Разделение и аналитическое определение жиро- и водорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ЗАОЧНЫЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи

УДК 543.544.45.867

ФИЛИМОНОВ ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВИЧ

РАЗДЕЛЕНИЕ И АНАЛИТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЖИРО- И ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

02.00.02 — Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1990

Работа выполнена па кафедрах аналитической химии Московского химико-технологического института им. Д. И. Менделеева и его филиала в г. Новомосковске

Научные руководители — доктор химических наук, профессор БАЛЯТИНСКАЯ Л. Н.

кандидат химических наук, доцент КОЛОСОВА И. Ф.

Официальные оппоненты — доктор химических наук, профессор КОРЕНМАН Я. И.

кандидат химических наук, старший научный сотрудник ТИХОМИРОЕА Л. П.

Еедущая организация — отдел жидкостной хроматографии Дзержинского ОКБА НПО «Химавтоматика»

Защита состоится « » /я¿¿/л' _1990 г. в час.

па заседании специализированного Совета К 063.45.02 при Всесоюзном заочном институте пищевой промышленности (109803, Москва, ул. Чкалова, 73, ВЗИПП).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан_ _ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат химических наук

КОЛОМИЕЦ

Новомосковское ППО. Т. 100. 3. 5366—90

(ШХШШШЯШ'ШШ

Актуальность теш. Среди биологически и физиологически актив-аых соединений, вероятно, никакие другие вещества не имеют большего значения для жизнедеятельности человека или животного, чем витамины. Поступающие в организм с нишей витамины играют роль биокатализаторов в процессе ос&гена веществ. Нарушение баланса потребления витаминов вызывает глубокие изменения различных функций организма и тявелые его заболевания. Имеется обширная информация по методам определения витаминов в лекарственных препаратах, клинических образцах, пищевых продуктах. Наряду с этим крайне ограничены сведения об определении витаминов в корковых препаратах и смесях для животноводства, содержание которых обусловливает их биологическую ценность. Отсутствие в арсенале аналитических слукб биохимических предприятий и агрохимических лабораторий точных и экспрессных методов определения витаминов в'сложных ксашознциях не позволяет осуществлять надежный контроль качества продукции для агропромышленного комплекса. Поэтому разработка способов анализа биологически активных соединений- витаминов - в слоаных рецептурах (особенно в кордах) является актуальной для современней аналитической химии!

Эффективным средством, позволяющим обеспечить решение этой проблемы, может стать высокоэффективная гдекостная хроматография (ВЗВД - универсальный аналитический метод разделения и анализа сложных смесей. Метод ВЗдХ незаменим при анализе термически и химически нестойких веществ, к которш относятся биологически активные соединения. Использование ВЗЖХ в аналитической практике требует подбора оптимальных условий разделения иногокшпонентннх смесей. В связи с этш для накопления экслершентальных данных по закономерностям удерживания различного класса соединений в конкретных системах ВЗЖХ, актуальным представляется: проведение систематического исследования хршатографического поведения витаминов.

Работа выполнена в соответствии с пятилетним (1985-1Э90гг.) координационным планом научного Совета по хроыатографии АН СССР по проблеме "Хроматография, электрофорез", раздел 2.15.9.3.

Цель настоящей работы - систематическое лзтоенче закономерностей разделения витаминов в условиях нормально-фазовой, обра-ценно-фазовой, ион-парной ВЗМХ и разработка на этой основе методик определения содераания витаминов в кормовых препаратах и смесях для животноводства. Для достижения этого необходимо: изучить

- г-

зависимость параметров удерживания сорбатов от свойств подвижной 2 ЕеподЕШЕной фаз в различных зфаьгатографетеских системах; выбрать оптшальные условия в технику зфшатографирования, обесге-чЕваицпе эффективное разделение исследуемых витаминов; рассмотреть еозмокность экстракционного извлечения жирорастворшкх би-таздгвсв щш. подготовке пробы к анализу; разработать аналитические кетодаке определении витаминов б иккрокапсулированвых препаратах г Еорговыг скесях (дрешксах); применять результаты лабораторных Ессдедовявкй в дроазводствешшх условиях.

- Научная новнзна. Впервые проведено систематическое . исследование хрзатографхческого поведения шеек smpo~(A,E,K.j,3) ) и водо-ргстворншд CBj^,Bg,Bc,PP,C) вктаяшов в условиях ВлвХ. Установлены закономерности изменения удерживания витаминов на поляр-них Фнаасорб-бОО, Сшшсорб-ЙН^ Сйласорб-ON ) и .неполярнше (Ск-дасорб-С2*^18 ^ сорбентах от состава бинарных подвижных фаз. Полу. чен ряд линейных одаошраметрических корреляционных уравнении, позволяющих прогнозировать параметры удерживания гкирорастворшых адташшов но .данным о составе элюента в ъежтлв ВШ*. Проведена проверка, адекватности ошеалия уравнениями Снайдера к Мураката экспериментальных даннкх но удерживаниюводорастворжоас витаминов на Саласорб-Cjrg- в системе №21. Показано соответствие эксперимента коделк'бураками при содержании органического компонента вод-водкой подьишов фазы в пределах 3-50 % об. По дакнш исследована предложена озтшакьвые условия и разработана техника хрека-тографпровавая дзш разделения многокшшоненгннх смесей витаминов. Предложено екстракциошое извлечение жирорастворимых вигакинов кз изкрокапсук-тровакных препаратов смесью гексана с дециловш сшгртои. . ■

