Электрофоретическое определение нейротрансмиттеров в биологических объектах с использованием OFF-LINE и ON-LINE концентрирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукоииси

jtc

СИДОРОВА АЛЛА АНАТОЛЬЕВНА

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ OFF-LINE И ON-LINE КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2006

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в ЦКП «Аналитическая спектрометрия» Санкт-Петербургского государственного политехнического университета.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Карцева Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты:

доктор технических наук, профессор Воронцов Александр Михайлович

доктор химических наук, профессор Дмитриенко Станислава Григорьевна

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Защита состоится 16 марта 2006 г. в 15.00 ч.

на заседании диссертационного совета Д 212.232.37 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 1990034 Санкт-Петербург, Средний проспект В О., д. 41/43. Большая химическая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

/А.Г. Папсуева/

ZOOGü

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. Нейротрансмиттеры (катехоламины и их метаболиты, нейротрансмиттерные гидрокси- и аминокислоты) играют важн> ю роль в регуляции деятельности сердечно-сосудистой и эндокринной систем, процессах обучения и памяти Измерение их содержания в биологических образцах является актуальной задачей и имеет важное практическое значение для клинической диагностики различных заболеваний (болезнь Паркинсона, Альцгеймера, феохромоцитома, нейробластома и др.)

Поскольку концентрации биогенных аминов и аминокислот в биологических жидкостях находятся на уровне нанограммовых количеств, требуются высокочувствительные и селективные методы их определения.

Традиционно используют иммунологические методы и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с УФ-, флуоресцентным и электрохимическим детектированием. Помимо явных достоинств, они имеют и некоторые ограничения. Иммунологические методы позволяют с высокой специфичностью определять только один компонент в ходе анализа, а для ВЭЖХ часто требуется проводить дериватизацию.

Основными методами анализа нейротрансмиттеров без перевода в производные являются обращенно-фазовая ВЭЖХ с амперометрическим детектированием и рач точные варианты капиллярного электрофореза, характеризующиеся высокой эффективностью и обеспечивающие разделение ионных и нейтральных аналитов.

Актуальность проблемы подтверждается поддержкой исследований в этом направлении со стороны центра фундаментального естествознания (гранты АСГ1-303375 и АСП-305104).

Цель работы. Разработка стратегии электрофорегического разделения и определения биогенных аминов (адреналин (А), норадреналин (NA), дофамин (DA), серотонин (Ser)), их предшественников (3,4-дигидроксифенилаланин, триптофан) и метаболитов (метанефрин (MN), норметанефрин (NMN), ванилил миндальная кислота (VMA), гомованилиновая кислота (HVA), кинуренин (Куп), 3-гидроксикинуренин (ЗОНК)) в биологических объектах с использованием off-line и on-line концентрирования.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи 1. Установить закономерности и выявить доминирующие факторы, определяющие электрофоретическое разделение нейрот аслшцеров и их основных и

РОС. национальна^

Библиотека i

кипотных метаболитов методами капиллярного зонного электрофоре« (КЗ')) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) 2 Разработать метод пробоподготовки реальных биологических объектов для электрофоретического определения аналитов, выяснить возможности различных вариантов off-line и on-line концентрирования с целью снижения предела обнаружения аналитов. 3. Предложить схемы анализа реальных биологических объектов (моча, плазма и сыворотка крови, структуры мозга) при определении нейротрансмиттеров.

Научная новизна

Выявлены факторы (состав, рН и концентрация рабочего буфера, условия ввода пробы), определяющие закономерности электрофоретического разделения нейротрансмиттеров различной природы и позволяющие прогнозировать пути оптимизации анализа сложных смесей органических соединений в режимах КЗЭ и МЭКХ.

Обнаружен эффект влияния макроциклов (18-кра>н-6, 4,13-диаза-18-краун-6, Р-циклодекстрина) и ион-парного реагента (додецилсульфата натрия) при электрофоретическом разделении нейротрансмиттеров и в ходе пробоподготовки при жидкостно-жидкостной и твердофазной экстракции.

Определены возможности off-line и on-line концентрирования (стэкинга) нейротрансмиттеров из биологических объектов для снижения предела обнаружения аналитов в режиме КЭ.

Практическая значимость работы

Разработан метод электрофоретического определения (КЗЭ и МЭКХ) нейротрансмиттеров в плазме крови, моче, структурах мозга, слезной жидкости с УФ-детектированием.

Предложены пути снижения пределов обнаружения при электрофоретическом определении катехоламинов, их предшественников и метаболитов в 10 - 1000 раз с использованием твердофазной экстракции (оксид алюминия и С18, модифицированный додецилсульфатом натрия) и on-line концентрирования.

Показана возможность выявления и контроля различных патологий, связанных с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями, посредством электрофоретического анализа биологических жидкостей (моча, плазма и сыворотка крови).

Разработан вариант капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) для количественного анализа смесей триптофана и его метаболитов (кину ренин, 3-гидроксикинуренин, кинуреновая кислота) в реальных объектах Результаты данной работы используются Санкт-

Петерб\ ргским Государственным Институтом физиочогии им Павлова для

и тения кинуренинового пути метаболизма триптофана. Положения, выносимые иа защиту

1 Результаты исследования влияния концентрации и pH буферного электролита, органических модификаторов (диэтиламин, триэтаноламин, ацетонитрил) и комплексообразователей (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6; ß-циклодекстрин; додецилсз льфат натрия) в составе рабочего буфера на электрофоретическое разделение нейротрансмиттеров в режиме капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной элекгрокинетической хроматографии (МЭКХ).

2 Влияние макроциклов как компонентов буферных систем (18-краун-6, 4.13-диаза-18-краун-6, ß-цикло декстрина) на эффективность и селективность элекгрофоретического разделения катехоламинов и их метаболитов и количественная оценка комплексообразования в системе «макроцшы-субстрат».

3. Оптимизированный регламент пробоподготовки биологических жидкостей (сыворотки, плазмы крови и мочи) при определении нейротрансмиттеров методами КЗЭ и МЭКХ с использованием твердофазной и жидкостной экстракции.

4 Способы on-line концентрирования (электростэкинг; стэкинг с большим вводом пробы; стэкинг с усилением поля) для увеличения УФ-чувствительности элекгрофоретического определения катехоламинов и их метаболитов методами капиллярного электрофореза (МЭКХ, КЗЭ).

5 Обоснование возможности и преимуществ электрофоретического определения биогенных аминов, нейротрансмиттерных гидрокси- и аминокислот в биологических объектах.

6. Практические приложения выявленных закономерностей:

- определение катехоламинов и их метаболитов методом КЗЭ в сыворотке крови и моче;

- определение триптофана и его метаболитов методом КЗЭ и МЭКХ в структурах мозга.

Публикапми и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в

3 статьях и 10 тезисах докладов. Результаты исследований докладывались на

Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографические приборы»

(2004, Клязьма); III Научной сессии УНЦХ СПбГУ (2004, Санкт-Петербург);

V Международной конференции по реабилитологии (2004, Москва); The

8-th Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry "Stress and

Behavior" (2004, St-Petersburg, Russia); The XXIXth Symposium "Chromatographic

methods of investigating the organic compounds" (2005, Katowice - Szczyrk, Poland);

5

International conference "Analytical chemistry and chemical analysis" (2005, Kiev, Ukraine); II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» (2005, Краснодар, Россия).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав с обсуждением полученных результатов, экспериментальной части, практического применения, приложения, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (162 наименования). Работа изложена на 184 страницах машинописного текста, содержит 4 схемы, 23 таблицы и 76 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования Отмечена перспективность использования метода капиллярного электрофореза при определении важнейших нейротрансмиттеров (биогенных аминов, гидрокси- и аминокислот) в биологических объектах

1-я глава (Обзор литературных данных) состоит из 4 разделов, в которых обсуждаются общие сведения о нейротрансмиттерах; пути их биосинтеза и ф> нкции в организме; физико-химические методы исследования (иммунологические, хроматографические и электрофоретические), варианты дериватизации, пробоподготовка биологических жидкостей при хроматографическом и электрофоретическом определении биогенных аминов и аминокислот

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов и методов исследования.

В 3-й главе предметом обсуждения является изучение электрофоретического поведения нейротрансмнттеров при определении их методами КЗЭ и МЭКХ с УФ- и МС-детектированием.

Показана возможность определения алифатических нейротрансмиттерных аминокислот (глицин, у-аминомаслянан кислота, глутаминоваи кислота, аспарагиновая кислота) в режиме КЭ на приборе «КАПЕЛЬ 105» с переводом в фенилтиокарбамоильные производные (при /. = 254 нм) и без предварительной дериватизации (при X = 190 нм).

Изучение закономерностей электрофоретического поведения аналитов проводили на 3-х сериях модельных систем: биогенные амины, нейротрансмиттерные ароматические гидрокси- и аминокислоты:

1 Оофамин (DA), серотонин (Ser), норадренашн (NA), норметанефрин (NMN), адреналин (А), метанефрин (MN),

2 ванилилминОальная кислота (VMA), гомованилиновая кислота (HVA), 3,4-

дигидроксифениюланин (DOPA), 5-гидроксииндолуксусная кисчота (HIA),

6

1 гприптофпн (Тгр), 3-гиОроксикинуренин (ЗОНК), кииуренин (Куп), кинуреновая

кислота (Куп acid).

