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия, 1986. 272 с.

127. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии / Под ред. Г.В. Лисичкина. М.: Химия, 1988. 248 с.

128. Malinowski E.R., Howery G.D. Factor analysis in chemistry. N.-Y.: Wiley. 1980. 182p.

129. Hansch C., Fujita T. A Method for the correlation of biological activity and Chemical structure // J. Ann. Chem. Soc. 1964. - V.86., P. 1616-1626.

130. Hanch C., Leo A. Substituent constants for correlation analysis in chemistry and Biology. Wiley-Interscience: New York. 1979. 352 p.

131. Leo A., Hansch C., Elkins D. Partition coefficients and their uses. //Chem. Rev. -1971.- V. 71,No.6. P. 525-616.

132. Финкелыцтейн E.E., Курбатова С.В., Колосова Е.А. Исследование биологической активности структурных аналогов адамантана.//Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. 2002. - Т.26, №4. - С. 121-128.

133. Kim Ki Н. Thermodynamic aspects of hydrophobicity and biological QSAR// J.Comp.-aided mol. design.-2001.-V. 15. P. 367-380.

134. Pekker R. The hydrophobic fragmental constants. Amsterdam Oxford - New York, Elsevier scientific publishing company. - 1977. P. 1-22.

135. Чернышева О.С., Власенко А.С.,. Куликов А.Ю, Логинова Л.П., Атаманиченко Я.А. Распределение фенола и его производных в системе вода-1-октанол.// Вюник Харювського нацюнального ушверситету. 2005. - Х1м1я. -Вип.13, №6. С. 139 - 144

136. Taft R.W., Abraham М.Н., Famini G.M., Doherty R., Abboud J.-L. M., Kamlet

137. M.J. Solubility properties in polymers and Biological media 5: An analysis of the physicochemical properties wich octanol Water partition coefficients of aliphatic and aromatic solutes// J. of Pharmaceutical Sciences. - 1985. - V.74, №8. - P. 807 -814.

138. Cambridge Soft Chemical Dawing, Chemical Databases, Enterpriese Solutions, Desktop Software, Consulting Services: Chttp://www.cambridizesoft.com )

139. Virtual Computational Chemistry Laboratory, ALOGPS 2.1 (http://www.vcclab.org)

140. Шатц В. Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатие, 1988. -390 с.

141. Wells M.J.M., Clark С. Investigation of N-alkylbenzamides by reversed-phase liquid chromatography.l. Isocratic elution characteristics of Ci C5 N-alkylbenzamides // J.Chromatogr. - 1982. - V. 235, № 1. - P. 31-41.

142. Пульцин M.H., Гайле A.A., Проскуряков В.А. Зависимость селективности от структуры растворителей и разделяемых компонентов. XVI. Селективность производных фурана и тетрагидрофурана // Журн. физ.химии. 1974. - Т. 48, № 8. - С. 2045-2047.

143. Салов В.В., Петрухин О.М. Влияние элюирующей силы растворителей на подвижность соединений в условиях жидкостной адсорбционной хроматографии //Журн. аналит. химии. 1988. - Т. 51, № 8. - С. 1391-1396.

144. Snyder L.R. Principles of adsorption chromatography, New York, NY, USA: M. Dekker, Inc., 1968.-413 p.

145. Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии (планарная хроматография). Пер с англ./ под ред. В.Г.Березкина. М. 1999. - Т. 2 . -348с.

146. Snyder L.R., Kirland J.J. Introduction to modern liquid chromatography. Wiley-Interscience. New York. 2nd 1979. 168p.

147. Kaiser R.E., Rieder R.I., Miller A., Pilgram B. Proceedings Instrumental High Chromatography. Interlaken. 1982. Inst for Chromatography, Bad Dürkheim. 1982.

148. Horvath C., Melander W., Molnar I. Solvophobic interactions in Liquid chromatography with nonpolar stationary phases // J. Chromatogr. 1976. - V. 125.-P. 129-135.

149. Сычев C.H., Аксенова H.C., Криволапов С.С. Адсорбционное модифицирование в жидкостной хроматографии на силикагеле // Журн. физ. химии. 1985. - Т. 59, № 8. - С. 1996-1999.

