Новые псевдостационарные фазы на основе поверхностно-активных веществ в электрокинетической хроматографии тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

Ои'-З"*" ■ —

Свидрицкий Егор Петрович

НОВЫЕ ПСЕВДОСТАЦИОНАРНЫЕ ФАЗЫ НА ОСНОВЕ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Специальность - 02.00.02 - Аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

1 о ДЕН 2005

Москва - 2009

003487800

Работа выполнена на кафедре аналитической химии Государственного учебно-научного учреждения Химический факультет Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный руководитель: д.х.н. Пирогов Андрей Владимирович Официальные оппоненты:

Д.х.н., ведущий научный сотрудник Института геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН (ГЕОХИ РАН) Тимербаев Андрей Роландович

К.х.н., руководитель отдела разработок, обучения и сервиса ООО «Люмэкс-Маркетинг» Комарова Наталья Викторовна

Ведущая организация:

Химический факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 23 декабря 2009 г. в 15 ч 00 мин в ауд. 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Отзывы и замечания просьба направлять по адресу:

119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М.В. Ломоносова, Химический факультет, кафедра аналитической химии, учёному секретарю диссертационного совета.

Автореферат разослан Ю ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат химических наук

И.И. Торочешникова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Введение

Актуальность темы Электрокинетическая хроматография наравне с ВЭЖХ является достаточно часто используемым аналитическим методом. Высокая эффективность разделения (до 1 ООО ООО теор. тарелок) даёт этому методу серьёзное преимущество по сравнению с ВЭЖХ - возможность одновременного определения десятков и даже сотен соединений за сравнительно небольшое время.

Основной разновидностью электрокинетической хроматографии для разделения нейтральных соединений является мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ). Однако, существенное ограничение данного метода - невозможность реализации селективного разделения сильно гидрофобных соединений, сильно солюбилизируюшихся мицеллами. Пики гидрофобных соединений остаются неразрешёнными, падает и эксирессность анализа.

Потенциально микроэмульсионная электрокинетическая хроматография (МЭЭКХ) позволяет решить проблему разделения гидрофобных соединений за счёт большей олеофильности фонового электролита (что обуславливается сравнительно высоким содержанием спирта-стабилизатора) и за счёт высокой проницаемости для молекул поверхности капли микроэмульсии. Однако работ, посвященных основам метода микроэмульсионной электрокинетической хроматографии и разработке его практических приложений, ещё мало. Представляется интересным продолжить изучение этого метода в рамках его возможностей для разделения гидрофобных соединений.

Актуальным направлением развития микроэмульсионной электрокинетической хроматографии, как и всей электрокинетической хроматографии, представляется поиск дополнительных возможностей управления селективностью разделения. Необходимо найти способ реализации разделения смесей, при котором малое изменение состава фонового электролита будет приводить к значительному изменению селективности. Одним из решений данной проблемы является поиск новых псевдостационарных фаз (ПСФ).

Представляется интересным разработка способов реализации мицеллярной электрокинетической хроматографии в присутствии небольших количеств поверхностно-активных веществ (ПАВ) - концентрации на уровне критической концентрации мицеллообразования (ККМ) и ниже. Снижение концентрации поверхностно-активных веществ в фоновом электролите будет препятствовать уширению полос на электрофореграммах вследствие разогревания фонового электролита.

Цель работы состояла в поиске и изучении новых типов псевдостационарных фаз в электрокинетической хроматографии, а также в поиске новых подходов в управлении селективностью разделения для существующих псевдостационарных фаз.

Достижение поставленной цели предусматривало следующие задачи:

• Создание и изучение свойств новых типов псевдостационарных фаз на основе полиэлектролитов - микроэмульсионных полиэлектролитных комплексов.

• Исследование закономерностей влияния неионогенных полимеров на разделение соединений в методе мицеллярной электрокинетической хроматографии. Изучение перспектив применения добавок полимеров для снижения критической концентрации мицеллообразования ПАВ и управления селективностью разделения.

• Создание подходов к применению в электрокинетической хроматографии принципиально новых псевдостационарных фаз - биконтинуальных микроэмульсий (согласно своему строению данные псевдостационарные фазы должны иметь иную селективность по сравнению с «классическими» моноконтинуальными микроэмульсиями).

• Оценка перспектив применения биконтинуальных микроэмульсий для определения величины logP при скрининге веществ на потенциальную биологическую активность.

• Изучение возможности применения микроэмульсионной электрокинетической хроматографии для одновременного разделения гидрофильных и гидрофобных соединений на примере разделения новых классов соединений.

Научная новизна Изучены основные свойства ранее не применявшихся в электрокинетической хроматографии псевдостационарных фаз - биконтинуальных микроэмульсий и микроэмульсионных полиэлектролитных комплексов. Мицеллярные полиэлектролитные комплексы исследованы в качестве псевдостационарных фаз для разделения новых классов веществ. Выявлено изменение селективности при переходе от режима капиллярного зонного электрофореза к мицеллярным полиэлектролитным комплексам.

Применение добавок неионогенных полимеров в методе мицеллярной электрокииетической хроматографии позволило целенаправленно изменять селективность разделения путём перехода от ион-парного механизма разделения к распределительному. Показано, что добавки полимеров приводят к снижению критической концентрации мицеллообразования ПАВ, что позволяет работать с более низкими концентрациями поверхностно-активных веществ в условиях мицеллярной электрокинетической хроматографии.

Установлены основные закономерности разделения соединений в условиях микроэмульсионной электрокинетической хроматографии с биконтинуальными микроэмульсиями в качестве псевдостационарных фаз. Показано, что корреляции времён миграции и коэффициентов удерживания и logP для серии биогенных аминов при использовании биконтинуальных микроэмульсий оказались выше, чем в режиме мицеллярной и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии с моноконтинуальными микроэмульсиями.

Впервые реализовано одновременное разделение широкой смеси веществ сильно различающихся по гидрофобности методом электрокинетической хроматографии на примере смеси водо- и жирорастворимых витаминов.

Практическая значимость Предложены новые способы управления селективностью разделения сложных смесей за счёт реализации мицеллярной электрокинетической хроматографии в присутствии полимеров, а также за счёт применения принципиально новых псевдостационарных фаз - полиэлектролитных комплексов.

Предложен способ одновременного определения четырёх водо- и шести жирорастворимых витаминов (никтотинамид (далее РР), С, В), пиридоксина гидрохлорид (далее В6), A, D3, Е ацетат, Е, Ki, К3) в витаминных блендах методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии. Способ успешно применён для определения состава серии из четырёх витаминных блендов. Применение микроэмульсий в качестве экстрагента витаминов позволило сократить число стадий в процессе пробоподготовки. Исчезла длительная процедура смены растворителя, которая вносит дополнительную погрешность в 10-20% от определяемой концентрации витамина. На защиту выносятся следующие положения:

• Закономерности селективности разделения малых заряженных органических молекул при переходе от режимов капиллярного зонного электрофореза, мицеллярной и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии к мицеллярным и микроэмульсионным полиэлектролитным комплексам в качестве псевдостационарных фаз.

• Способ управления селективностью разделения биологически активных соединений в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии путём добавки неионогенного полимера в фоновый электролит. Данные об изменении селективности и эффективности разделения, а также порядка выхода их пиков на электрофореграммах в зависимости от типа и концентрации добавленного неионогенного полимера.

• Обнаруженные различия в поведении в качестве псевдостационарных фаз между растворами мицелл, моно- и биконтинуальными микроэмульсиями. Зависимости времён миграции для веществ модельной смеси от содержания гептана при переходе от мицеллярных растворов к «классическим» моноконтинуальным микроэмульсиям и биконтинуальным микроэмульсиям.

• Способ предсказания величины logP органических соединений с использованием метода микроэмульсионной электрокинетической хроматографии и биконтинуальных

микроэмульсий. Корреляции величин logP для биогенных аминов от логарифмов времён миграции и коэффициентов удерживания в режиме электрокинетической хроматографии с различными псевдостационарными фазами.

• Научно-методический подход к подбору оптимальных условий для одновременного разделения веществ, сильно различающихся по гидрофобности, в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии. Апробация работы Результаты работы докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, Москва), Второй всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России 2007» (2007, Краснодар), II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (2008, Воронеж), Международном симпозиуме «Микроразделение» (2008, Берлин, Германия), Международном симпозиуме «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (2009, Дрезден, Германия), Московском семинаре по аналитической химии (2009, Москва), Третьей всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России 2009» (2009, Краснодар), научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских журналах и 8 тезисов докладов.

Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 4 глав обсуждения результатов, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал изложен на 149 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков и 30 таблиц, в списке цитируемой литературы 131 источник..

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзор литературы

В обзоре литературы кратко описываются свойства мицеллобразующих ПАВ, а также новых ПСФ, таких как микроэмульсии и полиэлектролитные комплексы. Рассмотрены и систематизированы работы, посвящённые применению МЭЭКХ в химическом анализе, а также работы, посвящённые применениию полимеров-модификаторов в МЭКХ. Во всех частях обзора литературы, посвящённых практическому применению электрокинетической хроматографии, особое внимание уделяется проблемам управления селективностью разделения.

Экспериментальная часть

В работе использовали следующее оборудование: система ВЭЖХ, состоящая из градиентного жидкостного хроматографа Agilent 1100 (Германия), снабженного автосемплером, термостатом колонок и диодно-матричным детектором; колонка для ВЭЖХ Synergi Hydro-RP (250x5 мм), диаметр зерна сорбента 4 мкм (Phenomenex, США); система капиллярного электрофореза Agilent СЕ30 (Германия), укомплектованная диодно-матричным детектором; для работы использовали кварцевые капилляры диаметром 50 мкм с общей/эффективной длиной 48,5/40 см (Phoenix, США); регистрацию хроматограмм проводили с помощью программных пакетов ChemStation (Agilent Technologies, США); распределение коллоидных частиц по размерам изучали методом динамического светорассеяния на приборе Zetasizer Nano ZS (Великобритания).

Приготовление микроэмульсий Микроэмульсии готовили смешением компонентов в стеклянной посуде. Затем смесь обрабатывали ультразвуком до гомогенизации. Микроэмульсии хранили при комнатной температуре, использовали в течение 14 дней после приготовления.

Приготовление полиэлектролитных комплексов (ПЭК) Раствор полиакриловой кислоты (ПАК) с концентрацией 33 мМ готовили растворением рассчитанной навески исходного раствора в фосфатном буферном растворе с последующим доведением pH до 6,0 концентрированным раствором щелочи. Раствор хранили в темном месте и использовали не ранее чем через 24 часа после приготовления.

Раствор цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ) с концентрацией 30 мМ также готовили в фосфатном буферном растворе, pH раствора составил 5,8.

Для приготовления раствора ПЭК отбирали аликвоту раствора ПАК объемом 18 мл и помещали в стаканчик на 50 мл, устанавливали на магнитную мешалку и при перемешивании по каплям добавляли 2 мл раствора ЦТАБ (либо микроэмульсии). Схема установки для синтеза ПЭК представлена на рис. 1. После добавления ЦТАБ либо микроэмульсии раствор становился мутным, однако, через 2 часа после перемешивания снова становился прозрачным. Таким образом, получали ПЭК нужного состава и концентрации.