Практическая значимость заботы. Разработаны н внедрены методики определеюш гафо-(А и. водорастворимых (í^.B^, bg,Bc,PP,C) витаминов в микроканеулированных препаратах и премиксах метода! ВЭЖХ. Методики характеризуется уменьшенной трудоемкостью разделения г определения лабильных смесей слоеного состава,.улучшении,ш петрологическими параметрами, сокращением времени анализа в сравнении со стандартными методиками. Составлены схемы выбора условий ВЭЕл в зависимости от качественного состава хроматографируемок смеск витаминов. Предложена схема хро-катографированин с переключением колонок, позволяющая достичь эффективного разделения смеси витаминов яри изократическом злюз-рованЕЕ. Составлена прогршша выбора нелинейной математической

| зависимости, описывающей изменения параметров удерживания Еитами-| нов от состава элюента.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальной части, выводов, списка литературы, включающего 167 наименований, приложения с актами внедрения и программой' выбора нелинейно!? математической Функции. Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, из них 40 рисунков и 25 таблиц.

Апробация диссертации и публикации. Основные результаты работы изложены в 4 публикациях и доложены на 3 Всесоюзных и I Международной конференциях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы Витамины- низкомолекулярные биологически, активные органические соединения разнообразной химической природы и сложной структуры. Б связи с этим в главе I рассмотрены существующие способы классификации витаминов и их основные физико-химические свойства.

В главе 2 приведена сравнительная характеристика применяемых методов определения и исследования витаминов. Отмечается, что наряду с высокой чувствительностью анализа определенных групп, витаминов биологическими методами трудоемкость, недостаточная воспроизводимость результатов, низкая селективность исследования ограничивает возможность их использования в практике промышленных лабораторий. Зто послужило стимулом для создания более информативных физико-химических методов определения витаминов. Аналитический обзор библиографии по физико-хшическим методам анализа витаминов показал, что при определении витаминов,

в многокомпонентных смесях весьма перспективна хроматография.

. Подробно рассмотрены возможности различных вариантов хршатог-рафического метода контроля содержания витаминов в лекарственных препаратах, клинических образцах, пищевых продуктах. Среди хро-матографических методов анализа термически и химически нестойких биологически активных веществ большие возможности представляет высокоэффективная зшдкостная хроматография. Отсутствие в опубликованных работах обашх методических принципов выбора условий анализа смеси витаминов требует проведения систематического исследования хроматографического поведения витаминов в нормально-фазовой, обращенно-фазовой, ион-парной ВЭ2£Х. Это обеспечит решение задачи поиска методологической основы для разработки аналитичес-

А ~

кгх методик определения витаминов б кормовых смесях для животноводства, Обоснован выбор направления исследований.

5 к с п ериг е н тальвая часть

I. Методы ж объекты исследования. -• Ошсанн объекты исследования, используемые методы е хроматог-рафическая аппаратура, условии и методика заполнения высокоэффективных хроматографтескю: колонок дла ВЗЖХ. 1роматографическиэ параметры удерживания яиро- (1-5 в табд.1) и водорастворимых (6-11 2 табл.1) витаминов измерены на отечественна: -¡киякостноы хроматографе пЦвет-304" со спектрофотриетраческЕм детектором (А =г&4ш).

Таблица 1

Исследуемые .витамины

&

гцп

Наименование витамина

эдпирхгаеская формула

Структурная £ошула

х. ¿-Ре№ЕШ1£це~ тат (А)

2.. <С-Токо^ер^льде-тат СБ)

3. Эргокалка^етюл

(32) .■ ■

4. Холекалыдаферол ' С3)3)

5..2-метйл-1,4-ваф-тохинон (мена-дион, К3) '

6. Тиашшхлоред 4%)

7. Рибофлавин Й^) ■

Б, Пирвдоксина гкд-рохлоркд (Ве) ..."

