Влияние модификаторов подвижных фаз на разделение аминокислот методом ТСХ на силикагеле

Ворожейкин, Сергей Борисович

Влияние модификаторов подвижных фаз на разделение аминокислот методом ТСХ на силикагеле тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.02 ВАК РФ

Ворожейкин, Сергей Борисович АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Саратов МЕСТО ЗАЩИТЫ

2012 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.02 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Влияние модификаторов подвижных фаз на разделение аминокислот методом ТСХ на силикагеле»

Автореферат диссертации на тему "Влияние модификаторов подвижных фаз на разделение аминокислот методом ТСХ на силикагеле"

005016822

На правах рукописи

Ворожейкин Сергей Борисович

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ ПОДВИЖНЫХ ФАЗ НА РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ТСХ НА СИЛИКАГЕЛЕ

02.00.02. - аналитическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 0 Т'"1

Саратов - 2012

005016822

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского»

Научный руководитель Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Штыков Сергей Николаевич

Селеменев Владимир Федорович

доктор химических наук, профессор, Воронежский государственный университет, заведующий кафедрой

Барышева Светлана Владимировна

кандидат химических наук, Энгельсский технологический институт Саратовского государственного технического университета, доцент

Самарский государственный университет

Защита состоится 25 мая 2012 года в 1600 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.07, созданного на базе ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н.Г.Чернышевского», 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, СГУ, корп.1, Институт химии.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.

Автореферат разослан «23» апреля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор химических наук

Русанова Т.Ю.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Важная биохимическая роль и широкое применение аминокислот в фармацевтике, медицине, биотехнологии, пищевой промышленности, спортивной практике, широкий ассортимент выпускаемых на их основе коммерческих продуктов достаточно стандартного состава требуют разработки простых методов их разделения, идентификации и количественного определения в различных смесях. Одним из таких методов является тонкослойная хроматография. Несмотря на принадлежность к одному классу химических соединений, признаком которого является присутствие в молекулах а-аминокислот одних и тех же функциональных групп, их химические и сорбционные свойства, вследствие различной природы и структуры основной части углеводородного остова молекулы, могут существенно различаться. В связи с этим аминокислоты подразделяют на несколько родственных групп.

Наиболее известна классификация, основанная на общей полярности молекулы, по которой аминокислоты делят на 4 группы: гидрофобные (неполярные), полярные, но незаряженные, полярные отрицательно заряженные и полярные положительно заряженные при рН 6-7 аминокислоты. Такое разнообразие свойств аминокислот предполагает возможность регулирования эффективности и селективности их разделения с помощью различных по природе подвижных фаз (ПФ). Разделению аминокислот методом ТСХ посвящено большое количество публикаций, однако полной предсказуемости влияния природы различных модификаторов ПФ, в том числе мицеллярных подвижных фаз, до сих пор не имеется.

Цель: работы состояла в оценке влияния модификаторов водно-органических и водных подвижных фаз на хроматографическое разделение различных групп аминокислот методом ТСХ на силикагеле.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить влияние природы и концентрации гидрофобных нелокализующихся (дихлор-, трихлор-, тетрахлорметана) и локализующихся протонных (этанол) и апротонных (диметилформамид) модификаторов ПФ, на подвижность и разделение аминокислот на силикагеле;

- изучить влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) различных типов (катионные, анионные и неионные) на подвижность аминокислот в водных ПФ на силикагеле;

рассчитать количественные характеристики, характеризующие эффективность хроматографического разделения и разрешение хроматографических зон для всех исследованных подвижных фаз и сорбатов;

- выявить зависимость подвижности аминокислот от рН среды и ионной силы в мицеллярных подвижных фазах;

- оценить возможность практического применения изученных систем для разделения и определения аминокислот в реальных объектах.

Научная новизна работы:

- выявлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы нелокализующихся хлоруглеводородных модификаторов, а также локализующихся модификаторов (этанола и диметилформамида) водно-органических ПФ на подвижность и хроматографическое разделение 17 аминокислот различных групп методом ТСХ на силикагеле;

- установлены зависимости, характеризующие влияние концентрации и природы мицелл ПАВ в водной ПФ на подвижность и хроматографическое разделение различных групп аминокислот методом ТСХ на силикагеле;

- рассчитаны параметры, характеризующие эффективность и селективность хроматографического разделения аминокислот методом ТСХ на силикагеле в водно-органических и мицеллярных водных ПФ;

- найдены оптимальные условия разделения аминокислот, принадлежащих разным группам, в водно-органических и водных ПФ на основе динамических модификаторов и показана возможность применения в ТСХ всех видов ПФ для разделения и определения аминокислот.

Практическая значимость работы. Полученные результаты позволяют расширить возможности метода ТСХ на силикагеле при разделении аминокислот, используя для динамической модификации водно-органических ПФ локализующиеся и нелокализующиеся растворители различной природы, и ПАВ для водных ПФ.

Предложены методики разделения и полуколичественного определения аминокислот в трех коммерческих препаратах биологически-активных добавок «Фактор роста», «ВСАА» и «Элтацин». На защиту выносятся:

- зависимости подвижности аминокислот от концентрации и природы модификаторов в водно-органических подвижных фазах, параметры эффективности и селективности их разделения на силикагеле;

- результаты влияния природы и концентрации ПАВ как модификаторов водных ПФ, кислотности среды и ионной силы раствора на подвижность аминокислот, параметры эффективности и селективности их хроматографирования в мицеллярных подвижных фазах;

- результаты применения водно-органических и мицеллярных ПФ для тестирования и количественного определения аминокислот в реальных объектах.

Личный вклад автора заключается в экспериментальном исследовании хроматографического поведения аминокислот в водно-органических и водных мицеллярных ПФ, выявлении концентрационных и других зависимостей их подвижностей, расчете параметров эффективности и селективности разделения, обработке, оформлении, обсуждении полученных результатов, подготовке публикаций, выявлении направлений их практического применения.

^ Апробация работы. Основные результаты работы изложены на V Международной научной конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных

регионов» (Элиста, 2006), У1-УШ Всероссийских конференциях молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов 2007, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), I Всероссийском симпозиуме с международным участием по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 работ в виде 1 статьи в журнале ВАК, 5 статей в сборниках и 2 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста включая введение, 4 главы, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 138 источника, приложение и список сокращений. В работе содержится 45 таблиц и 62 рисунка.

