Электрофоретическое разделение и тест-определение L-α- аминокислот в водных и организованных средах тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

На правах рукописи

СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ Ь-а- АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ

02.00.02 - Аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 О НОЯ 2011

Саратов 2011

4859239

Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель:

доктор химических паук,

засл. деятель науки РФ, профессор

Чернова Римма Кузьминична

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Амелин Василий Григорьевич Владимирский государственный университет

имени А.Г. и Н.Г. Столетовых

кандидат химических наук, доцент Угланова Варсения Загидовиа Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского

Ведущая организация: Воронежский государственный университет

Защита состоится 01 декабря 2011 года в 16 ч. 00 мин на заседании диссертационного совета Д 212.243.07 по химическим наукам при Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская 83, СГУ, Институт химии, I корпус.

С диссертацией можно ознакомиться в ЗНБ им. В.А. Артисевич Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Автореферат разослан 30.10.2011 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, Т^-'У

доктор химических наук \ | Русанова Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Смеси а-аминокислот и сами аминокислоты являются эффективными добавками при производстве пищевых продуктов, применяются в фармацевтической промышленности как препараты для спортивного и парэнтерального питания, при профилактике и лечении различных заболеваний. В связи с тем, что терапевтический эффект достигается при соответствующей концентрации аминокислот, содержание последних в продуктах питания и лекарственных препаратах строго нормируется.

Одной из актуальных задач аналитического контроля производства и применения аминокислотных препаратов является надежное определение этих биологически активных веществ в их смесях. Задача является одной из приоритетных в аналитической химии, и осложнена тем, что в смешанных растворах аминокислот могут протекать разнообразные побочные процессы, в результате чего образуется сложная многоионпая смесь, затрудняющая разделение и определение этих веществ.

Актуальна также разработка простых и дешевых тест-методов определения а-аминокислот, что востребовано при предварительных скринин-говых обследованиях многочисленных объектов на содержание аминокислот, поскольку в этих случаях применение прецизионных, дорогостоящих и сложных методов определения, таких как капиллярный электрофорез, ВЭЖХ экономически не оправдано и технически не реализуемо. В настоящее время тест-определения аминокислот практически не проводятся, т.к. на данный момент известна лишь одна фирма, производящая тесты на а-аминокислоты (Германия), основанные на принципе иммуноферментно-го анализа. Из обзора литературы следует, что тест-системам посвящено лишь около 1% исследований.

Решение указанной проблемы возможно с применением зонального электрофореза на целлюлозной поддерживающей среде, поскольку с одной стороны, это «мягкий» метод разделения, что важно в случае лабильных органических соединений, с другой - получение электрофореграмм с разделенными аминокислотами позволяет применять современные сканер-технологии, цветометрию, спектроскопию диффузного отражения для количественного определения аминокислот непосредственно на электрофо-реграмме. Варьирование факторов среды может послужить инструментом для направленного изменения селективности разделения аминокислот методом зонального электрофореза и таким образом обеспечить получение избирательных электрофоретических тестов на отдельные аминокислоты. Работы в этом направлении до настоящего исследования систематически не проводились.

Работа является частью плановых госбюджетных исследований кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ, а также выпол-

иена в соответствии с проектом Российского фонда фундаментальных исследований № 04-03-33-077.

Цель работы состояла в изучении закономерностей элекТрофорети-ческого разделения двадцати а-амйнокислот на целлюлозной матрице в водных и организованных средах и разработке на основе полученных результатов тест-методов определения отдельных аминокислот в их смешанных растворах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- установить взаимосвязь между электрофоретическим поведением а- аминокислот и состоянием их в водных и организованных средах;

- теоретически обосновать дифференцирующий эффект организованных сред на основе ПАВ при электрофоретическом разделении а-ами-нокислот;

- применить сканер-технологии и спектроскопию диффузного отражения для количественной оценки электрофоретических тестов;

- оценить эффект перезарядки цвиттерионных форм а-аминбкислот в смешанных растворах и влияние этого фактора на результаты электро-форетического разделения;

- представить примеры применеиия разработанных электрофоретических тестов для определения аминокислот в объектах.

Научная новизна исследования.

Установлено, что определяющими факторами при разделении смесей аминокислот в водных средах (рН =1,6) является отношение заряда аминокислоты к массе г/т и знак заряда, регулируемые с помощью рН-фактора.

Показана зависимость параметров эффективности элекгрофоретиче-ского выделения аминокислот от их состояния в растворе: с увеличением рН уменьшается элёктрофоретическая подвижность всего ряда аминокислот; изменяется направление движения ди-аниопов аминокислот.

, Впервые разработаны схемы электрофоретического выделения отдельных аминокислот, а также групп основных и кислых аминокислот из смешанных растворов. ■

Исследована природа дифференцирующего действия организованой среды на электрофоретическое разделение аминокислот с позиций электростатических и гидрофобнь1х взаимодействий. Подтверждено соблюдение. правил,а Гартли и доказано участие гидрофобных взаимодействий ряда аминокислот с мицеллами аПАВ (образование смешанных 'мицелл). Рассчитаны константы связывания и константы распределения аминокислот с мицеллами додецйлсульфата натрия. Предложена схема локализации аминокислот разных групп в мицеллах анионных поверхностно-активных веществ. ' ■■■-'•-■■ ■..■< Г'- > . .. , . ,.;■ ^ . ^ .

На основании изучения электропроводности, величин рН и показателя преломления в смешанных водных растворах систем: валин -. лизин, аланин - лизин, валин - аргинин, аспараг'иновая кйслота - ар'гинин и'обра-

богки полученных данных методом дисперсионного анализа показана возможность протекания процессов перезарядки цвиттериоиных форм аминокислот по типу: кислота-основание Бренстеда.

Разработана композиция на основе нингидрина и технология ее нанесения на электрофореграмму для визуализации аминокислот.

На основании установленных закономерностей разработаны методики электрофоретичееких тест-определений 8 аминокислот в объектах смешанных растворах аминокислот с близкими значениями изоэлектрических точек, фармацевтических препаратах, производственных растворах.

Применены методы цветометрии и спектроскопии диффузного отражения для количественной оценки визуализированных электрофоретичееких тестов.

Практическая значимость работы.

Найденные закономерности электрофоретического поведения а-ами-нокислот позволяют прогнозировать возможность их разделения в смешанных растворах.

Разработаны методики получения электрофоретичееких тестов на аминокислоты и показана возможность количественной оценки содержания аминокислот в смесях методами цветометрии и спектроскопии диффузного отражения.

Даны примеры практического применения разработанных тест-методик для оценки качества фармпрепаратов, разделения а-аминокислот с близкими значениями р1, определения пищевой ценности кормов, идентификации групп основных и кислых аминокислот в смешанных растворах.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты влияния рН-фактора на электрофоретическое разделение а-аминокислот в водных средах;

- дифференцирующий эффект организованной мицеллярной среды как фактор повышения избирательности электрофоретического разделения а-аминокислот;

- результаты применения сканер-технологии и спектроскопии .диффузного отражения для количественного определения разделенных а-аминокислот на электрофореграммах;

- методики проведения индивидуального и группового электрофоретического тестирования а-аминокислот в смешанных растворах;

- примеры использования электрофоретичееких тестов для определения а-аминокислот в объектах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях: XVIII Менделеевском Конгрессе по общей и прикладной химии (Москва, 2007); II Всероссийской конференции «Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2007);,XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008);

VIII Украинскойконференции по аналитической химии с международным участием (Одесса, 2008); II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008); съезде аналитиков России «Аналитическая химия -новые методы и возможности» (Клязьма, 2010); Всероссийской научной молодежной школе-конференции «Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии» (Омск, 2010); VII Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2010); IV Международной конференции «Экстракция органических соединений ЭОС -2010» (Воронеж, 2010); VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2011); V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научной школе по аналитической химии (Краснодар, 2011).

Объем и структура работы. ■'

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста. Структура работы включает введение, 7 глав, выводы и список цитируемой литературы (232 наименования). В работе содержатся 32 рисунка й 40 таблиц!

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложена новизна, практическая значимость полученных результатов и основные положения, вынесенные на защиту.

В первой главе представлено обобщение литературных данных по методам определения а-аминокислот. Дана их критическая оценка и отмечены перспективные направления дальнейшего развития.

Во второй главе указаны реактивы и оборудование, использованные в работе, техника проведения эксперимента.

В работе исследовано 20 препаратов L-a-амииокислот (New Jersey, USA), содержащих основного вещества 99% (глицин, глутаминовая кислота, тирозин, héñ^miy юолейцйн, валин, пролин, серин, метионин, аспара-гиновая кислой, глутамйн, аспарагин, триптофан, аланин), 98,5% (фени-лаланин) и 98% (аргинин, цистеин,'треонин, гистидин, лизин). Препараты хранили в защищенном от света месте при температуре не выше 15°С. В качестве целлюлозной поддерживающей среды при проведении электрофореза применяли Ьбеззоленную фильтровальную бумагу (ТУ 6-09-167895, Россия). ■ ' ' ■ -

Иcпoльзoвäлй: (шнгидрин (х.ч.);'йзати;и (ч., ТУ 2684-51); цетшгаири-диний хлористый одноводный (ЦПХ) (x.tiV, ТУ-6-09-15-121-74); додецил-сульфат натрия (ДДС) (х.ч., ТУ 6-09-64-70); tpinoii Х-305 (solution - 70% in water, Fluka. Швейцария); декстран (ч.); бромфеноловый синий (х.ч.);

ацетон (х.ч.); этанол (ГОСТ 18300-83); изо-бутанол (ч., ГОСТ 6016-72); амиловый спирт (ч., МРТУ 6-09-5531-68); хлороформ (х.ч.); бутанол-1, (ч.д.а., ГОСТ 6006-78); сульфат меди(П) ( х.ч., ГОСТ 4165-78); уксусную кислоту ледяную (х.ч.); кислоту хлороводородную (х.ч., ГОСТ 3118-77); аммиак водный (ч.д.а., ГОСТ 3760-79); кислоту лимонную (ч.д.а., ГОСТ 908-79); натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-и водный (ч.д.а,, ГОСТ 4172-76); гидроксид натрия (х.ч., ГОСТ 4328-77); гидроортофосфат натрия (х.ч).

Электронные спектры поглощения и спектры диффузного отражения в видимой области регистрировали на спектрофотометре SHIMADZU UV-2550. Электропроводность водных растворов аминокислот измеряли на лабораторном комплексе «УЛК Химия». Для измерения коэффициента преломления использовали рефрактометр Аббе УРЛ-1.

Потенциометрические титрования проводили с помощью рН-метра -иономера типа рХ-150МП. В качестве индикаторного электрода применяли стеклянный электрод, электрод сравнения - хлоридсеребряный электрод. Препараты веществ взвешивали на весах аналитических общего типа WP-11 второго класса точности с наибольшим пределом взвешивания 100 г. по ГОСТ 24104-88Е и на электронных прецизионных весах «ACC'ULAB»Vic-410d2. Дискретность 0,01, диапазон рабочих температур 10-30°С. Значения pH растворов измеряли с помощью рН-метра рХ -150МП и рН-метра - милливольтметра марки pH—121 со стеклянным электродом. Количественное определение аминокислот на визуализированных электрофореграммах проводили цветометрически с помощью обработки цифровых изображений в программе Photoshop 7.0. Для получения цифровых изображений, электрофореграммы сканировали с помощью сканера i-SENSYS MF 4018. Полученные изображения обрабатывали с помощью программы DENSITOMETR на денситометре «Сорбфил» ЗАО СОРБПО-ЛИМЕР г. Краснодар. Электрофореграммы сушили в сушильном шкафу СНОЛ (интервал рабочих температур 0-300°С). Для проведения электрофореза использовали стандартный прибор, состоящий из двух электродных сосудов и устройства для поддержания полосок в горизонтальном положении между сосудами. В качестве электродов применяли медно-графитовые электроды. Для предотвращения чрезмерного испарения растворов всю систему помещали в закрытую камеру для обеспечения влажной атмосферы насыщенных паров. Бумагу (размером 30x3 см2) смачивали буферным раствором, удаляли излишки раствора, промокая чистой фильтровальной бумагой, помещали на стекляЕШые подставки и концы погружали в сосуды с одинаковым уровнем буферного электролита. Пробу 10 мкл наносили дозатором либо непосредственно на линию старта, либо на «платформу» в виде круга из той же фильтровальной бумаги диаметром 0,5-1,0 см, расположив его на линии старта. Камеру закрывали и подключали к источнику постоянного тока. Условия проведения электрофореза:

напряжение 360 В, сила тока 8-10 мА, время электрофореза 0,5-2 ч. Полученные бумажные полоски сушили в сушильном шкафу 10-15 мии при 100°С. Затем высушенные электрофореграммы с помощью пульверизатора обрабатывали соответствующими визуализирующими растворами (один или два раза в зависимости от типа аминокислоты) и снова высушивали при той же температуре в течение 15 мин. Таким способом получали аналитическую форму, которую в дальнейшем исследовали с помощью спектроскопии диффузного отражения. Концентрацию образующейся аналитической формы находили, используя функцию Кубелки-Мунка (F) при длине волны максимального поглощения, а также, на основании цветомет-рИЧеских и денситометрических измерений. Использовали лекарственные формы «Элтацин», «Глицин», «Метионин».

