Разделение и определение витаминов групп A, E, K и D методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

' ДЕНИСОВА ЛЮБОВЬ ВАСИЛЬЕВНА

РАЗДЕЛЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИТАМИНОВ ГРУПП А, Е, К И в МЕТОДОМ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

(02 00 02 - аналитическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ

г

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических паук

Москва - 2004

Работа выполнена на кафедре "Неорганическая химия" Белгородского государственного университета им В Г Шухова и на кафедре "Аналитическая химия" Новомосковского института Российского химико-техноло! ического университета (НИ РХТУ) им Д И Менделеева

Научный руководитель:

Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат химических наук, д

В Н ФИЛИМОНОВ

доктор химических наук, профессор

Л Н БАЛЯТИНСКАЯ

Доктор химических наук, профессор

В М ИВАНОВ

доктор химических наук, профессор Е И ФИНКЕЛЬШТЕЙН Воронежский государственный университет, химический факультет

,О О часов

Защита состоится " ' 2004 г в /О1

на заседании диссертационного совета Д 212 204 07 в РХТУ им Д И Менделеева

по адресу 125190, г Москва, Миусская пл., д. 9 в 3 ? .__

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им ДИ Менделеева

Автореферат диссертации разослан " ¿¿^ А^глл*0-2004 г

Ученый секретарь диссертационного совета Д 212 204 07

к х н., доцент -Л Н Белова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди физиологически активных природных органических соединений - алкалоидов, гормонов, антибиотиков и других витамины занимают особое место Витамины находят широкое применение как пищевые добавки антиокислительного действия, используемые в здравоохранении и животноводстве Поэтому контроль содержания витаминов и уровня их сохранности очень важен для оценки пригодности фармацевтических готовых форм, препаратов для животноводства и пищевых продуктов

Эффективным методом, позволяющим обеспечить определение витаминов в многокомпонентных объектах, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - универсальный аналитический метод разделения и анализа сложных смесей Метод ВЭЖХ незаменим при анализе термически и химически лабильных жирорастворимых витаминов (ЖРВ) групп А, Р, Е и К, но требует подбора оптимальных условий разделения компонентов хромато-графируемого образца Нормально-фазовый (НФ) вариант разделения синтетических жирорастворимых витаминов не обеспечивает возможности эффективного разделения сложных смесей, с полным набором жирорастворимых витаминов (А, О, Е и КО в образцах с водосодержащей матрицей, так как даже небольшие количества воды могут негативно влиять на воспроизводимость результатов Такие препараты для НФ ВЭЖХ должны быть предварительно переведены методами щелочного гидролиза в форму, удобную для последующего хроматографирования При проведении подобных операций изменяется состав биологически активной формы - эфи-ров Поэтому определяется только содержание продуктов гидролиза

Основным методом анализа ЖРВ без изменения их состава и с сокращением времени пробоподготовки является обращенно-фазовая ВЭЖХ

Цель исследования. Изучение закономерностей удерживания жирорастворимых витаминов А (ацетач, пальмитат), О;, Ил, Е-ацетапа, К>, а также р-каротина и Е-токоферола в условиях ОФ ВЭЖХ, оптимизация условий разделения их и разработка аналитических методик количественного определения содержания витаминов в готовой продукции

Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2000-2004 г, утвержденным Президиумом Совета 21 08 2000 г, проблема "Применение хроматографических процессов для выделения и очистки биологически активных соединений", тема "Высокоэффективная жидкостная и высокоэффективная ионная хроматография биологически активных веществ", код 2 15 114 Х70

Научная новизна. Для достижения поставленной цели решены следующие задачи - рассчитаны характеристики полярности (Н)

БИБЛИОТЕКА I

¡пяля I

- изучен характер изменения параметров удерживания витаминов на кремнеземах, химически модифицированных полярными (КНавоЛ-МНг, БПаздгЬ-СМ, ЗНавогЬ-Ого!) и неполярными (БПазогЬ-Сг+Сщ) функциональными группами,

- исследовано хроматографическое поведение витаминов при элюировании бинарными и трехкомпонентными волосодержащими подвижными фазами на основе изопропано-ла, и -пропанола, ацетонитрила и 1,4-диоксана,

- показана применимость универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли преобладающих межмолекулярных взаимодействий в хроматографиче-ской системе,

- предложена процедура оптимизации состава трехкомпонентного элюента с использованием симплекс-решетчатых планов Шеффе (3,3}, которая включает проведение активного эксперимента и программу обработки полученных данных, разработанную в среде "МаЙюаЛ 2001", установлен оптимальный состав трехкомпонентного элюента для анализа многокомпонентных смесей витаминов,

- разработана рациональная схема выбора хроматографических систем для разделения и анализа смесей витаминов (до 6 компонентов) в различных сочетаниях,

- разработан комплекс методик определения жирорастворимых витаминов в готовых формах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии

Практическая значимость работы состоит в следующем

- установлены закономерности удерживания витаминов от природы сорбентов и состава водно-органических подвижных фаз;

- показана возможность эффективного разделения смеси А-ацетат, А-пальмитат, (3-каротин, Ог (О]), Е-ацетат (Е-токоферол) методом ОФ ВЭЖХ при изократическом элюировании подвижной фазой состава и.-пропанол ацетонитрил вода (59,76 5,66 34,58) на силикагеле с химически привитыми алкильными группами (-Сщ)

- разработаны методики количественного определения ЖРВ методом ОФ ВЭЖХ с сокращением времени пробоподготовки без отделения матрицы в готовых водорастворимых формах медицинской промышленности ("Водный раствор витамина ОЛ "Сан-тевит", "Мультивитамин", "Веторон-Е"), фармацевтических препаратах ("Углекислот-ный экстракт пихты сибирской", "Натуральный биоэкстракт облепихи и пихты сибирской"), препаратах для ветеринарии ("Тривит", "Нитамин") Методики внедрены на предприятиях Белгородского промышленного региона

' )<!-'.'>!1Ь •

1 1»}' т '

Закономерности хроматографического поведения, характеристики удерживания и приемы оптимизации разделения смесей ЖРВ могут быть включены в хроматографические базы данных

Положения, представляемые к защите:

• закономерности удерживания синтетических жирорастворимых витаминов (А-ацетат, К.1, 02, Е-ацетат) в условиях изократической ОФ ВЭЖХ,

• оценка роли сорбента и выбор его для разделения смеси жирорастворимых витаминов;

• выводы о возможности описания удерживания жирорастворимых витаминов с позиций теории универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ,

• процедура оптимизации состава трехкомпонентной подвижной фазы для разделения смеси витаминов,

• методики хроматографического определения витаминов в готовых формах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии

Апробация работы. Основные материалы работы были представлены на II Международном симпозиуме "Хроматография и спектроскопия в анализе объектов окружающей среды и токсикологии" (Санкт-Петербург, 1996), Международных симпозиумах по хроматографии (15С-96, Германия, Штутгарт, 18С-98, Италия, Рим), 10-м Международном симпозиуме "Успехи и применение хроматографии в промышленности" (Чехия, Братислава, 1996), Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997), 28 Международном Симпозиуме по аналитической химии окружающей среды (18ЕАС, Швейцария, Женева, 1998), XVI Менделеевском съезде по обшей и прикладной химии (Москва, 1998), 23 Международном Симпозиуме по разделениям в ВЭЖХ (НР1Х'99. Испания, Гранада, 1999), на VI конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока-2000" (Новосибирск, 2000), научно-технической конференции по хроматографии "Иониты" (Воронеж, 2003), Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003)

Публикации. Основное содержание диссертационной работы изложено в 12 статьях и тезисах 28 докладов Наиболее значимые публикации представлены в списке опубликованных работ

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех разделов экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы и пяти приложений Приложения включают детали расчета полярности и индекса связы-ваемости ЖРВ, характеристики пиков витаминов на исследуемых сорбентах, преобразование основного уравнения универсальной квазихимической модели удерживания в полиномный вид; программа оптимизации состава трехкомпонентного элюента, акты внедрения аналитических

методик определения ЖРВ в препаратах фармацевтической промышленности Работа изложена на 154 страницах, содержит 27 рисунков и 26 таблиц Слисок литературы включает 156 наименований, из них 68 в международных изданиях

В литературном обзоре рассмотрены структуры и свойства жирорастворимых витаминов, сравнены основные методы аналитического определения витаминов (химические и биологические, спектральные, электрохимические и хроматографические) Приведены основные факторы разделения в обращенно-фазовой ВЭЖХ характеристик» полярности сорбентов, классификация элюенгов rio элюирующен силе и физико-химическим параметрам, влияние свойств хроматографической системы на эффективность и селективность разделения смесей. Рассмотрены механизмы удерживания жирорастворимых витаминов на сорбентах различной природы с использованием моделей Снайдера, Мураками, Хорвата, универсальной квазихимической вы-теснительной модели Охарактеризованы различные методы планирования и оптимизации условий эксперимента.

В экспериментальной части приведены физико-химические характеристики растворителей, сорбентов и объектов исследования а-ретинилацегат (A-ацетат), эргокальциферол (D2), а-токоферилацетат (E-ацетат), менадмон (К,), p-каротин (провитамин А), холекальциферол (Di), peí инилпальмитат (витамин А-пальмитат) и о-токоферол (Е)

Разделения выполнены на жидкостном хроматографе "Цвет-304" со спектрофотометриче-ским детектором (Я=254 нм) в изократическом режиме элюирования на спальных колонках размером 100'5,4 мм Элюентами были водосояержащие двух и трехкомпонентные смеси растворителей

Количественное описание зависимостей удерживания ЖРВ от содержания органического компонента в подвижной фазе проведено по уравнению универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ, учитывающей межмолекулярные взаимодействия (образование ассоцнатов и комплексов) компонентов хроматографической системы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Закономерности разделения жирорастворимых витаминов при элюировании бинарными водно-органическими ълюентами

где вщ, Ь, Мт - мольные доли сорбата (в), наименее (Ь) и наиболее (М) сорбционно-активного компонента подвижной фазы (ш), Кь, Км, Кми, Кмм - константы равновесий квазихимических реакций сорбции и ассоциации сорбата и органического модификатора; Ф - фазовое отношение хроматографической колонки

Упрощение полиномного уравнения (1) позволило сократить время на математическую обработку экспериментальных данных, определить преобладающие типы взаимодействий в системе и описывающее их уравнение'

• в системе преобладают взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент

—^Л!—И-ИЛ = а„+а.Мш. (2)

к' ФК, ' " 1 '

• к указанным в (2) прибавляются взаимодействия сорбат-модификатор'

- = А—™——-Я1 = а„ + а.М + аМ-, (3)

ФК, .. I . 2 .. "

• указанные в (2) процессы дополнены взаимодействием модификатор-модификатор.