Благодарность. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю д.х.н., профессору Штыкову С.Н. за постоянное внимание к работе и участие в обсуждении результатов, а также Башко Е.С. за помощь при апробировании разработанных методик.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, изложена новизна, практическая значимость результатов и основные результаты выносимые на защиту.

В главе 1 представлено обобщение и систематизация литературных данных по современным методам, способам и приемам разделения и определения аминокислот, показаны преимущества и недостатки каждого из методов. Более подробно описаны способы, подвижные и неподвижные фазы, применяемые при разделении аминокислот методом ТСХ в водно-органических и мицеллярных ПФ.

В главе 2 описаны реактивы и оборудование, использованные в работе. Объектами исследований явились аминокислоты: валин (вал), лейцин (лей), изолейцин (иле), фенилаланин (фен), триптофан (три), а также метионин (мет) и пролин (про), которые можно отнести к гидрофобным (далее 3 группа), поскольку углеводородный радикал аминокислоты не содержит ионизируемых групп. Представителями незаряженных при рН 6-7 аминокислот, способных образовывать водородную связь с молекулами воды и спиртами, были глицин (гли), серин (сер), треонин (тре), цистеин (цис), аспарагин (асн) (далее 2 группа). Гидрофильными двухзарядными анионами являлись аспарагиновая (асп), глутаминовая (глу) кислоты, а двухзарядными катионами - лизин (лиз), аргинин (арг), гистадин (гис) (далее 1 группа).

Хроматографирование проводили методом восходящей ТСХ в стандартных герметичных камерах производства ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар. Использовали пластинки «Сорбфил» (сорбент силикагель СТХ-1А, зернение 5-17 мкм, толщина слоя 110 мкм, размер пластинки 100x100 мм), ЗАО «Сорбполимер». Детектирование и количественную обработку

хроматограмм проводили на видеоденситометре "Сорбфил", ЗАО «Сорбполимер». В качестве подвижных фаз использовали водные растворы поверхностно-активных веществ (ПАВ) и кислотные водно-органические смеси, содержащие дихлор-, трихлор- и тетрахлорметан, этанол и диметилформамид (ДМФА). Объем ПФ составлял 5 мл, объем наносимой пробы - 1 мкл. ПАВ содержали более 98 % основного вещества, а растворители имели квалификацию «чда» и «хч».

Для оценки эффективности и селективности процесса разделения исследуемых соединений в мицеллярных и водно-органических ПФ использовали следующие характеристики: число теоретических тарелок (>0, высоту, эквивалентную теоретической тарелке (ВЭТТ) и коэффициент селективности (а). В главах 3-4 приведены результаты

экспериментальных исследований. \

Хроматографическое поведение аминокислот на силикагеле в ПФ модификатор : этанол : ледяная уксусная кислота : вода

Изучено влияние природы и концентрации динамических модификаторов в водно-органических ПФ на основе уксусной кислоты, этанола и воды на подвижность, эффективность и селективность хроматографирования 17 аминокислот. В качестве модификаторов использовали дихлор-, трихлор- и тетрахлорметан. Варьирование концентрации модификаторов в присутствии постоянной концентрации этанола позволило установить, что гидрофильные аминокислоты в данных ПФ почти не разделяются. Наилучшее разделение двух других групп аминокислот достигается при концентрации хлоруглеводородов равной 47% (табл. 1), что в целом соответствует данным, описанным в литературе для трихлорметана.

Таблица 1. Оптимальные концентрации хлорсодержащего модификатора ПФ для разделения аминокислот в присутствии этанола_

Модификатор СН2С12 СНС13 СС14

Объемная доля % 28 36 47 56 62 28 36 47 56 62 28 36 47 56 62

1 группа +/- +/- +/- +/- +/-

2 группа +/- + +/- + +/- + +

3 группа +/- + +/- + + + +/- + +

1 группа- гидрофильные аминокислоты (арг, лиз, асп, глу, гис)

2 группа - незаряженные аминокислоты (гли, тре, сер, цис, асн)

3 группа - гидрофобные аминокислоты (мет, вал, три, фен, лей, иле, про)

+ - означает полное разделение, а +/- - только частичное разделение в группе.

Для анализа полученных результатов нами рассчитаны параметры полярности смесей указанных трех типов ПФ по Снайдеру, численные значения которых представлены в таблице 2. Чем больше величина индекса, тем больше полярность четырехкомпонентной ПФ. Примеры полученных

графических зависимостей подвижности от параметра Снайдера при 47% модификатора представлены на рисунке 1.

Из полученных результатов следует, что параметр силы растворителя (е°), модификатора - хлорпроизводного метана - в такой многокомпонентной ПФ не определяет изменение подвижности аминокислот. Этот параметр отражает силу взаимодействия растворителя с поверхностью НФ и изменяется

Таблица 2. Значения индексов полярности Снайдера ПФ с этанолом (РСМеси)

Модификатор Процентное содержание модификатора в ПФ

62% 56% 47% 36% 28%

СНС13 4,40 4,45 4,51 4,60 4,66

СН2С12 3,78 3,89 4,05 4,24 4,37

СС14 2,85 3,06 3,35 3,70 3,95

0,6 ■ 0,4 0,2 0

Р=3,35 Р=4,05

Р=4,51

"'1

- • Гли 0,8 -

—"—Тре 0,6 ■

—•—Сер 0,4 -

—•— Асп

0,2 -

—1 0 -

Р=3,35 Р=4,05

Р=4,51

-Мет -Вал -Три -Фен -Лей -Иле -Про

СС14

СН2С12 СНС13 Модификатор

СС14

СН2С12 СНС13 Модификатор

Рис. 1. Влияние полярности ПФ на подвижность (а) незаряженных, (б) гидрофобных аминокислот.

для силикагеля в ряду СН2С12>СНС13>СС14 : 0.32>0.26>0.11. Из рис.1 видно, что изменение величины Иг, не соответствует этой последовательности. В большей степени подвижность, как незаряженных, так и гидрофобных аминокислот зависит от обобщенной полярности ПФ по Снайдеру, которая также отражает полярность растворителя, но принимает во внимание его межмолекулярное взаимодействие с растворенной частицей. Следует заметить, что в этой же последовательности изменяется и полярность по Снайдеру самих модификаторов СНС13>СН2С12>СС14: 4.1>3.1>1.6.

