Аналитические возможности лигандообменного капиллярного электрофореза при определении биологически активных веществ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Санкт-Петербургский государственный университет

АЛЕКСЕЕВА АННА ВЛАДИМИРОВНА

АНАЛИТИЧЕСКИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ЛИГАНДООБМЕННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальность 02.00.02 - АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Пстерб\рг 2009

00346820680122

Работа выполнена на кафедре органической химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета и в ЦКГ1 «Аналитическая спектрометрия» Санкт-Петербургского государственного университета.

ПаучпыП руководитель:

Доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Даванков Вадим Алексаатровнч

Доктор химических наук, профессор Родинков Олег Васильевич

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова

Защита состоится 19 ноября 2009 г., в 17.00 ч.

На заседании совета Д 212.232.37 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург. Средний проспект В.О., д. 41/43. Большая химическая аудитория.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Санкт-Петербургского государственного у н ивсрситета.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность. Основными проблемами электрофоретического определения многих биологически активных соединений являются отсутствие в их молекулах хромофорных групп (сахара алифатические аминокислоты и амины), низкие значения констант диссоциации (сахара), недостаточная стабильность в процессе анализа (аскорбиновая кислота, полифенолы, катехол амины).

Использование процессов комплексообразования с органическими агентами (краун-эфирами, цикламами, циклодекстринами, ПАВ) и ионами переходных металлов (Cu2+, Fe3+ и др.), введенными в матрицу пробы, состав рабочего электролита или подвижную фазу, позволяет расширить аналитические возможности методов разделения. Перспективными в этом направлении могли бы оказаться электрофоретические методы, основанные па лигандном обмене, ближайшим аналогом которых является лигандообменная хроматография. При этом высокая эффективность метода КЭ и возможность on-line концентрирования могут обеспечить заметное снижение времени анализа и пределов обнаружения аналитов.

Данная работа посвящена выявлению возможностей лигандообменного капиллярного электрофореза (ЛОКЭ) при определении биологически активных соединений (аминокислот, биогенных аминов, сахарин и полифеполов) в объектах растительного происхождения, фармацевтических препаратах и биологических жидкостях человека. Имеющиеся зарубежные работы в этой области ориентированы, в основном, на хиралыюе разделение. Однако использование принципа лигандного обмена в капиллярном элекгрофорезе может способствовать решению и других задач: обнаружение не поглощающих в УФ-области соединений без проведения стадии дериватизации; снижение пределов детектирования поглощающих аналитов; изменение эффективности и селективности разделения.

Работа поддержана грантами РФФИ №07-03-01001 -а, «Ползуновскими грантами», «У.М.Н.И.К.» (С.-Петербург, Россия).

Цель работы: выявление возможностей лигандообменного капиллярного электрофореза при определении биологически активных соединений (Сахаров, аминокислот, аминов, природных антиоксидантов и т.д.) и установление критериев при выборе систем лигандного обмена.

В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

1. Установить факторы, влияющие на образование комплекса «.металл - органический лиганд» в условиях лиганднообменного капиллярного электрофореза

2. Количественно оценить обсуждаемые процессы комплексообразования для подтверждения выявленных закономерностей

3. Выявить пути снижения пределов обнаружения апатитов в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза, включая on-line концентрирование

4. Выяснить возможность одновременного определения органических биологически активных соединений (результат лигандного обмена) и неорганических ионов (косвенное детектирование)

5. Получить сравнительные оценочные характеристики метода лигандообменного капиллярного электрофореза с лигандообменной хроматографией

Научная новизна

Предложены критерии выбора систем для реализации режима лигандного обмена в капиллярном электрофорезе (природа металла-комплексообразователя и лиганда, рН рабочего электролита) в зависимости от характеристик определяемых аналитов (констант диссоциации р/("а, значений изоэлектрических точек р/, способности к хелатированию, наличия или отсутствия хромофорных фрагментов, а также функциональных групп, склонных к окислению).

Установлено влияние рН рабочего электролита на интенсивность аналитического сигнала аминокислот и показано, что максимальная интенсивность наблюдается при рН, близком к значению р/ аминокислот. Полученные закономерности подтверждены рассчитанными константами связывания (Кса)\ наибольшие значения Кса комплексов ((аминокислота - Си(П)» наблюдаются при рН = р/.

Показана перспективность использования on-line концентрирования в режиме ЛОКЭ. Наибольших факторов концентрирования удалось достичь в случае аминокислот при использовании динамического рН-скачка, основанного на различии в значениях рН зоны пробы и рабочего электролита. Пределы обнаружения аминокислот снижены в 20 - 30 раз и составили 0.5 - 1,0 мг/л.

На примере диализирующего раствора и сыворотки крови человека продемонстрирована возможность одновременного определения Сахаров (прямое УФ-детектирование в форме комплексов с Cu(II)) и неорганических катионов Na\ К+ (косвенное УФ-детектирование) в режиме лигандообменного капиллярного электрофореза.

Установлено, что возможность обнаружения Сахаров, алифатических аминов и аминокислот в условиях лигандного обмена в существенной степени определяется хелатным эффектом, а для образования комплекса «сахар - Cu(II)» необходимым условием также является циклическая форма молекулы сахара.

На примере цистеина и глутатиона показано, что аминокислоты и пептиды, молекулы которых содержат легкоокисляющиеся SH-группы, в условиях ЛОКЭ детектируются в форме комплексов их продуктов окисления с катионами Си2+.

Электрофоретическими и спектрофотометрическими методами установлено взаимодействие катехинов с белком молока - казеином, в отличие от другого биополимера ДНК, где радиопротекторное действие катехинов не сопровождается образованием комплекса

с макромолекулой.

Установлены факторы, влияющие на стабильность аскорбиновой кислоты в процессе се электрофоретического определения (рН элюента'рабочего электролита, присутствие катионов различных металлов (Са2+, Zn2\ Al3\ Co2t, Ni2', Cu*+, Fe"), органического растворителя (ацетонитрила, метанола). Показано, что максимальный стабилизирующий эффект оказывает снижение рН.

Практическая значимость работы

Предложен электрофоретический способ определения Сахаров, основанный на лигандном обмене, в пищевых продуктах (соках, винах, меде и т.д.), а также одновременного определения глюкозы и неорганических катионов (Na+, К+) в фармацевтических препаратах (раствор глюкозы для инъекций, диализирующий раствор для больных с почечной недостаточностью) и биологических жидкостях человека (сыворотка крови). Пределы обнаружения глюкозы, фруктозы, сахарозы, Na+ и К+ составили 21, 8. 183,27 и 35 мг/л, соответственно.

Предложен способ, исключающий стадию пробоподготовки, хроматографического (ВЭТСХ) определения кофеина (минорного компонента) в чае с использованием селективного взаимодействия катехинов с катионами Fe,+. Предел обнаружения кофеина составил 100 нг.

Выявлены факторы, определяющие устойчивость аскорбиновой кислоты в процессе элсктрофорегического анализа, и предложен вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью для ее определения. Предел обнаружения составил 80 мкг/л.

Положения, выносимые на защиту

1. Закономерности выбора систем для лигандообменного капиллярного электрофореза при обнаружении алифатических аминокислот, аминов и диаминов, Сахаров ионогенной (гепарин) и неионогенной (сахароза, глюкоза, фруктоза) природы.

2. Возможности снижения пределов обнаружения биологически активных соединений в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза, включая on-line концентрирование.

3. Количественная оценка процессов комплексообразования определяемых биологически активных соединений (аминов, аминокислот и Сахаров) с катионами металлов Си2+.

4. Возможности хиралыюго лигандообменного капиллярного электрофореза при разделения энантиомеров аминокислот в выбранных условиях.

5. Сравнительные оценочные характеристики лигандообменного капиллярного электрофореза, капиллярного зонного электрофореза с косвенным УФ-детектированием и лигаидообменной хроматографии.

6. Использование полученных закономерностей при решении практических задач:

определение Сахаров в напитках, фармацевтических препаратах и биологических жидкостях методом ЛОКЭ;

определение кофеина в различных образцах чая методом ВЭТСХ; определение аскорбиновой кислоты в напитках методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью.

Публикации и апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в 5 статьях и 25 тезисах докладов. Результаты исследований докладывались на Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии" (2002, Москва. Россия); international conference "Analytical chemistry and chemical analysis" (2005, Kiev, Ukraine); 29th International Symposium on Capillary Chromatography (2006, Riva del Garda, Italy); International congress on Analytical Sciences (2006, Moskow, Russia); Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии" (2007, Москва, Россия); XXXI Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds" (2007, Katowice-Szczyrk, Poland); XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (2007, Москва, Россия); II Всероссийской Конференции «Аналитика России» с международным участием (2007, Краснодар, Россия); научно-прикладном семинаре «Аналитические методы и приборы для химического анализа» (2007, С.Петербург, Россия); 3rd Internat. Symposium on Recent Advances in Food Analysis (2007, Prague, Czech Respublic); Всероссийской конференции "Химический анализ" (2008. Москва, Россия); Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хромато-масс-спектрометрия" (2008. Москва, Россия); Зй Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (2008, С.-Петербург, Россия); XIV симпозиуме по межмолекуляркому взаимодействию и конформациям молекул (2008, Челябинск, Россия); II Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (2008, Воронеж, Россия); 9th European Meeting on Enviromental Chemistry (2008, Girona, Spain); Международная конференция по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века» (2009, Санкт-Петербург, Россия), 34th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques (2009, Dresden, Germany); VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2009» (2009, Йошкар-Ола, Россия); Всероссийской конференции с международным с участием «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (2009, Самара, Россия); III Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (2009, Краснодар, Россия).

Структура и объем работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, 3 глав с обсуждением полученных результатов, приложения, списка принятых сокращений, выводов, списка цитируемой литературы (175 наименований). Работа изложена на 211 страницах машинописного текста, содержит 106 рисунков, 3 схемы и 35 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во Введении дано обоснование актуальности темы и сформулирована цель исследования. Отмечена перспективность использования процессов комплексообразования при определении биологически активных соединений (Сахаров, аминов, гидрокси- и аминокислот, природных антиоксидантов) в реальных объектах (пищевых продуктах, фармацевтических препаратах и биологических жидкостях) электрофоретическими методами.

1 -я глава (Обзор литературных данных) включает разделы, обсуждающие основы лигандного обмена в хроматографии и капиллярном электрофорезе (КЭ), возможности использования процессов комплексообразования при электрофоретическом и

хромагофафическом определении биологически активных соединений и физико-химические методы их определения.

Во 2-й главе рассматриваются общие характеристики объектов и методов исследования (капиллярный зонный электрофорез, мицеллярная электрокинетическая хроматографии с нормальной и обращенной полярностью, высокоэффективная тонкослойная хроматография с денситометрическим УФ-детектироваиием, спектрофотомерия).

В 3-й главе обсуждаются возможности использования лигандообменного капиллярного электрофореза при определении не поглощающих в УФ-области соединений (в первую очередь, аминов, аминокислот и Сахаров) и принципы выбора соответствующих разделяющих систем.

Основной проблемой при электрофоретическом и хроматографическом определении с УФ-детектированием указанных аналитов является отсутствие в их молекулах хромофорных групп. Проведение стадии дериватизации позволяет в большинстве случае решить данную задачу, однако обладает и рядом существенных недостатков: невозможность контроля полноты протекания реакции; получение реакционной смеси сложного состава (смесь стсреоизомсров производных Сахаров); длительность и трудоемкость.

Перспективным решением этой проблемы мог бы оказаться вариант прямого УФ-дстсктирования с использованием принципов лигандного обмена - лигаидообменный капиллярный электрофорез: разделение основано на образовании лабильных комплексов между молекулами аналитов и металлом-комплексообразователем, отличающихся электрофоретическими подвижностями.

| МеЬ||п1 + аАа" ^ (Си1.|^Ла]" а + а!.1\где Мел; -металч-комплексообра'юватель, ].'" -лиганд. Аа'-амштит

Схема ликвидного обмена

При выборе систем лигандного обмена необходимо было выяснить влияние факторов, обеспечивающих результативность такого подхода (табл. 1). Выбор аналитов обусловлен как их диагностической важностью, так и наличием в их молекулах функциональных групп (-ОН, -1МН; и -СООН-фупп), способных к комплексообразованню с катионами металлов.