В третьей главе приведены результаты предварительных исследований и данные по оптимизации параметров получения электрофоретиче-ских тестов. Рассмотрена возможность применения стандартной фильтровальной бумаги (ТУ 6-09-1678-95, Россия) в качестве поддерживающей среды при разделении а-аминокислот методом зонального электрофореза для последующего тест-определения. Показано, что применение «платформы» для нанесения пробы на тест-полосу формирует профиль электрофореграммы (пятно, зона) и снижает се размывание. Установлено, что для электрофоретического разделения а-аминокислот в кислой среде эффективен ведущий электролит на основе 30% СНЗСООН (pH = 1,6), который обеспечивает достаточную электропроводность раствора и хорошую подвижность а-аминокислот. ■

Исследованы способы визуализации а-аминокислот на электрофорс-граммах с помощью нингидрина и композиций па его основе. Проведена оптимизация процесса визуализации разделенных в кислой среде а-аминокислот с помощью предложенной композиции ( ниигидрин, цетил-пиридиний хлорид, буферный раствор, рН=8,5) и технологии ее напесепия на электрофореграмму.

Методом спектроскопии диффузного отражения изучены аналитические формы на электрофореграммах, образуемые аминокислотами с пип-гидрином (рис. 1) и композициями на его основе (комплексы с ионами металлов, ПАВ в разных буферных средах). Показано, что при визуализации растворами нингидрина зон аминокислот, выделенных электрофорстиче-ски в кислых средах.на бумажной основе, образуется смесь двух аналитических форм с преобладанием дикетогидринденкетогидрипамина пурпура Руэмана (520 нм), неустойчивого на воздухе, и гидриндантииа, что приводит к нестабильным результатам. При визуализации разработанной композицией на основе нингидрина образуется одна устойчивая аналитическая форма (580 нм), что приводит к получению стабильных воспроизводимых результатов при получении.'тестов.

Рис. 1. Спектры диффузного отражения продуктов взаимодействия гисти-дина с ыингидрипом (0,1% водный раствор) на бумажной матрице после элект-рофоретического выделения разных концентраций гистидина, моль/л: 0- холостой раствор; / - 5-Ю"4; 2-7-10"4; 5-МО"3; ^ - 210~3; 5-З-Ю"3; б-5-Ю"3; 7- 710"3; МО"2

Рассмотрены методологические подходы к оценке величин относительных подвижностей, параметров эффективности и селективности элек-трофоретического разделения аминокислот на целлюлозой поддерживающей среде.

Четвертая глава посвящена изучению закономерностей влияния протолитических свойств аминокислот на их электрофоретическое поведение. Постановка вопроса обусловлена тем, что амфотерные аминокислоты могут выступать в роли катионов, анионов, имеют изоэлектрическую точку и суммарный заряд таких веществ зависит от рН среды в широком диа-

пазоие. Следовательно, имеются предпосылки для выявления условий, при которых возможно электрофоретическое разделение аминокислот с целью их тест-определения непосредственно на бумажной матрице.

Исследовалось влияние рН на знак и величину заряда, Мг аминокислот, электроосмотический поток, адсорбцию на фильтровальной бумаге, а также «ток буфера» и время электрофореза.

Результаты систематического изучения электрофоретического поведения 20-и а-аминокислот в уксуснокислых средах (рН=1,6) представлены на рис.2.

/, см

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12. 13 14 15 16 17 18 19 2.0

Номер аминокислоты

Рис. 2. Подвижность а-аминокислот (30% СН3СООН, рН = 1,6) (в скобках указан параметр г/Мг): 1 - глицин (13,3); 2 - аланин (11,2); 3 - серии (9,5); 4 - валин (8,5); 5 - треонин (8,4); 6 - цистеин (8,3); 7 - пролин (8,1); 8 - лейцин (7,6); 9 - изолейцин (7,6); 10 - аспарагин (7,6); 11- аспарагиновая кислота (7,5); 12 - лизин (13,7); 13 - глутамииовая кислота (6,8); 14 - глутамин (6,8); 15 - ме-тионии (6,7); 16 - гистидин (12,9); 17 - фенилаланин (6,1); 18 - аргинин (12,0); /9-тирозин (5,5); 20 -триптофан (4,9)

Анализ электрофоретического поведения а-аминокислот в зависимости от рН позволил выявить три основные тенденции:

1. В сильнокислых средах управляющим фактором электрофоретиче-ской подвижности катионов аминокислот является параметр 2/Мг максимальный для глицина, аланипа и группы основных аминокислот (см. рис. 2).

■ 2. В области существования цвиттерионных форм аминокислот (рН = 4-8) электрофоретическая подвижность катионов большинства аминокислот, за исключением группы основных, уменьшается и разделение их

становится невозможным. Пределом является нулевая подвижность в области изоэлектрических точек.

3. Особое поведение ди-анионов аспарагиновой и глутаминовой кислот (рН = 4,5-8), когда лишь два ди-аниона мигрируют к аноду, их высокая подвижность создают предпосылки для избирательного отделения аспарагиновой и глутаминовой кислот от всех остальных аминокислот (рис. 3).

I, см

-3

-4

Номер аминокислоты

Рис. 3. Подвижность а-аминокислог (рН = 5,2; цитратно-фосфатный ведущий электролит): 1 - глицин; 2 - аланин; 3 - серии; 4 - валин; 5 -треонин; 6 - цистеин; 7 - пролин; 8 - лейцин; 9 - изолейцин; 10 — аспарагин; 11- аспара-гиновая кислота; 12 - лизин; 13 - глутаминовая кислота; 14 - глутамин; 15 - ме-тионин; 16 - гистидин; 17- фенилаланин; 18 -аргинин; 19 -тирозин; 20- триптофан

Исследовалась возможность электрофоретического разделения бинарных и многокомпонентных смешанных растворов аминокислот. Во всех случаях аминокислоты с высокими индексами Ъ!Ых четко отделялись от сопутствующих аминокислот (табл. 1).

Был применен цветометрический метод для количественной оценки выделенных аминокислот. Применение композиции на основе иингидрида позволило получить сходимые результаты, правильность которых проверялась методом «введено-найдено» (табл.2).

Обнаружено, что в кислых средах (рН = 1,6) мешающее взаимное влияние наблюдается лишь для группы основных аминокислот, представители других групп - даже в соотношении 1:10 мешающего влияния не оказывают (табл.3).

Тсб.чица I

Метрологические характеристики цветомегрического определения а-аминокислот

№ п/п Смеси аминокислот ' Определяемая аминокислота Условия отделения Диапазон определяемых содержаний мг/см3

1 Глицин, серин, пролин, цистеии, изолейцин, аспарагиновая кислота, фенилаланин, триптофан, лизин лизин pH=l,6; U=360 В; (30% СНзСООН) 1=1ч; 1=10 мА; Сисх=1 • 10~2М, НС1 IAK: Lys=l:l «-0,39

2 Глицин, глутаминовая кислота, тирозин, лейцин, валил, аланин, треонин, гистидин гистидин рН=1,6; U=340 В; (30%СН3ССЮН) t=¡4; 1=8 мА; Сисх=1- lo'2 M, НС1 I АК: His=l:l 46-0,78

3 Глицин, серин, глута-мин, тирозин, валин, аланин, фенилаланин,треонин, аргинин аргинин рН=1,6; U=520 В; (30%СН3СООН) t=24;I=l,5"2 мА; Сисх=1- 10~2М, I АК: Arg=l:l 52-0,87

4 Аланин, фенилаланин аланин, фенилаланин рН=1,6; U=520 В; (30%СН3С0011) 1=2ч; 1=1,5-2 мА; Сисх=1- Ю~2М, НС1 I Ala: Phl=l:l 26 0,45 49-0,83

■So ■о : Алании, триптофан аланин, триптофан рН=1,6; U=520 В; (30%СН3СООН) t=2Li; 1=1,5 2 мА; Сисх=1' 10~2 M, НС1 I Ala: Тгр=1:1 • 27-0,45 50-0,83

'6 IK?; Лизин, глутамин лизин, глутамин рН=8,9; U=290 В; (Na2B407 10Н20 НС1 ) t=20 мин; 1=1,5-2 мА; S Lys : Gin =1:1 53-0,28 44-0,74

7 Лизин, аспарагиновая кислота лизин (к) аспарагиновая1 кислота (а) р№=8,9; U=290 В; (Na2B407 10Н20 ' НС1 )4=20 мин; 1-1.5 2 мА; S Lys : Asp= 1:1 53-0,28 40-0,67

Таблица 2

Проверка правильности цветометрического определения аминокислот после электрофоретического отделения из смешанных растворов (п=3, р=0,95)

Введено, мг/см3 Найдено, мг/см3 (после отделения) Правильность, % Бг

ЛИЗИН смесь 9 аминокислот

1,0 0,9±0,2 90 0,09

1,4 1,53±0,09 109 0,08

10 9,5±0,9 95 0,04

2,0 2,2±0,3 110 0,05

АЛАНИИ смесь А1а - РЫ

1,0 1,1 ±0,2 110 0,09

2,0 2,2±0,5 110 0,08

0,14 0,16±0,03 114 0,06

ГИСТИДИН смесь 7 аминокислот

3,0 3,1 ±0,2 103 0,03

.20 23±5 115 0,08

0,45 0,48±0,03 107 0,05

АРГИНИН смесь 8 аминокислот

1,0 0,9±0,3 90 0,08

40 42±4 105 0,09

5,0 5,3±0,6 106 0,005

0,15 0,17±0,04 113 0,07

Таблица 3

Мешающее влияние аминокислот при цветометрическом определении (после электрофоретического отделения) лизина (рН=1,6) (п=3, р=0,95)

Аминокислота Отношение Ьуэ : аминок-та Введено Ьув, мг/см3 Найдено Ьуэ, мг/см3 Правильность %

Валин 1:1 1,46 1,40±0,04 106

1:10 1,46 1,42±0,03 97

Серии 1:1 1,46 1,42±0,05 97

1:10 1,46 1,44=0,04 98

Пролии 1:1 1,46 1,48±0,06 101

1:10 1,46 1,43±0,02 98

Окончание табл. 3

Аминокислота Отношение Ьуз : аминок-та Введено Ьуя, мг/смЗ Найдено Ьуя, мг/смЗ Правильность %

Цистеин 1:1 1,46 1,40±0,04 96

1:10 1,46 1,49±0,07 102

Лейцин 1:1 1,46 1,50±0,04 103

1:10 1,46 1,44±0,08 99

Аспарагиновая 1:1 1,46 1,52±0,04 104

кислота 1:10 1,46 1,58±0,04 108

Триптофан 1:1 1,46 1,51±0,06 103

1:10 1,46 1,54±0,05 105

Аргинин 1:1 1,46 1,99±0,08 156

1:10 1,46 2,74±0,07 180

Гиетидин 1:1 1,46 2,04±0,05 140

1:10 1,46 2,90±0,06 200

Замечено, что в области существования цвиттер-иоииых форм увеличение концентрации разделяемых аминокислот (исходная концентрация 1.104 и более) приводит к блокированию процессов разделения при наличии в смесях основных, нейтральных и кислых аминокислот, что выражается в заниженной концентрации выделяемых аминокислот.

Можно было полагать, что увеличение концентрации аминокислот в смешанных растворах приводит к появлению побочных процессов. Для выяснения возможных взаимодействий между аминокислотами в таких системах было проведено изучение ряда физико-химических параметров смешанных растворов.

Пятая глава посвящена физико-химическому изучению смешанных водных растворов а-аминокислот. Диссертант отмечает, что при решении задач элсктрофоретического разделения смесей а-аминокислот (бинарных и многокомпонентных) весьма важна информация о влиянии кнцентраци-онного фактора на состояние аминокислот, тем более что имеются сведения о возможных взаимодействиях цвиттерионых форм лизина и глицина в смешанных водных растворах. В связи с этим представляло интерес исследовать вопрос о том, насколько явление перезарядки цвиттериоггных форм универсально, имеет ли оно место в смесях аминокислот других групп и в каком концентрационном интервале, а также определить, имеет ли это явление отношение к электрофоретическому разделению смесей аминокислот.

Для исследования были выбраны четыре модельные системы сме-шанньЫ/водных растворов: валин - лизин, аланин - лизин, валин - аргинин и аспарагиновая кислота - аргинин. Выбор указанных систем был обусловлен тем, что лизин и аргинин являются представителями основных аминокислот, аланин и валил - нейтральных, аспарагиновая кислота -

«кислых» и, следовательно, в таких системах возможен в определенных условиях прогонный перенос. Измеренные параметры смешанных растворов: электропроводность, рН, коэффициент преломления в зависимости от концентрации приведены в табл. 4. Полученные результаты обрабатывались с помощью дисперсионного анализа.

Таблш/а 4

Исходные значения найденных параметров электропроводности, рН, п

№ Уа1 Ьуй к, кОм '-см 1 рН п

1 0 0 0,009 5,79 1,3330

2 0 0,016 0,263 9,92 1,3329

3 0 0,125 0,480 10,16 1,3353

4 0 0,5 1,521 10,26 1,3350

5 0,016 0 0,012 6,39 1,3330

6 0,016 0,016 0,457 9,43 1,3329

7 0,016 0,125 1,001 9,98 1,3355

8 0,016 0,5 1,599 10,26 1,3550

9 0,125 0 0,045 6,31 1,3520

10 0,125 0,016 0,682 .8,84 1,3530

11 0,125 0,125 1,440 9,61 1,3383

12 0,125 0,5 2,425 9,93 1,3420

13 0,5 0 0,092 6,35 1,3402

14 0,5 0,016 0,932 8,20 1,3409

15 0,5 0,125 2,510 9,02 1,3415

16 0,5 0,5 3,612 9,23 1,3499

Наиболее сильное влияние на изменение электропроводности оказывает лизин, изменение уровней валина практически не приводит к увеличению электропроводности, что отражено на рис. 4. Эти явления находят объяснение, если рассмотреть состояние ионов лизина и валипа при рН = 6-7. Согласно диаграммам распределения ионных форм аминокислот, при значениях рН = 6-7 преобладают практически полностью цвиттсрионные формы аминокислот: Уа1± и Ьув2±. Из этого следует, что валип, находясь в виде биполярного иона при рН, близком к его изоэлектрической точке, практически не является электролитом, что подтверждается также резким уменьшением подвижности этого иона, наблюдаемом нами при электрофорезе, в отличие от кислой среды, когда валин является катионом. Лизин же, напротив, будучи цвиттерионом, но с преобладанием положительного заряда (две протопирусмые аминогруппы), является'достаточно сильным электролитом, что и наблюдается на эксперименте. Таким образом, более сильное влияние уровней лизина в проведенном эксперименте является закономерным.