Таким образом, полярность всей ПФ в нашем случае зависит от природы введенного модификатора (см. табл. 2), т.к. остальные компоненты ПФ остаются неизменными. Видно, что чем больше полярность системы растворителей, образующих ПФ, тем меньше аминокислот, т.е. тем сильнее аминокислоты удерживаются неподвижной фазой. Отсутствие линейной зависимости подвижности от числа атомов хлора в молекуле углеводорода объясняется тем, что хлороформ является в большей степени протонодонором,

чем его гомологи, и может сильнее взаимодействовать как с поверхностью силикагеля, так и аминокислотами.

При варьировании концентрации хлорсодержащего модификатора в ПФ обнаружена обратная тенденция. Уменьшение его содержания и, в связи с этим, увеличение общей полярности ПФ, вследствие возрастания относительной концентрации высокополярных компонентов - этанола, воды и уксусной кислоты - увеличивает подвижность исследуемых аминокислот за счет усиления межмолекулярных взаимодействий между указанными протонсодержащими компонентами и аминокислотами в объеме ПФ. Таким образом, введение нелокализующихся хлорутлеводородов позволяет, по-видимому, изменять состояние поверхности силикагеля и её взаимодействие с другими компонентами ПФ и аминокислотами. В пользу этого свидетельствует также тот факт, что чем больше концентрация модификатора во всех ПФ, тем меньше время элюирования.

Можно отметить также, что чем больше гидрофобность хлоруглеводорода и аминокислот и меньше полярность ПФ, тем выше подвижность сорбатов. Оба факта свидетельствуют о том, что в таких ПФ на удерживание в большей степени влияет, по-видимому, взаимодействие с НФ полярных групп аминокислот, а не их гидрофобность. Интересно, что индекс полярности Снайдера для хлороформа при изменении его концентрации в указанных пределах меняется мало (см. табл.2), а подвижность (ДЯГ) растет существенно. Для ди- и тетрахлорметана, наоборот, индекс полярности меняется существенно, а ДИг, наоборот, незначительно. Величина ДЯг (или угол наклона концентрационной зависимости), кроме пролина (а для тетрахлорметана лейцина и изолейцина), практически не зависит от природы аминокислоты. Хотя все 3 модификатора принадлежат к одной группе нелокализующихся на силикагеле растворителей, хлороформ имеет наибольший индекс полярности и, кроме того, является протонодонором, т.е. наиболее сильно может изменять поверхность силикагеля и её взаимодействие с аминокислотами. Кроме того, хлороформ и дихлорметан принадлежат к VIII и V группам растворителей по Снайдеру, соответственно. В УШ группе селективность обусловлена в основном протонодонорными, а в V -дипольными свойствами растворителя в треугольнике селективности Снайдера.

Расчет методом наименьших квадратов зависимости подвижности аминокислот от концентрации модификатора в интервале 36-62% в системах с этанолом показал, что в основном они имеют линейный характер (табл.3), хотя в ряде случаев эта линейность соблюдается в более узком интервале концентраций модификатора. Анализ зависимостей подвижности аминокислот от их молекулярной массы показал, что при её увеличении примерно до 140, подвижность аминокислот растет, а далее практически не изменяется.

Установленные зависимости позволяют сделать заключение, что для лучшего разделения аминокислот в их смеси следует использовать элюент с хлористым метиленом в концентрации 47-56 % от общего объема исходного

элюента, поскольку в этих условиях достигается наибольшая эффективность процесса хроматографирования (рис.2). Рассчитаны параметры эффективности

Таблица 3. Уравнения линейных зависимостей подвижности аминокислот

в системах с этанолом в интервале концентраций модификатора 36 - 62%

АК Модификатор

СНС13 Я СН2С12 Я2

Асп -0,006х+0,388 0,933

Гис - 0,002х + 0,188 0,920

Гли -0,013х + 0,787 0,906 -0,010х+0,667 0,906

Тре -0,018х+ 1,09 0,905 -0,01 Зх+0,848 0,926

Цис -0,013х +0,853 0,969 -0,011х+0,813 0,970

Асн -0,012х+0,760 0,966

Мет -0,019х + 1,28 0,962 -0,009х+0,844 0,955

Вал -0,018х + 1,21 0,949 -0,008х+0,741 0,902

Три -0,012х+1,01 0,902

Фен -0, 017х + 1,27 0,952 -0,013х+1,08 0,935

Лей -0, 019х + 1,31 0,959

Иле -0,0104х+0,909 0,908

Про -0,0080х+0,583 0,924

Таблица 4. Параметры эффективности и селективности разделения аминокислот при различных концентрациях хлористого метилена с этанолом

АК 36% 47%

Яг ШЮ"2 Нх10"2 мкм а Иг ЫхШ"2 НхЮ"2 мкм а

Гли 0,46 0,21 6,9 - 0,35 0,22 6,9 -

Тре 0,54 0,42 2,5 20 0,45 0,62 2,5 7,8

Сер 0,48 0,71 3,6 19 0,39 0,82 3,6 8,2

Асн 0,43 0,52 4,1 20 0,31 0,33 4,1 6,3

Мет 0,71 2,1 0,51 9,1 0,65 4,1 5,2 10

Вал 0,66 3,1 0,88 7,2 0,59 3,5 8,7 5,5

Три 0,77 7,2 0,51 10 0,72 8,9 4,7 5,9

Фен 0,74 6,1 0,61 13 0,69 5,4 6,4 8,5

Лей 0,71 5,8 0,72 9,6 0,64 6,3 6,6 4,2

Иле 0,64 3,8 0,82 8,7 0,55 4,1 7,5 7,4

Про 0,43 1,6 2,1 - 0,39 1,6 2,1 -

Параметр селективности незаряженных АК рассчитан по отношению к глицину. Параметр селективности гидрофобных АК рассчитан по отношению к пролину.

и селективности разделения аминокислот при различных концентрациях хлоруглеводородов в ПФ с этанолом; пример расчета приведен в таблице 4.

А'1»"'«. , , г ч™ -м

^ и ч» ор* ^ ф + <(>« Г« ■ Ао,. с,«*»

а б

Рис. 2. Разделение гидрофобных аминокислот в ПФ: хлористый метилен : этанол : уксусная кислота : вода, а - 47%, б - 56% СН2С12. Слева направо: метионин, валин, триптофан, фенилаланин, лейцин, изолейцин, пролин.