2. Ь-Аскорбиновая кислота (С)

С22Н33°2 СЗХЕ53°3

С28Н44°

сн-с-сн)гемг- О-о^ си}

ш, си,

мг

СЦН8°2

« и »

»н еа,сн О Йу^ср.^

о» ом

Дрододжевие табл,I

•в Наименование п. п. витамина

Эмпарилеская формула

Структурная формула

10. Никотиновая кислота (РР)

11. Фолкевая кисло-

СШ

та (Вс)

ет

В работе использовали- аналитические колонки из нержавеющей стаи размере?,I 20x0,4 см и 10x0,4 см,; Заполнение колонок, сорбентами Сг-ласорб-€00г Сштсорб- КН^, Сетасорб-чЖ Силасорб^"^18 (7,5--10'■ мш) проводили в лабораторных условиях.суспензионным методом под давлением 16-24 ЫОа. Использованы следующие , бинарные подвижные фазы: дам НЖХ- смеси.гэксана с добавками хлороформа,кзопропанола, метиленхяорида, диэтилового эфира ; для (ЖХ- смеси бцдастяллкро-ванной воды с органическими модификаторами (цзопропанйл.ацетонкт-ршг, 1,4-даоксак); для ион-парной КЖ -смеси на. основе фосфатно- . го буфера с ион-паршлщ реагентами (тетрэдетилашоний бромистый, гетраэтиламмоний хлористый, тетрабутиламмоний хлористый, цетщг-. тршетилашоний бромистый)

В качестве мери удерживания сорбатов в хрдаатографическйх системах, отличающихся природой сорбентов '¿ составом подвижных фаз, применяли величины коэффициентов емкости (КЧ; меры селективности ' разделения - коэффициент селективности. (<£); меры эффективности разделения - критерий К5 . Отклонение хгрофши хроматографической зоны анализируемого вещества от: формы гауссовой кривой оценивали . с помощью фактора ассиметротноети ( Рд» ).

2, Хрсиатографическое поведение жирорастворимых витаминов в нориально-фазовой ВЭЮС , Для исследования жирорастворимых витаминов, растворимых в неполярных и слабополярных органических растворителях, использовала нормально-фазовый вариант жидкостной хроматеграфин (НФЖХ): этот вариант позволяет при; необходимости использовать экстракционное извлечение витаминов из препарата.

. Удерживание жирорастворимых витаминов на колонке , упакованной Силасорб-600, при злвироэании гексансм характеризуется значениями К*~> 40 (табл*2). Это свидетельствует о проявлении специфического • мехмолекулярногс взаимодействия здсорбат-силанолыше группы адсор-

¿вига. Действующие ораеитгщанные склы пропорциональна дапод£нш мсментш молекул витаашяов. _

■ Таблица 2

Параметры, характеризующие поведение аирорастворшкх / витаминов на специфических сорбентах Колонка - .20x0,4 см, размер частиц сорбента- 10 мкм, элюект~ гексан, расход — 2,7 мл/ыш

Сорбат Г> Силассрб-600 Силасорб- ИН2 Сцдасорб-Ш

ъ ■к* £ А К* Л К* А.

*3 1,2 46,03

В 2,6 46,11

А 2,3 69,37

V 5,2 125,1.

А 2,3

£ 2,6

5,2

•Е . 2,6

А-. 2,3

% 1,2

2>2 5,2

1.0

1,5 1,8

0,2 0,1

?,40 13,47 28,6

1,8 2,2

4,5. 2,8

0,92 0,95 1,28

1,03 1,35

4,95.

О

0,5 2,7

Однако абсолютные значения К1 исседуемых витаминов й доследователх-кость элшрованш сорбатов, не соответствующая ряду изменения да-польных моментов, свидетельствует о наличия в таких системах и более сильного спёшгф^еского взаимодействия. Вероятнее всего, происходит образование водородной связи некоторых структурных, фраг- . ментов витаминов с гидрсжсильными группами силикагеля. Так могут себя вести периферийные полярные группы полиеновой цепи молекул сорбатов: для А,Е; -ОН для Р2; атшы кислорода хиковдной группировки для К3.. Значительное удерживание жирорастворимых витаминов в системе гидроксилярованный силикагель-гексан приводит к размыванию и перекрыванию зон исследуемых веществ. Поэтому данная система характеризуется низкими критериями эффективности разделения 0,2.

Для поиска эффективных систем ШЖХ с элшрованием гексаном были испытаны колонки 4 упакованные сорбентами на основе.кремнезема с привитыми функциональнши амшныьга и нитрильнши группами. •

Замена атома кислорода в протонодонорной группе сорбента Си-

tacop6- NKg на менее электроотрицательный 'атом азота приводит к уменьшению дробного положительного заряда на атомах водорода в минной группе, а следовательно, к меньшей прот-онированности ашш-юй группы. Это придает сорбенту меньшую специфичность по сравнению с Силасорб-бОО, вследствие ослабления водородных связей Еита-шн-адссрбент, что приводит к уменьшению параметров удеркивакж îa Скласорб- NHg в 3-У раз. В системе Сяласорб- NH2 - гексан достигается эффективное (Rss 2,83) и селективное &1,8) разделение ;меси витаминов А,Е, Jg. Однако ' взаимодействие Ъ^ с не-

юдвикнок фазой за счет К-связей оказывает отрицательнее влияние îa величину К* (К* больше оптимальных значений). На сорбенте с ами-iorpynnavn не удается осуществить хроматографкрование витамина Kg ¡идет разрушение структуры привитой фазы).