Таблица 1. Факторы, влияющие на возможность реализации лигандного обмена в

Природа металла-комплексообраэователя Cir\ Ni2*, CoJ\ Cai', Zrr , Fe", Al3'

Природа прогивоиона SOr, Cf, ClhCOO'

Природа аиалита - природа функциональной группы (NHr, OH-, -COO'), включая значение рАа (pAb) или р/; - способность к хелатированшо (дентантность, размер образующегося цикла); - склонность к окислению (полифенолы, аскорбиновая кислота)

рН рабочего электролита рН = f (рА'а) или рН = (р/)

Влияние органического растворителя - на эффективность и селективность разделения; - на устойчивость (полифенолы, аскорбиновая кислота)

При определении глицина - простейшей аминокислоты, не поглощающей в УФ-свете, в качестве рабочего электролита был выбран аммонийно-ацетатный буфер с рН 6.0, соответствующим значению изоэлектрической точки глицина. Меньшие значения рН переводят его в катионную форму, что неблагоприятно для образования комплекса с ионами Си"*, а большие - вызывают гидролиз по ионам металла. Добавление в рабочий электролит | СийСи позволяет обнаружить аналитический сигнал глицина. При этом использование солей \Г*, Со2*, Ре'*, А13*, Са"*, ¿п2 к соответствующим результатам не привело.

Рис. 1. Электрофоре граммы глицина (1) в режиме КЗЭ (а) и ЛОКЭ (б) |

Условия: прибор: «Клпсль-105». капилляр" I !. 1:;:;:/!-- 50/60 см, 1.0. - 50 мкм; напряжение ^-25 кВ: ввод пробы 30 мбар, 10 с : \ детектирование 200 нм; рабочий электролит: (а) 10 мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 6.0). (б) 1мМ СиьО,. 10 мМ аммонкйко-ацстаитый буфер (рН 6.0)

При выяснении роли противоиона показано, что замена в рабочем электролите сульфата меди(П) на ацетат не влияет на интенсивность аналитического сигнала, а введение хлорид-ионов подавляет его полностью, что может быть связано с протеканием конкурирующих процессов комплексообразования между ионами Си" и СТ.

Аналогичные закономерности наблюдались и для других не поглощаюших в УФ-свете алифатических аминокислот и аминов (рис.2).

Для аминокислот и пептидов, содержащих легкоокисляющиеся тиольные группы (-БН), аналитический сигнал на электрофореграмме соответствует комплексу продуктов их окисления с катионами Си"* (рис. 3). На рис.4 представлены электрофореграммы восстановленного и окисленного глугатиона: аналитические сигналы соответствуют друг

Рис. 2. Электрофореграммы путресцина (а) и смеси аминокислот (б) в ЛОКЭ Условия: ем. рис. 1. рабочий электролит. 1мМ f uSO.. 10 мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 6.0)

длина волны" 230 нм ,

Проба: (а) путресцин. (б) смесь нспотлощающих аминокислот (Gly, Ala, Gin, Lys, Glu) (по 50 мт/л)

другу по площади и времени миграции. ' (а) (б)

Аа.,

I"1 ;

"wf .....

î ) Á > 6 7 so 5 6 7 8 9 10 11 12 13

1 -путресцин / - Gly. 2 - Ala. 3 - Gin. 4 - Lys.5 - Glu

Цмстемн (Су»)

Восстановленный глутатион (GSH)

кк

-Та

У

кь

ьг

i

Эгек-рофореграммз GSH

Электрофорефамм« GSSG

Цистмн (Cys-Cys)

^ Рис.4. Окисление аминокислот, содержащих SH-

W

Омклеямый туптмм* (GSSG)

группу, в процессе электрофоретического определения в режиме ЛСЖЭ Условия: см. рис.2.

Рис.3. Схема окисления цистеина и глутатиона в присутствии катионов Си"+

Значение рН рабочего электролита - один из доминирующих факторов. Нами было высказано предположение и затем экспериментально подтверждено, что интенсивность аналитического сигнала должна быть максимальной при значении рН рабочего электролита, близком к изоэлектрической точке (рис. 5). Модельная система содержала кислоты, отличающиеся количеством амин о- и карбоксильных групп: глицин (С/>), глутаминовая кислота (С1п) и лизин (¿}у). Пределы обнаружения глицина (р/ ~ 6.0) при рН 4.0, 6.0, 9.2 составили 50, 7 и 23 мг/л, соответственно. В этих же условиях происходит и максимальное связывание аминокислот в комплекс с катионами меди (табл. 2).

H2N—сн-с— I

н

С/у

HjN—СН-С—ОН

I

(Сн2)г

07«

H,N—СН-С-

I

(СН2)„

nh2

Lys

Рис. 5. Влияние рН рабочего электролита на интенсивность поглощения глицина, глутаминовой кислоты и лизина Условия: см. рис. 1.

рабочие электролиты: 1 мМ раствор Си$0.|. 10 мМ раствор ацетата аммония (рН 4.0, 5.0, 6.0. 7.0); боратный буфер (рН 8.0, 9.2)

Таблица 2. Константы связывания комплексов аминокислот с Си(П) при различных значениях

pi 1 рабочего элекп эолита

Аминокислота Р> А"с„ л-моль"'

Рабочий электролит № 1 Рабочий электролит №2 Рабочий электролит №3

Ch- 6.0 145 1330 655

ain 3.2 875 740 195

Lvs 9.2 90 765 1235

Рабочий -электролит№1: I мМ СиЯ04 в 10 мМ аммоиийно-ацетатном буфере с рН 4.0 Рабочий электролит№2: 1 мМСи504в 10 мМ аммонийно-ацетатном буфересрН 7.0 Рабочий -электролит №3: 1 мМ Си50< в 10 мМ боратиом буфере с рН 9.2

Расчет констант связывания (Кса) проводили по формуле-=-i--!_ +_!_,

Р~Р, (Рс-Р,Ж[Щ Мс - Pf

где /// - экспериментально измеренная электрофоретическая подвижность аналита, pf и рс -электрофоретические подвижности свободной и связанной форм, соответственно, см2/кВс.

При рН » р/ собственные электрофоретические подвижности (рс0бета) аналитов могут превысить скорость ЭОП и не достигнуть зоны детектирования. Этот эффект проявляется тем сильнее, чем меньше значение рКл аналита. Так, показано, что при рН > 10 не удается зафиксировать тирозин и глутаминовую кислоту (табл. 3), но уже при рН 7.0: тирозин элюируется в форме катиона, а глутаминовая кислота - является «медленным» анионом , достигая окна детектирования (табл.3). Еще в большей степени этот эффект выражен в случае лимонной кислоты, которая в условиях электрофоретического анализа при рН 7.0, является трехзарядным ионом.

Таблица 3. Электрофоретические подвижности тирозина, глутаминовой и лимонной кислот

при рН рабочего электролита 7.0 и 10.0

Лсобст. СМ*/кВ'С

Аминокислота Р К,ш рН 7.0 рН 10.0

nmpowH 2.20, 10.46 +0,080 -0,023

гл упиишноаая кислота 2.10, 4.07 -0,015 не удалось обнаружить ¡/'собст! > И 'ЮН

лимонная кислота 3.06, 4.77 6.40 не удалось обнаружить lAcoócrl > !' 'Ю1! не удалось обнаружить I/W-,' >/' x>:i

©

Роль рН оказалась определяющей и при ^ использовании в условиях ЛОКЭ on-line "

концентрирования {динамический рН-скачок), ^__^ ,_^

основанного на различии электрофоретических ®s.;, i_flPo с3=__!__!_{ ]®

подвижностей аналита в зоне пробы и в рабочем

электролите, отличающихся значениями рН (рис.6). Рис.6. Схема данамкчсскто рН-скачка

При рН пробы > рН рабочего электролита наибольшие факторы концентрирования получены для двухосновной глутаминовой кислоты: в этих условиях она обладает максимальной подвижностью по сравнению с другими аминокислотами (табл.4). При рН пробы < рН рабочего электролита максимальное концентрирование достигается для диаминокислоты - лизина; протонирование двух аминогрупп в кислой среде увеличивает подвижность лизина в большей степени, чем остальных аминокислот (табл.4).

Показано, что другим важным фактором для обнаружения аналитов в условиях ЛО является возможность образования устойчивого хслата. Для этого необходимо наличие бидентантного лиганда и образование 5-ти или 6-тичленного цикла, что проиллюстрировано на рис.7: монодентантный амин аналитического сигнала не дает; на электрофореграмме не обнаружен и аналитический сигнал нейротрансмиттерной гамма-аминокислоты, которая, в отличие от альфа-аминокислот, не способна образовывать 5-тичленный цикл.

10

Вариант концентрирования Определяемые компоненты

С/у | Ala | Gin | l.ys | Gin

SEF

3.0 ±0.5 | 2.4 ±0.4 | 7,2 ±0,8 I 2,0 ±0,4 | 2,2 ±0,4

Электростзкинг с «волной пробкой» Условия: матрица пробы ~ рабочий электролит, концентрация анатитов 50 м! 'л. Гидродинамический ввод воды (30 мбар, 5 с). члектрокииетический ввод пробы (20 кН. 2 с)

ПО. ли/л

5 1 5 | 10 | 7 | 10

SEF

20 ± 1 | 19± 1 | 33 ± 2 | 19±1 | 21 ± 1

Электроетэкинг с динамическим Условия: матрица пробы - я 100 мМ растворе аммиака, концентрация аналитов 50

рН-скачком МГ/Л.

рН пробы > 7 'Электрокинетический ввод пробы (20 кВ. 2 с)

ПО, мг/л

1.0 | 1,0 | 1.5 | 1.0 | 1,0

SEF

12± 1 | 12±1 | 11 ± 1 1 29 ± 1 | 21±1

Электростэкинг с динамическим Условия: матрица пробы - в ИХ) мМ растворе уксусной кислоты, концентрация

рН-скачко.м аналитов 50 мг/л.

рН пробы < 7 Злек-трокинетический ввод пробы (20 кВ. 2 с)

ПО, MZL1

1,5 | 1,0 | 0.5 | 0,5 | 3,5

„З/Х.б, ">• <а> путресции

, Х- ' \ 1-аминобутан

(а)

Д,(Tip,Туг) = 0.7

(б)

ЙДТф/Туг) = 1.9

Рнс.7. Электрофореграммы путресципа (а) и моноамина (б), а-аминокислоты (в) и у-аминомасляной кислоты (г) в условиях ЛОКЭ Условия: см.рис.1.

рабочий электролит: 1мМ Си50^. 10 мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 6.0). длина волны: 230 нм

Важным результатом использования принципа лигандного обмена в Ю явилось снижение в 2-3 раза пределов обнаружения поглощающих в УФ-области соединений и увеличение факторов их разрешения по сравнению с традиционным КЗЭ (рис.8).

Рис.8. Снижение пределов обнаружения поглощающих аминокислот в ЛОКЭ Рабочий электролит: ЮмМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 6.0) без (а) и с добавкой 1мМ С^Од (б)

Тф Туг Hist

о" С (а) 3,0 5,5 10

(б) 1.3 2.5 3

/ гнетами}! (Hisl). 2 трипта^шч iTrpj. J тиразин (Туг)

Основным отличием электрофоретических методов разделения от хромагогрфических является отсутствие стационарной фазы, и, как следствие, меньшая селективность разделения. Роль второй фазы существенно возрастает при разделении энантиомеров. Рассмотрим эту ситуацию на примере D.L-пролина (Pro) и нейротрасмиттерных аминокислот Д£-тирозина

(Туг) и Д1-3,4-дигидроксифенилатанина (ДОФА). В качестве хирального селектора выбран комплекс, образованный ионами Cu(II) и ¿-Pro, как наиболее часто используемый в лигандообменной хроматографии. Показано, что лучшее разделение энантиомеров наблюдается при соотношении Си2+и ¿-Pro 1:2 при концентрации ионов Си2+ 5 мМ (рис.9, 10).

D-ДОФА

1 - О-Туг 180 мАи 2 - ¿-Туг

1 ! R, = 0.9

1 - Мго

2 - ¿-Рта

,г R. = 0.7

¡1

JL

11 1} 14 15

II 12 11 14

Рис.9. Электрофореграммы модельных растворов Д£-ДОФА, D.L-Jyr, D.L-Pro

Рабочий электролит: 10 мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 6.0), 5 мМ CuSOj. 10 мМ Л-Рго

Рис.10. Зависимость фактора разрешения энантиомеров DX-ДОФА, D.L-Tyv, D.L-Pro от соотношения Cu"7L-Pro в рабочем электролите

Найденный режим проведения ЛОКЭ для аминокислот оказался полезным для углеводов ионогенной природы (рис.11). Однако сахара, имеющие низкие значения констант диссоциации (глюкоза, галактоза, фруктоза, сахароза и др.), в условиях электрофореза не могут быть определены. Необходим перевод их в анионную форму, что могло бы быть достигнуто с использованием процессов комплексообразования.