Электрофоретическое разделение в капилляре

Кассету с капилляром термостатировали при температуре 25 °С. Ввод пробы осуществляли гидродинамически. Перед каждым анализом капилляр кондиционировали ЫаОН, водой и фоновым электролитом. Режим кондиционирования определили экспериментально, в работе использовали промывку, которая обеспечивала наилучшую воспроизводимость результатов в ходе предварительных экспериментов. В качестве маркера электроосмотического потока (ЭОП) использовали ацетон.

Синтез и изучение свойств ПЭК Для синтеза мицеллярного ПЭК был использован способ, заключающийся в смешении растворов полиэлектролита и ПАВ. В качестве полиэлектролита была выбрана полиакриловая кислота с Р„ = 1800, а в качестве ПАВ - ЦТАБ. Остальные параметры системы были выбраны таким образом, чтобы ПЭК не выпадал в осадок при получении. Стояла задача получить ПЭК с концентрацией 30 мМ, ф = 0,1 в условиях рН 6,0 и концентрации фосфат-ионов 40 мМ.

Для получения микроэмульсионного ПЭК принципиально возможно применить два подхода. Первый основан на явлении солюбилизации «масла» раствором ПЭК. Второй основан на «обволакивании» микроэмульсии, уже содержащей «масло», макромолекулой ПАК. Первый способ не дал удовлетворительных результатов. После 30 мин выдерживания механической смеси растворов ПЭК и гептана на ультразвуковой бане не происходило никаких видимых изменений, гептан отслаивался от основной массы раствора в исходном количестве. Таким образом, для синтеза микроэмульсионного ПЭК был выбран второй способ, и первоначальная задача состояла в синтезе микроэмульсии на основе ЦТАБ. В стеклянной посуде к раствору ЦТАБ добавляли бутанол, после чего к этой системе прикапывали рассчитанное количество гептана и оставляли систему на ультразвуковой бане до полной солюбилизации гептана (на это потребовалось 30 мин). Полученную микроэмульсию объемом добавляли по каплями к раствору ПЭК при перемешивании. Выпавший с начала смешения осадок полностью растворялся после 2 часов непрерывного перемешивания.

Методом динамического светорассеяния было исследовано несколько полученных образцов мицеллярных и микроэмульсионных ПЭК, раствор ПАК и растворы исходных мицеллярных и микроэмульсионных систем на основе ЦТАБ. Сравнивая полученные данные, можно сделать вывод о том, как происходит трансформация полимера в ходе превращений. Так, средний размер частиц в растворе ПАК составляет 13 нм. Размер мицелл в 10 мМ растворе ЦТАБ в буферном растворе составляет 6 нм. Увеличение размера частиц при переходе от мицелл к микроэмульсиям является вполне ожидаемым. Переход к ПЭК сопровождается значительным увеличением размеров частиц. Средний размер частиц составляет около 20 нм. Переход к микроэмульсионным ПЭК приводит к дальнейшему росту значений среднего размера частиц (около 30 нм).

Однако изменение размера частиц является не единственным доказательством получения ПЭК. При использовании ПЭК в качестве фонового электролита не происходит перезарядки поверхности капилляра и, как следствие, изменения направления ЭОП. Это свидетельствует о том, что в растворе отсутствуют свободные молекулы ЦТАБ, не связанные противоположно заряженными цепями ПАК.

рЦ метр

/

I [оси* дозатор» для добавлении ПАВ

Млгншная мешалка

Рис, 1. Установка для приготовления ПЭК.

Микроэмульсионные и мицеллярные ПЭК в электрокинетической хроматографии

Для более полного описания свойств ПЭК в качестве новой псевдостационарной фазы следовало выбрать для разделения несколько групп различающихся по свойствам соединений. В качестве первой группы соединений были выбраны органические кислоты: галловая, гиппуровая, шщолилуксусная, пиколиновая кислота, сорбиновая, 4-аминобензойная, 3,5-динитробензойная, 3-аминобензойная, 2-аминобензойная, 5-бромсалициловая, сульфаниловая, салициловая, а также кофеин и ацетон в качестве маркера ЭОП. Все кислоты имеют в своём составе карбоксильную группу, основное отличие между ними состоит в строении ароматического остатка. Также в группе представлены полиосновные кислоты. При рН 6,0 все они, кроме кофеина и ацетона, будут заряжены, и ожидалось, что даже в зонном варианте будет происходить существенное разделение смеси. Ни одно из выбранных соединений не содержит большой гидрофобной группы и это не случайно. Взаимодействие аналитов с псевдостационарной фазой, скорее всего, осуществляется по двум основным механизмам: либо за счёт взаимодействия с ионизированной поверхностью частицы ПЭК, либо за счёт взаимодействия с гидрофобным ядром этой частицы. Вещества модельной смеси представляют собой легко ионизируемые соединения с низкой гидрофобностью, и по разделению соединений данной группы, можно судить о том, насколько сильно влияние взаимодействия аналитов именно с поверхностью псевдостационарной фазы. Наличие ароматического фрагмента позволяет детектировать компоненты тестовой смеси с помощью спектрофотометрического детектора. На рис. 2 представлена электрофореграмма модельной смеси кислот в режиме капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).

1. Ацетон, кофеин с

2. Галловая кислота

3. Гиппуровая кислота

4. Индолилуксусная кислота

5. Пиколиновая кислота

6. Сорбиновая, 4-аминобензойная, 3,5-динитробензойная кислоты

7.3-аминобензойная кислота 12

2-аминобензойная кислота 9.5-бромсалициловая кислота

10. Бензойная кислота

11. Сульфаниловая кислота

12. Салициловая кислота Ь ^

10

Рис. 2. Электрофореграмма модельной смеси. Фоновый электролит: 40 мМ раствор днгидрофосфата натрия, рН 6,0. Напряжение 25 кВ, ввод пробы: 200 мБар-е, концентрация веществ 40-55 мг/л.

Кофеин в данных условиях мигрирует вместе с маркером ЭОП. Перед апробацией полиэлектролитных комплексов в качестве ПСФ было изучено влияние полиакриловой

кислоты с различной концентрацией в фоновом электролите на времена миграции компонентов пробы. Электрофореграмма не имеет принципиальных отличий от варианта КЗЭ, за исключением того, что на ней отсутствует пик пиколиновой кислоты, и незначительно смещаются времена миграции аналитов. Последнее может быть связано как с изменением вязкости раствора, так и с изменением ионной силы. Было найдено, что вязкость в данном случае не изменяется, что свидетельствует о том, что главным фактором в изменении времен миграции веществ является ионная сила. Отсутствие пика пиколиновой кислоты может быть обусловлено ее специфическими взаимодействиями с полимерными цепями полиакриловой кислоты, что в свою очередь приводит к изменению направления миграции вещества (к аноду).

Перед анализом капилляр промывали в течение двух минут фоновым электролитом, после чего оставляли его на 10 мин для установления равновесия. Этот метод работы позволил добиться хорошей воспроизводимости результатов. На рис. 3 представлена электрофореграмма модельной смеси соединений с использованием мицеллярного ПЭК в качестве ПСФ.

1. Ацетон, кофеин д

3 2. Галловая кислота в 3. Гиппуроеая кислота

4 4. Индолилуксусная кислота с 5. Сорбиновая, 4-атинобензойная кислоты ^ б. 3,5-динитробензойная кислота " 7. 3-аминобензойная кислота

8. 2-аминобензойная кислота

9. Бензойная кислота 1 10. Сульфаниловэя кислота

11. Салициловая кислота

и

и

ю

^^.....

-т— 14

Рис. 3. Электрофореграмма модельной смеси. Фоновый электролит: 40 мМ раствор дигидрофосфата натрия, рН 6,0, 3 мМ ПАК/ЦТАБ (ф = 0,1). Напряжение 25 кВ, ввод пробы: 200 мБар-с, концентрации веществ 40-55 мг/л.

Необходимо отметить ряд важных особенностей:

• На электрофореграмме отсутствуют пики пиколиновой и 5-бромсалициловой кислот, что, как уже было сказано, связано с присутствием в системе макромолекул ПАК и ПЭК.

• Изменилась селективность и эффективность разделения. Эти параметры на примере гиппуровой и индолилуксусной кислот представлены в табл. 1. В подавляющем большинстве

случаев, несмотря на уменьшение эффективности, значительно улучшается разрешение пиков.

• Время анализа увеличилось больше чем в два раза, несмотря на невысокую концентрацию ПЭК в рабочем буферном растворе.

• По сравнению с разделением в режиме КЗЭ и в присутствии ПАК в данном случае происходит отделение пика 3,5-динитробензойной кислоты от пиков сорбиновой и 4-аминобензойной кислот.

Таблица 1. Сравнение разрешения, селективности и эффективности разделения в вариантах КЗЭ и ПЭК в качестве псевдостационарной фазы _

Фоновый электролит и* а N. ТТ/м (средняя)

40 мМ раствор дигидрофосфата натрия, рН 6,0 1,1 1,04 57000

40 мМ раствор дигидро-фосфата натрия, рН 6,0, 3 мМ ПЭК 3,0 1,11 45000

На рис. 4 показана зависимость числа теоретических тарелок от концентрации псевдостационарной фазы в фоновом электролите. Переход от варианта КЗЭ к ПЭК сопровождается уменьшением эффективности. Затем, начиная с концентрации ПЭК около 9 мМ, эффективность возрастает, достигая для некоторых веществ большей величины, чем при нулевой концентрации ПЭК. Из сказанного выше можно предположить о конкуренции двух факторов, влияющих на разделение смеси. В интервале концентраций ПЭК 0-9 мМ

Дальнейшее увеличение концентрации приводит к тому, что все больше определяемых веществ оказываются во взаимодействии с

псевдостационарной фазой. ПЭК имеют меньший коэффициент диффузии по сравнению с небольшими молекулами

растворителя, поэтому по мере увеличения концентрации ПЭК в рабочем буферном растворе, главным фактором, влияющим на эффективность, становится взаимодействие веществ с поверхностью псевдоста-

ционарной фазы.

Резюмируя, можно

утверждать, что взаимодействие разделяемых соединении, независимо от их строения, с микроэмульсионными полиэлектролитными комплексами, выступающими в качестве псевдостационарной фазы в фоновом электролите в электрокинетической хроматографии, происходит исключительно на поверхности агрегатов полиэлектролита и ПАВ. Заряженная поверхность полиэлектролитного агрегата полностью экранирует фазу «масла» и ПАВ. Мицеллы ПАВ в данном случае выступают в качестве ядра-каркаса, на основе которых происходит образование агрегатов ПСФ. На фоне этого различия в поведении мицеллярных и микроэмульсионных ПЭК практически нивелируются.

Тем не менее, ПЭК обладают принципиально иной селективностью по сравнению с известными ПСФ. Показано, что механизмы разделения в ЭКХ с ПЭК в качестве ПСФ и с

главную роль играет увеличение ионной силы раствора.

концентрации ПЭК в фоновом электролите.

ПАВ в качестве ПСФ принципиально различны. Это подтверждается как разной эффективностью разделения одних и тех же веществ, так и изменением порядка выхода их пиков на злектрофореграмме. Преимущества использования ПЭК при разделении малых заряженных молекул заключаются в принципиально иной селективности разделения по сравнению с МЭКХ и МЭЭКХ.

МЭКХ в присутствии добавок иеиопогеппых полимеров В данном случае в качестве модельной смеси были выбраны следующие соединения: адреналин, серотонин, витамины В6 и К3, кофеин, 4-аминбензойная, сорбиновая кислоты и ацетон. Большая часть этих веществ может присутствовать в различных «энергетических» напитках. Данная смесь позволяет весьма полно охарактеризовать ПСФ, так как она содержит вещества и катионного, неионного, и анионного характера.