Величина коэффициентов емкости витаминов на Силасорб-CN уменьшается в 25-70 раз по сравнению с достигаемыми на Силасорб-600. функциональные цианидные группы поверхности адсорбента не образует водородных связей с адсорбционными центрами молекул витаминов k,E,Kg. Ораентационные. силы мезду нитрильным сорбентом и витаминами компенсируются дисперсионными взаимодействиями неполчрной части молекул витаминов с гекеаном. Поэтому, чем более разветвлен 5гглеводорсдный скелет сорбата (Б > A »Kg), тем меньше удерживание хроматографируемых веществ (Е А Kg ) на. колонке с Склаеорб-CN . Только для витамина D2 на этом сорбенте сохраняется образование Н-связей, и это обеспечивает его селективное выделение (<¿=3,87) из смеси. Близкие значения К* не позволяют получить хорошего разделения витаминов А,Е,Кд: витамины А и Е выходят на хрсматограмме одним пиком (<А= I); критерий эффективности отделения пика витаг-мина Kg от объединенного сигнала витаминов А и Е составляет 0,49.

Характер удерживания жирорастворимых витаминов на специфических сорбентах в резшме НФЖХ при элщровании гекеаном не позволяет достичь эффективного хроматографического разделения смеси витаминов A,E,Kg,:J>2. Однако сочетание хроматографических колонок со стационарными фазами Силасорб-GN и Силасорб- NH2 обеспечивает экспрессное разделение смеси витаминов A.E.Dg с величиной К5>1,5.

Ддя хроматографического разделения пробы с шыгннм набором жирорастворимых витаминов было исследовано влияние состава подвижных фаз с добавками растворителей: диэтиловый эфир, изопропанол, хлороформ, металенхлорвд. Интерпретация полученных данных выполнена по корреляционным зависимостям между параметрами удерживания ви-

танинов и составам подвижной фазы., выбор которых осуществлялся на 3Ш типа. ЛВЕС-З по составленной программе. Обработка данных методами корреляционного анализа по сеж нелинейным регрессиям позволила установить наличие математической зависимости ыезду К'витаминов и содерЕаниш полярного ксшганента бинарной подвижной фазы (табл.3).

Добавление в подБикную фазу полярных растворителей создает условия для динамического адсорбционного модифицирования поверхности ; сорбента полярной добавкой,, что подтверждается сохранением ли-лЕнеёЕости уравнения 1/К'- {(Сцм.) , полученного с помощью ли-кеарххзувднх преобразовании нелинейной математической регрессии вила у= I/(ах+в) , на сорбентах Силасорб-600 и Силасорб-екин. Еа -редрецолярнал адсорбенте Силасорб-CN вероятность создания стабильного модифицирующего слоя выполняется только при использовании псдвиеных фаз с добавками изопропилового спирта. Обращает ка соба внимание, что для элззентов с добавками даэтилового эфира, . хлороформа, тгетиленхлорэда определяющей является .нелинейная per -рессик у= 'ах® , линеаризация которой приводит к корреляцкок-поиу уравнению вида tyK'-'l(tjßta) Такая билогариулическая зависимость согласуется с представлениями о конкурентной сорбции Сшйдера и Сочевизского.

Црз'обвем уменьшении коэффициентов-емкости жирорастворимых ви-таияноз на специфических сорбентах при элщровании бинаршши под-беенкми фазами достигается:

- на Силасорб-бОО частичное разделение витаминов А,Е,К,]) при использовании в качестве. подашных фаз смесей гексана с изопропа-нолсаг при шлок концентрации полярного компонента (не более 0,03 моль/л). Критерии разделения составляют - для пары E/A- 2,10; для пары A/Kg - Rs =0,34; для парыЗ^/Кз - Rs- 10,2. Использование в качестве добавок растворителей других групп обеспечивает эффективное отделение с {^>1,5 витаминов Е иЭ^ от А и Kg, параг-глетры удерживания которых близки независимо от вида и-концентра -цак применяемых добавок; • .

в хроматографических системах, • сочетающих ачинную стационарную фазу-и смешанный элюент гексап-полярный растворитель регистрируется разделение витаминов А к Б при малых концентрациях добавки и отделение витамина Dg от .суммарного пика витаминов А+Е при концентрации полярного растворителя, в злюенте более 1,5 моль/л;

- на колонке с Cj*jiacop6~CN сохраняется ранее отмеченная потеря

Таблица 3

Нелинейные математические регрессии, описиьшцие совокупность чисел X и У . с минимальной дисперсией С 8 ) Х- концентрация добавки полярного сорастворигаяя к гексану, коль/л; У- коэффициент алсоети.

Неподвик- Вита- ' Л 0 л я р н ц 0 сора с. тв о'р ц т е л и

ная фаза мин Диэтиловый эфир Изолрогшдовый спирт Хлороформ Бзтгсеюслорид

функция Б -------------г' функция Б — ---------- ------------- ЕГ" Функция 5 фуНКЦЕЯ. 5 ^ " ' ......