Известно, что соединения с вицинальными ОН-группами способны образовывать заряженные комплексы с борат-ионами. Использование боратного буфера привело к некоторому росту оптической плотности (рис.12), однако этого оказалось недостаточно для обнаружения аналитического сигнала. Для реатизации режима лигандного обмена к боратному буферу добавили 2 мМ Си304- Однако и этот прием не позволил зафиксировать на электрофореграмме требуемые сигналы.

Проблема была решена при использовании в качестве рабочего электролита медно-аммиачного раствора [Си(ЫНз)4]2+. Молекулы аммиака в данных

Л

CifKl . , . , ,

0 2 4 ft 8 10 12 14 16 IS 20 22 24 U 2ft 30 32 чин

Рис.П. Элсктрофореграмма гепарина Рабочий электролит. I мМ CuS04. 10 мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 4,0); 2^5 нм

,.....Ггккоза в 50 мМ

боратном буфере

Рис.12. Изменение спектральных характеристик глюкозы в присутствии борат-ионов

условиях не только выполняют роль лиганда, но обеспечивают требуемую разность поглощения рабочего электролита и пробы и перевод Сахаров в анионную форму (рис.13).

Для выяснения влияния природы лиганда в рабочий электролит (2 мМ Си*". 250 мМ МН;) в качестве конкурирующей добавки ввели аланин, комплексообразование которого с ионами меди было изучено ранее. Сокращение времени анализа за счет роста скорости ЭОП и снижение интенсивности аналитического сигнала (рис. 14) свидетельствует о протекании конкурирующих процессов с участием аланина. Уменьшение чувствительности детектирования подтвердило предпочтительность предыдущей медно-аммиачной системы.

Рис. 13. .Ш-Элсктрофорсграмма глюкозы в условиях ЛОКЭ

Прибор «Agilent»; детектирование; 200-600 нм; рабочий электролит; 2мМ Си"". 250мМ NH?:

С(А1а]. мМ

Рис.14. Зависимость

электрофоретической подвижности (¡и) и площади пика (S) глюкозы от концентрации аланина в рабочем электролите,

содержащем 2 мМ Си"*. 250 мМ NH,

I- fi-jorb !!„,-,Щ. 3 - /(,,„;,„,„

При разделении структурных изомеров (глюкозы и фруктозы) изучено влияние концентраций аммиака и ионов Си " в рабочем электролите на их разрешение. Выбрана концентрация аммиака 175 мМ, а ионов Си2+ - 1 мМ (рис.15): большие значения приводят к резкому увеличению времени анализа, меньшие - к уменьшению чувствительности детектирования (рис.16). В выбранных условиях оказалось возможным и определение дисахарида - сахарозы (рис. 17).

Рис.15. Зависимости разрешения (Rs) глюкозы и фруктозы от

Рис.16. Изменение интенсивности

концентрации ионов Си" (а) и аммиака (6) в рабочем сигнала гаюкозы от концентрации

электролите ионов Си" в рабочем электролите

рабочий электролит: (1) 0,5 - 3.0 мМ Си2*, 250 мМ NH3; рабочий электролит: 0,5 - 3,0 мМ Си2",

(2) 1 мМ Си2", 150 - 300 мМ NH3; 30 мбар, 10 с ; 25 кВ; 245 нм 250 мМ 30 мбаР> 10 с ' 25 кВ: 245 ™

15 тли

J

J

¡3

L ^JiL^

ni о

12 3 4 5 6 ? К 9 10 И 12 13 Uhh

При установлении состава комплексов «сахар - Си(//)л выявлены следующие закономерности. Электрофорстические

подвижности и площади аналитических сигналов Сахаров в смеси соответствуют индивидуальным соединениям, что свидетельствует об отсутствии смешанных комплексов, т.е. стехеометрия образующегося комплекса -1:1. Для выяснения какая из форм моносахарида, линейная или циклическая, образует комплекс с ионами Си2+, проведены электрофоретпческие эксперименты с линейными аналогами глюкозы: восстановленной (сорбитом) и окисленной (глюконовой кислотой) формами. На JD-электрофореграмме не наблюдалось соответствующих сигналов, т.е. необходимым условием для образования комплекса с ионами меди(Н) является циклическая форма молекулы сахара. Предложены следующие структуры комплексов. Хелатообразованис происходит по ОН-группам 1-го и 2-го атомов углерода глюкозы и 2-го и 3-го - в случае фруктозы.

Рис. 17. Электрофорсграмма смеси Сахаров Условия: см. рис.1

Рабочий электролит: (а) 1 мМ CuSOj, 175 мМ Nth: детектирование 245 нм

-он

CHjOH

CHjOH /}-сорби гол

Л-пнжоновая

шелл □

Ко.чн ¡t'n «О-глюкош -( V

Ком/пеке • П-фрукгтуш -Си'

Наряду с успешным разделением структурных и оптических изомеров, разделить эпимеры - глюкозу и галактозу - в условиях ЛОКЭ не удалось, в отличие от КЗЭ, где такое комплексообразование отсутствует (рис.18). Сахара не поглощают в УФ-свете, поэтому был использован косвенный режим детектирования: в рабочий электролит ввели триптофан в качестве поглощающего маркера (рис.186). Поскольку молекулы галактозы и глюкозы отличаются лишь расположением ОН-группы при 4-м атоме углерода, это является независимым подтверждением того. что но-'

н

образование комплекса с ионами Си*+ проходит с участием ОН-групп при 1-м и 2-м углеродных атомах.

а-О-глкжопираноча

«-/Э-галактопираж»а

(б)

V

1 2 34

7 Я « 10 11 12. 13

12 13 1*И1

Рис. 18. Электрофореграммы смеси сахарозы, глюкозы, галактозы и глюкозы в ЛОКЭ с прямым (а) и КЗЭ с косвенным УФ-детектированием (б) Условия: см.рис.3.2 Рабочий электролит: (а) 1 мМ СиЗОд. 175 мМ МНь детектирование 245 нм (б) 5мМ триптофана, 50 мМ ХаОН; детектирование 280 нм

^ Ж

он 0

Эиикатсхин Аскорбинова я кислота

4-я глава посвящена выявлению возможностей процессов комплексообразования полифенолов и аскорбиновой кислоты с катионами металлов и органическими лигандами

Установленные закономерности по обнаружению аминов, аминокислот и Сахаров методом ЛОКЭ определили и наше решение относительно постановки аналогичной задачи для полифенолов и аскорбиновой кислоты - сильнейших природных антиоксидантов. Эти соединения, как и аминокислоты, являются ионогенными; в их молекулах, как и в случае Сахаров, содержатся вицинальные ОН-группы, способные к комплексообразованию; но при этом они поглощают в УФ-области.

В отличие от предыдущих экспериментов, где детально изучено поведение индивидуальных аналитов, электрофоре!ическому анализу подвергли реальный объект -зеленый чай, основными компонентами которого являются катехины (соединения полифенольного типа), а также аскорбиновая кислота, теанин (не поглощающая в УФ-области аминокислота) и алкалоид кофеин, который, вероятно, не должен образовывать комплексы с катионами металлов.

Показано, что в условиях лигандного обмена (рабочий электролит: 10 мМ боратный буфер (рН 8.0), 5 мМ (!-циклодекстрнна, 1 м.М СиЗО.;) зафиксировать аскорбиновую кислоту и полифенолы не удается (рис.19). Однако при этом на электрофореграмме появляется сигнал теанина (рис. 196), который без использования режима лигандного обмена не обнаруживается (рис. 19а). Невозможность их определения в выбранных условиях могла быть связана с высокими значениями рН или присутствием катионов Си2+ в рабочем электролите. Поэтому эти факторы были изучены более детально.

Рис.19. Электрофореграммы водного экстракта зеленого чая в КЗЭ (а) и ЛОКЭ (б) ¿"■Условия: см рис. 1. Рабочий электролит: (а) 10 мМ боратный буфер (рН 8.0), 5 мМ р-циклодскстрина, (б) 10 мМ боратный буфер (рН 8.0), 5 мМ циклодскстрина, 1 мМ СиЯ04

ж

1 - неидеитифицированный компонент, 2 — ЭК, 3 — ЭГК, 4 - ЭКГ, ЭГКГ, 5 - аскорбиновая кислота, 6 -теанин

Показано, что при уменьшении рН от 10 до 2 интенсивности аналитических сигналов катехинов и аскорбиновой кислоты заметно возрастают. В пробе аскорбиновой кислоты, содержащей ионы меди, обнаружено присутствие продукта ее полного окисления - щавелевой кислоты (рис.20).

Рис.20. Электрофоре грамма молельного раствора, содержащего аскорбиновую кислоту Си804 Рабочий электролит: 1 % уксусная кислота. 30 мМ ТЗА; ввод пробы: 30 мбар. 10 с: напряжение: -20 кВ: 200 нм: проба: 0.5 мМ аскорбиновая кислота и 0.5 мМ Си(И) в 5 мМ орт офосфорной кислоте и 5 % ацетонитриле / щавелевая кислота

Отношение молярных концентраций Ме/ЭГКГ

Рис.21.

Изменение

эпигаллокатехин галлата в зависимости от концентрации Fe'+, AIJ+ и Cu"' в пробе

I

В случае катехинов влияние рН оказалось менее существенным, чем присутствие ионов металла. При введении солей Fe(lll), Al(il), Cu(Il) в пробу наблюдается их заметное расходование (рис.21), что было проиллюстрировано для примере основного полифенола зеленого чая - эпигаллокатехин галлата (ЭГКГ) и реальных объектах (рис.22).

Рис.22. Электрофореграммы зеленого чая без добавок солей металлов (а), с добавкой CuSO^ (б), Ab(S04)3 (в), Fe2(S04).i (г)

Рабочий электролит: 25мМ фосфатный буфер; рН 7.0; 25 мМ ДДСН: 25 кВ; 200 нм 1 кофеин. 2 ЭГК, 3 - ЭГКГ. 4 ЭК, 5 ЭКГ

1

, ее

ЭКГ

6 7 8 9

5-я

глава посвящена оосуждению достоинств

ограничении метода лигандообменного капиллярного электрофореза и его практическому применению

В работе изучены подходы к выбору систем лигандного обмена и аналитические возможности метода ЛОКЭ при определении аминокислот, аминов, Сахаров, полифенолов. Значение рН рабочего электролита является существенным фактором, определяющим стабильность образующегося в режиме on-line комплекса «аналит -металл» и интенсивность аналитического сигнала. Пределы обнаружения триптофана, тирозина, гистамина в ЛОКЭ

16

были снижены в 2 - 3 раза по сравнению с традиционным вариантом капиллярного зонного электрофореза и оказались равны 1 - 3 мг/л. Пределы обнаружения не поглощающих в УФ-области аминокислот, аминов и Сахаров составили 10 - 20 мг/л (исключение: для сахарозы ПО - 183 мг/л, а использование динамического рН-скачка позволило снизить их в 10 - 30 раз. Линейный диапазон в ЛОКЭ составил 103.

Показано, что лигандообменный капиллярный электрофорез превосходит зонный вариант с косвенным детектированием и лигандообменную хроматографию по эффективности (табл.5), что позволяет скомпенсировать недостаточную селективность разделения по сравнению с хроматографическими методами.

Таблица.5. Сравнительные характеристики методов КЗЭ и ЛОКЭ для определения Сахаров

Метод КЗЭ с косвенным УФ-детектированием ЛОКЭ с прямым УФ-детектированисм

Условия рабочий электролит: 50 мМ .\'аОН, 5мМ триптофана; 280 нм рабочий электролит: I мМ Си"*, 175 мМ 1МН3;245 нм

Эффективность (М) 2 104 3105

Время анализа, мин 20 10

ПО, мг/л фруктоза, глюкоза, сахароза-40 фруктоза - 8, гл юкоза - 21, сахароза - 183

Линейный диапазон 10' Ю1

При сравнении метода ЛОКЭ с лигандоообменной хроматографией отметим также, что наличие сорбента в последнем случае ограничивает выбор элюирующих систем по значениям рН. В случае ЛОКЭ может возникать другая трудность - сорбция катионов металла (или положительно заряженного комплекса) на стенках отрицательно заряженного кварцевого капилляра, что может привести к потере эффективности. Однако присутствие в рабочем электролите лиганда, способного взаимодействовать с катионами металла, предотвращает сорбцию последнего. Нами показано, что при определении Сахаров методом ЛОКЭ (рабочий электролит: I мМ Си50.|, 175 мМ ,\Н.О нет необходимости «отмывать» капилляр.

