Влияние организованных сред на хроматографическое и электрофоретическое определение лекарственных препаратов с использованием on-line концентрирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ
|
Стрельникова, Елена Геннадьевна
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Санкт-Петербург
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2006
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.02
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
Санкт-Петербургский государственный университет
На правах рукописи
СТРЕЛЬНИКОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА
ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕД НА ХРОМАТОГРАФ ИЧЕСКОЕ
И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ON-LINE КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ
Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Санкт-Петербург 2006
Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в НИО Лабораторной диагностики Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования.
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор Карцева Людмила Алексеевна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Калинкин Игорь Петрович
доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич
Ведущая организация:
Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова
Защита состоится^РкТЛ-^Л- 2006 г. в 15.00 ч.
на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 1990034 Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43.
Большая химическая аудитория
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.
Автореферат разослан Л/ ¿¿¿¿¿ТЛ^А* 2006 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета «фдл^? ^ /А.Г. Папсуева/
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ
Актуальность проблемы
Контроль остаточного содержания лекарственных препаратов в биологических жидкостях крайне важен при оценке эффективности проводимой лекарственной терапии. Одновременное определение стероидов эндо- (кортизол, кортизон, 11-дегидрокортикостерон, кортикостерон, 11 -дезоксикортикостерон, 11-дезоксикортизол) и экзогенного (преднизалон, дексаметазон, кортинефф, кортизон ацетат) происхождения позволяет обсудить причину нарушения стероидогенеза при различных эндокринных патологиях. Анализ нестероидных лекарственных средств, применяемых с терапевтическими целями, способствует выявлению оптимальной дозы для конкретного пациента. Имеющиеся публикации в этом направлении носят разрозненный характер.
Дтя обнаружения стероидных гормонов в биологических жидкостях наибольшее распространение получили хроматографические и иммунологические методы. Последние имеют принципиальные ограничения: за один аналитический цикл можно определять лишь одно соединение.
Перспективным для решения поставленной задачи, наряду с ВЭЖХ, мог бы оказаться метод капиллярного электрофореза, эффективность которого значительно выше. При этом низкая чувствительность УФ-детектирования метода КЭ затрудняет определение остаточных лекарств в реальных биологических объектах. Подобие химических структур природных и лекарственных стероидов обуславливает близость их хро матографи ч еских и электрофоретических характеристик, и, как следствие, недостаточную селективность разделения этих соединений. Задача одновременного определения стероидных гормонов эндо- и экзогенной природы до сих пор не решена.
Снижения пределов обнаружения определяемых компонентов можно было бы достичь при использовании различных вариантов on-line концентрирования, а увеличения селективности разделения - введением в состав элюента или рабочего буфера так называемых организованных сред с жесткой и нежесткой структурами (циклодекстринов, краун-эфиров, цикламов, мицелл ПАВ и др.).
Термин «организованные среды» в последние годы широко используется и является ключевым понятием супрамолекулярной химии, в основе которой — образование комплексов по типу «гость-хозяин» с участием невалентных взаимодействий.
Работа поддержана конкурсным центром фундаментального естествознания (гранты АСП-303307 и М06-2.5К-119) и грантом 2005 года «Развитие научного потенциала высшей школы».
Цель работы; получить оценочные характеристики методов хроматографического и электрофоретического определения остаточных лекарственных препаратов в
з
биологических жидкостях с использованием комплексообразующих агентов (в составе подвижной фазы и рабочего буфера) и различных вариантов on-line концентрирования.
В связи с постатейной целью необходимо быяо решить следующие задачи:
1. На модельных смесях соединений (природные и синтетические стероиды), близких по химической структуре, установить закономерности их одновременного хроматографического (ОФ ВЭЖХ, ВЭ'ГСХ) и электрофоретического (КЗЭ и МЭКХ) определения.
2. Выявить влияние мицелл и комплексообразующих агентов ф-циклодекстрин (Р-ЦД), сульфо-р-циклодекстрин, 4,13-диаза-18-краун-6, циклам) на эффективность и селективность разделения стероидов эндо- и экзогенной природы.
3. Предложить физико-химическую модель и основные количественные соотношения, описывающие процессы комплексообразования в системе комтексообразукнций агент -лекарственный препарат,
4. Отработать процедуру профподготовки и выяснить возможности on-line концентрирования для снижения предела обнаружения.
5. Предложить схемы хроматографического и электрофоретического определения лекарств стероидной и нестероидной природы в реальных биологических объектах (моча, сыворотка крови).
В процессе выполнения работы использовались: высокоэффективная жидкостная и тонкослойная хроматография, включая мицаллярный вариант; капиллярный зонный электрофорез и мицеллярная электрокинетическая хроматография, а также времяпролетная масс-спектрометрия.
IIдумная новизна
Установлены закономерности хроматографического и электрофоретического разделения и определения эндо- и экзогенных кортикостероидов, а также нестероидных противовоспалительных средств различной природы, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий разделения сложных смесей этих соединений в режиме ОФ ВЭЖХ, капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).
Обнаружено влияние организованных сред (мицелл ДДСН, р-ЦД, сульфо-р-ЦЦ, 4,13-диаза-18-краун-6, циклама, мочевины) неэффективность и селективность разделения при электрофоретическом и хроматографическом определении с УФ-детектированием природных стероидных гормонов и синтетических стероидных лекарственных средств, а также нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВС).
Проведена количественная оценка комплексообразования стероидных лекарственных препаратов с Р-ЦД в режимах ОФ ВЭЖХ и КЗЭ и показано, что, несмотря
на большую гидрофобность дексаметазона, устойчивость его комплекса из-за стерических препятствий наименьшая.
Изучены возможности on-line концентрирования (стэкинга и свипинга) кортикостероидов в режимах зонного и мицеллярного капиллярного электрофореза, позволивших снизить пределы обнаружения определяемых компонентов в 25 - 200 раз.
Разработаны варианты миделлярной ОФ ВЭЖХ (с УФ-детектированием) и мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (с денситометрическим детектированием) для одновременного количественного определения эндо- и экзогенных кортикостероидов.
Практическая значимость работы
Предложены варианты электрофоретического определения с УФ-детектированием природных и синтетических кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных препаратов в сыворотке крови и моче.
Показана возможность определения кортикостероидов в реальных объектах (моча, сыворотка крови) методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с использованием on-line и off-line концентрирования.
Предложены способы определения экзо- и эндогенных кортикостероидов методом мицеллярной ВЭТСХ с использованием водного и водно-органического (ацетонитрил, диэтиловый эфир) растворов додецилсульфата натрия (ДЦСН).
Установлена возможность выявления различных заболеваний коры надпочечников и оценки эффективности проводимой лекарственной терапии посредством хроматографического и электрофоретического анализа биологических жидкостей.
Результаты работы используются НИИ Эндокринологии Санкт-Петербургской Медицинской академии последипломного образования для выявления различных эндокринных заболеваний (врожденная гиперплазия коры надпочечников, синдром Иценко-Кушинга, рак коры надпочечников, альдостерома) и выбора оптимальной лекарственной терапии и контроля за ней.
Положения, выносимые на защиту 1. Результаты исследования влияния органических растворителей (метанол, диметилсульфоксид) и компонентов организованных сред (ПАВ - додецилсульфат натрия, p-циклодекстрин, су льфо-р-ци кл одекстри н, 1,4,8,11-тетраазациклогетра-декан, 4,13-диаза-18-краун-6, мочевина) в качестве составляющих рабочего буфера, на эффективность и селективность электрофоретического и хроматографического разделения природных стероидных гормонов и синтетических стероидных лекарств в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).
2. Данные о влиянии добавок комплексообразующих агентов (ß-циклодексгрин, сульфо-р-циююдекстрин, 4,13-д и аза-18-крау н-6) в составе буферного электролита на электрофоретические характеристики нестероидных противовоспалительных средств.
3. Пробоподготовка биологических жидкостей (сыворотки крови и мочи) при определении кортикостероидов (преднизолон, дексаметазон, кортинефф, кортизон ацетат) и нестероидных противовоспалительных средств (аспирин, парацетамол) хр о матограф нч еск им и и электрофоретическими методами с использованием твердофазной и жидкостной экстракций.
4. Способы on-line концентрирования (стэкинг с обращенно-мигрируювдими мицеллами; стэкинг с усилением поля при вводе с обращен но-мигри ру ю щи ми мицеллами; стэкинг с высокопроводящей матрицей; свипинг; свипинг с добавкой мочевины или ß-ЦД в матрицу пробы) для снижения предела обнаружения эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).
5. Обоснование возможностей и преимуществ классического и мицеллярного вариантов ВЭТСХ-разделения эндо- и экзогенных кортикостероидов, а также нестерондных противовоспалительных средств.