к' ФК, ■

Удерживание витаминов при элюировании водно-изопропанольной смесью с сильнополярного сорбента БНаюгЬ-КНг описывается полиномом второй степени (3) При этом факторы емкости всех сорбатов, независимо опт содержания органического компонента в подвижной фазе, близки между собой (соответственно Я\ для всех пар стремится к нулю) Удерживание соль-ватированных органическим растворителем молекул ЖРВ осуществляется на сорбционно-модифицированной молекулами изопроланола поверхности сорбента, вероятно, за счет дисперсионного и диполь-дипольного межмолекулярных взаимодействий

На нитрильной фазе взаимодействие витаминов с поверхностью сорбента осуществляется за счет диполь-дипольных и дисперсионных, а с элюентом за счет образования направленных водородных связей, диполь-дипольных и дисперсионных взаимодействий, т е взаимодействие витамин-изопропанол в объеме подвижной фазы велико Удерживание витаминов адекватно описывается полиномом второй степени, учитывающим взаимодействия сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, модификатор-сорбат (4)

На диольной неподвижной фазе удерживание витаминов описывается полиномом второй степени, аналогичным применяемому в случае аминной фазы (3) Поскольку элюент содержит органический растворитель, способный к образованию направленных водородных связей с поверхностью БНавогЬ-Ою!, можно предполагать, что после его адсорбции поверхность становит-

ся достаточно гидрофобной и удерживание молекул ЖРВ осуществляется в основном за счет дисперсионных взаимодействий

Применение полярных сорбентов и водно-изопропанольного элюента не привело к эффективному разделению смеси витаминов Кз, А-ацетат, Е-ацетат и D2 Селективного разделения смеси ЖРВ в ОФ ВЭЖХ следует ожидать при использовании сорбентов, обусловливающих сорбцию витаминов за счет гидрофобных групп их молекул Такими сорбентами являются ал-килпривитые силикагели Silasorb С2-Сщ Максимальная селективность неподвижной фазы отмечена для алкилпривитых кремнеземов с >к не менее 18' Silasorb-Сц

При увеличении элюирующей силы органических модификаторов (ацетонитрип<1,4-диоксан<изопропанол) относительное удерживание молекул витаминов уменьшается, вероятно, за счет усиления взаимодействия полярного фрагмента молекулы с элюентом При элюирова-нии ЖРВ смесями воды с ацетонитрилом, обладающим наименьшей элюирующей силой (S=3,l) и значительной склонностью к диполь-дипольиым взаимодействиям, наблюдается увеличение удерживания и размывание профилей хроматографических пиков

В хроматографической системе с элюеитами на основе диоксана (S=3,5) преобладают диполь-дипольные и протоноакцепторные межмолекулярные взаимодействия Вклад гидрофобных (неспецифических) сил, обуславливающих селективное разделение сорбатов на алкил-силикагеле, уменьшается Поэтому происходит уменьшение разрешающей способности Rs хроматографической системы при одновременном снижении к' до оптимальных значений Однако пик витамина Е-ацетат остается несимметричным Улучшение формы пиков происходит при усилении роли взаимодействий "сорбат-модификатор" элюентов на основе пропанола S=4,2, добавляющего к ранее отмеченным протоно-донорные взаимодействия Элюирование сорбатов с колонки, заполненной Silasorb-Ci», водно-изопропанольными смесями характеризуется снижением величин к' и А 9 для всех витаминов до оптимальных значений, при одновременном ухудшении разрешения Замена изоспирта на «-пропанол приводит к незначительным изменениям к' и As (в оптимальном диапазоне) при более высоких значениях Iis для пар КУА, A/D2

Применение водно-ацетонитрильных элюентов позволяет увеличить разрешающую способность системы с сорбентом Silasorb-Cm, водно-спиртовых - улучшить значение факторов емкости и форму пиков Рациональная схема выбора условий ВЭЖХ для разделения смесей ЖРВ в различных комбинациях представлена на рис 1

Поэтому эффективного разделения смеси витаминов (А-ацетат, Е-ацетат, Ki, D2) на Si-lasorb-Cie следует ожидать при изократическом элюировании подвижной фазой, обеспечивающей доминированне в хроматографической системе диполь-дипольных сил, при одновремен-

¥

Рис 1 Рациональная схема выбора условий ВЭЖХ для разделения смеси жирорастворимых витаминов

ном участии протоно-донорно-акцепторных взаимодействий это возможно при использовании трехкомпонентных элюентов состава вода-и.-пропанол-ацетонитрил

Многопараметрическая оптимизация состава трехкомпонентной подвижной фазы

Процедура многопараметрической оптимизации состава трехкомпонентных подвижных фаз проводилась в рамках кибернетического подхода по программе, составленной в среде математического пакета "МаЛса<12001"

С целью обеспечения максимально возможной эффективности разделения смеси сорба-тов использован следующий алгоритм огггимизации состава элюента

• построение концентрационного треугольника "состав-свойство" (рис 2) для определения оптимального состава трехкомпонентного элюента по характеристикам разделения бинарными элюентами Ограниченная область факторного пространства представляет собой параллелограмм (КЬММ) с вершинами, соответствующими составам трехкомпо-нентных подвижных фа! и -пропанол-ацетонитрил-вода (*, дг, г,, об %) К (50 30 20), Ь (50 15 35), М (60.5 35), N (60.20 20),

• разделение четырехсторонней области существования трехкомпонентной подвижной фазы оптимального состава на два треугольных симплекса А1 (59,30 19,50 21,20) и А2 (59,76.5,66 34,58), отвечающих условиям Лу, > 1 0, 0 5 < к, < 20, 0 7 < Л»,. < 1 ^,

• математическое планирование эксперимента в локальных треугольниках диаграмм "состав-свойство" по симплекс-решетчатым планам Шеффе ¡3,3),

• определение коэффициентов уравнений регрессий, связывающих критерии эффективности Яв, к' и Ав с составом элюента (гь 7.2, гт) Кчп. Г-А^^.гД,, |, к^г^г^,

• совместное решение системы неравенств Кчи-!- й^^л),,,.!?!, 0,5 < к'=1Т2|,г2,г-()т<20,0, 0,7< Аапг^гьгз.г^щ <1,5 с целью поиска оптимального состава элюента,

• экспериментальная оценка качества математического прогнозирования эффективности разделения смеси путем сравнения расчетных и экспериментальных величин Результаты расчетов характеристик хроматограмм в обеих оптимальных областях были

проверены экспериментально (табл 1) В локальном оптимуме (Д I) характеристики разрешения пиков близки к оптимальным, но не достигают их, найденный из глобального оптимума (Д 2) состав элюента отвечает условиям селективного разделения хроматографических пиков

100

so

Рис 2 Общий вид главного концентрационного треугольника "свойство-состав" (область представлена без соблюдения масштаба для сохранения наглядности изображения)

70

100

Таблица 1

Сравнение рассчитанных и экспериментальных характеристик разделения витаминов элюентом состава н.-пропанол-ацетонитрил-вода

Витамин AKLM (А1, локальный оптимум)

расчетные данные экспериментальные данные

к'+8 As±6 Ri+6 к'±5 As±S R,sl8

К, 0,63+0,03 1,28+0,05 0,81+0,05 0,8910,05 0,7910,05 0,6510,03 1,27К»,08 0,82Ю,04 0,8810,05 0,7710,05

А-ацетат 1,91 ±0,07 1,1510.03 1,9410,12 1,1510,07

Dj 4,09±0,12 1,6210,04 4,0610,31 1,63+0,10

Е-ацетат 7,04+0,02 2,1010,08 7,02Ю,55 2 08+0,15

AMNK (Д2, глобальный оптимум)

к, 0,8410,03 1,1310,04 1,4910,09 1,03+0,04 1,7810,12 0,8310,034 1,1210,05 1,5010,07 1,05+0,05 1,7610,11

А-ацетат 3,64 Щ15 1,24+0,05 3,65+0,140 1,2010,06

D2 6,26Ю,22 1,35±0,07 6,2810,249 1,34±0,07

Е-ацетат 13,1110,29 1,1410,05 13,1410,536 1.15Ю.05

Элюент состава и -пропанол-ацетонитрил-вода (59,76 5,66 34,58) обеспечивает оптимальное разделение четырехкомпонентной модельной смеси витаминов А-ацетат, Е-ацетат, Ki hD2

В состав многих препаратов дополнительно входят Р-каротин (провитамин А), А-пальмитат, D3, Е ( токоферол) и водорастворимые витамины (Bi, Bj, В„, Bi2 и С) Применение оптимальной хроматографической системы (Д2) обеспечило возможность анализа более сложных смесей (табл. 2 и рис 3).