В качестве фонового электролита было решено выбрать фосфатный буферный раствор, поскольку его использование дает возможность исследовать широкий диапазон рН (от кислых до щелочных сред), при этом обеспечивается достаточная буферная ёмкость практически при любом заданном значении рН.

Первым этапом работы стало определение наиболее оптимальных условий разделения модельной смеси в режиме КЗЭ, который является базовым, и относительно которого должно проводиться сравнение в дальнейшем. Электрофореграмма модельной смеси в режиме КЗЭ представлена на рис. 5.

4

г> о

Ё о

Рис. 5. Электрофореграмма модельной смеси в выбранных условиях: 25 мМ фосфатный буферный раствор, рН 5,6. Пики: 1 - серотонин, 2 - адреналин, 3 -витамин В6, 4 - ацетон, кофеин, витамин Кз, 5 - 4-аминобензойная кислота, б - сорбат калия. Напряжение 25 кВ, ввод пробы: 200 мБар-с.

Следующим этапом работы стало изучение разделения компонентов модельной смеси в варианте мицеллярной электрокинетической хроматографии. В качестве ПАВ был выбран додецилсульфат натрия (ДДСН). Для определения влияния концентрации ПАВ на разделение компонентов содержание ДДСН в используемых псевдостационарных фазах варьировали от 1 мМ до 20 мМ. Стоит отметить, что типичные используемые концентрации ПАВ в МЭКХ обычно находятся в диапазоне 20 - 100 мМ.

Критическая концентрация мицеллообразования ДДСН составляет в воде порядка 8 мМ, в буферных растворах она несколько снижается. Было проведено разделение компонентов модельной смеси при следующих концентрациях ДДСН: 1, 2, 3, 5, 10 и 20 мМ. На рис. 6 приведена зависимость разрешения пиков кофеина и витамина К] в зависимости от концентрации ДДСН без добавления полимеров. Резкое увеличение разрешения начинается с концентраций ДДСН, граничащих с ККМ ПАВ - 5-10 мМ.

Для изучения влияния добавок высокомолекулярных соединений на разделение компонентов модельной смеси были выбраны следующие неионогенные пол «меры:

Полиэтиленгликоли (ПЕГ), М» = 400, 1500, 20000,40000 г/моль; ■ Полипропиленгликоль (ППГ), = 2000 г/моль.

Для определения влияния добавок на разделение соединений модельной смеси была приготовлена серия растворов следующего состава: фосфатный буферный раствор, 25 мМ, рН 5,6,0,01% масс, соответствующего полимера, концентрации ПАВ 1,2, 3, 5, 10 и 20 мМ.

На рис. 7 представлено сравнение разрешений трех пар пиков соединений модельной смеси: витамин В6-ацетон, ацетон-кофеин и кофеин-витамин Кз в зависимости от типа полимера-

модификатора при

концентрации ДДСН 3 мМ.

При концентрации ДДСН 3 мМ не удалось добиться полного разделения пиков незаряженных или слабо заряженных

соединений (ацетон, кофеин, витамин Кз, витамин Вб). Однако, стоит отметить, что при использовании в качестве модификатора псевдостационарной фазы ППГ-2000 наблюдается полное разделение пиков витамина Вб, кофеина и витамина К3. Ацетон и кофеин практически не взаимодействуют с мицеллами, поэтому отсутствие разделения их пиков при столь малых концентрациях ПАВ было вполне предсказуемым. В случае с ППГ-2000 разделение гидрофобных соединений начинается уже при концентрации ДДСН 2 мМ, а именно, разрешение пары пиков витамин В6-кофеин составляет = 3,5, пары пиков кофеин-витамин Кз = 0,94. Таким образом, добавка полипропиленгликоля-2000 обеспечивает разделение соединений, достаточно различающихся по гидрофобности, уже при концентрации ПАВ 2 мМ (в отсутствие добавок, необходимая концентрация ПАВ составляет около 5 мМ, рис. 8).

Рис. 6. Зависимость разрешения пиков кофеин/витамин К3 от концентрации ПАВ.

1 1 1 I

Ж 1 1 : И — -

без добавок ПЭГ-400 ПЗГ-1500 ПЭГ-20000 ПЭГЛ0000 ППГ-2000

Рис. 7. Сравнение разрешения пиков компонентов модельной смеси на электрофореграммах, полученных при концентрациях ДДСН 3 мМ в фоновом электролите.

Полиэтиленгликоли (М„. = 1500, 20000, 40000) также позволили добиться разрешения пиков большинства веществ (витамин В6, витамин К3 и кофеин), однако, несколько худшего, чем при использовании ППГ.

На рис. 8 приведено аналогичное сравнение эффективности модификаторов, но уже при концентрации ПАВ 5 мМ. Как можно видеть, ППГ-2000 при этой концентрации ПАВ также достаточно эффективен в качестве модификатора, т.к. обеспечивает полное разрешение всех трех пар пиков, разрешаются даже пики ацетона и кофеина.

Резкий скачок величин ¿.5 при переходе от концентрации ДДСН 3 мМ к 5 мМ обусловлен изменением механизмов разделения - переход от разницы в электрофоретических подвижностях и ион-парного механизма к преобладанию распределительного механизма (происходит снижение ККМ за счёт влияния ионной силы и компонентов пробы). При концентрации ДДСН 3 мМ наблюдается полное разделение пары пиков витамин В^ - ацетон, а при концентрации 5 мМ происходит улучшение разрешения пар пиков ацетон - кофеин и кофеин - витамин К]. Применение модификаторов, особенно ППГ, позволяет улучшить разделение пары В6 - ацетон при содержании ДДСН 5 мМ. Полный переход к мицеллярному варианту в отсутствие модификатора происходит в интервале концентраций ДДСН 5-8 мМ, что показано на примере разрешения пары кофеин/витамин Кз (рис. 6). Полимерные модификаторы сглаживают переход, приближая картину разрешения пар пиков при 3 мМ ДДСН к таковой при 5 мМ ДДСН без добавок модификаторов, что указывает на снижение величины ККМ для ДДСН.

Рис. 8. Сравнение разрешения пиков компонентов модельной смеси на электрофореграммах, полученных при концентрациях ДДСН 5 мМ в фоновом электролите.

Кроме того, при использовании в качестве модификаторов псевдо-стационарной фазы полиэтиленгликолей с = 400, 1500, 20000 и 40000 был обнаружен эффект ослабления ими взаимодействия серотонина и мицелл, что, возможно, может быть использовано при анализе сильно взаимодействующих с мицеллами компонентов для уменьшения их времен миграции и сокращения времени анализа при одновременном увеличении эффективности разделения. В табл. 2 приведены времена миграции компонентов тестовой смеси, количество разделённых пиков и общее время анализа в присутствии различных модификаторов.

Таблица 2. Времена миграции компонентов тестовой смеси, количество разделённых

Параметр ^^^ разделевия^^^ С (ДДСН) Без модификатора ПЭГ-1500 ППГ-2000

3 мМ 5 мМ 20 мМ 3 мМ 5 мМ 20 мМ 3 мМ 5 мМ 20 мМ

1м адреналина, мин 1,87 2,17 4,44 1,67 1,83 4,03 1,86 2,24 6,38

1м серотонина, мин 2,06 н/о н/о 1,85 н/о 7,90 2,25 2,68 н/о

1м витамина В<„ мин 2,36 2,39 4,21 2,14 2,23 3,50 2,47 2,75 5,23

1м кофеина, мин 2,69 2,47 3,32 2,28 2,33 2,62 2,64 2,83 3,54

1м витамина К3, мин 2,73 2,87 6,18 2,34 2,64 4,13 2,75 3,33 9,57

1м 4-амино-бензоата, мин н/о н/о 7,33 н/о н/о 4,28 н/о н/о 6,52

1м сорбата, мин н/о н/о 7,69 н/о н/о 5,05 н/о н/о 7,02

1м ацетона, мин 2,65 2,39 3,15 2,28 2,28 2,31 2,64 2,83 2,93

Число пиков па электрофореграмме 6 5 7 5 5 8 5 5 7

Число полностью разделённых пиков 3 3 7 3 2 8 3 2 5

Общее время анализа, мин 3 3 8 2,5 3 8 3 3,5 10

н/о - не определяли, так как времена миграции данных компонентов составило более 20 минут

Таким образом, получены данные о влиянии неионогенных полимеров на разделение аналитов в режиме МЭКХ при низкой концентрации ДДСН. Показано, что полимерные модификаторы снижают фактическую ККМ ДДСН в фоновом электролите. Таким образом, получен удобный инструмент варьирования селективности ПСФ. Добавляя тот или иной модификатор, можно при одной и той же концентрации ДЦСН реализовывать разделение по ион-парному или по распределительному механизму. Показано, что полимеры, имеющие алкильный остаток (ППГ), оказывают более существенное влияние на снижение ККМ ПАВ, чем их незамещённые аналоги (ПЕГ). Полученные зависимости могут быть использованы для определения биологически-активных веществ в объектах анализа.

Биконтинуальные микроэмульсии как новый тип псевдостационарной фазы

Биконтинуальные микроэмульсии представляют собой системы, в которых как фаза воды, так и фаза «масла» непрерывны, а не существуют в виде изолированных микрокапель. На рис. 9 схематически представлено строение моно- (А) и биконтинуальной (Б) микроэмульсии. Для корректного сравнения были выбраны moho-, биконтинуальные и мицеллярные системы, максимально схожие по составу. Двигаясь по оси содержания углеводорода фазовой диаграммы, было возможно получить все типы систем, отличающиеся только по содержанию масла при неизменном содержании остальных компонентов.

В качестве

изучаемой микроэмульсии A s Б

была взята система, описанная в литературе, содержащая 8% ДДСН, 26,7% 1 -бутанола, 13,3% гептана и водную фазу. Помимо этого, были изучены системы,

содержащие меньшее количество гептана 11%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% и 0%. Для получения указанных систем в качестве водной фазы использовали 10 мМ раствор ацетата аммония с рН 6,7, что позволило работать в областях умеренного ЭОП и предотвратить выпадение солей из-за большого количества органических растворителей в системах. Данная величина рН позволяет минимизировать изменения ККМ ДДСН вследствие изменения кислотности среды. Сначала все системы были охарактеризованы на полидисперсность методом динамического светорассеяния. Согласно полученным данным системы, содержащие менее 8% гептана, относятся к моноконтинуальным МЭ (средний диаметр капель 4,0 - 4,2 нм). Для систем, содержащих 11 % и 13,3% гептана, диаметр коллоидных частиц не поддаётся измерению, что указывает на их биконтинуальный характер. Полученные данные позволяют сделать вывод, что фазовая граница, разделяющая моно- и биконтинуальные системы проходит между точками 8% и 11% содержания гептана. Затем системы были протестированы на сегрегационную устойчивость в присутствии высокого напряжения. Все системы, содержащие 8% и более гептана, рано или поздно расслаивались при наложении тока, что приводило к закупориванию капилляра капельками «масла», однако, при ограниченных величинах напряжения (10-25 кВ) ток и базовая линия были стабильными достаточно продолжительное время (30-40 минут). В табл. 3 представлен состав некоторых изученных систем, средний диаметр коллоидных частиц и максимальное рабочее напряжение.

Рис 9. Строение моноконтинуальной (А) биконтинуальной (Б) микроэмульсий.