Эффект oí изменения уровня фактора

Рис. 4. Зависимость главных эффектов от факторов А и В: / - эффект от изменения концентрации валима; 2 - эффект от изменения концентрации лизина

На рис. 5 показано изменение средней электропроводности при разных сочетаниях уровней валина и лизина. Из представленных данных следует, что наиболее сильное влияние концентрации лизина на величину электропроводности проявляется при высоких концентрациях валина. Это свидетельствует о том, что при высоких концентрациях валина становится существенным вклад реакции

Val1 + Lys* «-+ Val" + Lys+ ( 1 )

в процессы ионизации аминокислот. При небольших количествах валина в растворе основными реакциями ионизации лизина являются реакции с участием молекул воды и их недостаточно для обеспечения высокой электропроводности раствора.

Рис. 5. Влияние изменения концентрации Ь-лизииа (уровни фактора 0-3) на электропроводность смешанного раствора валина и Ь-лизина при различных уровнях концентрации валина. Уровни фактора валина отвечают концентрациям, М: 0-0; /-0,016; 2-0,125; 5-0,5

Таким образом, в водных растворах указанных аминокислот возможно образование амфолита - цвиттериона Lys* с выраженной щелочной функцией (pi 9,80} и цвиттериона валима с выраженной кислотной функцией (pl 6,02). В смешанном растворе таких кислот возможна реализация реакции, связанной с переносом протона от цвиттериона валина как кислоты Бренстеда к цвиттсриону лизина как основанию Бренстеда с образованием анионов валина и катионов лизина.

На основании изложенного можно полагать, что реакция (1) может быть ответственна за изменение электропроводности в обсуждаемых смешанных растворах, поскольку из двух цвиттерионов образуются две заряженные частицы.

Аналогичные закономерности наблюдались и для других исследованных систем.

В шестой главе исследуются особенности электрофоретического разделения а-аминокислот в организованных средах на основе анионных ПАВ. Установлено, что наличие в буферном электролите (30% СТЬСООН, рН=],6) мицеллярных концентраций ДДС (15-20 мМ и более) приводит к резкому изменению электрофоретического поведения исследуемых аминокислот (рис. 6).

Тгр

Gis ï.i-u

Ai-g

-4

-S

Sci

I I

As|>

Tip

Tvr Val

ГШ

Tvr I Vi" I !<'" .Via

Ilis

Mi-t

Рис. 6. Дифференцирующий эффект организованной среды ДДС

При этом десять аминокислот (аспарагиновая и глутаминовая кислоты, серин, цистеин, глицин, пролин, треонин, аланин, глутамин, аспарагин) мигрируют, как и без добавок ДДС, к катоду, сохраняя положительный заряд. Четыре аминокислоты (метионин, валин, тирозин, лизин) практически остаются па линии старта, однако .при минимальных мицеллярных концеи-

трациях ДДС. они имеют тенденцию несколько перемещаться к катоду, а при увеличении мицеллярной концентрации ДДС слегка перемещаться к аноду, в целом балансируя на линии старта. Шесть аминокислот (гистидин, лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, аргинин) интенсивно перемещались к аноду, обнаруживая изменение знака заряда на противоположный. Таким образом, по своему элсктрофоретическому поведению исследуемые аминокислоты подразделяются на три группы.

Наблюдаемый факт представляет интерес как с точки зрения дополнительной возможности электрофоретического разделения смесей аминокислот, так и с точки зрения оценки электростатического и гидрофобного факторов при взаимодействии аминокислот с ионной мицеллой. Такие взаимодействия представляют также общехимический интерес, поскольку в определенной мере могут моделировать взаимодействие аминокислот с биологическими мембранами.

Для дальнейшего проведения экспериментов были выбраны представители аминокислот трех электрофоретически дифференцированных групп: серии, глицин, пролин, треонин - катонные формы; метионии, ва-лин, тирозин, лизин - локализация на линии старта; лейцин, гистидин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, аргинин - перезарядка ионов и движение к аноду. Исследовалось влияние мицеллярных псевдофаз ДДС на величины рК ионизации указанных аминокислот.

Исследовались процессы ионизации аминокислот по карбоксильной и аминогруппам постадийно в разных средах. Проводились три варианта титрований: водных 0,01 М растворов аминокислот: без добавок, с добавками фонового электролита KCl (для создания ионной силы раствора 1=0,1) и в мицеллярной среде с концентрацией ДДС 0,1 М. Тиграптом служил 0,1 М раствор HCl. Типичная кривая титрования приведена па рис. 7.

HCL v, мл КОН

Рис.7. Типичная кривая потенциометрического титрования аминокислоты: / - в водной среде и с добавкой KCl; 2 - в мицеллярной среде ДДС

Ниже приводятся полученные результаты и дан расчет значений рК ионизации СООН-групп аминокислот.

Кривые титрования в мицсллярных средах характеризуются сдвигом рК в сторону больших значений, что является следствием сорбцисй мицеллой положительно заряженной формы аминокислоты и сдвигом равновесия (1) вправо. Обобщенные данные для исследованных аминокислот приведены в табл.5.

II II - +___II ■ Н

Н,С-С-С-COO + Н ILC-С—С-C001I (1)

I +l I + 1

(11, NH3 СП, N11,

Таблица 5

Сравнительная характеристика сдвигов величин рК ионизации -СООН группы исследованных аминокислот в мицеллярных средах ДДС, водных средах

и в присутст вии фонового электролита KCI (п=3, г=0,95)

№ Аминокислоты рКа™ рКака рКаа№ АрК

и/и рКаа|,|,-рК;* рК/|,р-рКакп

1 Валим 2,25±0,08 2,32±0,03 3,94±0,06 1,69 1,62

2 Изолейцин 2,23±0,07 2,20±0,09 4,24±0,07 2,01 2,04

3 Пролип 2,13±0,06 2,17±0,04 3,31 ±0,09 1,18 1,14

4 Метионин 2,25±0,03 2,26±0,04 4,04±0,08 1,79 1,78

5 Фенилаланин 2,23±0,10 2,26±0,07 4,86±0,10 2,63 2,60

6 Глицин 2,38±0,05 2,35±0,07 3,74±0,09 1,36 1,39

7 Серии 2,25±0,08 2,28±0,10 3,75±0,11 1,5 1,47

Разница в величинах АрК ионизации аминокислот но карбоксильной группе для водных и организованных сред ДДС представлена также в табл. 6. Наиболее сильное взаимодействие мицеллярной псевдофазы ДДС наблюдается с феиилаланипом и изолейцином ( лрк составляют соответственно 2,60 и 2,04), затем с метионином и валином (лрк составляют соответственно 1,78 и 1,62) и наиболее слабое взаимодействие отмечено соответственно для серина, глицина и пролина (1,47; 1,39; 1,14), хотя в целом фактор ми-целлярного воздействия ДДС достаточно велик и хорошо воспроизводим для всех исследованных а-амииокислот. Отметим, что полученные результаты согласуются с наблюдаемыми электрофоретическими эффектами дифференциации электрофоретического поведения а-аминокислот. Так, именно фенилаланин и изолейцин, наиболее сильно взаимодействующие с мицеллами ДДС, изменили направление движения (вместо катода к аноду). Более слабые взаимодействия метионина и валина с'мицеллами ДДС проявились в том, что эти аминокислоты существенно понизили свой положительный заряд, присущий им в кислой среде, и оказались на линии старта. И, наконец, наиболее слабые взаимодействия серипа, глицина и пролина с

Таблица 6

Связь параметров гидрофобное™ аминокислот с элекгрофоретическим поведением*

№ п/п Аминокислота Кв Рт/м Положение на электро-фореграмме ДрИ"1"' Коэф. распределения аминокислоты в системе п-окганол / Н20 п-Ю~3

1 Валии 7,28 27,57 старт 3,94 ± 0,06 5,9

2 Лейцин 9,00 34,09 А 4,24 ± 0,07 30

3 Пролин 5,20 19,70 3,31 ±0,09 3,1

4 Серии 4,87 18,45 ->К 3,75 ±0,11 0,5

5 Метпопин 6,36 24,09 старт 4,04 ± 0,08

6. Фенилаланин 7,59 28,75 -> А 4,86 + 0,10 50

7 Глицин 4,35 18,59 ->К 3,74 ± 0,09 0,62

* А - анод, К - катод, —> — направление миграции иона

мицеллами ДДС не привели к существенному изменению нх суммарного заряда, о чем свидетельствует их высокая подвижность и по-прежнему миграция к катоду.

Таким образом, можно полагать, что анодно-ориснтированные аминокислоты в силу выраженного гидрофобного взаимодействия, могут образовывать смешанные мицеллы с ДДС; аминокислоты нулевой подвижности скорее всего располагаются в области двойного электрического слоя; катодпо-ориентированные аминокислоты находятся в диффузной области двойного электрического слоя (рис.8).

Рис. 8. Вероятная схема взаимодействия аминокислот с мицеллой ДДС

В главе 7 описывается практическое применение разработанных электрофоретических тестов на а-аминокислоты. Проведенные исследования легли в основу разработки методик определения: основного вещества в лекарственных формах аминокислот; технологически важной аминокислоты тпипто(Ьа1 ш в смеси кислот (ли^ии. мотиоптм^ трсонип., трнгггосЬп.п),

применяемой в качестве кормовой добавки; аминокислот с близкими значениями изоэлектричсских точек в их смешанных растворах и создания тест-бумаг для избирательной идентификации пролина и триптофана в смеси аминокислот.

Возросшие в последнее время объемы фальсификации лекарственных средств сделали актуальной задачу разработки тест-способов определения аминокислот в фармацевтической продукции. Разработаны методики определения содержания основного вещества в препаратах «Глицин», «Метионин», «Элтацин». В случае первых двух препаратов разделения аминокислот не требовалось, отделялись лишь вспомогательные вещества таблеток. В случае элтацина требовалось разделение глицина и глута-миновой кислоты, которое проводилось вначале путем электрофореза препарата в кислой среде (отделение и определение глицина), затем при рН=5,6 (отделение и определение глутамиповой кислоты). В случае лекарственных форм основные этапы анализа включали пробоподготовку препаратов, электрофоретическое выделение основного вещества, визуализацию и определение концентрации аминокислоты цветомстрическим методом (табл.7).

Таблица 7

Результаты определения аминокислот в лекарственных препаратах (п=3, р=0,95)

Лекарственный препарат Определяемая аминокислота Содержание г/таб.

по данным производителя тест-методом спектрофого-' метрически

«Метионин» Метионин 0,25 0,23 0,245

«Глицин» Глицин 0,1 0,9 0,86'

«Элтацин» Глицин, % 32,0 29,9 31,2

Ь-глутаминовая кислота, % 31,7 32,8 31,1

Применение мицеллярных сред было необходимо при1 разделении технологических аминокислот: в кислых средах отделялся лизин','мигрируя к катоду, в то время как триптофан мигрировал к аноду и также хорошо выделялся из смеси. Разделение смесей аминокислот с близкими значениями изоэлектричсских точек (табл. 8) также проводилось в мицеллярных средах. . . •• •

•■•,, , Таблица Я

Разделение аминокислот с близкими значениями р!

Состав смешанных растворов | Параметры эффективности разделения

Аминокислота . Направление движения /1, см ¡2, СМ '■■ Ы- - ■

Смесь N9 1 ■ _ -.

Пролин* Валин 6,30 | К ( ) . , 6,02 1 старт '• .2,6 0,1 300; 33.4

Окончание табл. 8

Состав смешанных растворов Параметры эффективности разделения

Аминокислота рЗ Направление движения см 12, СМ N

Смесь № 2

Серии* Тирозин 5.70 5.71 К(-) старт 4,4 0 1239 324,9

Смесь № 3

Серии* Метнонин 5.70 5.71 К(-) старт 4,6 0 940 66,1

Смесь № 4

Серии* Триптофан 5,70 5,94 к(-) А(+) 3,8 -0,2 924 . 62,4

Примечание. * - определяемая кислота; 1\ - расстояние, пройденное основными аминокислотами от линии старта до середины пятна; /2 - расстояние, пройденное другими аминокислотами; N - число теоретических тарелок (основные аминокислоты); /?.у- разрешение для двух электрофоретически выделенных зон.

ВЫВОДЫ

1. Изучено электрофоретическое поведение 20 Ь-а-амипокислот в водных и организованных средах при варьировании рН-фактора методом зонального электрофореза на целлюлозной поддерживающей среде, позволившее разработать подход к тест-определению некоторых аминокислот в их смесях.

Исследовано влияние строения и состояния аминокислот в растворах, концентрации и типа поверхностно-активных веществ, способов визуализации электрофореграмм на эффективность элсктрофоретического выделения и определения аминокислот. Установлена возможность избирательного элсктрофоретического отделения основных (рН=1,6), кислых (рН =4,6) и других аминокислот из многокомпонентных смешанных растворов, определяемая фактором 2/Мг.