Таблица 2

Характеристики хроматографического разделения ЖРВ на вНавогЬ-Ст при элюировании трехкомпонентной подвижной фазой и -пропанол-ацетонитрил-вода (59,76 5,66 34,58, % об)

Определяемый витамин к'±5 А$±5 Яч±б

Пз 7,86+0,28 1,3310,06 1,36+0,07 7,56+0,43 31,54±2,04

Е (токоферол) 11,86+0,52 1,21 ±0,05

А-пальмитат 38,43+2,15 1,35±0,08

(З-каротин 73,57±4,38 1,14+0,04

А-авдтат

Е-ацстат

А-пальмитат

[^-каротин

и и

и

12

20

30

40

50 Ь мин

Рис 3 Хроматограмма разделения модельной смеси жирорастворимых витаминов

Содержание, мг/мл Кч 0,24, А-ацетат 0,5, 02 0,5, ^ 0,5, Е-токоферол 8,3, Е-ацетат 6,0;

А-пальмитат 3,6, (3-каротин 1,5

Предлагаемая процедура оптимизации состава трехкомпонентных подвижных фаз позволяет-

- осуществить многопараметрическую оптимизацию эффективности хроматографического разделения смеси сорбатов в трехфакторном пространстве и сформировать представление о поверхностях откликов с их одновременной графической интерпретацией;

- сократить необходимое число экспериментов для построения формально-математической модели хроматографического поведения сорбатов и существенно упростить математическую обработку экспериментальных данных,

- выявить глобальный оптимум с погрешностью по параметрам оптимизации в среднем 3-5 % (максимум до 10 %),

- провести оптимизацию в полуавтоматическом режиме при наличии соответствующего программного обеспечения и аппаратурного оформления.

Определение предела обнаружения и параметров уравнений регрессии Величины предела обнаружения (ПрО) рассчитывали по высоте пика, трехкратно превышающей уровень шумов (38-критерий, средняя высота шумов нулевой линии 2,5 мм), для А-ацетата - 0,1, А-пальмитата - 0,1, |3-каротина - 0,01, Кз - 0,08, Е-ацетата - 2,0, Е (<х-токоферола) - 2,0, Ог- 0,01, Э.,- 0,01 (мкг в пробе)

Характеристики уравнений регрессии приведены в табл. 3

Таблица 3

Характеристики градуировочных зависимостей для определения ЖРВ уравнения 5=ах+Ь

мшх Интервал определяемых содержаний, мг/мл а Ь

1 2 3 4 5

А-ацетат

у 200 1,0-8,0 29,21 -4,28 0,9989

х100 0,5-2,5 73,59 1,00 0,9998

х20 0,1 -0,5 376,01 -1,79 0,9999

хЮ 0,05 - 0,25 736,02 0,60 0,9995

х4 0,01 -0,06 3751,43 -1,13 0,9999

А-пальмитат

х100 5.00-10,00 20,28 -12,49 0,9999

х20 1,00- 6.50 99,23 38,11 0,9999

х10 0,20 - 1.50 251,62 1,59 0,9998

х4 0,05 - 0,25 514,35 25,51 0,9999

Эргокал! •циферол

х100 3,00 - 15,00 20,20 20,36 0,9998

х20 0,50-4,00 119,38 48,97 0,9999

х10 0,07-0,5 489,92 0,211 0,9997

х4 0,01 -0,08 1207,93 1,07 0,9998

Холекальциферол

х100 3,00 - 15,00 20,33 20,05 0,9999

х20 0,50 - 4,00 121,79 35,04 0.9998

х10 0,07-0,5 487,95 0,573 0,9991

х4 0 01-0,08 1250,00 1,39 0,9909

3-каротин

х20 0,2-1,5 154,79 0,11 0,9971

х4 0,04-0,3 707,39 -1,08 0,9998

Е-ацетат

х200 25,0 - 60.0 2,52 -29,21 0,9998

хЮО 15,0-35,0 4,60 -36,55 0,9998

х20 4,0-16,0 9,19 36,65 0,9996

хЮ 1,0-6,0 35,75 -2,20 0,9994

Продолжение табл 3

1 2 3 4 5

х4 0.2-1,2 244,0 -1,333 0,9999

Е

х200 25,0-60,0 2,38 -27,47 0,9999

х100 15,0-35,0 4,21 -35,47 0,9997

х20 4,0-16,0 9,03 34,62 0,9997

х10 1,0-6,0 36,65 -2,14 0,9994

х4 0,2-1,2 241,29 -1,39 0,9999

к,

х20 1,0-10,0 76,44 -4,96 0,9999

чЮ 0,09-1,08 396,72 11,01 0,9998

х4 0,008 - 0,096 1053,66 -3,13 0,9999

Определение витаминов в фармацевтических и ветеринарных препаратах с водорастворимой матрицей

При контроле содержания ЖРВ в фармацевтических и ветеринарных препаратах с водорастворимой матрицей нет необходимости отделения наполнителей, и возможно непосредственное хроматографирование растворов препаратов

Предварительная обработка образцов состояла в их разбавлении дистиллированной водой (для водных растворов), растворении кристаллических или усредненных таблегированных форм в и -пропаноле или воде, экстракты анализировали без обработки

Идентификацию пиков проводили по временам удерживания стандартных растворов витаминов, содержание ЖРВ по градуировочным зависимостям Продолжительность анализа для четырехкомпонентных объектов, не содержащих (3-каротин - не более 30 мин, более сложного состава - 60 мин

Присутствие в препаратах ("Вегорон-Е", "Сантевит" и "Мультивитамин") водорастворимых витаминов (ВРВ) (Вь В2, В6, В,2 и С) и наполнителей не мешало определению смеси ЖРВ, т к время удерживания ВРВ составляет от 2,1 до 2,5 мин

Двойное хроматографирование выполняли при анализе препарата "Тривит" При первом вводе пробы фиксировали пики витаминов Е-ацетат и 01, хроматографирование разбавленного раствора (1 50) позволяет определить витамин А-ацетат

В препаратах "Нитамин" и "Мультивитамин" не указано, в какой форме присутствуют витамины А и Е Идентификацию пиков проводили по временам удерживания стандартных растворов ретиниацетата (ретинилпальмитата) и а-токоферола (а-токоферилацетата) Сравнение параметров удерживания показало, что витамины в препарате "Нитамин" и таблетирован-

ных формах для витаминизированного напитка "Мультивитамин" находятся в ацетатной форме (А-ацетат и Е-аиетат)

Для образцов экстрактов пихты содержание витаминов не заявлено Идентификацию витаминных форм проводили по временам удерживания, правильность методики проверяли введением стандартных добавок ЖРВ, с нахождением содержания стандарта и исходного содер-^ жания ЖРВ по градуировочным зависимостям В препарате "Углекислотный экстракт пихты

сибирской" найдены витамины А-ацетат, Е-ацетат и О;, в препарате "Натуральный биоэкстракт I облепихи и пихты сибирской" - А-ацетат, Е-ацетат, (5-каротин и 1)2. Метрологические характе-

£ ристики методик в сравнении со стандартными спектрофотометрическими методами (СФ)

представлены в табл. 4

Таблица 4

Метрологические характеристики методик определения ЖРВ в готовых формах (п=5, Р=0,95)

V

№ п/п Препарат, фирма-изготовитель Витамины, регламентировано, мг/мл Найдено, Г ±6, мг/мл, методами &

СФ ВЭЖХ

1 2 3 4 5 6

1 Водный раствор витамина Рз, (Тегро1, АО Серадэ, Польша) Из, 0,374 0,37 ±0,02 0,374 ± 0,025 0,053

2 "Веторон Е", (г. Москва, НПП АКВА-МДТ, Россия) Р-карогин, 20,02 19,1 ±0,3 20,1 ±0,4 0,017

Е-ацетат, 40,4) 40,1 ±1,1 39,6 ±1,1 0,023

3 "Нитамин", (г Саратов, ЗАО "Ни-та-ФАРМ", Россия) А-ацегат, 14,86 14,6 ±0,4 14,9+0,5 0,027

СЬ, 0,124 0,12±0,01 0,12±0,01 0,056

Е-ацетат. 49,98 46,8 ± 1,2 49,9+1,5 0,024

4 "Сантевит",(000 "Сантафарм", г Копейск, Россия) А-ацетат 0,48 0,47+0,03 0,49±0,04 0,063

Е-ацетат, 4,49 4,5 + 0,2 4,8±0,3 0,047

Р-карогин, 0,12 0,12±0,01 0,11+0,01 0,071

5. "Мультивитамин", (ПЕЦ Хунга-рия, Яношморя, Венгрия) Е-ацетат, 9,98 9,8 ±0,3 9,9+0,4 0,032

6 "Тривит", (г Белгород, ЗАО "Ве-рофарм", Россия) А-ацетат, 21,6 21,6 + 0,6 20,6 + 0,7 0,026

ЕЬ, 0,25 0,23 ± 0,01 0,24 ±0,02 0,058

Е-ацетат, 70,0 68,0± 1,1 69,6± 1,4 0,016

7 "Углекислотный экстракт пихты сибирской" (г Екатеринбург, НПО "Кристалл", НПФ "Гранд", Россия) А-ацетат 0,2210,01 0,21+0,01 0,048

Ог 0,13±0,01 0,15+0,01 0,047

Е-ацетат 0,41 ±0,02 0,39+0,02 0,042

8 "Натуральный биоэкстракт облепихи и пихты сибирской"(г Екатеринбург, НПО "Градиент", Россия) А-ацетат 0,29±0,01 0,26±0,01 0,035

о2 0,14±0,01 0,12±0,01 0,042

Е-ацетат 0,58±0,02 0,59±0,02 0,034

Р-каротин 0,05±0,01 0,05±0,01 0,063

Основные преимущества меподик- высокая точность, простота в исполнении, сокращение времени анализа в сравнении со стандартными спектрофотометрическими методиками Разработанные методики позволяют определять содержание витаминов без предварительной пробоподготовки в водорастворимых готовых формах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии и могут быть положены в основу разработки пакета сертификационных методик

ВЫВОДЫ

В целях разработки методов аналитического определения жирорастворимых витаминов в готовых формах медицинской, фармацевтической промышленностях и препаратах для ветеринарии проведено систематическое исследование хроматографического разделения жирорастворимых витаминов А-ацетата (ретинилацетат), А-пальмитата (ретинилпальмитат), Е-ацетата (токоферилацетат), ГЬ (холекальцнферол). О* (эргокальциферол). Кч (менадион), (3-каротин, Е (а-токоферол) в условиях изократической обращенно-фазовой жидкосгной хроматографии