150. Левин М.Г., Гризодуб А.И., Асмолова H.H., Григорьева В.Д., Георгиевский В.П. Механизм удерживания в обращенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии с многокомпонентными подвижными фазами // Журн. аналит. химии. 1993. - Т. 48, № 11. - С. 81-93.

151. Snyder L.R., Poppe Н. Mechanism of solute retention in liguid-solid chromatography and the role of the mobile phase in affecting separation. Competition versus "sorption" // J. Chromatogr. 1980. V. 184, № 4. - P. 363413.

152. Dolan J.W., Gant J.R., Snyder L.R. Gradient elution in high-performance liquid chromatography. 2. Practical application to reversed-phase systems // J. Chromatogr.- 1979.- V. 165, № 1,- P. 31-58.

153. Шатц В. Д. Выбор условий элюирования в обращенно-фазовой хроматографии. Общая зависимость удерживания от концентрации органического модификатора подвижной фазы. // Журн. физ. химии. 1986. -Т. 60, № 1.-С. 1-8.

154. Ланин С.Н., Никитин Ю.С. Прогнозирование удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Межмолекулярные взаимодействия в подвижной фазе // Журн. аналит.химии. 1991. - Т. 46, № 10. - С. 1971-1980.

155. Ланин С.Н. Никитин Ю.С. Прогнозирование удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Вытеснительная модель // Журн. аналит. химии. 1994. - Т. 46, № 8. - С. 1493-1502.

156. Ланин С.Н., Ланина Н.А., Никитин Ю.С. Влияние ассоциации молекул сорбата и модификатора в подвижной фазе на удерживание в высокоэффективной жидкостной хроматографии. // Журн. физ. химии. -1995.- Т. 69, №11.- С. 2045-2051.

157. Ланин С.Н. Физико-химические закономерности адсорбции ароматических соединений и их проявление в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Автореферат докторской диссертации. М., МГУ, 1998. 50 с.

158. Horvath С., Melander W., Molnar I. , Molnar P. Liquid chromatography ionogenic substances with nonpolar stationary phases //Anal. Chem. 1977. -V.49, №1. - P.142-154.

159. High-Performance Liquid Chromatography/Ed. Horvath C.N.Y.: Academic Press. 1983. V.2

160. Horvath C., Melander W.R. Ion-pair chromatography theory and biological pharmaceutical application/ Ed. Heart M.Y.W.N.Y.: Marcel Dekker, 1985. P. 27.

161. Bidlingmeyer B.A.// J. Chromatogr. Science. 1980. V. 18, № 10. - P. 525.

162. Pucciarelli E., Passamontil P., Cecehi T.//J. Liq. Chromatogr. and Relat Technol. 1997. V.20, № 14. - P. 2233 -2240.

163. Басова Е.М., Болынова Т.А., Иванов В.М. Модели и закономерности удерживания сорбатов в ион-парной хроматографии.// Журн. аналит. химии. -1996. Т. 51, № 7. - С. 694-704.

164. Kim Y.S., Liu J., Han X.J., Pervin A., Linhardt R.J. Analysis of fluorescently labeled sugars by reversed-phase ion-pairing high-performance liquid chromatography// J. Chromatogr. Sci. 1995. - V.33, №4. - P. 162 - 167.

165. Tost W., Spatz R., Jietz R., Eisenbeiss F. The ion-pairing HPLC. //Lab.Prax. -1984.- V.8, №11.-P. 1184-11188.

166. West L., Tsui I., Haas G. Single column approach for the liquid chromatographic separation of polar and non-polar glucosinolates from broccoli sprouts and seeds //J. Chromatogr. A. 2002. - V. 966, № 1-2. - C. 227-232

167. Bidlingmeyer B.A. Ratention mechanism for reversed-phase liquid chromatography// J. Chromatogr. 1979. - V. 186. - P. 419 - 434.

168. Барышева С.В. Ион-парная хроматография кислых и основных производных бензола в растворах ПАВ и сильных электролитов. Дисс.канд. хим наук. Саратов. 2003. 197 с.