2. Установлено дифференцирующее действие организованных сред на основе анионных ПАВ на электрофоретическое поведение 20 а-аминокнелот. Выделено три эффекта поведения при воздействии мицелл ДДС: группы: нулевая подвижность, катодно- и анодно-ориентированное перемещение аминокислот. С позиций электростатических и гидрофобных взаимодействий дана интерпретация наблюдаемым явлениям. Факт гидрофобного взаимодействия аминокислот с мицеллами додецилсульфата иа-трпя подтвержден найденными значениями констант связывания, констант распределения и их соответствием величинам коэффициента распределения аминокислот в системе п-октанол - вода.

■ ■ Предложена схема возможной локализации трех групп аминокислот в мицеллах ДЦС. Выявлены новые возможности избирательного электро-форетичсского выделения 10 аминокислот из смешанных растворов в модифицированном ПАВ буферном электролите.

3. Применен дисперсионный анализ для исследования влияния концентрационного фактора на возможные взаимодействия между аминокислотами в смешанных водных растворах. Установлен факт увеличения электропроводности при уровнях концентраций компонентов выше 0,1 Мв смешанных растворах: основные (лизин, аргинин) - нейтральные (валим, алашш) или кислые (аспарагиновая кислота) аминокислоты, что находит объяснение с позиций возможного переноса протона между цвиттерпоп-пыми формами аминокислот и оснований (по Бренстеду) с образованием катионов и анионов.

4. Изучены условия и разработана технология получения электрофо-ретических тестов на аминокислоты. Показана перспектива применения сканер-технологии и спектроскопии диффузного отражения для определения миллиграммовых концентраций электрофоретически выделенных и визуализированных аминокислот с погрешностью, не превышающей 8-10%.

Разработаны селективные тест-бумаги для идентификации пролина и триптофана в многокомпонентных смесях аминокислот.

Новизна предлагаемых аналитических решений подтверждена патентом.

5. Электрофоретические тесты применены для выделения и определения аминокислот в растворах и фармацевтических препаратах: глицине, метиопипе, элтацине. Предварительная пробоподготовка фармпрепаратов предусматривает перевод пробы в раствор, избирательное электрофорети-ческое выделение аминокислоты на бумажной матрице, ее визуализацию и цветометрическое определение: ■

Автор выражает благодарность к.х.н., доценту И.В. Косыревой за научные консультации.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах: .

1. Патент JN« 2390015 Россия, МПК G 01 N 31/22. Способ избирательной идентификации триптофана в смеси а-аминокислот / Е.И. Селифопова, Р.К. Чернова, O.A. Царевская. 2010. Бюл. № 14. 1 ,

2. Чернова Р.К.. Косырева И,В., Селифопова Е.И., Денисова E.H. Электрофорегическое разделение и цветометрическое определение некоторых а-аминокислот // Изв. вузов. Сер. Химия и химическая технология. 2007. Т. 50, вып. 9. С. 21-24. ......:

3. Козлова Л.М., Чернова Р.К., Селифонова Е.И. Фотометрическое и комплексонометрическое определение бериллия (II) в сплавах и сточных водах // Цветные металлы. 2009. № 11. С. 50-53.

4. Селифонова Е.И., Косырева И.В., Чернова Р.К. Цветометричсское определение лизина после его электрофоретического отделения от смеси а-амипокислот // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2011. Т. 11, вып. 1. С. 33-38.

5. Чернова Р.К., Селифонова Е.И., Косырева И.В. Некоторые методологические подходы к электрофоретическому разделению а-аминокислот // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2007. Т. 7, вып. 2. С. 21-27.

6. Царевская O.A., Селифонова Е.И., Чернова Р.К. Тест-идентификация некоторых а-аминокислот // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. Саратов: Научная книга,

2007. С. 234-236.

7. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Косырева И.В. Некоторые подходы к разделению а-аминокислот методом зонального электрофореза // Новые методы н приборы для химических исследований и анализа: Тез. докл. XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (23-27 септ. 2007 г.): в 5 т. Т. 4: Биомолекулярная химия и биотехнология. М.: Издат. дом «Граница», 2007. С. 216.

8. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Царевская O.A. Тест-определение некоторых а-аминокислот // Аналитика России: Материалы II Всерос. конф. по аналит. химии с междунар. участием. Краснодар, 2007. С. 465.

9. Селифонова Е.И., Никонова Д.А. Некоторые нанохимические аспекты электрофоретического разделения а-аминокислот // Материалы XV Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2008». Химия. М„ 2008. С. 58.

10. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Никонова Д.А. Разделение а-аминокислот методом зонального электрофореза в гидрофобизировапных средах // Тез. докл. VIII Украин. конф. по аналит. химии с междунар. участием, 8-12 септ. 2008 г. Одесса: Атлант, 2008. С. 138.

11. Селифонова Е.И., Чернова Р.К. Закономерности электрофоретического разделения а-аминокислот // Аналитика и аналитики: Реф. докл. II Междунар. форума, 22-26 сснт. 2008 г.: в 2 т. Воронеж: Изд-во ВГТА,

2008. Т. 2. С. 552.

12. Селифонова Е.И., Царевская O.A. Реактивные индикаторные бумаги для тест-определения а-амииокислот // Аналитика и аналитики: Реф. докл. II Междунар. форума, 22-26 сент. 2008 г.: в 2 т. Воронеж: Изд-во ВГТА, 2008. Т. 1.С. 167.

13. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Косырева И.В., Пысипа М.В. Методология электрофоретического отделения и цветометрического определения основных а-аминокислот // Аналитическая химия - новые мЬтоды и

возможности: Тез. докл. съезда аналитиков России, г. Клязьма, 26-30 апр. 2010 г. М.: Б.и., 2010. С. 161-162.

14. Косырева И.В., Селифонова Е.И., Пысипа М.В. Электрофорети-ческос отделение и цветометрическое определение лизина в смеси а-амн-покислот // Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии: Тез. докл. Всерос. науч. молодеж. шк.-конф., г. Омск, 16-24 мая 2010 г. Омск: Б.и.,2010. С. 1-2.

15. Иванов Д.Н., ГТысипа М.В., Селифонова Е.И., Косырсва И.В., Чернова Р.К. Спектроскопия диффузного отражения в анализе визуализированных электрофореграмм а-аминокислот // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VII Всерос. конф. молодых ученых. Саратов: Изд-во «КУБиК», 2010. С. 159-161.

16. Селифонова Е.И., Косырева И.В., Пысина М.В., Чернова Р.К. Мнцеллярная экстракция анионными ПАВ в электрофоретическом разделении и цветометрическом определении а-аминокислот // Экстракция органических соединений ЭОС - 2010: Каталог докл. IV Междунар. конф., г. Воронеж, 20-24 септ. 2010 г. Воронеж: Изд-вО ВГТА, 2010. С. 108.

17. Селифонова Е.И., Новиков А.Н., Чернова Р.К. Некоторые физико-химические характеристики смешанных водных растворов валина и лизина // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VIII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК». 20l 1. С. 156-160.

18. Пысина М.В., Селифонова Е.И., Чернова Р.К. Влияние протоли-тических свойств (Ь)-а-аминокислот на их электрофоретическое поведение // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VIII Всерос. конф. молодых ученых с междуп. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2011. С. 110-115.

19. Джураева O.A., Селифонова Е.И., Пысина М.В., Жукова Д.В., Чернова Р.К. Влияние мицеллярных сред на протолитические свойства а -аминокислот // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VIII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК», 2011. С. 170-173.

20. Пысина М.В., Селифонова Е.И. Электрофоретическое отделение и дснситометрическое определение гистидина в смесях' а-аминокислот // Химия в современном мире: Материалы V'Beepoc. копф. студентов и аспирантов. СПб., 2011. С. 124-126. 1;

21. Чернова Р.К., Селифонова Е.И., Пысина М.В, Электрофоретическое ракзделепие а-аминокислот с помощью, лиофильцых наноразмерных агрегатов анионных ПАВ // Всероссийская научная школа по аналитической химии: материалы научной школы: Краснодар, 201Т; С. 143.

СЕЛИФОНОВА Екатерина Игоревна

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ И ТЕСТ-ОПРЕДЕЛЕНИЕ L-a- АМИНОКИСЛОТ В ВОДНЫХ И ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 27.10.2011 Формат 60x48 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 120 экз. Заказ № 230-Т

Типография Саратовского государственного университета имени Н.Г. Чернышевского 410012 г. Саратов, ул. Большая Казачья, д.. 112 а Тел.: (8452) 27-33-85

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ а-АМИНОКИСЛОТ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

1.2. Газожидкостная и газовая хроматография.

1.3. Тонкослойная хроматография.

1.4. Ионообменная хроматография аминокислот.

1.5. Капиллярный электрофорез.

1.6. Спектрофотометрия.

1.7. Титриметрические методы.

1.8. Электрохимические методы.

1.9. Проточные методы определения а-аминокислот.

1.10. Сенсоры на аминокислоты.

Глава 2. РЕАГЕНТЫ, АППАРАТУРА, ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ

ЭКСПЕРИМЕНТА.

2.1. Исходные вещества и реагенты.

2.2. Аппаратура и методика эксперимента.

Глава 3. ПРЕДВАРИТЕЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНР1Я

И ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ТЕСТОВ.

3.1. Особенности бумажных носителей как поддерживающей среды для проведения зонального электрофореза а-аминокислот.

3.2. Выбор оптимальных буферных растворов для электрофоретического разделения а-аминокислот на целлюлозной поддерживающей среде.

3.3. Выбор оптимальных условий визуализации электрофоретически разделенных а-аминокислот на целлюлозной поддерживающей среде.

3.4. Подвижность, параметры эффективности и селективности электрофоретического разделения а-аминокислот.

Глава 4. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ а-АМИНОКИСЛОТ В КИСЛЫХ СРЕДАХ

4.1. Взаимосвязь электрофоретического поведения а-аминокислот с их протолитическими свойствами.

4.2. Другие факторы, влияющие на электрофоретическое поведение а-аминокислот на целлюлозной поддерживающей среде.

4.2.1. Электроосмотический поток.

4.2.2. Ток буфера и «сифонный эффект».

4.2.3. Адсорбция аминокислот на фильтровальной бумаге.

4.2.4. Влияние времени электрофореза на параметры эффективности выделения аминокислот

4.2.5. Некоторые примеры электрофоретического разделения смесей аминокислот.

4.2.6. Цветометрическая обработка полученных электрофореграмм аминокислот.

Глава 5. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ

СМЕШАННЫХ ВОДНЫХ РАСТВОРОВ а-АМИНОКИСЛОТ.

5.1. Система смешанных водных растворов валин - лизин.

5.2. Система аланин - лизин - Н20. И

5.3. Система валин - аргинин - №0.

5.4. Система аспаргиновая кислота - аргинин - Н20.

Глава 6. ОСОБЕННОСТИ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ а-АМИНОКИСЛОТ В ОРГАНИЗОВАННЫХ СРЕДАХ НА ОСНОВЕ АНИОННЫХ ПАВ.

6.1. Влияние предмицеллярных концентраций ПАВ на электрофоретическое поведение а-аминокислот на целлюлозной поддерживающей среде.

6.2. Дифференцирующий эффект организованных сред аПАВ при разделении а-аминокислот методом зонального электрофореза на целлюлозной поддерживающей среде.

6.3. Определение констант связывания и констант распределения катионов а-аминокислот с мицеллярными фазами ДДС.

6.4. Изучение влияния мицеллярной псевдофазы додецилсульфата натрия на ионизацию а-аминокислот по аминогруппе.

Глава 7. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

РАЗРАБОТАННЫХ МЕТОДИК.

7.1. Тесты на присутствие основных и кислых аминокислот в их смешанных растворах.

7.2. Идентификация пролина и триптофана в смешанных растворах с помощью реактивных индикаторных бумаг (РИБ).

7.3. Новые возможности разделение в мицеллярных средах.

7.4. Определение основного вещества в препаратах аминокислот

7.4.1. Определение основного вещества в препарате «Глицин»

7.4.2. Определение основного вещества в препарате «Метионин».

7.4.3. Определение глицина и глутаминовой кислоты в препарате «Элтацин».

ВЫВОДЫ.

Актуальность работы. Смеси а-аминокислот и сами аминокислоты являются эффективными добавками при производстве пищевых продуктов, применяются в фармацевтической промышленности как препараты для спортивного и парэнтерального питания, при профилактике и лечении различных заболеваний. В связи с тем, что терапевтический эффект достигается при соот-, вегствующей концентрации аминокислот, содержание последних в продуктах питания и лекарственных препаратах строго нормируется.

Одной из актуальных задач аналитического контроля производства и применения аминокислотных препаратов является надежное определение этих биологически активных веществ в их смесях. Задача является одной из приоритетных в аналитической химии, и осложнена тем, что в смешанных растворах аминокислот могут протекать разнообразные побочные процессы, в результате чего образуется сложная многоионная смесь, затрудняющая разделение и определение этих веществ.

Актуальна также разработка простых и дешевых тест-методов определения а-аминокислот, что востребовано при предварительных скрининговых обследованиях многочисленных объектов на содержание аминокислот, посколыс-у в этих случаях применение прецизионных, дорогостоящих и сложных методов определения, таких как капиллярный электрофорез, ВЭЖХ экономически не оправдано и технически не реализуемо. В настоящее время тест-определения аминокислот практически не проводятся, т.к. на данный момент известна лишь одна фирма, производящая тесты на а-аминокислоты (I ерма-ния), основанные на принципе иммунофермептного анализа. Из обзора ли, тературы следует, что тест-системам посвящено лишь около 1% исследований.