Химическая стр\ кт\ ра этих соединений в значительной степени диктовала выбор рабочего электролита с определенным значением рН. После серии предварительных экспериментов определение и разделение биогенных аминов осуществляли в кислой среде в виде катионов за счет протонирования аминогруппы молек\ л аналитов Варьировались концентрации буферных электролитов на основе ацетата аммония (рН 4.0) (15-50 мМ) и уксусной кислоты (рН 3.0) В качестве добавок, модифицирующих стенки кварцевого капилляра, использовали гидрохлорид диэтиламина, н-бутиламин и триэтаноламин.

Оптимальные результаты были получены с участием следующих рабочих электролитов: 25 мМ ацетатно-аммонийный бу ферный раствор, 20 мМ диэтиламин и 0,175 М уксусная кислота, 30 мМ триэтаноламин (Рис. 1).

1 ^ Рис. 1. Электрофореграмма модельной смеси

(дофамин (1), серотонин (2), иорадреналин (3), i 4 норметанефрин (4), адреналин (5), метанефрин

(6)) 10 мг/л в 1 М растворе уксусной кислоты

Прибор: «Agilent 1100», X = 200 HM, 1^о6щ — 60 см, Ь,фф = 50 см, d = 50 мкм;

| : | 1 . J1 ввод пробы: 50 мбар, 20 с;

wJ w U \J рабочий электролит 1 %-ный раствор уксусной

кислоты и 30 мМ триэтаноламина; рН 3.0.

При этом оставалась нерешенной проблема разделения дофамина и серотонина.

На электрофоретические характеристики аналита (подвижность, разрешение, эффективность и селективность разделения) помимо природы, концентрации и рН рабочего электролита влияют органические растворители и комплексообразователи в составе рабочего буфера, что было детально изучено на примере пары дофамин/серотонин Дофамин - маркер таких заболеваний как шизофрения, болезни Паркинсона и Альцгеймера, для диагностики которых необходимо контролировать как содержание самого дофамина, так и его соотношение с серотонином

Введение 18-краун-6 (18-К-6) в состав буферного электролита с рН < 7 должно было бы повлиять на электрофоретические характеристики протонированных аминосоединений за счет комплексообразования последних с макроциклом.

Для исключения конкурентного комплексообразования с ионами аммония ацетатно-аммонийного буфера был выбран рабочий электролит на основе 1 %-ного раствора уксусной кислоты и раствора триэтаноламина (ТЭА), рН 3.0.

Введение 18-К-6 в состав электролита позволило разлепить зту пару соединений (Рис 2). Влияние краун-эфира значительно сказывается лишь на электрофоретических характеристиках аналитов с первичной аминогруппой (дофамин, норадренатин, серотонин) и практически не влияет на вторичные амины (например, адреналин) (Рис. 3) Именно поэтому в данных условиях адреналин (вторичный амин) и норметанефрин (первичный амин) элюируются одним пиком (Рис.2), что подтверждено и резу льтатами расчета констант комплексообразования в системе «макроцикл-аналит» (дофамин 10 ± 2 л/моль, серотонин 14 ± 3 л/моль, норадреналин 13 ± 3 л/моль) Для вторичных аминов соответствующие значения оказались крайне малы, и количественная оценка их методом КЭ невозможна

Р-

£ ЪШ * чш \ „».

iпАл л Л«» n/(?n ir'» tftr nrk"! pir яЛ< г Am

I в-KOI И

Рис. 2. Электрофореграмма рис. з. Графические зависимости модельной смесн биогенных аминов эффективных электрофоретических

подвижностей биогенных аминов от

«Agilent 1100 CE», X = 200нм.

Рабочий электролит- 1%-ный р-р концентрации 18-К-6 СНзСООН, ЮмМТЭА, ЮмМ 18-К-6

Наряду с увеличением коэффициента разрешения (Кя) пары дофамин/серотонин (от 0,5 до 4,9) наблюдается и заметный рост эффективности (К) (для дофамина от 4x105 т.т. до 8><105 т т.).

В отличие от макроциклов ион-парный агент, каким является додецилсульфат натрия (ДДСН), изменяет электрофоретические подвижности как первичных, так и вторичных аминов, что позволило полностью разделить смесь катехоламинов и их метаболитов. Однако в этом случае рост селективности разделения сопровождался значительным снижением эффективности (Рис. 4, 5).

I + 4 мМ + 5%

Рис. 4. Электрофореграмма модельной смеси катехоламинов (дофамин (DA), норадреналин (NA), адреналин (А), метанефрии (MN), норметанефрин (NMN), серотонин (Ser))

Прибор' «Капель 105», ?„Ш11С=210 нм

Из\ чено влияние ДДСН и ацетонитрила на эффективность и селективность разделения аналитов в режиме КЗЭ (Рис 4, 5) Введение ацетонитрила, изменяющего сольватнл ю оболочку аналитов, в состав электролита, содержащего 4 мМ ДДСН, позволило резко увеличить эффективность при сохранении

Ряс. Влияние ДДСН и ацетонитрила на эффективность определения катехоламииов и их метаболитов в режиме КЗЭ

1 - 1 %-ный р-р СНзСООН, 30 мМ ТЭА

2 - 1 %-ный р-р СН,СООН, 30 мМ ТЭА, 4 мМ ДДСН

3 - 1 %-ный р-р СНзСООН, 30 мМ ТЭА,

4 мМ ДДСН, 5% СНяСК

1 2 3

В режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (10 мМ

ДДСН) удалось достичь требуемого разрешения с высокой эффективностью лишь с участием 4,13-диаза-18-крау н-6 (4мМ) (Табл. 1,Рис 6,7)

Таблица 1. Зависимость коэффициента разрешения и эффективности от концентрации 4,13-дназа-18-К-6 в буферном электролите (25 мМ фосфатного буфера, рН 7.0, 10 мМ ДДСН)

селективности разделения (Рис 4, 5).

■ норадреналин

□ дофамин

□ норметанефрин

□ адреналин

□ метанефрин

Концентрация Ив Эффективность ХЮ3 т.т.

4,13-диаза-18-К-6, мМ тел/А АЛ)А КА А ЭА

0 1,7^0,1 1,0=0,1 76 9 16

2 2,7±0,3 9,2±0,2 154 41 77

4 1,2±0,1 6,5±0,2 171 172 88

6 0,6±0,1 1,6+0,1 15 101 12

норадреналин

адреналин

дофамин

О 5

[4 11 диазаНв.К.б], нИ

Рис. 6. Зависимость электрофоретической Рис. 7. Электрофореграмма подвижности компонентов смеси от модельной смеси катехоламинов

концентрации 4,13-диаза-18-К-6 в буферном буферный электролит: 25 мМ

электролите (фосфатный буфер рН 7.0, 10 фосфатный буфер рН 7.0, 10 мМ

мМ ДДСН) ДДСН, 4 мМ 4,13-диаза-18-К-6.

Конкурирующее взаимодействие макроцикла и мицелл «за аналит» с участием водородных связей в наибольшей степени сказалось на дофамине, что может быть независимо использовано при его индивиду альном определении.

Задача электрофоретического разделения кислотных метаболитов катехоламинов, гомовапилиновои (НУА), ванили миндальной (УМА),

9

5-гиОроксиин<)о1-3-уксуснои (HIA), ЗЛ-Оигидроксифеничалатиш (DOPA) - маркеров опухолевых процессов - была решена с участием макроцикла с гидрофобной полостью (ß-циклодекстрина (ß-ЦД)). Использовали рабочий электролит с pH > 7, и нейротрансмиттерные аминокислоты разделялись в виде анионов (Рис 8)

Рис. 8. Электрофореграмма модельной смеси биогенных аминов и нейротрансмиттерных кислот

«КАПЕЛЬ 103Р» >.=254 нм;

Рабочий электролит: 20 мМ боратный буфер (рН 8 1), 30 мМ р-цд

_____ __ Для расширения диапазона растворимости Р-ЦД в

состав рабочего электролита вводили органические модификаторы (диметилсульфоксид (ДМСО), ацегонитрил) Снижение подвижностей кислот происходило в разной степени в зависимости от их структуры и природы органического растворителя, а в случае ацетонитрила порядок элюирования компонентов даже обращался (Рис. 9. а, б), что обусловлено различной сольватацией ионов и устойчивостью образующихся комплексов (Табл. 2)

6»

POPA VW«

UVA

б)

DOPA ШД

С ЭК ÍSX ДОС WK

ict»i fc

аил ama ж

Рис. 9. Графические зависимости эффективных электрофоретических подвижностей ароматических кислот от концентрации макроцикла в буфере

а) боратный буфер +10% СН}СМ;

б) боратный буфер +15% ДМСО

Таблица 2. Значении констант устойчивости [л/моль] комплексов ароматических кислот с -ПД в различных буферных системах

----__Аналит Буфер ——-__ DOPA VMA HVA HIA

боратный буфер 6±1 27±2 56±6 31±2

боратный буфер +15% ДМСО 30±6 54±2 26±2 33±5

боратный буфер +10% CH3CN 13±2 17±1 22±1 18±1

В режиме КЗЭ выявлены факторы, определяющие закономерности эчектрофоретического поведения триптофана и его метаболитов, содержание которых резко возрастает при катаракте, глаукоме, урологических патологиях'

сютав, рН и концентрации блферною электролита время ваода пробы и напряжение, что по ¡воли та подобрать оптим&тьный режим и\ разделения (Рис 10)

Рис. 10. Электрофореграмма модельной смеси аминокислот (триптофан, кинуренин, 3-гидроксикииуренин, кинуреновая кислота)

«КАПЕЛЬ 105», 227 нм;

рабочий электролит- 5 мМ тетрабората натрия, рН 9 0

Ввод пробы- 30 мбар, 20 с.