169. Horvath С., Melander W.R. Liquid chromatography with hydrocarbonceous bonded phases, theory and practice of reversed-phase chromatography// J. Chromatogr. Science. 1977. V. 15, № 9. - P. 393 - 404.

170. Zou H., Zhang Y., Hong M., Lui P. Effect of carbon content bonded on silica surface on retention values in reversed phase liquid chromatography and ion-pair liquid chromatography // J. Liquid Chromatogr. - 1993. V. 16, № 9. - P. 3445 -3455.

171. Басова E.M., Болынова Т.А., Иванов В.М. Модели и закономерности удерживания сорбатов в ион-парной хроматографии.// Журн. аналит. химии. -1996. Т. 51, № 7. - С. 694-704.

172. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии. М.: Мир, 1991.- 763 с.

173. Химический энциклопедический словарь. Под ред. И.Л. Кнунянца. М.: Сов. Энциклопедия, 1982. 792 с.

174. Sadek P. The HLPC solvent guide. New York: John Wiley&Sons, NY. 1996. -346 p.

175. Jandera P., Colin H., Gulochon G. Optimization of separation conditions in reversed phase liguid chromatography using complex solvent mixtures // Chromatogr. Sci. 1982. - V. 16. - P. 132-137.

176. Stewart J.J.P. Optimization of parameters semiempirical methods. I. Method//J. Comput. Chem. 1989. -V. 10, №2. - P. 209 - 220.

177. Stewart J.J.P. Optimization of parameters semiempirical methods. II. Applications//J. Comput. Chem. 1989. - V. 10, №2. - P. 221 - 264.

178. Будыка М.Ф., Зюбина T.C. Диссоциация ароматических азидов в основном и низших возбужденных состояниях с отрывом молекулярного азота// Журн. физ.химии. 1998,-Т.72,№ 8. - С.1420 - 1426.

179. Новоселов Н.П., Бандура А.В. Третьяк В.М. и др. Компьютерное моделирование взаимодействия целлобиозы с органическими растворителями// Журн. физ. химии. 1998. - Т.72, № 7. - С.1207 - 1212.

180. Глинка H.J1. Общая химия. / Под ред. А.И. Ермакова. М.: Интеграл-Пресс, 2000. - 728 с.

181. Григорьева А.Б., Курбатова С.В., Земцова М.Н. и др. Жидкостная хроматография некоторых производных цинхониновых кислот// Журн. физ.химии. 2001. - Т.75, №11.- С.2048 - 2052.

182. Schronk I., Grisby R.D., Hanks A.R. Reversed phase HPLC retention behavior of coal-related nitrogen heterocyclic compounds// J.Chromatogr. Sci. 1981. -V.19. - P. 490 - 495.

183. Шаповалова E.H., Офицерова M.H., Савостьянова E.B. и др. Ион-парная хроматография комплексов металлов с унитиолом в присутствии четвертичных фосфониевых солей.//Журн. аналит. химии. 2001. - Т.56, №2. - С. 181 - 187.

184. Warth L.M., Copper R.S., Fritz J.S.// J. Chromatogr. 1989. - V. 479, № 2. -P. 401 -404.

185. Ion-Pair Chromatography. N.Y.: Marcell Dekker Inc., 1985 P. 53

186. Рухадзе М.Д., Безарашвили Г.С., Сидамонидзе Ш.И., Махарадзе Т.Г., Кокиашвили Н.Г. Оптимизация хроматографического разделения смеси133витаминов группы В симплеск-методом // Журн. физ. химии. 1999. - Т. 73, № 12. - С. 2237-2239.

187. Деффаль К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1994. 268с.

188. Безарашвили Г.С. Планирование эксперимента.Тбилиси: ТГУ, 1989.- 107с.

189. Булатицкий К.К. Особенности метрологических характеристик методик количественного анализа как методик выполнения косвенных измерений // Зав. лаб. 2001. - Т. 67, № 6. - С. 59-61.

190. Коренман И.М. Экстракция в анализе органических веществ. М.: Химия, 1977. -200с.