Силасорб-600

А'

Б

Э

Силасорб-емин •

2 А ' В

, Ь

Силасорб- А+ Е нитрдд . Кд 3>о

>,7^85 ЯО"

2,9266*10"

- . ________,9007* 10" ^

1/( ах+в)4,9658<Х0"^ I/(ах+в)2,0164'ХО-0 1/(ах+в) З.ЗВОв'Ю"3 1/1(ш-в)8,144ёЧ0*"5 Ко I/(ах+в)7,92X5'10"4 I/(ах+в)2,6290'ХО"6 1/(ах+в) 7,6829'Х0~4 ХДех+о^.^бЗЧО"4 - "-----* ^ - ----------------*......-,0613-ю-6

I/ (ах+в)5|9059' Х0~5 I/ (ах+в) 3 ] 4279 ■• Ю-4 I/1 ах+в) 1102 9 • Х0~5 X/ < аг+в) X,

Х/(ах+в)5 1/(ах+в)2

ч-9

,4689-Ю ,779Э'Х0"5

X/(ах+в) 7,0884■10

,-3

Х/(ах+в) Х/(ах+в) X/ (ах+в)

ах^ вхв ах?

9,3950'Х0~ь 6,Х85Х-10~5 8,Х955'Х0~7

1/(ах+е)7,2548*Х0 ах1 I/ (ах+в )3,7260' 10~5 ах1 1/( ах+в) 1,5936'Ю-5 ах'

в

9,7X02-10' Х,ОбХВ*ХО' 8,7956-10"

6.5958-ХО"^ 1,3147'ХО"7 2,1398 «Ю-8

,-3

X/(ах+в)2,5251'*Х0 I/ (ах+в )5,64В5 • 10' I/(ах+в)6,3173•Х0~^

ахв 1,2207'ЯП3 ахв /2,6460* КГ7

ах® 7,07X7-10-

I

СО I

салектййностй рьзлвлонки ветамгаов А а В, часткчзюе отделение ао-ки зитшина Ку от объединенного пика- А+Е'щда 0,4-0,8'; эффек-

тивное отделение ?ихшнна' 52 -витаминов А.Е,.^ при солее низ- ' ких значениях коэффициентов валкости (К* =4,95).

. Таким образом, при изократическом нордально-фазсвом элшрова-ш разделение смеси жирорастворимых.витаминов не достигается. Для разделения витаминов А„3,К',]) . необходим градиентный режим элшро-. вания, реализация которого на отечественных, приборах нереальна. Поэтому целесообразнш является хрсматографкческое разделение смеси, с переключением колонок, упакованных полярными сорбентами разной природа, ара нгократическш элшрований. Вариант принципиальной .схемы, обеспечивающей .разделение смеси жирорастворимых витаминов с > I, приведен на ряс.X. Хрокатогракгда смеси витаминов с переключением колонок изображена на. рис. 2. Техника хршаТографи-рования описана в данной главе. ..

Рйс.Х. Принципиальная схема для хроматографирования с переключением колонок: I-резврвуар для элюента; 2-насос высокого давления;3-ввод пробы;4-колонка с Си-ласорб-CN ;5-колонка с Са-ласорб-600; 6-колонйа с Сила-' copó- NK¿; 7-УФ-детехтор; 8 ,#-кран-переклтателъ;9,9-игольчатый вентиль;10-само-писец. ' .

Рис. 2. Хроматограша См-* 6** си жирорастворимых витаьш-нов с переключением колонок. Расход злюента (0,0262 М раствор изопропанола в гек-,, сане) 2. мл/мин. .

20

30

ig j ГШ.

3. Хрсшатографическов. повеление зодораетвортшх ватздвнos . з условиях обрйиенно-4®зовой ВЭЖХ Группа водорастворимых витаминов (Bj,B2,Bg,Bc,FP,C) характеризуется максимума« поглощения в области 260-470 на.- Ввиду- блазос- . т:г значения■длин волн в максгзлумах помещения щ:едъявляатся поен-шеннке требования к качеству хрсматографического разделения. ; •' "

Задачу анализа водорастворимых''витаминов-наиболее целесообразно решать методом GCpcüQinio-^aboBoii S32LX ка химически привитых сорбентах.. • '. ' .

При выборе оптимального сорбента для разделёння водорастворк-1лцх аита-.шхюз а разшге СФЖХ было оценено ачиянаэ длины цена прибитого углеводорода сорбентов Силасорб-^^хе на удер&аэалиэ сор* батов (рг.с.З)._Критическая длила цепа, найденйач аз пересеченая экстраполированных ветвей (на рис» 3) на превышает 14. Дозтс-лу . для разделения водорастворимых витаминов целесообразно применять .модифицированные кремнезеш с химически прзвитдаи алк&шшми группами длиной цепи более С^. . _ "

3g (б) на модифицированных кремнеземах от длины цепи привитых углеводородов. Колонки 10x0,4 см, зернение сорбентов 7,5 ыкм;

подвижная фаза- вода-ззопропэнол (87,5:12,5), расход-1,24мл/ьган.