6. Практическое приложение выявленных закономерностей:
- изучение особенностей стероидогенеза больных с компенсацией, декомпенсацией и передозировкой лекарственными препаратами;
- сопоставление возможностей и ограничений определения кортикостероидов в биологических жидкостях с использованием хроматографических и электрофоретических методов.
Публикации и апробация работы Материалы диссертации опубликованы в 3 статьях и 22 тезисах докладов. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (2002, Москва); Первой международной медицинской конференции «Высокие медицинские технологии XXI века» (2002, Бенидорм, Испания); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (2003, Москва); Менделеевском съезде (2003, Казань); Конференции «Врачи мира пациентам» (2003, Санкт-Петербург); III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нейроэндокринологии» (2003, Москва); 22 Всемирном Конгрессе «Pathology Laboratory Medicine» (2003, Бусан, Корея); Il между народи ом конгрессе «Современные медицинские технологии XXI века» (2003, Бенидорм, Испания); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы» (2004, Москва); XXIXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" (2005, Katowice-Szczyrk, Poland); II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» (2005, Краснодар, Россия); 29th Int. Symposium on Capillary Chromatography (2006, Riva del Garda, Italy); Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные
6
вопросы клинической и экспериментальной медицины» (2006, Санкт-Петербург, Россия); конференции «Современные диагностические и лечебные технологии в многопрофильной клинике» (2006, Санкт-Петербург, Россия); ХХХЛ Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" (2006t Katowice-Szczyrk, Poland); 6th Int. Symposium on Separations in BioSciencies (2006, Moscow, Russia).
Структура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав с обсуждением полученных результатов, экспериментальной части, практического применения, приложения, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (165 наименований). Работа изложена на 223 страницах машинописного текста, содержит 2 схемы, 32 таблицы и 91 рисунох,
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во Введении дано обоснование аюуалъности темы и сформулированы цели исследования. Отмечена перспективность использования методов капиллярного электрофореза, жидкостной и высокоэффективной тонкослойной хромагографий при определении экзо- и эндогенных кортикостероидов, нестероидных противовоспалительных препаратов и необходимость одновременного определения природных и синтетических стероидов в моче и сыворотке крови при проведении лекарственной терапии.
1-я глава (Обзор литературных данных) включает разделы, обсуждающие общие сведения о лекарственных стероидных гормонах коры надпочечников, их природных аналогах, нестероидных противовоспалительных средствах; физико-химических методах исследования (иммунологических, хроматограф ических и электрофоретических); макроциклических агентах, используемых в хроматографии и капиллярном электрофорезе при анализе реальных объектов; пробоподготовку биологических жидкостей.
Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов н методов исследования.
В 3-й главе предметом обсу ждения является оптимизация хроматографического и электрофоретического разделения эндо- и экзогенных кортикостероидов (рис. 1) при определении их методами МЭКХ и КЗЭ, ОФ ВЭЖХ и ВЭТСХ с УФ-детектированием. Использование компонентов организованных сред (ПАВ - додецилсульфат натрия,
мочевина, p-циклодекстрин, су льфо-р-ц иклодекстрин, циклам, 4,13-диаза-18-краун-6), в
составе подвижной фазы или буферного электролита привело к увеличению
селективности разделения эндо- и экзогенных стероидов при их одновременном
хроматографическом и электрофоретическом определении.
Рнс.1. Стр> ктуры стероидов
Так, введение заряженных циклодекстринов (сульфо-р-ЦД) в состав рабочего буфера позволило определять нейтральные стероиды в зонном варианте, а добавка ПАВ, формирующих дополнительную мицеллярную фазу в режиме жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза повлияла на селективность разделения (рис. 2).
а)
ОЙОЛ- ОН
эоп
обоз- рн
обоз-
ЭОП
б)
С12Н25050з"Ма+
ККМ = 8,3 мМ Концентрация ПАВ > ККМ
Подвижная \ АГдл(.'
фаза , | —^Миасяла*
^Неподвижная", фаза :
Рис. 2. Влияние добавок организованных сред в подвижную фазу или буферный электролит: а) заряженного сульфо-р-цикл од екстрина, б) мицелл ПАВ на электрофоретические и хро матографические характеристики аналитов
Первый этап исследования включал оптимизацию хроматографического определения стероидных лекарств.
Введение мицелл ДДСН в подвижную фазу привело к разделению синтетического лекарственного препарата - дексамстазона и природного стероидного гормона - 11-де-
гидрокортикостерона. Однако для другой пары гормон-синтетический стероид (кортизол/преднизолон) этого достичь не удалось (рис. 3).
Более успешным оказалось использование в составе подвижной фазы макроцикла с каркасной структурой - р-цикл одекстрина, позволившего полностью отделить лекарственные препараты от природных гормонов и при этом сократить в 2 раза общее время анализа.
Максимальное значение, рассчитанной по (1) константы комплексообразования в системе р-циклодекстрин-стероидный гормон получено для наиболее гидрофильного анагата - преднизолона; минимальное - для дексамегазона (табл. 1).
........................11.1:
Рис. 3. Влияние добавок организованных сред на хроматограф« час кое определение эндо- и экзогенных кортикостероидов: а) подвижная фаза: ацеггонитрил:вода (29:71, по объему), б) добавка 8 мМ Р-ЦД, в) добавка 15 мМ ДДСН, где Р - киртшоя, Е -кортизон, А - 11-дегидро-кортикостерон, В — кортико-стерон, Р1 - преднизалон, ВЕХ ~ дексачетазон, Е-ас - кортизон ацетат, Со/Т - кортинефф
1 _[СР]К + 1
к4 ко ко
(1),
где к'о - фактор емкости определяемого компонента в отсутствие макроцикла; к* -фактор емкости определяемого компонента в присутствии макроцикла; К - константа комплексообразования; [СО] - концентрация макроцикла.
Наряду с ВЭЖХ, нами оптимизирован способ экспресс-контроля содержания стероидных лекарств и диагностически важных эндогенных гормонов методами высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) с денситометрическим детектирова-
Таблица I. Значения критериев гидрофобности стероидов и констант устойчивости их комплексов с р-циклодекстрином, введенным в состав подвижной фазы
Лекарственный стероидный гормон Константа устойчивости Коэффициент детермииаци и (К1) Критерий гидрофобности (Н)*
Преднизолон 90,4 ± 2,4 0,9990 12,06
Кортизол 54,7 ±1,4 0,9998 12,06
Кортизон 42,6 ± 1,6 0,9999 12,06
11-Дегидро-кортикосгерон 18,1 ±0,5 0,9998 13,00
Дексаметазон 14,2 ±0,3 0,9991 14,06
* Н " пН - 4 V" , гдещН - суммарное число атомов углерода и галогенов, ш-— число функциональных групп в молекуле сорбата.
нием. В режиме ВЭТСХ проведена серия экспериментов с использованием пластин на основе силикагеля и подвижных фаз (толу ол :этанол (9:1), бензолзтанол (9:1), гексан:этилацетат (3:7), (голуол:этанол (3:1). В скобках даны объемные соотношения. Предел обнаружения кортикосгероидов сосгавил 20 - 30 нг в пятне.
Пример оптимального разделения природных и лекарственных препаратов представлен на рис. 4,
Рис. 4. Схема разделения эндо- (кортизол, кортизон, 11-дсзоксикортикостерон, 11 -дезокси кортизол) и экзогенных (преднизалон, дексаметазон, кортизон-ацетат, кортинефф) стероидов методом ВЭТСХ с двукратным элюированием: толуолгэтанол (9:1); гексан:этилацетат (3:7)
Для внедрения подобной схемы анализа в практику клинической медицины содержание органических растворителей в составе подвижной фазы желательно свести к минимуму. Такую роль мог бы выполнить водно-мицеллярный раствор до децил су л ьф ата натрия (ДДСН), что было проверено нами на примере лекарственного препарата преднизолона, как наиболее гидрофильного и прочнее удерживаемого на силикагеле. Оптимальное содержание детергента составило 15 мМ. При этом использование индивидуальной водной фазы оказаюсь малоэффективным (рис. 5).
11-деэокси кортизол
кортинефф
11-де^оксикортико-
Остерон
кортизон ацетат
О
дексаметазон
О кортизон
кортизол — преднизопон
При этом добавки незначительного количества органических растворителей (ацетонитрил, диэтиловый эфир) в мицеллярную водную фазу приводят к значительному росту эффективности (рис. 6).
¡С о
Р.
аг ~
О ч
8,3
15
10000-1 ЙООО-6000 7000
есюо-5000 4000
зооо 2000 1000 о
в в,з 12
|Д0П*инлсульфат натрия] нМ
п дипмроеый э$ир-«ода
п ацетонктри№вода
Рис. 5. Схема ВЭТСХ-определення Рис. 6. Влияние добавки ДЦСН в элюент на
преднизолона с использованием водных эффективность (т.т.) (расчет осуществлялся
растворов ДЦСН в качестве подвижной на примере кортизона) фазы
Следующий этап работы был посвящен выяснению возможностей электрофорегического определения компонентов модельной смеси. Нейтральный характер стероидов не позволил решить эту задачу в режиме капиллярного зонного электрофореза: определяемые вещества движутся вместе с электроосмотическим потоком (ЭОП) (рис. 7а).
