Новые возможности капиллярного электрофореза в системах металл - органический лиганд тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

у-

Санкт-Петербургский государственный университет

На правах рукописи

ии^и530В5

п

МАРКОВА ОЛЬГА ИГОРЕВНА

НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В СИСТЕМАХ МЕТАЛЛ - ОРГАНИЧЕСКИЙ ЛИГАНД

Специальность 02 00 02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2007

003053065

Работа выполнена на кафедре аналитической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в Центре коллективного пользования «Аналитическая спектрометрия» при Санкт-Петербургском государственном политехническом университете.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Карпова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты

доктор химических наук, профессор Родинков Олег Васильевич

доктор технических наук, профессор Воронцов Александр Михайлович

Ведущая организация:

Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)

Защита состоится 15 марта 2007 г. в 15.00 ч.

на заседании диссертационного совета Д 212 232.37 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 1990034 Санкт-Петербург, Средний проспект В О , д. 41/43 Большая химическая аудитория

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан /£> 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

У /А.Г Папсуева/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. Определение биогенных металлов и биологически активных соединений в природных объектах является одной из актуальных задач аналитической химии. В субклеточных фракциях тканей мозга, характеризуемых высоким содержанием катехоламинов, обнаружены и значительные концентрации ионов металлов. В организме биогенные металлы находятся преимущественно в виде координационных соединений с биологически активными органическими лигандами.

Все большее распространение при определении биологически активных органических соединений и катионов металлов получает метод капиллярного электрофореза (КЭ). Однако электрофоретические подвижности многих гидратированных металлических ионов близки, а чувствительность УФ-детеюирования в методе КЭ недостаточна для их определения в реальных образцах

Изменить электрофоретические характеристики определяемых ионов и снизить пределы обнаружения возможно при использовании процессов комплексообразования с органическими лигандами, поглощающими в УФ-свете либо образующими поглощающие комплексы.

Потучение подобной информации могло бы представить как практическую ценность, так и теоретическую новизну в связи с установлением новых возможностей электрофоретического метода, а также решения задач клинической диагностики

Данное исследование поддерживалось грантами НАТО (программа «Наука для мира») и Минобразования России

Цель работы Изучение возможностей электрофоретического определения катионов биогенных металлов и биологически активных веществ в форме их комплексных соединений.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи-

1 Выбрать аналитические формы биогенных металлов (Си2 ', А13+, 7.х\\ Со2+, Ре3+, №г") с органическими реагентами и уточнить их фотометрические характеристики для оптимизации условий электрофоретического определения.

2 Выяснить возможности определения этих металлов с использованием традиционных фотометрических реагентов в различных режимах КЭ :

- косвенное и прямое детектирование в УФ-области;

- введение в кварцевый капилляр предварительно подготовленных комплексов;

- образование комплексов металлов с фотометрическими реагентами внутри кварцевого капилляра (электроинжекционный и электрофоретически опосредованный методы анализа).

з

3. Оптимизировать условия off-line и on-line комплексообразования в системе

органический лиганд - металл. 4 Оценить возможности различных вариантов электрофоретического определения биологически активных лигандов (биогенных аминов, аминокислот, полифенолов, ароматических функционально замещенных карбоновых кислот) в форме комплексных соединений с биогенными металлами 5. Предложить схемы электрофоретического анализа реальных объектов (природные воды, витамины, моча) при определении катионов металлов и/или органических лигандов в форме их комплексов.

Научная новизна

Выявлены аналитические формы и уточнены фотометрические характеристики при определения биогенных металлов с использованием фотометрических реагентов в различных режимах капиллярного электрофореза: косвенное и прямое детектирование в УФ-обласге; электроинжекционный и электрофоретически опосредованный варианты анализа

Обнаружена высокая комплексообразующая способность природных антиоксидантов полифенольного типа с ионами Fe3+. Показано, что доминирующим фактором в образовании таких комплексов является наличие пирокатехиновых фрагментов (1,2-фенольных гидроксилов) в составе молекул полифенолов

На примерах непоглощающих в УФ-свете аминокислот (глутаминовой, аланина, валина) и азомакроцикла (циклама) установлено, что чувствительность их определения возрастает в 10 - 30 раз при использовании ионов Си2+ в составе буферного электролита.

Теоретическая значимость работы Обоснованы преимущества и ограничения различных схем электроинжекционного метода и электрофоретически опосредованного микроанализа при определении катионов металлов в зависимости от природы реагента, относительных значений электрофоретических подвижностей реагента и комплекса, электроосмотического потока.

На примерах модельных биологически активных соединений - норадреналина (NA}, 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и глутаминовой кислоты (Glu) - оптимизированы условия определения их в форме комплексов с ионами Си2+ в различных режимах капиллярного зонного электрофореза

Показано, что добавление ионов Меп+ в состав рабочего буфера приводит к улучшению разрешения функциональных замещенных ароматических кислот, за счет процессов комплексообразования по аминному и карбоксилатному типу в случае ионов и с участием фенольных гидроксилов - для ионов Al + и Fe + .

Практическая значимость работы

Разработаны способы электрофоретического определения А13+ в форме комплекса с ксиленоловым оранжевым в природных и питьевых водах и ионов Со3', Cu2+, Zn2+ в форме комплексов с 4-(2-пиридилазо)резорцином в витаминах «Компливит»

Предложены схемы электрофоретического анализа ванилинминдальной и гомованилиновой кислот - маркеров нейробластомы - в моче в режима мицеллярной электрокинетической хроматографии (фосфатный буфер, рН 7,0, 150 мМ ДЦСН) и методом капиллярного зонного электрофореза (боратный буфер, рН 8,5, 1 мМ Си2+).

Положения, выносимые на защиту: 1 Аналитические формы металлов (Cu2+, Al3+, Zn2+, Со2+, Fe3f, Ni2+) с традиционными органическими реагентами и их фотометрические и элсктрофоретические характеристики

2. Обоснование преимуществ и ограничений схем электроинжекционного и электрофоретически опосредованного методов анализа при определении ионов биогенных металлов с использованием фотометрических реагентов: ксиленолового оранжевого (КО), нитрозо-Р-соли (НРС), 4-(2-пиридилазо)резорцина (ПАР)

3 Концентрации, состав, рН буферного электролита, соотношение реагентов в системе металл - органический лиганд при off-line и on-line комплексообразовании в режиме капиллярного зонного электрофореза.

4 Способы on-line концентрирования (стекинг с большим вводом пробы и стекинг с усилением поля) для увеличения чувствительности электрофоретического определения катионов металлов и/или их комплексов методами традиционного капиллярного зонного электрофореза, электроинжекционного и электрофоретически опосредованного методов анализа

5 Условия электрофоретического определения биологически активных органических соединений (биогенные амины, аминокислоты, полифенолы, ароматические ф\ нкционально замещенные карбоновые кислоты) в форме комплексов с биогенными металлами

6 Практические приложения выявленных закономерностей в схемах анализа для определения :

- ионов алюминия в природных и питьевых водах методам электроинжекционного анализа и капиллярного зонного электрофореза,

ионов кобальта, меди и цинка в витаминном комплексе «Компливит» с использованием 4-(2-пиридилазо)резорцина (ПАР) методом капиллярного, зонного электрофореза,

- маркеров злокачественной опухоли - ванилинминдальной и гомованилиновой кислот методами КЗЭ и МЭКХ с введением в состав рабочего буфера катионов Си2+ с оптимизированным вариантом пробоподготовки.

Публикации и апробация работы Материалы диссертации опубликованы в 2 статьях и 9 тезисах докладов Результаты исследований докладывались на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы аналитической химии» (2002, Москва); 1-ой Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (2002, СПб); Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии» (2002, Краснодар); Международной конференции «SIS03 Separation of Ionic Solutes» (2003, Братислава, Словакия); VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА - 2004» с международным участием (2004, Уфа), конференции «Аналитика России» (2004, Москва, Клязьма); II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической и радиохимии» (2005, Краснодар, Россия), 29th Int Symposium on Capillary Chromatography (2006, Riva del Garda, Italy), XXXth Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" (2006, Katowice-Szczyrk, Poland). Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, четырех глав с обсуждением полученных результатов, экспериментальной части, практического применения, списка принятых сокращений, выводов и списка цитируемой литературы (200 наименований) Работа изложена на 208 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц и 111 рисунков

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении дано обоснование актуальности темы и сформулированы цели исследования Отмечена перспективность использования метода капиллярного электрофореза при определении катионов металлов и биологически активных органических соединений в форме их комплексов.

1-я глава (Обзор литературных данных) состоит из разделов, в которых обсуждаются общие сведения о катионах металлов; формы их существования и биологические функции, физико-химические методы исследования; комплексообразование с фотометрическими реагентами, использование координационных соединений биогенных металлов с биологически активными соединениями

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов и методов исследования.

В 3-й главе предметом обсуждения является выбор аналитических форм биогенных металлов (Cu2+, Al3+, Zn2+, Со2+, Fe3+, Ni2+) с органическими реагентами и уточнение фотометрических характеристик для оптимизации условий их определения

6

различными вариантами капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ), включая электроинжекционный анализ (ЭИА) и электрофоретичееки опосредованный микроанализ (ЭОМА).

Первоначально был реализован вариант электрофоретичеекого определения катионов метатлов в режиме косвенного детектирования с использованием бензимидазольного буфера (рН 4,8) с добавкой гликолевой кислоты

Однако в этих условиях затруднительно определение ионов А13' и Ре3'" вследствие гидролиза Кроме того, достигнутая чувствительность определения (~ 5х10~6 М) недостаточна при анализе реальных объектов, поэтому были исследованы различные способы прямого детектирования с использованием фотометрических реагентов, в качестве которых взяты 4-(2-пиридилазо)резорцин (ПАР) и ксиленоловый оранжевый (КО), широко применяемые при хроматографическом и спектрофотометрическом определении ионов переходных металлов Дня оптимизации условий детектирования при электрофоре™ ческом анализе были получены спектры поглощения реагентов и

длина волны, нм

Рис. 1. Спектры поглощения ПАР и комплексов Ме-ПАР

20 мМ тетраборат натрия, рН 9,18 Спектрофотометр СФ-46

Рис. 2. Электрофореграмма комплексов Со2+-ПАР (1), Си2+-ПАР (2) и Хп2+-П\Р (3). «Капель 105 Р». Капилляр: ЬЭфф=30 см, ЬобЩ=60 см, ¿виутр=75 мкм. Хмакс=540 нм; ввод гидродинамический - 30 мбар/10 с, + 25 кВ Рабочий электролит' 8 мМ боратный буфер (рН 7,8) + 8 мМ янтарной кислоты

Для электрофоретичеекого определения ионов А13+ и Ре3+ (рН < 4,0) выбран универсальный фотометрический реагент - ксиленоловый оранжевый (КО)

В 90-х г. предложен метод электроинжекционного анализа (ЭИА), позволяющий осуществлять фотометрическую реакцию непосредственно в кварцевом капилляре Проба и реагент электрокинетически вводятся с противоположных концов капилляра и движутся навстречу друг другу (рис 3.).