Таблица 3. Состав, средний размер капель некоторых исследованных коллоидных систем, а также максимальная величина рабочего напряжения._

Содержание гептана, % (масс.)* Средний размер частиц, нм Максимальное напряжение, кВ

0 4 25

2 4 25

8 4 20

11 бнконт. 15

13,3 биконт. 15

1 прочие компоненты: ДЦСН 8%, 1-бутанол 26,7%, 10 мМ аммошшно-ацетатный буферный раствор, рН 6,7

В качестве тестовой системы была выбрана смесь биогенных аминов и ацетон. Для сокращения времени анализа было решено использовать ввод пробы с короткого конца капилляра, в этом случае эффективная длина капилляра была уменьшена практически в 5 раз, что позволило существенно сократить время анализа. В качестве маркера ЭОП использовали воду (в составе пробы). Пик ацетона не соответствует положению ЭОП, поэтому не может быть использован в качестве маркера. Это связано, скорее всего, с высоким содержанием органических растворителей в фоновом электролите, в связи с чем облегчается переход молекул ацетона между двумя фазами. Получены зависимости времен миграции разделяемых компонентов (рис. 10) от содержания гептана в разделяющем буфере. На рисунке виден скачок, расположенный за точкой содержания гептана 8%. Данный факт так свидетельствует о резком изменении свойств псевдостационарной фазы и переходе между различными типами микроэмульсий в интервале концентраций гептана 8-11%. Одной из причин излома является резкое повышение вязкости системы - характерное явление при данном фазовом переходе. 20 1 -^эсп

-е-Дофамин ■ Серспинин 15 -I Диметмлдофзмин -♦-Ацетон о п-Метилфенэтиламин

а. ю

а 5

монококтикуапьнчя МЭ

биконшнуалънал МЭ

0 2 4 6 8 10 12 14

Гептан, %

Рис 10. Влияние содержания гептана в фоновом электролите на времена миграции компонентов тестовой смеси.

Таким образом, впервые показана принципиальная возможность применения биконтинуальных микроэмульсий в качестве ПСФ для электрокинетической хроматографии. Однако, слишком большие времена миграции и нестабильность ПСФ во времени не позволило найти конкретное аналитическое приложение данным системам. Следует

отметить, что полученных данных достаточно для оценки возможности применения биконтинуальных МЭ для предсказания величины ^Р для органических соединений. Для установления корреляции между временами миграции ¡м и 1о§Р для четырёхкомпонентных микроэмульсий была выбрана простейшая модель линейной зависимости:

1о§Р = а-1о$к + Ь

По сути, коэффициент удерживания (к) показывает положение пика в «окне миграции». Рассчитать величину к не всегда возможно, так как не всегда удаётся зарегистрировать пики, соответствующие ЭОП и ПСФ. Время миграции ПСФ (1псф) в первом приближении можно заменить на время миграции наиболее удерживаемого компонента смеси, в данном случае цетона (Ацетон), а время миграции ЭОП Оэоп) - на время миграции наименее удерживаемого компонента, в данном случае воды Ошо), получив таким образом величину к":

к = 'м4 эоп /сн= *м~'н7о

1

, 'псф,

В табл. 4 представлены величины 1м, 1о§к", полученные при различном содержании гептана в фоновом электролите, а также истинная величина логарифма коэффициента липофильности (1о^РцСт) для серии веществ, которые использовались в качестве модельной смеси при исследовании четырёхкомпонентных биконтинуальных микроэмульсий. Веществом с наибольшим временем миграции был ацетон.

Таблица 4. Величины Ь], и 1(^РЯСТ для исследованной группы соединений

Соединение 1М (п = 5, Р = 0,95) к^к"(п = 5,Р = 0,95) ^Р (АСО ЬаЬэ) 1о2Р„ст

0% 6% 11% 0% 6% 11%

Ацетон 8,8 12,2 27,3 нет нет нет -0,16±0,19 -0,24

Диметил-дофамин 6,3 9,3 21,6 -0,03 0,49 1,01 1,20±0,24 0,77

Серотонин 5,7 7,8 15,4 -0,39 0,10 0,45 0,21 ±0,23 0,21

Дофамин 3,9 5,4 7,6 нет -2,18 -0,87 0,12±0,22 -0,97

п-Метил-фенэтиламин 5,6 5,7 9,4 -0,47 -0,87 -0,26 0,72±0,21 -0,42

На рис. 11 представлена зависимость логарифма коэффициентов удерживания разделяемых веществ при разных концентрациях гептана в рабочем электролите и ^Р„ст.

'ЭОП

1-(

ацетон )

'Н20

(6% гептана) и биконтинуальных (11% гептана) микроэмульсий.

В табл. 5 представлены параметры полученных линейных зависимостей, а также величины logP„CT. Как видно из таблицы, при переходе от моноконтинуальных микроэмульсий к биконтинуальным корреляция логарифмов коэффициентов к" и logP улучшается. Таким образом, показана принципиальная возможность применения биконтинуальных МЭ в качестве ПСФ для предсказания величин logP. Биконтинуальные МЭ показывают лучшую корреляцию логарифмов коэффициентов к" с logP по сравнению с моноконтинуальными аналогами и растворами мицелл ещё и за счёт того, что в этих системах значительно больше поверхность раздела фаз, что облегчает переход молекул между фазами.

Таблица 5. Параметры линейной зависимости между величинами 1ойк" и 1опР„Ст для исследованной группы соединений_

Концентрация гептана, % Параметры уравнения logP„CT = a- logk" + b, R"

6% а = 0,62; b = 0,28; R" = 0,9485

11% a = 0,92; b = -0,18; R2 = 0,9994

Применение МЭЭКХ для разделения смесей веществ, сильно различающихся по гидрофобпости, на примере витаминов

Существенной проблемой всех хроматографических методов, как ВЭЖХ, так и ЭКХ, является одновременное разделение соединений, сильно различающихся по гидрофобности. Для решения этой задачи с помощью метода МЭЭКХ в качестве объектов анализа были взяты витамины. Данные объекты являются хорошей моделью, так как большинство водорастворимых витаминов представляют собой малые заряженные молекулы, а жирорастворимые - большие незаряженные молекулы с гидрофобными остатками.

Для одновременного разделения витаминов обеих групп была взята за основу следующая микроэмульсия: 3% ПАВ, 0,8% гептана, 6,6% 1-бутанола и 25 мМ тетраборат

натрия с рН 9,3 в качестве фонового электролита. Установлено, что без модифицирующих добавок в фоновый электролит можно разделить только пики водорастворимых витаминов и пик витамина Кз, обладающего умеренной гидрофобностью. Пики остальных витаминов не появляются на электрофореграмме в течение 40 мин (рис. 12А).

Рис. 12. Влияние концентрации Бридж 35 на картину разделения витаминов. Микроэмульсия: 3,0% ПАВ, 6,6% 1-бутанола, 0,8% гептана и 25 мМ тетраборатный буферный раствор рН 9,3, напряжение 22 кВ. Содержание ДЦСН/Бридж 35 (%, масс.): (А) 3,0/0; (Б) 2,8/0,2; (В) 2,6/0,4; (Г) 2,4/0,6; (Д) 2,2/0,8.

Был выбран следующий алгоритм оптимизации разделения: (1) снижение поверхностного заряда капель микроэмульсии за счёт введения неионогенного ПАВ, (2) повышение олеофильности фонового электролита за счёт введения 2-пропанола в качестве модификатора.

В качестве неионогенного ПАВ был выбран Бридж 35. Содержание Бридж 35 в фоновом электролите в концентрации до 0,4% способствует увеличению селективности и существенно уменьшает время миграции водорастворимых витаминов (рис. 12Б, рис. 12В). Однако, дальнейшее повышение концентрации Бридж 35 до 0,8% ухудшает разделение (рис. 12Г, рис. 12Д). В качестве оптимальной выбрана концентрация Бридж 35 0,4%. Для повышения олеофильности фонового электролита в качестве модификатора использовали 2-пропанол. В табл. 6 и табл. 7 показано, что повышение содержания 2-пропанола в микроэмульсин приводит к возрастанию времён миграции водо- и жирорастворимых витаминов из-за возрастания вязкости микроэмульсии и падения потенциала стенок капилляра. Однако, при этом улучшается разделение жирорастворимых витаминов. Наилучшее разделение достигается при концентрации 2-пропанола 10%, которая выбрана в качестве оптимальной при удовлетворительной общей продолжительности анализа.

Таблица 6. Влияние концентрации 2-пропанола на времена миграции водорастворимых витаминов. Условия разделения: мнкроэмульсня состава 2,6% ДДСН, 0,4% Бридж 35, 6,6% 1-бутанола, 0,8% гептана и 25 мМ тетраборатный буферный раствор рН

Таблица 7. Влияние концентрации 2-проиапола на селективность определения жирорастворимых витаминов. Условия разделения: микроэмульсия состава 2,6% ДДСН, 0,4% Бридж 35, 6,6% 1-бутанола, 0,8% гептана и 25 мМ тетраборатный буферный раствор рН 9,2; напряжение 20 кВ

Витамин Времена миграции, мин Витамин Т„/Гт(03)

/2-пропанол 0% 5% 10% /2-пропанол 0% 5% 10%

РР 5,0 7,0 9,9 1,000 1,000 1,000

В6 7,2 11,7 21 Е 1,005 1,008 1,017

С 9,6 16,4 31 Е ацетат 1,004 1,020 1,036

В5 10,2 17,6 более 35 мин к. 1,004 1,019 1,045

Таким образом, в качестве оптимального фонового электролита для одновременного разделения водо- и жирорастворимых витаминов была выбрана МЭ следующего состава: 2,6% ДДСН, 0,4% Бридж 35, 10% 2-пропанола, 6,6% 1-бутанола и 0,8% гептана и 25 мМ тетраборатный буферный раствор с рН 9,2. На рис. 13 представлена электрофореграмма смеси витаминов В6, РР, С, Вь Е, Е ацетат, 03, Кь К3, А.

ед.опт.пл. -103 РР

Рнс. 13. Электрофореграммы смеси витаминов РР, В), Кз, В6, А, С, Из, Е, Е ацетат, К, при 200 им (1) и 270 им (2). Условия разделения: микроэмульсия состава 2,6% ДДСН, 0,4% Бридж 35, 10% 2-пропанола, 6,6% 1-бутанола, 0,8% гептана и 25 мМ тетраборатный буферный раствор рН 9,2; напряжение 22 кВ.

В табл. 8 представлены электрофоретические параметры разделения. Метрологические характеристики предложенного способа разделения представлены в табл. 9. Предложенный способ по многим параметрам (эффективность и время анализа) превосходит ранее предложенные селективные способы определения витаминов методом ВЭЖХ. Аналогов представленного способа в варианте ЭКХ не существует.

Витамин Время миграции, мин а я* N 'Ю"3

РР 8,8 - - 230

В, 9,2 1,04 4,1 180

К, 17,0 1,92 76 270

В6 17,9 1,02 2,6 410

А 28,5 1,60 68 320

С 30,6 1,05 6,8 290

V} 31,8 1,02 2,7 850

Е 32,3 1,02 3,3 630

Е ацетат 32,9 1,02 2,8 550

К, 33,1 1,01 1,2 270

Применение предложенного способа одновременного определения витаминов методом МЭЭКХ имеет ряд особенностей. Для реализации такого одновременного определения существует необходимость использования специального экстрагента, извлекающего витамины обеих групп. Для этой цели использовали рабочую микроэмульсию.