-г-¡г-?-

Пределы обнаружения ароматических гидротеикислот составили 250 мкг/л, что является достаточным для их определения в реальных объектах Более высокие значения пределов обнаружения биогенных аминов не позвочяли проводить количественное определение их в биологических жидкостях.

В связи с этим был использован вариант on-line концентрирования, т.н стэкинг. Основной принцип его заключается в различии электропроводностей раствора пробы и буфера, электропроводность последнего больше Компоненты пробы ускоряются в более высоком поле матрицы образца и концентрируются на границе с буферным электролитом (Рис. 11). Испытано несколько вариантов-стэкинг с усилением поля, использование "водной пробки", бочъиюй объем вводимого раствора пробы и электростэкинг

Наилучшие результаты получили,

+ i 1Ж<:г : ч"ЗШЖ^^ ИСП0ЛЬЗУЯ 'лектростэкинг и стэкинг с

¿У большим объемом образца.

+ g первом случае образец вводится

Рис. 11. Схематическое изображение

г электрокинетически под действием

стэкинга

-область низкопроводящей матрицы высокого напряжения (15 кВ, 90 с) -область высокопроводящей матрицы

Этот способ позволил снизить предел

обнаружения биогенных аминов до 2 5 мкг/л При стэкинге с большим объемом образца вводится «длинная» зона пробы (30 мбар, 90 с) из раствора с меньшей электропроводностью, чем у рабочего буфера Концентрирование происходит за счет низкой проводимости матрицы образца на границе раздела между зонами пробы и буфера Предел обнаружения биогенных аминов составил 50 мкг/л Свой выбор мы остановили на последнем варианте, поскольку воспроизводимость электростэкинга недостаточна.

Оценку степени концентрирования проводили по значениям факторов концентрирования (вЕРь) (Табл. 3).

высота пика полученного при концентрировании ^ ? где Л — доля разбавления

высота пика, полученного при обычных условиях ввоОапробы (2с)

Варианты on-line концентрирования DA | NA | NMN | А | MN

SEFh

СТЭКИН1 L усилением и» (я 30 мбар, 20с. С - 10 чг/т 15-1 | 13 ±1 | 12 ^ 2 | 12 = 1 | 13±1

Преде т обнаружения 500 мкг/л

С1ЭКИН1 с большим ВВО ЮМ пробы 30 мбар, 20с С - 10 мг/л 16- 1 | 14= 1 | 14 ± 1 | 14= 1 | 14^ 1

Предел обнаружения 900 mki/л

'(0 мбар, 90с С= 100 мкг/i 36 = 2 | 35 = 2 | 34± 1 | 36= 1 | 39± 1

Пре ie. 1 обнаружения 50 mki /л

злектрос гзкинг с большим вводом пробы 10 кВ, 12с С = 10 мг/л 5±2 | 4±2 | 4 ± 2 | 4=1 | 4±2

Предел обнару жения 1 ООО мкг/л

15 кВ 90 с С - 100 мкг/1 194=45 180±60 170±52 182=52 170=28

С = 25 мкг/т 500=80 405±42 36(Ь36 404±30 390=37

С = Ю мкг/л 720=85 580±54 560±40 670^93 585±86

Пре дел обнаружения 2,5 мм/л

"водная пробка" 30 мбар. 5с ввод пробы 30 мбар, 20 с С = 10 мг/л 14 ± 1 15 ± 1 13± 1 12 ± 1 12= 1

Предел обнару жения 500 мкг/л

Установленные закономерности электрофоретического разделения аналитов и выяснение возможностей on-lme концентрирования позволили перейти к анализу' реальных объектов (плазма и сыворотка крови, моча, структу ры мозга)

В процессе пробоподготовки биологических образцов изу чены возможности жидкостно-жидкостной (ЖЖЭ) и твердофазной экстракций (ТФЭ)

Для оптимизации условий ЖЖЭ варьировали матрицу образца, использовали процессы комплексообразования с участием 18-К-6 и формирования ионных пар с ДДСН; последний вариант оказался наиболее интересен

Биогенные амины в у словиях ан&тиза практически не переходят в органические растворители Для повышения их гидрофобности в раствор пробы был введен ион-парный реагент (20 мМ ДДСН) Отмечено, чго более гидрофобные аналиты (метабо шты катехоламинов) экстрагируются в большей степени (Табл 4).

Обнаруженное влияние макроциклов и ион-парных добавок оказалось полезным и при разработке стратегии твердофазной экстракции Испытаны оксид алюминия с рН поверхности < 7, силикагель, обращенно-фазовый сорбент С18

Основная схема твердофазной экстракции с использованием АЬОз для выделения катехотаминов из биообъектов представтена на Рис 12. На AbOs селективно сорбируются только катехоламины

Дру той самостоятельной задачей являлась одновременная экстракция катехоламинов и их метаболитов (Табл. 5)

12

Таблица 4. Степени экстракции биогенных аминов после проведения ЖЖЭ с этилацетатом с использованием ДДСН в составе пробы

DA 46% ± 2

NA 44% ± 1

NMN 63% I 2

А 44% ± 2

MN 64% -2

Для повышения селективности экстракции на силикагеле проводи ти предварительн> ю модификацию

сорбента раствором 18-К-6 Апатиты элюировали, используя конкурентное комплексообразование, раствором KNO3. При этом вторичные амины (адреналин, метанефрин) элюировались в большей степени (Табл 5) за счет меньшей стабильности комплекса аналита с макроциклом.

Обнаруженный факт находится в хорошем соответствии с проведенными нами расчетами констант комплексообразования в режиме КЭ

На гидрофобном обращенно-фазовом сорбенте С18 биогенные амины не удерживаются, поэтому по аналогии с жидкостно-жидкостной экстракцией в пробу добавляли раствор 18-краун-6 либо ион-парную добавку ДДСН, и на С18 сорбировались комплексы аминов с макроциклом либо ионные пары (Табл. 5).

Таблица 5. Степени ТФЭ катехоламинов и их метаболитов

Степень твердофазной экстракции, %

А1203 Силикагель, С 18,

н в модифицированный 18-К-6 модифицированный ДДСН

Э л ю е н т :

< 1М CHjCOOH 20мМ KN03 1М CHjCOOH 95% CFhCN 95% ClbOH

DA 84 ±3 28 ± 1 ^ 65 ± 1 68 ±6 96+4

NA 89 ±4 43 ±3 58 ±3 67 ±8 70±6

NMN 0 27 ±2 70 ±2 62 ±9 96±1

А 87 ±8 84 ± 1 61 ±2 75 ¿7 88±2

MN 0 77 ±2 69 ± 1 64 ±4 94±2

Проведенное off-line концентрирование привело к дополнительному снижению

предела обнаружения биогенных аминов в 10-20 раз, что обеспечило возможность

их электрофоретического определения в биологических объектах.

Проведена серия экспериментов по определению катехоламинов методом КЭ с

масс-спектрометрическим детектированием на приборе Agilent 1100 CE-ESI-MS и

показано, что предел обнаружения биогенных аминов в этом случае (в SIM режиме),

составляет 17 мкг/л, что сопоставимо со значениями, полученными при

использовании on-line концентрирования в режиме КЭ с УФ-детектированием

В качестве референтного метода для подтверждения правильности пот> чаемых

нами количественных данных по содержанию катехоламинов был использован

13

/. добавление Э/(Т i, 2 добавление it J) 1, 3. доведениерНр-ра до 8,5; 4 переманивание ? чин, 5. фильтрование

AljOj + биогенные ачнны

1. промывание водой (1*2 мл)

2. элюирование аналитов

IWр'ром уксусной кислоты

Рис. 12. Процесс ТФЭ биогенных аминов из реального образца.

метол обрашенно-фазовой высокоэффею-ивнон жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием (ОФ ВЭЖХ-АД) (Табл 6)

Таблица 6. Результаты меж набора горного количественного конт роля модельной смеси катсхол аминов____

Аиалит Введено (мкг/л) Найдено (мкг/л)

КЭ-УФ «КАПЕЛЬ 105» НПФ Люч жц Сакк! -i Iciepm pi ОФ ВЭЖХ-АД «Цвет-Яуза» i 1ПО Химатома i ика, Москш

адреналин 500 504 ± 10 500 ± 3

норадреналин 500 495 ± 8 504 з=2

дофамин 500 495 ± 10 499 - 2

При этом следует отметить, что определенный предел обнаружения катехоламинов в режиме ВЭЖХ с амперометрическим детектированием составил 46 нг/л для норадреналина, 28 нг/л для адреналина и 288 нг/л для дофамина. Это на порядок больше, чем в режиме капиллярного электрофореза с УФ- и МС-детектированием Однако электрохимическое детектирование возможно лишь для соединений, содержащих электрофорные функциональные группы, т.е. весь набор важнейших нейротрансмитгеров в таком варианте определить невозможно.