Решение указанной проблемы возможно с применением зонального электрофореза на целлюлозной поддерживающей среде, поскольку с одной стороны, это «мягкий» метод разделения, что важно в случае лабильных органических соединений, с другой - получение электрофореграмм с разделенными аминокислотами позволяет применять современные сканер-технологии, цветометрию, спектроскопию диффузного отражения для количественного определения аминокислот непосредственно на электрофореграмме. Варьирование факторов среды может послужить инструментом для направленного изменения селективности разделения аминокислот методом зонального электрофореза и таким образом обеспечить получение избирательных электро-форетических тестов на отдельные аминокислоты. Работы в этом направлении до настоящего исследования систематически не проводились.

Работа является частью плановых госбюджетных исследований кафедры аналитической химии и химической экологии СГУ, а также выполнена в соответствии с проектом Российского фонда фундаментальных исследований № 04-03-33-077.

Цель работы состояла в изучении закономерностей электрофоретиче-ского разделения двадцати а-аминокислот на целлюлозной матрице в водных и организованных средах и разработке на основе полученных результатов тсст-методов определения отдельных аминокислот в их смешанных растворах. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- установить взаимосвязь между электрофоретическим поведением а-аминокислот и состоянием их в водных и организованных средах;

- выявить влияние организованных сред на основе ПАВ при электрофо-ретическом разделении а-аминокислот;

- применить сканер-технологии и спектроскопию диффузного отражения для количественной оценки электрофоретических тестов;

- оценить эффект перезарядки цвиттерионных форм а-аминокислот в смешанных растворах и влияние этого фактора на результаты электро-форетического разделения;

- представить примеры применения разработанных электрофоретических гестов для определения аминокислот в объектах.

Научная новизна исследования. Установлено, что определяющими факторами при разделении смесей аминокислот в водных средах (рН = 1,6) является отношение заряда аминокислоты к массе Z/M и знак заряда, регулируемые с помощью рН-фактора.

Показана зависимость параметров эффективности электрофоретического выделения аминокислот от их состояния в растворе: с увеличением рН уменьшается электрофоретическая подвижность всего ряда аминокислот; изменяется направление движения ди-анионов аминокислот.

Впервые разработаны схемы электрофоретического выделения отдельных аминокислот, а также групп основных и кислых аминокислот из смешанных растворов.

Исследована природа дифференцирующего действия организованной среды на электрофоретическое разделение аминокислот с позиций электростатических и гидрофобных взаимодействий. Подтверждено соблюдение правила Гартли и доказано участие гидрофобных взаимодействий ряда аминокислот с мицеллами аПАВ (образование смешанных мицелл). Рассчитаны константы связывания и константы распределения аминокислот с мицеллами додецилсульфата натрия. Предложена схема локализации аминокислот разных групп в мицеллах анионных поверхностно-активных веществ.

На основании изучения электропроводности, величин рН и показателя преломления в смешанных водных растворах систем: валин - лизин, аланин -• лизин, валин - аргинин, аспарагиновая кислота - аргинин и обработки полученных данных методом дисперсионного анализа показана возможность протекания процессов перезарядки цвиттерионных форм аминокислот по типу: кислота-основание Бренстеда.

Разработана композиция на основе нингидрина и технология ее нанесения на олектрофореграмму для визуализации аминокислот.

На основании установленных закономерностей разработаны методики электрофоретических тест-определений аминокислот в многокомпонентных смешанных растворах, в бинарных растворах аминокислот с близкими значениями изоэлектрических 1'очек, в фармацевтических препаратах.

Применены методы цветометрии и спектроскопии диффузного отражения для количественной оценки визуализированных электрофоретических тестов.

Практическая значимость работы. Найденные закономерности элек-трофоретического поведения а-аминокислот позволяют прогнозировать возможность их разделения в смешанных растворах.

Разработаны методики получения электрофоретических тестов на аминокислоты и показана возможность количественной оценки содержания аминокислот в смесях методами цветометрии и спектроскопии диффузного отражения.

Даны примеры практического применения разработанных тест-методик для оценки качества фармпрепаратов, разделения а-аминокислот с близкими значениями рТ, определения пищевой ценности кормов, идентификации групп основных и кислых аминокислот в смешанных растворах.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты влияния рН-фактора на электрофоретическое разделение а-аминокислот в водных средах;

- дифференцирующий эффект организованной мицеллярной среды как фактор повышения избирательности электрофоретического разделения ос-аминокислот;

- результаты применения сканер-технологии и спектроскопии диффузного отражения для количественного определения разделенных а-аминокислот на электрофореграммах;

- методики проведения индивидуального и группового электрофоретического тестирования а-аминокислот в смешанных растворах;

- примеры использования электрофоретических тестов для определения а-аминокислот в объектах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях: XVIII Менделеевском Конгрессе по общей и прикладной химии (Москва, 2007); II Всероссийской конференции

Аналитика России» с международным участием (Краснодар, 2007); XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008); VIII Украинской конференции по аналитической химии с международным участием (Одесса, 2008); II Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008); съезде аналитиков России «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (Клязьма, 2010); Всероссийской научной молодежной школе-конференции «Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии» (Омск, 2010); VII Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2010); IV Международной конференции «Экстракция органических соединений ЭОС-2010» (Воронеж, 2010); VIII Всероссийской конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2011); V Всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011); Всероссийской научной школе по аналитической химии (Краснодар, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 работа: один патент; 10 статей, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК; 7 статей в реферируемых сборниках научных статей; 10 тезисов докладов.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Патент № 2390015 Россия, МПК G 01 N 31/22. Способ избирательной идентификации триптофана в смеси а-аминокислот / Е.И. Селифонова, Р.К. Чернова, O.A. ТДаревская. 2010. Бюл. № 14.

2. Чернова Р.К., Косырева И.В., Селифонова Е.И., Денисова E.H. Элек-трофоретическое разделение и цветометрическое определение некоторых а-аминокислот // Изв. вузов. Сер. Химия и химическая технология. 2007. Т. 50, вып. 9. С. 21-24.

3. Козлова Л.М., Чернова Р.К., Селифонова Е.И. Фотометрическое и комплексонометрическое определение бериллия (II) в сплавах и сточных водах // Цветные металлы. 2009. № 11. С. 50-53.

4. Селифонова Е.И., Косырева И.В., Чернова Р.К. Цветометрическое определение лизина после его электрофоретического отделения от смеси а-аминокислот // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2011. Т. 11, вып. 1.С. 33-38.

5. Чернова Р.К., Селифонова Е.И., Косырева И.В. Некоторые методологические подходы к электрофоретическому разделению а-аминокислот // Изв. Сарат. ун-та. Нов. сер. Сер. Химия. Биология. Экология. 2007. Т. 7, вып. 2. С. 21-27.

6. Царевская O.A., Селифонова Е.И., Чернова Р.К. Тест-идентифика-ция некоторых а-аминокислот // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. Саратов: Научная книга, 2007. С. 234-236.

7. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Косырева И.В. Некоторые подходы к разделению а-аминокислот методом зонального электрофореза // Новые методы и приборы для химических исследований и анализа: Тез. докл. XVIII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (23-27 сент. 2007 г.): в 5 т. Т. 4: Биомолекулярная химия и биотехнология. М.: Издат. дом «Граница», 2007. С. 216.

8. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Царевская O.A. Тест-определение некоторых а-аминокислот // Аналитика России: Материалы II Всерос. конф. по аналит. химии с междунар. участием. Краснодар, 2007. С. 465.

9. Селифонова Е.И., Никонова Д.А. Некоторые нанохимические аспекты электрофоретического разделения а-аминокислот // Материалы XV Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2008». Химия. М., 2008. С. 58.

10. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Никонова Д.А. Разделение а~ аминокислот методом зонального электрофореза в гидрофобизированных средах // Тез. докл. VIII Украин. конф. по аналит. химии с междунар. участием, 8-12 сент. 2008 г. Одесса: Атлант, 2008. С. 138.

11. Селифонова Е.И., Чернова P.K. Закономерности электрофоретиче-ского разделения а-аминокислот // Аналитика и аналитики: Реф. докл. II Меж-дунар. форума, 22-26 сент. 2008 г.: в 2 т. Воронеж: Изд-во ВГТА, 2008. Т. 2. С.552.

12. Селифонова Е.И., Царевская O.A. Реактивные индикаторные бумаги для тест-определения а-аминокислот // Аналитика и аналитики: Реф. докл. II Между нар. форума, 22-26 сент. 2008 г.: в 2 т. Воронеж: Изд-во ВГТА, 2008. Т. 1.С. 167.

13. Селифонова Е.И., Чернова Р.К., Косырева И.В., Пысина М.В. Методология электрофоретического отделения и цветометрического определения основных а-аминокислот // Аналитическая химия - новые методы и возможности: Тез. докл. съезда аналитиков России, г. Клязьма, 26-30 апр. 2010 г. М.: Б.и., 2010. С. 161-162.

14. Косырева И.В., Селифонова Е.И., Пысина М.В. Электрофоретическое отделение и цветометрическое определение лизина в смеси а-ами-нокислот // Химия под знаком СИГМА: исследования, инновации, технологии: Тез. докл. Всерос. науч. молодеж. шк.-конф., г. Омск, 16-24 мая 2010 г. Омск: Б.и., 2010. С. 1-2.

15. Иванов Д.Н., Пысина М.В., Селифонова Е.И., Косырева И.В., Чернова Р.К. Спектроскопия диффузного отражения в анализе визуализированных электрофореграмм а-аминокислот // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VII Всерос. конф. молодых ученых. Саратов: Изд-во «КУБиК», 2010. С. 159-161.

16. Селифонова Е.И., Косырева И.В., Пысина М.В., Чернова Р.К. Мицел-лярная экстракция анионными ПАВ в электрофоретическом разделении и цве-тометрическом определении а-аминокислот//Экстракция органических соединений ЭОС - 2010: Каталог докл. IV Междунар. конф., г. Воронеж, 20-24 сент. 2010 г. Воронеж: Изд-во ВГТА, 2010. С. 108.

17. Селифонова Е.И., Новиков А.Н., Чернова Р.К. Некоторые физико-химические характеристики смешанных водных растворов валина и лизина //

Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VIII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием. Сара, тов: Изд-во «КУБиК». 201,1. С. 156-160.

18. Пысина М.В., Селифонова Е.И., Чернова Р.К. Влияние протолитиче-ских свойств (Ь)-а-аминокислот на их электрофоретическое поведение // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VIII Всерос. конф. молодых ученых с междун. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК». 2011. С. 110-115.

19. Джураева O.A., Селифонова Е.И., Пысина М.В., Жукова Д.В., Чернова Р.К. Влияние мицеллярных сред на протолитические свойства а —аминокислот // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Межвуз. сб. науч. тр. VIII Всерос. конф. молодых ученых с междунар. участием. Саратов: Изд-во «КУБиК», 2011. С. 170-173.

20. Пысина М.В., Селифонова Е.И. Электрофоретическое отделение и денситометрическое определение гистидина в смесях a-аминокислот // Химия в современном мире: Материалы V Всерос. конф. студентов и аспирантов. СПб., 2011. С. 124-126.

21. Чернова Р.К., Селифонова Е.И., Пысина М.В. Электрофоретическое ракзделение a-аминокислот с помощью лиофильных наноразмерных агрегатов анионных ПАВ // Всероссийская научная школа по аналитической химии: ма териалы научной школы: Краснодар, 2011. С. 143.

ВЫВОДЫ

1. Изучено электрофоретическое поведение 20-ти L-a-аминокислот в водных и организованных средах при варьировании рН-фактора методом зонального электрофореза на целлюлозной поддерживающей среде.

Исследовано влияние с(роения и состояния аминокислот в растворах, концентрации и шпа поверхностно-активных веществ, способов визуализации элекгрофореграмм на эффективность электрофоретического выделения и определения аминокислот. Установлена возможность избирательного элек-трофоретического отделения основных (рН= 1,6), кислых (рН = 4,6) и других аминокислот из многокомпонентных смешанных pací воров, определяемая фактором Z/Mr.

2. Установлено дифференцирующее действие opj анизованных сред на основе анионных ПАВ на электрофорешческое поведение 20 а-аминокислот. Выделено три группы: нулевой подвижности, каюдно- и анодно-ориен-тированных аминокислот. С позиций электростатических и гидрофобных взаимодействий дана интерпретация наблюдаемым явлениям. Факт гидрофобного взаимодействия аминокислот с мицеллами додецилсульфат натрия \ подтвержден найденными значениями констант связывания, констант распределения и их соответствием величинам коэффициента распределения аминокислот в системе н-октанол - вода.

Предложена схема возможной локализации аминокислот в мицеллах ДДС. Выявлены новые возможности избирательного электрофоретического выделения 10-nb аминокислот из смешанных растворов в модифицированном ПАВ буферном электролите.

3. Применен дисперсионный анализ для исследования влияния концентрационного фактора на возможные взаимодействия между аминокислотами в

1 < смешанных водных растворах. Установлен факт увеличения электропроводности при уровнях концентраций компонентов выше 0,1 М в смешанных растворах: основные (лизин, аргинин) - нейтральные (валил, аланип) или кислые (аспарагиновая кислота) аминокислоты, что находит объяснение с позиций возможного переноса протона между цвиттерионными формами аминокислот и оснований (по Бренстеду) с образованием катионов и анионов.

4. Изучены условия и разработана технология получения электрофоре-тических тестов на аминокислоты. Показана перспектива применения сканер-технологии и спектроскопии диффузного отражения для определения миллиграммовых концентраций электрофоретически выделенных и визуализированных аминокислот с погрешностью, не превышающей 8-10%.

Разработаны селективные тест-бумаги для идентификации пролина и триптофана в многокомпонен i ных смесях аминокислот.

Новизна предлагаемых аналитических решений подтверждена патентом.