(В

е

ф

©

©

©

Рис. 3 Схема электроинжекционного метода анализа

Требования к ЭИА: ЦРеагент<0; ¡ЦРеагент! » |ЦЭОп1 Ц-Продукт < 0, | ЦПродукг! » |ЦЭОп!

Нами показано, что в зависимости от различий в подвижностях реагента (|1r) и образующихся комплексов металлов (цмс-r) возможны два варианта ЭИА: при Цме-R > Цк ЭИА проводится с использованием селективного реагента; при рме-R < Ця возможно применение как селективных, так и универсальных реагентов Первый вариант был реализован при определении ионов Со2+ с нитрозо-Р-солью (селективный реагент) и второй - для одновременного определения А13+ и Fe3+ с ксиленоловым оранжевым (универсальный реагент)

Изучение влияния различных факторов (состав и pH рабочего электролита, соотношение концентраций реагент/металл, время ввода пробы, состав буферного раствора при подготовке пробы, время взаимодействия реагента с аналитом, присутствие мешающих ионов) позволило предложить схемы определения Со2+ в фармацевтических препаратах и биологически активных добавках на основе бурых водорослей в диапазоне содержаний кобальта 10 - 300 мкг/л и А13+ (свободного и общего) в природной воде (0,1 -2,0 мг/л) в присутствии Fe3+ (III) в соизмеримых количествах (0,1 - 2,0 мг/л). Использование наряду с фотометрическими реагентами on-line концентрирования -стекинга с большим вводом пробы и стекинга с усилением поля - привело к снижению пределов обнаружения (6-10 мкг/л).

В 4-й главе обсуждаются возможности определения биологически активных органических соединений в форме их комплексов с биогенными металлами различными вариантами капиллярного электрофореза: зонного и мицеллярного.

После серии предварительных экспериментов с различными биологически активными соединениями более подробно мы остановились на изучении процессов

комплексообразования с участием 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА), норадреналина (NA) и глутаминовой кислоты (Glu)

В качестве биогенного металла, в основном, использовались ионы меди Си~+. Такой выбор обусловлен следующим молекулы этик соединений, как и изученных ранее фотометрических реагентов, содержат фенольные гидроксилы (NA. ДОФА), амино-(NA, ДОФА, Glu) и карбоксильные группы (ДОФА и Glu), они являются диагностическими маркерами многих заболеваний и способны образовывать координационные соединения с различными биогенными металлами; наибольшее число публикаций, обсуждающих образование координационных соединений с лекарствами и компонентами биологических сред, посвящено меди

Логика постановки электрофоретических экспериментов была такой же, как и при использовании фотометрических реагентов'

- получение спектров поглощения исходных органических соединений и смесей каждого из них с ионами (Си2*) (см. в качестве примера Рис. 4 ) для установления оптимальной длины волны при элекгрофоретическом детектировании,

- изучение возможностей электроинжекционного (ЭИА) и электрофоретически опосредованного микроанализа (ЭОМА) для этих систем,

- использование режима традиционного КЗЭ с введением в кварцевый капилляр предварительно подготовленного комплекса органический лиганд - металл, так и добавление в состав буферного электролита (35 мМ боратный буфер; рН 8,6) одного из участников комплексообразования.

3,4-Дигидроксифенилаланин (ДОФА)

Норадреналин (NA)

Глутаминовая кислота (Glu)

I

а)

б)

Рис. 4. Спектры поглощения глутаминовой кислоты (а) и комплекса глутаминовая кислота+Си2+ ; спектрофотометр Shimadzy UV-1700

9

NA и ДОФА хорошо поглощают в УФ-свете. Glu - практически нет и элюируется после электроосмотического потока (ЭОП) в форме едва заметного пика Добавление ионов Си2 позволило увеличить чувствительность определения глутаминовой кислоты более, чем в 10 раз (рис. 5), а использование стекинга с усилением поля или с большим вводом пробы - снизить еще предел ее обнаружения в 5 - 15 раз

4 и*

О т>

_д

'А - . I ■ .------п т--Т--------I

4 S i 7 ma < S 6 ' мя

Рис. 5. Электрофореграмма глутаминовой кислоты (а) и ее комплекса с Си2+(мольное соотношение 1:1) (б). Условия- «Капель 103 РЕ», X = 254 нм, Ь0бЩ/ЬЭфф = 60/30 см , d = 75 мкм, ввод пробы- 30 мбар, 20 с; рабочий электролит: 35мМ боратный буфер, рН 8,5.

Рассчитанные значения электофоретических подвижностей NA, ДОФА и Glu, а также соответствующих им комплексов с ионами Си2+ оказались по абсолютной величине меньшими, чем значение скорости ЭОП (табл ), что не позволяло реализовать схем)' элекгроинжекционного анализа.

Таблица. Электрофоретические подвижности ЭОП, органических лигандов и их комплексов с Си2+

рН Электрофоретическая подвижность, ц (см2/кВ с)

ЭОП ДОФА ДОФА+Си2+ NA NA+Cu2" Glu Glu+Cu2*

8,5 0,470 ±0,002 -0,177 ±0,001 - 0,236 ±0,002 - 0,066 ±0,001 -0,115 ±0,002 - 0,238 ±0,002 - 0,245 ±0,003

При этом оставалась возможность осуществления электрофоретически опосредованного микроанализа (ЭОМА), когда реагент и анализируемая проба вводятся с анодного конца капилляра «вдогонку» друг за другом Нами исследован такой вариант образования комплекса в потоке «Медленным» реагентом выступал биологически активный органический лиганд (NA, ДОФА, Glu), вводимый в кварцевый капилляр первым «Быстрым» (догоняющим) - раствор Си2+ Между зонами реагентов вводили буферный электролит (время ввода варьировалось' 0, 10, 30, 60 с).

При большом времени ввода (60 с) буфера комплекс практически не успевал образовываться. При снижении времени от 30 с до 10 с степень конверсии увеличивалась в ~ 5 раз (рис. 6)

Ю

Время ввода буфера между зонами проб, с

Рис. 6. Зависимость высот пиков ДОФА (1) и комплекса ДОФА+Си2+ (2) от времени ввода буферного электролита между зонами проб в режиме ЭОМА

33 мМ боратный буфер (рН 8,5). Ввод пробы: 30 мбар х 20 с 2,5-Ю"4 М ДОФА; +20 кВ х г с буфер, 30 мбар ч 20 с МО"4 М раствора Си2+. Анализ: +20 кВ, 72 мкА. «Капель 103 РЕ», >.=254 нм

Изучено влияние соотношения концентраций металл - лиганд (рис. 7) и времени ввода пробы (рис. 8) на интенсивность аналитического сигнала при различных варианта* электрофоретического анализа Общий вид электрофореграмм представлена рис 9.

Отношение молярных концентраций Cu.'L

20 4 0 60 8С

Вреня ввода ДОФА, с

Рис. 7. Зависимость площади пика Рис. 8. Зависимость площади пика ДОФА (1) и комплекса ДОФА+Си2+ (2) комплекса ДОФА+Си2+ от времени от молярного отношения концентраций ввода (с) пробы ДОФА (2х10ч М)

Cu ДОФА

35 мМ боратный буфер (рН 8,6);

35 мМ боратный буфер (рН 8,5) с добавкой 2x10"4 М Си2'.

«Капель 105 Р» Капилляр - Ьэфф=50 см, d,„y,p=75 мкм; УФ -детектор, >-макс~220 нм; ввод - гидродинамический 30 мбар х 20 с, + 20 кВ

Максимальной степени конверсии

SL

соответствует соотношение концентрации С и2 71. ~ 3 (рис. 8) и время ввода 60 с (рис. 9)

Рис. 9. Электрофореграмма комплекса ДОФА 4x10"* М + Си2+ 2Х10"4 М. Остальные условия представлены на рис. 7.

При наличии ионов Си2: в составе буферного электролита чувствительность определения ДОФА возрастает ~ в 2 раза и на электрофореграмме фиксируется только пик соответствующего комплекса (рис 10)

Рис. 10. Электрофореграмма полученного в капилляре комплекса ДОФА+Си*+. Рабочий электролит 35 мМ боратный буфер (рН 8,5) с добавкой Си2+ (2Х10"4 М).'

н I! и «

Основываясь на полученных результатах, можно предложить возможные структуры образующихся комплексов (рис 11 ).

н.

I о "Í

ЧХ'^ Ъ-А0 "V -он

X.

ж:

НС — INHj^

\ / H,N— СН

Ж

Рис. 11. Предполагаемые структуры образующихся комплексов ДОФА+Си1+

Изменение условий электрофоретического анализа (10 мМ тетраборат натрия, рН 9,18) и варьирование концентрации ионов Си2+ позволило разделить энантиомеры О,Ь-ДОФА (рис. 12), что крайне важно при проверке энантиомерной чистоты соответствующего лекарственного препарата (Ь-ДОФА)

Ч о ¿ ?

I V 1

Рис.12. Разделение энаптиомеров

(электрофореграмма пробы DL-ДОФА+Си24)

Рабочий электролит - 10 мМ тетраборат натрия, рН 9,18 «Капель 105 Р», '/. = 220 нм, ЬобцДэфф = 60/50 см , d = 75 мкм, ввод пробы 30 мбар, 10 с

Появление интенсивного сигнала комплекса непоглощающей глутаминовой кислоты с ионами Си2" при КЭ-определении дало основание провести подобные

12

эксперименты и с участием других, непоглощающих в УФ- (вшгин, аланин) и поглощающих кислот (цистеин, цистин, тирозин, триптофан) Большинство из них ответственны за процессы комплексообразования белков, нейропептидов, лекарственных препаратов с биогенными металлами

При введении в кварцевый капилляр аланина (или валина) с Си2+ в молярном соотношении 1:1 регистрируется интенсивный сигнал практически одновременно с ЭОП, что свидетельствует о нейтральном характере образующегося комплекса, состав которого 2:1 (органический лиганд металл).

Предел обнаружения со стекингом непоглощающих в УФ кислот составил ~ 1-Ю"7 М Хорошо поглощающие в УФ- аминокислоты - тирозин и триптофан - при добавлении к анализируемой пробе Си2+ увеличивают интенсивность сигнала в 1,5-2 раза (X = 214 нм), а разрешение (Яэ) ~ в 5 раз

Согласно литературным данным, для белков в составе которых содержатся серосодержащие аминокислоты (цистин, цистеин, гистидин) отмечено наиболее сильное удерживание стационарными фазами, насыщенными ионами Си2 или 7п2'. Было изучено взаимодействие этих кислот с ионами металлов в разных вариантах КЭ Индивидуальные аминокислоты элюируются в форме анионов размытыми пиками матой интенсивности, которая возрастает в 4 - 5 раз при введении ионов Си2+ (рис 13) Образующиеся комплексы элюируются практически вместе с ЭОП, т е нейтральны При этом общее время анализа резко сокращается

н2 / ня—с—сн^

5 с,

\ нг_

СН—С 5. с.