1 Рассчитаны характеристики полярности (Н) и индекс связываемости (х) витаминов

2 Установлены закономерности удерживания витаминов А, Ог, Е и К( полярными (51-ЫвогЬ-МНз, ЗНавогЬ-СМ, ЯПавогЬ-Ою!) и неполярными (ЗНавогЬ-Сг-Сщ) функциональными группами Для разделения витаминов целесообразно применять модифицированные кремнеземы с химически привитыми алкильными группами длиной цепи более Сю

3 Исследовано влияние подвижной фазы на хроматографическое разделение витаминов Универсальная квазихимическая модель удерживания в ВЭЖХ применена для оценки роли преобладающих взаимодействий сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, сорбат-модификатор и модификатор-модификатор Бинарные водно-органические элюенты с использованием в качестве органического компонента изопропанола, и.-пропанола, аце-тонитрила и 1,4-диоксана пригодны для разделения двух- и трехкомпонетных смесей витаминов А-ацетат, К,, Рг, Е-ацетат Применение водно-ацетонитрильных элюентов позволяет увеличить разрешающую способность системы с сорбентом 5ПазогЬ-С|к, водно-спиртовых - улучшить значение факторов емкости и форму пиков

4 Для эффективного разделения четырехкомпонентной смеси витаминов предложена оптимизация состава трехкомпонентного элюента на основе симплекс-решетчатых планов Шеффе ¡3,3) Сравнение рассчитанных и экспериментально найденных характеристик разделения витаминов с элюентом выбранного состава подтвердило адекватность модели

5 Составлена рациональная схема выбора неподвижной фазы и элюента для анализа различных сочетаний смесей витаминов

6 Определены интервалы концентраций и пределы обнаружения uni аминов в 6-компоиентных смесях А-ацетата, А-пальмитата, Р-каротина, Ki, Е-ацетата (<х-токоферола), D2 (Di)

7 Разработаны аналитические методики определения жирорастворимых витаминов в фармацевтических и ветеринарных препаратах ("Водный раствор витамина Di", "Сантевит", "Мультивитамин", "Веторон-Е", "Углекислотный экстракт пихты сибирской", "Натуральный биоэкстракт облепихи и пихты сибирской", "Тривит", "Нитамин") с водорастворимой матрицей без ее отделения

8 Разработанные методики определения жирорастворимых витаминов в фармацевтических препаратах ("Сантевит" и "Веторон-Е") и препаратах для ветеринарии ("Тривит") прошли испытание и внедрены на предприятиях Белгородского региона

Список опубликованных работ по теме диссертации

1 Балятинская Л H, Денисова Л В, Филимонов В H Обращенно-фазовая жидкостная хроматография для разделения и количественного определения жирорастворимых витаминов // "Проблемы химии и химических технологий" Материалы региональной науч -техн конф -Воронеж, 1995, с 235-236

2 Балятинская Л H, Филимонов В H, Денисова Л В, Колосова И Ф, Батракова 3 И, Данков-ская ДФ Контроль содержания жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах // Заводская лаборатория - 1997 -Т63, №8 -С. 1-3

3 Балятинская Л H, Филимонов В H, Денисова Л В, Колосова И Ф Хроматографическое поведение жирорастворимых витаминов в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии // Журнал аналитической химии - 1997 - Т 52, № 9 - С 877-879

4 LN Balyatinskaya, L V Denisova,VN Filimonov, SN Dudina HPLC of Fat-Soluble Vitamins in Multivitamin Formulations and Tablets // Intern Journal"Ecological Congress"-1999 V 3, № I _p 37-40

5 Балятинская Л H, Филимонов В H , Замуруев О В , Колосова И Ф, Денисова Л В Хроматографическое удерживание витаминов на силикагеле с применением многокомпонентных элюентов // Заводская лаборатория Диагностика материалов - 2001 - № 3 - С 7-12

6 Балятинская Л H, Филимонов В H, Замуруев О В , Колосова И Ф, Денисова Л В Оптимизация и оценка применимости метода ВЭЖХ для подтверждения показателя качества поливитаминных фармацевтических препаратов // Заводская лаборатория Диагностика материалов -2001.10 -С8-13

7 Балятинская J1Н, Филимонов В Н, Денисова JT В, Колосова И Ф Применение ВЭЖХ для контроля содержания жирорастворимых витаминов в биологических средах // Хроматография и спектроскопия в анализе объектов окружающей среды Материалы международного симпозиума - Санкт-Петербург, 1996 - С 285

8 Балятинская Л Н, Филимонов В Н, Денисова Л В , Колосова И Ф Оценка содержания биологически активных веществ в поливитаминных препаратах методом ВЭЖХ // Экоаналити-ка-96 Материалы всероссийской научно-технической конференции - Краснодар, 1996 - С 209

9 L N Balyatinskaya, V N Filimonov, L V Denisova, I F Kolosova High- performance Lignid chromatography determination of water and fet-soluble vitamins in multivitamins and dry concentrates//International Symposium on chromatography -Stuttgart, 1996 -P 273

10 L N Balyatinskaya, V N Filimonov, L V Denisova, IF Kolosova Reverse - phase HPLC of fat -soluble vitamins in multivitamin formulations //lO"1 Intern Symp "Advances and Applications of chromatography in Industry" - Bratislava, 1996 - H/11, P.247

11 LN Balyatinskaya, VN Filimonov, L V Denissova, Reverse-phase HPLC of fat-soluble vitamins in multivitamin and fodder preparations // XIV Helsinki University Course in Drug Research -Finland, 1997-P 134

12 LN Balyatinskaya, VN Filimonov, LV Denisova, IF Kolosova Revers-phase ion-pair HPLS of water-soluble vitamins in dry concentrates and fodders // XY University Congress on Drug Re-serch - Finland, 1999. - P 26

13 Денисова Л В., Балятинская Л Н, Филимонов В.Н, Колосова И Ф, Замуруев О В Особенности разделения жирорастворимых витаминов на неспецифических сорбентах в режиме обращенно-фазовой ВЭЖХ // Аналитика Сибири и Дальнего Востока Тезисы докладов VI конференции. - Новосибирск, 2000 - С 393 V

14. Филимонов В Н, Денисова JIВ, Балятинская Л Н, Колосова И Ф Выбор активного компонента водно-органической подвижной фазы для разделения жирорастворимых витаминов в ОФ ВЭЖХ // Менделеевский съезд молодых ученых РХТУ им Д И Менделеева Тезисы докладов - Москва, 2000 - С 564

15 VN Filimonov, LN Balyatinskaya, L V Denisova, IF Kolosova The possibilities of normalphase chromatographic systems for the separation and determination of fat-soluble vitamins by HPLC method // Intern Congress on Analytical chemistry - Moscow, 1997 - С 112

16 LN Balyatinskaya, L V Denisova, VN Filimonov, I F Kolosova Liquid chromatographic determination of fat-soluble vitamins in environmental samples // 28 л Ann Int Symp on Environmental // Analytical chemistry Geneva Switzerland, 1998 - P 43

17 LN Balyatinskava, L V Denisova, V N Filimonov, I F Kolosova Reversed-phase HPLC of fat-soluble vitamins // Book of Abstracts of ISC 98 Roma, Italy, 1998 № 606, - P 47

18 Филимонов В H, Денисова J1 В, Балятинская Л Н, Колосова И Ф, Замуруев О В Эколого-аналитический мониторинг смесей, содержащих витамины, методом высокоэффективной жидкостной хроматографией // Менделеевский съезд по общей и прикладной химии Материалы XVI съезда - Москва. 1998 ~т 3, С 260

19 Балятинская Л Н , Денисова Л В , Филимонов В Н, Колосова И Ф Оптимизация выбора подвижной фазы для обращено-фазовой ВЭЖХ жирорастворимых витаминов // Международный форум "Аналитика и Аналитики" Материалы форума - Воронеж, 2003 -С 182

Заказ № въ

Объем п.л._Тираж 100

Тираж 100экз

Отдел оперативной полиграфии Белгородского государственного технологического университета им В.Г Шухова

* - 54 0 3

РНБ Русский фонд

2004^4 36718

I

J

Список сокращений и обозначений

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Общая характеристика жирорастворимых витаминов

1.2. Методы аналитического определения витаминов групп А, Э, Е и К

1.2.1. Химические и биологические методы

1.2.2. Оптические методы

1.2.3. Электрохимические методы

1.2.4. Хроматографические методы

2. Основные факторы, влияющие на разделение в обращенно-фазовой жидкостной хроматографии

2.1 Неподвижные фазы и адсорбция сорбатов

2.2. Подвижные фазы и их селективность

2.3. Закономерности и модели удерживания в ОФ ВЭЖХ

2.4. Методы оптимизации эксперимента

2.5. Задачи и этапы исследования

3. Экспериментальная часть

3.1. Объекты и методы исследования

3.2. Растворители и реактивы

3.3. Приборы и оборудование

3.4. Приготовление хроматографических колонок

3.5. Расчет параметров хроматографического разделения

4. Закономерности разделения жирорастворимых витаминов при элюировании бинарными водно-органическими элюентами

4.1. Структура и гидрофобность сорбатов

4.2. Применение универсальной квазихимической модели удерживания ЖРВ при элюировании водно-органическими смесями

4.3. Разделение на химически модифицированных сорбентах

4.4. Разделение на кремнеземах с привитыми алкильными группами

5. Многопараметрическая оптимизация состава трехкомпонентной подвижной фазы

5.1. Выбор композиционных факторов и параметров оптимизации

5.2. Ограничение области факторного пространства на «главном» концентрационном треугольнике "составсвойство"

5.3. Математическое планирование проведения эксперимента, расчет уравнений регрессий, проверка адекватности полученных уравнений, решение задач «максимина» и совместное решение системы неравенств

5.4. Экспериментальная проверка математического прогнозирования качества разделения смеси сорбатов

5.5. Схема выбора сорбента и элюента для разделения ЖРВ

6. Определение витаминов в лекарственных смесях, фармацевтических и ветеринарных препаратах

6.1. Характеристики селективности и эффективности разделения витаминов на сорбентах различной природы

6.2. Определение предела обнаружения и параметров уравнений регрессии

6.3. Определение витаминов в препаратах с водорастворимой основой

Выводы

Актуальность темы. Среди физиологически активных природных органических соединений - алкалоидов, гормонов, антибиотиков и других - витамины занимают особое место. Они представляют собой постоянные составные части живого функционирующего организма, незаменимы для питания и являются лечебными средствами, усиливающими защитные функции организма. Витамины находят широкое применение как пищевые добавки антиокислительного действия, используемые в здравоохранении и животноводстве/1/. Поэтому контроль содержания витаминов и уровня их сохранности очень важен для оценки пригодности фармацевтических препаратов, особенно пищевых продуктов и препаратов для животноводства.