Таким образом, показаны возможности капиллярного электрофореза с УФ-детектором для количественного определения и селективного разделения сложных смесей органических соединений с амино-, гидрокси- и карбоксигруппами независимо от природы биологического объекта (Схема!)

Схема 1. Основные этапы пробоподготовки биологического объекта к анализу

Была поставлена серия специальных экспериментов на модельной системе нейротрансмитгеров (триптофана и его метаболитов (кинуренин, 314

гидроксикину ренин, кину реповая кислота)) для выяснения иолюлноыии высокоэффективной тонкое юйной хроматографии (В^ГСХ) в целях медицинской диагностики Использовались пластины на основе силика1еля, а также модифицированные Р-циклодекстрином и 18-краун-6 Разделения удалось достичь только на модифицированных пластинах Показано, что применение ВЭТСХ возможно лить при достаточно высоких содержаниях апатитов в биологических объектах (> 500 мкг/л).

В 4-ой главе представлены возможности практического применения разработанных вариантов электрофоретического разделения и определения нейромедиаторов

Обнаруженные на модельных смесях закономерности позволили предложить схему определения дофамина и норадренлшна в моче (Рис 13) и /ыаше крови для диагностики сердечно-сосудистых заболеваний

Рис. 13. Электрофореграмма реального объекта (мочи (а) и плазмы крови (б)) после ТФЭ с использованием АЬОз; исходный объем мочи 10 мл, плазмы 2 мл Прибор: «КАПЕЛЬ 105»;

] %-ный раствор уксусной кислоты (0 17М), 30 мМ триэтаноламина; ввод пробы: 30 мбар, 90 сек

Результаты количественного анализа методом абсолютной градуировки следующие:

в моче 200 мкг/сутки (DA), 30 мкг/сутки (NA); плате крови 350 мкг/л (DA), 1600 мкг/л (NA).

Самостоятельной задачей явилось изучение кипуренинового пути метаболизма триптофана (КПМТ), с которым связывают различные нейродегенеративные, урологические и глазные заболевания; болезни Паркинсона и Альцгеймера КПМТ возможен как в человеческом организме, так и у насекомых и грызунов.

Наиболее интересный биологический объект, на котором можно исследовать модельные мутации КПМТ, это - Дрозофилы, относительно короткая жизнь которых (50 дней) позволяет изучать различные биохимические изменения, происходящие с возрастом.

4

I

а)

Были протестированы мутанты Дрозофи 7 canton S, а также cardinal (избыток 3-гидроксикин\ ренина), cinnabar (избыток кинуреновой кислоты), vermilion (избыток триптофана) предоставленные институтом физиологии им Павлова

Реальный объект представлял собой гомогентат готов Дрозофт в фосфатном б>ферном растворе рН 8.0 (Рис 14)

Содержание З-гидроксикину ренина составило от 40 до 500 нг/мг ткани, в зависимости от мутации и половой принадлежности мух.

1 Установлены закономерности электрофоретического разделения катехоламинов и их метаболитов и выявлены доминир> ющие факторы- модификатор поверхности кварцевого капилляра (диэтиламин, триэтаноламин), комплексообразователи (18-К-6, 4,13-диаза-18-К-6, р-циклодекстрина, додецилсульфата натрия (ДДСН)) и органические растворители (ацетонитрил, диметилсульфокеид) в составе рабочего электролита.

2. Обнар>жено влияние махроциклов (18-К-6, 4,13-диаза-18-К-6, (3-циклодекстрина) и ион-парного реагента (ДДСН) на эффективность и селективность электрофоретического раздатения катехоламинов и их кислотных и основных метаболитов в режиме капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии. Проведена количественная оценка комплексообразования в системе «макроцикл-иналит».

3. Разработан унифицированный регламент пробоподготовки биологических объектов (моча, плазма и сыворотка крови, структуры мозга) для электрофоретического анализа, основанный на различных вариантах жидкостной (экстрагент - этилацетат) и твердофазной экстракции (АЬОз; силикагель, модифицированный 18-К-6; С18 с использованием додецилсульфата натрия в составе анализируемой пробы).

4 Выявлены возможности различных вариантов on-line концентрирования (электростэкинг, стэкинг с большим вводом пробы, стэкинг с усилением поля) и

Рис.14. Электрофореграмма реального образца (гомогенизат голов Дрозофил).

Прибор. «Agilent 1100 СЕ», X = 227 нм. Рабочий электролит: 7 мМ боратный буферный раствор рН 8,14

ВЫВОДЫ

показано, что стэттг с Сючьишм ввооон пробы снижает npezie*1 обнаружении биогенных аминов до 50 мкг/л и позволяет проводить анализ биологических жидкостей методом капиллярного электрофореза

5 Предложена схема электрофоретического анализа реальных объектов: (плазма и сыворотка крови, моча и структуры мозга)

- определение норадреналина и дофамина в плазме крови и моче методом КЗЭ,

- определение триптофана и его метаболитов в структурах мозга и слезной жидкости методом КЗЭ и МЭКХ.

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Л А. Карцова, А А Сидорова, В.А Казаков, ЕА Бессонова, А Я Яшин Определение катехоламинов методами капиллярного электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ // Журнал Аначит. Химии 2004 Т.59. №8 С.826 -831.

2 Л А Карцова, ЕА. Бессонова, А А Сидорова, И А Тверьянович, В А Казаков, ЛИ Вечиканова. Определение адреналина, норадреналина, дофамина методом капиллярного электрофореза//Журнал прикл Химии. 2004. Т 77 С.1164 — 1169.

3. В А Казаков, М.Н. Сляднев, А.А Сидорова, Л А Карцова, А А Ганеев, Л.Н Москвин. Оптимизация условий определения катехоламинов методом капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием // Научное приборостроение 2004. Т. 14. №1. С. 33-44.

4. Л А Карцова, А А Сидорова, О В Ганжа. Оптимизация процедуры пробоподготовки при определении нейротрансмиттеров в структурах мозга методами масс-спектрометрии и капиллярного электрофореза // Тезисы Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы" Москва. Клязьма. 2004. С. 199.

5. DS Orlov, A A Sidorova, IA Tveryanovich, VA Popova, PD Shabanov. Modem methods for détection of biologically active compounds // Тезисы. Психофармакология и биологическая наркология (Psychopharmacology & Biological narcology). 2004. T 4. № 2-3 С. 705.

6 LA Kartsova, A A Sidorova, О V Ganzha, S. V Nikotaev, P D Shabanov The détermination of neurotransmitters in rat brain structures by capillary electrophoresis and mass spectrometry// Тезисы Psychopharmacology & Biological narcology 2004. T. 4. № 2-3. C. 710.

7 Л A Карцова, E.A Бессонова, A A Сидорова, О В Ганжа. Использование возможностей капиллярного электрофореза для диагностики эндокринных и

онкологических заболеваний // Теотсы V Межд\ народная конференция по реабилитологии 2004. С. 116

8 Л А Карцова, А А Сидорова В А Казаков, ЕА Бессонова, А Я Яшин. Определение катечоламинов методами КЭ и ОФ ВЭЖХ // Тезисы. Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы" Москва. Клязьма. 2004. С. 169.

9 A A Sidorova, LA Kartsova The application of macrocyctic reagents for electrophoresis separation of organic compounds with ammo-, hydroxyl-, and carboxyl groups // The XXIXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" Thesis. Katowice. Poland. 2005 P. 72.

10 A A Sidorova, L A. Kartsova, A Alekseeva. The study of kynurcnine pathway by capillary electrophoresis // International conference "Analytical chemistry and chemical analysis". Thesis Kiev. Ukraine. 2005. P. 150.

11 А А СиОорова, Л.А Карцова, OB 1'анжа, А.С Иванова. Разработка алгоритма пробоподготовки биологических объектов (сыворотка и плазма крови, моча, ткани мозга) при электрофоретическом определении нейротранечиттерных аминокислот и биогенных аминов // II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» Тезисы. Краснодар. 2005. С. 259.

12 А А Сидорова, Л А Карцова. Метод капиллярного электрофореза при изучении кину ренинового пути метаболизма триптофана // II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» Тезисы Краснодар 2005. С. 258.

13 .ОИ Маркова, Л А Карцова, А А Сидорова. Определение гомованилиновой и

ванилинчиндальной кислот методом зонного капиллярного электрофореза с fl-циклодекстрином в составе буферного электролита // II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии». Тезисы. Краснодар. 2005. С 371-372.

Подписано в печать 06 02 2006. Формат бумаги 60x84 1/16 Бу мага офсетная. Печать ризографическаная Усл. печ. л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 3731 Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр 26

г

40 - 35 28

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Общая характеристика нейротрансмиттеров.

1.2. Методы определения нейротрансмиттеров в биологических объектах.

1.2. 1. Иммунологические и радиохимические методы анализа.

1.2. 1. 1. Иммунологический анализ.

1.2. 1.2. Радиоферментный анализ.

1. 2. 2. Газовая хроматография.

1.2. 2. 1. Силилирование.

1. 2. 2. 2. Алкилирование.