Таблица 9. Воспроизводимость, линейность и пределы обнаружения витаминов (п = 5;

Р = 0,95)

Витамин Эг, % Диапазон линейности, мг/л Стт, МГ/Л

РР 2 1,0-60 0,8

в, 3 0,5-30 0,4

Ко 5 0,2-25 0,2

В6 3 0,5-70 0,5

А 5 0,6-15 0,4

С 10 3-30 2,4

о, 15 0,5-10 0,3

Е 9 0,6-30 0,3

Е ацетат 12 0,5-45 0,2

к, 5 0,4-40 0,4

Дополнительным преимуществом в этом случае являлась близость состава пробы к составу фонового электролита, что позволяло избежать появления системных пиков на электрофреграмме и улучшить эффективность разделения. Помимо этого, применение такого экстрагента позволило существенно упростить пробоподготовку. Отпала необходимость в смене растворителя из-за того, что экстракция жирорастворимых витаминов осуществлялась не гексаном, который рекомендуется для извлечения витаминов в литературе (такой экстракт невозможно использовать для ввода пробы - необходимо его упарить, а остаток перерастворить в другом растворителе, например, в 2-пропаноле или ацетонитриле).

Для оценки полноты извлечения витаминов из блендов было решено использовать экстрагирование водой и метанолом (необходимость применения метанола для извлечения жирорастворимых витаминов из блендов обоснована в литературе). В качестве независимого метода анализа использовали ВЭЖХ.

Разработанный способ одновременного определения витаминов был апробирован на примере анализа серии витаминных блендов (ООО «Электронная медицина», Россия). Результаты определения витаминов в серии блендов представлены в табл. 10.

Марка Характеристика бленда А о3 Е ацетат РР В, в6 С

Найдено в бленде (МЭ+МЭЭКХ), мг/г 0,47±0,08 не обн. 5,4±0,4 3,9±0,3 0,46±0,08 5,3±0,4 58±5

Степень извлечения МЭ, % 78 не обн. 54 98 92 88 97

СЛ О Степень извлечения водой/МеОН, % 0/93 не обн. 0/93 103/15 91/0 93/17 94/0

Содержание по паспорту, мг/г 0,60±0,06 0,01 ±0,001 10,0±0,6 4,0±0,3 0,50±0,04 0,60±0,06 60±4

Найдено в бленде (ВЭЖХ), мг/г 0,57±0,05 0,008±0,003 10,2±0,3 4,0±0,1 0,48±0,05 0,63±0,05 54±1

Найдено в бленде (МЭ+МЭЭКХ), мг/г не содерж. не содерж. 3,4±0,4 3,7±0,3 0,47±0,08 не содерж. 54±5

Степень извлечения МЭ, % не содерж. не содерж. 52 93 94 не содерж. 90

Степень извлечения водой/МеОН, % не содерж. не содерж. 0/88 95/3 95/0 не содерж. 98/0

Содержание по паспорту, мг/г не содерж. не содерж. 6,5±1,5 4,0±0,5 0,5±0,1 не содерж. 60±10

Найдено в бленде (ВЭЖХ), мг/г не содерж. не содерж. 6,1±0,2 4,1 ±0,1 0,5±0,05 не содерж. 58±1

Найдено в бленде (МЭ+МЭЭКХ), мг/г 0,37±0,07 не содерж. 3,6±0,4 не содерж. 0,46±0,08 не содерж. 51 ±5

Степень извлечения МЭ, % 74 не содерж. 51 не содерж. 92 не содерж. 92

« и Степень извлечения водой/МеОН, % 0/87 не содерж. 0/91 не содерж. 91/0 не содерж. 96/0

О Содержание по паспорту, мг/г 0,5±0,1 не содерж. 7±1 не содерж. 0,5±0,1 не содерж. 55±5

Найдено в бленде (ВЭЖХ), мг/г 0,51 ±0,05 не содерж. 7,1 ±0,3 не содерж. 0,51 ±0,05 не содерж. 56±2

Найдено в бленде (МЭ+МЭЭКХ), мг/г 0,33±0,07 не содерж. 4,0±0,4 7,9±0,6 0,38±0,07 0,47±0,08 54±5

оо Степень извлечения МЭ, % 75 не содерж. 55 96 91 92 92

о сч СЛ и Степень извлечения водой/МеОН, % 0/89 не содерж. 0/90 99/0 96/0 98/22 101/0

Содержание по паспорту, мг/г 0,44 не содерж. 7,3 7,9 0,42 0,51 59

Найдено в бленде (ВЭЖХ), мг/г 0,40±0,05 не содерж. 7,1 ±0,3 7,5±0,2 0,45±0,05 0,44±0,05 60±3

не обн. - ниже минимально определяемой концентрации не содерж. - не содержится в бленде

Применение способа одновременного определения витаминов методом МЭЭКХ позволило получить информацию о составе каждого бленда в ходе одного анализа и с применением одного экстрагента, в отличие от метода ВЭЖХ. Применение микроэмульсии для экстракции не позволило достичь полного извлечения витаминов А и Е из блендов. Степень извлечения витамина А составила около 76%, а витамина Е ацетат - 55%. Однако, данная величина является воспроизводимой для всех исследованных блендов и связана, по-видимому, с распределением витамина между микроэмульсией и каолином, который представляет основу бленда. Таким образом, неполная степень извлечения не является мешающим условием для одновременного определения витаминов в данном типе объектов.

Выводы

1. Предложен способ управления селективностью при определении малых заряженных органических молекул путём перехода от КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ к электрокинетической хроматографии с мицеллярными и микроэмульсионными ПЭК в качестве ПСФ.

2. Исследованы закономерности влияния добавок неионогенных полимеров на селективность разделения и величину ККМ для поверхностно-активного вещества в режиме МЭКХ. Показано, что добавка полимера позволяет менять селективность, путём перехода от ион-парного механизма разделения к распределительному.

3. Впервые биконтинуальные микроэмульсии охарактеризованы в качестве псевдостационарных фаз.

4. Установлена лучшая корреляция величины logP серии биогенных аминов и логарифмов коэффициентов удерживания с использованием биконтинуальных микроэмульсий в качестве ПСФ по сравнению МЭКХ и классической МЭЭКХ.

5. Предложен алгоритм подбора условий одновременного разделения веществ, сильно различающихся по гидрофобности в режиме МЭЭКХ.

6. Предложен новый способ одновременного разделения водо- и жирорастворимых витаминов в режиме МЭЭКХ. За 33 минуты достигнуто полное разрешение следующих витаминов и витамерных форм РР, В|, К3, В6, А, С, Dj, Е, Е ацетат и К|. С помощью разработанного способа определения витаминов был проанализирована серия витаминных блендов. Применение микроэмульсии в качестве экстрагента витаминов позволило существенно упростить пробоподготовку, путём удаления трудоёмкой стадии смены растворителя.

Основные результаты диссертации изложены в следующих статьях и тезисах докладов:

1. Svidritskiy Е. Determination of fat soluble vitamins in polyvitamin pills, premixes, fodders and dairy products by HPLC I Pirogov A., Bendryshev A., Svidritskiy E., Shpigun O. // In the book of International conference of Instrumental methods of analysis. Modern trends and application. October 2-6, 2005, Crete, Greece, P. 486.

2. Svidritskiy E. Determination of fat soluble vitamins in polyvitamin pills, premixes, fodders and dairy products by HPLC / Pirogov A., Bendryshev A., Svidritskiy E., Shpigun О. II In the book of ICAS-2006. Chromatography. June 26-30,2006, Moscow, Russia, P. 207.

3. Свидрицкий Е.П. Определение водо- и жирорастворимых витаминов в объектах с различной матрицей / Бендрышев A.A., Пирогов A.B., Свидрицкий Е.П., Пашкова Е.Б., Шпигун O.A. Н Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», Москва. 2007, № 145.

4. Свидрицкий Е.П. Определение жиро- и водорастворимых витаминов в мицеллярных растворах ПАВ / Бендрышев A.A., Пирогов A.B., Свидрицкий Е.П., Пашкова Е.Б., Шпигун O.A. // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях», Москва. 2007, № 146.

5. Свидрицкий Е.П. Применение микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЕЕКС) для разделения смеси водорастворимых и жирорастворимых витаминов. Применение свипинга для он-лайн концентрирования витаминов в режиме МЕЕКС / Свидрицкий Е.П., Пирогов A.B., Бендрышев A.A., Шпигун O.A. // Тезисы

докладов II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», Краснодар. 2007, С.464.

6. Свидрицкий Е.П. Определение витаминов в различных матрицах: проблемы и решения / Свидрицкий Е.П., Бендрышев A.A., Пирогов A.B., Шпигун O.A. // Рефераты докладов II Международного форума «Аналитика и Аналитики», Воронеж. 2008, С.

7. Svidritskiy Е. Comparative study of mono- and bicontinues microemulsion systems without co-surfactants via microemulsion electrokinetic chromatography / Egor Svidritskiy, Zahar Shamsullin, Andrey Pirogov, Oleg Sbpigun. // In the book of MSB-2008. March 9-13, 2008, Berlin, Germany, P. 386.

8. Свидрицкий Е.П. Определение жирорастворимых витаминов в зерновых премиксах, блендах, таблетированных биологически активных добавках и медпрепаратах методом ВЭЖХ / Пирогов A.B., Бендрышев A.A., Свидрицкий Е.П., Шпигун O.A. // Заводская лаборатория. 2008. №3. С. 3-9.

9. Свидрицкий Е.П. Использование добавок полимеров в фоновый электролит в мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) / Свидрицкий Е.П., Услольцев И.А., Шамсуллин З.А., Пирогов A.B., Шпигун O.A. // Тезисы докладов III Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием «Аналитика России», Краснодар. 2009, С. 202.

10. Свидрицкий Е.П. Определение алендронат-иона и ряда неорганических ионов методом капиллярного электрофореза / Свидрицкий Е.П., М.Ш. Цзян, В.И. Ильин, Д.И. Дыньков, Пирогов A.B., Шпигун O.A. // Вестник Моск. ун-та. Химия. 2010. № 1. С. 15-19.

11. Свидрицкий Е.П. Одновременное определение жиро- и водорастворимых витаминов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии / Свидрицкий Е.П., Пашкова Е.Б., Пирогов A.B., Шпигун O.A. // Жури, аналит. химии. 2010. Т.65. № З.С. 1-6.

549.