5. Электрофоретические тесты применены для выделения и определения аминокислот в растворах и фармацевтических препаратах: глицине, метиони-не, элтацине. Предварительная пробоподготовка фармпрепаратов предусматривает перевод пробы в pací вор, избирательное электрофоретическое выделение аминокислоты на бумажной матрице, ее визуализацию и цветометри-ческое определение.

1. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А., Зельвенский В.Ю., Ган-кина Э.С., Шагц В.Д. Аналитическая хроматография. М.:Химия, 1993.464с.

2. Бауэр Г., Энгельгард X., Хеншеп А. и др. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / под ред. А. Хеншена, К.-П. Хупе, Ф. Лот-шпайх, В. Вёльтера. М.: Мир, 1988.

3. Fekkes D. State-of-the-art of high-performance liquid chromatographic analysis of amino acids in physiological samples // J. Chromatogr. B. 1996. Vol. 682, № l.P. 3-22.

4. Teerlink Т., Leeuwen P.A.M. van, Iloudijk A. Plasma Amino Acids determined by liquid chromatography within 17 minutes // Clin. Chem. 1994. Vol. 40, № 2. P. 246-249.

5. Краснова И.Н., Карпова Л.А., Черкас Ю.В. Определение аминокислот в сыворотке крови человека методом обращен!ю-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в режиме изократического элюирования // Жури, аналит. химии. 2000. Т. 55, № 1. С. 66-74.

6. Jozeph М., Davies P. Electrochemical activity of o-phthaldialdehyde mercapto-ethanol derivatives of amino acids // J. Chromatogr. 1983. Vol. 274. P. 125-130.

7. Jacobs W.A. O-Phthalaldehyde-sulfite derivatization of primary amines for liquid chromatography-electrochemistry // J. Chromatogr. 1987. Vol. 392. P. 435-441.

8. Lottspiech F., Birarelli M., Carducci C., Pontecorvi A., Antonozzi I. Simultaneous high-performance liquid chromatographic determination of amino acids in a dried blood spot as a neonatal screening test//J. Chromatogr. 1990. Vol. 511. P. 131-136.

9. Qureshi G.A., Gokmen S. Determination of amino acidb by liquid chromatography based on pre- and column derivation // Clin, acta turc. 1987. Vol. 15, № 2. P. 227-241.

10. Allison L.A., Mayer J.S., Shoup R. o-Phthalaldehyde derivatives of amines for high-speed liquid chromatography/electrochemistry // Anal. Chem. 1984. Vol. 56, №7. P. 1089-1096.

11. Donzanti B.A., Yamamoto B.K. An improved and rapid HPLC-EC method for the isocratic separation of amino acid neurotransmitters from brain tissue and microdialysis perfusates // Life Sciences. 1988. Vol. 43, № 11. P. 913-922.

12. Qureshi G.A., Qureshi A.R. Determination of free amino acids in biological samples: problems of quantitation // J. Chromatogr. 1989. Vol.491, №2. P. 281-289.

13. Fiorino A., Frigo G., Cucchetti E. Liquid chromatographic analysis of amino and imino acids in protein hydrolysatcs by post-column derivatization with o-phthalaldehyde and 3-mercaptopropionic acid // J. Chromatogr. 1989. Vol. 476. P. 83-92.

14. Zhao Q., Wada LI. On-line precolumn derivatization method for determination of amino acids with o-phthalaldehycle and 2-mercaptoethanol // Anal. Sci. 1989. Vol. 5, № 4. P. 487-488.

15. Yamashita Т., Yamasaki M., Sano Т., Harada S., Yano IT. Micellar catalytic effects of the kinetics of the ionization of basic amino acid and acidic amino acid studied by the ultrasonic absorption method //Lanamuir. 1995. Vol. 11. P. 1477.

16. Juhasz G., Kekesi A.K., Pungor K., Slezsak I. Measurement of microdialysis samples by electrochemical and fluorescent detectors // Bioelectroanalysis II: 2nd Symp., Natratuzed. 11-15 Oct., 1992. Budapest: Akadimiai Kiads, 1993. P.59-74.

17. Algennissen В., Nundel M., Rieclel E. Analytik von Aminosauren mit Fluoreszenz I-IPLC // GIT. 1989. Vol. 33, № 9. S. 783-790.

18. Moretti F., Birarelli M., Carducci C., Pontecorvi A., Antonozzi I. Simultaneous high-performance liquid chromatographic determination of amino acids in a dried spot as a neonatal screening test // J. Chromatogr. A. 1990. Vol. 511. P. 131-136.

19. Wen W., Min L., Yicong Z., Wuan Ch., Quingle Z. Энантиомерное разделение производных аминокислот на неподвижной фазе L-винной кислоты // Chin. J. Anal. Chem. 2004. Vol. 32, № 2. P. 213-216.

20. Bestimmung von Aminosfureri mit FMOC //LaborPraxis. 1994. Vol. 18,№8.S.38.

21. Краснова ШТ., Колмакова И.В., Карпова Л.А. Анализ нейромедиаторных аминокислот и биогенных аминов в спинномозговой жидкости методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии. 1997. Т. 52, № 7. С. 767-772.

22. Витт С.В., Воробьев ММ., Пасконова Е.А., Сапоровская М.Б., Беликов В.М. Определение N-тринитрофенилпроизводных некоторых аминокислот и пептидов методом жидкостной хроматографии высокого давления //Журн. аналит. химии. 1983. Т. 38, № 8. С. 1538-1539.

23. Maliner M.F., Schrocder L.A. Amino acid analysis by high-performance liquid chromatography with methanosulfonic acid hydrolysis and 9-Hudrenylmethyl-chlorolomea derivatization // J. Chromatogr. 1990. Vol. 814, № 2. P. 227-238.

24. Astephen N., Wheal T. An amino acid analysis method for assessing nutritional quality of infant formulas // Int. Lab. 1993. Vol. 23, № 5. P. 22-26.

25. Dimova N. RP-HPLC analysis of amino acids with UV-detection // Докл. Ьолг. АН. 2003. Т. 56, № 12. С. 75-78.

26. Cohen S.A., van Wandelen Ch. Determining protein concentration by quantitative amino acid analysis // Pitt. Febr. 27 March 4, 1994: Abstr. Chicago III, 1994. P. 4190.

27. Чернобровкин М.Г., Кольцова H.B., Шепелев Б.Н. Определение аминокислот в препарате «Элтации» // Фармация. 2004. Т. 53, № 5. С. 18-20.

28. Min У., "lomellini S.A. Indirect fluorescence detection of amino acids and ali, , phatic biogenic polysmines for HPLC // Pitt. Conf. Anal. Chem. Appl. Spectosc.1. Orlando, 1999. P. 49. '

29. Gatte R., Gioia M.G., di Pieta A.M. Phanquenone: a useful fluorescent pre-chromatographic derivatization reagent for liquid chromatographic analysis of aminoacid dosage fonn // Anal. Chem. Acta. 2002. № 1-2. P. 11-20.

30. Peterson J.A., Lorenz L.J., Risley D.S., Sandmann B.J. Amino acid analysis of peptides using HPLC with evaporative light scattering ^election п J. Liq. Chio-matogr. Relat. Technol. 1999. Vol. 22, № 7. P. 1009-1025.

31. Subramanian R., Kelley W.R., Floyd Ph.D., Tan Zh.J., Webb A.G. A microcoil NMR probe for coupling microscale HPLC with on-line NMR spectroscopy // Anal. Chem. 1999. Vol. 71, № 23. P. 5335-5339.

32. Holsommer H.J., Klein I., Griihing J., Hoplcer H.-R. Bcstimmung von D-Ami-nosauren in Fruchsaften // Flussig. Obst. 1989. Vol. 56, № 10. S. 649-651.

33. Rundlett K.L., Armstrong L.W. Determination of free D-amino acids in food using precolumn FMOC derivatization with chiial рЬаьс 11PLC // PiHsbuigli Conf., Anal. Chem. and Appl. Spectrosc. Atlanta, Ga, Match 8-12th, 1993: Abstr. P. 85.

34. Басюк B.A. Разделение энантиомеров аминокисло! на сорбенте с обращенными фазами, покрытом Ы-окгал-Ь-пролпном // Журн. аналит. химии. 1990. Т. 45, № 11. С. 2166-2169.

35. Сакида X., Аояма Т. Жидкостная хроматография и масс-спектрометрия. Примеры анализа биологически активных соединений // Гшдай кагаку = Chem. Today. 1989. № 216. P. 36-41.

36. MD800 LCD nuovo rivelabore Fisons per ITPLC // Riv. Ital. Sostanze grasse. 1994. Vol. 71, № 3. S. 430.

37. Бубенчикова В.IT., Сухомлинова 10.А. Лабазник шестилепестный: аминокислотный и минеральный состав // Фармация. 2005. Т. 54, № 3. С. 9-11.

38. Erdmann D., Stuurman II.W., Tuss И. Automalische Probenvorbereitung und Analyse in der HPLC // Gil I. 1989. Vol. 33, Suppl. № 3. 3. 3-5.

39. Liu A., Wang E. Amjjerometric detection of amino acids in a flow-injection system with a nickel(II)-modified electrode with an Eastman-AQ polymer film // Anal. Chim. Acta. 1993. Vol. 280, № 2. P. 223-229.

40. Simonson Pt.G., Petrzyk D.J. Separation and detection of underivatized amino acids //J. Liquid. Chromatogr. 1993. Vol. 16, № 3. P. 597-618.

41. Mitic S.S., Pavlovic A.N., Tosic S.B., ArsicB.B., Sunaric S.M. Quantitative Determination of Glycine in Commercial Dosage Forms by Kinetic Spectrophotometry// Журнал аналитической химии.2009. Т. 64, № 7. С. 703-708.

42. Лядощук В.А., Денисенко А.Д. Определение концентрации асимметричною диметиларгинина в плазме крови у человека методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектором // Клиническая лабораторная диагностика. 2010. № 5. С. 5-8.

43. Рыжова Г.Л., Братчиков А.В. Определение аминокислот в рапе и лечебной грязи методом газожидкостной хроматографии // Журн. аналит. химии.• ■ 1980. Т. 35, №4. С. 803-805.

44. Бородина В.Л., Крылов А.И., Рогозкии В.А. Экспресс-метод количественного определения аминокислот с помощью газожидкостной хроматографии // Лаб. Дело. 1984. № 7. С. 395-397.

45. Kuryt Т., Sawnor-Corszynska D. Quantitative analysis of amino acids in biological fluids by gas chromatography with flame ionization detection // Acta Chromatogr. 2000. № 10. P. 97-103.

46. Buiatti S., Zironi R., Boschelle O. Determinazione degli aminoacidi nel mosto d'uva mediante GLC capillare // Ind. Bev. 1989. Vol. 18, № 5. S. 365-368, 397.

47. Moodie 1.М., Shevard G.S., Labadarios D. A review of quantitative ion es-change, high performance liquid and gas chromatographic analyses of amino acids in physiological fluids //J. High Resolut. Chromatogr. 1989. Vol. 12, № 8. P. 509-516.

48. Donati S., Tambosso T. A fiber optic colorimeter for liquid phase chromatography of aminoacids // Chem., Biochem. and Environment. Appl. of Fibers: Proc. Boston, Mass., 8-9 Sept., 1988 // SPIE. 1989. Vol. 990. P. 70-77.

49. Bruckner H., Hausch M. Detection of free D-amino acids in food by chiral phase capillary gas chromatography // J. High Resolut. Chromatogr. 1989. Vol.12, № 10. P. 680-684.1. J \

50. Beril E., Emur H. Determination of selenoaminoacids by gas chromatography-mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 505, № 1. P. 101-106.

51. Герасимова Ц.Н. Определение серотонина, триптофана, 5-окситриптро-фана, 5-оксииндолилуксусной кислоты, гистамина и гистидина в одной пробе биологического материала// Лаб. дело. 1982. № 8. С. 14-21.

52. Khaledi M.G., Rodgers А 11. Micellar-mediated shifts of ionization constants of amino acids and peptides // Anal. Chim. Acta. 1990. Vol. 239. P. 121.

53. Эгерт В.Э., Богуславский A.M. Хро*матографирование а-аминокислот на пластинках силуфол // Журн. аналнт. химии. J 986. Т. 41, № 8. С. 1405-1410.

54. Эгерт В.Э., Богуславский А.Н. Определение цистина и цистеина в присутствии других аминокислот методом тонкослойной хроматографии на пластинках силуфол//Журн. аналнт. химии. 1982. Т. 37, № 10. С. 1865-1868.

55. Шаршунова М., Шварц В., Михалец Ч. Тонкослойная хроматография в фармации и клинической биохимии: в 2 т. М.: Мир, 1980. Т. 1. 624 с.

56. Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки. М.: Мир, 1985. 456 с.

57. Бондаренко Б.Н. Количественное определение аминокислот при хроматографии в тонком слое // Лаб. дело. 1984. № 2. С. 118-120.

58. Дегтярев Е.В., Дегтярь В.Г., Вайсбург А.Ф. Количественное определение L-триптофана метод'ом хроматоденситометрии пластинок // Хим.-фарм. журн. 1994. Т. 28, № 4. С. 52-55.

59. Дегтярев Е.В., Панфилов В.Ф., Тарасов А.П. Количественное определение L-лизина, L-гомосерина и а-треопина в культуральных жидкостях методом хроматоденситометрии на отечественных пластинках «Сорбфил» // Хим.-фарм. журн. 1992. Т. 26, № 9-10. С. 121-123.

60. Бестужева С.В. Разделение и количественное определение свободных аминокислот в сыворотке крови на пластинках Фикспон 50 х 8 // Лаб. дело. 1977. №3. С. 133-136.