1. 2. 2. 3. Ацилирование.

1.2.3. Определение биогенных аминов и аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

1. 2. 3. 1. УФ- и флуориметрическое детектирование.

1. 2. 3. 2. Электрохимическое детектирование.

1.2.4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ).

1.2.5. Метод капиллярного электрофореза (КЭ) при определении нейротрансмиттеров.

1. 2. 5. 1. Основы метода капиллярного электрофореза.

1. 2. 5. 2. Основные варианты капиллярного электрофореза (КЭ).

1. 2. 5. 2. 1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ).

1.2.5.2.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография

МЭКХ).

1. 2. 5. 3. Методы детектирования в капиллярном электрофорезе.34 1. 2. 5. 3. 1. УФ-детектирование в капиллярном электрофорезе.

1. 2. 5. 3. 2. Флуоресцентное детектирование.

1. 2. 5. 3. 3. Электрохимическое детектирование.

1. 2. 5. 3. 4. Масс-спектрометрическое детектирование.

1. 2. 5. 4. Возможности on-line концентрирования в КЭ.

1.2.5.5. Эффективность, разрешение и селективность разделения в методе капиллярного электрофореза.

1.2.5.6. Характеристика макроциклических реагентов, используемых в капиллярном электрофорезе.

1.3. Пробоподготовка биологических объектов к электрофоретическому определению биогенных аминов и аминокислот.

1.3. 1. Твердофазная экстракция.

1. 3. 2. Жидкостная экстракция катехоламинов.

1. 3. 3. Жидкостная экстракция аминокислот.

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. 1. Аппаратура.

2. 2. Реагенты.

2. 3. Методы исследования.

2 .3 .1. Метод капиллярного электрофореза с УФ-детектированием.

2. 3. 2. Метод капиллярного электрофореза с МС-детектированием.64 2.3.3. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза.

2. 3. 4. Метод высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

2. 3. 5. Использование обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием при определении катехоламинов.

2.3.6. Масс-спектрометрический анализ реальных объектов и индивидуальных нейротрансмиттеров.

2. 3. 7. Пробоподготовка биологических объектов к анализу.

ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ ДОМИНИРУЮЩИХ ФАКТОРОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ.

3. 1. Нейротрансмиттеры. Задачи и проблемы их определения в биологических жидкостях.

3.2. Установление факторов, влияющих на электрофоретическое разделение биогенных аминов.

3.2. 1. Оптимизация электрофоретического разделения биогенных аминов методом капиллярного электрофореза с УФ-детектированием.

3.2.1.1. Оценка констант устойчивости комплексов биогенных аминов с 18-краун-6.

3.2.1.2. Сравнительные оценочные характеристики влияния макроциклов, ион-парного агента и органического растворителя на электрофоретическое разделение аналитов.

3.2.2. Влияние Р-циклодекстрина на электрофоретические характеристики нейротрансмиттерных ароматических кислот.

3.2.2.1. Оценка констант устойчивости комплексов ароматических кислот с p-циклодекстрином.

3.2.3. Определение ароматических кислот методом МЭКХ с УФдетектированием.

3. 2. 4. Выяснение возможностей электрофоретического определения алифатических аминокислот методом капиллярного электрофореза с УФ-детектированием без предварительной дериватизации и с использованием фенилтиокарбамоильных производных.

3.2.5. Изучение кинуренинового пути метаболизма триптофана методами капиллярного электрофореза.

3.2.6. Определение биогенных аминов методом капиллярного электрофореза с масс-спектрометрическим детектированием.

3.2.7. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза.

3.3. Хроматографическое определение нейротрансмиттеров.

3.3.1. Анализ катехоламинов методом ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием.

3.3.2. Определение триптофана и его метаболитов методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

3.4. Масс-спектрометрическое определение нейротрансмитгеров на приборе MALDI-TOF "Voyager DE".

3. 5. Пробоподготовка биологических жидкостей к анализу.

3.5. 1. Оптимизация условий пробоподготовки биологических объектов для масс-спектрометрического анализа.

3.5.2. Пробоподготовка биологических жидкостей для электрофоретического и хроматографического определения.

3.5.2.1. Твердофазная экстракция катехоламинов на активированном оксиде алюминия.

3. 5. 2. 2. Твердофазная экстракция катехоламинов на силикагеле.

3.5.2.3. Твердофазная экстракция катехоламинов на модифицированном С18.

ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ.

4.1. Определение лекарственного препарата «Алкеран».

4. 1. 1. Определение мелфалана в режиме капиллярного зонного электрофореза.

4.2. Определение 3-гидроксикинуренина в структурах мозга Дрозофил.

4. 2. 1. Кинурениновый путь метаболизма триптофана.

4. 2. 2. Оптимизация условий определения и разделения метаболитов кинуренинового пути триптофана в режиме капиллярного электрофореза.

4. 2. 3. Определение 3-гидроксикинуренина, кинуренина и триптофана в реальном образце методом капиллярного электрофореза.

4.3. Определение катехоламинов в биологических жидкостях при сердечно-сосудистых заболеваниях.:.

ВЫВОДЫ.

ПРИМЕЧАНИЯ.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

Актуальность проблемы. Нейротрансмиттеры (катехоламины и их метаболиты, нейротрансмиттерные гидрокси- и аминокислоты) играют важную роль в регуляции деятельности сердечно-сосудистой и эндокринной систем, процессах обучения и памяти [1]. Измерение их содержания в биологических образцах имеет важное практическое значение для клинической диагностики различных заболеваний (болезнь Паркинсона, Альцгеймера, феохромоцитома, нейробластома и др.) [2].

Поскольку концентрации биогенных аминов и аминокислот в биологических жидкостях находятся на уровне нанограммовых количеств, требуются высокочувствительные и селективные методы их определения [3].

Традиционно используют иммунологические методы и высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с УФ-, флуоресцентным и электрохимическим детектированием [3]. При этом иммунологические методы позволяют с высокой специфичностью определять только один компонент в ходе анализа, а для ВЭЖХ часто требуется проведение дериватизации. Основные методы анализа нейротрансмиттеров без перевода в производные - ОФ ВЭЖХ с амперометрическим детектированием [4] и капиллярный электрофорез, характеризующийся высокой эффективностью и обеспечивающий разделение ионных и нейтральных аналитов [5-7].

Цель диссертационного исследования. Разработка стратегии электрофоретического разделения и определения биогенных аминов и их метаболитов в биологических объектах с использованием off-line и on-line концентрирования.

Научная новизна. Выявлены факторы (состав, рН и концентрация рабочего буфера, органические растворители и комплексообразователи в составе электролита, условия ввода пробы), определяющие закономерности % электрофоретического разделения нейротрансмиттеров различной природы и позволяющие прогнозировать пути оптимизации анализа сложных смесей.

Обнаружен эффект влияния макроциклов (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6, p-циклодекстрина) и ион-парного реагента (додецилсульфата натрия) на эффективность и селективность электрофоретического разделения нейротрансмиттеров.

Определены возможности off-line и on-line концентрирования (стэкинга) нейротрансмиттеров из биологических объектов для снижения предела обнаружения аналитов в режиме КЭ.

Практическая значимость работы. Разработан метод электрофоретического определения (КЗЭ и МЭКХ) нейротрансмиттеров в плазме крови, моче, структурах мозга, слезной жидкости с УФ-детектированием.

Предложены пути снижения пределов обнаружения при электрофоретическом определении биогенных аминов и их метаболитов в 10 - 1000 раз с использованием твердофазной экстракции (оксид алюминия и С18, модифицированный додецилсульфатом натрия) и on-line концентрирования.

Показана возможность выявления и контроля различных патологий, связанных с сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями, посредством электрофоретического анализа биологических жидкостей (моча, плазма и сыворотка крови).

Разработан вариант капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) для количественного анализа смесей триптофана и его метаболитов (кинуренин, 3-гидроксикинуренин, кинуреновая кислота) в биологических образцах.

Положения, выносимые на защиту

1. Результаты исследования влияния концентрации и рН буферного электролита, органических модификаторов и комплексообразователей в составе рабочего буфера на электрофоретическое разделение нейротрансмиттеров в режиме КЗЭ и МЭКХ.

2. Влияние макроциклов как компонентов буферных систем (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6, p-циклодекстрина) на эффективность и селективность электрофоретического разделения катехоламинов и их метаболитов и количественная оценка комплексообразования в системе «макроцикл-субстрат».

3. Оптимизированный регламент пробоподготовки биологических жидкостей с использованием твердофазной и жидкостной экстракции.

4. Способы on-line концентрирования (электростэкинг; стэкинг с большим вводом пробы; стэкинг с усилением поля) для увеличения УФ-чувствительности электрофоретического определения биогенных аминов.

5. Обоснование возможности и преимуществ электрофоретического определения нейротрансмиттеров в биологических объектах.

6. Практические приложения выявленных закономерностей:

- определение биогенных аминов методом КЗЭ в сыворотке крови и моче;

- определение триптофана и его метаболитов в структурах мозга.

выводы

1. Установлены закономерности электрофоретического разделения катехоламинов и их метаболитов и выявлены доминирующие факторы: модификатор поверхности кварцевого капилляра (диэтиламин, триэтаноламин), комплексообразователи (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6, p-циклодекстрина, додецилсульфата натрия (ДЦСН)) и органические растворители (ацетонитрил, диметилсульфоксид) в составе рабочего электролита.