-Е-Г"Т-*—В—(-* 1

Си

Х-сн-с5-V \

/"••МИ;

В

Vе"

// о

(V

О

//

с I о

Н2м. I с н ^о

■О «2*

ЦИСТИН + Си

1—I—[—\

Рис. 13. Электрофореграммы цистеииа и цистина и их комплекса с ионами Си Возможная схема образования комплекса.

Сделано любопытное наблюдение цистеин и цистин, введенные в кварцевый капилляр, заполненный боратным буфером и содержащим ионы Си2+, образовывали один и тот же комплекс (рис 13) Было высказано предположение, что легко окисляемый цистеин в присутствии ионов Си2 переходит в цистин, и последний взаимодействует с ионами меди, находящимися в избытке, с образованием нейтрального комплекса.

Интересной моделью в качестве возможного органического лиганда явился азомакроцикл - циклам Известно, что азотистые макроциклы входят в состав многих антибиотиков, обеспечивая селективный захват ионов металлов

С ^

Циклам

Изучено его взаимодействие с ионами Си2+, 2п2+, №2', Со2+ и А13+. Варьировались концентрации, менялись условия проведения электрофоретических экспериментов в соответствии с описанной выше логикой. Максимальное взаимодействие обнаружено для ионов Си2+ и №2+(рис. 14) Образующийся комплекс характеризуется высокой интенсивностью поглощения и элюируется в форме катиона до ЭОП (рис. 14 б), сам циклам практически не поглощает в УФ-области (рис. 14 а)

а)

б)

Рис. 14. Электрофореграмма циклама (а) и его комплекса с медью 1:1 (б)

35мМ боратный буфер, рН 8,5 «Капель 105 Р», X = 250 нм, Ц,с„Д.,фф = 60/50 см , 6 = 75 мкм, ввод пробы: 30 мбар, 30 с

Полученные закономерности при изучении индивидуальных биологически активных органических лигандов позволили перейти к исследованию модельных смесей сложного состава и к реальным объектам

В рабочий буфер (35 мМ боратный буфер; рН 8,6) вводили 1 мМ Си2+. Во избежание возможной сорбции катионов меди в подобных экспериментах в буфер добавляли органический растворители - ацетонитрил (10%) и/или ион-парный агент Д ЦСН (2 мМ)

В качестве модельной системы выбрана смесь ароматических органических кислот

(ванилинминдачьная, гомованилиновая, 2,4-дигидроксибензойная, -м-аминобензойная,

и

салициловая, антранилован, аскорбиновая, бензоинам), в молекулах которых наряду с карбоксильной группой и ароматическим кольцом содержатся аминогруппы и фенольные гидроксилы. Среди них - нейротранс миттеры, лекарственные препараты, консерванты.

НзСО

Н3СО

Вдоилявминлальная Гомовздилинова*

Актрани-ин*зя

КИСЛОТЯ

Са.ЧИЦИИУ!(!1Я КИСЛО {'а

!>,4-Днгнлрокси-оеичойиая кислота

"ОН

НО. „:0

меяш-А ми ч ибс РГЮЙ КИЯ кисяога

Никотиновая кислота Бензойная кислота

При введении ионов Си увеличивается разрешение и наблюдается полное разделение всех компонентов (рис 15).

а)

и

б)

! И |(11,

^—. ^— 75ТТ* И и 14 В № П К 19 3» Я а 21 24 Н » Ь 2» » « .4 Ч V Ч ч>

и

5

Рис. (5. Электрофореграмма молельной смеси ароматических кислот

а) 35 мМ бораггный буфер (рН К,5), 10 % ацетонитрила;

б)35мМ боратныи буфер (рН К,5), 10 % ацетонитрила: 1 мМ Си" ,

«Капель 105 Р». Капилляр - Цфф=50 см, ЙинуТр=75 мкм; УФ-детектор, лшк-"214 им: + кВ: ввод - гидродинамический 30 мбар, 20 с.

На рис. 16 представлена зависимость разрешения (Кй) от добавления ионов меди в буферный электролит. Видно, что для пары никотиновая - бензойная кислота КЗ изменяется с 0 до 2; для .м-аминобензойной - салициловой кислот - в 2 раза; 2.4-дигидроксибензойной - м-ам и но бензойной кислот более, чем в 2 раза.

Рис. 16. Разрешение различных пар органических кислот (1 -

ванилинминдальная кислота; 2 -гомованилиновая кислота; 3 - 2,4-дигидроксибензойная кислота; 4 - м-аминобензойная кислота; 5 -салициловая кислота; 6 - антраниловая кислота, 7 - никотиновая кислота; 8 -бензойная кислота) 35 мМ боратный буфер, рН 8,5

ионов

Изучено влияние ряда фактороз (время ввода пробы, напряжение и длина волны детектирования) на интенсивность аналитического сигнала, разрешение и эффективность, влияние на эти характеристики других катионов металлов (рис 17)

Рис. 17. Зависимое! ь разрешения (И,) различных пар органических кислот от природы добавленного в рабочий буфер катиона Ме°+ (1 мМ) (1 - ванилинминдальная кислота/ гомованилиновая кислота; 2 дигидроксибензойная к-та/ м-аминобензойная кислота, 3 - м-аминобензойная кислота/

салициловая кислота, 4 - салициловая кислота/ антраниловая кислота; 5 -антраниловая кислота/ никотиновая кислота, 6 - никотиновая кислота/ I бензойная кислота)

Влияние ионов Си2', в первую очередь, сказывается на поведении кислот, в молекулах которых присутствуют аминогруппы или атом азота в составе гетероцикла, а наличие ионов А13+ значительно изменяет электрофоретические характеристики кислот, содержащих фенольные гидроксилы.

Последнее обстоятельство явилось причиной электрофоретического изучения возможности взаимодействия биогенных металлов Ме3+ (А13+, Ре3+) с природными антиоксидантами - полифенолами, которые обладают противораковыми и антибактериальными свойствами.

Из литературных данных известно, что полифенолы образуют комплексы с ионами металлов, в первую очередь ионами Рс,+ и А13+, предотвращая их участие в окислительных процессах.

В качестве стандартов были выбраны важнейшие: катехин (С), эпикатехин (ЕС) и эпигатлокатехин галлат (ЕвСС) Последний - обладает максимальной антиоксидантной активностью.

он

он

(+)-Катехин (С)

(-)-Эпикатехин (ЕС)

НО у Х)Н

он

(-)-Эпигаллокатехин галлат (ЕОСО)

Сами полифенолы и их комплексы элюируются в форме анионов с различными электрофоретическими подвижноегями Эпигаллокатехин галлат в выбранных условиях и при соотношении молярных концентраций ЕОСО'Ре'1 равном 1 1 расходуется практически полностью (рис 18)

,1000 ' 900

£ 600 ^ 500 £ 400 л 300 | 200 ° 100 о

Рис. 18. Зависимость уменьшения высоты пика ЕССО при добавлении ионов Ге3+ к пробе

25мМ боратный буфер (рН 8,5) Концентрация ЕОСО - 1Х10"4 М Прибор. «Капель 105 Р», X = 200 нм, Еобщ/Еэфф = 60/50 см , с! = 50 мкм, ввод пробы 30 мбар, 60 с

0,5 1 Отношение

1,5 2 2,5 молярных концентраций Ре/1_

В большей степени эта тенденция выражена для ионов Ре3+

Получив эти результаты, перешли к реальному объекту - зеленому чаю, в составе которого наряду с полифенолами (катехинами) содержится кофеин В режиме зонного капиллярного электрофореза смесь указанных катехинов полностью не разделяется, поэтом)' был выбран мицеллярный вариант (25 мМ фосфатный буфер; рН 7,0; 25 мМ ДДСН).

Все полифенолы образуют комплексы с ионами железа (III), которые детектируются в видимой области На электрофореграмме регистрируется только пик кофеина (рис. 19), что может быть использовано при определении последнего в случае плохого разрешения остальных компонентов.

а) б)

:1

! п

' v í

J [/

Jll

Рис. 19. Элекгрофореграмма водного экстракта зеленого чая

а) водный экстракт зеленого чая; б) водный экстракт зеленого чая с добавкой в пробу ионов Ре 'т

25мМ фосфатный б> фер, рН 7,0; 25 мМ ДДСН. X = 200 нм Остальные условия см рис. 18

Оставалось непонятным, что доминирует в наблюдаемом комплексообразовании-1,2-диольные фенольные гидроксилы (пирокатехиновые) или 1,3- (резорциновые) Именно поэтому нами была проведена серия специальных экспериментов с простейшими фенолами' резорцином и пирокатехином.

При взаимодействии ионов Ре3^ со смесью указанных фенолов наблюдается резкое снижение пика пирокатехина и лишь незначительное - резорцина Таким образом, в первую очередь, в комплексообразовании участвуют пирокатехиновые (1,2-диольные) фенольные гидроксилы

70т*и а.

а, 1

5=6 7 8 9 10 II мм 5 = « 7 8 9 10 11 >т

Рис. 20. Электрофореграмма смеси резорцина и пирокатехина (а) и этой же смеси после добавления ионов железа (III) к этой пробе (б)

Концентрация органических лигандов - lxl О"4 М. Концентрация ионов железа -1x10^ М Х=214нм Остальные условия см рис 18

В 5-ой главе рассматриваются основные практические приложения.

Предложены схемы определения ионов AI3 в форме комплекса с ксиленоловым оранжевым в природных водах в присутствии главной мешающей примеси ионов Fe3+ и определения ионов Со2+, Cu2+, Zn2+ в форме комплексов с 4-(2-пиридилазорезорцином) в витаминах «Компливит» (ПО 6-10 мкг/л).

Одним из важных результатов является влияние ионов Си2+ в составе буферного электролита для количественного определения гомованилиновой (ГВА) и ванилинминдальной (BMA) кислот - диагностических маркеров опухоли (нейробластомы, феохромоцитомы). Хорошего разрешения удается достигнуть только в случае смеси стандартов при использовании рабочего буфера, содержащего ß-циклодекстрин. Реальный объект имеет значительно более сложный электрофоретический профиль. Поэтому был предложен альтернативный подход при определении BMA и ГВА в таком объекте: добавление ионов Си2' в состав рабочего буфера (в режиме КЗЭ). Полученные результаты подтвердили возможность одновременного качественного и количественного определения BMA и ГВА с хорошим разрешением (Rs ~ 2) от мешающих пиков, чего не удавалось добиться ранее (рис. 21).