Эффективным методом, позволяющим обеспечить количественный контроль содержания витаминов в многокомпонентных объектах, является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) - универсальный аналитический метод разделения и определения компонентов сложных смесей. Метод ВЭЖХ незаменим при анализе термически и химически лабильных жирорастворимых витаминов (ЖРВ) групп А, О, Е и К. Обычно применяемый вариант нормально-фазового (НФ) разделения синтетических жирорастворимых витаминов /2/ основан на элюировании их неполярными органическими растворителями после сорбции на полярных сорбентах (химически модифицированных кремнеземах (ХМК), модифицированных полярными функциональными группами). Однако такой вариант ВЭЖХ не обеспечивает эффективного разделения сложных смесей, с полным набором жирорастворимых витаминов (А, Э, Е и Кз) в пробах с водосо-держащей матрицей, так как даже небольшие количества воды могут негативно влиять на воспроизводимость результатов. Такие препараты для НФ ВЭЖХ должны быть предварительно переведены методами щелочного гидролиза в форму, удобную для последующего хроматографирования. При проведении подобных операций изменяется состав биологически активной формы - эфиров. Поэтому определяется только суммарное содержание продуктов гидролиза.

Основным методом анализа ЖРВ без изменения их состава может стать об-ращенно-фазовая ВЭЖХ.

Цель работы. Изучение закономерностей удерживания жирорастворимых витаминов (А, Э, Е, Кз) в условиях изократической обращенно-фазовой ВЭЖХ, оптимизация условий их дифференцированного разделения и разработка аналитических методик определения содержания витаминов в готовой продукции.

Работа выполнена в соответствии с Координационным планом Научного Совета РАН по адсорбции и хроматографии на 2000-2004 г., утвержденный Президиумом Совета 21.08.2000 г., проблема "Применение хроматографических процессов для выделения и очистки биологически активных соединений", тема "Высокоэффективная жидкостная и высокоэффективная ионная хроматография биологически активных веществ", код 2.15.11.4.Х70.

Научная новизна. Для достижения поставленной цели решены следующие задачи:

- рассчитаны характеристики полярности (Н) и индекс связываемости (х) витаминов;

- изучен характер изменения параметров удерживания витаминов на кремнеземах, химически модифицированных полярными (БЛазогЬ-ЬГНг, Бь 1азогЬ-СЫ, БПазогЬ-Ою!) и неполярными (ЗПазогЬ-Сг-г-С^) функциональными группами;

- исследовано хроматографическое поведение витаминов при элюировании бинарными и трехкомпонентными водосодержащими подвижными фазами на основе изопропанола, //.-пропанола, ацетонитрила и 1,4-диоксана;

- показана возможность применения уравнения универсальной квазихимической модели удерживания для оценки роли межмолекулярных взаимодействий сорбат-сорбент, модификатор-сорбент, модификатор-сорбат, модификатор-модификатор;

- предложена процедура оптимизации состава трехкомпонентного элюента с использованием симплекс-решетчатых планов Шеффе {3,3}, которая включает проведение активного эксперимента и программу обработки полученных данных, разработанную в среде "МаШсас! 2001"; установлен оптимальный состав трехкомпонентного элюента для анализа многокомпонентных смесей витаминов;

- разработана рациональная схема выбора ОФ хроматографических систем для анализа витаминов (до 6 компонентов) в различных сочетаниях;

- разработан комплекс методик определения жирорастворимых витаминов А (ацетат, пальмитат), Кз, Р-каротин, Эг (Оз), Е (ацетат, токоферол) - в готовых продуктах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии.

Практическая значимость работы состоит в следующем:

- установлены закономерности удерживания витаминов от природы сорбентов и состава водно-органических подвижных фаз;

- показана возможность эффективного разделения смеси А-ацетат, А-пальмитат, Кз, р-каротин, Ог (Оз), Е-ацетат (Е-токоферол) методом ОФ ВЭЖХ при изократическом элюировании подвижной фазой состава //.-пропанол:ацетонитрил:вода (59,76:5,66:34,58) на силикагеле с химически привитыми алкильными группами (-С|8).

- разработаны методики количественного определения ЖРВ методом ОФ ВЭЖХ с сокращением времени пробоподготовки без отделения матрицы в готовых водорастворимых формах медицинской промышленности ("Водный раствор витамина Оз", "Сантевит", "Мультивитамин", "Веторон-Е"), фармацевтических препаратах ("Углекислотный экстракт пихты сибирской", "Натуральный биоэкстракт облепихи и пихты сибирской"), препаратах для ветеринарии ("Тривит", "Нитамин"). Методики внедрены на предприятиях Белгородского промышленного региона.

Закономерности изменения хроматографического поведения, характеристики удерживания и приемы оптимизации разделения смесей ЖРВ могут быть включены в хроматографические базы данных.

Положения, представляемые к защите:

1). закономерности удерживания синтетических жирорастворимых витаминов (А-ацетат, Кз, Бг, Е-ацетат) в условиях изократической ОФ ВЭЖХ.;

2). оценка роли сорбента и выбор его для разделения смеси жирорастворимых витаминов;

3). выводы о возможности описания удерживания жирорастворимых витаминов с позиций универсальной квазихимической модели удерживания в ВЭЖХ;

4). процедура оптимизации состава трехкомпонентной подвижной фазы для разделения смеси витаминов;

5). методики хроматографического определения витаминов в готовых формах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на II Международном симпозиуме "Хроматография и спектроскопия в анализе объектов окружающей среды и токсикологии" (Санкт-Петербург, 1996); на Всероссийской конференции "Экоаналитика-96" (Краснодар, 1996); Российско-американском конгрессе "Экологическая инициатива" (Воронеж, 1996); Международных симпозиумах по хроматографии (1БС-96, Германия, Штутгарт; 18С-98, Италия, Рим); 10 Международном симпозиуме "Успехи и применение хроматографии в промышленности" (Словакия, Братислава, 1996); Международном конгрессе по аналитической химии (Москва, 1997); I Международной научно-технической конференции "Экология человека и природа" (Иваново, 1997); 28 Международном Симпозиуме по аналитической химии окружающей среды (18ЕАС, Швейцария, Женева, 1998); XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 1998); 23 Международном Симпозиуме по разделениям в ВЭЖХ (HPLS'99, Испания, Гранада, 1999); на VI конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока-2000" (Новосибирск, 2000); Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003); Научно-технической конференции по хроматографии "Иониты" (Воронеж, 2003).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 40 печатных работ, из них 5 статей в "Журнале аналитической химии", "Заводская лаборатория. Диагностика материалов", "Ecological Congress", 7 статей в сборниках статей и трудов конференций; 28 тезисов докладов. Наиболее значимые публикации представлены в списке опубликованных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и характеристики метода, четырех разделов экспериментальной и расчетной части, выводов, списка цитируемой литературы и приложений. Работа изложена на 159 страницах, содержит 27 рисунков и 26 таблиц. Список литературы включает 156 наименований, в том числе 68 иностранных источников.

выводы

В целях разработки методов определения жирорастворимых витаминов в готовых водорастворимых формах медицинской промышленности и препаратах для ветеринарии:

1. Рассчитаны характеристики полярности (Н) и индекс связываемости (%) жирорастворимых витаминов.

2. Проведено систематическое исследование обращенно-фазового хромато-графического разделения жирорастворимых витаминов: А-ацетата (рети-нилацетат), А-пальмитата (ретинилпальмитат), Е-ацетата (токоферилаце-тат), D2 (холекальциферол), D3 (эргокальциферол), Кз (менадион), р-каротин.

3. Установлены закономерности удерживания витаминов групп A, D2, Е и Кз на специфических сорбентах Silasorb-NH2, Silasorb-CN, Silasorb-Diol.

4. Изучено хроматографическое разделение витаминов на модифицированных силикагелях типа Silasorb-C2^Ci8. Для разделения витаминов целесообразно применять модифицированные кремнеземы с химически привитыми ал-кильными группами длиной цепи более Ci6.

5. Исследовано влияние подвижной фазы на хроматографическое разделение витаминов. Зависимость удерживания витаминов от состава подвижной фазы описываются с использованием универсального квазихимического уравнения. Бинарные водно-органические элюенты с использованием изопро-панола, н.-пропанола, ацетонитрила и 1,4-диоксана пригодны для разделения, двух- и трехкомпонентных. смесей, витаминов А-ацетат, К3, D2 и Е-ацетат. Однако эти элюенты непригодны для разделения четырехкомпо-нентной смеси витаминов.

6. Состав трехкомпонентного элюента для эффективного разделения четырех-компонентной смеси витаминов оптимизирован на основе симплексрешетчатых планов Шеффе {3,3}. Сравнение рассчитанных и экспериментально найденных характеристик разделения витаминов с элюентом рассчитанного состава подтвердило адекватность модели.