Закономерности, обнаруженные при выборе систем и апатитов в условиях ЛОКЭ позволили решить ряд практических задач.

Рассчитаны пределы обнаружения глюкозы, фруктозы и сахарозы (21, 8, 183 мг/л, соответственно) и проведен количественный анализ реальных объектов: соков, нектаров, вин, меда методом ЛОКЭ (рис.23).

т

Ж-

Рис.23. Электрофореграммы красного полусухого вина (а), цветочного меда (б) и грейпфрутового сока (в)

рабочий электролит: 1 мМ СиБОд, 175 мМ N11}; 25 кВ; 30 мбар, 10 с; 245 нм

1 - системный пик, 2 - неидентифицированные компоненты, 3 - ЭОП, 4 - сахароза, 5 - глюкоза, 6 - фруктоза

Дчя проверки правильности полученных результатов использовали метод «введено-найдено» (табл.6). Результаты определения

Таблнца.6. Оценка правильности

глюкозы, фруктозы и сахарозы методами электрофоретического определения Сахаров

мрттпм <.итенп — няй прнп» (Р = П п =

ЛОКЭ с прямым и КЗЭ с косвенным УФ-детектированием, выбранным в качестве референтного, находятся в хорошем соответствии (табл.7).

Аналит Введено, мг/л Найдено, мг/л

Глюкоза 30 ± 1.2 30.2 ± 3,4

300 ± 12 297 ±9

Фруктоза 25 ± 1 22.6 ± 4.2

200 ±8 203.5 ± 1,6

Сахароза 500 ± 20 513 ± 33

1000 ±40 999 ± 39

Таблица 7. Результаты количественного анализа вишневого сока, полученные в ЛОКЭ с прямым и КЗЭ с косвенным УФ-детектироваписм (Р - 0,95, п - 3)

Метод Концентрация, г/л

Глюкоза Фруктоза Сахароза

ЛОЮ-УФ 48,1 ± 1.9 48,9 ± 1.8 35,0 ± 2,2

КЗЭ-УФ (косвенное) 47,7 ± 2,0 48,5 ± 2,0 35.6 ±2,5

Важным результате!

использования принципа лигандного обмена явилась возможность одновременного определения

Сахаров, в форме поглощающих комплексов с ионами меди (прямое УФ-детектировапие), и неорганических катионов (косвенное УФ-детектирование) (рис.24). Пределы обнаружения N8* и К4 составили 27 и 35 мг/л, соответственно. Определение анионов (СГ, 504*", N03") в данных условиях невозможно из-за высокой собственной элсктрофоретической подвижности: они не достигают зоны детектирования. Практическим приложением послужило определение глюкозы в диализате, а также в сыворотке крови больного почечной недостаточностью до и после диализа (рис.24, табл.8).

•и-—Ч^ТИ-

н— 111

Рнс.24. Электрофоретическое определение глюкозы в лекарственном препарате и сыворотке крови Условия: см. рис. 14. Проба: (а) диализат для больных с почечной недостаточностью, разбавленный в 200 раз, (б) сыворотка крови больного до диализа, (в) сыворотка крови больного после диализа I - К'; 2 - На'; J - системный пик; 4 - ЭОП; 5 - глюкоза

Таблица 8. Определение глюкозы и неорганических катионов (На4, К4) в сыворотке крови больных

Концентрация, г/л

глюкоза N3+ К+

норма 0,8-1,2 2,5-4,1 0,6-2,7

до диализа после диачиза до диачиза после диачиза до диачиза после диализа

Образец 1 0,56 ± 0.02 1,02 ± 0,02 3,62 ± 0,07 6,65 ±0,12 0,73 ± 0,02 0,66 ± 0,02

Образец 2 0,32 ± 0,02 0,89 ± 0,02 3,87 ±0,08 4,50 ±0,10 0,82 ± 0,02 0,88 ± 0,03

Изучение влияния рП рабочего электролита на стабильность полифеиолов и аскорбиновой кислоты позволило предложить способы их электрофоретического определения: метод мицеллярной электрокинетической хроматографии с рП рабочего электролита < 7.0 для

18

полифенолов и мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ) с рабочим электролитом с рН 2.0 - для аскорбиновой кислоты (рис.25). Предел обнаружения полифенолов составил 300 - 500 мг/л, аскорбиновой кислоты ~ 80 мкг/л.

ж

!! I

ад *. I 1

Рис.25. Электрофоретическое определение полифенолов (МЭКХ) и аскорбиновой кислоты (ОПМЭКХ)

Рабочий электролит: (а) 20 мМ фосфатного буфера (рН 7.0), 25 мМ додецилсульфата натрия; 25 кВ: 200 им

(б) 33 мМ ацетата натрия, 66 мМ лимонной кислоты, !0 мМ ДДСН (рН - 2,0): -25 кВ; 245 им

Проба: (а) модельная смссь полифенолов, (б) клюквенная наливка, разбавленная в 10 раз рабочим электролитом;

(а) I - эиигаллокатсхин, 2 - эпигаллокатсхин галлат, 3 - эиикатсхин. 4 -галловая кислота, 5-эпикатсхин галлат

(б) 1 - аскорбиновая кислота

Обнаруженный эффект максимального окисления полифенолов в присутствии ионов железа оказался полезным при определении кофеина в зеленом чае в условиях ВЭТСХ. Добавка соли железа(Ш) нивелирует мешающее влияние полифенолов (комплексы металл-полифенол остаются на линии старта); при этом никак не сказываясь на хроматографических характеристиках кофеина, что было проверено в специальных модельных экспериментах (рис.26). Предел обнаружения кофеина составил 100 нг. Показано, что результаты количественного анализа, полученные двумя методами, находятся в хорошем соответствии.

Полученные данные методом ВЭТСХ находятся в хорошем соответствии с результатами электрофоретического (МЭКХ) определения кофеина (табл.9).

Рис.26. Зависимость изменения площади пиков полифенолов и кофеина от мольного соотношения Ре3*/аналит

Рабочий электролит: 25 мМ фосфатный буфер (рН 7,0), 25 мМ ДДСН Концентрация всех аналитов по МО"4 М

Таблица. 9. Результаты определения кофеина в различных сортах чая методом ВЭТСХ (Р = 0.95, п = 3)

Образец чая Содержание кофеина, масс. %

ВЭТСХ МЭКХ

Черный чай листовой «Ришехат» (Дарджилинг, Индия) 1,23 ±0,07 1,21 ±0,07

Зеленый чай листовой «Кольца Джейд» (Китай) 2,7 ± 0,2 2,8 ±0,1

Белый чай листовой «Серебряные иглы» (Китай) 2,7 ± 0,2 2,4 ±0,1

При изучении возможностей ЛОКЭ к легко окисляющимся апатитам, исследованы не только их взаимодействия с катионами тяжелых металлов, но и с органическими соединениями. Совместно с физиками, проведены эксперименты с биополимерами казеином (молочный белок) и ДНК и показано, что в первом случае происходит непосредственное взаимодействие катехинов с макромолекулой, что снижает концентрацию свободных полифенолов в чае при добавлении молока, а в случае ДНК обнаруженное радиозащитное действие катехинов не сопровождается комплексообразованием.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены критерии, обеспечивающие разделение и обнаружение анапитов в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза (природа мет&пла-ком плексообразователя и природа противоиона; характеристики аналита (значение рК„, способность к хелатированию и т.д.); присутствие конкурирующих добавок; рН рабочего электролита, значение которого влияет на электрофоретические характеристики анапитов и возможность образования комплекса с ионами Си"+ (максимальная интенсивность аналитического сигнала и связывание аминокислот с ионами Си*+ наблюдается при рН = р/).

2. Установлено, что использование метода ЛОКЭ позволяет снизить пределы обнаружения поглощающих в УФ-области соединений (триптофан, тирозин, гистамин) по сравнению с традиционным капиллярным зонным электрофорезом в 2-3 раза. При реализации on-line концентрирования (динамического рН-скичка) пределы обнаружения алифатических аминокислот были снижены в 20 - 30 раз и составили 0,5 - 1,0 мг/л.

3. Предложен способ электрофоретического определения Сахаров в форме их комплексов с катионами Си*4 и показано, что необходимым условием является циклическая форма сахара.

4. Разработан способ одновременного определения глюкозы в форме комплексов с Си*1 и неорганических катионов Na+, К+ (результат косвенного УФ-детектирования) в диализирующсм растворе и сыворотке крови больных почечной недостаточностью.

5. Предложен способ экспресс-определения кофеина в зеленом чае методами капиллярного электрофореза и высокоэффективной тонкослойной хроматографии, основанный на использовании селективного связывания полифенолов (мешающих компонентов) катионами FeJ+, Си**, без проведения стадии пробоподготовки.

6. Выявлены возможности хирального лигандообменного капиллярного электрофореза при разделении аминокислот (значения фактора разрешения (Rs) для энантиомеров D.L-Pro, Д£-Тут, D.L -ДОФА составили 0.7,0.9, 1.4, соответственно) в выбранных условиях.

7. Показано, что метод лигандообменного капиллярного электрофореза превосходит лигапдообменную хроматографию по времени анализа и эффективности, уступая ей по селективности.

Основные материалы работы опубликованы в следующих работах:

1. JI.A. Карцова, А.В. Алексеева. Обзор: Свойства и физико-химические методы определения полифенольных соединений // ЖАХ. 2008. В. 63. № 11. С. 1126-1136.

2. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева. Влияние казеинов молока на содержание полифенолов в составе чая //ЖАХ. 2008. В. 63. № П. С. 1107-1111.

3. Л.А. Карцова, Н.А. Касьяненко, А.В. Алексеева, О.В. Ганжа, С.В. Пастон, Д.С. Ершов. Электрофоретическое определение катехинов и изучение процессов их комплексообразования с органическим» и неорганическими соединениями //Журнал прикладной химии. 2008. В. 8. С. 16331638.

4. Л.А. Карцова, И.К. Хмельницкий, А.В. Алексеева, В.Г. Березкин, Т.В. Печенко. Одновременное

определение водо- и жирорастворимых витаминов в различных режимах высокоэффективной тонкослойной хроматографии // "Сорбционные и хроматографические процессы". 2007. Т. 7. В. 7. С. 909-916

5. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева. Использование селективного комплексообразования катехинов с

нонами FeJ* при определении кофеина в чае методом ВЭТСХ // ЖАХ. 2009. Т.64. № 9. С. 954-958.

6. O.V. Ganzha, L.A. Kartsova, A.V. Alekseeva. The detennination of flavan-3-ols containing in nonalcoholic

and strong drinks by capillary electrophoresis // Thesis of International Congress on Analytical Sciences.

2006. Moskow, Russia. P. 436.

7. O.V, Ganzha, L.A. Kartsova, A.V. Alekseeva. Simultaneous determination of tea polyphenols compounds

and caffeine in tea extract by micellar electrokinetic chromatography // Thesis of 29"1 International Symposium on Capillary Chromatography. 2006. Riva del Garda. Italy.

8. Л.А. Карцова, О.И. Маркова, А.В. Алексеева. Электрофоретическое изучение процессов on-line и off-

line комплексообразования а системе природные полифенолы - Fe,+ // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Современные проблемы хроматографии". 2007. Москва, Россия. С. 88.

9. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева. Определение кофеина в различных образцах чая методами мицеллярной и высокоэффективной тонкослойной хроматографии // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Современные проблемы хроматографии". 2007. Москва, Россия. С.

154.

10. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева, О.В. Ганжа. Электрофоретическое определение полифенольных природных антиоксидантов в составе различных сортов зеленого и черного чая // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Современные проблемы хроматографии". 2007. Москва, Россия. С.

155.

11. L.A. Kartsova, A.V. Alekseeva. Dependence of tea polyphenols content on milk proteins // Thesis of XXXI Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds". 2007. Katowice-Szczyrk, Poland. P. 49.

12. L.A. Kartsova, A.V. Alekseeva. Determination of caffeine in tea extracts by CE and HPTLC // Thesis of XXXI Symposium "Chromatographic methods of investigating the organic compounds". 2007. Katowice-Szczyrk, Poland. P. 48.