SirriU

14 15 16 17 18 19

И 12 13 14 1S 16 17 18 19 мм

Рис. 21. Электрофореграмма реальной пробы мочи в режиме КЗЭ на буфере без добавления меди (а) и с добавлением в рабочий буфер 1 мМ ионов меди (б)

«Капель-105Р» Капилляр: Ьэфф=50 см, с1ВНу1р:=50мкм, УФ -детектор, —200 нм. Буферный электролит 35 мМ боратный буфер рН 8,6, 10% ацетонитрила; ввод - гидродинамический 30 мбар, время ввода 10 с, + 20 кВ.

выводы

1. Обоснован выбор аналитических форм биогенных металлов (Со2+, Ni2+, Fe3+, Al3", Cu2+, Zn2') с фотометрическими реагентами (пиридилазорезорцин, ксиленоловый оранжевый, нитрозо-Р-соль) для их электрофоретического определения.

2. Выявлены преимущества и ограничения различных схем электроинжекционного метода и электрофоретически опосредованного микроанализа при определении биогенных металлов в зависимости от природы реагента, относительных значений электрофоретических подвижностей реагента, комплекса, электроосмотического потока Использование различных вариантов стекинга (стекинг с большим вводом пробы и стекинг с усилением поля) с пределом обнаружения 6-10 мкг/л

3. Реализованы различные варианты и режимы электрофоретического анализа смесей биологически активных соединений (биогенные амины, амино- и гидрокси-карбоновые кислоты, полифенолы) в форме их комплексов с биогенными металлами: с введением в кварцевый капилляр предварительно приготовленного комплекса или при наличии одного из участников комплексообразования в составе буферного электролита

4. На примерах непоглощающих в УФ-свете аминокислот (глутаминовой, аланина, ватина) и азомакроцикла (циклама) установлено, что чувствительность их определения возрастает в 10-30 раз при использовании ионов меди в составе буферного электролита

5 Установлены закономерности влияния ионов Меп+ в составе рабочего электролита на эффективность, селективность и коэффициенты разрешения ароматических органических кислот с гидрокси- и аминогрурппами. Показано, что добавление ионов Си2+ позволяет разделить никотиновую и бензойную кислоты, добавление ионов А13" приводит к улучшению разрешения (Rs) (в 2 раза) всех компонентов системы органических кислот.

6 Обнаружена высокая комплексообразующая способность природных антиоксидантов полифенольного типа с ионами Fe3+ Показано, что доминирующим фактором в образовании таких комплексов является наличие пирокатехиновых фрагментов (1,2-фенольных гидроксилов) в составе молекул полифенолов

7. В соответствии с установленными закономерностями предложены схемы электрофоретического анализа.

- определение ионов А13+ в ферме комплекса с ксиленоловым оранжевым в природных водах (ПО 10 мкг/л);

- определение ионов Со2+, Cu2+, Zn2+ в форме комплексов с 4-(2-пиридилазорезорцичом) в витаминах «Компливит» (ПО 6 мкг/л)

- определение ванилинминдальной и гомованилиновой кислот - маркеров нейробластомы - в моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (фосфатный буфер (рН 7,0), 150 мМ ДЦСН) и методом капиллярного зонного электрофореза (боратный буфер (рН 8,5), 1 мМ Си2т) Показана возможность одновременного количественного определения этих кислот как в норме, так и в патологии (диагностика, контроль лечения),

Основные материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1 Маркова О.И , Никитина Т.Г., Москвин JT.H , Андреев В.П Электроинжекционное определение алюминия в водных растворах // Журнал аналитической химии. 2006. Т.61 №2. С.192 - 198.

2. Карцова J1.A, Попова А М, Сидорова А.А, Маркова О.И. Оценка констант устойчивости органических веществ кислотного и основного характера с 18-краун-6 и |3-циклодекстрином методом капиллярного зонного электрофореза// Журнал аналитической химии. 2007. Т. 62. № 2. С 198 - 203.

3. Никитина Т. Г, Маркова О. И, Андреев В П Определение микроконцентраций кобальта методом элекгроинжекционного анализа // 1-ая Всероссийская конференция «Аналитические приборы» СПб 2002 С. 15.

4. Маркова О И, Андреев В. П., Никитина Т. Г. Применение «Капели-103РЕ» для определения катионов металлов методами элекгроинжекционного анализа и электрофоретически опосредованного микроанализа // Всеросийская конференция «Актуальные проблемы аналитической химии». Москва 2002. С. 259

5. Маркова О И, Никитина Т. Г., Крашенинников А. А, Андреев В. П Разделение катионов тяжелых метатлов методом электрофоретически опосредованного микроанатиза // Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в анатитической химии» Краснодар 2002. С. 282

6 Никитина Т. Г., Маркова О И., Андреев В П., Москвин Л. Н Determination of toxic cations by electroinjection analysis // Международная конференция «SIS03 Separation of Ionic Solutes» Братислава 2003

7. Маркова О И., Никитина Т Г, Москвин Л Н Электроинжекционное определение алюминия в природных объектах // VI Всероссийская конференция по электрохимическим методам анатиза «ЭМА - 2004» с международным участием. Уфа 2004 С 197.

8. Маркова О. И., Никитина Т. Г, Москвин Л Н., Андреев В П Электроинжекционное определение катионов метатлов в природных объектах. // Конференция «Аналитика России» Москва, Клязьма 2004 С 91-92.

9. Маркова О.И., Карцова Л.А, Сидорова А А. Определение гомованилиновой и ванилинминдальной кислот методом зонного капиллярного электрофореза с 13-циклодекстриноч в составе буферного электролита // Материалы II Международного симпозиума «Разделение и концентрирование в анатитической и радиохимии». Краснодар. 2005 С. 371-372

10. Markova O.I., Kartsova L.A. Electrophoretic studying of complexation processes of copper with biologically active organic ligands // The Jubilee XXXй1 Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds". Katowice-Szczyrk, Poland, 12-14 June 2006 Book of Abstracts P. 116

11. Kartsova L A , Markova О I The ectrophorctic investigation of complexation processes of biogenic metals with biologically active ligands // 29th International . Symposium on Capillary Chromatography. Palazzo dei Congressi, Riva del Garda, Italy. May 29 -June 2 2006. H. 17

Подписано в печать 06.02.2007. Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная Печать ризографическая Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 3930.

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии НИИХ СПбГУ. 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр.26

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Актуальность проблемы определения катионов металлов.

1.2. Формы существования ионов алюминия, железа, кобальта, меди и цинка в водных растворах.

1.3. Физико-химические методы определения ионов металлов.

1.4. Фотометрическое определение ионов металлов в водных растворах.

1.5. Хроматографические методы определения катионов металлов.

1.6. Определение ионов металлов методом капиллярного электрофореза (КЭ).

1.6.1. Основы метода КЭ.

1.6.2. Капиллярный зонный электрофорез.

1.6.3. Мицеллярная электрокинетическая хроматография.

1.6.4. Электрокинетический и гидродинамический способы ввода.

1.6.5. Основные варианты УФ-детектирования ионов металлов в методе КЭ.

1.6.5.1. Определение ионов металлов с косвенным детектированием.

1.6.5.2. Электрофоретическое определение катионов металлов с использованием органических реагентов (прямое детектирование).

1.7. Комплексообразование ионов металлов с традиционными фотометрическими реагентами.

1.7.1. Комплексы ионов металлов с ксиленоловым оранжевым.

1.7.2. Комплексы ионов металлов с 4-(2-пиридилазо)резорцином (ПАР).

1.8. Предколоночное и внутриколоночное комплексообразование катионов металлов с органическими лигандами.

1.8.1. Влияние процесса комплексообразования на электрофоретическую подвижность аналитов.

1.8.1.1. Введение слабых комплексообразующих агентов (одно-, двух-, трехосновные и гидроксикарбоновых кислот) в состав рабочего буфера.

1.8.1.2. Использование мультидентатных хелатирующих реагентов.

1.8.2. Разделение органических соединений с использованием солей металлов в составе рабочего буфера.

1.8.3. Основные факторы, определяющие комплексообразование в системе металл - органический лиганд.

1.9. Электроинжекционный метод анализа (ЭИА) смеси катионов металлов.

1.10. Разделение катионов металлов методом электрофоретически опосредованного микроанализа (ЭОМА).

1.11. Детектирование в КЗЭ при определении комплексов металлов.

1.12. Физико-химические модели разделения ионов металлов в присутствии комплексообразующих агентов в ионной хроматографии.

1.13. Использование ионов металлов в лигандообменной хроматографии.

1.14. Координационные соединения меди и перспективы их использования в медицине.

ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Аппаратура.

2.2. Реагенты.

2.3. Подготовка кварцевого капилляра.

2.4. Приготовление рабочих растворов.

2.5. Методы определения ионов металлов.

2.5.1. Фотометрическое определение катионов металлов.

2.5.1.1. Определение металлов методом капиллярного электрофореза с косвенным детектированием.

2.5.1.2. Использование фотометрических реагентов: 4-(2-пиридилазо)резорцина и ксиленолового оранжевого (прямое детектирование).

2.5.2. Электроинжекционное определение (ЭИА) биогенных металлов.

2.6. On-line концентрирование в режиме капиллярного электрофореза.

2.7. Разрешение, эффективность и селективность разделения в методе КЭ.

ГЛАВА 3. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФОТОМЕТРИЧЕСКИХ РЕАГЕНТОВ.

3.1.Элекгрофоретическое определение биогенных металлов с 4-(2-пиридилазо)резорцином (ПАР).

3.1.1. Определение металлов методом капиллярного электрофореза с прямым детектированием комплексов металл-пиридилазорезорцин (Ме-ПАР).

3.1.2. Определение металлов в форме комплексов Ме-ПАР методом электрофоретически опосредованного микроанализа.

3.2. Электрофоретическое определение катионов металлов с ксиленоловым оранжевым.

3.2.1. Определение металлов методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с прямым детектированием комплексов

Ме-КО.

3.3. Определение ионов биогенных металлов методом электроинжекционного анализа (ЭИА).

3.3.1. Электроинжекционный анализ (ЭИА) с использованием ЭДТА в качестве фотометрического реагента.

3.3.2. Электроинжекционный анализ (ЭИА) с использованием ксиленолового оранжевого (КО) в качестве фотометрического реагента.

3.3.3. Электроинжекционное определение ионов Со с использованием нитрозо-Р-соли.

3.3.4. Электроинжекционное определение ионов А1 в водных растворах в присутствии Fe3+.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БИОГЕННЫХ МЕТАЛЛОВ (Cu2+, Со2+, Al3*, Fe3*) С БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫМИ ОРГАНИЧЕСКИМИ ЛИГ АНДАМИ МЕТОДАМИ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА. И

4.1. Процессы on-line и off-line комплексообразованя в системе биологически активный органический лиганд - металл.

4.2. Электрофоретическое изучение системы циклам (1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан)+Си2+.

4.3. Влияние добавок ионов металлов в состав рабочего электролита на разделение функционально замещенных гидрокси- и амино-ароматических кислот методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).

4.4. Электрофоретическое изучение процессов комплексообразования в системе природные полифенолы - Fe3+.