61. Лужбин А.В. Диагносшческое значение количественного определения свободных аминокислот в сыворотке крови на пластинках «Фиксион 50x8» в острейшем периоде мозговых инсультов // Лаб. дело. 1980. № 4. С. 217-219.

62. Загниборода Д.Н. Новый вариант тонкослойной хроматографии с управляемой газовой фазой: Автореф. дис. . канд. хим. наук. Саратов, 2009.

63. Макиева М.С., Дзеранова К.Б. Использование тонкослойной хроматографии и титриметрии для анализа глицина таблеток подъязычных // Анали-шка России: Тез. докл. III Всерос. конф. 2009.

64. Csapo J., Penke В., Toth-Pesfai J., Csapo-ICiss Zs. Separation and determination of D- and L-aminoacids by ion exchange column chromatography in the form of diastereomer dipeptides // Acta alim. 1990. Vol. 19, № 1. C. 87-104.

65. Dabral S.K., Rawal J.P., Muktawat K.P.S. Ion-exchange chromatographic determination of amino acids on impregnated papers // Anal. Lett. 1989. Vol. 22, № 3. P. 537-543/

66. Агупова М.В., Бобрешова О.В., Бобринская Г.А., Якунина Т.В. Определе-• • ние лизина после разделения смешанных растворов лизина и глицина с использованием катионита КУ-2-8 // Сорбцнопные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8, вып. 6. С. 931-941.

67. Бочков А.С. Лигандообменный хроматографический анализ энантиоме-ров a-аминокислот с применением обращенно-фазовых сорбентов: Автореф. дис. канд. хим. наук. М.: ВЗИПП, 1983. 23 с.

68. Jandik P., Clarke A., Avdalonic N. Anion exchange chromatrography and integrated amperometric detection of amino acids, amino sugars, and carbohydrates in biological matrices // Pitt. Conf. Anal. Chem. Appl. Spectrosc. Orlando, 1999. P. 371.

69. Киселева Т.Л., Фролова Л.Н., Баратова Л.А., Байбакова Г.В., Ксенофонтов А.Л. Изучение аминокислотной фракции экстракта мумие сухого // Хим.-фарм. журн. 1998. № 2. С. 47-51.

70. Ледерер М. Введение в электрофорез на бумаге и родственные методы / пер. с англ. И.И. Третьяковой; под ред. и с прсдисл. проф. Я. Капланского. М.: Изд-во иностр. лит., 1956.172 с.

71. Yan J., Kett W.C., Herbert B.R., Gooley A.A., Packer N.H., Williams K.L. Identification and quantitation of cysteine in proteins separated by gel electrophoresis//J. Chromatogr. 1998. Vol. 813, № 1. P. 187-200.

72. Sadecka J., Polonsky J. Electrophoretic methods in the analysis of beverages. // J. Chromatogr. A. 2000. Vol. 880. C. 243-279.

73. Prata C., Bonnafous P., Fraysse N., Treilhou M., Poinsot V., Couderc F. Recent advances in amino acids analysis by capillary electrophoresis // Electrophoresis. 2001. Vol. 22. P. 4129-4138.

74. Chen Bing, Li Xiaoge, He Ping et al. Одновременное определение аминокислот в пищевых продуктах методом капиллярною электрофореза при косвенном детектировании в УФ-лучах // РЖ 19. Химия. Своди, т. / ВИНИТИ. 2004. №22. Р. 1.19.

75. Тихонов Б.Б. Применение метода капиллярного электрофореза для исследования аминокислотного состава белков амаранта // Вестн. Тверск. гос. техн. ун-та. 2002. № 2. С. 128-130.

76. Шпак А.В., Пирогов А.В., Шпигун О.А. Электрофоретические методы определения аминокислот // Аналитика и аналитики: Каталог реф. и статей; Воронеж, 2-6 июля 2003 г.: в 2 т. Воронеж, 2003. Т. 1. С. 192.

77. Система капиллярного злектрофореза «Капель»: Руководство по эксплуатации 105.00.00.00.00. РО. СПб.: ООО «Люмэкс», 2001. С. 71.

78. Wan Н., Blomberg L.G. Chiral separation of amino acids and peptides by capillary electrophoresis//J. Chromatogr. 2000. Vol. 875. P. 43.

79. Karbaum A., Jira T. Chiral separation of unmodieed amino acids with nonaqueous capillary electrophoresis based on the ligand-exchange principle // J. Chromatogr. 2000. Vol. 874. P. 285.

80. Семенов В.Ф., Страшилина Н.Ю., Калач А.В. Качественное и количественное определение аминокислот в зерновых культурах методом капиллярного электрофореза // Сорбцпонные и хромато! рафические процессы.2004. Т. 4, №2. С. 159-169.

81. Boulat О., McLaren D.G., Arriaga Е.А., Chen D.D. Analysis of free amino acids in human plasma by capillary electrophoresis with laser induced fluorescence // J. Chromatogr. 2001. Vol. 754. P. 217.

82. Dzygiel P., Rudzinska E,, Wieczorec P., Kafarski P. Determination of optical purity of phosphonic acid analogues of aromatic amino acids by capillary electrophoresis with a-cyclodextrin // J. Chromatogr. 2000. Vol. 895. P. 301.

83. Arlt K., Brandt S., Kehr J. Amino acid analysis at the single plant cell level using capillary electrophoresis coupled to iaser-induced-fluorescence detection // J. Chromatogr. Vol. 926. P. 319-325.

84. Latorre R.M., Saurina J., Hernandez-Cassou S. Determination of amino acids in overlapped capillary electrophoresis peaks by means of partial least-squares regression // J. Chromatogr. 2000. Vol. 871. P. 331.

85. Crowder M.W, Numan A.-G., Haddadian F., Weitzel M.A. Capillary electrophoresis of phosphoamino acids with indirect photometric detection // Anal. Chim. Acta. 1999. Vol. 384, № 2. P. 127-133.

86. Pobozy E., Czarkowska W., Troja-nowicz M. Determination of amino acids in saliva using capillary electrophoresis with fluorimetric detection // J. Biochem. Biophys. Methods. 2006. Vol. 67, № 1. P. 37-47.

87. Ivanov A.R., Nazimov I.V., Lobazov A.P., Popkovich G.B. Direct determination of amino acids and carbohydrates by high-performance capillaiy electrophoresis with refractometric detection // J. Chromatogr. A. 2000. Vol. 894. P. 253-257.

88. Melnilcov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.P., Popkovich G.B. Capillaiy electrophoresis of coded nonmodified amino acids with refractometric detection // 3rd Intern. Symp. on Separations in Biosciences. M., 2003. P. 263.

89. Kang X., Xiao J., Iiuang X., Gu Z. Optimization of dansyl derivatization and chromatrographyic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples // Clinica Chimica Acta. 2006. Vol. 366. P. 352-356.

90. Lunn G., Hellwig L.C. Handbook of derivatization reactions for HPLC. N.Y.: Wiley & Sons, 1998. 190 p.

91. Li X.F., Ren H., Le X., Qi M., Ireland I.D., Dovichi N.J. Migration time correction for analysis of derivatized amino acids and oligosaccharides using micellar capillaiy electrochromatrography// J. Chromatogr. 2000. Vol. 869. P. 375-384.

92. Ming Yong-fei, Sun Yu-xi, Shi Yun wei et al. Разделение аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием 9-(2-карбазол)-этилхлорформиата (СЕОС) в качестве дериватизирующего агента // РЖ 19. Химия. Сводн. т. / ВИНИТИ. 2006. № 8. Б.2.542.

93. Novatchev N., Holzgrabe U. Evaluation of the impurity profile of amino acids by means of CE // J. Pharm. and biomed. Anal. 2001. Vol. 26, № 5-6. P. 779-789.

94. Манаенков O.B., Сидоров А.И., Сульман Э.М. Экспресс-определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без их предварительной дериватизации // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 53, № 10. С. 1093-1096.

95. Шпак А.В., Пирогов А.В., Шпигун О.А. Определение аминокислот методом капиллярного электрофореза без предварительной дериватизации // Журн. аналит. химии. 2003. Т. 58, № 7. С. 317-319.

96. Soga Tomoyoshi, Lleiger David N. Amino acid analysis by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry // Anal. Chem. 2000. Vol. 72. P. 1236-1241.

97. Feng Lei, Johnson Mitchell E. Selective fluorescence derivatization and capillary electrophoretic separation of amidated amino acids // J. Chromatogr. A. 1999. Vol. 832, № 1-2. P. 211-224.

98. Пахомова О.А., Коренман Я.И. Экстракционное разделение тирозина и глицина // Современные наукоемкие технологии. 2007. № 5. С. 16-18.

99. Li Hao-Jie, Guo Yin-Long, Liang Bing, Ou Qing-Yu. Применение капиллярного электрофореза для определения возбудительных аминокислот в спинномозговой жидкости после повреждения мозга // Huaxue huebao = Acta Chim. Sin. 2002. № 9. P. 1677-1681.

100. Yeh F., Jiang S.-J., His T.-S. Determination of sulfur-containing amino acids by capillary electrophoresis dynamic reaction cell inductively coupled plasma mass spectrometry // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 502, № 1. P. 57-63.

101. Bobbit D.R., Jackson W.A., Hendrickson H.P. Chemiluminescent detection of amines and amino acids using in situ generated Ru(bpy) with following separation by capillary electrophoresis // Talanta. 1998. Vol. 46, № 4. P. 565-572.

102. Lee K.-P., Song Y.-M, Enantiomeric separation of 2,4-dinitrophenyl amino acids by capillary electrophoresis with (3-cyclodextrin derivative // Chem. J. Chin. Univ. 1999. Vol. 20, № 20. P. 211 -214.

103. Zhai H.-Y., Pei-Xiang C., Zuan-Guang Ch., Guan-Hong L. Быстрое разделение и определение аминокислот методом капиллярного электрофореза с высокочастотным детектором // Chem. J. Chin. Univ. 2004. Vol. 25, № 6. P. 10371039.

104. Шпак A.B., Пирогов А.В., Шпигун O.A. Электрофоретические методы определения аминокислот // Аналитика и аналитики: Каталог реф. и ст. Меж-дунар. форума, 2-6 июня 2003 г.: в 2 т. Воронеж: Изд-во ВГТА, 2003. Т. 1. С. 192.

105. Lau S.K., Zaecardo F., Little M., Banks P. Nanomolar derivatization with 5-carboxyiluorescein suc-cinimidyl ester for fluorescence detection in capillaiy electrophoresis // J. Chromatogr. A. 1998. Vol. 809, № 1-2. P. 203-210.

106. Nouadje G., Simeon N., Nentz M., Couderc F. Capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence. Different detection modes and their application in analysis of hightly sensible amines and amino-acids // Analysis. 1996. Vol. 24, № 9. P. 360-370.

107. Wenzhe Lu, Yang J., Cole R.B. On-line capillary electrophoresis mass spectrometry using acetic asid electrolytes // Pitt. Conf. Anal. Chem. and Appl. Spec-t-rosc., New Orlean, La, March 5-10, 1995: Book Abstr. New Orlean, 1995. P. 196.

108. Yang X., Wang L., Mo J., Xie Т., Yang B. Investigation of capillary electrophoresis with amperometric detection of electroactive amino acids in enzymatic hy-drolyzing hair // Pitt., Conf. Anal. Chtm. Appl. Spectrosc. Orlando, 1999. P. 2263.

109. Frerichs V., Colon L. Characterization of non-invasive subcutaneous samples using capillary electrophoresis // Pitt. Conf. Anal. Chem. Appl. Spectrosc. Orlando, 1999. P. 2212.

110. Даванков В.А., Навратил Дж., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир, 1990. 294 с.

111. Карцова Л.А., Алексеева А.В. Лигандообмешшый капиллярный электрофорез в анализе природных объектов // VII Всерос. конф. по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика 2009»: Тез. докл. Йошкар-Ола, 2009. С. 107-108.

112. Карцова Л.А., Алексеева А.В. Лигандообменный капиллярный электрофорез как новый метод определения биологически активных соединений в природных матрицах // Аналитика России: Материалы III Всерос. конф. Краснодар, 2009.

113. Weber Paul L., Buck Daniel R. Capillary Electrophoresis: A Fast and Simple Method for the Determination of the Amino Acid Composition proteins // J. Chem. Educ. Vol. 71, № 7. P. 609-612.

114. Пахомова О.А., Коренман Я.И., Нифталиев С.И. Анализ аминокислотных препаратов методом капиллярного электрофореза // Пути и формы совершенствования фармацевтического образования: Материалы Всерос. конф. Воронеж, 2007. С. 321.

115. Пахомова О.А., Клоков Г.А., Коренман Я.И. Электрофоретическое определение аминокислот в синтетических лекарственных препаратах // 73 конф. молодих вчених, acnipaHTiB i студештв, Кив, Украша. Киев, 2007. Ч. I. С. 111.

116. Пахомова О.А. Новые экстракционные системы для определения ос-аминокислот в водных средах: Дис. . канд. хим. наук / Пахомова Оксана Анатольевна. Саратов, 2007.

117. Казицына JI.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ-, ИК-, ЯМР- и масс-спектроскопии в органической химии. М.: Высш. шк., 1979. 240 с.

118. Берштейн Н.Я., Каминский Ю.Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии. Л.: Химия, 1986. 200 с.

119. Marchon J., Claeys-Bruno М., Pecaut J. Analysis of mixtures of amino acid en-antiomers by IH NMR spectroscopy using cobalt (III) and rhodium (III) chiro-porphyrins as chiral shift reagents // Intern. J. Astrobio. 2004. № 6. P. 104-108.