Необходимо было использовать либо заряженные добавки в составе рабочего электролита, либо выполнять разделение в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), позволяющей определять ионные и нейтральные аналиты. Изучены обе возможности и учтены предварительные результаты хромагографических экспериментов: способность аналитов образовывать комплексы с циклодекстринами и проявлять высокое сродство к мицеллам.
Введение заряженного сульфо-р-циклодекстрина (С-Р-ЦЦ) изменило электрофоретические подвижности стероидов и привело к разделению компонентов (кортизол, кортикостерон, 11-дезоксикортикостерон, 11-дезоксикортизол) за исключением
а)
1+2+3+4+5
5 мМ
2+3 _
■■ ■■ '. ■, ■ '
'V*'«Л4.у. -л&Ч.VМ»'X. ^чг . ; ^ лу
Рис. 7. Разделение природных стероидных гормонов в режиме капиллярного зонного электрофореза а) буферный электролит (6,25 мМ тетраборат натрия), рН 9,3, б) с добавкой сулъфо-Р-ЦД, в) с дополнительным введением 4 М мочевины, где 1 - кортизол, 2 -кортизон, 3 - кортикостерон, 4 - 11-дезоксикортикостерон, 5 - ] 1-дезоксикортизол
пары кортизол/кортизон (рис. 76).
Добавка мочевины в боратныЙ буферный электролит способствовала полному разделению всех аналитов с высокой эффективностью (рис. 8). Такое влияние можно
Рис. 8. Зависимость эффективности (N, т.т.) от Рис. 9. Масс-спектр водного раствора
концентрации мочевины в буферном мочевины
элекгролите: 6,25 мМ тетрабораг натрия с
добавкой 5 мМ С-Р-ЦД, рН 9,3 (эффективность
рассчитана для корти костерон а)
объяснить как взаимодействием мочевины с определяемыми веществами с участием водородных связей, так и ее способностью образовывать межмолекул чрные ассоциогы, что было независимо нами подтверждено при анализе ее растворов различной концентрации на времяпролетном масс-спектрометре Малди (рис. 9). Обнаружены как сигналы мономеров, так и ассоциатов из 2 - 5 молекул мочевины.
В мицелляркой электрокинетической хроматографии (МЭКХ) подвижность стероидов обеспечивают отрицательно заряженные мицеллы.
В режиме обращенной полярности (ввод пробы с катодного конца) определяемые компоненты, распределяясь между раствором буферного электролита и псевдостационарной фазой (мицеллы ДДСН), движутся против ЭОП по направлению к аноду (рис. 10а).
Использование мочевины и в этом случае позволило резко сократить время анализа, разделить все компоненты с высокой эффективностью (рис. 106). Таким образом, этот вариант, по сравнению с зонным является предаочтительным.
Выяснив доминирующие факторы при хроматографическом и электрофоретическом разделении природных и синтетических стероидов, мы перешли к анализу реальных объектов с использованием в качестве пробоподготовки жидкостной (экстрагент -хлороформ) и твердофазной (сорбент Cíe) экстракций для мочи и сыворотки крови, соответственно. Степени извлечения ~ 75 - 102 %. Предел обнаружения в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии составил 3-5 нг/мл, что достаточно для определения стероидных лекарств и природных гормонов в биологических жидкостях
данным методом. Однако электрофоретический метод анализа не позволяет достичь таких
величин без предварительного концентрирования.
а) /
\ШШ
эоп
Рис. 10. Схематическое изображение (а) и электрофореграмма (б)
разделения нейтральных стероидов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии. Ведущий электролит - 25 мМ фосфорная кислота, 15 мМ ДДСН, 7 М мочевины, рН = 2,5, где F — кортшол, Е — кортизон, В - кортикостерон, Т -тестостерон, DOC — 11-дезокси-кортикостерои, Р1 — преднизолон, DEX— дексаметазон, Е-ас - кортизон ацетат, Cort — кортинефф
Именно поэтому были изучены следующие варианты on-line концентрирования: стэкинг с обращенно-мигрирующнми мицеллами; стэкинг с усилением поля при вводе с обращенно-мигрирующими мицеллами; стэкинг с высокопроводящей матрицей; свипинг; свипинг с добавкой мочевины или р-ЦД в матрицу пробы.
В основе свипинга лежит концентрирование определяемых веществ псевдостационарной фазой (мицеллами), которая проникает в зону образца, не содержащую мицелл. При этом проводимость раствора образца близка проводимости рабочего электролита, а скорость ЭОП близка к нулю (рН < 7).
Лучшие результаты концентрирования (25 - 200 раз) получены для случая свипинга с добавкой 5 мМ fi-ЦД в матрицу образца. В капилляр вводится большой объем раствора образца (30 мбар, 110 с), отличающегося от рабочего буфера содержанием р-ЦД В зоне образца происходит процесс комплексообразования гидрофобных анхштов с гидрофобной полостью макроцикла. Мицеллы проникают в зону пробы, и аналиты перераспределяются между раствором буферного электролита, раствором, содержащим Р-ЦД, и псевдостационарной фазой - мицеллами.
Оценку степени концентрирования проводили по значениям факторов концентрирования (SEFj,) (табл. 2).
SEFh™_высота пика, наученною при концентрированы и_^ ( ГДв Д — ДОЛЯ рЗЗбаВЛ€НИЯ (2)
высота пика, полученного при обычных условиях ввода пробы (2с)
Предел детектирования в режиме МЭКХ составил 5 нг/мл.
Таблица 2. Факторы концентрирования стероидных гормонов в режиме МЭКХ, где Doc - 11 -дезоксикортикостерон, Dex - дексаметазон, Е-ас -кортизон ацетат, В - кортикостерон, C-f- кортинефф, Р1 - преднизолон, Е - кортизон, F - кортизол (п=6, Р=0,95)
Вариант концентрирования ЩШШШМШШш Определяемые к-очиоиешы ишии
Doc Dii К-ас I В | С-Г PI Е р
SEFh
Стэкинг с 2,0 ± 0,1 5,0 ±0,1 2,0 ±0,1 3,0 ±0,1 8,0 ±0,2 1 ± 0,02 1 ± 0,02 1 ± 0,02
усилением поля при вводе с обращен иммигрирующими мицеллами Условия: матрица пробы - 5 мМ Н3РО4,1 М мочевины, концентрация пробы - 0,5 мкг/мл, ввод пробы: вода 90 мбар, проба -25 кВ до 70% начального тока
Предел детектирования: 300 иг/мл
Стэкинг с 11,0 ±03 14± 1 15± 1 8,0 ±0,1 18,0 ±0,5 12,0 ±0,5 10,0 ±0,5 14,0 ±0,5
высоко-проводящей матрицей Условия: матрица пробы - вода с добавкой 25 мМ хлорида натрия, концентрация пробы - 0,2 мкг/мл, ввод пробы: 150 мбар/с
П редел детектирования: 50 нг/мл
Стэкинг с обращение- 7,0 ±0,1 39 ± 1 20 ±1 11±1 26 ± 1 4,0 ±0,2 4,0 ±0,2 4,0 ±0,2
мигрирующими мицеллами Условия: матрица пробы - вода, концентрация пробы - 2,5 мкг/мл, ввод пробы: 6000 мбар
Предел детектирования: 100 нг/мл
Свипннг 32,0 ±0,5 42 ±1 41 ±2 28 ± 2 66 ±1 35 ± 1 30±1 20 ±1
(матрица - фосфорная кислота) Условия: матрица пробы - 30 мМ Н3РО4, концентрация пробы - 2,5 мкг/мл, ввод пробы: 4200 мбар
П| эедел детектирования: 15 нг/мл
Свипинг 53 ±2 45 ± 1 50 ±2 30±1 112 ±3 25 ± 1 30±1 20 ± 1
(матрица - фосфорная кислота с добавкой мочевины) Условия: матрица пробы - 30 мМ Н3РО4 с добавкой 2,5 М мочевины, концентрация пробы - 2,5 мкг/мл, ввод пробы: 3300 мбар
П редел детектирования: 10 нг/мл
Свипинг 212 ±3 83 ±2 109 ±2 41 ±2 251 ±5 51 ±2 38 ± 1 29 ± 1
(матрица - фосфорная кислота с добавкой Р-ЦД) Условия: матрица пробы - 30 мМ Н3РО4 с добавкой 5 мМ (ЩЦ, концентрация пробы - 0,1 мкг/мл, ввод пробы: 3300 мбар
Предел детектирования: 5 нг/мл
Результаты по оптимизации условий разделения природных гормонов и синтетических лекарств и их количественному определению позволили сопоставить используемые в данной работе методы (табл. 3).