ГЛАВА 5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ.

5.1. Определение катионов металлов в витаминах методом капиллярного зонного электрофореза.

5.2. Определение массовой концентрации ионов алюминия в питьевых и природных водах методом капиллярного электрофореза.

5.3. Электроинжекционное определение алюминия (III) в природных водах.

5.4. Электрофоретическое определение ванилинминдальной и гомованилиновой кислот в режимах мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) и капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с введением ионов Си в состав рабочего буфера.

ВЫВОДЫ.

Актуальность проблемы

Определение катионов биогенных металлов и биологически активных соединений в природных и биологических объектах является одной из актуальных задач аналитической химии. Металлы играют важную роль в процессах живого организма, входят в состав активных центров ферментов. В организме жизненно важные металлы находятся преимущественно в виде координационных соединений. Их избыток или недостаток, вмешательство токсичных веществ и вирусов (потенциальных комплексообразователей) в конкуренцию за металл приводят к различным заболеваниям, для диагностики и лечения которых необходимо проводить как определение ионов металлов в различных физиологических растворах и биологических жидкостях, так и органических лигандов.

Все большее распространение вследствие высокой эффективности и экспрессности получает метод капиллярного электрофореза (КЭ). Однако при этом есть и определенные проблемы: электрофоретические подвижности многих гидратированных металлических ионов близки, а чувствительность УФ-детектирования в методе КЭ недостаточна для определения их и биологически активных органических соединений в реальных объектах.

Изменить электрофоретические характеристики определяемых ионов и снизить пределы обнаружения возможно при использовании процессов комплексообразования с органическими лигандами, поглощающими в УФ-свете либо образующими поглощающие комплексы.

Получение подобной информации могло бы представить как практическую ценность, так и теоретическую новизну в связи с выяснениями новых возможностей метода капиллярного электрофореза.

Стоит отметить еще одно важное обстоятельство: имеются публикации относительно образования в организме человека координационных соединений ионов металлов с лекарственными препаратами. Возможность электрофоретического контроля за подобными процессами может оказаться весьма полезной в практике клинической медицины как для определения биогенных металлов, так и соответствующих биологически активных веществ эндо- и экзогенного происхождения.

Цель диссертационного исследования: Изучение возможностей электрофоретического определения катионов биогенных металлов и биологически активных веществ в форме их комплексных соединений.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Выбрать аналитические формы биогенных металлов (Cu2+, Al3+, Zn2+, Со2+, л. лг

Fe , Ni ) с органическими реагентами и уточнить их фотометрические характеристики для оптимизации условий электрофоретического определения.

2. Выяснить возможности определения этих металлов с использованием традиционных фотометрических реагентов в различных режимах КЭ :

- косвенное и прямое детектирование в УФ-области;

- введение в кварцевый капилляр предварительно подготовленных комплексов;

- образование комплексов металлов с фотометрическими реагентами внутри кварцевого капилляра (электроинжекционный и электрофоретически опосредованный методы анализа).

3. Оптимизировать условия off-line и on-line комплексообразования в системе органический лиганд - металл.

4. Оценить возможности различных вариантов электрофоретического определения биологически активных лигандов (биогенных аминов, аминокислот, полифенолов, ароматических функционально замещенных карбоновых кислот) в форме комплексных соединений с биогенными металлами.

5. Предложить схемы электрофоретического анализа реальных объектов (природные воды, витамины, моча) при определении катионов металлов и/или органических лигандов в форме их комплексов.

Научная новизна

Выявлены аналитические формы и уточнены фотометрические характеристики при определения биогенных металлов с использованием фотометрических реагентов в различных режимах капиллярного электрофореза: косвенное и прямое детектирование в УФ-области; электроинжекционный и электрофоретически опосредованный варианты анализа.

Обнаружена высокая комплексообразующая способность природных

3+ антиоксидантов полифенольного типа с ионами Fe . Показано, что доминирующим фактором в образовании таких комплексов является наличие пирокатехиновых фрагментов (1,2-фенольных гидроксилов) в составе молекул полифенолов.

На примерах непоглощающих в УФ-свете аминокислот (глутаминовой, аланина, валина) и азомакроцикла (циклама) установлено, что чувствительность их определения возрастает в 10-30 раз при использовании ионов Си2+ в составе буферного электролита.

Теоретическая значимость работы

Обоснованы преимущества и ограничения различных схем электроинжекционного метода и электрофоретически опосредованного микроанализа при определении катионов металлов в зависимости от природы реагента, относительных значений электрофоретических подвижностей реагента и комплекса, электроосмотического потока.

На примерах модельных биологически активных соединений -норадреналина (NA}, 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и глутаминовой кислоты (Glu) - оптимизированы условия определения их в форме комплексов с ионами Си2+ в различных режимах капиллярного зонного электрофореза.

Показано, что добавление ионов Меп+ в состав рабочего буфера приводит к улучшению разрешения функциональных замещенных ароматических кислот: за счет процессов комплексообразования по аминному и карбоксилатному типу в случае ионов и с участием фенольных гидроксилов - для ионов А13+ и Fe3+ .

Практическая значимость работы

Разработаны способы электрофоретического определения А1 в форме комплекса с ксиленоловым оранжевым в природных и питьевых водах и ионов Со2+, Cu2+, Zn2+ в форме комплексов с 4-(2-пиридилазо)резорцином в витаминах «Компливит».

Предложены схемы электрофоретического анализа ванилинминдальной и гомованилиновой кислот - маркеров нейробластомы -в моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (фосфатный буфер, рН 7,0; 150 мМ ДДСН) и методом капиллярного зонного f\ I электрофореза (боратный буфер, рН 8,5; 1 мМ Си ).

Положения, выносимые на защиту:

1. Аналитические формы металлов (Cu2+, Al3+, Zn2+, Со2+, Fe3+, Ni2+) с традиционными органическими реагентами и их фотометрические и электрофоретические характеристики.

2. Обоснование преимуществ и ограничений схем электроинжекционного и электрофоретически опосредованного методов анализа при определении ионов биогенных металлов с использованием фотометрических реагентов: ксиленолового оранжевого (КО), нитрозо-Р-соли (НРС), 4-(2-пиридилазо)резорцина (ПАР).

3. Концентрации, состав, рН буферного электролита, соотношение реагентов в системе металл - органический лиганд при off-line и on-line комплексообразовании в режиме капиллярного зонного электрофореза.

4. Способы on-line концентрирования (стекинг с большим вводом пробы и стекинг с усилением поля) для увеличения чувствительности электрофоретического определения катионов металлов и/или их комплексов методами традиционного капиллярного зонного электрофореза, электроинжекционного и электрофоретически опосредованного методов анализа.

5. Условия электрофоретического определения биологически активных органических соединений (биогенные амины, аминокислоты, полифенолы, ароматические функционально замещенные карбоновые кислоты) в форме комплексов с биогенными металлами.

6. Практические приложения выявленных закономерностей в схемах анализа для определения:

- ионов алюминия в природных и питьевых водах методами электроинжекционного анализа и капиллярного зонного электрофореза;

- ионов кобальта, меди и цинка в витаминном комплексе «Компливит» с использованием 4-(2-пиридилазо)резорцина (ПАР) методом капиллярного зонного электрофореза;

- маркеров злокачественной опухоли - ванилинминдальной и гомованилиновой кислот методами КЗЭ и МЭКХ с введением в состав рабочего буфера катионов Си с оптимизированным вариантом пробоподготовки.

выводы

1. Обоснован выбор аналитических форм биогенных металлов

Со , Ni ,

Fe3+, Al3+, Cu2+, Zn2+) с фотометрическими реагентами (пиридилазорезорцин, ксиленоловый оранжевый, нитрозо-Р-соль) для их электрофоретического определения.

2. Выявлены преимущества и ограничения различных схем электроинжекционного метода и электрофоретически опосредованного микроанализа при определении биогенных металлов в зависимости от природы реагента, относительных значений электрофоретических подвижностей реагента, комплекса, электроосмотического потока. Использование различных вариантов стекинга (стекинг с большим вводом пробы и стекинг с усилением поля) с пределом обнаружения 6-10 мкг/л.

3. Реализованы различные варианты и режимы электрофоретического анализа смесей биологически активных соединений (биогенные амины, амино- и гидрокси- карбоновые кислоты, полифенолы) в форме их комплексов с биогенными металлами: с введением в кварцевый капилляр предварительно приготовленного комплекса или при наличии одного из участников комплексообразования в составе буферного электролита.

4. На примерах непоглощающих в УФ-свете аминокислот (глутаминовой, аланина, валина) и азомакроцикла (циклама) установлено, что чувствительность их определения возрастает в 10 - 30 раз при использовании ионов меди в составе буферного электролита.

5. Установлены закономерности влияния ионов Меп+ в составе рабочего электролита на эффективность, селективность и коэффициенты разрешения ароматических органических кислот с гидрокси- и

2+ аминогрурппами. Показано, что добавление ионов Си позволяет

3+

разделить никотиновую и бензойную кислоты, добавление ионов А1 приводит к улучшению разрешения (R^) (в 2 раза) всех компонентов системы органических кислот.

6. Обнаружена высокая комплексообразующая способность природных

11 антиоксидантов полифенольного типа с ионами Fe . Показано, что доминирующим фактором в образовании таких комплексов является наличие пирокатехиновых фрагментов (1,2-фенольных гидроксилов) в составе молекул полифенолов.

7. В соответствии с установленными закономерностями предложены схемы электрофоретического анализа:

- определение ионов А13+ в форме комплекса с ксиленоловым оранжевым в природных водах (ПО 10 мкг/л);

- определение ионов Со2+, Cu2+, Zn2+ в форме комплексов с 4-(2-пиридилазорезорцином) в витаминах «Компливит» (ПО 6 мкг/л).

- определение ванилинминдальной и гомованилиновой кислот -маркеров нейробластомы - в моче в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (фосфатный буфер (рН 7,0); 150 мМ ДДСН) и методом капиллярного зонного электрофореза (боратный буфер (рН 8,5); 1 мМ Си ). Показана возможность одновременного количественного определения этих кислот как в норме, так и в патологии (диагностика, контроль лечения);

1. Н. Wittrisch, S. Conradi, Е. Rohde, J. Vogt, С. Vogt. Characterization of metal complexes of pharmaceutical interest by capillary electrophoresis with element sensitive detection // J. Chromatogr. A. 1997. V. 781. № 1-2. P. 407-416.

2. H. Veillard. Hydration of the cations Al3+ and Cu2+. Theoretical study. //J. Amer.Chem.Soc. 1977. V.99. № 2. P.7194.

3. R. Caminiti, G. Licheri, G. Piccaluga at al. Order phenomena in aqueous A1C13 solutions. //J. Chem. Phys. 1979. V.71. №6. P.2473.

4. D.E. Irish, G. Chang, D.L. Nelson. Concerning cation nitrate ion contact in aqueous solution. // Inorg. Chem. 1970. V.9. № 2. P.425.