120. Коренман И.М. Фотометрический анализ. Методы определения органических веществ. М.: Химия, 1975. 360 с.

121. Духанина И.В., Айрапетова А.Ю., Лазарян Г.Д., Васиоенко Ю.К. Количественное определение аминокислот в пыльце (обножке) // Фармация. 2009. № 6. С. 22-23.

122. Простолупова A.B., Ярыгина Т.И., Вдовина Г.П. Спектрофотометрическое • ' определение калия аспарагината// Фармация. 2009. № 6. С. 16-18.

123. Мокшина Н.Я. Экстракция аминокислот и витаминов. Воронеж: ВГТА, 2007. 246 с.

124. Симонян A.B., Саламатов A.A., Покровская Ю.С., Аванесян A.A. Использование нингидриновой реакции для количественного определения а-аминокислот в различных объектах: Метод, рекомендации. Волгоград, 2007.

125. Xiqui W., Jingfeng L., Hongyin W., Qimude W. Количественное определение метионина методом производной инфракрасной спектроскопии с применением внутреннего стандарта // Spectrosc. And Spectral Anal. 2000. Vol. 20, № 4. P. 484-488.

126. Рошаль E.P., Сенаторова В.Н., Шолин А.Ф. УФ-спектрофотометрическое определение ароматических аминокислот // Хим.-фарм. жури. 1991. Т. 35, №З.С. 80-83.

127. Казначеев A.B. Спектрофотометрическое определение ароматических и гетероциклических аминокислот в их смесях//Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55, № 4. С. 375-377.

128. Орос Г.Ю., Мокшина Н.Я., Селеменев В.Ф. Применение методов хроматографии и спектроскопии для идентификации пигментов белковых гидроли-затов // Сорбц. и хроматогр. процессы. 2003. Т. 3, № 5. С. 543-551.

129. Аникина Н.В., Пудель М.Е. Спектрофотометрическое определение цистина //Хим.-фарм. журн. 1983. Т. 17, № 2. С. 244-245.

130. Рожнова О.И., Котова Д.Л., Селеменев В.Ф., Крысанова Т.А. Спектрофотометрическое определение цистеина в водном растворе // Журн. аналит. химии. 1999. Т. 54, № 12. С. 1265-1267.

131. Казначеев A.B., Хохлова O.Ii., Селеменев В.Ф., Хохлов В.Ю., Мокшина Н.Я. Спектрофотометрическое определение ароматических и гетероциклических аминокислот в их смесях // Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55, № 4. С. 375-377.

132. Ананьева И.А., Шаповалова E.H., Шпигун O.A., Армстронг Д.В. Разделение оптически активных аминокислот и изомеров их производных на мак-роциклическом антибиотике «Тикопланип» // Жури, аналит. химии. 2009. Т. 64, № 7. С. 703-708.

133. Tonellato U. Reactivity and selectivity in aggregate systems // Pure&Appl. Chem. 1998. Vol. 70. P. 1961-1968.

134. Великанова О.Ф. Спектрофотометрический метод определения суммарного количества аминокислот в сыворотке крови // Лаб. дело. 1981. № 11. С. 701-702.

135. Евгеньев М.И., Евгеньева И.И. Избирательное спектрофотометрическое определение пролина и триптофана в присутствии других аминокислот в виде 4,6-динитробензофуроксановых производных // Журн. аналит. химии. 2000. Т. 55, №8. С. 825-829.

136. Балаховский И.С., Варфоломеев В.А. Определение суммарного количества аминокислот в крови и других биологических жидкостях // Лаб. дело. 1977. №4. С. 213-216.

137. Гутикова Л.В. Содержание аминокислот в грудном молоке кормящих женщин //Клин. лаб. диагностика. 2007. № 7. С. 21-23.

138. Karaiste R., Atkinson I., Shorter J. Knight A., Keene F. Molecular beam spectroscopy of molecules with low volatility via laser desorption from thin films containing particulate silver // Anal. Chem. 1993. Vol. 65, № 20. P. 2776-2783.

139. Зегря Г.Г. Новый метод диагностики аминокислот с помощью полупроводниковых квантовых точек // Письма в ЖТФ. 2006. Т.32. вып. 4. С.75-80.

140. КоренманИ.М. Новые титриметрические методы. М.: Химия, 1983. 176 с.

141. Бауэр К. Анализ органических соединений. М.: Изд-во иностр. лит., 1953. С. 470.

142. Глицин таблетки сублингвальные 0,1 г: ФСП 42-0025265-02-99-7.06.2002.

143. Доссон Р., Эллиот Д. Справочник биохимика. М.: Мир, 1991. 544 с.

144. European Pharmacopoeia. Cystine. Sainte-Ruffin-France, 1977. P. 702.

145. Мискиджьян С.П., Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов. Киев: Вища шк., 1976. 232 с.

146. Шайдарова Л.Г., Федорова И.Л., Улахович Н.А., Будников Г.К. Инверси-онно-вольтамперометрическое определение некоторых аминокислот на модифицированных краун-эфирами угольно-пастовых электродах // Журн. аналит. химии. 1997. Т. 52, № 3. С. 268-272.

147. Abbaspour A., Ghaffarinejad A., Safaei E. Determination of L-histidine by modified carbon paste electrode using tetra-3,4-pyridinoporphirazinatocopper (II) // Talanta. 2004. Vol. 64, № 4. P. 1036-1040.

148. Шведене H.B. Применение метода дифференциальной импульсной вольт-амперометрии для количественного определения аминокислот // Вестн.• ■ Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1988. Т. 29, № 1. С. 77-88.

149. Швядас В.Ю. О возможности вольтамперометрического определения ос-аминокислот//Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 1984. Т.25, №1. С.56-58.

150. Moreno L., Arben М., Saurina J. Analysis of amino-acids in complex samples by using volt-ammetry and multivariate calibration methods // Anal. Chim. Acta. 2004. Vol. 507, № 2. P. 247-253.

151. Вахобова Р.У., Рачинская Г.Ф., Лыкова Ф.П. Определение алапина по полярографическому каталитическому току в растворах молибдена (VI) и гидроксиламина// Журн. аналит. химии. 1992. Т. 47, № 2. С. 403-405.

152. Левина И.И., Чечекин Г.В., Арзамасцев А.П., Григорьев Н.Б., Гаевский А.В. Непрямое полярографическое определение триптофана, триптамина и серотонина в водно-органических растворах формальдегида // Хим.-фарм. журн. 1997. Т. 31, № 10. С. 50-51.

153. Ивановская A.M., Орлов Е.Ю., Агилов В.А. Полярографическое определение метионина при анодной поляризации // Фармация. 1992. Т. 41, № 1. С. 72-73.

154. Shiu Kwok-Keung, Chan Wing-Hong, Lee Wai-Ming, Wong Wai-Cheang. Differential-pulse polarographic micro-determination of amino acids via in situ generation ofdithiocarbamates//Analyst. 1993. Vol. 18, № 7. P. 869-872.

155. Мокшина Н.Я., Пахомова O.A., Нифталиев С.И. Электрохимическое определение ароматических аминокислот в экстрактах на основе гидрофильных растворителей // Журн. аналит. химии. 2007. Т. 62, № 10. С. 1072-1078.

156. Мокшина Н.Я., Пахомова О.А., Зыков А.В., Коренман ЯМ. Оптимизация условий экстракции и определения ароматических аминокислот и водорастворимых витаминов // Аналитика России: Материалы III Всерос. конф. Краснодар, 2009. С. 407.

157. Депеш И. Титрование в неводных средах. М.: Мир, 1977. 413 с.

158. Крешков А.П., Быкова Л.Н., Казарян II.A. Кислотно-основное титрование в неводных средах. М.: Химия, 1967. 100 с.

159. Сиггиа С., Ханна Дж.Г. Количественный органический анализ по функциональным группам. М.: Химия, 1983. 132 с.

160. Ионселективные электроды в анализе и исследовании органических соединений: сб. работ. М.: ИНХС АН СССР, 1989. С. 87.

161. Абдуллина С.Г., Лира О.А., Петрова И.К., Зиятдинова Г.К., Будников Г.К. Кулонометрическое определение глутаминовой кислоты // Фармация. 2009. №5. С. 5-10.

162. Liu A., Wang Е. Amperometric detection of amino acids in a flow-injection system with a nickel(II)-modified electrode with an Eastman AQ polymer film // Anal. Chim. Acta. 1993. Vol. 280, № 2. P. 223-229.

163. Пискунова M.C., Сергеев Г.М. Определение низких содержаний протоли-тов методом потоковой кондуктометрии в аминокислотных средах // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 1999. Т. 42, № 6. С. 117-121.

164. Фицева Н.А. Определение некоторых а-аминокислот методами проточно-инжекционного и непрерывного поточного анализа с использованием мембранной эксракции // Журн. аналит. химии. 1998. Т. 53, № 7. С. 729-733.

165. Аристов И.В., Бобрешова С.В., Стрельникова М.В. Ионизация глицина и L-лизина в смешанном водном растворе // Электрохимия. 2002. Т. 38, № 5. С. 633-636.

166. Катралл Р.В. Химические сенсоры / пер. с англ. М.: Научный мир, 2000. 143 с.

167. Проблемы аналитической химии / отв. ред. Ю.А. Клячко, С.М. Беленький. Т. VIII. Методы анализа пищевых продуктов. М.: Наука, 1988. С. 270.

168. Шведене Н.В. Селективные электроды на органические ионы // Соросов-ский образовательный журнал. 2004. Т. 8, № 2. С. 37-43.

169. Leyzerovich N.N., Shvedene N.V., Blikova Yu.N. et al. Comparative study of metall-phtalocyanates as active component in sal-selective electrodes // Electro-analysis. 2001. Vol. 13, № 3. P. 246-252.

170. Титова Н.Ю. Потенциометрический биосепсор для анализа содержания метилового эфира L-триптофана // Аналитические приборы: Тез. докл. 3 Всерос. конф. СПб., 2008. С. 115.

171. Кленкова Н.И. Структура и реакционная способность целлюлозы. М.: Наука. Ленингр. отд-ние, 1976. 376 с.

172. Хроматография на бумаге / под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. М.: Изд-во иностр. лит., 1962. 851 с.

173. Попечителев Е.П., Старцева О.Н. Аналитические исследования в медицине, биологии и экологии. М.: Высш. шк., 2003. 279 с.

174. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. 288 с.

175. Файгль Ф. Капельный анализ органических соединений / пер. с англ. под ред. проф. В.И. Кузнецова. М.: Гос. науч.-техн. изд-во химич. лит., 1962. 836 с.

176. Khan A.A. Studies о^ kinetics and mechanism of interaction of a-aminoacids with ninhydrin // J. Indian Chem. Soc. 1989. Vol. 66, № 7. P 454-456.

177. MacFadyen D.A., Fowler N. On the mechanism of the reaction of ninhydrin with a-amino acids. II. A spectrophotometric study of hydrindantin reactions // J.Biol. Chem. 1950. P. 10-22.

178. Гааль Д., Медьеши Г., Верецкеи JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул / пер. с англ. под ред. проф. Е.И. Розснгарта. М.: Мир, 1982.448 с.

179. Аристов И.В., Бобрешова О.В., Елисеев С.Я., Кулинцов ГШ. Подвижность ионов глицина и аланина в солянокислых водных растворах при 25°С // Электрохимия. 2000. Т. 36, № 3. С. 361-364.

180. Berthon G. The stability constants of metal complexes of amino acids with polar side chains //Pure&Appl. Chem. 1995. Vol. 67. P. 1117.

181. Sovago J., Kiss Т., Gergely A. Critical survey of the stability constants of complexes of aliphatic amino acids // Pure&Appl. Chem. 1993. Vol. 65. P. 1029,

182. PettitL.D. Critical survey of formation constants of complexes ofhistidine, phenylalanine, tysosine, L-Dopa and tryptophan // Pure&Appl. Chem. 1984. Vol. 56. P. 247.

183. Агупова M.B., Паршина A.B., Бобрешова O.B., Кулинцов П.И. Новый способ определения доннановского потенциала в электромембранных процессах // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8, вып. 2. С. 241-245.

184. Агупова М.В., Бобрешова О.В., Бобринская Г.А., Якунина Т.В. Определение лизина после разделения смешанных растворов лизина и глицина с использованием катионита КУ-2-8 // Сорбционные и хроматографические процессы. 2008. Т. 8, вып. 6. С. 931-941.

185. Бобрешова О.В., Агупова М.В., Паршина А.В. Определение лизина в вод' ' ных растворах с использованием модифицированных перфторированныхмембран // Журн. аналит. химии. 2009. Т. 64, № 6. С. 660-665.

186. Бобрешова О.В., Паршина А.В., Тимофеев С.В., Полуместная К.А. Пат 87260 РФ. № 2009115481; заявл. 23.04.2009; опубл. 27.09.2009; бюл. № 27. 2 с.

187. Зяблов А.Н., Калач А.В., Жиброва Ю.А., Селеменев В.Ф., Дьяконова О.В. Определение глицина в водных растворах ■ пьезосенсором, модифицированным полимером с молекулярным отпечатком // Журн. аналит. химии. 2010. Т. 65, № 1.С. 93-95.

188. Jia-Xie Z., Jin-Rui X. Chiral amino-acid electrode for the determination of D-alanine // Chem. J. Chin. Univ. 1999. Vol. 20, № 20. P. 109-113.

189. Sarkar P., Tothill I.E., Setford S.J. Screen-printed amperometric biosensors for the rapid measurement ofL- and D-amino acids // Analyst. 1999. Vol. 124, № 6. P. 865-870.

190. Альберт А., Сержент E. Константы ионизации кислот и оснований. М.: Химия, 1964. 180 с.