Таблица 3. Оценочные характеристики методов (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ), используемых при определении эндо- и экзогенных кортикостероидов
Параметр МЭКХ ОФ ВЭЖХ ВЭТСХ
Эф<{>ективность (М), т. т. 250000- 300000 10000-15000 1000-9000
Линейный диапазон определяемых концентраций (мкс4|л) 0,05 - 50 0,003 - 500 0,2-500
Предел обнаружения (нг/мл) без концентрирования с концентрированием 500 5-10 50 3 — 5 500 100
Количество биологического образца (мл) сыворотка крови моча 2-3 2-3 1 1 2-20
Объем пробы 20 нл 20 мкл 50-100 мкл
Скорость потока (мкл/мнн) 0,3 250 -
Время анализа (мнн) 10 30 изо критический режим 20-80
Вспомогательные процедуры (мин): • кондиционирование капилляра/колонки/ пластины 20 20 30
• проведение пробопо ДГОТОВ КИ 60 30 60 - 300
Порядок элюирования В порядке уменьшения гидро<}юбности В порядке увеличения гидро<1юбности В порядке уменьшения гидро<1>обности
Возможность одновременного анализа нескольких образцов +
Метод МЭКХ превосходит другие по эффективности и характеризуется наименьшим временем анализа. В случае ОФ ВЭЖХ максимален линейный диапазон. Метод ВЭТСХ обеспечивает возможность одновременного анализа ряда образцов, благодаря чему увеличивается производительность анализа. Пределы обнаружения с учетом концентрирования в мицеллярном варианте и ВЭЖХ сопоставимы.
Обсуждаемые методы могут выступать в качестве референтных по отношению друг к другу при анализе биологических объектов, что было специально проверено в данной работе.
В 4-й главе рассматриваются варианты эле ктрофоретичес кого (КЗЭ) и хроматографнческого (ВЭТСХ) определения нсстероидных противовоспалительных средств.
Установленные закономерности при хроматографическом и электрофоретическом определении смеси гидрофобных стероидных лекарств позволили прогнозировать режим разделения гидрофильных нестероидных противовоспалительных препаратов (ибупрофен, аспирин, салициловая кислота, днклофенак, кеторол, анальгин, мелоксикам и парацетамол). Выбраны вариант зонного КЭ (ионные аналиты) и ВЭТСХ.
Использование нейтрального (Р-ЦД) (рис. 11а) и заряженного (сульфо-р-ЦД) (рис. 116) циклодекстринов, а также макроцикла с гидрофильной полостью (4,13-диаза-18-краун-6) (рис. 11в) позволило подтвердить или опровергнуть индивидуальность ряда лекарств. Например, введение краун-эфира в буферный электролит привело к увеличению селективности разделения ацетилсалициловой кислоты и продуктов ее гидролиза — салициловой и уксусной кислот.
«Одни
«»нккаиам Вмркртвим дшиьпм хшшрн
• стцнкшккяп * Awreeow +WTDIHA ùn&jftppÇftA
Рис. 11. Зависимость общей электрофоретической подвижности НПВС от концентрации макроциклов: а) р-ЦД б) сульфо-р-ЦД, в) 4,13 -дназа -18 -крау н- 6 в составе рабочего электролига (6,25 мМ тетрабората натрия, рН 9,3)
Концентрации макроциклов варьировались от 1 до 8 мМ. Зависимости общей электрофоре™ческой подвижности НПВС от концентрации макроциклов в буферном электролите представлены на рис. 11.
В 5-ой главе представлены возможности практического применения разработанных вариантов хроматографического и электрофоретического разделения эндо- и экзогенных стероидных гормонов коры надпочечников в биологических объектах (моча, сыворотка крови) пациентов с заболеваниями коры надпочечников.
Проведена сравнительная оценочная характеристика комплексного определения кортизола различными методами и выявлено хорошее совпадение (рис. 12).
I. ОФ вэжх-
экспернмент
15 10 5
II. ВЭТСХ-эксперимент
С,о,.« -.--¡Л'.'." "
111. МЭКХ-эксисримснг
Концентрация кортизола:
ОФ ВЭЖХ: 0,34 ± 0,01 мкг/мл, п=4, Р=0,95; ВЭТСХ: 0,38 ± 0,04 мкг/мл; п=3, Р=0,95; МЭКХ: 0,36 ± 0,02 мкг/мл, п=3, Р=0,95.
0 мин.
Рис. 12. Результаты количественного определения кортизола в моче донора с диагнозом синдром Иценко-Кушинга хроматографическими и элекгрофоретическими методами, где Р - кортизол, Е - кортизон; ВЭТСХ: 1-6 — калибровка; МЭКХ: 1-7 - дополнительные соединения
Показано, что метод ОФ ВЭЖХ в оптимизированных условиях может быть успешно использован для контроля за проводимой лекарственной терапией (т.н. дексаметазоновая проба) (рис. 13).
Изучены особенности стероидогенеза пациентов, имеющих диагноз врожденная гиперплазия коры надпочечников, с компенсацией, декомпенсацией и передозировкой препаратом кортизон ацетат, т.е. введен дополнительный диагностический критерий по данным ВЭЖХ-анализа.
шли
тАУ
Кортизол (р) Кортизон (Е) НЕ (сыв.) Е/Р (моча)
Сыворотка (нг/мл)
Норма 63,6 ± 3,3 19,1 ± 1,1 3,3 ± 0,2
До пробы 101,5 ±3,5 30,2 ± 20,1 3,3 ± 0,1
2 мг Оех 92,6 ± 3,0 15,2 ±0,7 6,1 ± 0,2
8 мг Оех 43,2 ± 2.5 9,7 ± 0,3 4,4 ± 0,1
Моча (мкг/сут
Норма 12,5 ±2,5 31,5 ±4,2 2,5 ± 0,2
До пробы 107,0 ± 3,5 95,4 ±3,0 0,89 ± 0,05
2 мг Оех 59,1 ± 2,5 88,1 ± 2,7 1,5± 0,1
8 мг Оех 6,9 ±0,3 25,5 ± 2,0 3,7 ±0,1
Рис. 13. Оценка проводимой лекарственной терапии на примере пробы с дексаметазоном. Хроматограммы мочи донора а) до проведения пробы, б) после введения 8 мг дсксаметазона. Элюент: 29 %-ный раствор СН3СК в воде с добавкой 8 мМ р-ЦД. Р - кортизол, Е — кортизон, ВЕХ— дексстеттон
Неидентифицированное соединение (X) (рис. 14), регистрируемое на хроматограмме сыворотки крови и мочи донора с данным заболеванием было препаративно выделено (с учетом отработанных ранее условий) методом ТСХ и проанализировано на времяпролетном масс-спектрометре Малди. Подтверждена
структура андростендиона (рис. 14).
О 10 20 30 Время (миф 20 30 Время (мин)
Рис. 14. Хроматограммы подготовленных экстрактов а) сыворотки крови, б) мочи пациента с диагнозом врожденная гиперплазия коры надпочечников. Условия анализа: подвижная фаза: Н20;СНзСЫ вода (29:71, по объему) с добавкой 8 мМ Э"ЦД» колонка Бире1со С18 100x2,1 мм, 5 мкм; скорость элюирования 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы 20 мкл, где Р - кортизол, Е ~ кортизон, В - кортикостерон, ООС - 11-дезокси-кортиксктерон, Б - 11 -дезоксикортизол, Х-андростендион
выводы
1. Установлены закономерности электрофоретического разделения кортнкостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в режимах МЭКХ, КЗЭ, ОФ ВЭЖХ и выявлены доминирующие факторы: органические добавки (метанол, диметилсульфоксид), комплексообразователи (р-ци клодекст рн н, сульфо-р-циклодекстрин, циклам, 4,13-диаза-18-крау н-6, мочевина) в составе элюента или рабочего электролита на эффективность и селективность разделения.
2. Разработана процедура пробоподготовки биологических объектов (моча, сыворотка крови) для хроматографического и электрофоретического анализа, основанные на различных вариантах жидкостной (с хлороформом) и твердофазной экстракции (Cis).
3. Выявлены возможности различных вариантов on-line концентрирования (стэкинг с обращен но-ми гри ру ющ и ми мицеллами, стэкинг с усилением поля при вводе с обращенно-мигрирующими мицеллами, использование "водной пробки", стэкинг с высокопроводящей матрицей, свипинг, свипннг с добавкой мочевины или р-ЦД в матрицу пробы) и показано, что свипинг с добавкой fi-ИД в матрицу пробы позволяет снизить предел обнаружения кортикостероидов до 5 нг/мл, что обеспечивает возможность анализа биологических жидкостей методом капиллярного электрофореза.