5. M.M. Крыжановский, Ю.А. Волохов, A.H. Павлов и др. О сульфатных комплексах алюминия. // Ж. прикл. химии. 1971. Т.44. №3. С.476.

6. В.А. Назаренко, В.П. Антонович, Е.М. Невская. Гидролиз ионов металлов в разбавленных растворах. М. Атомиздат. 1979.192 С.

7. Ю.А. Волохов, А.Н. Павлов, Н.И. Еремин, В.Е. Миронов. Гидролиз солей алюминия. //Ж. прикл. химии. 1971.Т.44. № 2. С.246.

8. Н.М. Николаева, JI.H. Толпыгина. Гидролиз солей алюминия при повышенных температурах. // Изв. Сиб. отд. АН СССР. Сер. хим. наук. 1969. вып. 3. №7.С.49.

9. N. Dezelic, H. Bilinski, R.H. Wolf. Precepitation and hydrolysis of metallic ions. 4. Studies on the solubility of aluminum hydroxide in aqueous solution. //J. Inorg. AndNucl. Chem. 1971. V.33.№ 3. P.791.

10. C.R. Frink, M. Peech. Hydrolysis of the aluminum ion in dilute aqueous solution. // Inorg. Chem. 1963. V.2. №3. P.473.

11. A.C. Першин. Гидролиз ионов алюминия. //Радиохимия. 1972. Т.14. № 1. С. 159.

12. П.Н. Линник, В.И. Набиванец. Формы миграции металлов в пресных поверхностных водах. Л. Гидрометеоиздат. 1986.

13. О.Ю. Пыхтеев, А.А. Ефимов, Л.Н. Москвин. Гидролиз аквакомплексов железа (III). // Ж. прикл. химии. 1999. Т. 72. № 1. С. 11.

14. C.F. Baes, R.E. Mesmer. The hydrolysis of cations. New York etc. Wiley. 1976. 489 p.

15. M. Soylak, M. Tuzen. Diaion SP-850 resin as a new solid phase extractor for preconcentration-separation of trace metal ions in environmental samples // J. of Hazardous Materials. 2006.

16. A.K. Malik, V. Kaur, N. Verma. A review on solid phase microextraction— High performance liquid chromatography as a novel tool for the analysis oftoxic metal ions // Talanta. V. 68. № 3. 2006. P. 842-849.

17. P.S. Marshall, B. Leavens, O. Heudi, C. Ramirez-Molina. Liquid chromatography coupled with inductively coupled plasma mass spectrometry in the pharmaceutical industry: selected examples // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1056. №1-2. P. 3-12.

18. M. Guo, H. Zou, H. Wang, L. Kong, J. Ni. Binding of metal ions with protein studied by a combined technique of microdialysis with liquid chromatography // J. Anal. Chim. Acta. 2001. V. 443. № 1. P. 91-99.

19. E. Munoz, S. Palmero, M.A. Garcia-Garcia. A continuous flow system design for simultaneous determination of heavy metals in river water samples // Talanta. 2002. V. 57. № 5. P. 985-992.

20. M. Yaqoob, A. Waseem, A. Nabi. Determination of Total Iron in Fresh waters Using Flow Injection with Potassium Permanganate Chemiluminescence Detection // Журн. Аналит. Химии. 2006. T.61. № 9. C.991-995.

21. C.-F. Yeh, S.-J. Jiang. Speciation of V, Cr and Fe by capillary electrophoresis-bandpass reaction cell inductively coupled plasma mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1029. № 1-2. P. 255-261.

22. Метод изотопного разбавления (внутреннего стандарта) // Труды Радиевого института. 1956. Т. VII. Вып 1. 128 С.

23. H.L. Schmidt, Н. Foerstel, К. Heinziger. Stable Isotopes. New York: Elsevier. 1982.

24. О. Самуэльсон. Ионообменные разделения в аналитической химии. Пер. с англ. Ленинград. «Химия». 1966.416 С.

25. J. Ruzicka. The second coming of flow-injection analysis. // Anal. Chim. Acta. 1992. V.261. P.3-10.

26. P.C. Hauser, W.T. Thusitsa, R. Rupasinghe. Simultaneous determination of metal ion concentrations in binary mixtures with a multi-LED photometer. // Fresenius J. Anal. Chem. 1997. V.357. № 8. P. 1056-1060.

27. L. Campanella, K. Pyrzynska, M. Trojanowicz. Chemical speciation by flow-injection analysis. (Review) // Talanta. V. 43. 6. 1996. P. 825-838

28. P. Jandik, В. Bonn, Capillary Electrophoresis of Small Molecules and Ions, VCH, New York, 1993.

29. J.S. Fritz, in: P. Camilleri (Ed.), Capillary Electrophoresis, Theory and Practice, CRC Press, Boca Raton, FL, 2nd ed., 1997.

30. В.П. Андреев. Электроинжекционный анализ: от нового способа смешения пробы и реагента в проточно-инжекционном анализе к новому аналитическому методу // Журн. Аналит. Химии. 1999. Т.54. № 7. С.769-776.

31. Е.М. Soliman, М.В. Saleh, S.A. Ahmed. Alumina modified by dimethyl sulfoxide as a new selective solid phase extractor for separation and preconcentration of inorganic mercury (II) // Talanta. 2006. V. 69. № 1. P. 55-60.

32. Y.-S. Kim, G. In, C.-W. Han, J.-M. Choi. Studies on synthesis and application of XAD-4-salen chelate resin for separation and determination of trace elements by solid phase extraction // J. Microchemical. 2005. V. 80. № 2. P. 151-157.

33. A. Demirbas, E. Pehlivan, F. Gode, T. Alton, G. Arslan. Adsorption of Cu(II), Zn(II), Ni(II), Pb(II), and Cd(II) from aqueous solution on Amberlite IR-120 synthetic resin // J. of Colloid and Interface Science. 2005. V. 282. № 1. P, 20-25.

34. S. Agarwal, S.G. Aggarwal, P. Singh. Quantification of ziram and zineb residues in fog-water samples // Talanta, 2005. V. 65.1.1. P. 104-110.

35. T. Nedeltcheva, M. Atanassova, J. Dimitrov, L. Stanislavova. Determination of mobile form contents of Zn, Cd, Pb and Cu in soil extracts by combinedstripping voltammetry // J. Anal. Chim. Acta. 2005. V. 528. № 2. P. 143-146.

36. P.S. Roldan, I.L. Alcantara, C.C.F. Padilha, P.M. Padilha. Determination of copper, iron, nickel and zinc in gasoline by FAAS after sorption and preconcentration on silica modified with 2-aminotiazole groups // J. Fuel. 2005. V. 84. № 2-3. P. 305-309.

37. J.F. van Staden, R.E. Taljaard. Determination of Lead(II), Copper(II), Zinc(II), Cobalt(II), Cadmium(II), Iron(III), Mercuiy(II) using sequential injection extractions // Talanta. 2004. V. 64. № 5. P. 1203-1212.

38. S. Yal?in, R. at Apak. Chromium(III, VI) speciation analysis with preconcentration on a maleic acid-functionalized XAD sorbent // J. Anal. Chim. Acta. 2004. V. 505. № 1, 3. P. 25-35.

39. C.C. Nascentes, M.A.Z. Arruda. Cloud point formation based on mixed micelles in the presence of electrolytes for cobalt extraction and preconcentration // Talanta. 2003. V. 61. № 6, 23. P. 759-768.

40. K. Kilian, K. Pyrzyska. Spectrophotometry study of Cd(II), Pb(II), Hg(II) and Zn(II) complexes with 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxylphenyl)porphyrin // Talanta. 2003. V. 60. № 4. P. 669-678.

41. E. Poboy, R. Halko, M. Krasowski, T. Wierzbicki, M. Trojanowicz. Flow-injection sample preconcentration for ion-pair chromatography of trace metals in waters // J. Water Research. 2003. V. 37. № 9. P. 2019-2026.

42. S. Scaccia, M. Carewska. Determination of stoichiometry of Lil+yCo02 materials by flame atomic absorption spectrometry and automated potentiometric titration // J. Anal. Chim. Acta. 2002. V. 455. №1. P. 35-40.

43. U. Divrikli, L. EI5L Determination of some trace metals in water and sediment samples by flame atomic absorption spectrometry after coprecipitation with cerium (IV) hydroxide // J. Anal. Chim. Acta. 2002. V. 452. № 2. P. 231-235.

44. Y. Cui, X. Chang, Y. Zhai, X. Zhu, H. Zheng, N. Lian. ICP-AES determination of trace elements after preconcentrated with p-dimethylaminobenzaldehyde-modified nanometer Si02 from sample solution //J. Microchemical. 2006. V. 83. № 1. P. 35-41.

45. Y. Liu, P. Liang, L. Guo. Nanometer titanium dioxide immobilized on silica gel as sorbent for preconcentration of metal ions prior to their determination by inductively coupled plasma atomic emission spectrometry // Talanta. 2005. V. 68. № l.P. 25-30.

46. X. Zou , Y. Li, M. Li, B. Zheng, J. Yang. Simultaneous determination of tin, germanium and molybdenum by diode array detection-flow injection analysis with partial least squares calibration model // Talanta. 2004. V. 62. № 4. P. 719-725.

47. F.L. Coco, L. Ceccon, L. Ciraolo, V. Novelli. Determination of cadmium(II) and zinc(II) in olive oils by derivative potentiometric stripping analysis // J. Food Control. V. 14. № 1. 2003. P. 55-59.

48. P. Gonzalez, V. A. Cortinez, C. A. Fontan. Determination of nickel by anodic adsorptive stripping voltammetry with a cation exchanger-modified carbon paste electrode // Talanta. 2002. V. 58. № 4. P. 679-690.

49. J. Davis, D.H. Vaughan, D. Stirling, L.Nei, R.G. Compton. Cathodic stripping voltammetry of nickel: sonoelectrochemical exploitation of the Ni(III)/Ni(II)couple // Talanta. 2002. V. 57. № 6. P. 1045-1051.

50. M. Zougagh, A. Garcia de Torres, J. M. Cano Pavon. Determination of cadmium in water by ICP-AES with on-line adsorption preconcentration using DPTH-gel and TS-gel microcolumns // Talanta. 2002. V. 56. № 4. P. 753-761.

51. J.M. Hall, L.-H. Chan, W.F. McDonough, K.K. Turekian. Determination of the lithium isotopic composition of planktic foraminifera and its application as a paleo-seawater proxy // J. Marine Geology. 2005. V. 217. № 3-4. P. 255265.

52. D. Sanchez-Rodas, J.L. Gomez-Ariza, I. Giraldez, A. Velasco, E. Morales. Arsenic speciation in river and estuarine waters from southwest Spain // J. Science of The Total Environment. 2005. V. 345. № 1-3. p. 207-217.