13. Л.А. Карцова, Н.А. Касьяненко, A.B. Алексеева, С.В. Пастон, Д.С. Ершов. Взаимодействие природных полифенолов с различными органическими и неорганическими соединениями // Тезисы, докладов XVIII Менделеевского съезда по обшей и прикладной химии. 2007. Москва, Россия.

14. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева. Влияние белков молока на содержание полифенолов в составе чая // Тезисы докладов II Всероссийской Конференции «Аналитика России» с международным участием.

2007. Краснодар, Россия. С. 407.

15. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева, О.И. Маркова. Влияние катионов Fe3* на изменение хроматографического и электрофоретического профиля биологически активных веществ в составе зеленого чая // Тезисы докладов II Всероссийской Конференции «Аналитика России» с международным участием. 2007. Краснодар, Россия. С. 432.

16. L.A. Kartsova, A.V. Alekseeva. Using off-line and on-line complex forming processes for electrophoretical determination of biologically active compounds in foods // Thesis of 3rd Inemational Symposium on Recent Advances in Food Analysis. 2007. Prague, Czech Respublic. P. 397.

17. JI.Л. Карцова, Л.В. Алексеева, Л.II. Вилкова. Использование различных режимов высокоэффективной тонкослойной хроматографии при определении биологически активных соединений // Тезисы докладов Всероссийской конференции "Химический анализ". 2008. Москва, Россия. С. 56.

18. Л.А. Карпова, A.B. Алексеева, А.11. Вилкова. Определение биологически активных органических соединений с карбокси-, гидрокси- и аминогруппами методом лигандообменной тонкослойной хроматографии // Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Хроматография и хромато-масс-спектрометрия". 2008. Россия, Москва. С. 143.

19. Д.С. Ершов, C.B. Пастон, Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. О.В. Ганжа. H.A. Касьяненко. Раднозашитное действие биофлавоноидов в процессе гамма-облучения растворов ДНК // Тезисы докладов XIV симпозиума по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул. 2008. Челябинск, Россия. С. 134.

20. Л.А. Карцова. A.B. Алексеева, О.В. Ганжа. Возможности и ограничения метода капиллярно! электрофореза для определения полифенольных соединений и алкалоидов // Тезисы докладов ! Всероссийской конференции «Аналитические приборы». 2008. С.-Петербург, Россия. С.45.

21. Л.А.. Карцова, A.B. Алексеева. Процессы комплексообразования при электрофоретическом и хроматографическом определении биологически активных соединений И Тезисы докладов II Международного Форума «Аналитика и аналитики». Сентябрь, 2008. Воронеж, Россия. В.2. С. 550.

22. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Хроматографическое и электрофоретическос определение Сахаров, гидрокси- и аминокислот, витаминов с использованием процессов комплексообразования // Тезисы докладов II Международного Форума «Аналитика и аналитики». Сентябрь, 2008. Воронеж, Россия. В.2. С. 532.

23. L.A. Kartsova, A.V. Alekseeva. Ligand-exchange capillary electrophoresis possibilities for enviromental and food control // Thesis of 9th European Meeting on Enviromental Chemistry. December, 2008. Girona, Spain. P. 126.

24. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Хиральное разделение биологически активных соединений с использованием лигандного обмена методом капиллярного электрофореза // Тезисы международной конференции по химии «Основные тенденции развития химии в начале XXI века». Апрель, 2009. Санкт-Петербург. Россия. С.206.

25. 1..Л. Kartsova, A.V. Alekseeva, Vilkova A.N. The use of the complex forming processes of transitiv metals ions with biologically active compounds for their chromatographic and electrophoretic determination // Thesis of 34'1' International Symposium on High-Performancc Liquid Phase Separatio! and Related Techniques. June-July, 2009. Dresden, Germany. P. 198.

26. Jl.A. Карцова, A.B. Алексеева. Электрофоретическое определение Сахаров в режимах косвенного и прямого детектирования // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции по анализу объекте окружающей среды «Экоаналитика-2009». Июнь, 2009. Йошкар-Ола, Россия.

27. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Лигандообменный капиллярный электрофорез в анализе природнь объектов // Тезисы докладов VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающе среды «Экоаналитика-2009». Июнь, 2009. Йошкар-Ола, Россия.

28. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева, А.Н. Вилкова. Проблемы и решения при хроматографическом электрофоретическом определении аскорбиновой кислоты // Тезисы докладов Всероссийскс конференции с международным с участием «Теория и практика хроматографии. Хроматография нанотехнологии». Июль, 2009. Самара, Россия.

29. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Использование процессов комплексообразования rip электрофоретическом определении биологически активных соединений с гидрокси- и амин группами в биологических объектах // Тезисы докладов Всероссийской конференции международным с участием «Теория и практика хроматографии. Хроматография нанотехнологии». Июль, 2009. Самара, Россия.

30. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Лигандообменный капиллярный электрофорез. Достоинства ограничения // Тезисы докладов Всероссийской конференции с международным с участие «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии». Июль, 2009. Самар Россия.

Подписано к печати 25.09.2009г. Формат бумаги 60\84 '/», Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать цифровая. Усл. печ.л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 4515.

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф. Университетский пр. 26 Тел: (812)428-4043, 428-6919

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

1.1. Лигандный обмен в хроматографии и капиллярном электрофорезе.

1.2. Факторы, влияющие на разделение аналитов в лигандообменном капиллярном электрофорезе.

1.3. Процессы комплексообразования при хроматографическом и электрофоретическом разделении энантиомеров.

1.3.1. Хиральный лигандообменный капиллярный электрофорез.

1.3.2. Аффинный электрофорез.

1.4. Off- и on-line концентрирование с использованием процессов комплексообразования при электрофоретическом и хроматографическом определении биологически активных соединений.

1.5. Свойства биологически активных соединений и физико-химические методы их определения.

1.5.1. Углеводы.

1.5.1.1. Общая характеристика углеводов.

1.5.1.2. Физико-химические методы определения Сахаров.

1.5.2. Аминокислоты.

1.5.2.1. Общая характеристика аминокислот.

1.5.2.2. Физико-химические методы определения аминокислот.

1.5.3. Биогенные амины.

1.5.3.1. Общая характеристика биогенных аминов.

1.5.3.2. Физико-химические методы определения биогенных аминов.

1.5.4. Полифенолы.

1.5.4.1. Общая характеристика полифенолов.

1.5.4.2. Физико-химические методы определения полифенолов.

1.5.5.Аскорбиновая кислота.

1.5.5.1. Свойства и биологические функции аскорбиновой кислоты.

1.5.5.2. Физико-химические методы определения аскорбиновой кислоты.

1.6. Пробоподготовка реальных объектов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Аппаратура.

2.2. Реагенты.

2.3. Подготовка кварцевого капилляра.

2.4. Приготовление стандартных растворов определяемых веществ.

2.5. Приготовление рабочих растворов.

2.6. Определение параметров удерживания, эффективности и факторов селективности и разрешения в капиллярном электрофорезе и хроматографии.

2.7. Подбор систем лигандного обмена при определении аминокислот, аминов и Сахаров.gl

2.8. Определение Сахаров методом лигандообменного капиллярного электрофореза.

2.8.1. Оптимизация условий разделения фруктозы и глюкозы.

2.8.2. Количественный анализ реальных объектов.

2.9. Определение катехинов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии.

2.10. Изучение процессов комплексообразования полифенолов с катионами А1 , Fe , Си методами капиллярного электрофореза и ВЭТСХ.

2.10.1. Определение кофеина в чае методом ВЭТСХ с использованием комплексообразования полифенолов с Fe в режиме off-line.

2.11. Исследование взаимодействия аскорбиновой кислоты с катионами металлов (Сa ,Ni , Си ,Fe , А1 ) методом КЗЭ.

2.12. Изучение взаимодействия полифенолов с биополимерами (казеином и ДНК).

2.12.1. Изучение взаимодействия полифенолов с казеином методом мицеллярной электрокинетической хроматографии. Ю

2.12.2. Исследование влияния катехинов на свойства ДНК.

2.13. Хиральное разделение аминокислот методом лигандообменного капиллярного электрофреза.

2.14. Количественная оценка процессов комплексообразования в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза. ЮЗ

ГЛАВА 3. ЛИГАНДНЫЙ ОБМЕН ПРИ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ АМИНОКИСЛОТ, АМИНОВ И САХАРОВ.

3.1. Лигандообменный капиллярный электрофорез аминокислот

3.2. Использование метода ЛОКЭ для определения Сахаров.

3.2.1. Выбор системы лигандного обмена.

3.2.2. Установление строения комплексов «сахар — Си(П)у>.

ГЛАВА 4. ПРОЦЕССЫ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАНИЯ ПРИ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОМ И ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМ ОПРЕДЕЛЕНИИ ПОЛИФЕНОЛОВ И АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ.

ГЛАВА. 5. ДОСТОИНСТВА И ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА ЛИГАНДООБМЕННОГО КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА И ЕГО

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Актуальность. Основными проблемами электрофоретического определения многих биологически активных соединений являются отсутствие в их молекулах хромофорных групп (сахара, алифатические аминокислоты и амины), низкие значения констант диссоциации (сахара), недостаточная стабильность в процессе анализа (аскорбиновая кислота, полифенолы, катехоламины).

Использование процессов комплексообразования с органическими агентами (краун-эфирами, цикламами, циклодекстринами, ПАВ) и ионами переходных металлов (Си , Fe и др.), введенными в матрицу пробы, состав рабочего электролита или подвижную фазу, позволяет расширить аналитические возможности методов разделения. Перспективными в этом направлении могли бы оказаться электрофоретические методы, основанные на лигандном обмене, ближайшим аналогом которых является лигандообменная хроматография. При этом высокая эффективность метода КЭ и возможность on-line концентрирования могут обеспечить заметное снижение времени анализа и пределов обнаружения аналитов.

Данная работа посвящена выявлению возможностей лигандообменного капиллярного электрофореза (ЛОКЭ) при определении биологически активных соединений {аминокислот, биогенных аминов, Сахаров и полифенолов) в объектах растительного происхождения, фармацевтических препаратах и биологических жидкостях человека. Имеющиеся зарубежные работы в этой области ориентированы, в основном, на хиральное разделение. Однако использование принципа лигандного обмена в капиллярном электрофорезе может способствовать решению и других задач: обнаружение не поглощающих в УФ-области соединений без проведения стадии дериватизации; снижение пределов детектирования поглощающих аналитов; изменение эффективности и селективности разделения.

Работа поддержана грантами РФФИ №07-03-01001-а, «Ползуновскими грантами», «У.М.Н.И.К.» (С.-Петербург, Россия).

Цель работы; выявление возможностей лигандообменного капиллярного электрофореза при определении биологически активных соединений (сахаров, аминокислот, аминов, природных антиоксидантов и т.д.) и установление критериев при выборе систем лигандного обмена.

В связи с поставленной ifenbio необходимо было решить следующие задачи:

1. Установить факторы, влияющие на образование комплекса «металл — органический лиганд» в условиях лиганднообменного капиллярного электрофореза

2. Количественно оценить обсуждаемые процессы комплексообразования для подтверждения выявленных закономерностей

3. Выявить пути снижения пределов обнаружения аналитов в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза, включая on-line концентрирование

4. Выяснить возможность одновременного определения органических биологически активных соединений (результат лигандного обмена) и неорганических ионов (косвенное детектирование)

5. Получить сравнительные оценочные характеристики метода лигандообменного капиллярного электрофореза с лигандообменной хроматографией

Научная новизна

Предложены критерии выбора систем для реализации режима лигандного обмена в капиллярном электрофорезе (природа металла-комплексообразователя и лиганда, рН рабочего электролита) в зависимости от характеристик определяемых аналитов (констант диссоциации рКа, значений изоэлектрических точек рI, способности к хелатированию, наличия или отсутствия хромофорных фрагментов, а также функциональных групп, склонных к окислению).

Установлено влияние рН рабочего электролита на интенсивность аналитического сигнала аминокислот и показано, что максимальная интенсивность наблюдается при рН, близком к значению рI аминокислот. Полученные закономерности подтверждены рассчитанными константами связывания (Ксв): наибольшие значения Ксв комплексов «аминокислота — Си(11)» наблюдаются при рН ~ рI.

Показана перспективность использования on-line концентрирования в режиме ЛОКЭ. Наибольших факторов концентрирования удалось достичь в случае аминокислот при использовании динамического рН-скачка, основанного на различии в значениях рН зоны пробы и рабочего электролита. Пределы обнаружения аминокислот снижены в 20 - 30 раз и составили 0,5 — 1,0 мг/л.