4. Предложен способ экспресс-контроля за содержанием эндо- и экзогенных стероидов в режимах высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ).
5. Разработаны способы хроматографического и электрофоретического анализа реальных объектов (сыворотка крови, моча), позволяющих осуществлять оценку проводимой лекарственной терапии с использованием синтетических кортикостероидов.
6. Проведено сопоставление элекгрофоретических и хроматографических методов определения лекарственных препаратов стероидной и нестероидной природы.
Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:
1. Л.А. Карцова, Л.И. Великанова, Е.Г. Павлова (Стрельникова), Е.А. Бессонова. Изучение особенностей стероидогенеза больных с заболеваниями коры надпочечников методом ВЭЖХ // Журнал аналитической химии. 2004, том 59, № 10, С. 976-982.
2. Карцова Jl.А., Бессонова Е.А., Великанова Л.И., Павлова (Стрельникова) Е.Г. Влияние ß-циклодекстрина на факторы удерживания стероидных гормонов ОФ ВЭЖХ // Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2005. Вып. 1. С. 78-84.
3. Великанова Л.И., Ворохобина Н.В., Серебрякова И.П., Крнхели И.О., Жижина О.Л., Глухов Н.В., Бессонова Е.А., Стрельникова Е.Г. Диагностическое значение высокоэффективной жидкостной хроматографии кортикостероидов при заболеваниях гипофизарно-надпочечниковой системы Н Вестник ассоциации эндокринологов Санкг-Петербурга и Ленинградской области. 2003, № 1(21), С. 1-2.
4. Л.А. Карпова, Л.И. Великанова, Е-Г. Павлова (Стрельникова), Е.А. Полякова. Интерпретация хроматограф ических профилей кортикостероидов в биологических жидкостях, полученных методом ОФ ВЭЖХ, для диагностики патологии коры надпочечников // Всероссийский симпозиум «Современные проблемы хроматографии» 18-22 марта 2002г. Москва. С. 99.
5. Великанова Л.И., Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Павлова (Стрельникова) Е.Г., Крихели И.О., Шафигуллина З.Р., Серебрякова И.П. ВЭЖХ кортикостероидов биологических жидкостей в ранней диагностике патологии коры надпочечников И
Первая международная медицинская конференция «Высокие медицинские технологии XXI века». Испания. 2-9 ноября 2002г. С.62.
6. L.A. Kartsova, L.I. Velikanova, E.G. Pavlova (Strelnikova), E.A. Bessonova. The Investigation of Steroidogenic Characters and Corticosteroids Metabolism by RP HPLC // 3ri Int. Symposium on Separations in BioSciencies "100 years of chromatography" 1318 may, 2003. Moscow, Russia. P. 118.
7. Карцова Л.А., Великанова Л.И., Бессонова E.A., Павлова (Стрельникова) Е.Г. Анализ кортикостероидов в сыворотке крови методом ОФ ВЭЖХ и исследование хроматографических стероидных профилей при различных дисфункциях коры надпочечников II Менделеевский съезд, Казань, сентябрь 2003г. С. 60.
8. Великанова Л.И., Ворохобина Н.В., Серебрякова И.П., Павлова (Стрельникова) Е.Г., Бессонова Е.А. Диагностическое значение хроматографических профилей кортикостероидов при различных формах надпочечниковой гиперандрогении // Конференция «Врачи мира пациентам», Санкт-Петербург, сентябрь 2003г. С. 15-16.
9- Ворохобина Н.В., Великанова Л .И., Краснов Л.М., Крихели И.О., Заркуа Н.Э., Павлова (Стрельникова) Е.Г. Особенности метаболизма кортикостероидов у больных с различными формами гиперкортизолизма Н Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы нейроэндокринологии», Москва, 2003г. С. 284-285.
10. Серебрякова И.П., Ворохобина Н.В., Великанов а Л.И., Павлова (Стрельникова) Е.Г. Диагностическое значение ВЭЖХ кортикостероидов в оценке степени компенсации больных с Врожденной гиперплазией коры надпочечников // Конференция «Врачи мира пациентам», Санкт-Петербург, сентябрь 2003г. С. 13-14.
11. L. Velikanova, I. Serebryakova, Z. Shafigullina, N. Vorohobina, E. Pavlova (Strelnikova), N. Glukhov. High performance liquid chromatography of blood and urine corticosteroids in the diagnostics of hypophysis-adrenal system // 22 World Congress of Pathology Laboratory Medicine, 30 august - 3 September 2003, Busan, Korea. P. 154.
12. L.I. Velikanova, L.A, Kartsova, I.P, Serebryakova, N.V. Gloukhov, E,A, Bcssonova, E.G. Pavlova (Strelnikova). High Performance Liguid Chromatography of Corticosteroids in the Diagnosis of Adrenal Steroidogenesis Abnormalities in Different Forms of Hyperandrogenism // II международный конгресс «Современные медицинские технологии XXI века» Бенидорм, Испания, 1-7 ноября 2003г. С. 72.
13. Л.А. Карцова, Л.И. Великанова, Е.Г. Стрельникова, Ю.С. Дмитриева. Определение лекарственных стероидных препаратов в сыворотке крови и моче // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» 2004, Москва, С. 289.
14. L.A. Kartsova, E.G. Strelnikova, U.S. Dmitrieva. Macrocyclic agents and their application for chromatographic and electrophoretic separation of compounds from biological liguids // XXIXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds", Katowice-Szczyrk, Poland, 8-10 June 2005, P. 126.
15. Карцова Л.А., Стрельникова Е.Г. Макроциклические соединения в процессах хроматографического и электрофоретического разделения компонентов биологических сред И II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» Краснодар, 2005. С. 180.
16. Стрельникова Е.Г. Одновременное определение эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с использованием on-line концентрирования // Всероссийская конференция молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и эксперимент&чьной медицины» 19 мая 2006. Санкт-Петербург. С. 251.
17. Стрельникова Е.Г. Определение нестероидных противовоспалительных средств методом капиллярного зонного электрофореза It Всероссийская конференция молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» 19 мая 2006. Санкт-Петербург. С. 254.
18. Великанова ЛИ., Крихели И.О., Стрельникова Е.Г., Милютина О.Л. Информативные критерии лабораторной диагностики субклинического синдрома Иценко-Кушинга // Конференция «Современные диагностические и лечебные технологии в многопрофильной клинике». 18-19 мая 2006, Санкт-Петербург. С.43.
19. Kartsova L.A., Strelnikova E.G., Malahova LI., VeliKanova L.I, Concurrent determination of endogenic and drugs corticosteroids by high performance thin-layer chromatography (HPTLC) // 29th Int. Symposium on Capillary Chromatography May 29 - June 2,2006. Italy, poster O. 14.
20. Kartsova L.A., Strelnikova E.G. The determination ofendo- and exogenic corticosteroids by micellar electrokinetic chromatography (MEKC) using on-line concentration // 29th Int. Symposium on Capillary Chromatography May 29 - June 2, 2006. Italy, poster II, 09.
21. Strelnikova E.G., Kartsova L.A. The application of micellar mobile phases for the corticosteroids separation by high performance thin-layer chromatography (HPTLC) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC) // XXXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds", Katowice-Szczyrk, Poland, June 2006. P. 23.
22. L.A. Kartsova, A.A. Sidorova, E.G. Strelnikova, O.V. Ganzha. The electrophoretical profiles of biologically active compounds from different matrixes // XXXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds", Katowice-Szczyrk, Poland, June 2006. P. 110.
23. E.G. Strelnikova, L.A. Kartsova. The principle of molecular recognition for the determination of residual drugs from serum using macrocyclic agents // XXXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds", Katowice-Szczyrk, Poland, June 2006. P. 27.
24. Strelnikova E.G., Kartsova LA. The cyclodextrin-modified micellar electrokinetic chromatography for the determination of endo- and exogenic corticosteroids using online concentration // Int. Congress of Analytical Science. 25-30 June, 2006, Moscow, Russia.P. 317.
25. Strelnikova E.G., Kartsova L.A., Velicanova L.I. Micellar mode of thin-layer chromatography for the separation of exo- and endogenic steroids // Int. Congress of Analytical Science. 25-30 June, 2006, Moscow, Russia. P. 194.
Подписано в печать 14.08.2006. Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3834,
Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр.26
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.
1. Основные группы лекарственных препаратов.
2. Общая характеристика биогенных и лекарственных кортикостероидов.
1.3. Свойства нестероидных противовоспалительных средств (НПВС).
1.4. Макроциклические агенты, используемые в хроматографии и капиллярном электрофорезе при определении лекарственных препаратов.
1. 4. 1. Циклодекстрины.
1. 4. 1. 1. Комплексообразование циклодекстриное со стероидными гормонами.