Хроматографическое поведение аминокислот на силикагеле в ПФ модификатор : ДМФА : ледяная уксусная кислота : вода

Поскольку изменение природы модификаторов позволяет регулировать элюирующую силу и селективность разделения также за счет эффектов локализации растворителя на сорбенте и образования водородных связей нами сделана попытка заменить локализующийся протонодонорный компонент ПФ этанол на основный протонакцепторный ДМФА. Оптимальные ПФ в системе модификатор : ДМФА : ледяная уксусная кислота : вода в соотношении х : 4,5 : 1,3 : 0,6. для разделения аминокислот приведены в таблице 4. Таким образом, протонный растворитель этанол, способный образовывать водородные связи как с силанольными, так и силоксановыми группами силикагеля и с разделяемыми аминокислотами, был заменен на апротонный ДМФА, не способный взаимодействовать с силоксановыми группами и имеющий другой характер взаимодействия с силанольными группами и аминокислотами.

Таблица 4. Оптимальные концентрации хлорсодержащего модификатора ПФ для разделения аминокислот в присутствии ДМФА_

% модификатора СН2С12 СНС13 СС14

28 36 47 56 62 28 36 47 56 62 28 36 47 56 62

1 группа + + + + + + + + + +/-

2 группа +/- + + + + +/- + + +/-

3 группа +/- +/- +/- +/-

Рассчитанные значения индексов полярности по Снайдеру приведены в таблице 5. Видно, что такие ПФ более полярны, чем ПФ с этанолом и с уменьшением концентрации модификатора полярность растет значительнее.

Таблица 5. Значения индексов полярности Снайдера ПФ с ДМФА (РСМеси)-

Модификатор Процентное содержание модификатора в системе

62% 56% 47% 36% 28%

СНС1-, 4,96 5,11 5,30 5,54 5,72

СН2С12 4,34 4,55 4,83 5,18 5,43

СС14 3,41 3,72 4,13 4,64 5,01

Сравнение таблиц 4 и I и анализ данных показывают, что поведение аминокислот в присутствии апротонного ДМФА изменилось:

- стало возможным разделение полярных аминокислот 1 группы и невозможно гидрофобных аминокислот 3 группы;

- количество вариантов систем растворителей для разделения 1-2 групп увеличилось;

- разделение аминокислот 1-2 групп стало возможным при более низких концентрациях хлорсодержащих модификаторов;

- вследствие увеличения общей полярности ПФ с ДМФА, по сравнению с аналогичными ПФ на основе этанола, возросла общая подвижность аминокислот;

- при замене этанола на ДМФА уменьшилась ВЭТТ. Чем меньше концентрация ДМФА, тем больше разница в ВЭТТ. Например, при разделении незаряженных аминокислот в присутствии хлороформа и концентрации ДМФА 36% значения ВЭТТ в 2-8 раз меньше, чем в присутствии этанола. Пример хроматограмм для гидрофильных аминокислот дан на рис.3.

(лДЛ- иле- 4

ЧЛСЛУ'ОАА

а^г од »t

•Р М и/' 7 I ¡Ъ%СЙ,С1,:1)Ш'1>.

¿¿М «да«,/

5 ЦМ-Ы^И-

а б в

Рис. 3. Разделение гидрофильных аминокислот в ПФ: 36% модификатора : ДМФА : уксусная кислота : вода, а - СС14 , б - СНС1з , в - СН2С12. Слева направо: аргинин, лизин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, гистидин.

Так же как и для систем с этанолом, при увеличении полярности ПФ в результате изменения природы хлоруглеводородного модификатора подвижность аминокислот уменьшается, т.е. растет их конкуренция с компонентами ПФ при сорбции на силикагеле. Для гидрофильных

аминокислот этот эффект незначителен, а для незаряженных более выражен, особенно при большой концентрации модификатора (рис.4).

Влияние полярности системы при изменении концентрации модификатора на подвижность аминокислот также соответствует тенденции, найденной для этанола: с увеличением концентрации модификатора и уменьшением полярности ПФ подвижность аминокислот уменьшается (рис.5, 6). Таким образом, при высокой концентрации нелокализующегося хлоруглеводорода, как и в случае этанола, проявляется его экранирующая роль и аминокислота слабее сорбируется на неподвижной фазе. Как видно из рис. 6, в диапазоне концентраций хлороформа (и других хлоруглеводородов) от 28% до 47% улучшаются эффективность и селективность разделения: исчезают так называемые "хвосты", пятна становятся более компактными.

0,8 ■

0,6 -

0,4

0,2

Р=5,01 Р=5,43 Р=5,71

0,8 -|

—•— Гли 0,6 -

■ Тре

—♦—Сер 0.4 -

■ Асп

0,2 -

0 -

СС14 СН2С12 СНС13 Концентрация

Рис. 4. Влияние полярности ПФ, содержащей разные модификаторы, на подвижность незаряженных аминокислот.

- Арг Лиз

- Асп

- Глу -Гис

28%

Концентрация 5. Динамика

47%

Рис. 5. Динамика значений гидрофильных аминокислот при изменении концентрации ССЦ в ПФ, содержащей ДМФА.

[ Jvl. -и,

1ЦП. Oill wi l'f

~ мм-ну /

•f- 1Й W

юл чМ ."С

■ иш^уи

Рис. 6. Влияние концентрации СНО? (28%-47%) на разделение гидрофильных аминокислот.

Как и с этанолом, при увеличении концентрации модификатора длительность элюирования уменьшается. В целом же, процесс элюирования, в системах с ДМФА, более длителен во времени, по сравнению с элюированием в ПФ с этанолом. Зависимости подвижности аминокислот в случае ДМФА в интервале концентраций хлоруглеводорода 36 - 62% также имеют линейный

характер (табл. 6). Пример расчета параметров эффективности и селективности в ПФ, содержащей ДМФА приведен в таблице 7.

Таблица 6. Уравнения зависимостей подвижности аминокислот в ПФ с ДМФА в интервале концентраций модификатора 36 - 62%._