Заказ №94-а/11/09 Подписано в печать 16.11.2009 Тираж 110 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Список используемых сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Основные свойства растворов ПАВ

1.2 Псевдостационарные фазы в электрокинетической хроматографии

1.2.1 Мицеллярная электрокинетическая хроматография

1.2.2 Микроэмульсионная электрокинетическая хроматография

1.2.3 Полиэлектролитные комплексы, получение и свойства

1.2.4 Влияние полимерных добавок на ККМ ПАВ

1.3 Применение микроэмульсионной электрокинетической хроматографии 38 и ПЭК в химическом анализе

Глава 2. Оборудование, материалы, техника эксперимента

2.1 Оборудование и материалы

2.2 Проведение эксперимента

Глава 3. Синтез и изучение свойств ПЭК

3.1 Разработка подхода к синтезу ПЭК

3.2 Доказательства существования микроэмульсионных ПЭК в растворе

3.3 Микроэмульсионные и мицеллярные ПЭК в электрокинетической 60 хроматографии

Глава 4. МЭКХ в присутствии добавок неионогенных полимеров

4.1 Выбор модельной смеси соединений

4.2 Выбор условий разделения в режиме МЭКХ

4.3 Влияние добавки полимерных модификаторов на разделение 95 модельной смеси

4.4. Сравнение влияния различных модификаторов

Глава 5. Биконтинуальные микроэмульсии как новый тип 112 псевдостационарной фазы

5.1 Четырехкомпонентные микроэмульсии

5.2. Трёхкомпонентные микроэмульсии

5.3. Корреляция параметров удерживания с величиной logP в условиях применения биконтинуальных микроэмульсий в качестве ПСФ

Глава 6. Применение МЭЭКХ для разделения смесей веществ, сильно различающих по гидрофобности, на примере витаминов

6.1 Разделение смеси жирорастворимых витаминов

6.2 Разделение смеси водорастворимых витаминов

6.3 Совместное разделение водо- и жирорастворимых витаминов

6.4 Определение витаминов в пищевых блендах 132 Выводы 135 Литература мээкх

ItANa

ПДАДМА пэк спэк

ТТАБ ЦТАБ ЭКХ

Список используемых сокращений водорастворимые витамины высокоэффективная жидкостная хроматография додецилсульфат натрия додецилтриметиламмоний бромид жирорастворимые витамины капиллярный зонный электрофорез критическая концентрация агрегации критическая концентрация мицеллообразования капиллярный электрофорез масс-спектрометрия микроэмульсия мицеллярная электрокинетическая хроматография микроэмульсионная электрокинетическая хроматография нестехиометрический полиэлектролитный комплекс поверхностно активное вещество полиакриловая кислота полиароматические углеводороды полиакрилат натрия полидиметилдиаллиламмоний полиметакриловая кислота полипропиленгликоль псевдостационарная фаза полиэлектролит полиэтиленгликоль полиэлектролитный комплекс нестехиометрический полиэлектролитный комплекс тетрадецилтриметиламмония бромид цетилтриметиламмония бромид электрокинетическая хроматография эоп электроосмотический поток

CBZ- карбобензокси

РАА полиаллил амины

DNS- дансил

Актуальность темы Электрокинетическая хроматография наравне с ВЭЖХ является достаточно часто используемым аналитическим методом. Высокая эффективность разделения (до 1 ООО ООО теор. тарелок) даёт этому методу серьёзное преимущество по сравнению с ВЭЖХ - возможность одновременного определения десятков и даже сотен соединений за сравнительно небольшое время.

Основной разновидностью электрокинетической хроматографии для разделения нейтральных соединений является мицеллярная электрокинетическая хроматография. Однако, существенное ограничение данного метода — невозможность реализации селективного разделения сильно гидрофобных соединений, сильно солюбилизирующихся мицеллами. Пики гидрофобных соединений остаются неразрешёнными, падает и экспрессность анализа.

Потенциально микроэмульсионная электрокинетическая хроматография позволяет решить проблему разделения гидрофобных соединений за счёт большей олеофильности фонового электролита (что обуславливается сравнительно высоким содержанием спирта-стабилизатора) и за счёт высокой проницаемости для молекул поверхности капли микроэмульсии. Однако работ, посвящённых основам метода микроэмульсионной электрокинетической хроматографии и разработке его практических приложений, ещё мало. Представляется интересным продолжить изучение этого метода в рамках его возможностей для разделения гидрофобных соединений.

Актуальным направлением развития микроэмульсионной электрокинетической хроматографии, как и всей электрокинетической хроматографии, представляется поиск дополнительных возможностей управления селективностью разделения. Необходимо найти способ реализации разделения смесей, при котором малое изменение состава фонового электролита будет приводить к значительному изменению селективности. Одним из решений данной проблемы является поиск новых псевдостационарных фаз.

Представляется интересным разработка способов реализации мицеллярной электрокипетической хроматографии в присутствии небольших количеств поверхностно-активных веществ — концентрации на уровне критической концентрации мицеллообразования и ниже. Снижение концентрации поверхностно-активных веществ в фоновом электролите будет препятствовать уширению полос на электрофореграммах вследствие разогревания фонового электролита.

Цель работы состояла в поиске и изучении новых типов псевдостационарных фаз в электрокинетической хроматографии, а также в поиске новых подходов в управлении селективностью разделения для существующих псевдостационарных фаз.

Достижеиие поставленной цели предусматривало следующие задачи:

• Создание и изучение свойств новых типов псевдостационарных фаз на основе полиэлектролитов - микроэмульсионных полиэлектролитных комплексов.

• Исследование закономерностей влияния неионогепных полимеров на разделение соединений в методе мицеллярной электрокинетической хроматографии. Изучение перспектив применения добавок полимеров для снижения критической концентрации мицеллообразования ПАВ и управления селективностью разделения.

• Создание подходов к применению в электрокинетической хроматографии принципиально новых псевдостационарных фаз — биконтинуальных микроэмульсий (согласно своему строению данные псевдостационарные фазы должны иметь иную селективность по сравнению с «классическими» моноконтинуальными микроэмульсиями).

• Оценка перспектив применения биконтинуальных микроэмульсий для определения величины logP при скрининге веществ на потенциальную биологическую активность.

• Изучение возможности применения микроэмульсионной электрокинетической хроматографии для одновременного разделения гидрофильных и гидрофобных соединений на примере разделения новых классов соединений.

Научная новизна Изучены основные свойства ранее не применявшихся в электрокинетической хроматографии псевдостационарных фаз -биконгинуальных микроэмульсий и микроэмульсионных полиэлектролитных комплексов.

Мицеллярные полиэлектролитные комплексы исследованы в качестве псевдостационарных фаз для разделения новых классов веществ. Выявлено изменение селективности при переходе от режима капиллярного зонного электрофореза к мицеллярным полиэлектролитным комплексам.

Применение добавок неионогенных полимеров в методе мицеллярной электрокинетической хроматографии позволило целенаправленно изменять селективность разделения путём перехода от ион-парного механизма разделения к распределительному. Показано, что добавки полимеров приводят к снижению критической концентрации мицеллообразоватгая ПАВ, что позволяет работать с более низкими концентрациями поверхностно-активных веществ в условиях мицеллярной электрокинетической хроматографии.

Установлены основные закономерности разделения соединений в условиях микроэмульсионной электрокинетической хроматографии с биконтипуальными микроэмульсиями в качестве псевдостационарных фаз. Показано, что корреляции времён миграции и коэффициентов удерживания и logP для серии биогенных аминов при использовании биконтинуальных микроэмульсий оказались выше, чем в режиме мицеллярной и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии с моноконтинуальными микроэмульсиями.

Впервые реализовано одновременное разделение широкой смеси веществ сильно различающихся по гидрофобности методом электрокинетической хроматографии на примере смеси водо- и жирорастворимых витаминов. Практическая значимость Предложены новые способы управления селекгивностью разделения сложных смесей за счёт реализации мицеллярной электрокинетической хроматографии в присутствии полимеров, а также за счёт применения принципиально новых псевдостационарных фаз -полиэлектролитных комплексов.

Предложен способ одновременного определения четырёх водо- и шести жирорастворимых витаминов (никтотинамид (далее РР), С, Вь пиридоксина гидрохлорид (далее Вб), A, D3, Е ацетат, Е, Кь К3) в витаминных блендах методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии. Способ успешно применён для определения состава серии из четырёх витаминных блендов. Применение микроэмульсий в качестве окстрагента витаминов позволило сократить число стадий в процессе пробоподготовки. Исчезла длительная процедура смены растворителя, которая вносит дополнительную погрешность в 10-20% от определяемой концентрации витамина. На защиту выносятся следующие положения:

• Закономерности селективности разделения малых заряженных органических молекул при переходе от режимов капиллярного зонного электрофореза, мицеллярной и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии к мицеллярным и микроэмульсионным полиэлектролитным комплексам в качестве псевдостационарных фаз.

• Способ управления селективностью разделения биологически активных соединений в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии путём добавки неионогенного полимера в фоновый электролит. Данные об изменении селективности и эффективности разделения, а также порядка выхода их пиков на электрофореграммах в зависимости от типа и концентрации добавленного неионогенного полимера.

• Обнаруженные различия в поведении в качестве псевдостационарных фаз между растворами мицелл, моно- и биконтинуальными микроэмульсиями. Зависимости времён миграции для веществ модельной смеси от содержания гептана при переходе от мицеллярных растворов к «классическим» моноконтинуальным микроэмульсиям и биконтинуальным микроэмульсиям.

• Способ предсказания величины logP органических соединений с использованием метода микроэмульсионной электрокинетической хроматографии и биконтинуальных микроэмульсий. Корреляции величин logP для биогенных аминов от логарифмов времён миграции и коэффициентов удерживания в режиме электрокинетической хроматографии с различными псевдостационарными фазами. • Научно-методический подход к подбору оптимальных условий для одновременного разделения веществ, сильно различающихся по гидрофобности, в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии.

Апробация работы Результаты работы докладывались на Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (2007, Москва), Второй всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России 2007» (2007, Краснодар), II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (2008, Воронеж), Международном симпозиуме «Микроразделение» (2008, Берлин, Германия), Международном симпозиуме «Высокоэффективная жидкостная хроматография» (2009, Дрезден, Германия), Московском семинаре по аналитической химии (2009, Москва), Третьей всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России 2009» (2009, Краснодар), научных коллоквиумах лаборатории хроматографии кафедры аналитической химии.

Публикации По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российских журналах и 8 тезисов докладов.

Структура и объём работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 4 глав обсуждения результатов, общих выводов и списка цитируемой литературы. Материал изложен на 149 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков и 30 таблиц, в списке цитируемой литературы 131 источник.

Выводы

1. Предложен способ управления селективностью при определении малых заряженных органических молекул путём перехода от КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ к электрокинетической хроматографии с мицеллярными и микроэмульсионными ПЭК в качестве ПСФ.

2. Исследованы закономерности влияния добавок неионогенных полимеров на селективность разделения и величину ККМ для поверхностно-активного вещества в режиме МЭКХ. Показано, что добавка полимера позволяет менять селективность, путём перехода от ион-парного механизма разделения к распределительному.

3. Впервые биконтинуальные микроэмульсии охарактеризованы в качестве псевдостационарных фаз.

4. Установлена лучшая корреляция величины logP серии биогенных аминов и логарифмов коэффициентов удерживания с использованием биконтинуальных микроэмульсий в качестве ПСФ по сравнению МЭКХ и классической МЭЭКХ.

5. Предложен алгоритм подбора условий одновременного разделения веществ сильно различающихся по гидрофобности в режиме МЭЭКХ.

6. Предложен новый способ одновременного разделения водо- и жирорастворимых витаминов в режиме МЭЭКХ. За 33 минуты достигнуто полное разрешение следующих витаминов и витамерных форм РР, В1, КЗ, Вб, А, С, D3, Е, Е ацетат и К1. С помощью разработанного способа определения витаминов был проанализирована серия витаминных блендов. Применение микроэмульсии в качестве экстрагента витаминов позволило существенно упростить пробоподготовку, путём удаления трудоёмкой стадии смены растворителя.

1. Холмберг К., Йенссон Б., Кронбсрг Б., Линдман Б. Поверхностно-активные вещества и полимеры в водных растворах. Москва. БИНОМ. Лаборатория знаний. 2007. 530 с.