1. 4. 2. Глюкопептидиые антибиотики в качестве стационарной фазы е капиллярной электрохроматографии (КЭХ).
1. 4. 3. Резорцинарен.
1. 4. 4. Иммобилизованные белки.
1. 4. 5. Циклами.;.
1. 4. 6. Использование краун-эфиров для разделения лекарственных препаратов.
1.5. Методы определения кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в биологических жидкостях.
1. 5.1. Иммунологические методы анализа.
1. 5. 1. 1. Совместное использование методов капиллярного электрофореза и иммунологического исследования для определения стероидных гормонов.
1. 5. 2. Газохроматографическое определение кортикостероидов .35 1. 5. 2. 1. Дериватизация стероидов.
1. 5. 3. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в медико-биологических исследованиях.
1. 5. 4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) для определения лекарственных препаратов.
1. 5. 4. 1. Подвижные фазы в ВЭТСХ.
1. 5. 4. 2. Мицеллярный вариант высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ).
1. 5. 4. 3. Сравнение методов МТСХ и ТСХ.
1. 5. 5. Метод капиллярного электрофореза при анализе кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств.
1. 5. 5. 1. Основные варианты капиллярного электрофореза.
1. 5. 5. 1. 1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ).
1. 5. 5. 1. 2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ).
1. 5. 5. 2. Способы концентрирования при вводе проб ("стэкинг", свипинг") в методах капиллярного электрофореза.
1. 5. 5. 3. Эффективность, разрешение и селективность разделения в
МЭКХ.
1. 5. 5. 4. Оптимизаъ^ия разделения лекарственных препаратов методом капиллярного электрофореза.
1. 5. 5. 4. 1. Тип циклодекстрина, ко1щентрация и структура определяемого компонента.
1. 5. 5. 4. 2. Влияние рН, концентрации буферного электролита и температуры капилляра на разделение органических соединений.
1. 5. 5.4.3. Эффекты органических модификаторов, добавленных в буферный электролит.
1.5. 6. Сравнительная характеристика методов КЭ, ВЭЖХ и ВЭТСХ.
1.6. Пробоподготовка биологических жидкостей при определении стероидных гормонов и нестероидных противовоспалительных средств.
1. 6. 1. Микродиализ, мембранная фильтрация.
1. 6. 2. Твердофазная и жидкостная экстракции.
1. 6. 3. Специфика пробоподготоеки биологических жидкостей для определения стероидных гормонов.
ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ
ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Аппаратура.
2. 2. Реагенты.
2. 3. Методы исследования.
2.3.1. Капиллярный электрофорез с УФ-детектированием.
2. 3. 1. 1. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза.
2. 3. 2. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии.19 2. 3. 3. Высокоэффективная жидкостная хроматография с ультрафиолетовым детектированием.
2. 3. 4. Времяпролетная масс-спектрометрия.
ГЛАВА 3. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНДО- И ЭКЗОГЕННЫХ КОРТИКОСТЕРОИДОВ.83 3.1. Использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии для определениям эндо- и экзогенных кортикостероидов.
3. 2. 1. Мицеллярная ОФ ВЭЖХ эндо- и экзогенных кортикостероидов.
3. 1. 2. Обращенно-фазовая ВЭЖХ с fi-циклодекстрином в качестве компонента подвижной фазы.
3. 2. Метод капиллярного зонного электрофореза для определения эндо-и экзогенных кортикостероидов.
3. 3. Физико-химическая модель вторичных равновесий в системе стероид-макроцикл».,.
3. 4. Использование мицеллярной электрокинетической хроматографии для определения эндо- и экзогенных кортикостероидов.
3. 4. 1. Оптимизация электрофоретического разделения стероидов методом МЭКХ.
3. 4. 2. Изучение возможностей циклодекстрин-модифицированной мицеллярной электрокинетической хроматографии для определения стероидов.
3. 4. 3. On-line концентрирование эндо- и экзогенных кортикостероидов.
3. 5. Определение эндо- и экзогенных кортикостероидов методом классической тонкослойной хроматографии.
3. 6. Сравнительный анализ методов ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ и МЭКХ при определении стероидных гормонов.
Ш 3. 7. Определение эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллярной тонкослойной хроматографии.
3. 8. Пробоподготовка биологических объектов к анализу.
3. 8.1. Пробоподготовка сыворотки крови.
3. 8. 2. Пробоподготовка мочи.
ГЛАВА 4. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ И ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕСТЕРОИДНЫХ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СРЕДСТВ (НПВС).
4. 1. Определение нестероидных противовоспалительных средств методом капиллярного зонного электрофореза и высокоэффективной тонкослойной хроматографии.
4. 1. 1. Определение нестероидных противовоспалительных средств методом КЗЭ с использованием макроциклических агентов.
ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ.
5. 1. Сравнительные оценочные характеристики методов ОФ ВЭЖХ,
ВЭТСХ и МЭКХ при анализе реальных объектов.„.
5. 2. Использование метода ОФ ВЭЖХ для разработки информативных критериев лабораторной диагностики заболеваний коры надпочечников.
5. 2.1. Исследования при проведении пробы с дексаметазоном.
5. 2. 2. Лекарственная терапия с применением кортизон ацетата или преднизолона.
5. 3. Установление структуры неидентифицированного соединения.
5. 4. Определение нестероидных противовоспалительных средств в сыворотке крови методом капиллярного электрофореза.
ВЫВОДЫ.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.
Контроль за остаточным содержанием лекарственных препаратов (стероидной и нестероидной природы) в биологических жидкостях (кровь, моча) крайне важен при оценке эффективности проводимой лекарственной терапии. Так, одновременное определение стероидов эндо- и экзогенного происхождения позволяет обсудить причину нарушения стероидогенеза при различных эндокринных патологиях. В свою очередь, анализ нестероидных лекарственных средств, применяемых с терапевтическими целями, способствует выявлению требуемой дозы препарата.
Среди опубликованных методов определения лекарственных средств наиболее широкое распространение получили иммунологические и хроматографические. При этом иммуноферментные - имеют существенное ограничение, позволяя за один аналитический цикл определять лишь одно соединение.
•4 Традиционный вариант решения подобных задач - обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ) [1 - 14]. Появление отечественных систем капиллярного электрофореза, (системы «Капель» и «Нанофор»), позволяющих с высокой эффективностью анализировать биологические объекты, требуют разработки новых методик электрофоретического определения лекарственных препаратов. Недостаточная селективность капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) может быть «скомпенсирована» использованием мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), где в качестве псевдостационарной фазы (мицелл) используют поверхностно-активные вещества. Метод. МЭКХ обеспечивает определение соединений ионной и нейтральной природы. При этом необходимо преодолеть еще один барьер: низкую концентрационную чувствительность УФ-детектирования метода капиллярного электрофореза для снижения предела обнаружения.
Изучение отечественной и зарубежной литературы показало, что в таком аспекте (одновременный анализ стероидов экзо- и эндогенного происхождения) ранее задача не ставилась.
Аналитические методы, используемые для определения лекарственных соединений нестероидной природы, включают ВЭЖХ, капиллярный электрофорез (КЭ) и капиллярную электрохроматографию [8, 15 - 27], высокоэффективную тонкослойную (ВЭТСХ) [28] и газовую хроматографию (ГХ) [29].
Применение организованных сред (краун-соединений, цикламов, циклодекстринов, мицелл) в составе подвижной фазы и буферного электролита позволяет увеличивать селективность энантиомерного разделения [6, 16, 25, 26].
Термин «организованные среды» широко используется в последние годы в области аналитической химии и является одним из основных понятий супрамолекулярной химии - науки, в основе которой лежит образование комплексов типа «гость-хозяин» с участием невалентных взаимодействий (диполь-дипольные, ион-ионные и водородные связи) [30 - 34]. В качестве «хозяина» могут выступать различные макроциклические агенты (циклодекстрины, краун-эфиры, криптанды) - жестко организованные системы. В свою очередь, примерами нежестких систем могут служить мицеллы поверхностно-активных веществ.
Используя хроматографические и электрофоретические методы с применением макроциклических агентов (МА) в составе рабочего буфера, возможно осуществить не только разделение лекарственных препаратов, но и определение их энантиомерной чистоты [1 - 4, 15 - 17].
В последнее время широко развивающимся направлением является применение циклодекстринов (ЦД) и краун-эфиров в методах разделения: ОФ ВЭЖХ [1 - 4, 35 - 39] и КЭ [15, 16, 19, 20, 25, 26]. Их используют для анализа природных объектов, ферромонов, летучих компонентов ароматов [1], в качестве хиральных селекторов для энантиоселективного разделения оптически активных соединений [1 - 4, 15, 16, 19, 20, 25, 26, 40 - 43]. Производные полисахаридов (эфиры и карбаматы целлюлозы, карбаматы амилозы) достаточно широко используются в качестве хиральных стационарных фаз в ВЭЖХ [3,9-11].