На примере диализирующего раствора и сыворотки крови человека продемонстрирована возможность одновременного определения Сахаров (прямое УФ-детектирование в форме комплексов с Cu(II)) и неорганических катионов Na+, К+ (косвенное УФ-детектирование) в режиме лигандообменнош капиллярного электрофореза.

Установлено, что возможность обнаружения Сахаров, алифатических аминов и аминокислот в условиях лигандного обмена в существенной степени определяется хелатным эффектом, а для образования комплекса «сахар - Си(П)у> необходимым условием также является циклическая форма молекулы сахара.

На примере цистеина и глутатиона показано, что аминокислоты и пептиды, молекулы которых содержат легкоокисляющиеся SH-группы, в условиях ЛОКЭ детектируются в форме комплексов их продуктов окисления с катионами Си2+.

Электрофоретическими и спектрофотометрическими методами установлено взаимодействие катехинов с белком молока — казеином, в отличие от другого биополимера ДНК, где радиопротекторное действие катехинов не сопровождается образованием комплекса с макромолекулой.

Установлены факторы, влияющие на стабильность аскорбиновой кислоты в процессе ее электрофоретического определения (рН элюента/рабочего электролита, присутствие катионов различных металлов (Са2+, Zn2+, Al3+, Со2+, Ni2+, Cu2+, Fe3+), органического растворителя (ацетонитрила, метанола). Показано, что максимальный стабилизирующий эффект оказывает снижение рН.

Практическая значимость работы

Предложен электрофоретический способ определения Сахаров, основанный на лигандном обмене, в пищевых продуктах (соках, винах, меде и т.д.), а также одновременного определения глюкозы и неорганических катионов (Na+, К+) в фармацевтических препаратах (раствор глюкозы для инъекций, диализирующий раствор для больных с почечной недостаточностью) и биологических жидкостях человека (сыворотка крови). Пределы обнаружения глюкозы, фруктозы, сахарозы, Na и К составили 21, 8, 183, 27 и 35 мг/л, соответственно.

Предложен способ, исключающий стадию пробоподготовки, хроматографического (ВЭТСХ) определения кофеина (минорного компонента) в чае с использованием селективного взаимодействия

II катехинов с катионами Fe . Предел обнаружения кофеина составил 100 нг.

Выявлены факторы, определяющие устойчивость аскорбиновой кислоты в процессе электрофоретического анализа, и предложен вариант мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью для ее определения. Предел обнаружения составил 80 мкг/л.

Положения, выносимые на защиту

1. Закономерности выбора систем для лигандообменного капиллярного электрофореза при обнаружении алифатических аминокислот, аминов и диаминов, Сахаров ионогенной (гепарин) и неионогенной (сахароза, глюкоза, фруктоза) природы.

2. Возможности снижения пределов обнаружения биологически активных соединений в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза, включая on-line концентрирование.

3. Количественная оценка процессов комплексообраования определяемых биологически активных соединений (аминов, аминокислот и Сахаров) с катионами металлов Си2+.

4. Возможности хирального лигандообменного капиллярного электрофореза при разделения энантиомеров аминокислот в выбранных условиях.

5. Сравнительные оценочные характеристики лигандообменного капиллярного электрофореза, капиллярного зонного электрофореза с косвенным УФ-детектированием и лигандообменной хроматографии.

6. Использование полученных закономерностей при решении практических задач: определение Сахаров в напитках, фармацевтических препаратах и биологических жидкостях методом ЛОКЭ; определение кофеина в различных образцах чая методом ВЭТСХ; определение аскорбиновой кислоты в напитках методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью.

выводы

1. Выявлены критерии, обеспечивающие разделение и обнаружение аналитов в условиях лигандообменного капиллярного электрофореза природа металла-комплексообразователя и природа противоиона; характеристики аналита (значение рКа, способность к хелатированию и т.д.); присутствие конкурирующих добавок; рН рабочего электролита, значение которого влияет на электрофоретические характеристики аналитов и возможность образования комплекса с ионами Си (максимальная интенсивность аналитического сигнала и связывание аминокислот с ионами 2+

Си наблюдается при рН ~ pi).

2. Установлено, что использование метода ЛОКЭ позволяет снизить пределы обнаружения поглощающих в УФ-области соединений (триптофан, тирозин, гистамин) по сравнению с традиционным капиллярным зонным электрофорезом в 2-3 раза. При реализации on-line концентрирования {динамического рН-скачка) пределы обнаружения алифатических аминокислот были снижены в 20 — 30 раз и составили 0,5 — 1,0 мг/л.

3. Предложен способ электрофоретического определения Сахаров в форме их комплексов с катионами Си и показано, что необходимым условием является циклическая форма сахара.

4. Разработан способ одновременного определения глюкозы в форме комплексов с

Си2+ и неорганических катионов Na , К (результат косвенного УФ-детектирования) в диализирующем растворе и сыворотке крови больных почечной недостаточностью.

5. Предложен способ экспресс-определения кофеина в зеленом чае методами капиллярного электрофореза и высокоэффективной тонкослойной хроматографии, основанный на использовании селективного связывания полифенолов (мешающих компонентов) катионами Fe3+, Cu2+, без проведения стадии пробоподготовки.

6. Выявлены возможности хирального лигандообменного капиллярного электрофореза при разделении аминокислот (значения фактора разрешения

Rs) для энантиомеров D,L-Pro, AZ-Tyr, D,L -ДОФА составили 0.7, 0.9, 1.4, соответственно) в выбранных условиях.

7. Показано, что метод лигандообменного капиллярного электрофореза превосходит лигандообменную хроматографию по времени анализа и эффективности, уступая ей по селективности.

1. В.А. Даванков, Дж. Навратил, X. Уолтон. Лигандообменная хроматография. Пер. с англ. М.: Мир. 1990. 294 С.

2. G. Giibitz, W. Jellenz, W. Santi. Separation of the optical isomers of aminoacids by ligand-exchange chromatography using chemically bonded phases // J. Chromatogr. 1981. V. 203. P. 377-384.

3. E. Gassmann, J. E. Kuo, and R. N. Zare. Electrokinetic Separation of Chiral

4. Compounds // Science. 1985. V. 230. P. 813-814.

5. P. Gozel, E. Gassman, H. Michelsen, R.N. Zare. Electrokinetic resolution ofamino acid enantiomers with copper (II) — aspartame support electrolyte // Anal. Chem. 1987. V. 59. P. 44-49.

6. M. Blanco, I. Valverde. Choice of chiral selector for enentioseparation bycapillary electrophoresis // Trends in Analytical Chemistry. 2003. V. 22. P. 428-439.

7. M.G. Schmid, N. Grobuschek, O. Lecnik, G. Giibitz. Review article: Chiralligand-exchange capillary electrophoresis // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. V. 48. P. 143-154.

8. N. G. Sundin, T.M. Dowling, N. Grinberg, G. Bicker. Enantiomeric separationof dansyl amino acids using MECC with a ligand exchange mechanism // J. Microcolumn Separations. 1996. V. 8.1. 5. P. 323-329.

9. A. Vergali, M.G. Schmid, F. Kilar, G. Giibitz. Chiral separation of a-aminoacids by ligand-exchange capillary electrophoresis using N-(2-hydroxy-octyl)-L-hydroxyproline as a selector // Electrophoresis. 1998. V. 19. P. 2109-2112.

10. M.G. Schmid, R. Rinaldi, D. Drenevy, G. Giibitz. Enantioseparation of a-aminoacids and dipeptides by ligand exchange capillary electrophoresis of various L-4-hydroxyproline derivatives //J. Chromatogr. A. 1999. V. 846. P. 157-163.

11. M.G. Schmid, G. Giibitz. Direct enantiomer separation of underivatized aminoacids by capillary zone electrophoresis based on ligand exchange // Enantiomer. 1996. V. 1. P. 23- 27.

12. M.G. Schmid, О. Lecnik, U. Sitte, G. Giibitz. Application of ligand-exchangecapillary electrophoresis to the chiral separation of a-hydroxy acids and p-blockers // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 307-314.

13. Z. Chen, J.-M. Lin, K. Uchiyama, T. Hobo. Separation behaviour of amino acid enantiomers in ligand-exchange micellar electrokinetic chromatography // J. Microcolumn Separations. 1999. V. 11. P. 534-540.

14. V. Cucinotta, A. Guffrida, D. La Mendola, G. Maccarone, A. Puglisi, E.L

15. N. Grobuschek, M.G. Schmid, C. Tuscher, M. Ivanova, G. Giibitz. Chiral separation of P-methyl-amino acids by ligand-exchange using capillary elecrophoresis and HPLC // J. Pharmaceuticals and Biomedical Analysis. 2002. V. 27. P. 599-605.

16. S. Zhao, Y.-M. Liu. Enantioseparation of underivatized amino acids by capillary electrophoresis using copper(II) (S)-3-aminopirrolidine - L-histidine ternary complex as the chiral selector // Analytica Chimica Acta. 2001. V. 426. P. 65-70.

17. X. Lu, Y. Chen, L. Guo, Y. Yang. Chiral separation of underivatized amino acids by ligand-exchange capillary electrophoresis using a copper(II) — L-lysine complex as selector // J. Chromatogr. A. 2002. V. 945. P. 249-255.

18. Z. Chen, K. Uchiyama, T. Hobo. Chiral resolution of dansyl amino acids byligand exchange-capillary electrophoresis using Cu(II)-L-prolinamides as chiral selector // Analytica Chimica Acta. 2004. V. 523. P. 1-7.

19. V.A. Davankov. Enantioselective ligand exchange in modern separation techniques //J. Chromatogr. A. 2000. V. 1000. P. 891-915.

20. A. Bazanella, К. Bachmann. Separation and direct UV detection of sugars bycapillary electrophoresis using chelation of copper (II) // J. Chromatogr. A. 1998. V. 799. P. 283-288.

21. J. Snopek, I. Jelinek, E. Smolkova-Keulemansova. Review: Chiral separationby analytical electromigration methods // J. Chromatogr. 1992. V. 609. P. 117.

22. S.A.C. Wren. Theory of chiral separation in capillary electrophoresis // J. Chromatogr. 1993. V. 636. P. 57-62.

23. Е.П. Соколова, H.A. Смирнова. Межмолекулярные взаимодействия. Основные понятия: Учебное пособие для университетов. СПб.: Санкт-Петербургский университет, ВВМ, 2008. — 225 е.: илл.

24. Панкратов А.Н. Кислоты и основания в химии: Учеб. пособие. — Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. — 196 е.: ил.

25. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 1. Общие вопросы. Методы разделения: Учеб. Для вузов/Ю.А. Золотов, Е.Н.Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А. Золотова. — 2-е изд., перераб. и доп. — М.: Высш. шк., 2002. — 351 е.: ил.

26. JI.A. Карцова, А.А. Сидорова, А.С. Иванова. Электрофоретическое определение биогенных аминов в биологических жидкостях // Журнал Аналитической Химии. 2007. Т. 62. № 10. С. 1066-1071.

27. W.J. Shieh, A.R. Hedges. Properties and applications of cyclodextrines // J.M.S. Pure Appl. Chem. A. 1996. V. 33 (5). P. 673-683.

28. A. M. Rizzi. Efficiency in chiral high-performance liquid-exchange chromatography. Influence of the complexation process, flow-rate and capacity factor// J. Chromatogr. 1991. V. 542. P. 221-237.

29. V.A. Davankov. Chiral selectors with chelating properties in liquid chromatography: fundamental reflections and selective review of recent developments // J. Chromatogr. A. 1994. V. 666. P. 55-76.

30. S. Fanali. Enantioselective determination by capillary electriphoresis with cyclodextrines as chiral selectors // J. Chromatogr. A. 2000. V. 875. P. 89122.

31. L. Guo, S. J. Lin, Y.F. Yang, L. Qi, M.X. Wang, Y. Chen. Fast enentioseparation of arylglycine amides by capillary electrophoresis with highly sulfated-(3-cyclodextrin as a chiral selector // J. Chromatogr. A. 2003. V. 998. P. 221-228.

32. Z. Chen, J.-M. Lin, K. Uchiyama, T. Hobo. Simultaneous separation of sixteenpositional and optical isomers of the tryptophan family by ligand-exchange micellar electrokinetic chromatography // Chromatographia. 1999. V. 49. P. 436-443.