2. Tharwat F. Tadros. Applied surfactants. WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. 2005. 645 p.

3. Fanun M. Microemulsions. Properties and applications. New York. CRC Press. 2009. 568 p.

4. Kumar P. Handbook of microemulsion science and technology. New York. Marcel Dekker. 1999. 849 p.

5. Система капиллярного электрофореза «Капель-103Р». Руководство по эксплуатации. С.-Петербург. ООО «Люмекс». 2001. 99 с.

6. Terabe S., Otsuka К., Itchikawa К. Electrokinetic separations with micellar solutions and open tubular capillaries // Anal. Chem. 1984. V. 56. P. 111-113.

7. Muijselaar P., Otsuka K., Terabe S. Micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography // J.Chromatogr. A. 1997. V.780. №.1-2. P. 41-61.

8. Gottlicher В., Bachmann K. Application of particles as pseudo-stationary phases in electrokinetic chromatography// J.Chromatogr. A. 1997. V.780. №.1-2. P. 63-73.

9. Ram S., Jun X., Ochan O. Application of spherical and other polymers in capillary zone electrophoresis: separation of antiviral drugs and deoxyribonucleoside phosphates by different principles // J. Chromatogr. A. 1996. V. 756. №.1-2. P. 263-277.

10. Armel A., Morteza G., Study of solute partitioning into cationic vesicles of dihexadecyldimethylammonium bromide using electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2003 V. 1004. №.1-2. P. 145-153.

11. Potocek В., Chmela E., Maichel В., Tesarova E., Kenndler E. Gas Capillary Electrokinetic Chromatography with Charged Linear Polymers as a Nonmicellar

12. PseudoStationary Phase: Determination of Capacity Factors and Characterization by Solvation Parameters. // Anal. Chem. 2000. V. 72. P. 74-80.

13. Tanaka N., Nakagawa K., Hosoya K., Palmer C., Nakajima T. Control of migration time window and selectivity in electrokinetic chromatography with mixed polymeric pseudostationary phases. //J. Chromatogr. A. 1998. V. 802. №.1. P. 23-33.

14. Peterson D., Palmer C. Alkyl modified anionic siloxanes as pseudostationary phases for electrokinetic chromatography. Synthesis and characterization // J. Chromatogr. A. 2001. V. 924. №.1-2. P. 103-110.

15. Peterson D., Palmer C. Novel alkyl-modified anionic siloxanes as pseudo-stationary phases for electrokinetic chromatography. Performance in organic-modified buffers. // J. Chromatogr. A. 2002 V. 959. №.1-2. P. 255-261.

16. Wang S., Chen W. Detennination of p-aminobenzoates and cinnamate in cosmetic matrix by supercritical fluid extraction and micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. A. 2000. V. 416. №.2. P. 157-167.

17. Watanabe Т., Terabe S. Analysis of natural food pigments by capillary electrophoresis //J. Chromatogr. A. 2000. V. 880. №.1-2. P. 311-322.

18. Watanabe Т., Terabe S. Applications of in-capillary reaction micellar electrokinetic chromatography in the food industry // J. Chromatogr. A. 2000. V. 880. №.1-2. P. 295301.

19. Hu S., Haddad P. Micellar electrokinetic capillary chromatographic separation and fluorescent detection of amino acids derivatized with 4-fluoro-7-nitro-2,l,3-benzoxadiazole // J. Chromatogr. A. 2000. V. 876. №.1-2. P. 183-191.

20. Gaillon L., Cozette S., Lelievre J., Gaboriaud R. New pseudo-stationary phases for electrokinetic capillary chromatography. Complexes between bovine serum albumin and sodium dodecyl sulfate // J. Chromatogr. A. 2000. V. 876. №.1-2. P. 169-182.

21. Altria K.D. Background theory and applications of microemulsion electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2000. V. 892. №.1-2. P. 171-186.

22. Watarai H. Microemulsion in separation science // J. Chromatorg. A. 1997. V. 780. №.1-2. P. 93-102.

23. Klampfl Ch. W., Solvent effect in microemulsion electrokinetic chromatography // Electrophoresis. 2003. V. 24. P. 1537-1543.

24. Shelton C., Koch J., Desai N., Wheeler J. Enhanced selectivity for capillary zone electrophoresis using ion-pair agents // J. Chromatogr. A. 1997. V. 792. №.1-2. P. 455462.

25. Janini G., Muschik J., Issaq H. Micellar electrokinetic chromatography in zero-electroosmotic flow environment//J. Chromatogr. B. 1996. V. 683 №.1. P. 29-35.

26. Furumoto Т., Sekiguchi M., Sugiyama Т., Watarai H. Migration mechanism of bases and nucleosides in oil-in-water microemulsion capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 3438-3443.

27. Terabe S., Matsubara N., Ishihama Y., Okada Y. Microemulsion electrokinetic chromatography: comparison with micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 1992. V. 608. №.1-2. P. 23-29.

28. Hancen S., Gbal-Jensen C., El-Sherbiny D., Pedersen-Bjergaard S. Microemulsion electrokinetic chromatography or solvent modified micellar electrokinetic chromatography// Trends in Anal. Chem. 2001. V. 20. P. 614-619.

29. Goddard E.D. Interactions of surfactants with polymers and proteins. Florida. CRC Press. 1990. 289 p.

30. Харенко O.A., Харенко A.B., Калюжная P.M., Изумрудов B.A., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Нестехиометричные полиэлектролитные комплексы новые водорастворимые макромолекулярные соединения // Высокомолек. Соед., 1979. Т. XXI. Ж12. С.2719-2724.

31. Касаикин В.А., Литманович Е.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Самоорганизация мицеллярной фазы при связывании додецилсульфата натрия полидиаллилдиметиламмоний хлоридом в разбавленном водном растворе // ДАН. Физ. Химия. 1999. Т. 367. № 3. С. 359-362.

32. Ибрагимова З.Х., Касаикин В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Нестехиометрические полиэлектролитные комплексы полиакриловой кислоты и катионных поверхностно-активных веществ // Высокомолек. соед. 1986. Т. 28. С. 1640-1646.

33. Kasaikin V.A., Zakharova J.A., Self-organization in complexes of polyacids with oppositely charged surfactants // Colloids and surfaces. 1999. V. 147. P. 107-114.

34. Beyer P., Nordmeier Е. Ultracentrifugation, viscometry, рН, and dynamic light scattering studies of the complexation of ionene with poly(acrylic acid) and poly(methacrylic acid) // European Polymer J. 1999. V. 35. P. 1351-1365.

35. Kuhn P.S., Levin Y., Barbosa M.C. Complex formation between polyelectrolytes and ionic surfactants // Chem. Phys. Lett. 1998. V. 298. P. 51-56.

36. Kochanowski A., Witek E., Bortel E. Wholly water-soluble interpolymer complexes formed by interaction of strong anionic and cationic poly electrolytes. // J. Macromolec. Sci. 2003. Y. A40. № 5. P. 449-460.

37. Bokias G., Staikos G. A quantitative description of the viscometric behaviour of partially neutralized poly(acrylic acid) in aqueous solutions studied by the isoionic dilution method // Polymer. 1995. V. 36. № 10. P. 2079-2082.

38. Huglin M.B., Webster L. Complex formation between poly(4-vinylpyridinium chloride) and polysodium(2-acrylamido-2-methyl propane sulfonate). in dilute aqueous solution // Polymer. 1996. V. 37. № 7. P. 1211-1215.

39. Харенко O.A., Касаикин B.A., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Нестехиометричпые полиэлектролитные комплексы — новые водорастворимые макромолекулярные соединения // Высокомолек. соед. А. 1979. Т. 21. № 12. С. 2719-2735.

40. Зезин А.Б., Касаикин В.А., Кабанов В.А., Харенко О.А. Влияние соотношения степеней полимеризации компонентов на образование нестехиометричных поликомплексов // Высокомолек. соед. А. 1984. Т. 26. № 7. С. 1519-1527.

41. Scheutjens J.M., Fleer G. Statistical theory of the adsorption of interacting chain molecules. II. Train, loop and tail size distribution. // J. Phys. Chem. 1980. V. 84. P. 178-188.

42. Shpak A., Pirogov A., Shpigun O. Micellar electrokinetic chromatography with polyelectrolyte complexes as micellar pseudo-stationary phases. // J. Chromatogr. B. 2004. V. 800. №.1-2. P. 91-100.

43. Пирогов A.B. Полиэлектролитные комплексы в ионной хроматографии и капиллярном электрофорезе. Диссертация на соискание ученой степени доктора химических наук // Москва. 2007.

44. Свидрицкий Е.П., М.Ш. Цзян, В.И. Ильин, Д.И. Дыньков, Пирогов А.В., Шпигун О.А. Определение алендронат-иона и ряда неорганических ионов методом капиллярного электрофореза // Вестник Московского Университета. Химия. 2010. №1. С 15-19.

45. Lange Н. Interactions of sodium alkyl sulfate and poly(vinylpyrrolidinone) in aqueous solutions // Kolloid Z. Z. Polym. 1971. V. 243. № 1. P. 101-106.

46. Nagarajan R. Polymer-surfactant interactions. Fort-Myers. 2001. 19 p.

47. Ахмедов К.С., Арипов Э.А., Вирская Г.М. Водорастворимые полимеры и их взаимодействие с дисперсными системами. Ташкент. 1969. 250 с.

48. Kwak J.C.T. Polymer-surfactant systems. New York. 1998. 482 p.

49. Goddard E.D., Ananthapadhmanabhan K.P. Interactions of surfactants with polymers and proteins. New York. Boca Raton. 1993. 448 p.

50. Goddard E.D. Polymer-surfactant interaction, part I: Uncharged wa-ter-soluble polymers and charged surfactants // Coll. and Surf. 1986. V. 19. № 2-3. P. 255-300.

51. Cabane В. Duplessix R. Organization of surfactant micelles ad-sorbed on a polymer molecule in water: a neutron scattering study // J. Phys. France. 1982. V. 43. № 1. P. 1529-1542.

52. Энгельгардт X. Руководство по капиллярному электрофорезу / под ред. Волощука A.M. Научный совет российской академии наук по хроматографии. Москва. 1995. 111 с.

53. Kaniansky D., Masar М., Marak J., Bodor R. Capillary electrophoresis of inorganic anions //J. Chromatogr. A 1999. V. 834. P. 133-178.

54. Lunte S.M., Radzik D.M. Pharmaceutical and Biomedical Applications of Capillary Electrophoresis, Progress in Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Oxford. Pergamon Press. 1996. 502 p.

55. Altria K.D., Kelly M.A., Clark B.J. Current applications in the analysis of pharmaceuticals by capillary electrophoresis. II // Trends in Analytical Chemistry. 1998. V. 17. №4. P. 214-226.

56. Thormann W., Caslavska J. Capillary electrophoresis in drug analysis // Electrophoresis. 1998. V. 19. №16-17. P. 2691-2694.

57. Fanali S. Editorial // Electrophoresis. 1997. V. 18. №6. P. 841-842.

58. Strege M.A., Lagu A.L. Capillary electrophoresis of biotechnology-derived proteins // Electrophoresis. 1997. V. 18. P. 2343-2352.

59. Righetti P.G., Bossi A. Isoelectric focusing of proteins and peptides in gel slabs and in capillaries // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 372. P. 1-19.

60. Slater G.W., Kist T.B.L., Ren H.J., Drouin G. Recent developments in DNA electrophoretic separations//Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 1525-1541.