Аминокислота Модификатор

СНСЬ* R2 СН2СЬ R2

Apr -0,005х + 0,313 0,944 -0,005х + 0,302 0,984

Лиз - - -0,002х + 0,134 0,949

Асп -0,012х + 0,716 0,928 -0,011х +0,713 0,958

Глу -0,016х + 0,980 0,983 -0,011х +0,818 0,902

Гис - - -0,004х + 0,279 0,959

Гли -0,014х +0,815 0,983 -0,012х + 0,771 0,971

Тре -0,018х+ 1,06 0,929 -0,017х + 1,12 0,976

Сер -0,013х +0,795 0,963 -0,015х +0,983 0,991

Асн -0,013х +0,777 0,931 -0,012х + 0,745 0,968

Мет -0,025х + 1,62 0,988 -0,023х + 1,71 0,939

Вал -0,023х + 1,49 0,989 -0,021х + 1,54 0,913

Три -0,026х + 1,65 0,946 -0,024х + 1,76 0,919

Фен -0,024х+ 1,60 0,952 -0,021 х + 1,68 0.930

Лей -0,024х + 1,60 0,988 -0,023х + 1,77 0,922

Иле -0,025х + 1,64 0,988 -0,022х+ 1,68 0,934

Про -0,018х + 1,11 0,971 -0,018х + 1,26 0,962

У хлороформа линейная зависимость исследовалась в интервале 36-60%

Основываясь на результатах, полученных для водно-органических ПФ, следует отметить, что общая полярность ПФ зависит от природы введенного модификатора; чем больше эта полярность, тем меньше подвижность аминокислот, а следовательно, тем сильнее аминокислоты удерживаются неподвижной фазой. Варьируя же концентрацию модификатора, можно менять поверхность силикагеля, создавая, тем самым, оптимальные условия для хроматографического разделения аминокислот разных групп.

Таблица 7. Параметры эффективности и селективности разделения аминокислот в присутствии хлористого метилена и ДМФА._

АК 28% 36% 47%

Rf NxlO'2 HxlO"2 мкм а Rf NxlO"2 HxlO"2 мкм а Rt NxlO"2 HxlO"2 мкм а

Apr 0,39 1,4 1,1 5,7 0,26 0,44 2,3 8,5 0,19 0,87 0,81 5,2

Лиз 0,15 0,41 1,9 6,3 0,11 0,25 0,19 5,3 0,11 0,31 1,1 7,3

Асп 0,61 2,8 1,2 6,7 0,64 1,8 1,3 6,2 0,43 0,75 1,7 9,3

Глу 0,71 8,2 0,52 6,2 0,71 6,9 0,47 4,3 0,53 3,2 0,63 8,3

Гис 0,11 0,41 3,1 0,11 0,31 3,6 0,16 0,41 1,9

Гли 0,52 1,4 2,6 0,47 1,2 2,1 0,37 0,94 1,8

Тре 0,71 9,7 0,41 8,1 0,66 7,7 0,41 7,3 0,49 8,2 0,23 5,2

Сер 0,60 8,6 0,38 3,6 0,56 6,6 0,38 3,6 0,53 3,6 0,53 6,4

Цис 0,55 7,7 0,55 4,2 0,52 6,7 0,57 4,1 0,47 5,9 0,61 5,2

Асн 0,47 6,2 0,65 5,4 0,41 6,3 0,41 6,3 0,37 2,3 0,67 4,6

Параметр селективности гидрофильных АК рассчитан по отношению к гистидину.

Параметр селективности незаряженных АК рассчитан по отношению к глицину.

Замена протонодонорного растворителя этанола на апротонный ДМФА позволила ещё больше расширить вариабельность ПФ и улучшить эффективность хроматографического процесса. Полученные данные позволяют сделать вывод, что системы с этанолом и ДМФА дополняют друг друга и позволяют подобрать оптимальную ПФ для каждого конкретного объекта, содержащего те или иные группы аминокислот.

Хроматографическое поведение аминокислот в мицеллярных подвижных фазах

Как следует из анализа литературных данных число работ, посвященных применению мицеллярных подвижных фаз (МПФ) для разделения аминокислот, не более десяти, причем практически во всех используют обращенные НФ. Нами поставлена цель оценить возможность применения МПФ для разделения аминокислот на полярном силикагеле. Для достижения данной цели, изучали влияние следующих факторов:

- природы ПАВ;

- концентрации ПАВ;

- величины ионной силы раствора в МПФ, позволяющей регулировать взаимодействие аминокислоты с мицеллой;

- кислотности среды, позволяющей регулировать химическую форму аминокислоты в растворе.

1. Влияние анионного ПАВ - ДДС.

Изучено влияние водных растворов ионных и мицеллярных концентраций анионного поверхностно-активного вещества (АПАВ) -додецилсульфата натрия (ДДС) на разделение аминокислот. Установлено, что величина нейтральных аминокислот в присутствии мицелл ДДС близка к единице, т.е. их разделение практически невозможно, поэтому далее хроматографическое поведение аминокислот этой группы не рассматривается. Гидрофильные аминокислоты разделяются хорошо, а гидрофобные можно разделить лишь частично при более низкой концентрации ДДС (рис. 7). Влияние концентрации ДДС на подвижность гидрофильных аминокислот, параметры эффективности и селективность показано в таблице 8.

^ Ял <±/М' ии-

1 ~ о,«!>г м «в1

• •

а б

Рис 7. Разделение гидрофильных аминокислот в МПФ на основе 0,02 М ДДС (а) и гидрофобных аминокислот в МПФ на основе 0,005 М ДДС (б).

Установлено, что использование в качестве ПФ мицеллярного водного раствора ДДС обуславливает наличие на хроматограмме двойного фронта элюента, что соответствует литературным данным: первый фронт содержит главным образом воду и растворенные в ней ионы ДДС, а второй - воду и мицеллы ПАВ. С увеличением концентрации ДДС второй фронт постепенно ближается с первым. Показано, что аминокислоты - аргинин и лизин всегда находятся во втором фронте, поэтому изменение концентрации ДДС позволяет влиять на их подвижность. На примере этих двух аминокислот показано, что увеличение концентрации ДДС в ПФ сопровождается несколькими эффектами:

- увеличением подвижности обеих аминокислот, переносимых мицеллами;

- увеличением расстояния между их хроматографическими зонами (рис.8);

- большим удерживанием неподвижной фазой более гидрофобного лизина.

Следует отметить, что большее удерживание более гидрофобного лизина соответствует общей тенденции мицеллярной ТСХ и объясняется гидрофобизацией силикагеля при динамической адсорбции ДДС на поверхности сорбента. Установлено что, наилучшее разделение аминокислот возможно в интервале концентраций ДДС - 0,02-0,04 М.

Рис. 8. Влияние концентрации ДДС в ПФ на подвижность 1-лизин, 2-аргинин.