2. Установлено влияние макроциклов (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6, p-циклодекстрина) и ион-парного реагента (ДЦСН) на эффективность и селективность электрофоретического разделения катехоламинов и их кислотных и основных метаболитов в режиме капиллярного зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии. Проведена количественная оценка комплексообразования в системе «макроцикл-аналит».

3. Разработан унифицированный регламент пробоподготовки биологических объектов (моча, плазма и сыворотка крови, структуры мозга) для электрофоретического анализа, основанный на различных вариантах жидкостной (этилацетатом) и твердофазной экстракции (А120з; силикагель, модифицированный 18-краун-6; С18 с использованием додецилсульфата натрия в составе анализируемой пробы).

4. Выявлены возможности различных вариантов on-line концентрирования (электростэкинг, стэкинг с большим вводом пробы, стэкинг с усилением поля) и показано, что стэкинг с большим вводом пробы позволяет снизить предел обнаружения биогенных аминов до 50 мкг/л, что обеспечивает возможность анализа биологических жидкостей методом капиллярного электрофореза.

Предложена схема электрофоретического анализа реальных объектов: (плазма и сыворотка крови, моча и структуры мозга)

- определение норадреналина и дофамина в плазме крови и моче методом КЗЭ,

- определение триптофана и его метаболитов в структурах мозга и слезной жидкости методом КЗЭ и МЭКХ.

1. Розен В.Б. Основы эндокринологии / М. 1994. 384 с.

2. D.-C. Chen, D.-Z. Zhan, C.-W. Cheng, A.-C. Liu, C.-H. Chen. Determination of urine catecholamines by capillary electrophoresis with dual-electrode amperometric detection // J. Chrom. B. 2001. V.750. P.33-39.

3. R.P.H. Nikolajsen, A.M.Hansen. Analytical methods for determining urinary catecholamines in healthy subjects // Analytica Chimica Acta. 2001. V.449. P. 1-15

4. J.Lange, K. Thomas, C. Wittmann. Comparison of a capillary electrophoresis method with high-performance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples // J. Chrom. B. 2002. V. 779. P. 229-239

5. J.Bergquist, A. Sciubisz, A. Kaczor, J. Silberring. Catecholamines and methods for their identification and quantitation in biological tissues and fluids // J. Neuroscience Methods. 2002. V. 113. P. 1-13

6. Эндокринология / под ред. H. Лавина. 1999. 1128 с.

7. Руководство по лабораторной клинической диагностике / под ред. В.В. Меньшикова. М., Медицина. 1982. 576 с.

8. В. К. Glod, К. I. Stanczak. Application of RP-HPLC-ED assay to analysis of the blood of Parkinson's disease patients // Acta Chromatographica. 2005. №15. P. 276-288

9. С. Rodier, R. Sternberg, F. Raulin, C. Vidal-Madjar. Chemical derivatization of amino acids for in situ analysis of Martian samples by gas chromatography. // J. Chrom. A. 2001. V. 915. P. 199-207

10. Shulin Zhao, Yangzheng Feng, Michael H. LeBlanc, John E. Piletz, Yi-Ming Liu. Quantitation of agmatine by liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection. // Anal. Chim. Acta. 2002. V.470. P. 155161

11. A. Namera, M. Yashiki, M. Nishida, T. Kojima. Direct extract derivatization for determination of amino acids in human urine by gas chromatography and mass spectrometry // J. Chrom. A. 2002. V. 776. P. 49-55.

12. K. Vuoresola, H. Siren. Determination of urinary catecholamines with capillary electrophoresis after solid-phase extraction. // J. Chrom. A. 2000. V. 895. P. 317-327.

13. J1. А. Карцова, Д. Б. Гладилович, И. О. Захарова. Взаимодействие о-фталевого диальдегида с первичными аминами в присутствии нуклеофильных агентов // Журн. Общ. Химии. 1993. Вып. 9. Т. 63. С. 2117-2125

14. J1. А. Карцова, И. Н. Краснова, А. И. Пименов. Анализ нейротрансмиттерных аминокислот и биогенных аминов методом ВЭЖХ в присутствии краун эфиров в подвижной фазе // Журн. Аналит. Химии. 1996. Т. 51. № ю. С. 1068-1073

15. J1. А. Карцова, И. Н. Краснова, И. В. Колмакова. Анализ нейромедиаторных аминокислот и биогенных аминов в спинномозговой жидкости методом обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. Аналит. Химии. 1997. Т. 52. № 7. С. 767-772

16. И. Н. Краснова, J1. А. Карцова, Ю. В. Черкас, Т. В. Димисенко. Количественный анализ аминокислот в сыворотке крови методом обращено-фазной ВЭЖХ // Журн. Клинич. Лаборат. Диагност. 1999. №7. С. 11-14

17. JL А. Карцова, И. Н. Краснова, Ю. В. Черкас. Определение аминокислот в сыворотке крови человека методом обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии в режиме изократического элюирования // Журн. Аналит. Химии. 2000. Т. 55. № 1.С. 66-74

18. Y.V. Tcherkas, L.A. Kartsova, I.N. Krasnova. Analysis of amino acids in human serum by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chrom. A. 2001. V. 913. P. 303-308

19. Y. Ohkura, М. Kai, Н. Nohta. Fluorigenic reactions for biomedical chromatography. // J.Chrom. B. 1994. V. 659. P. 85-107.

20. H. Todoriki, T. Hayashi, H. Naruse, A. Y. Hirakawa. Sensitive high-performance liquid chromatographic determination of catecholamines in rat brain using a laser fluorimetric detection system. // J. Chrom. B. 1983. V. 276. P. 45-54.

21. M.E. Bovingdon, R.A. Webster. Derivatization reactions for neurotransmitters and their automation. // J.Chrom. B. 1994. V. 659. P. 157183.

22. H.A. Bardelmeijer, J.C.M. Waterval, H. Lingeman, R. van't Hof, A. Bult, W.J.M. Underberg. Pre-, on- and post-column derivatization in capillary electrophoresis. //Electrophoresis. 1997. V.18. P. 2214-2227.

23. T. Okumura, Y. Nakajima, M. Matsuoka, T.Takamatsu. Study of salivary catecholamines using fully automated column-switching high-performance liquid chromatography // J. Chrom. B, 1997. V. 694. P. 305-316

24. M. Yamaguchi, Y. Ishida, M. Yoshimura. Simultaneous determination of urinary catecholamines and 5- hydroxyindolamines by high- performance liquid chromatography with fluorescence detection // Analyst. 1998. V.123. P.307- 311

25. S. Honda, M. Takahashi, Y. Araki, K. Kakehi. Postcolumn derivatization of catecholamines with 2- cyanoacetamide for fluorimetric monitoring in high-performance liquid chromatography. // J.Chrom. B. 1983. V. 274. P. 45-52.

26. Ф. E. Романцев, В. H. Прозоровский. Синтез фенилтиокарбамильных производных аминокислот и их определение методом обращенно-фазовой жидкостной хроматографии. // Журнал Аналитической Химии. 1988. С. 1100-1104.

27. T. Iwata, H. Mitoma, M. Yamaguchi. Fluorescence derivatization of amino acids with 4-(5',6'-dimethoxybenzothiazolyl)phenylisothiocyanate in liquid chromatography. // Anal. Chim. Acta. 2000. V. 416. P. 69-75.

28. R. Gatti, M.G. Gioia, A.M. Di Pietra. Phanquinone: a useful fluorescent pre-chromatographic derivatization reagent for liquid chromatographic analyses of amino acid dosage forms. // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 474. P. 11-20.

29. Hui-Min Ma, Zhi-Hua Wang, Mei-Hong Su. New triazine spectroscopic reagent for the separation of DL-amino acids by micellar electrokinetic chromatography. // J. Chrom. A. 2002. V. 955. P. 125-131.

30. Shen Hu, Paul C.H. Li. Micellar electrokinetic capillary chromatographic separation and fluorescent detection of amino acids derivatized with 4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole. // J. Chrom. A. 2000. V. 876. P. 183191.,

31. M. Peter. A. Peter, F. Fulop. Application of (1S,2S)- and (1R,2R)-1,3-diacetoxy-l-(4-nitrophenyl)-2-propylisothiocyanate to the indirect enantioseparation of racemic proteinogenic amino acids. // J. Chrom. A. 2000. V. 871. P. 115-126.

32. М. Ummadi, B.C. Weimer. Use of capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence for attomole detection of amino acids. // J. Chrom. A. 2002. V. 964. P. 243-253.

33. M.A. Raggi, C. Sabbioni, G. Casamenti, G. Gerra, M. Calonghi, L. Masotti. Determination of catecholamines in human plasma by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chrom. B. 1999. V. 730. P. 201-211

34. Y.V. Therkas, L.A. Karsova, I.N. Krasnova. Analysis of amino acids in human serum by isocratic reversed-phase high-perphormance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chrom. A. 2001. V. 913. P. 303-308

35. M. Hay, P. Mormede. Determination of catecholamines and methoxycatecholamines excretion patterns in pig and rate urine by ion-exchange liquid chromatography with electrochemical detection. // J. Chrom. B. 1997. V. 703. P. 15-23.