Цель работы: получить оценочные характеристики методов хроматографического и электрофоретического определения остаточных лекарственных препаратов в биологических жидкостях с использованием комплексообразующих агентов в составе подвижной фазы и рабочего буфера и различных вариантов on-line концентрирования.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1. На модельных системах соединений, близких по химической структуре (природные и синтетические стероиды), установить закономерности их одновременного хроматографического (ОФ ВЭЖХ, ВЭТСХ) и электрофоретического (КЗЭ и МЭКХ) определения.
2. Выявить влияние мицелл и комплексообразующих агентов (|3-циклодекстрин ((3-ЦД), сульфо-|3-циклодекстрин, 4,13-диаза-18-краун-6, циклам) на эффективность и селективность разделения стероидов эндо- и экзогенной природы.
3. Предложить физико-химическую модель и основные количественные соотношения, описывающие процессы комплексообразования в системе комплексообразующий агент -лекарственный препарат.
4. Отработать процедуру пробоподготовки и выяснить возможности on-line концентрирования для снижения предела обнаружения.
5. Предложить схемы хроматографического и электрофоретического определения лекарств стероидной и нестероидной природы в реальных биологических объектах (моча, сыворотка крови).
На защиту выносятся следующие положения:
1. Результаты исследования влияния органических растворителей метанол, диметилсульфоксид) и компонентов организованных сред (ПАВ - додецилсульфат натрия, (3-циклодекстрин, сульфо-|3-циклодекстрин, 1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан, 4ДЗ-диаза-18-краун-6, мочевина) в качестве составляющих рабочего буфера, на эффективность и селективность электрофоретического и хроматографического разделения природных стероидных гормонов и синтетических стероидных лекарств в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ).
2. Данные о влиянии добавок комплексообразующих агентов (|3-циклодекстрин, сульфо-(3-циклодекстрин, 4ДЗ-диаза-18-краун-6) в составе буферного электролита на электрофоретические характеристики нестероидных противовоспалительных средств.
3. Пробоподготовка биологических жидкостей (сыворотки крови и мочи) # при определении кортикостероидов (преднизолон, дексаметазон, кортинефф, кортизон ацетат) и нестероидных противовоспалительных средств (аспирин, парацетамол) хроматографическими и электрофоретическими методами с использованием твердофазной и жидкостной экстракций.
4. Способы on-line концентрирования (стэкинг с обращенно-мигрирующими мицеллами; стэкинг с усилением поля при вводе с обращенно-мигрирующими мицеллами; стэкинг с высокопроводящей матрицей; свипинг; свипинг с добавкой мочевины или (3-ЦД в матрицу пробы) для снижения предела обнаружения эндо- и экзогенных кортикостероидов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ).
5. Обоснование возможностей и преимуществ классического и мицеллярного вариантов ВЭТСХ-разделения эндо- и экзогенных кортикостероидов, а также нестероидных противовоспалительных средств.
Практическое приложение выявленных закономерностей: - изучение особенностей стероидогенеза больных с компенсацией, декомпенсацией и передозировкой лекарственными препаратами; сопоставление возможностей и ограничений определения кортикостероидов в биологических жидкостях с использованием хроматографических и электрофоретических методов.
выводы
1. Установлены закономерности электрофоретического разделения кортикостероидов и нестероидных противовоспалительных средств в режимах МЭКХ, КЗЭ, ОФ ВЭЖХ и выявлены доминирующие факторы: органические добавки (метанол, диметилсульфоксид), комплексообразователи (р-цикло-декстрин, сульфо-Р-циклодекстрин, циклам, 4,13-диаза-18-краун-6, мочевина) в составе элюента или рабочего электролита на эффективность и селективность разделения.
2. Разработана процедура пробоподготовки биологических объектов (моча, . сыворотка крови) для хроматографического и электрофоретического анализа, основанные на различных вариантах жидкостной (с хлороформом) и твердофазной экстракции (С]8).
3. Выявлены возможности различных вариантов on-line концентрирования (стэкинг с обращенно-мигрирующими мицеллами; стэкинг с усилением поля при вводе с обращенно-мигрирующими мицеллами, использование "водной пробки"; стэкинг с высокопроводящей матрицей; свипинг; свипинг с добавкой мочевины или |3-ЦД в матрицу пробы) и показано, что свипинг с добавкой fi-ЦД в матрицу пробы позволяет снизить предел обнаружения кортикостероидов до 5 нг/мл, что обеспечивает возможность анализа биологических жидкостей методом капиллярного электрофореза.
4. Предложен способ экспресс-контроля за содержанием эндо- и экзогенных стероидов в режимах высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) и мицеллярной высокоэффективной тонкослойной хроматографии (МВЭТСХ).
5. Разработаны способы хроматографического и электрофоретического анализа реальных объектов (сыворотка крови, моча), позволяющих осуществлять оценку проводимой лекарственной терапии с использованием синтетических кортикостероидов.
6. Проведено сопоставление электрофоретических и хроматографических методов определения лекарственных препаратов стероидной и нестероидной природы.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Стероиды:
F - кортизол; Е - кортизон;
UFF - свободный кортизол мочи;
UFE - свободный кортизон мочи;
А - 11-дегидрокортикостерон;
В - кортикостерон;
Т - тестостерон;
S - 11 -дезоксикортизол;
DOC - 11-дезоксикортикостерон;
17-ОНРг- 17-гидроксипрогестерон;
Рг - прогестерон;
PI - преднизолон;
МР - 6-метил-преднизолон;
МРА - б-метил-преднизолон ацетат;
DHEA - дегидроэпиандростерон;
Aldo - альдостерон;
Рп - преднизон;
DEX - дексаметазон;
Cort - кортинефф;
Е-ас - кортизон ацетат;
АКТГ - адренокортикотропный гормон;
Циклодекстрины: ß-ТЩ (ß-CD) - ß-циклодекстрин; а-ЦД (а-CD) - а-циклодекстрин; у-ЦД (y-CD) - у-циклодекстрин; Me-CD - метилированный циклодекстрин; TM-ß-CD - триметил-р-цикл о декстрин; HE-ß-CD - ги дроксиэтил - ß - ци клоде кстрин; HP-ß-CD - гидроксипропил-Р-циклодекстрин; HDM-ß-CD - гептакис(2,3 -О-диметил)-ß- ц и клодекстр ии; HTM-ß-CD - гептакис(2,3,6-0-триметил)-[3-циклодексгрин; C-ß-ЦД (S-ß-CD) - сульфо-Р-циклодекстрин; SPE-CD - сульфо-к-пропиловый эфир циклодекстрина; SBE-ß-CD - сульфобутиловый эфир ß-циклодекстрин; hm-ß-CD - 6-fle30KCH-6-N-rHCTaMHH0-ß-HHiai0fleKCTpHH; mh-ß-CD - 6-дeзoкcи-6-[2-аминoэтил]имидазoл-ß-циклoдeкcтpин; ß-CD-CN - цианоэтилированный ß-циклодекстрин; HDAS-ß-CD - гeптaкиc(2,3-диaцeтил-6-cyльфo)-ß-циклoдeкcтpин; ODAS-y-CD - октакис(2,3-диацетил-6-сульфо)-у-циклодекстрин; Et-NH-ß-CD- гeптaкиc(6-мeтoкcиэтил-aминo-6-дeзoкcи)-ß-циклoдeкcтpин;
З-СБ-ОЬ - моно-(5-глутаминамино-6-дезокси)-|3- циклодекстрин; МРШ - натриевая соль хемисукцината;
МРЭО - [21[8-метил-(2-сульфоэтил)амино]-8-оксооктаноат]-натриевая соль;
ЖЖЭ - жидкостно-жидкостная экстракция;
ТФЭ - твердофазная экстракция;
РИА - радиоиммунологический анализ;
ИФА - иммуноферментный анализ;
ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография;
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография;
ГХ - газовая хроматография;
МС - масс-спектрометрия;
ПИД - ионизационно-пламенный детектор;
ДЭЗ - детектор электронного захвата;
КЭ - капиллярный электрофорез;
КЗЭ - капиллярный зонный электрофорез;
КЭХ - капиллярная электрохроматография;
МЭКХ - мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография;
ИТФ - изотахофорез;
ДДС - додецилсульфат натрия;
ПАВ - поверхностно-активное вещество;
ККМ - критическая концентрация мицеллообразования;
ДЭС - двойной электрический слой;
СИК - синдром Иценко - Кушинга;
ВГКН - врожденная гиперплазия коры надпочечников;
ГФБ - гептафторбутират;
ТМХС - триметилхлорсилан;
ГМДС - гексаметилдисилазан;
БСА - 1\[,0-бис(триметилсилил)ацетамид;
ТМСИМ - триметилсилилимидазол;
ТМСДЭА - Ы-(триметилсилил)диэтиламин;
МСТФА - Ы-Метил-К-триметилсилилтрифторацетамид;
БСТФА - К,0-бис-(триметилсилил)трифторацетамид;
РБРА - пентафторпропионовый ангидрид.