Ионная сила, создаваемая добавлением хлорида натрия, также сильно влияет на хроматографическое поведение аргинина и лизина. В диссертации представлены вычисленные нами значения параметров эффективности и селективности хроматографирования аминокислот при варьировании

мицеллярной концентрации ПАВ и ионной силы раствора. Увеличение концентрации электролита в растворе «высаливает» аминокислоты из водной среды в менее полярное мицеллярное окружение, т.е. увеличивает их солюбилизацию мицеллами ПАВ - переносчиками аминокислот. Следствием этого должно быть уменьшение сорбции аминокислот на неподвижной фазе и увеличение их подвижности в МПФ, что и наблюдалось в эксперименте. Графически влияние ионной силы раствора на примере гидрофильных аргинина и лизина показано на рис. 9а. Действие ионной силы уменьшается с увеличением мицеллярной концентрации ДЦС, поскольку этот фактор также улучшает солюбилизацию аналита. Установлено, что применять концентрации электролита более чем 0.13 М не рекомендуется, так как происходит размывание хроматографических зон.

Проверка влияния величины рН подвижной фазы вызвана большим числом основных и кислотных групп в молекулах аминокислот, способствующих реализации в растворе нескольких химических форм с разными сорбционными и солюбилизационными свойствами. Наиболее существенно рН влияет только на подвижность аргинина и лизина (рис 96). С увеличением рН подвижность аминокислот уменьшается, что связано с диссоциацией карбоксильных групп (перегиб кривых примерно соответствует рКдис в мицеллах ДДС) и отталкиванием анионов сорбатов от одноименно заряженной мицеллы ДДС.

Видно также, что растет ДЯ* (эффект дифференцирования), что является положительным фактором, однако из-за одновременного увеличения размеров пятен (уменьшения эффективности) использовать щелочную среду не рекомендуется. При низких значениях рН зоны аргинина и лизина более узкие и вытянуты вдоль основания пластинки. Зависимость времени элюирования гидрофильных и гидрофобных аминокислот от концентрации ДДС одинаковая: с её повышением время элюирования возрастает в 2-3 раза.

Ю'

0,7

0,6

0,5

0,4 -

0,3

0,02 Ионная сила

яг

0,8

ДДС

0,021 М 0,7

ДДС 0,6-

0.027 М

ДДС

0,033 м 0,5 ■

0,4 ■

- Лргинин -Лизин

2,6

5,2

рН

а б

Рис 9. Влияние ионной силы раствора на подвижность аргинина (а) и рН на подвижность аргинина и лизина (б).

2. Влияние катионного ПАВ - ЦПХ. Аналогичные исследования выполнены в ПФ с катионным ПАВ (КПАВ) - цетилпиридиний хлоридом (ЦПХ). Частичное разделение нейтральных и гидрофобных аминокислот

происходит только при достаточно высоких мицеллярных концентрациях ЦПХ (рис.10). Гидрофильные аминокислоты удалось разделить при концентрации ЦПХ 0,002 М. Следует отметить, что подвижность аспарагиновой и глутаминовой кислот, при данной концентрации, достаточна высокая, а аргинина и лизина, наоборот, низкая (см. рис. 10). По видимому, это связано с взаимным отталкиванием положительно заряженных полярных молекул аминокислот и катионных мицелл ПАВ.

Небольшой дифференцирующий эффект для гидрофильных аминокислот получен при введении в ПФ, содержащую ЦПХ, 0.4-0.5 М электролита (Рис.11а). Возможно, это объясняется усилением солюбилизации аминокислот и увеличивается подвижность аргинина и лизина.

Сильное влияние на разделение аминокислот оказывает кислотность ПФ (рис.116). В целом ход этой зависимости соответствует интервалам рН, смены одной химической формы аминокислоты в другую. Видно, что в щелочной среде происходит резкое снижение к, аргинина и лизина, поскольку в растворе начинают преобладать анионные формы аминокислот, которые, вероятно, сильнее взаимодействуют с положительно заряженной поверхностью сорбента за счет образования бислоя КПАВ.

Нейтральные аминокислоты частично делятся во всем интервале рН среды. Но наилучшее разделение наблюдается в щелочной среде. Данный факт объясняется тем, что нейтральные аминокислоты так же, как и гидрофильные, приобретают в данных условиях отрицательный заряд.

3. Влияние неионного ПАВ - Тритон Х-100. Аналогичные исследования для всех аминокислот выполнены в ПФ с неионным поверхностно-активным веществом (НПАВ) - Тритон Х-100 (ТХ-100).

jJ^t iOJAj früW ftUt.

• „

4« J^»

^ W- nxJf- К)Л\ или M-0 1 ' o,o05 Л I^IW

• •

а б

Рис. 10. Разделение гидрофильных аминокислот в МПФ на основе 0,002 М. ЦПХ (а) и гидрофобных аминокислот в МПФ на основе 0,005 М ЦПХ (б).

Как видно из рис. 12а в МПФ на основе ТХ-100 удалось разделить три представителя из пяти гидрофильных аминокислот - лизин, гистидин и глутаминовую кислоту и 5 гидрофобных аминокислот из семи (рис. 126).

Солюбилизация гидрофобных аминокислот нейтральными мицеллами происходит, по-видимому, за счет преимущественно гидрофобных взаимодействий.

Рассмотрено также влияние ионной силы раствора на разделение аминокислот. Как и для других МПФ, с увеличением ионной силы раствора существенно растет, в основном, подвижность лизина и аргинина (рис. 13а), для гистидина этот рост не превышает 0.1 ед. Г^, а для двух других аминокислот, идущих с фронтом растворителя, изменения практически отсутствуют.

' 1

0,8 -Ü.6 0,4 -0,2 О

Bi 0,8 -

- Аргинин

- Лизин

- Артнин

- Лизин

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Ионная сила

0 2 4

8 10 12 рн

а б

Рис. 11. Влияние ионной силы (а) и рН среды (б) на подвижность аргинина и лизина в ПФ, содержащей 0,03 М ЦПХ.

r>D

Г* S X Ч ЧЧ

а б

Рис. 12. Разделение гидрофильных (а), слева направо: лизин, глутаминовая кислота, гистидин; и гидрофобных (б) аминокислот (слева направо: метионин, валин, триптофан, фенилапанин, лейцин, изолейцин, пролин) в МПФ на основе 0,005 М ТХ-100.

Необходимо отметить, что модификация данной МПФ за счет введения хлорида натрия, позволила разделить 4 гидрофильные аминокислоты, например при ионной силе 0,1. Введение электролита в ПФ с ТХ-100, позволило выявить две закономерности для гидрофильных аминокислот -аргинина и лизина: во-первых, большую насыщенность окраски пятен аргинина и лизина с повышением ионной силы раствора, вероятно, за счет всаливания аминокислот в мицеллу и улучшения их реакции в мицеллярном

нанореакторе с нингидрином; во-вторых, увеличение подвижности сорбатов, за счет гидрофобизации неионным ПАВ гидрофильной поверхности силикагеля при его адсорбции на поверхности.