7. По результатам исследований предложены оптимальные условия разделения ЖРВ: н.-пропанол:ацетонитрил:вода (59,76:5,66:34,58) / БПазогЬ-С^. Составлена рациональная схема выбора неподвижной фазы и элюента для анализа различных сочетаний смесей витаминов, охарактеризованы эффективность, селективность и время анализа смесей.

8. Разработаны методики определения жирорастворимых витаминов (рети-нилацетата, а-токоферилацетата, эргокальциферола, менадиона в присутствии ретинилпальмитата, Р-каротина, а-токоферола и холекальциферола) в сложных смесях с водорастворимой основой без ее отделения. Пределы определения для витаминов составляют 0,01ч-100 мкг. Рассчитаны диапазоны определения витаминов и коэффициенты градуировочных зависимостей для различных хроматографических систем.

9. Определены витамины: Эз в готовых формах; А-ацетат, Э2 и Е-ацетат в экстракте пихты сибирской; А-ацетат, Э2, Е-ацетат и Р-каротин в биоэкстракте облепихи и пихты сибирской; Р-каротин и Е-ацетат в препарате "Веторон-Е"; А-ацетат, Эз и Е-ацетат в препаратах для ветеринарии "Нитамин" и "Тривит"; А-ацетат, Е-ацетат, Р-каротин в биологической добавке к пище "Сантевит"; витаминизированных таблетках "Мультивитамин". Основные преимущества методик: простота в исполнении, сокращение времени анализа в сравнении со стандартными спектрофотометрическими методиками, высокая точность.

10. Разработанные методики могут быть использованы при определении ЖРВ в витаминизированных пищевых продуктах ("мягкие масла") с применением различных способов пробоподготовки.

1. Березовский В.М. Химия витаминов. М.: Пищевая промышленность, 1973. 600 с.

2. Замуруев О.В. "Нормально-фазовая изократическая ВЭЖХ жирорастворимых витаминов: закономерности удерживания, оптимизация состава подвижной фазы и разработка аналитических методик". Дисс.канд. хим. наук. М. 2003. 197 с.

3. Миндел Э. Справочник по витаминам и минеральным веществам. Пер. с англ. М.: Медицина и питание, 2000. 432 с.

4. Витамины /Под ред. М.И. Смирнова. Т. 8. М.: Наука, 1988. С. 5-8.

5. Государственная Фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.2.М.:Медицина.1990.

6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т.2. М.: Медицина, 1972. С. 3-43.

7. Экспериментальная витаминология. Справочное руководство / Под ред. Ю.М. Островского. Минск: Наука и техника, 1979. 552 с.

8. Стронова Л.А., Суранова Н.П. и др. Современные методы анализа фармацевтических препаратов. Всесоюзный НИИ фармации. t.XXVI. Москва, 1988. С. 32-34.

9. Спектрофотометрические методы определения витаминов А, D3, Е. ТУ 9353004-00480037-93.

10. Лутцева А.И., Маслов Л.Г., Середенко В.И. Методы контроля и стандартизации лекарственных препаратов, содержащих жирорастворимые витамины (обзор) // Химико-фармац. журн.- 2001. Т. 35. - №10. - С. 41-46.

11. И. Методы определения витаминов (химические и биологические). Под ред. В.А. Девяткина. М: Пищепромиздат, 1954. с.

12. Филимонов В.Н., Балятинская Л.Н., Колосова И.Ф. Методы исследования жирорастворимых витаминов // Деп. В ВИНИТИ, 1987. № 3079. - 50 с.

13. Байерман К. Определение следовых количеств органических веществ. Пер. с анг. М.: Мир, 1987. С. 284-360.

14. Юртаев Г.И., Тульчинская К.З., Яковлева В.Е. Биологический метод определения витамина Е // Труды. Всесоюзного научно-исследовательского витаминного института. -1953. №4. - С. 142-144.

15. Комаров С.Н. Содержание витамина D в жирах из печени балтийской трески.// Труды. Всесоюзного научно-исследовательского витаминного института. -1953. -№4. С. 209-211.

16. Постнов П.Е., Туманов А.А. Биологический метод анализа: проблемы избирательности и чувствительности определения биологически активных веществ // Журн. аналит. химии. 2000. - Т. 55. - №2. - С. 208-211.

17. Sheves М., Zriedman N. Conformational analysis of flexible trans Dienes by polarisation spectroscopy // Isr. J. Chem. - 1979. - V. 18. - № 3-4. - P. 359-363.

18. Hassan Saad S.M. Spectrophotometric determination of vitamin D2 (calciferol) by reaction with HC1 and tetrachlorethane // Presenilis' J. Anal. Chem. . 1978. - V. 1. -№ 5. - P. 416.

19. Sanchez Peres A., Gallego Matilla M. J., Hernandes Mendes J. A sensitive spectrophotometric method for the determination of vitamin Рз using the charge transfer spectra of vitamin D3 iodine complex // Anal. Lett. - 1993. - V. 26. - № 4.-P. 721-731.

20. A.c. // 63225 СССР, МКИ 601 № 21/78. Способ количественного определения менадиона // Артемченко С. С., Петренко В. В. (СССР). № 3714316/23-04; Заявлено 22.03.84; Опубликовано 23.06.85, Бюлл. № 23.

21. Berzas Nerado J.J., Murillo Pulgarin J.A.,Gomez Laguna M.A. Spectrophluorimetric determination of vitamin K3 // Analyst. 1998. - V. 123. - № 2. - P. 287-290.

22. Juan Zhuobin, Zhang Sun. Определение витамина Кз методом осцилополярографии с однократной разверткой потенциала инеополярографии // Фэноси Хуасюэ. Anal. Chem. 1989. - V. 17. - № 4. - P. 312-316.

23. Hassan Saad S.M. Manual and semiautomated spectrophotometric determination of vitamin K3 by reactions wiith piperidine and malononitrile // J. Assoc. Anal. Chem. -1981. V. 84. - № 3. - P. 611-615

24. Vire J.C., Abo E.N., Patriar che G.J. Square-wave adsorptive stripping voltammetry of menadione (vitamin K3)// Talanta. 1988. - V. 35. - № 12. - P. 997-1000.

25. Atuma S.S. Critical evaluation of voltammetric analysis of fat-soluble vitamins // Tr. AC. Trends Anal.Chem. 1998. - V.l. - № 14. - P. 339-342.

26. Taylor L.R. Polarographic and voltammetric determination of vitamins // Pittsburg Conf. State Art Anal. Chem. and Appl. Spectrosc., Cleveland, Ohio. 1978. Abstrs.-Mosoeville. 1978. P. 89.

27. Зенкевич И.Г., Макаров В.Г., Дадали Ю.В., Соколова Л.И. Рефрактометрическое определение а-токоферилацетата в препаратах витамина Е // Зав. лаб. 2001. - Т. 67. -№ 12.-С. 13-16.

28. Янак Я.Л. Роль хроматографии в современной аналитической химии // Журн. ВХО им. Д. И. Менделеева. 1983. Т. 28,-№ 1. - С. 3-7.

29. Хроматография. Практическое приложение метода. В 2-х ч. 4.1.Пер. с англ./ Под ред Э. Хефтмана.-М.: Мир, 1986. С. 262-265.

30. Руководство по газовой хроматографии: в 2-х ч. ч.1 Пер. с нем./ Под ред. Э.Лейбница, Х.Г.Штруппе. М.:Мир, 1988. 480 с.

31. Березкин В.Г., Ретунский В.Н. Состояние и тенденции развития аналитической химии (наукометрическое исследование) // Журн. аналит. химии. 1988. Т. 63.-№ 1. - С. 166-171.

32. Березкин В.Г. Химические методы в газовой хроматографии. М.:Химия, 1980. 256 с.

33. Кузьмин Н.М. О построении схем анализа // Журн. аналит. химии . 1996. Т. 5t-№3.-С. 262-269.

34. Hartman K.J. A simplified gas liquid chromatographic determination for vitamin E in vegetable oils // J. Amer. Oil. Chem. Soc. 1977. - V. 54. - № 10. - P. 421-423.

35. Scheffer J.J.C., Koedam A., Baerheim Svendsen A. Improved gas chomatographic analysis of naturally occurring monoterpene hydrocarbons following pre-fractionation by liquid-solid chromatography/ Sei. Pharm. 1976. - V. 44. - P. 119.

36. Мазор Jl. Методы органического анализа. М.: Мир, 1986. 584 с.

37. Хроматография в тонких слоях / Под ред. Э. Шталя. М.: Мир, 1965. 508 с.

38. Перри С., Амос Р., Брюер П. Практическое руководство по жидкостной хроматографии: Пер. с англ. М.: Мир, 1974. С.132-188.

39. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. / Под ред. О.Микета. М.:Мир, 1982. С. 538.

40. Ripphahn J., Halpaap H. Quantitation in high-performance microthin-layer chromatography // J.Chromatogr. 1975. - V. 112. - P. 81-96.

41. Беленький Б.Г., Волынец М.П., Ганкина Э.С. Современная тонкослойная хроматография // Журн. ВХО им. Д. И. Менделеева. 1983. Т. 28.-№ 1. - С. 3034.

42. Высокоэффективная тонкослойная хроматография: Пер. с анг./ Под ред. А.Златкиса, Р.Кайзера.-М.: Мир, 1979. С. 246.

43. Основы тонкослойной хроматографии. Пер. с нем.Под ред. Гейсс Фридрих, в 2-х томах, М.: Мир, 1999, с.

44. Киселев А.В., Яшин Я.И. Адсорбционная газовая и жидкостная хроматография. М.: Химия, 1979. 288 с.

45. Albertario Е., Gnocchi A. Determinazione della vitamina D2 (calciferolo)in specialita farmaceutiche polivitaminiche utilizando tecniche cromatografiche (TLC-G.L.C.-NPLC)// Cron. Chim. 1978. - V. 32. - № 55. - P. 12-18.