Б зависимости от величины удерживания на исследуешсс сорбентах происходит разделение водорастворимых витаминов на два подгруппы : К' -г. I (витамины ВС,РР,С) и К* > I (витамины ВрВд.В^). Сравнение селективности разделения витаминов на неспецифичесних сорбентах позволило рекомендовать неподвижную фазу Саяасорб-С^д. На этой фазе

кабладается аффехтавво» отдаление .хрсасагогра^аческшс зов витаминов, разных подгрупп, а таил« частичное разделение витаминов Вт, Б-,, В,- пря-айсолшчшх значениях К'^20. . -

<* О ■ t

При алщрозанни водорастворимых. витаминов водой наблюдалось (рис.4,б) селективное удерниваяие витаминов Б^.В^.Б^ к десорбция с поверхности Силаоорб-С^ объединенного пика РР,С,В , для кото- • рых К'<1. Это обстоятельство шдет быть использовано для предварительного отделения водорастворшых витаминов разных подгрупп. Поэтому было изучено влияние природы и концентрации оргашгческого модификатора водного элюента на величины К' к селективность разделения.

•Для описания зависимости удерживания водорастворшйкх ваталкнов ка Силасорб-С^ от состава подвижной фазы экспершентальше данные обработали методами линейного регрессионного анализа о использованием уравнений Снайдера и Муракаыи.' Обе зависимости линейны в исследуемом диапазоне содержания органических модификаторов (изо-' пропанол,' диоксан, ацетонитрил) бинарных эдюектов. Дяя водорастворимых витаминов меньшее среднеквадратичное отклонение экспериментальных." данных от расчетных дает уравнение Мураками; оно более достоверно описывает результаты хршагографического анализа витаминов (коэффициент, корреляции равен 0,995-0,293) . Оптимальные критерии •разделения витаминов ВрВ^Вд получены при использовании ацетонитрила (ряс.4,а). .

Ни одна из рассмотренных систем ОФЖХ не позволяет достичь селективного разделения водорастворшых. витаминов кислого характера: аскорбиновой,никотиновой, фоляевой кислот; все кислоты-практически не удершваются в этих системах. Эффекиюныи способом - 'увеличения удерживания кислот в ВЗЖК является введение в элюент ион-парного реагента и реализация ион-парной жидкостной хроматографии (ИПХ).

Для оптимизации условий разделения витаминов в ИПХ изучены влияние длины алкильной цепи противоиона (соли.четвертичных аммониевых оснований), кислотности элюента, концентрации ион-парного реагента и содержания органического компонента (изопропанола) в подвижной фазе. Выбран режим хроматографирования, обеспечивающий разделение витаминов Вс,РР,С с критериями разрешения более 1,0; хро-матограша разделения приведена на рис.5. .

Таким образом, разделение смеси водорастворимых витаминов возможно сочетанием элшрования пробы с двух колонок, упакованных Си-

ласорб-С^, полярной подвязной фазой в рекше ОШ1 и полярной под-важной фаз от; с добавками прохивоиона (тетрабутилашония )-рвг?:гй РЛ Предварительное разделение хроматографируемой смеси витаминов на подгруппы выполняется при элзировааки волной подвшной базк.

а)

pp*e*B¡

Í)

fPi&l * 5

мин.

О 10 20 50 кен. О й !!> 36

Рис.4. Хрокатограгдгда смеси водорастворимых витаминов на Сила-ссрб-С18, подвижная фаза: а) ацетонитрил-вода (12,5:87,5); б) вода; расход элюента - 1,24 мл/мин.

W

Рис.5. Хроматсграша смеси витаминов С,р?,Вс в режиме ИПХ. Колонка размером 10x0,4 см с С'илаеорб-С^, подвижная фаза - 0,007 Ы раствор тетра-бутщашонт„ рН 9,65; 3,5 _ обД изолропанола. с "Т » ¿* н а юн.

По давнкм удерживания витаминов в изученных ШФ1Х,0ФЖХ,ШХ) хроматографических системах составлена схемы выбора условий ВЭЖХ для разделения--смесей, витаминов любого качественного состава.

4. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии -для определения витаминов в кортовых препаратах и смесях - Закономерности хроматографического поведения жиро- и водорастворимых -витшинов в различных режимах ВЭЕХ применены для разра-

<-с.?*.е методик ех определения в корковых, препаратах и смесях для Елвотноводства.

Определение жирорастворимых виу аистов в микрокапстлкроваккых препаратах» Для предварительного выделения жирорастворимых вита»::!-, нов из многокомпонентных шосрокадсулированных кормовых препаратов гранувыт-Е, микрозат-гА, вгдеин- 2)3, гранувит- Э2) предложен екст-акционшй способ извлечения витаминов. Применение экстракции упро-;ает процесс подготовки пробы к анализу, частично устраняет влия-сопутствующих ингредиентов, позволяет перевести анализируемые : оппоненты в фазу удобную для последующего хроматографкровакия и жределЕТь .биологически активные форш без их деструкции. Характеристики экстракционного выделения жирорастворимых витаминов приведены в табл.4. Последующее хроматографирование экстрактов вита-шнов Э2» 2>з Б регдае НФЖХ сокращает время количественного лх. определения до 30 щщ , при относительном стандартно:.! отклоне-шг не превышающем 0,03 (табл.5 ). .