иг

0.9

0.8

0.7

0.6 -

0.5 -

0.4 -0

а б

Рис. 13. Влияние ионной силы (а) и рН (б) на подвижность аргинина и лизина в ПФ на основе 0,03 МТХ-100.

Зависимость подвижности от кислотности среды в МПФ на основе ТХ-100 имеет тот же характер, как и для КПАВ, объясняемый протеканием в растворе кислотно-основных реакций. На подвижность гидрофобных аминокислот кислотность среды практически не влияет. Разделить нейтральные аминокислоты, варьируя рН среды не удалось, по-видимому, из-за их плохой солюбилизации в мицеллах Тритон Х-100.

Резюмируя полученные данные по всем мицеллярным ПФ, можно сделать следующие выводы:

- хорошее разделение гидрофильных аминокислот происходит в МПФ, содержащей 0,002 М водный раствор ЦПХ, оно несколько лучше в МПФ, содержащей 0,02 М водный раствор ДДС; концентрации этих ПАВ в обоих случаях примерно в 2 раза превышают ККМ, т.е. в растворе присутствуют сферические мицеллы, что согласуются с тенденциями в ТСХ, известными для других классов соединений; основная проблема в обеих МПФ - разделение глутаминовой и аспарагиновой кислот; в 0,005 М растворе ТХ-100 возможно разделение трех гидрофильных аминокислот;

- гидрофобные аминокислоты частично разделяются во всех трех видах МПФ ДДС, ЦПХ и Тритон Х-100, при примерно одинаковой концентрации ПАВ, равной 0,005 М;

- при увеличении концентрации ПАВ, в большинстве случаев число теоретических тарелок увеличивается, а ВЭТТ - уменьшается, т.е. эффективность разделения улучшается;

- незаряженные аминокислоты частично можно разделить в МПФ на основе ЦПХ при концентрации 0,06 М;

- на разделение аминокислот сильное влияние оказывает рН среды и ионная сила раствора;

- зависимость длительности процесса элюирования от концентрации ДДС, для гидрофильных и гидрофобных аминокислот одинаковая: с повышением концентрации ДДС время элюирования растет; увеличение

концентрации ЦПХ и ТХ-100 практически не влияет на длительность процесса элюирования;

- с увеличением молекулярной массы гидрофильных аминокислот подвижность во всех МПФ уменьшается, а для нейтральных и гидрофобных, наоборот, возрастает.

Практическое применение метода ТСХ в мицеллярных подвижных фазах и на основе органических компонентов

В выбранных оптимальных условиях проведено разделение аминокислот в трех объектах: "Фактор роста", "Элтацин", "ВСАА 1000". Данные препараты повышают толерантность организма к физическим нагрузкам и увеличивают мышечную массу. Примеры хроматограмм, иллюстрирующих разделение аминокислот в выбранных объектах, представлены на рис. 14-15. Результаты количественного определения аминокислот в исследуемых объектах статистически обработаны. Для выявление выбросов в полученных выборочных совокупностях результатов определения аминокислот в коммерческих препаратах БАДов использовали рекомендованный в ГОСТ ИСО/МЭК 5725-2000 критерий Граббса (Р = 0.95). После отбрасывания выпадающих результатов для каждой ПФ вычисляли дисперсию и рассчитывали Р-критерий для пары водно-органическая ПФ/мицеллярная ПФ (Р = 0.95) и сравнивали полученную величину с табличной. Если Р,кс||<Гта6;1, дисперсии принимали однородными, а результаты равноточными. Наличие систематических погрешностей между средними значениями, полученными при использовании водно-органических и мицеллярных ПФ оценивали по Г-критерию. Обобщенные результаты вычислений представлены в таблице 8.

ЪЪСооззМ

<•; С'.

Т1Мт д : с ': п> х -.>г; - л*

Ч Ч'/с-

¥ л Н". '*"/' г*° .?•,■; 'УА;

а б

Рис. 14. Разделение гидрофильных аминокислот в ПФ на основе 0.03 М ДДС (а); слева - направо: арг, лиз, аспарагиновая и глутаминовая кислоты, гис. Цифры -аминокислоты, разделенные в БАДе "Фактор роста": 1-арг, 2-лиз, 3- орнитин; и (б) аминокислот в объектах "Фактор роста": 1-арг: 2-лиз; 3-орнитин; объекте "Элтацин": 1-глу; 2-гли; 3-цис; "ВСАА-1000": 1-лей; 2-иле; 3-вал ПФ: 47% СН2С12:ДМФА: СН,СООН: вода.

• • •

у£/ ¿ИМ

Ли

•3

г ем

100 с

а б

Рис. 15. Разделение гидрофобных (а) аминокислот; слева-направо: метионин, вапин, триптофан, фенилапанин, лейцин, изолейцин, пролин. Цифрами обозначены аминокислоты, разделенные в БАДе "ВСАА1000": 1- лей; 2- иле; 3- вал и незаряженных (б) слева-

направо: гли, тре, сер, цис, асн и глу. Цифры - аминокислоты, разделенные в БАДе "Элтацин": 1-глу, 2-гли, 3-цис. ПФ: 36% СНС13:ДМФА:СН3СООН: вода.

Таблица 8. Метрологические параметры определения аминокислот в БАДах с

Объект Ам. к-та п ПФ ш, мг в2 в К эксп. Р табл. 1 эксп. 1 табл.

x 5 я 8 в-о 94.6 3,51 1,88 5,07 3 6 4,58 2,12

- 15 ддс 88.3 17,8 4,22

н и и о. < 6 ЦПХ 86,9 35,6 5,97 10,1 4,74 2,21 4,3

дн о. 6 ТХ-100 89,3 41,3 6,43 11,8 4,74 1,41 4,3

о н 8 в-о 17,7 0,83 0,91 11,3 3,6 4,1 2,1

се е X в 15 ддс 21,2 9,36 3,06

- 5 ч 6 ЦПХ 21,2 5,34 2,31 6,4 4,74 2,55 4,3

6 ТХ-100 20,0 31 5,57 37,8 4,74 0,71 4,3

~х Гли 15 в-о 128 16,5 4,07 7,09 19,38 1,37 2,20

я я 6 ЦПХ 117 2,33 1,53

н ч Л >-> 15 в-о 130 33,1 5,75 1,09 19,35 0,746 2,20

и 6 ЦПХ 125 30,3 5,51

7 в-о 178 19,0 4,35 1,31 4,76 0,006 2,26

о ® Вал 4 ЦПХ 178 24,9 4,99

гн < < и со 8 ТХ-100 177 70 8,37 3,69 4,53 0,14 2,23

ч 7 в-о 184 64 8,0 1,02 8,94 0.51 2,26

Я 4 ЦПХ 186 63 7,94

8 ТХ-100 184 26,8 5,18 2,39 6,16 0,105 2,23

в-о - водно-органические ПФ.