46. Практическая газовая и жидкостная хроматография. Учебн. пособие /Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Витенберг и др. СПб.: Изд-во С.-Петербург. Унта. 1998. 612 с.

47. Thorpe V.A. Liquid chromatography and fluorescence detection of vitamin A in animal feeds, and premixes // J. Assoc. Offlc. Anal. Chem. 1990. - V. 73. - № 3. -P.463 - 466.

48. Скурихин B.H., Шабаев C.B. Методы анализа витаминов А, Е, D и каротина в кормах, биологических объектах и продуктах животноводства. М.: Химия, 1996. 96с.

49. Thompson J.N., Natina G., Maxwell W.B/ High performanze liquid chromatographic determination of vitamin A in margarin, milk, partially skimmed milk // J. Assoc. Anal. Chem. 1980. - V. 63. - № 4. - P. 894-898.

50. Финкелыптейн Е.И., Морев C.H., Ефремова M.H., Краснокутская И.С. Определение изомеров ретинилацетата при многоволновом режиме детектирования. //Журн. |физ. химии. 1994. Т. 68.-№ 10. - С. 1829-1831.

51. Kostinen Т., Valtonen P. Comparison of HPLC separation of vitamin D3 metabolites and their isotachysteroh derivatives // J. Liquid Chromatogr/ 1999. - V. 8. - № 3. -P. 463-472.

52. De Vries E.J., Borsje B. Analysis of fat-soluble vitamins. XXIX. Liquid chromatographic determination of vitamin D in AD-concentrates: collaborative study // J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 1985. - V. 68. - № 5. - P. 822-825.

53. Романов H.A., Осипова Т.Л. Определение витамина D2 в растительных материалах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. //Журн.аналит.химии. 1988. Т. 43-№ 9. - С. 1704-1708.

54. Nabbolz A., Herforth S. High pressure liquid chromatographic determination of vitamin D in dietetic products // Mitt. Geb. Lebensmittel-untersuch. Und Hyd.— 1980. -№ l.-P. 100-107.

55. Авдеева A.A., Светлаева B.M. и др. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для контроля процесса фотосинтеза витамина D3 и его анализа в масляных растворах. // 1987. Т. 4Z-№ 10. - С. 1891-1895.

56. Rammell Colin G., Hoogen-booml Jacobus. Seperation of tocols by HPLC on an aminocyano polar phase column. // J. Liquid Chromatogr. 1985. - V. 8. - № 4. -P. 707-717. Цит. по РЖХим, 1985, 20Г330

57. Zonta F., Stancher B. High performance liquid chromatography of fat-soluble vitamins, simultaneous quantitative analysis of vitamins from cod liver// J. Chromatogr. 1983. - V. 256. - № 1. - P. 93-100. Цит. по РЖХим, 1983, 1Ю270

58. Lampi A.-M., Ollilainen V., Piironen V. Normal phase liquid chromatography of tocopherols: Pap. Finn. Chem. Congr., Helsinki, 30 Okt. 1 Nov.,1990 // Kemia-Kemi. - 1990. - V. 17. - № 10B. - P. 954: Цит. по РЖХим, 1991, 10Г299.

59. Дейнека В.И., Высочин А.Н., Староверов В.М., Кузьмин А.С. Высокоэффективная жидкостная хроматография синтетического а-токоферилацетата (витамин Е)// Журн. аналит. химии. 1991. Т. 46.-№ 6. — С. 1206-1211.

60. Аныпаков В.И, Брыкина Г.Д., Лазарева E.E. Определение витамина Е методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с косвенным спектрофотометрическим детектированием // Вестник Моск. ун-та. Серия химия. 2000. - Т. 41. - № 4. - С. 233-235.

61. Филимонов В.Н., Замуруев О.В., Балятинская Л.Н., Колосова И.Ф., Денисова Л.В. Оптимизация и оценка применимости метода ВЭЖХ для подтверждения показателя качества поливитаминных фармацевтических препаратов // Зав. лаб. 2001. - Т. 67. -№ Ю. - С. 8-13.

62. Филимонов В.Н., Замуруев О.В., Балятинская Л.Н., Колосова И.Ф. Оценка качества и экологической безопасности поливитаминных фармацевтических препаратов методом нормально-фазовой ВЭЖХ // Экология ЦЧО РФ. 2000. -Т. 5.-№ 2. - С. 11-15.

63. Филимонов В.Н., Балятинская Л.Н., Колосова И.Ф. Разделение синтетических жирорастворимых витаминов с помощью многоколоночной нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. физ. химии. 1994. - Г 68. -№ ю. - С.* 1835-1838;

64. Takamura К., Hoshino Н., Sugahara Т., Amano Н. Determination of vitamin D2 in shiitake mushroom (Lentinus edodis) by high performance liquid chromatography // J.Chromatogr. - 1991. - V. 545. - № 1. - P. 201 - 204.

65. Proska Bohumil, Zeiselova Maria, Picala Milos. Sposob stan ovenia dl-a-tocoferolu a dl-a-tocoferylacetatu kvapalinovou chromatogration. // A. c. 219654, ЧССР. Заявл. 11.10.80, № 6891-80, опубл. 01.12.85. МКИ G 01 №31/08. РЖХ, 1986, 10Г314П

66. Haints-Nutt R.F., Adams P. Stability of oral vitamin К a comprasion of an HPLC and Derivative Spectrophotometric Method // Anal. Proc. - 1984. - V. 21. - № 7. -P. 241-243.

67. Granado F., Olmeddilla В., Blanco L., Rojas-hidalgo E. An imported HPLC method for the separation of fourteen carotenoids, including 15-13 and phytoflene including 15 - Цит. по РЖХим, 1992, 6Г347

68. Miller K.W., Yang C.s. An isocratic high-performance liquid chromatography method for simultaneous analysis of plasma retinal, a-tocopherol and various carotenoids. // Anal. Biochem. 1985. - V. 145. - №3. - P. 21-26.

69. Якушина JI.M., Таранова А.Г. Быстрый способ определения жирорастворимых витаминов в сыворотке крови человека. //Журн. физ. химии. 1994. Т. 68.-№ 10.-С. 1826-1828.

70. Hasegava Н. Vitamin D determination using high-performance liquid chromatography with internal standard-redox mode electrochemical detection and its application to medical nutritional products // J. Chromatogr. 1992. - V. 605. - № 2.-P. 215-220.

71. High-performance liquid chromatographic determination of a-tocopheryl-nicotinatethin cosmetic preparations: Pap. 15 Int. Symp. Column. Liquid Chromatogr. 1992. -V. 593.-№ 1-2.-P. 95-97.

72. Shaikh R., Hyang H.S. Gas-liquid chromatographic analysis of benzoa.pyrene in cigarette smoke a nematic liquid crystal // Ibid. 1977. - V. 60. - P. 137-139.

73. Luscomble D.L., Bond A.M. Determination of tokopherols by reverse-phase liquid chromatography and electrochemical detection at a surface-oxide modified platinum microelectrode, without added electrolyte // Talanta. 1991. - V. 38. -№ 1. - P. 6572.

74. Hurthi T.N., Devdhara V.D., Jacob George. Determination of vitamin A in vanaspati by high-pressure liquid chromatographic method using UV detector// J.Food sci and Teclmg- 1990. № 27. - P. 1-3.

75. Andreoli R., Careri M., Manini P., Mori G., Musci M. HPLC analysis of fat-soluble vitamins on standard narrow bore columns with UV, Electrochemical and particle beam MS detection // Chromatographia. 1997. - V. 44. - № 11-12. - P. 605-612.

76. Collins Clyde A., Chow Ching K. Determination of vitamin A and vitamin A acetate by high-performance liguid chromatography with fluorescence detection // J. Chromatogr. 1984. - V. 317. - P. 349-354.

77. Клюев C.A. Определение витамина А и E методом ВЭЖХ с предварительным равновесным распределением в двух несмешивающихся жидких фазах //Журн. аналит. химии. 1996. Т. 51-№ 9. - С. 961-963.

78. Скурихин В.Н., Двинская JI.M. Определение токоферола и ретинола в биологических субстратах с использованием обращенно-фазовой хроматографии // 5 Всес. Симп. по молекул, жидкост. хроматогр.: Тез.докл., Юрмала, 1990. Рига. Зинатне - 1990. - С. 210.

79. Van Schaik F., van Schoonhoven J., Schrijver J. Simultaneous HPLC of several retinoids, carotenoids and E vitamins // 18th Int. Symp. Chromatogr., Amsterdam, 1990. Vol. 1. Amsterdam. - 1990. - С. MoP/077. Цит по РЖХ, 1991, 16Г242.

80. Cham B.E., Roeser H.P., Kamst T.W. Simultaneous liquid-chromatographic detection of vitamin Kj and vitamin E in serum // Clin. Chem. 1989. - V. 35. - № 12.-P. 2285-2289.

81. Mc Cann Meraney, Atuart M., Purnell J.H. Effect of binary eluent composition on retention of solutes in high-performance liquid chromatography // J.Chromatogr. -1984.-V. 294.-P. 349-356.

82. Кожанова JI.А., Федорова Г.А., Барам Г.И. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в поливитаминных препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии. -2002. Т. 57-№ 1.-С.49-54.

83. Сакодынский К.И. Аналитическая хроматография. М.: Химия, 1993. 464 с.

84. Киселев А.В. Межмолекулярные взаимодействия в адсорбции и хроматографии. М.: Высшая школа, 1986. 360 с.

85. Сакодынский К.И. Современные сорбенты для хроматографии // Журн. ВХО им. Д.И.Менделеева. 1983. Т. 28,-№ 1. - С. 34-43.

86. Модифицированные кремнеземы в сорбции, катализе и хроматографии / Под ред. Г.В. Лисичкина. М.: Химия, 1988, с. 12-15.

87. Сычев С.Н., Аксенова Н.С., Криволапое С.С. Адсорбционное модифицирование в жидкостной хроматографии на силикагеле // Журн. физ. химии. 1985. Т. 59-№ 8. - С. 1996-1999.