Таблица 4

Характеристики.экстракционного выделения жирорастворимых . витаминов.

Состав растворителей и ха- В и т а м и н ы

рактеристики 'экстракции А Е Ъ2

Объемная доля .ДО?А 0,17 0,17 0,5 0,67

Оптимальное соотношение гексан -дециловыЁ спирт 1,4:1 3,5:1 9:0. 6:1

Коэффициент распределения 87,5 46,1 112,0 103,7

Коэффициент синергетности 1,14 1,07 - 0,72

Степень извлечения при однократной акстракиш, в %' .35,9 93,0 94,7 .-96,5

Время достижения экстракционного равновесия, мин. 5 5 2,5 1,5 .

Определение жиро- иводорастворэтлых витаминов в премиксах. Основой для приготовления премиксов в животноводстве являются отходы зернообрабатывающей прдашшекности (отруби), в которые вводятся биологически активные соединения (витамины), равномерно распределяйте механическим перевешиванием. Для повышения чувствительности анализа витаминов в премиксах за счет увеличения навески анализируемого образца осуществляется предварительное устранение елняния наполнителя ва ход определения с помощью просеивания пробы

■ . Таблица 5

Результаты определэнкя жирорастворимых витаминов з препаратах: ( п = 5, Р = 0,95 )

Препарат Норма содер-:ьания витамина по Т2Г в Найдено т ± £ X ' мг . - V

согласно методш

навеске, ■ /Яг ; Ш,.

мг . мг

^икровит-А ■Гранувит-Е Ввдеин-2-з

Гранувкт-32

13,5+14,5

90 +110

0,45-:-0,55

опытная партия

14,2± 1,9 14,3 106 ± 10 107 0,51± 0,07 0,52

14,ЗД),5 0,028 107 ¿ 4 0,030 0,52* 0,01 0,016

0,37 0,37^ 0,01 0,029

премикса через сито диаметром 0,4 ш. В остатке на сите установлено отсутствие витаминов. В методике определения жирорастворимых . ■ витаминов в премиксах условия экстракционного извлечения витэши-ноз соответствует режиму анализа ишрокапсулированвых препаратов. Алгоритм подготовки пробы к определению водорастворимых витаминов сводится к обработке просеянного образца, дистиллированной водой с рН 9-Ю. Хроматограшы экстрактов а зодннх вытяжек приведены, на рис. 6,7. В таблице 6 представлены результаты определения витами-

Рис.в. Хрйыатог-рашы экстрактов из премиксов при определении'витаминов А а 3 (а), витаминов и Кд (б).

л.*

ч,

й -яг лив нов в премиксах.

Работоспособность я. правильность разработанных шзтодак подтверждается хорошш согласованием результатов хроматографического анализа с данными стандартных методов и нормативным содержанием вита-нов в анализируемых объектах.

Внедрение методик осуществлено на Болоховскш кшбанате сштети-

s)

г/

\t i

VJ

7.5 /5 22,5 38

Рис.7. Хроматег-рашы при определении водорастворимых витаминов в премиксе.

а)-режим СЩХ

б)-режш ЙПХ

' Таблица 6

Результаты определения витаминов в премиксах- типа П-2-1 ( п = 5, Р » 0,95 )

Определяемый Еита'лин Норма по регламенту, г/т Найдено, №х, г/т íñx í ST, г/т Sz .w , ■ %

А 344 . 338 338 i 23 0,055 6,8

3 400 397 397 ¿ 19 0,039 4,9

3,75 3,80 3,80 ¿ 0,36 0,076 9,4 '

% 100 97,8 97,8 ¿7,2 0,059. 7,3

В1 200 202 202 + 14 0,054 6,7

% 400 339 399 ¿21 0,043 5,4.

Вс 50 . 51 51 - 4 0,065 8,1

РР . 1500 ■ 1500 1500 ¿53 0,028 3,5

С 5000 5001 5001 ¿ 75 0,012 1,5

ческих полупродуктов и витаминов и на Вфремовском биохимическом заводе в 1967-1989 годах. Акты внедрения включены в приложение диссертации.

в а в од ы

1. Проведено систематическое исследование хроматографического поведения жиро-(А,Е,Кд,Э ) и водорастворита. (ВрВ^.В^.З^РР.С) витаминов в условиях высокоэффективной жидкостной хроматографии.