53. E. Urdova, L. Vavrukova, M. Suchanek, P. Baldrian, J. l Gabriel. ICP-MS determination of heavy metals in submerged cultures of wood-rotting fungi // Talanta. 2004. V. 62. № 3. P. 483-487.

54. J. Threeprom, R. Meelapsom, W. Som-aum, J.-M. Lin. Simultaneous determination of Cr(III) and Cr(VI) with prechelation of Cr(III) using phthalate by ion interaction chromatography with a C-18 column // Talanta. 2006.

55. M.Y. Khuhawar, G.M. Arain. Liquid chromatographic determination of vanadium in petroleum oils and mineral ore samples using 2-acetylpyridne-4-phenyl-3-thiosemicarbazone as derivatizing reagent // Talanta. 2006. V. 68. №3.P. 535-541.

56. J. Munoz, M. Gallego, M. Valcarcel. Speciation analysis of mercury and tin compounds in water and sediments by gas chromatography-mass spectrometry following preconcentration on C60 fullerene // J. Anal. Chim. Acta. 2005. V. 548. № 1-2. P. 66-72.

57. Q.M. Jaradat, K.A. Momani, A.-A.Q. Jbarah, A. Massadeh. Inorganic analysis of dust fall and office dust in an industrial area of Jordan // Environmental Research. V. 96. № 2. 2004. P. 139-144.

58. J. Munoz, J. R. Baena, M. Gallego, M. Valcarcel. Speciation of butyltin compounds in marine sediments by preconcentration on C60 and gas chromatography-mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1023. № 2. P. 175-181.

59. S. Oszwadowski, J. Jakubowska. Simultaneous determination of zirconium and hafnium as ternary complexes with 5-Br-PADAP and fluoride using solid-phase extraction and reversed-phase liquid chromatography // Talanta. 2003. V. 60. №4. P. 643-652.

60. P.A. Williams, G.D. Rayson. Simultaneous multi-element detection of metal ions bound to a Datura innoxia material // J. of Hazardous Materials. 2003. V. 99. № 3. P. 277-285.

61. E. Poboy, R. Halko, M. Krasowski, T. Wierzbicki, M. Trojanowicz. Flow-injection sample preconcentration for ion-pair chromatography of trace metals in waters // J. Water Research. 2003. V. 37. № 9. P. 2019-2026.

62. M. A. Arain, M. Y. Khuhawar, M. I. Bhanger. Gas and liquid chromatography of metal chelates of pentamethylene dithiocarbamate // J. of Chromatography A. 2002. V. 973.1. 1-2. P. 235-241.

63. M.R.B. Abas, I.A. Takruni, Z. Abdullah, N.M. Tahir. On-line preconcentration and determination of trace metals using a flow injection system coupled to ion chromatography // Talanta. V. 2002. 58. № 5. P. 883890.

64. W. Ни, K. Hasebe, K. Tanaka, J.S. Fritz. Determination of total acidity and of divalent cations by ion chromatography with n-hexadecylphosphocholine as the stationary phase // J. Chromatogr.A. 2002. V. 956. № 1-2. P. 139-145.

65. A. Dibudak, S. Bekta, S. Patir, O. Gen?, A. Denizli. Cysteine-metal affinity chromatography: determination of heavy metal adsorption properties // J. Separation and Purification Technology. 2002. V. 26. № 2-3. P. 273-281.

66. A.K. Бабко, A.T. Пилипенко. Фотометрический анализ. Общие сведения и аппаратура. М.: Химия, 1968, С. 13-23.98. 3. Марченко. Фотометрическое определение элементов. М., Мир, 1971. 504 С.

67. Р.А. Алиева, А.С. Алиева, Ф.М. Чырагов. Бис-{2,3,4-тригидроксифенилазо)бензидин как реагент для фотометрического определения алюминия // Журн. Аналит. Химии. 2006. Т.61. № 7. С.686-689.

68. С. Sarzanini. Liquid chromatography: a tool for the analysis of metal species //J. Chromatogr. A. 1999. V. 850. № 1-2. P. 213-228.

69. Д. Фритц, Д. Гьерде, К. Поланд. Ионная хроматография. М. Мир, 1984.

70. M.Y. Khuhawar, Sh.N. Lanjwani // Microchimica Acta. 1998. V.129. № 1-2. P.65-70.

71. A.C. Co, A.N. Ко, Y. Liwen, C.A. Lucy. Modification of 4-(2-pyridylazo)-resorcinol postcolumn reagent selectivity through competitive equilibria with chelating ligands // J. Chromatogr. A. 1997. V. 770. P. 69-74

72. E.A. Gautier, R.T. Geffar. Surfactant-sensitized post-column reaction with xylenol orange for the determination of lanthanides by ion chromatography // J. Chromatogr. A. 1997. V.770. № 1-2. P.75-83.

73. M.A. Proskurnin, A. Yu. Luk'yanov, S.N. Bendrysheva, A.A. Bendryshev, A.V. Pirogov, O.A. Shpigun. Optical photothermal detection in HPLC // Anal, and Bioanal. Chem. 2003. V. 375. № 8. P.1204-1211

74. A. Al-Shami, R. Dahl. Determination of lanthanides in Kola nitrophosphate solution by cation-exchange ion chromatography // J. Chromatogr. 1994. V. 671. P.173-179.

75. M.L. Litvina, I.N. Voloschik, B.A. Rudenko. Application of a dynamically coated sorbent and conductimetric and UV detectors to the determination of alkaline earth and transition metal cations // J. Chromatogr A. 1994. V. 671. № 1-2. P. 29-32.

76. L.M. Nair, R. Saari-Nordhaus, J.M.Jr. Anderson. Ion chromatographic separation of transition metals on a polybutadiene maleic acid-coated stationary phase // J. Chromatogr. A. 1994. V. 671. № 1-2. P. 43-49.

77. I.N. Voloschik, M.L. Litvina, B.A. Rudenko. Separation of transition and heavy metals on an amidoxime completing sorbent // J. Chromatogr. A. 1994. V. 671. № 1-2. P. 51-54.

78. P.N. Nesterenko, Ph. Jones. Single-column method of chelation ion chromatography for the analysis of trace metals in complex samples // J. Chromatogr. A. 1997. V.770. № 1-2. P.129-135.

79. A. Padarauskas, G. Schwedt. Capillary electrophoresis in metal analysis. Investigations of multi-elemental separation of metal chelates with aminopolycarboxylic acids // J. Chromatogr. A. 1997. V. 773.1. 1-2. P. 351360.

80. W. Buchberger, K. Haider. Studies on the combination of ion chromatography-particle-beam mass spectrometry with capillary columns. // J. Chromatogr. A. 1997. V.770. N 1-2. P.59-68.

81. Новый справочник химика и технолога. Аналитическая химия. НПО «Мир и Семья». СПб. 2002. Карцова JI.A. Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез. С. 343 388.

82. Z. Krivacsy, A. Gelencser, J. Hlavay, G. Kiss, Z. Sarvari. Review, Electrokinetic injection in capillary electrophoresis and its application to the analysis of inorganic compounds // J. Chromatogr. A. 1999. V. 834. P. 21 44

83. D.J. Rose, J. W. Jorgenson Characterization and automation of sample introduction methods for capillary zone electrophoresis // J. Anal. Chem. 1988. V. 60. P. 642 648

84. J.D. Olechno, J.M.Y. Tso, J. Thayer, A. Wainright, Am. Lab. 1990. V. 22. P. 30-37

85. K.D. Lukacs, J.W. Jorgenson, J. High, Resolut. Chromatogr. 1985. V.8. P. 407-411

86. R. Kuhn, S. Hoffsteller-Kuhn, Capillary Electrophoresis Principles and Practice. Springer. Berlin. 1993. P. 106

87. J. Sadecka, J. Polonsky. Determination of inorganic ions in food and beverages by capillary electrophoresis. // J. Chromatogr. A. 1999. V.834. P.401-409

88. A.R. Timerbaev. Strategies for selectivity control in capillary electrophoresis of metal species //J. Chromatogr. A. 1997. V.792. P.495-518

89. F.B. Regan, M.P. Meany, S.M. Lunte. Determination of metal ions by capillary electrophoresis using on-column complexation with 4-(2-pyridylazo)resorcinol following trace enrichment by peak stacking // J. Chromatogr. B. 1994. V. 657. N 1-2. P.409-417.

90. N. Iki, H. Hishino. High-Performance Separation and Determination of Co(III) and Ni(II) Chelates of 4-(2-Pyridylazo)resorcinol at Femtomole1.vels by Capillary Electrophoresis // Chem. Lett. 1993. P. 701-710

91. P.A.G. Butler, B. Mills, P.S. Hauser. // Analyst. 1997. V.122. P.949.

92. A.R. Timerbaev, O.P. Semenova, P. Jandik, G.K. Bonn. Metal ion capillary electrophoresis with direct UV detection effect of a charged surfactant on the migration behaviour of metal chelates. // J. Chromatogr. A. 1994. V. 671. P. 419-427

93. J. Kobayashi, M. Shirao. //J. Liq. Chromatogr. Rel. Techn. 1998. V.21. P. 151.

94. H.M. Дятлова, В.Я. Темкина, И.Д. Колпакова. Комплексоны. М. Химия. 1970.

95. В.Н. Тихонов. Комплексообразование ионов металлов с ксиленоловым оранжевым. // Ж. Аналит. Химии. 1986. Т. 41. № 8. С. 1353-1359

96. В.Н. Тихонов, Л.Ф. Петрова. Повышение точности фотометрического определения алюминия с ксиленоловым оранжевым измерением оптической плотности в изобестической точке. //Ж. аналит. химии. 1973. Т.28. №7.с.1413.

97. В.А. Назаренко, Е.М. Невская. Исследование химизма реакций ионов многовалентных элементов с органическими реагентами. Сообщение 16. Взаимодействие алюминия и галлия с ксиленоловым оранжевым. // Ж. аналит. хим. 1969. Т.24. № 4. С.536.

98. А.И. Черкесов, В.И. Казаков, B.C. Тонкошуров. Изучение кинетики взаимодействия ионов алюминия с ксиленоловым оранжевым и алюмокрезоном. // Ж. аналит. химии. 1967. Т.22. № 10. С. 1464.

99. В.М. Иванов. Гетероциклические азотсодержащие азосоединения. М. Наука. 1982

100. A.R. Timerbaev, О.A. Shpigun. Recent progress in capillary electrophoresis of metal ions // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 4179-4191.

101. A.R. Timerbaev. Recent advances and trends in capillary electrophoresis of inorganic ions // Electrophoresis. 2002. V. 23. P. 3884-3906.

102. A.R. Timerbaev. Capillary electrophoresis of inorganic ions: An update // Electrophoresis. 2004. V. 25. P. 4008^031.

103. M. Chiari. Enhancement of selectivity in capillary electrophoretic separations of metals and ligands through complex formation // J. Chromatogr. A. 1998. V. 805. P. 1-15.