33. V. Cucinotta, A. Giuffrida, G. Maccarrone, M. Messina, A. Puglisi, A. Torrisi,

34. G. Vecchio. The 6-derivative of (3-cyclodextrin with succinic acid: a new chiral selector for CD-EKC // J. Pharmaceuticals and Biomedical Analysis. 2005. V. 37.1. 5. P. 1009-1014.

35. K. Takeo. Review: Advances in affinity electrophoresis // J. Chrom. A. 19951. V. 698. P. 89-105

36. K.L. Larsen, W. Zimmermann. Analysis and characterization of cyclodextrinsand their inclusion complexes by affinity capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1999. V. 836. P. 3-14.

37. S. Bose, J. Yang, D.S. Hage. Guidelines in selecting ligand concentrations forthe determination of binding constants by affinity capillary electrophoresis // J. Chromatogr. B. 1997. V. 697. P. 77-88.

38. JI.А. Карцова, Е.А. Бессонова. Методы on-line концентрирования в капиллярном электрофорезе // Журнал аналитической химии. 2009. Т.64. №4. С. 340-351. ^

39. Н. Tsuchiya, М. Sato, Н. Kato, Т. Okubo, L.R. Juneja, М. Kim. Simultaneousdetermination of catechins in human saliva by high performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 1997. V. 703. P. 253-258.

40. H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, H. Kureshiro, N. Takagi. Nanoscale analysis ofpharmacologically active catechins in body fluids by HPLC using borate complex extraction pretreatment // Talanta. 1998. V. 46. P. 717-726

41. M. Vaher, M. Koel. Separation of polyphenolic compounds extracted from plant matrices using capillary electrophoresis // J. Chromatogr .A. 2003. V. 990. P. 225-230.

42. D.J. Weiss, C.R. Anderton. Determination of catechins in matcha green tea bymicellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1011. P. 173-180.

43. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Обзор: Свойства и физико-химические методы определения полифенольных соединений // ЖАХ. 2008. В. 63. № 11. С. 1126-1136.

44. К. Vuorensola, Н. Siren. Determination of urinary catecholamines with capillary electrophoresis after solid-phase extraction // J. Chromatogr. A. 2000. V. 895. P. 317-327.

45. T.T. Березов, Б.Ф. Коровкин. Биологическая химия: Учебник — 3-е изд., перераб. и доп.- М.: Медицина, 1998- 704 е.: ил- (Учеб. лит. для студентов мед. вузов). ISBN 5-225-02709-1.

46. Б.И. Збарский, И.И. Иванов, С.Р. Мардашев. Биологическая химия: Учебник.- 5-е изд., испр. и доп.- Ленинград.: Медицина, 191972 582 е.: ил — (Учеб. лит. для студентов мед. вузов).

47. C. W. Wilson, P. E, Shaw, C. W. Campbell. Determination of organic acidsand sugars in Guava (Psidium guajava L.) cultivars by high-performance liquid chromatography // J. Sci. Food Agric. 1982. V. 33. P. 777-780.

48. K. Tang, L. Liang, Y. Cai, S. Мои. Determination of sugars and alditols in tobacco with high-performance anion-exchange chromatography // J. Sep. Sci. 2007. V. 30. P. 2160-2166.

49. J J. Conboy, J. Henion. High-performance anion-exchange chromatography coupled with mass spectrometry for the determination of carbohydrates // Biological Mass Spectrometry. 1992. V.21. P. 397-407.

50. R.M. Saunders. Separation of sugars on an ion-exchange resin // Carbohydr. Res. 1968. V. 7. P. 76 79.

51. H. F. Walton. Ligand-exchange chromatography: A brief review // Ind. Eng.

52. Chem. Res. 1995. V. 34. P. 2553-2554.

53. M. Stefansson, D. Westerlund. Ligand-exchange chromatography of carbohydrates and glycoconjugates // J. Chromatogr. A. 1996. V. 720. P. 127136.

54. S. M. Santos, A. C. Duarte, V. I. Esteves. Development and application of capillary electrophoresis based method for the assessment of monosaccharide in soil using acid hydrolysis // Talanta. 2007. V. 72. P. 165-171.

55. E. Maeda, M. Kataoka, M. Hino, K. Kajimoto, N. Kaji, M. Tokeshi, J. Kido, Y.

56. Shinohara, Y. Baba. Determination of human blood glucose levels using microchip electrophoresis //Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 2927-2933.

57. C. Chiesa, P. Oefner, L. R. Zieske, R. A. O'Neill. Micellar electrokinetic chromatography of monosaccharides derivatized with l-phenyl-3-methyl-2-pyrazolin-5-one // J. CAP. ELEC. 1995. V. 2 (4). P. 175-183.

58. H. Schwaiger, P. J. Oefner, C. Huber, E. Grill, G. K. Bonn. Capillary zone electrophoresis and micellar electrokinetic chromatography of 4aminobenzonitrile carbohydrate derivatives // Electrophoresis. 1994. V. 15. P. 941-952.

59. M. Ristolainen. Characterization of totally chlorine-free effluents from Kraftpulp bleaching. II. Analysis of carbohydrate-derived constituents after acid hydrolysis by capillary zone electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1999. V. 832. P. 203-209.

60. Z. L. Rassi, Y. Mechref. Recent advances in capillary electrophoresis of carbohydrates: Review//Electrophoresis. 1996. V. 17. P. 275-301.

61. X. Y. Wang, Y. Chen, Z. Li, Z. Wang. Analysis of carbohydrates by capillaryzone electrophoresis with on-capillary derivatization // J. of Liquid Chromatography & Related Technology. 2002. V. 25.1. 4. P. 589-600.

62. A.V. Jager, F.G. Tonin, M.F.M. Tavares. Comparative evaluation of extractionprocedures and method validation for determination of carbohydrates in cereals and dairy products by capillary electrophoresis // J. Sep. Sci. 2007. V. 30. P. 586-594.

63. Y.-H. Lee, T.-I. Lin. Determination of carbohydrates by high-performance capillary electrophoresis with indirect absorbance detection // J. Chromatogr. B. 1996. V. 681. P. 87-97.

64. Y. Ciringh, J. S. Lendsey. Analysis of sugar phosphates and related compoundsusing capillary zone electrophoresis with indirect UV detection // J. Chromatogr. A. 1998. V. 816. P. 251-259.

65. B. Lu, D. Westerlund. Indirect UV detection of carbohydrates in capillary zoneelectrophoresis by using tryptophan as a marker // Electrophoresis. 1996. V. 17. P. 325-332.

66. S. Hoffstetter-Kuhn, A. Puulus, E. Gassmann, H. M. Widmer. Influence of borate complexation on the electrophoretic behavior of carbohydrates in capillary electrophoresis //Anal. Chem. 1991. V.63. P. 1541-1547.

67. G. Morales-Cid, В. M. Simonet, S. Cardenas, M. Valcarcel. On-capillary sample clean up method for the electrophoretic determination of carbohydrates in juice samples // Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 1557-1563.

68. A. Pervin, A. Al-Hakim, R.J. Linhardt. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reversed polarity // Anal. Biochem. 1994. V. 221. P. 182-188.

69. T. Toida, R. J. Linhardt. Detection of glucosaminoglycans as a copper (II) complex in capillary electrophoresis // Electrophoresis. 1996. V. 17. P. 341346.

70. S. Rovio, J. Yli-Kauhaluoma, H. Siren. Determination of neutral carbohydratesby CZE with direct UV detection // Electrophoresis. 2007. V. 28. P. 31293135.

71. A.M. Tolbert, R. Baldwin. Liquid chromatography and electrochemical detection of alditols and acidic sugars at a cobalt phthalocyanine-containing chemically modified electrode // Electroanalysis. 1989. V. 1. P. 389-395.

72. L.A. Kartsova, Y.V. Cherkas, I.N. Krasnova. Analysis of aminoacids in humanserum by isocratic reversed-phase liquid high-performance chromatography with various types of phtalaldehyde derivatization // J. Chromatogr. A. 2001. V. 913. P. 303-308.

73. Encyclopedia of Separation Science. C. F. Poole, M. Cooke, I.D. Wilson (Eds).

74. Publisher: Academic Press; 2000. 4500 p.

75. JI.A. Карпова, И.Н. Краснова, И.В. Колмакова. Анализ нейромедиаторныхаминокислот и биогенных аминов в синномозговой жидкости методом обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии // Журнал аналитической химии. 1997. Т. 52. № 7. С. 767-772.

76. М. Krizek, Т. Pelikanova. Determination of seven biogenic amines in foods bymicellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. A. 1998. V. 815. P. 243-250.

77. E.K. Paleologos, S.D. Chytiri, I.N. Savvaidis, M.G. Kontominas. Determination of biogenic amines as their benzoyl derivatives after cloud point extraction with micellar liquid chromatographic separation // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1010. P. 217-224.

78. B. Kagedal. Catecholamines and their methabolites // J. Chromatogr. B. 1988.1. V. 429. P. 177-233.

79. A. Kovacs, L. Simon-Sarkadi, K. Ganzler. Determination of biogenic aminesby capillary electrphoresis // J. Chromatogr. A. 1999. V. 836. P. 305-313.

80. S.C. Su, S.S. Chou, P.C. Chang, D.F. Hwang. Determination of biogenic amines in fish implicated in food poisoning by micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. B. 2000. V. 749. P. 163-169.

81. K.B. Male, J.H.T. Luong. Derivatisation, stabilization and detection of biogenic amines by cyclodextrin-modified capillary electrophoresis laser-induced fluorescence detection // J. Chromatogr. A. 2001. V. 926. P. 309-317.

82. X. Sun, X. Yang, E. Wang. Determination of biogenic amines by capillary electrophoresis with pulsed amperometric detection // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1005. P. 189-195.

83. X. Liu, L.-X. Yang, Y.-T. Lu. Determination of biogenic amines by 3-(2-furoyl)quinoline-2-carboxaldehyde and capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection // J. Chromatogr. A. 2003. V. 998. P. 231-219.

84. T. A. Smith. Polyamines // Annu. Rev. Plant Physiol. 1985. V. 36. P. 117-143.

85. C. W. Tabor, H. Tabor. Polyamines // Annu. Rev. Biochem. 1984. V. 53. P.749.790.

86. V. Quemener, Y. Blanchard, L. Chamaillard, R. Havouis, B. Cipolla, J-Ph. Moulinoux. Polyamine deprivation: A new tool in cancer treatment // Anticancer Res. 1994. V. 14. P. 443-448.

87. D.H. Russell, C.C. Levy, S.C. Schimpff, I.A. Hawk. Urinary polyamines in cancer patients //Cancer Res. 1971. V. 31(11). P. 1555-1558.

88. B. ten Brink, C. Damink, H.M.L J. Joosten, J.H.J. Huis in't Veld. Occurrenceand formation of biologically active amines in foods // Int. J. Food Microbiol. 1990. V. 11. P. 73-84.

89. P. Volin. Determination of free urinary catecholamines by high-performance liquid chromatography with electrochemical detection // J. Chromatogr. B. 1994. V. 655. P. 121-126.

90. R.P.H. Nikolajsen, A.M. Hansen. Analtical methods for determining urinary catecholamines in healthy subjects // Analytica Chimica Acta. 2001. V. 449. P. 1-15.

91. M.A. Raggi, C. Sabbioni, G. Casamenti, G. Gerra, M. Calonghi, L. Masotti. Determination of catecholamines in human plasma by high-performance liqiud chromatography with electrochemical detection // J. Chromatogr. B. 1999. V. 730. P. 201-211.

92. R.M. Riggin, P.T. Kissinger. Determination of catecholamines in urine by reverse-phase liquid chromatography with electrochemical detection // Anal.Chem. 1977. V. 49(13). P. 2109-2111.

93. S. Honda, M. Takahashi, Y. Araki, K. Kakehi. Post-column derivatization of catecholamines with 2-cyanoacetamide for fluorometric monitoring in high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 1983. V. 274. P. 4552.

94. Y. Ohkura, M. Kai, H. Nohta. Fluorigenic reactions for biomedical chromatography // J. Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 85-107.

95. T. Okumura, Y. Nakajima, M. Matsuoka, T. Takamatsu. Study of salivary catecholamines using fully automated column-switching high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 1997. V. 694. P. 305-316.

96. M.E. Bovingdon, R.A. Webster. Derivatization reactions foe neurotransmittersand their automation // J. Chromatogr. B. 1994. V. 659. P. 157-183.

97. J. Lange, K. Thomas, C. Wittmann. Comparison of a capillary electrophoresis method with high-performance liquid chromatography for the determination of biogenic amines in various food samples // J. Chromatogr. B. 2002. V. 779. P. 229-239.