2. Установлены закономерности удерживания жирорастворимых витаминов в ношально-фазовой БЭ2Х на специфических сорбентах Силасорб-600, Силасорб-СЫ , Силасорб-КЕ^. Для описания влияния состава подвижной фазы на параметры удерживания сорбатов по разработанной для йЩ программе выбран рад однопараметрических корреляционных уравнений вида X' = (■ . Уравнения могут быть использованы для

прогнозирования удерживания. и оптимизации условий разделения витаминов А,Б,Кд,2) в режше ©ЕК. Для объяснения изменения удерьа-ваная жзрорастворшшс витаминов. применены теоретические положения,-рассматривающие адсорбционное модифицирование поверхности специфических сорбентов полярной добавкой по~вш;ной фазы и конкурент-ную адсорбцию молекул сорбата и элюекта на активных. участках сорбента. •

3. Изучено хроматографнеское поведение водорастворимых витаминов б обращекно-фазовой ВЗЕХ ка ыод®1)КЦЕрованню: силикагелях типа Саласорб-^-КЗд-ц. Для разделения витаминов целесообразно применять модифицированные кремнеземы с химически- привитыми адаилькыш -группами длиной цепи более С^. Для описания зависимости удерживания ' водорастворимых витаминов от состава подвижной фазы справедливо уравнение Муракзди. Из исследованных модификаторов подвижной фазы оптимальное разделение витаминов достигается при использовании ацетонитрила. Разделение витаминов В„,РР,С проведено ме-

•О

тодом ион-парной ВЭЖХ, с введением в элюент ион-парного реагенте; - ионов тетрабутдлашоняя.-

4. Для разделения смесей водорастворимых витаминов и экстрактов жирорастворимых витаминов предложен прием хроматографирования проб с переключением колонок и сочетанием различных хроматографи-ческих систем.

5. По даннш удерживания витаминов в изученных хроматографи-ческих системах, составлены схемы выбора условий В5ЖХ при анализе. смесей с различным сочетанием витаминов.

6. Предложен экстракционный способ предварительного извлечения-жирорастворимых витаминов из корловых препаратов, исключающий ста-, да щелочного гидролиза и выпаривания экстрагентов, упрощающий процесс подготовки пробы к анализу и позволяющий определить биологически активные формы без их деструкции.

7. Разработан комплекс методик определения жирорастворимых (А, Е,Рз'^З' ^ и водорастворимых (Б2,В2,В6,Вс,РР,С) витаминов в корловых препаратах и премиксах для животноводства методом ВЭЖХ. Методики характеризуются уменьшенной трудоемкостью разделения и определения лабильных смесей сложного состава, улучшенндаи метрологическими параметрами, (относительная погрешность не более 10%), сокращением.времени анализа в 2-3 раза в сравнении со стандартными. Разработанные методики внедрены в промышленности.

До материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Филимонов В.Н. .Колосова И.Ф. .Балятинская JE.H. Разработка способа яяагаяа жирорастворимых витаминов в кормах методом ВШ // Тез. докл. ВТ Всес. сгип. по молекулярной жидкостной хрокатогрг-фии, 16-20 исвя 1987т,— Алма-Ата, 1987.- С.88

2. Филимонов В.Е. идр. Методы исследования жирорастворимых витаминов / Филимонов В.Н., Балятинская 1Л., Колосова И.Ф.; Моск. хим.-твхнол. ин-т,- M., 1987,- 29с.- Библиогр.: 50 назв.- Деп. е ВИНИТИ 30.04.87., & 307S.

3. Балятинская ПЛ..Колосова И.®.,Филимонов В.Н. Влияние ПАВ на стабильность водных эмульсий ври экстракционном извлечении жиро-

• растворив» витаминов JJ Тез. докл. УН Всес. конф. по ПАВ и сырью для кх .производства, 14-16 сент. 1388г.- Белгород, 1988.-Ч.2,-С. ЗЭД.

4. Определение «¿-токоферилацетата в кормовых микрокалсулнрован-ных препаратах методой высокоэффективной жидкостной хроматографии / Филимонов В.Н. .Колосова К.Ф..Балятинская Я.Е. .Меньшикова

.И..Епифанов А.Е. // Заводская лаборатория.-IS88.- Т.54, & &.-С. 25-27.

5. Фалшонов В.Н. .Колосова И.Ф. .Балятинская I.E. Контроль содержания витамина Е в кортовых препаратах методом жидкостной хроматографии // Методы анализа и контроля качества продукции : Сб. НШТЗХИЫ.- Ы., I98S.-И 2.- С.15-17.

6. Балятинская I.H. .Филимонов В.Н. »Колосова И.Ф. Экстракционное извлечение жирорастворимых виташшов при анализе кордовых смесей методой ВШ. // Тез. докл. I Всес. конф. по экстракции органических соединений, 7-9 ишя 1989г.- Воронеж,1989,- 4,2.-C.5I-52.

7.Фшашйнов В Л.,Колосова И. 9.,Балятинская Д.Н. Определение зкиро-растворимых вжтшинов вкорювых препаратах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Жури, аналит. химии - 1989.-Т.44, * 8.- C.I433-I436. •

8. PilimcmoT V.H., B&ljatinslceya Ь.К., Kolosovu I.P. High-perfor-шапое liquid cbromatogrepîay in production analysis of water-soluble vitamins // Abet. S-tb, Int. Symp- advances and application of