104. E. Naujalis, A. Padarauskas. Development of capillary electrophoresis for the determination of metal ions using mixed partial and complete complexation techniques // J. Chromatogr. A. 2002. V. 977. P. 135-142.

105. Y. Shi, J.S. Fritz. Separation of metal ions by capillary electrophoresis with a complexing electrolyte. // J. Chromatogr. 1993. V. 640. P. 473-479

106. Lin T.I., Lee Y.H., Chen Y.C. Capillary electrophoretic analysis of inorganic cations : Role of complexing agent and buffer pH // J. Chromatogr. A. 1993. V. 654. P. 167-176.

107. Y.H. Lee, I. Lin. Determination of metal cations by capillary electrophoresis effect of background carrier and completing agents // J. Chromatogr. A. 1994. V. 675. P. 227-236.

108. A. Weston, P.R. Brown, P. Jandik, W. R. Jones, A. L. Heckenberg Factors affecting the separation of inorganic metal cations by capillary electrophoresis

109. J. Chromatogr. 1992. V. 593. P. 289 295.

110. Z. Chen, R. Naidu. On-column complexation of metal ions using 2,6-pyridinedicarboxylic acid and separation of their anionic complexes by capillary electrophoresis with direct UV detection // J. Chromatogr. A. 2002. V. 966. № 1-2. P. 245-251.

111. Q. Yang, J. Smeyers-Verbeke, W. Wu, M.S. Khots, D.L. Massart. Simultaneous separation of ammonium and alkali, alkaline earth and transition metal ions in aqueous-organic media by capillary ion analysis // J. Chromatogr. A. 1994. V. 688. P. 339 349

112. T. Hirokawa, T. Ohta, K. Nakamura, K. Nishimoto, F. Nishiyama. Bidirectional isotachophoretic separation of metal cations using EDTA as a chelating agent // J. Chromatogr. A. 1995. V. 709. № 1. P. 171 180

113. J.P. Wiley. Determination of polycarboxylic acids by capillary electrophoresis with copper complexation // J. Chromatogr. A, 1995. V. 692. P. 267 274

114. S.D. Harvey. Capillary zone electrophoretic and micellar electrokinetic capillary chromatographic separations of polyaminopolycarboxylic acids as their copper complexes // J. Chromatogr. A. 1996. V. 736. P. 333-340.

115. M. Chiari, N. Dell'Orto, L. Casella. Separation of organic acids by capillary zone electrophoresis in buffers containing divalent metal cations // J. Chromatogr. A. 1996. V. 745. P. 93-101.

116. R.A. Mosher, Electrophoresis 11 (1990) 765 769

117. M. Маска, P.R. Haddad, W. Buchberger. Separation of some metallochromic ligands by capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. A. 1995. V. 706. P. 493 501.

118. B. Gassner, W. Friedl, E. Kenndler. Wall adsorption of small anions in capillary zone electrophoresis induced by cationic trace constituents of the buffer // J. Chromatogr. A. 1994. V. 680. P. 25 31

119. M. Deacon, T.J. O'Shea, S.M. Lunte, M.R. Smyth. Determination of peptides by capillary electrophoresis-electrochemical detection using on-column Cu(II) complexation // J. Chromatogr. A. 1993. V. 652. № 2. P. 377 383

120. P. Gozel, E. Gassman, H. Michelson, R.N. Zare. Electrokinetic resolution of amino acid enantiomers with copper(II)-aspartame support electrolyte // Anal. Chem. 1987. V. 59. P. 44-49

121. C. Vogt, S. Conradi. Complex equilibria in capillary zone electrophoresis andtheir use for the separation of rare earth metal ions // Anal. Chim. Acta, 1994. V. 294. №2. P. 145-153

122. P. Gebauer, P. Bocek, M. Demil, J. Janak. Isotachophoresis of Kinetically labile complexes // J. Chromatogr. 1980. V. 199. P. 81 94

123. V.P. Andreev, N.B. Ilyina, E.V. Lebedeva, A.G. Kamenev, N.S. Popov Electroinjection analysis. Concept, mathematical model and applications // J. Chromatogr. A. 1997. V. 772. № 1. P. 115-127.

124. J. Bao, F.E. Regnier. Ultramicro enzyme assays in a capillary electrophoretic system // J. Chromatogr A. 1992. V 608. P. 217-224

125. B.J. Harmon, D.H. Patterson, F.E. Regnier. Electrophoretically mediated microanalysis of ethanol // J. Chromatogr A. 1993. V 657 № 1. P 429 434

126. B.J. Harmon, D.H. Patterson, F.E. Regnier. Mathematical treatment of electrophoretically mediated microanalysis // Anal. Chem. 1993. V 65. № 19. P. 2655-2662

127. A.R. Timerbaev, O.P. Semenova, J.S. Fritz. Improved photometric detection of metal ions by capillary zone electrophoresis after precapillary complexation // J. Chromatogr. A. 1998. V. 811. № 1-2. P. 233-239.

128. R.A. Wallingford, A.G. Ewing. Capillary zone electrophoresis with electrochemical detection// Anal. Chem. 1987. V. 59. № 14. P. 1762-1766.

129. Y. Liu, V. Lopez-Avila, J.J. Zhu, D. Wiederin, W.F. Beckert. Capillary Electrophoresis Coupled Online with Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry for Elemental Speciation // Anal. Chem. 1995. V. 67. № 13. P. 2020-2025.

130. P. Janos. Retention models for the ion chromatographic separations of metals in the presence of complexing agents // J. Chromatogr. A. 1996. V. 737. № 2. P. 129-138.

131. В. А. Даванков, Дж. Навратил, X. Уолтон. Лигандообменная хроматография. Пер. с англ. М.: Мир. 1990. 294 С.

132. J.R.I. Sorenson, W. Hangarter. Treatment of rheumatoid and degenerative diseases with copper complexes / Inflammation. 1997. 2. № 3. P. 217-238.

133. J.R.I. Sorenson. Copper chelates as possible active forms of the anti-arthritic agents//J. Med. Chem. 1976. V. 19. № 1. P. 135-148.

134. Координационные соединения металлов в медицине / Е.Е. Крисс, И.И. Волченскова, А.С. Григорьева и др. Киев: Наук. Думка, 1986. 216 С.

135. N. Shakulashvili, Т. Faller, Н. Engelhardt. Simultaneous determination of alkali, alkaline earth and transition metal ions by capillary electrophoresis with indirect UV detection // J. Chromatogr. A. 2000. V. 895. P. 205 212.

136. Аналитическая химия элементов. Алюминий., М. «Наука», В. Н. Тихонов, 1971, 267 С.

137. Руководство по капиллярному электрофорезу. / Под ред. A.M. Волощука. М. 1996. 112 С.

138. R.L. Chien, D.S. Burgi. On-column sample concentration using field amplified in CZE. // Analytical Chemistry. 1992. V. 64. P. 489

139. P. Britz-McKibbin, S, Terabe. On-line preconcentration strategies for trace analysis of metabolites by capillary electrophoresis. // J. Chrom. A. 2003. V. 1000. P. 917-934

140. D.M. Osbourn, D.J. Weiss, C.E. Lunte. On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2000. V. 21. P. 2768-2779

141. V. Pacakova, P. Coufal, K. Stulik. Review. Capillary electrophoresis of inorganic cations // J. Chromatogr. A. 1999. V. 834. P. 257-275

142. S. Watanabe, Т. Saito. Circular Dichroism and Ultraviolet Studies of the Cupric (II) and Nickel (II) - L-3,4-Dihydroxyphenylalanine Complex // J. Inorganic Biochemistry. 1995. V. 58. P. 147-155

143. Эндокринология / под ред. H. Лавина. 1999. 1128 С.

144. Руководство по лабораторной клинической диагностике / под ред. В.В. Меньшикова. М., Медицина. 1982. 576 С.

145. A. Golcu. Spectrophotometric determination of furosemide in pharmaceutical dosage forms using complex formation with Си (II) // Журн. Аналит. Химии. 2006. Т. 12. № 8. С. 811-817.

146. Х. Liang, P. Sadler. Cyclam complexes and their applications in medicine // Chem. Soc. Rev. 2004. V. 33. P. 246-266.

147. S. Khokhar, R.K.O. Apenten. Iron binding characteristics of phenolic compounds: some tentative structure-activity relations // Food Chem. 2003. V. 81. № 1. P. 133-140.

148. L.M. Costa, S.T. Gouveia, J.A. Nobrega. Comparison of heating extraction procedures for Al, Ca, Mg and Mn in tea samples // Analytical Sciences. 2002. V. 18. P. 313-318.

149. S.B. Erdemoglu, S. Gucer. Selective Determination of Aluminum Bound with Tannin in Tea Infusion // Analytical Sciences. 2005. V. 21. P. 1005-1008

150. M.K. Shirao, S. Suzuki, J. Kobayashi, H. Nakazawa, E. Mochizuki. Analysis of creatinine, vanilmandelic acid, homovanillic acid and uric acid in urine by micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr B. 1997. V. 693. P. 463-467.

151. H. Siren, M. Mielonen, M. Herlevi. Capillary electrophoresis in the determination of anionic catecholamine metabolites from patients' urine // J. Chromatogr A. 2004. V. 1032. P. 289 297.

152. H. Siren, U. Kaijalainen. Study of catecholamines in patient urine samples by capillary electrophoresis // J. Chromatogr A. 1999. V. 853. P. 527 533

153. A. Garcia, M. Heinanen, L.M.Jimenez, C. Barbas. Direct measurement of homovanillic, vanillylmandelic and 5-hydroxyindoleacetic acids in urine by capillary electrophoresis // J. Chromatogr A. 2000. V. 871. P. 341 350

154. В. Kagedal, D.S. Goldstein. Review. Catecholamines and their metabolites // J. Chromatogr. Biomed. Appl. 1988. V. 429. P. 177 233.

155. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

156. КЭ капиллярный электрофорез

157. КЗЭ капиллярный зонный электрофорез

158. МЭКХ мицеллярная электрокинетическая хроматография1. МС масс-спектрометрия

159. ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография1. ГХ газовая хроматография

160. ЭИА электроинжекционный анализ

161. ЭОМА электрофоретически опосредованный метод анализа

162. ЭОП электроосмотический поток1. КА катехоламины

163. ДДСН додецил сульфат натрия1. NA норадреналин1. Glu глутаминовая кислота

164. ДОФА 3,4-дигидроксифенилаланин

165. ВМА ванилинминдальная кислота

166. ГВА гомованилиновая кислота

167. ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

168. ШВА гидроксиизомасляная кислота

169. АПАВ анионное поверхностно-активное вещество

170. ЦДТА циклогексан-1,2-диаминтетрауксусная кислота

171. ТТАВ тетрадецилтриметиламмоний бромид1. С катехин1. ЕС эпикатехин

172. EGCG эпигаллокатехин галлат1. ПАР пиридилазорезорцин1. КО ксиленоловый оранжевый1. НРС нитрозо-Р-соль1. ПО предел обнаружения