98. H. Siren, M. Mielonen, M. Herlevi. Capillary electrophoresis in the determination of anionic catecholamine methabolites from patients' urine // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1032. P. 289-297.

99. K. Vuoresola, H. Siren. Determination of urinary catecholamines with capillary electrophoresis after solid-phase extraction // J. Chromatogr. A. 2000. V. 896. P. 317-327.

100. E.C.Y. Chan, P.Y. Wee, O.Y. Ho. HPLC assay for catecholamines and metanephrines using fluorimetric detection with pre-column 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride derivatization// J. Chromatogr. B. 2000. V. 749. P. 179-189.

101. A. Mitsui, H. Mohta, Y. Ohkura. High-performance liquid chromatography of plasma catecholamines using 1,2-diphenylethylenediamine as precolumn fluorescence derivatization reagent // J. Chromatogr. B. 1985. V. 344. P. 6170.

102. J. A. M. McKenzie, C. J. Watson, R.D. Rostand, I. German, S.R. Witowski, R.T. Kennedy. Automated capillary liquid chromatography for simultaneuos determination of neuroactive amines and amino acids // J. Chromatogr. A. 2002. V. 962. P. 105-115.

103. V. Stangl, H. Dreger, K. Stangl, M. Lorenz. Molecular targets of tea polyphenols in the cardiovascular system // Cardiovascular Research. 2007. V. 73. P. 348-358.

104. H. Yu, J. Yin, S. Shen. Effects of epi-gallocatechin gallate on PC-3 cell cytoplasmic membrane in presence of Cu2+ // Food Chemistry. 2006. V. 95. P. 108-115.

105. G. Lill, S. Voit, K. Schror, A.-A. Weber. Complex effects of different green tea catechins on human platelets // FEBS Letters. 2003. V. 546. P. 265-270.

106. H. Horie, K. Kohata. Application of capillary electrophoresis to tea quality estimation // J. Chromatogr .A. 1998. V. 802. P. 219-223.

107. H. Horie, T. Mukai, K. Kohata. Simultaneuos determination of qualitatively important components in green tea infusions using capillary electrophoresis // J. Chromatogr.A. 1997. V. 758. P. 332-335.

108. E. Blahova, J. Lehotay. Sample preparation and HPLC determination of catechins in green tea // Chem. Anal. 2006. V. 51. P. 795-807.

109. M. C. Pascual-Marti, A. Salvador, A. Chafer, A. Berna. Supercritical fluid extraction of resveratrol from grape skin of Vitis vinifera and detremination by HPLC // Talanta. 2001. V. 54. P. 735-740.

110. В.И. Слесарев. Основы химии живого. СПб: Химиздат, 2001. 784 С.

111. V. Nwuha, М. Nakajima, J. Tong, S. Ichikawa. Solubility study of green tea extracts in pure solvents and edible oils // J. Food Engineering. 1999. V. 40. P.161-165.

112. Биохимия фенольных соединений. Под ред. Дж. Харборна. М.: Мир, 1968.451 С.

113. S. Khokhar, R. К. Owusu Apenten. Iron binding characteristics of phenolic compounds: some tentative structure-activity relations // Food Chemistry. 2003. V. 81. P. 133-140.

114. S.B. Erdemoglu, S. Guser. Selective determination of aluminium bound with tannin in tea infusion // Analytical Science. 2005. V. 21. P. 1005-1008.

115. L.M. Costa, S.T. Gouveia, J.A. Nobrega. Comparison of heating extraction procedures for Al, Ca, Mg and Mn in tea samples // Analytical Science. 2002. V. 18. P. 313-318.

116. Chia-Chann Shiue, Shu-Yu Lin, Chuen-Ying Liu. Chemically bonded fullerene C60 capillary column for the electrophoretic separation of plant polyphenols //J. Chinese chemical society. 2001. V. 48. P. 1029-1034.

117. M. Lopez-Serrano, A. R. Barselo. Reversed-phase and size-exclusion chromatography as useful tools in the resolution of peroxidase-mediated (+)-catechin oxidation product // J. of Chromatogr. A. 2001. V. 919. P. 267-273.

118. A.M. van Nederkassel, M. Daszykowski, D.L. Massart, Y. Vander Heyden. Prediction of total green tea antioxidant capacity from chromatograms by multivariate modeling // J. Chromatogr.A. 2005. V. 1096. P. 177-186.

119. M.Sano, M.Tabata, M. Suzuki, M. Degawa, T. Miyase, M. Maeda-Yamamoto. Simultaneous determination of twelve tea catechins by high-perfomance liquid chromatography with electrochemical detection // The Analyst. 2001. V. 126. P. 816-820.

120. M. Kumamoto, T. Sonda, K. Takedomi, M. Tabata. Enhanced separation and elution of catechins in HPLC using mixed-solvents of water, acetonitrile and ethyl acetate as mobile phase // Analytical sciences. 2000. V. 16. P. 139-144.

121. A. Kotani, Y. Hayashi, R. Matsuda, F. Kusu. Optimization of HPLC-ECD of catechins with precision and efficiency based on FUMI theory // Analytical Science. 2003. V. 19. P. 865-869.

122. B. Suarez, A. Picinelli, J.J. Mangas. Solid-phase extraction and high-performance liquid chromatographic determination of polyphenols in apple musts and ciders // J. Chromatogr.A. 1996. V.727. P. 203-209.

123. G. Maiani, M. Serafini, M. Salucci, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi. Application of a new high-perfoemance liquid chromatigraphic method for measuring selected polyphenols in human plasma // J. Chromatogr.A. 1998. V. 692. P. 311-317.

124. H. Tsuchiya. High performance liquid chromatographic analysis of polyhydroxyflavones using solid-phase borate complex extraction // J. Chromatogr.В. 1998. V. 720. P. 225-230.

125. H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, T. Okubo, L.R. Juneja, M. Kim. Simultaneous determination of catechins in human saliva by high performance liquid chromatography // J. Chromatogr. B. 1997. V. 703. P. 253-258.

126. P. L. Fernandez, M. J. Martin, A. G. Gonzalez, F. Pablos. HPLC determination of catechins and caffeine in tea. Differentation of green, black and instant teas // Analyst. 2000. V. 125. P. 421-425.

127. Y. Zuo, H. Chen, Y. Deng. Simultaneous determination of catechins, caffeine and gallic acid in green, Oolong, black and pu-erh teas using HPLC with photodiode array detector // Talanta. 2002. V. 54. P. 307-316.

128. X. Gu, Q. Chu, M. O'Dwyer, M. Zeece. Analysis of resveratrol in wine by capillary electrophoresis // J. Chromatogr.A. 2000. V.881. P.471-481.

129. D J. Weiss, C.R. Anderton. Determination of catechins in matcha green tea by micellar electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. A. 2003. V. 1011. P. 173-180.

130. J. Pazourek, G. Gonzalez, A.L. Revilla, J. Havel. Separation of polyphenols in Canary Islands wine by capillary zone electrophoresis without preconcentration // J. Chromatogr. A. 2000. V. 874. P. 111-119.

131. M. Vaher, М. Koel. Separation of polyphenolic compounds extracted from plant matrices using capillary electrophoresis // J. Chromatogr.A. 2003. V. 990. P. 225-230.

132. J.J. Dalluge, B.C. Nelson. Determination of tea catechins // J. Chromatogr. A.2000.V. 881. P. 411-424.

133. B.-L. Lee, C.-N. Ong. Comparative analysis of tea catechins and theaflavins by high-performance liquid chromatography and capillary electrophoresis // J. Chromatogr.A. 2000. V. 881. P. 439-447.

134. H. Tsuchiya, M. Sato, H. Kato, H. Kureshiro, N. Takagi. Nanoscale analysis of pharmacologically active catechins in body fluids by HPLC using borate complex extraction pretreatment // Talanta. 1998. V. 46. P. 717-726.

135. E. G. Yanes, S. R. Gratz, A. M. Stalcup. Tetraethylammonium tetrafluoroborate : a novel electrolyte with a unique role in the capillary electrophoretic separation of polyphenols found in grape seed extracts // Analyst. 2000. V. 125. P. 1919-1923.

136. J. P. Aucamp, Y .Hara, Z. Apostolides. Simultaneous analysis of tea catechins, caffeine, gallic acid, theanine and ascorbic acid by micellar electrokinetic capillary chromatography // J. Chromatogr. A. 2000. V. 876. P. 235-242.

137. B. Z'umreoglu-Karan. The coordination chemistry of Vitamin C: An overview // Coordination Chemistry Reviews. 2006 V. 250. P. 2295-2307.

138. A. Versari, A. Mattioli, G. P. Parpinello, S. Galassi. Rapid analysis of ascorbic and isoascorbic acids in fruit juice by capillary electrophoresis // Food Control. 2004. V. 15. P. 355-358.

139. J. Oszmianski, A. Wojdylo, J. Kolniak. Effect of Z-ascorbic acid, sugar, pectin and freeze-traw treatment on polyphenol content of frozen strawberries // LWT-Food Science and Technology. 2009. V. 42. P.581-586.

140. A.E. Martell, in: P.A. Seib, B.M. Tolbert (Eds). Ascorbic acid: Chemistry, Metabolism and Uses. Publisher: Advances in Chemistry Series 200, American Chemical Society. 1989. P. 152-156.

141. J. C. Deutsch. Review: Dehydroascorbic acid // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 299-307.

142. H. Iwase, I. Ono. Determination of ascorbic acid in food by column liquid chromatography with electrochemical detection using eluent for pre-run sample stabilization //J. Chromatogr. A. 1998. V. 806. P. 361-364.

143. M. J. Esteve, R. Farre, A. Frigola, J. M. Garcia-Cantabella. Determination of ascorbic and dehydroascorbic acids in blood plasma and serum by liquid chromatography // J. Chromatogr. B: Biomedical Sciences and Applications. 1997.V. 688. P. 345-349.

144. C. W. Klamplf, W. Buchberger, P. R. Haddad. Review: Determination of organic acids in food samples by capillary zone electrophoresis // J. Chromatogr. A. 2000. V. 881. P. 357-364.

145. Г.Б. Голубицкий, E.B. Будко, E.M. Басова, A.B. Костарной, B.M. Иванов. Устойчивость аскорбиновой кислоты в водных и водно-органических растворах для количественного определения // ЖАХ. 2007. Т. 62. № 8. С. 823-828.

146. F. Sahbaz, G. Somer. Determination of ascorbic acid in fruit and vegetables using normal polarography // Food Chemistry. 1992. V. 44. P. 141-146.

147. Л.Г. Шайдарова, И.А. Челнокова, A.B. Гедмина, Г.К. Будняков. Совместное вольтамперометрическое определение дофамина и аскорбиновой кислоты на электроде, модифицированном бинарной системой золото палладий // ЖАХ. 2009. Т. 64. № 1. С. 43-51.

148. E.M. Strochkova, Y.I. Kuselman, A. Shenhar. Simultaneous voltammetric determination of uric and ascorbic acids in urine // Talanta. 1997. V. 44. P. 1923-1928.

149. S. Wang, D. Du. Differential pulse voltammetry determination of ascorbic acid with ferrocene-X-cysteine self-assembled supramolecular film modified electrode // Sensors and Actuators B. 2004. V. 97. P. 373-378.

150. H. Horie, A. Nesumi, Т. Ujihara, К. Kohata. Rapid determination of caffeine in tea leaves // J. Chromatogr. A. 2001. V. 942. P. 271-273.

151. K.L. Rundlett, D.W. Armstrong. Examination of the origin, variation, andproper use of expressions for the estimation of association constants by capillary electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1996. V. 721. P. 173-186.

152. Пронин А.Я. Хроматографическое разделение глюкозы и фруктозы. Хроматография на благо России. М.: Издательская группа «Граница». 2007. 688 с.

153. Kim J.I., Hong S.B., Row К.Н. Effect of particle size in preparative reversed-phase high-performance liquid chromatography on the isolation of epigallocatechin gallate from Korean green tea // J. Chromatogr. A. 2002. V. 949. P. 275.

154. Л.А. Карцова, A.B. Алексеева. Влияние казеинов молока на содержание полифенолов в составе чая // ЖАХ. 2008. В. 63. № 11. С. 1107-1111.

155. Л.А. Карцова, А.В. Алексеева. Использование селективного комплексообразования катехинов с ионами Fe3+ при определении кофеина в чае методом ВЭТСХ // ЖАХ. 2009. Т.64. № 9. С. 954-958.