61. Perrett D. Capillary electrophoresis in clinical chemistry // Ann. Clin. Biochem. 1999. V. 36. P. 133-150.

62. Elgstoen K.B.P., Gislefoss R., Jellum E. Recent advances in the clinical applications of capillary electrophoresis // Chromatographia. 1999. V. 49. P. S79.

63. Maurer H.H. Liquid chromatography-mass spectrometry in forensic and clinical toxicology // J. Chromatogr. B. 1998. V. 713. P. 3-25.

64. Pedersen-Bjergaard S., Gabel-Jensen C., Hansen S.H. Selectivity in microemulsion electrokinetic chromatography// J. Chromatogr. A. 2000. V. 897. P. 375-381.

65. Mrestani Y., El-Mokdad N., Ruettinger H.H., Neubert R.H.H. Characterization of partitioning behavior of cephalosporins using microemulsion and micellar electrokinetic chromatography// Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 2895-2899.

66. Boso R.L., Bellini M.S., Miksik I., Deyl Z. Microemulsion electrokinetic chromatography with different organic modifiers: separation of water- and lipid-soluble vitamins // J. Chromatogr. A. 1995. V. 709. P. 11-19.

67. Altria K.D. Application of microemulsion electrokinetic chromatography to the analysis of a wide range of pharmaceuticals and excipients // J. Chromatogr. A. 1999. V. 844. P. 371-386.

68. Pedersen-Bjergaard S., Nass 0., Moestue S., Rasmusen K.E. Microemulsion electrokinetic chromatography in suppressed electroosmotic flow environment: Separation of fat-soluble vitamins // J. Chromatogr. A. 2000. V. 876. P. 201-211.

69. Sanchez J.M., Salvado V. Comparison of micellar and microemulsion electrokinetic chromatography for the analysis of water- and fat-soluble vitamins // J. Chromatogr. A. 2002. V. 950. P. 241-247.

70. Hansen S.H. Recent applications of microemulsion electrokinetic chromatography // Electrophoresis. 2003. V. 24. P. 3900.

71. Lange J., Thomas K., Wittmann C. Comparison of a capillary electrophoresis method with high-performance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples // J. Chromatogr. B. 2002. V. 779. №.2. P. 229-239.

72. Namera A., Yashiki M., Nishida M., Kojima T. Direct extract derivatization for determination of amino acids in human urine by gas chromatography and mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2002. V. 776. №.1. P. 49-55.

73. D'Hulst A., Verbeke N. Carbohydrates as chiral selectors for capillary electrophoresis // Enantiomer. 1997. V.2. P. 69-70.

74. Cole R.O., Sepaniak M J., Hinze W.L., Gorse J., Oldiges K. Bile salt surfactants in micellar electrokinetic capillary chromatography : Application to hydrophobic molecule separations // J. Chromatogr. 1991. V. 557. P. 113-123.

75. Kuhr W.G., Monning C.A. Capillary Electrophoresis // Anal. Chem. 1992. V. 64. P. 389R-407R.

76. Otsuka K., Terabe S., Ando T. Electrokinetic chromatography with micellar solutions: Retention behaviour and separation of chlorinated phenols // J. Chromatogr. 1985. V. 348. P. 39-47.

77. Miksik I., Gabriel J., Deyl Z. Microemulsion electrokinetic chromatography of diphenylhydrazones of dicarbonyl sugars // J. Chromatogr. A. 1997. V. 772. №.1-2. P. 297-303.

78. Krissmann U., Kleibohmer W. Separation of hydroxylated polycyclic aromatic. 1997. V. 774. №.1-2. P. 193-201.

79. Siren H., Karttunen A. Microemulsion electrokinetic chromatographic analysis of some polar compounds // J. Chromatogr. B. 2003. V. 783. P. 113-124.

80. Pomponio R., Gotti R., Luppi В., Cavrini V. Microemulsion electrokinetic chromatography for the analysis of green tea catechins: Effect of the cosurfactant on the separation selectivity // Electrophoresis. 2003. V. 24. P. 1658-1667.

81. ГанжаО.В. Новые возможности мицеллярной и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии при определении катехинов и катехоламинов в природных объектах // Санкт-петербург. 2007.

82. Fogarty В., Dempsey E., Regan F. Potential of microemulsion electrokinetic chromatography for the separation of priority endocrine disrupting compounds // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1014. P. 129-139.

83. Puig P., Borull F., Aguilar C., Calull M. Sample stacking for the analysis of penicillins by microemulsion electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. B. 2006. V. 831. P. 196-204.

84. Hansen S.H., Sheribah Z.A. Comparison of CZE, MEKC, MEEKC and nonaqueous capillary electrophoresis for the determination of impurities in bromazepam // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 39. P. 322-327.

85. Pomponio R., Gotti R., Fiori J., Cavrini V. Microemulsion electrokinetic chromatography of corticosteroids: Effect of surfactants and cyclodextrins on the separation selectivity// J. Chromatogr. A. 2005. V. 1081. P. 24-30.

86. Broderick M.F., Donegan S., Power J., Altria K.D. Optimisation and use of water-in-oil MEEKC in pharmaceutical analysis // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 37. P. 877-884.

87. Okamoto H., Nakajima Т., Ito Y. et al. Simultaneous determination of ingredients in a cold medicine by cyclodextrin-modified microemulsion electrokinetic chromatography // J. Pharm. Biomed. Anal. 2005. V. 37. P. 517-528.

88. Aurora-Prado M.S., Silva C.A., Tavares M.F.M., Altria K.D. Determination of folic acid in tablets by microemulsion electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1051. P. 291-296.

89. Puig P., Borull F., Aguilar C., Calull M. Strategies for Analyzing Cephalosporins by Microemulsion Electrokinetic Chromatography // Chromatographia. 2005. V. 62. P. 603-610.

90. Harang V., Jacobsson S.P., Westerlund D. Microemulsion electrokinetic chromatography of drugs varying in charge and hydrophobicity Part II: Strategies for optimization of separation// Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 1792-1809.

91. Mertzman M.D., Foley J.P. Comparison of dodecoxycarbonylvaline microemulsion, solvent-modified micellar and micellar pseudostationary phases for the chiral analysis of pharmaceutical compounds // Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 41534163.

92. Chang L.C., Chang H.T., Sun S.W. Cyclodextrin-modified microemulsion electrokinetic chromatography for separation of a-, y-, 5-tocopherol and a-tocopherol acetate // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1110. P. 227-234.

93. Seelanan P., Srisa-art M., Petsom A., Nhujak T. Determination of avermectins in commercial fonnulations using microemulsion electrokinetic chromatography // Anal. Chim. Acta. 2006. V. 570. P. 8-14.

94. Huang H.Y., Chiu C.W., Chen Y.C., Yeh J.M. Comparison of microemulsion electrokinetic chromatography and micellar electrokinetic chromatography as methods for the analysis of ten benzophenones // Electrophoresis. 2005. V. 26. P. 895-902.

95. McEvoy E., Marsh A., Altria K., Donegan S., Power J. Recent advances in the development and application of microemulsion EKC // Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 193-207.

96. Klampfi C. W., Leitner Т., Hilder E. Development and optimization of an analytical method for the determination of UV filters in suntan lotions based on microemulsion electrokinetic chromatography // Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 24242429.

97. Nishi H. Pharmaceutical applications of micelles in chromatography and electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1997. V. 780. P. 243-264.

98. Muijselaar P.G. Retention indices in micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. V. 780. P. 117-127.

99. Nishi H., Terabe S. Micellar electrokinetic chromatography. Perspectives in drug analysis // J. Chromatogr. A. 1996. V. 735. P. 3-27.

100. Flook K.J., Cameron N.R., Wren S.A.C. Polymerised bicontinuous microemulsions as stationary phases for capillary electrochromatography: Effect of pore size on chromatographic performance // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1044. P. 245-252.

101. Jia Z., Mei L., Lin F., Huang S., Killion R.B. Screening of octanol-water partition coefficients for pharmaceuticals by pressure-assisted microemulsion electrokinetic chromatography// J. Chromatogr. A. 2003. V. 1007. P. 203-208.

102. Watarai H. Microemulsion Capillary Electrophoresis // Chem. Lett. 1991. P. 391394.

103. Mahuzier P.E., Altria K.D., Clark B.J. Selective and quantitative analysis of 4-hydroxybenzoate preservatives by microemulsion electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2001. V. 924. P. 465-470.

104. Huie C. Recent applications of microemulsion electrokinetic chromatography // Electrophoresis. 2006. V. 27. P. 60-75.

105. Poole S.K., Durham D., Kibbey C. Rapid method for estimating the ocatanol-water partition coefficient (log Pow) by microemulsion electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. B. 2000. V. 745. P. 117-126.

106. Friberg S.E., Bothorel P. Microemulsions: Structure and Dynamics. Florida. CRC Press LLC, Boca Raton. 1987. p. 119.

107. Altria K.D., Mahuzier P.E., Clark B.J. Background and operating parameters in microemulsion electrokinetic chromatography // Electrophoresis. 2003. V. 24. P. 315324.

108. Шпак А.В. Полиэлектролитные комплексы как новый тип псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук // Москва. 2005.

109. Kern С. J., Antoshkiw Т., Maiese М. R. p-Aminobenzoic acid and its sodium salt // Anal. Chem. 1948. V. 20. № 10. P. 919-922.

110. Stedry M., Jaros M., Hruska V., Gas B. Eigenmobilities in background electrolytes for capillary zone electrophoresis: III. Linear theory of electromigration // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 3071-3079.

111. Sangster J. Octanol-water partition coefficients of simple organic compounds // J. Phys. Chem. Ref. Data. 1989. V. 18. P. 1111-1229.

112. Shiu W.Y., Wania F., Hung H., Mackay D. Temperature Dependence of Aqueous Solubility of Selected Chlorobenzenes, Polychlorinated Biphenyls, and Dibenzofuran // J. Chem. Eng. Data. 1997. V. 42. №2. P. 293-297.

113. Hansch С., Leo A.J. Substituent constants for correlation analysis in chemistry and biology. New York. Wiley. 1979. p. 339.

114. Lentzen H., Philippu A. Physico-chemical properties of phenethylamines and their uptake into synaptic vesicles of the caudate nucleus // Biochem. pharmacol. 1981. V. 30. №13. P. 1759-1764.

115. Katayama M., Yamomoto M., Kobayashi S., Oguchi K., Yasuhara H. Comparative lipophilicities of substrates of monoamine oxidase // J. Pharm. Pharmacol. 1986. V. 38. №5. P. 382-384.

116. Свидрицкий Е.П., Пашкова Е.Б., Пирогов A.B., Шпигуп О.А. Одновременное определение жиро- и водорастворимых витаминов методом микроэмульсионной элсктрокинетической хроматографии // Журн. аиалит. химии. 2010. Т. 65. № 3. С. 1-6.

117. Eitenmiller R.R., Landen W.O. Vitamin analysis for the health and food sciences. New York. CRC Press LLC, Boca Raton. 2000. p. 518.

118. Leenheer А.Р., Lambert W.E., Van Bocxlaer J.F. ed. by. Modern Chromatographic analysis of vitamins. New York. Marcel Dekker. 2000. p. 616.

119. Пирогов A.B., Бендрышев A.A., Свидрицкий Е.П., Шпигун О.А. Определение жирорастворимых витаминов в зерновых премиксах, блендах, таблетированных биологически активных добавках и медпрепаратах методом ВЭЖХ // Завод, лабор. 2008. Т. 74. №.3. С. 3-9.