88. Киселев А.В. Межмолекулярные взаимодействия на коротких расстояниях. // Журн. 'физ. химии. 1984. Т. 38-№ 12. - С. 2753-2773.

89. Wells M.J.M., Clark C. Investigation of N-alkylbenzamides by reversed-phase liquid chromatography. 1. Isocratic elution characteristics of Ci C5 N-alkylbenzamides // J.Chromatogr. - 1982. - V. 235. - № 1. - P. 31-41.

90. Стыскин E.A., Ициксон Л.Б., Брауде E.B. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М.: Химия, 1986. 288 с.

91. Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир, 1980. 248 с.

92. Золотов Ю.А. Аналитическая химия: проблемы и достижения. М.: Химия, 1992. - 288 с.

93. Схунмакерс П. Оптимизация селективности в хроматографии. Пер. с англ. М.: Мир, 1989. 399 с.

94. Пульцин М.Н., Гайле А.А., Проскуряков В.А. Зависимость селективности от структуры растворителей и разделяемых компонентов. XVI. Селективность производных фурана и тетрагидрофурана // Журн. физ.химии. 1974. Т. 48.-№ 8. - С. 2045-2047

95. Садов В.В., Петрухин О.М. Влияние элюирующей силы растворителей на подвижность соединений в условиях жидкостной адсорбционной хроматографии //Журн. аналит. химии. 1988. Т. 37 -№ 8. - С. 1391-1396.

96. Snyder L.R. Classification of solvent properties of common liquids // J. Chromatogr. Sci. 1974. - V. 92. - № 2. - P. 223-230.

97. Snyder L.R. Classification of solvent properties of common liquids // J. Chromatogr. Sci. 1978. - V. 118. - № 6. - P. 223-234.

98. Snyder L.R., Dolan J.W., Gant J.R. Gradient elutient in high-performance liquid chromatography. 1. Theoretical basis for reversed-phase system // J. Chromatogr. -1979. V. 165. - № 1. - P. 3-30.

99. Киселев A.B., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия, 1986. 272 с.

100. Jandera P., Colin Н., Gulochon G. Optimization of separation conditions in reversed phase liquid chromatography using complex solvent mixtures // Chromatogr. Sci. 1982. - V. 16. - P. 132-137.

101. Mc Cormick R.M., Karger B.L. Role of organic modifier sorption on retention phenomena in reversed-phase liguid chromatography // J. Chromatogr. Sci. 1980. -V. 199.-P. 250-273.

102. Snyder L.R. Role of the solvent in liquid-solid chromatography // Anal. Chem. -1974.-V. 46. № 11.-P. 1384-1393.

103. Jaroniec M., Dawidowier A., Jaroniec J.A. A sample linear dependence of the logarithm of the capacity rate upon mobile phase composition in the reversed-phase liquid chromatography // J. Liquid Chromatogr. 1985. - V. 8. - № 3. - P. 441-448.

104. Biegansowska M., Soczewinski E. Retention parameters and eluent composition in thin-layer and high-performance liquid chromatography of aromatic nitro compounds in reversed-phase systems // J. Chromatogr. 1981. - V. 205. - № 2. -P. 451

105. Dolan J.W., Gant J.R., Snyder L.R. Gradient elution in high-performance liquid chromatography. 2. Practical application to reversed-phase systems // J. Chromatogr.- 1979. V. 165. - № 1. - P. 31-58.

106. Schoenmakers P.J., Billiet A.H., De Galan L. Influence of organic modifiers on the retention behaviour in reversed-phase liquid chromatography and its consequences for gradient elution // J.Chromatogr. 1979. - V. 185. - P. 179-195.

107. Шатц В.Д., Сахартова О.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография. Рига: Зинатне, 1988. 390 с.

108. Рудаков О.Б., Алексюк М.П., Коновалов В.В. Микроколоночная высокоэффективная жидкостная хроматография орто-замещенных гидрофобных производных фенола // Журн. аналит. химии. 2001. Т. 56.-№ 4.- С. 398-406.

109. Сычев С.Н. Методы совершенствования хроматографических систем и механизмы удерживания в ВЭЖХ. Орел: ОрелГТУ, 2000. 212 с.

110. Дмитриков В.П., Набивач В.М. Взаимосвязь между молекулярной структурой и параметрами удерживания алкилфенолов в ВЭЖХ.// Журн. аналит. химии. 1987. Т. 42,-№ 6. - С. 1110-1113.

111. Шатц В.Д. Выбор условий элюирования в обращенно-фазовой хроматографии. Общая зависимость удерживания от концентрации органического модификатора подвижной фазы. // Журн. физ. химии. 1986. Т. 60-№ 1. - С. 1-8.

112. Левин М.Г., Гризодуб А.И., Асмолова Н.Н., Григорьева В.Д., Георгиевский В.П. Механизм удерживания в обращенно-фазовом варианте жидкостной хроматографии с многокомпонентными подвижными фазами // Журн. аналит. химии. 1993. Т. 48-№ 11. - С. 81-93.

113. Snyder L.R., Рорре Н. Mechanism of solute retention in liquid-solid chromatography and the role of the mobile phase in affecting separation. Competition versus "sorption" // J. Chromatogr. 1980. - V. 184. - № 4. - P. 363413.

114. Horvath C., Melander W., Molnar I. Solvophobic interactions in Liquid chromatography with nonpolar stationary phases // J. Chromatogr. -1976.-V. 125. -№ l.-P. 129-156.

115. Horvath C., Melander W., Molnar I. Liquid chromatography of ionogenic substances with nonpolar stationary phases // Anal. Chem. 1977. - V. 49. - № 1. -P. 142-154.

116. Murakami F. Retention behaviour of benzene derivative on bonded reversed-phase columns // J. Chromatogr. 1979. - V. 178. - № 2. - P. 393-399.

117. Ланин C.H., Никитин Ю.С. Прогнозирование удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Межмолекулярные взаимодействия в подвижной фазе // Журн. аналит. химии. 1991.- Т. 46.-№ 10. С. 1971-1980.

118. Ланин С.Н., Никитин Ю.С. Прогнозирование удерживания в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Вытеснительная модель // Журн. аналит. химии. 1994. Т. 46г№ 8. - С. 1493-1502.

119. Ланин С.Н., Ланина Н.А., Никитин Ю.С. Влияние ассоциации молекул сорбата и модификатора в подвижной фазе на удерживание ввысокоэффективной жидкостной хроматографии. //Журн. физ. химии. 1995. -Т. 69г№ п. с. 2045-2051.

120. Ланин С.Н. Физико-химические закономерности адсорбции ароматических соединений и их проявление в высокоэффективной жидкостной хроматографии. Автореферат докторской диссертации. М, МГУ, 1998. 50 с.

121. Доёрфель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1997. 268 с.

122. Асатурян В.И. Теория планирования эксперимента. М.: Радио и связь, 1983. 248 с.

123. Ахназарова С.Л., Кафаров В.В. Методы оптимизации эксперимента в химической технологии: Учеб. пособие для хим.-технол. спец. вузов. 2-е изд., перераб. и доп.-М.: Высш. школа, 1985. 327 с

124. Райхардт К. Растворители и эффекты среды в органической химии. М.: Мир, 1991.-763 с.

125. Химический энциклопедический словарь. Под ред. И.Л. Кнунянца. М.: Сов. Энциклопедия, 1982. 792 с.

126. Херхагер М., Партоль X. Mathcad 2000: полное руководство. К.: BHV, 2000.-416 с.

127. Очков В.Ф. Mathcad 8 Pro для студентов и инженеров. М.: Компьютере Пресс, 1999. - 523 с.

128. Mathcad 6.0 Plus. Финансовые, инженерные и научные расчеты в среде Windows 95 / Пер. с анг. М.: Филин, 1996. - 712 с.

129. Лебедев H.H., Манаков М.Н., Швец В.Ф. Теория технологических процессов основного органического и нефтехимического синтеза. М.:Химия, 1975.-478 с.

130. Кафаров В.В., Дорохов И.Н., Дранишников Л.В. Системный анализ процессов химической технологии. Процессы полимеризации. М.: Наука, 1991.-350 с.

131. Walters Fr. Sequential simplex optimization: An update // Anal. Lett. V. 32-№ 2.-P. 193-212.

132. Sachok В., Kong R.C., Deming S.N. Multifactor Optimization of Reversed-Phase Liquid Chromatographic Separations // J. Chromatogr. 1980. - V. 199. — P. 317325.

133. Henisch S., Riviere P., Rocca J.L. A computer Routine for the Selection and Optimization of Multisolvent Mobile Phase Systems in Reversed-Phase Liquid Chromatography // Chromatographia. 1991. - V. 32.-№l 1/12. - P. 559-565.

134. Рухадзе М.Д., Безарашвили Г.С., Сидамонидзе Ш.И., Кокиашвили Н.Г., Рогава М.М. Математическое моделирование хроматографического удерживания барбитуратов в ион-парной обращенно-фазовой хроматографии // Журн. физ. химии. 1999. - Т. 73-№ 7. С. 1307-1311.

135. Рухадзе М.Д., Безарашвили Г.С., Сидамонидзе Ш.И., Махарадзе Т.Г., Кокиашвили Н.Г. Оптимизация хроматографического разделения смеси витаминов группы В симплекс-методом // Журн. физ. химии. 1999. — Т. 73-№ 12. С. 2237-2239.

136. Безарашвили Г.С. Планирование эксперимента. Тбилиси: ТГУ, 1989. 107 с.

137. Toon S., Rowland М. Simple Method for the optimization of mobile phase composition for high-performance liquid chromatographic analysis of a multicomponent mixture // J. Chromatogr. 1981. - V.208-№ 2. - P.391-397.

138. Булатицкий K.K. Особенности метрологических характеристик методик количественного анализа как методик выполнения косвенных измерений // Зав. лаб. 2001. - № 6. - Т. 67. - С. 59-61.