НПВС - нестероидные противовоспалительные средства;
АСК - ацетилсалициловая кислота;
СК - салициловая кислота;
МА - макроциклические агенты;
ХСФ - хиральная стационарная фаза;
ЛИФ - детектор с лазер-индуцированной флуоресценцией;
ЭОП - электроосмотический поток;
Р - доверительный интервал; р - уровень статистической значимости по сравнению с контрольной группой.
1. Л. А. Карцова, О. В. Маркова, А. И. Амельченко, Н. Д. Острянина. Макроциклы как компоненты газохроматографических фаз // Журнал Аналитической Химии. 2000. Т.55. № 3. С. 270 279.
2. K.G.Flood, E.R.Reynolds, N.H.Snow. Characterization of inclusion complexes of betamethasone related steroids with cyclodextrins using high -performance liquid chromatography // J. Chromatogr. A. 2000. V. 903. P.49 -65.
3. C.Misl'anova, M.Hutta Role of biological matrices during the analysis of chiral drugs by liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 2003. V. 797. P. 91-109.
4. Л. А. Карцова, Л. И. Великанова, Е. Г. Павлова, Е. А. Бессонова. Изучение особенностей стероидогенеза больных с заболеваниями коры надпочечников методом ВЭЖХ // Журнал Аналитической Химии. 2004, том 59. № 10. С. 976-982.
5. О. Nozaki. Steroid analysis for medical diagnosis // J. Chromatogr. A. 2001. V. 935. P. 267-278.
6. M. E. R. Rosas, Sh. Patel, I. W. Wainer. Determination of the enantiomers of ketamine and norketamine in human plasma by enantioselective liquid chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. B. 2003. V. 794. P. 99 -108.
7. H. G. Ugland, M.Krogh, L.Reubsaet. Three-phase liquid-phase microextraction of weakly basic drugs from whole blood // J. Chromatogr. B. 2003. V. 798. P. 127 135.
8. M. C. Millot. Separation of drug enantiomers by liquid chromatography and capillary electrophoresis, using immobilized proteins as chiral selectors // J. Chromatogr. B. 2003. V. 797. P. 131 159.
9. K. Tachibana, A. Ohnishi. Reversed-phase liquid chromatographic separation of enantiomers on polysaccharide type chiral stationary phases // J. Chromatogr. A. 2001. V. 906. P. 127 154.
10. H. Y. Aboul-Enein. High-performance liquid chromatographic enantioseparation of drugs containing multiple chiral centers on polysaccharide-type chiral stationary phases // J. Chromatogr. A. 2001. V. 906. P. 185- 193.
11. E. Yashima. Polysaccharide-based chiral stationary phases for highperformance liquid chromatographic enantioseparation // J. Chromatogr. A. 2001. V. 906. P. 105- 125.
12. E. Н.Орлов, E. M. Антипов, H. H. Николаев. Некоторые аспекты получения стероидных профилей мочи // Вопросы медицинской химии. 1993. №5. С. 7-9.
13. М. Г. Морозова, Н. JI. Гампер, Е. Е. Дубинина, Ю. J1. Нуллер, А. В. Лебедев. Высокоэффективная жидкостная хроматография кортикостероидов у больных с депрессией и деперсонализацией // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. №4. С. 14 16.
14. М. Salo, Н. Siren, P. Volin, S. Wiedmer, Н. Vuorela. Structure-retention relationships of steroid hormones in reversed-phase liguid chromatography and mi cellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. A. 1996. V. 728. P. 83 -88.
15. S. Fanali. Enantioselective determination by capillary electrophoresis with cyclodextrins as chiral selectors // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 89 -122.
16. B. Koppenhoefer, X. Zhy, A. Jakob, S. Wuerthner, B. Lin. Separation of drug enantiomers by capillary electrophoresis in the presence of neutral cyclodextrins // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 135 161.
17. G. Gubitz, M. G. Schmidt. Recent progress in chiral separation principles in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 4112 4135.
18. Т. V. Goel, J. G. Nikelly, R. C. Simpson, В. K. Matuszewski. Chiralseparation of labetalol stereoisomers in human plasma by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1027. P. 213 221.
19. S. Fanali, P. Catarcini, C. Presutti. Enantiomeric separation of acidic compounds of pharmaceutical interest by capillary electrochromatography employing glycopeptide antibiotic stationary phases // J. Chromatogr. A. 2003. V. 994. P. 227-232.
20. S. Eelting, G. P. Rozing, W. Th. Kok. Recent applications in capillary electrochromatography // Electrophoresis. 2003. V. 24. P. 3935 3961.
21. A. H. Que, A. Palm, A. G. Baker, M. Novotny. Steroid profiles determined by capillary electrochromatography, laser-induced fluorescence detection and electrospray-mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2000. V. 887. P. 379 -391.
22. M. C. Vescina, A. M. Fermier, Y. Guo. Comparing cyclodextrin derivatives as chiral selectors for enantiomeric separation in capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 2002. V. 973. P. 187 196.
23. H. Wikstrom, L. A. Svensson, A. Torstensson, P. K. Owens. Immobilisation and evaluation of a vancomycin chiral stationary phase for capillary electrochromatography // J. Chromatogr. A. 2000. V. 869. P. 395 409.
24. В. Д. Красиков. Современная планарная хроматография // Журнал аналитической химии. 2003. том 58. № 8. С. 792 807.
25. A. Ruderisch, J. Pfeiffer, V. Schurig. Mixed chiral stationary phase containing modified resorcinarene and 3-cyclodextrin selectors bonded to a polysiloxane for enantioselective gas chromatography // J. Chromatogr. A. 2003. V. 994. P. 127- 135,
26. С. H. Штыков. Химический анализ в нанореакциях: основные концепции и применения // Журнал Аналитической Химии. 2002. Том 57. № 10. С. 1018-1028
27. С, Н. Штыков, Е. Г. Сумина. Аналитические возможности мицеллярных подвижных фаз в тонкослойной хроматографии 1,3-дикетонатов некоторых металлов// Журнал Аналитической Химии. 1998. Том 53. №5. С. 508- 513
28. S. Е. Friberg, В. Lindman. Organized solution in scince and technology / N.Y. Marcel Dekker, Inc. 1992. 410 P.
29. IT. О. Мчедлов-Петросян. Дифференцирование силы органических кислот в истинных и организованных растворах / Харьков. Изд. Харьковского национального университета. 2004. 326 С.
30. Карцова Л.А., Бессонова Е.А., Великанова Л.И., Павлова Е.Г, «Влияние (3-циклодекстрина на факторы удерживания стероидных гормонов ОФ ВЭЖХ» // Вестник СПбГУ. Сер. 4. 2005. Вып. 1. С. 78 84.
31. В.Д. Красиков. Основы планарной хроматографии / СПб. Химиздат. 2005.232 С.
32. Е. Schneiderman, А. М. Stalcup. Cyclodextrins: a versatile tool in separation, science // J. Chromatogr. B. 2000. V. 745. P.83 102.
33. E. Forgacs, T. Cserhati. Interaction of some steroid drugs with (3-cyclodextrin polymer// J. Chromatogr. A. 1999. V. 845. P. 447 453.
34. W. J. Shieh, A. R. Hedges. Properties and applications of cyclodextrines // J.M.S. Pure Appl. Chem. A. 1996. V.33 (5). P. 673 683.
35. A. A. M. Stolker, P. L. W. J. Schwillens, L, A. van Ginkel, U. A. Th. Brinkman. Comparison of different liquid chromatography methods for the determination of corticosteroids in biological matrices // J. Chromatogr. A. 2000. V. 893. P.55 67.
36. A. Ghulam, M. Kouach, A. Racadot, A. Boersma, M. C. Yantyghem, G. Briand. Quantitative analysis of human serum corticosterone by highperformance LC coupled to electrospray ionozatión mass spectrometry // J.
37. Chromatogr. B. 1999. V. 727 P. 227 233.
38. R. Herraes-Hernandes, P. Campins-Falko. Chromatographic separation of chlortalidone enantiomers using (3-cyclodextrins as chiral additives // J. Chromatogr. B. 2000. V. 740. P. 169 177.
39. P. K. Zarzycki, К. M. Kulhanek, R. Smith. Chromatographic behaviour of selected steroids and their inclusion complex with (3-cyclodextrin on octadecylsilica stationary phases with different carbon loads // J. Chromatogr. A. 2002. V. 955. P. 71 78. ' ■
40. Эндокринология. Под ред. H. Лавина. / М. Практика. 1999. 1128 С.
41. В. В. Корпачев. Популярно о фармакологии / К. Наука, 1989. 184 С.52