36. Красиков В.Д. Современная планарная хроматография // Журнал Аналитической химии. 2003.Т.58. № 8. С. 792 8067.

37. Хираока М. Краун-соединения. / М.: Мир. 1986. С. 356

38. В. Д. Красиков. Основы планарной хроматографии / СПб.: Химиздат. 2005. С. 231

39. R.M. Linares, J. Н. Ayala. Effect of non-ionic surfactants as mobile phase additives on the fluorescence intensity of dansyl derivatives of biogenic amines in high-performance thin-layer chromatography // Analyst. 1998. V. 123. P. 725-729

40. JT. А. Карцова, О. В. Маркова. Молекулярное распознавание в хроматографии / СПб.: СПбГУ. 2004. С. 140

41. Y. Nagata, Т. Iida, М. Sakai. Enantiomeric resolution of amino acids by thin-layer chromatography // J. Molecular Catalysis B: Enzimatic. 2001. V. 12. P. 105-108

42. Baranowska, M. Kozlowska. TLC separation and derivative spectrophotometry of some amino acids // Talanta. 1995. V. 42. P. 15531557

43. R. Bhushan, V. Parshad. Thin-layer chromatographic separation of enantiomeric dansylamino asids using a macrocyclic antibiotic as a chiral selector// J. Chrom. A. 1996. V. 736. P. 235-238

44. S. Terabe, K. Otsuka, K. Ichikawa, A. Tsuchiya, T. Ando. Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries // Anal. Chem. 1984. V. 56. P. 111-113

45. E.S. Ahuja, B.P. Preston, J.P. Foley. Anionic-zwitterionic mixed micelles in micellar electrokinetic chromatography: sodium dodecyl sulfat N-dodecyl-N,N-dimethylammonium-3-propane-1-sulfonic acid //J. Chrom. B. 1994. V. 657. P. 271-284

46. A.A. Mohammand, J.R. Peterson, M.G. Bissell. Micellar electrokinetic capillary chromatographic separation of steroids in urine by trioctylphosphine oxide and cationic surfactant // J. Chrom. B. 1995. V. 674. P. 31-38

47. Burgi D.S. //Analytical chemistry. 1993. V.65. 3776-3779

48. Nicole E. Baryla, Charles A. Lucy. pH-Independent large-volume sample stacking of positive or negative analytes in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 52-58

49. M. K. Shirao, S. Suzukia, J. Kobayashia, H. Nakazawab, E. Mochizuki. Analysis of creatinine, vanilmandelic acid, homovanillic acid and uric acid in urine by micellar electrokinetic chromatography // J.Chrom. B. 1997. V. 693. P. 463-467

50. Руководство по капиллярному электрофорезу. Под ред. А. М. Волощука. Москва. 1996

51. Chien R.L., Burgi D.S. On-column sample concentration using field amplified in CZE. // Analytical Chemistry. 1992. V. 64. P. 489

52. A.B. Wey, С.-Х. Zhang, W. Thormann. Head-column field-amplified sample stacking in binary system CE. Preparation of extracts for determination of opioids in microliter amount of body fluids. // J. Chrom. A. 1999. V. 853. P. 95-106.

53. G. McGrath, W.F. Smyth. Large-volume sample stacking of selected drugs of forensic significance by capillary electrophoresis // J. Chrom. 1996. V. 681. P. 125-131.

54. Ch.-E. Lin, H.-Ch. Huang, H.-W. Chen. A capillary electrophoresis study on the influence of b-cyclodextrin on the critical micelle concentration of sodium dodecyl sulfate //J.Chrom. A. 2001. V. 917. P. 297-310

55. Z. Liu, H. Zou, M. Ye, J. Ni, Y. Zhang. Effects of organic modifiers on retention mechanism and selectivity in micellar electrokinetic capillary chromatography studied by linear solvation energy relationships // J. Chrom. A. 1999. V. 863. P. 69-79

56. Система капиллярного электрофореза «Капель-ЮЗР». Руководство по эксплуатации. // ООО «Люмэкс». С.-Петербург. 2001

57. A. Mitsui, Н. Mohta, Y. Ohkura. High- performance liquid chromatography of plasma catecholamines using 1,2- diphenylethylenediamine as precolumn fluorescence derivatization reagent. //J.Chrom. B. 1985. V. 344. P. 61-70.

58. R. M. Riggin, P. Т. Kissinger. Determination of catecholamines in urine by reverse-phase liquid chromatography with electrochemical detection. // Anal. Chem. 1977. V.49 (13). P. 2109-2111.

59. Z. Shen, Z. Sun, Liu Wu, Kui Wu, Siqin Sun, Z. Huang. Rapid method for the determination of amino acids in serum by capillary electrophoresis. // Journ. of Chromatogr. A. 2002. V. 979. P. 227-232.

60. C. В. Смирнова, И. И. Торочешникова, И. В. Плетнев. Экстракция аминокислот динонилнафталинсульфокислотой в присутствии дициклогексил-18-краун-6. // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2000. Т. 41. №3. С. 186-188

61. Hong Wan, Lars G. Blomberg. Enantiomeric separation of small chiral peptides by capillary electrophoresis // J.Chrom. A. 1997. V. 792. P. 393400

62. C.-S. Chiou. J.-S. Shih. Application of crown ethers as modifiers for the separation of amines by capillary electrophoresis // Anal. Chim. Acta. 1998. V. 360. P.69-76

63. S.C. Su, S.S. Chou, P.C. Chang, D.F. Hwang. Determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning by micellar electrokinetic capillary chromatography//J.Chrom. B. 2000. V. 749. P. 163-169

64. Ch.-H.Wu, M.-Ch. Chen, A.-K. Su, P.-Y. Shu, Sh.-H. Chou, Ch.-H. Lin. Determination of corticosterone in mouse plasma by a sweeping technique using micellar electrokinetic chromatography // J. Chrom. B. 2003. V. 785. P. 317-325

65. P. Britz-McKibbin, A.R. Kranack, A. Paprica, D.D.Y. Chen. Analyst. 1998. V. 123. P. 1461.

66. Chien R.L., Burgi D.S. Sample stacking of an extremely large injection volume in high-performance capillary electrophoresis. // Analytical Chemistry. 1992. V. 64. P. 1046-1050

67. Z.Liu, P. Sam, S.R. Sirimanne, P.C. McClure, J. Grainger, D.G.Patterson.// J. Chrom. A. 1994. V. 673. P. 125-132

68. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatography. 5. Field-enhanced sample injection with reverse migrating micelles. // Anal. Chem. 1998.V. 70. P. 1893-1901

69. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of analytes for micellar electrokinetic chromatography. I. Normal stacking mode. // J. Chromatogr. A. 1997. V. 781. P. 119-128

70. Quirino J.P., Terabe S. On-line concentration of neutral analytes for micellar electrokinetic chromatograph. 3. Stacking with reverse migrating micelles. // Anal. Chem. 1998. V.70. P. 149-157.

71. P. Quirino, S. Terabe. Exceeding 5000-fold concentration of analytes in micellar electrokinetic chromatography. // Science. 1998. V. 282 (5388). P. 465-468

72. S. K. Poole and C. F. Poole. Characterization of surfactant selectivity in Micellar Electrokinetic Chromatography // Analyst. 1997. V. 122. P. 267274

73. A. V. Pirogov, A. V. Shpak, O. A. Shpigun. Application of polyelectrolyte complexes as novel pseudo-stationary phases in MEKC // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 375. P. 1199-1203

74. P.G. Muijselaar, K. Otsuka, S. Terabe. Micelles as pseudo-stationary phases in micellar electrokinetic chromatography // J. Chrom. A. 1997. V. 780. P. 41-61

75. Y. He, H.K. Lee. Large-volume sample stacking in acidic buffer for analysis of small organic and inorganic anions by capillary electrophoresis. //Analytical Chemistry. 1999. V. 71. P. 995-1001

76. A. Kovacs, L. Simon-Sarkadi, K. Ganzler. Determination of biogenic amines by capillary electrophoresis // J. Chrom. A. 1999. V. 836. P. 305-313

77. X. Liu, L.-X. Yang, Y.-T. Lu. Determination of biogenic amines by 3-(2-furoyl)quinoline-2-carboxaldehyde and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection // J. Crom. A. 2003. V. 998. P. 213-219

78. X. Li, W. Jin, Q. Weng. Separation and determination of homovanillic acid and vanillylmandelic acid by capillary electrophoresis with electrochemical detection // Anal. Chim. Acta. 2002. V. 461. P. 123-130

79. Wu A.H., Gornet T.G. Preparation of urine samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines: bonded-phase phenylboronic acid, cation-exchange resin, and alumina adsorbents compared.//Clin. Chem. 1985. V. 31. N. 2. P. 298-302

80. K. Vuorensola, J. Kokkonen, H. Siren, R. A. Ketola. Optimization of capillary electrophoretic-electrospray ionization-mass spectrometric analysis of catecholamines // Electrophoresis. 2001. V. 22. P. 4347-4354

81. A. Martin-Girardeau, M.-F. Renou-Gonnord. Optimization of a capillary electrophoresis-electrospray mass spectrometry method for the quantitation of the 20 natural amino acids in children blood // J. Chrom. B. 2000. V. 742. P. 163-171

82. D. M. Osbourn, D. J. Weiss, С. E. Lunte. On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 2768-2779

83. P.Britz-McKibbin, D.D.Y. Chen. Selective focusing of catecholamines and weakly acidic compounds by capillary electrophoresis using a dynamic pH junction. Analytical Chemistry. 2000. V. 72. 1242-1252.

84. M. Krizek, T. Pelikanova. Determination of seven biogenic amines in foods by micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chrom. A. 1998. V. 815. P. 243-250

85. P.Britz-McKibbin, S, Terabe. On-line preconcentration strategies for trace analysis of metabolites by capillary electrophoresis. // J. Chrom. A. 2003. V. 1000. P. 917-934

86. J.-B. Kim, Y. Okamoto, S, Terabe. On-line sample preconcentration of cationic analytes by dynamic pH junction in capillary electrophoresis. // J. Chrom. A. 2003. V. 1018. P. 251-256

87. P.Britz-McKibbin, G.M. Bebault., D.D.Y. Chen. Velocity difference induced focusing of nucleotides in capillary electrophoresis with a dynamic pH-junction. // Analytical Chemistry. 2000. V. 72. № 8. P. 1729-1735.

88. Jl. H. Москвин, И. Г. Зенкевич, Jl. А. Карцова. Понятие «селективность» и его содержание в методах разделения веществ // Журн. Аналит. Химии. 2004. Т. 59. №7. С. 697-703

89. А. Ф. Пожарский. Супрамолекулярная химия. Часть I. Молекулярное распознавание // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 9. с.32-39.

90. Yu Liu, Bin Li, Bao-Hang Han, Yu-Mei Li and Rong-Ti Chen. Enantioselective recognition of amino acids by p-cyclodextrin 6-0-monophosphates // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1997. V. 2. P. 1275-1278

91. Y. Mori, K. Ueno, T. Umeda. Enantiomeric separations of primary amino compounds by non-aqueous capillary zone electrophoresis with a chiral crown ether // J. Chrom. A. 1997. V. 757. P. 328-332

92. Y. Tanaka, K. Otsuka, SH. Terabe. Separation of enantiomers by capillary electrophoresis-mass spectrometry employng a partial filling technique with a chiral crown ether// J. Chrom. A. 2000. V. 875. P. 323-330

93. T. Kitae, T. Nakayama and K. Kano. Chiral recognition of a-amino acids by charged cyclodextrins through cooperative effects of Coulomb interaction and inclusion // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1998. V. 2. P. 207-212

94. К. В. Male, J. Н. Т. Luong. Derivatizayion, stabilization and detection of biogenic amines by cyclodextrin-modified capillary electrophoresis laser-induced fluorescence detection // J. Chrom. A. 2001. V. 926. P. 309-317

95. E.C.Y. Chan, P.Y. Wee, O.Y. Ho. HPLC assay for catecholamines and metanephrines using fluorimetric detection with pre-column 9-fluorenylmethyloxy-carbonyl chloride derivatization // J. Chrom. B. 2000. V. 749. P. 179-189.

96. VOYAGER Training Programs. The PerSeptive Biosystems Technical Center. // PerSeptive Biosystems.

97. JI.A. Карцова, А.А. Сидорова, В.А. Казаков, Е.А. Бессонова, А.Я. Яшин. Определение катехоламинов методами капиллярного электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ // Журнал аналитической химии, 2004, т.59, № 8, с.826 831.

98. JI.A. Карцова, Е.А. Бессонова, А.А.Сидорова, И.А. Тверьянович, В.А. Казаков, Л.И. Великанова. Определение адреналина, норадреналина, дофамина методом капиллярного электрофореза.// Журнал прикладной химии, 2004, т. 77, с. 1164 1169.

99. Л.А. Карцова, А.А. Сидорова, В.А. Казаков, Е.А. Бессонова, А.Я. Яшин. Определение катехоламинов методами КЭ и ОФ ВЭЖХ // Тезисы. Всероссийский симпозиум "Хроматография и хроматографические приборы", Москва, Клязьма, 2004, с. 169.

100. T.I.G. Wilson, К.К. Thomsen, R.O. Petersen, J.O.Duus, R.P. Oliver. Detection of 3-hydroxykynurenine in a plant pathogenic fungus // J. Biochem. 2003. V. 371. P. 783-788

101. Дюмаев К.М., Воронина Т.А., Смирнов Л.Д. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС / М. 1995. 271 с.

102. Х. Sun, X. Yang, Е. Wang. Determination of biogenic amines by capillary electrophoresis with pulsed amperometric detection // J. Chrom. A. 2003. V. 1003. P. 189-195

103. S.C. Schucker, G. К. E. Scriba. Analysis of isomeric glutamyl peptides by capillary electrophoresis. Application to stability studies // J. Chrom. A. 2000. V. 888. P. 275-279

104. H. Siren, K. Luomanpera, T. Tyopponen, S. Rovio, P. Vastamaki, P. Savolahti. Process control and drug analysis with on-line capillary electrophoresis system // J. Biochem. Biophys. Methods. 2004. V. 60. P. 295-307.

105. H.M. Liebich, R. Lehmann, G. Xu, H.G. Wahl, H.-U. Haring. Application of capillary electrophoresis in clinical chemistry: the clinical value of urinary modified nucleosides // J. Chrom. B. 2000. V. 745. P. 189-196

106. H. Siren, U. Karjalainen. Study of catecholamines in patient urine samples by capillary electrophoresis // J. Chrom. A. 1999. V. 853. P. 527-533.

107. Izatt R.M., Pawlak K., Bradshaw J.S., Bruening R.L. Thermodinamic and kinetic data for macrocycle interaction with cations and anions // Chem. Rev. 1991. V. 91. P. 1721-2085

108. Куликов O.B., Терехова И.В. Термодинамика комплексообразования аминокислот и пептидов, содержащих неполярные боковые группы, с 18-краун-6 в воде // Коорд. Хим. 1998. Том 24. С. 395-399.

109. Larsen K.L., Endob Т., Uedab Н., Zimmermanna W. Inclusion complex formation constants of a-, P-, y-, 5-, е-, C,-, r|- and 0-cyclodextrins determined with capillary electrophoresis // Carbohydrate Res. 1998. V. 309. P. 153159.

110. Rekharsky M.V., Inoue Y. Complexation thermodynamics of cyclodextrins // Chem. Rev. 1998. V. 98. P. 1875-1917.

111. N.V. Komarova, J. S. Kamentsev, A. P. Solomonova, R. M. Anufrieva. Determination of amino acids in fodders and raw materials using capillary zone electrophoresis // J. Chrom. B. 2004. V. 800. P. 135-143

112. Brian D. Hood, Brett Garner, Roger J. W. Truscott. Human lens coloration and aging // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 46. P. 32547 32550

113. Sidorova A.A., Kartsova A.A., Alekseeva A. The study of kynurenine pathway by capillary electrophoresis // International conference "Analytical chemistry and chemical analysis". Thesis. Kiev, Ukraine. 2005. P. 150

114. Сидорова A.A., Карцова JI.A. Метод капиллярного электрофореза при изучении кинуренинового пути метаболизма триптофана // II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии». Тезисы. Краснодар. 2005. С. 258

115. С. К. Man Choy, P. Cho, W.-Y. Chung, I. F. F. Benzie. Water-Soluble » antioxidants in human tears: effect of the collection method // Invest.

116. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. V. 42. P. 3130-3134

117. A. Garsia, М. Heinanen, L.M. Jimenez, С. Barbas. Direct measurement of homovanillic, vanillylmandelic and 5-hydroxyindolacetic acids in urine by capillary electrophoresis // J. Chrom. A. 2000. V. 871. P. 341-350

118. H. Wan, M. Ohman, L. G. Blomberg. Chemometric modeling of neurotransmitter amino acid separation in normal and reversed migration micellar electrokinetic chromatography // J. Chrom.A. 2001. V. 916. P. 255263

119. Preparative peptide purification by cation exchange and reversed-phase perfusion chromatography. // Biochemica Technica. 1996. № 4.

120. L. Yang, Z. Yuan. Comparison of enantioseparation of amino acid derivatives in aqueous and mixed aqueous-organic media by capillary zone electrophoresis // Fresenius J. Anal. Chem. 1999. V. 365. P. 541-544

121. E. Chernokalskaya, A. Dedeo, D. Brewster, P. Clark, M. Emerick, B. Kopaciewicz. Integrated sample preparation platform for in-gel protein digestion. // Millipore Corporation, Life Science Division, Danvers, MA, USA.

122. Н.Г. Лопатина, Л. А. Дмитриева, Е.Г. Чеснокова, В.В. Пономаренко. Роль кинуренинов в созревании функции нервной системы медоносной пчелы APIS MELLIFERA в онтогенезе // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1994. Т. 30. №1. С. 156-157

123. И. Ф. Жимулев. Генетическая детерминированность поведения дрозофилы и человека // Соросовский образовательный журнал. 1997. №1. С. 22-25

124. Л.С. Колесниченко, В.И. Кулинский, A.C. Горина. Аминокислоты и их метаболиты в крови и моче при минимальной церебральной дисфункции у детей // Вопросы медицинской химии. 1999. Т. 45. №1. С. 25-30