ВЫВОДЫ:

1. Изучено влияние нелокализующихся ди-, три- и тетрахлорметана и локализующихся протонодонорного (этанол) и протоноакцепторного (диметилформамид) растворителей на хроматографическую подвижность 17 аминокислот, относящихся к полярным, неполярным и гидрофобным группам. Показано, что на их подвижность влияет полярность по Снайдеру четырехкомпонентной системы растворителей, образующей ПФ; чем она больше в ряду СНС1з>СН2С12>СС14, тем меньше Яг аминокислот, т.е. тем сильнее они удерживаются неподвижной фазой. Эта тенденция сильнее выражена для ПФ, содержащей в качестве второго модификатора этанол. Уменьшение концентрации хлорсодержащего модификатора, также увеличивающего полярность ПФ, увеличивает подвижность аминокислот за счет усиления межмолекулярных взаимодействий между полярными компонентами ПФ и аминокислотами.

2. Получены уравнения количественных зависимостей подвижности от концентрации ди-, три- и тетрахлорметана в ПФ, содержащих этанол и ДМФА, рассчитаны параметры эффективности и селективности хроматографического процесса для каждого вида водно-органических ПФ. Показано, что замена протонодонорного этанола на апротонный ДМФА позволяет расширить возможности ПФ и улучшить эффективность хроматографического процесса. Сделан вывод, что системы с этанолом и ДМФА дополняют друг друга и позволяют подобрать оптимальную ПФ для каждого конкретного объекта, содержащего те или иные группы аминокислот.

3. Изучено влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ как модификаторов подвижной фазы на разделение аминокислот на силикагеле. Показано, что модификация водной ПФ анионными (ДДС) и катионными (ЦПХ) ПАВ позволяют хорошо разделять гидрофильные аминокислоты при концентрации ПАВ в 2 раза превышающей критическую концентрацию их мицеллообразования, что согласуются с тенденциями мицеллярной ТСХ. В ПФ на основе 0,005 М ТХ-100 возможно разделение трех гидрофильных аминокислот. Гидрофобные и незаряженные аминокислоты разделяются во всех трех видах МПФ частично. Рост концентрации ПАВ в МПФ в большинстве случаев увеличивает число теоретических тарелок и уменьшает ВЭТТ. Впервые показано, что варьирование ионной силы раствора и рН среды позволяет дополнительно влиять на подвижность, эффективность и селективность разделения в МПФ.

4. С использованием полученных результатов проанализированы 3 коммерческих препарата биологически-активных добавок «Фактор роста», «ВСАА» и «Элтацин», содержащие аминокислоты. Установлено, что как водно-органические, так и мицеллярные ПФ позволяют тестировать указанные препараты на присутствие аминокислот и количественно определять эти аминокислоты методом ТСХ с применением денситометрических измерений интенсивности окрашенных зон. Показано, что содержание аминокислот в препаратах в целом соответствует заявленному в паспорте.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Ворожейкин С.Б., Башко Е.С., Штыков С.Н. Тонкослойная хроматография аминокислот в мицеллярных подвижных фазах на силикагеле // Сорбционные и хроматогр. процессы. 2011. Т.П. № 6. С.840-847.

2. Башко Е.С., Ворожейкин С.Б., Перфилова O.A., Штыков С.Н. Влияние додецилсульфата натрия на хроматографическое поведение аргинина и лизина на прямой фазе ТСХ // Современные проблемы теорет. и эксп. химии: Межвуз. сборник науч. трудов VIII Всерос конф. молодых ученых с международ, участием. - Саратов: Изд-во «КУБиК», 2011. - С. 141-143.

3. Ворожейкин С.Б., Башко Е.С., Штыков С.Н. Влияние хлористого метилена на хроматографическое поведение гидрофобных аминокислот на прямой фазе // Современные проблемы теорет. и эксп. химии: Межвуз. сборник науч. трудов VII Всерос конф. молодых ученых с международ, участием. - Саратов: Изд-во «КУБиК», 2010. - С. 202-204.

4. Ворожейкин С.Б., Штыков С.Н. Влияние хлороформа и хлористого метилена на хроматографическое поведение аминокислот в ТСХ // Современные проблемы теорет. и эксп. химии: Межвуз. сборник науч. трудов VI Всерос конф. молодых ученых с международ, участием. - Саратов: Изд-во «Научная книга», 2007. - С. 180-183.

5. Ворожейкин С.Б., Башко Е.С., Перфилова O.A., Штыков С.Н. Влияние мицелл ПАВ на разделение аминокислот на силикагеле методом тонкослойной хроматографии // От коллоидных систем к нанохимии. Сб. тез. докл. I Всерос. симп. по поверхностно-активным веществам (с международ, участием). -Казань, 2011. С. 132.

6. Ворожейкин С.Б., Штыков С.Н. Закономерности удерживания аминокислот в тонком слое силикагеля при варьировании донорно-акцепторных и гидрофобных свойств компонентов подвижной фазы // Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез: Матер. Всерос. конф. 26 сент-1 окт. 2010. - Краснодар, 2010. С. 202.

7. Ворожейкин С.Б., Ворожейкина С.С. Аминокислоты: основные достижения методов их анализа и разделения // Вестник института комплексных исследований аридных территорий. Элиста. 2008. № 2. С.163-168.

8. Ворожейкин С.Б., Романов O.E. Влияние различных концентраций хлороформа на подвижность аминокислот // Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов: Матер, пятой международ, заочной науч. конф. Секция химии. Элиста, 7-8 дек. 2006. С.125-127.

Подписано к печати 20 апреля 2012 года. Формат 60x48 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 120 экз. Заказ № 124-Т

Отпечатано в типографии СГУ Саратов, Большая Казачья 112-а

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Ворожейкин, Сергей Борисович, Саратов

61 12-2/500

ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

На правах рукописи

ВОРОЖЕЙКИН Сергей Борисович

ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАТОРОВ ПОДВИЖНЫХ ФАЗ НА РАЗДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ТСХ

НА СИЛИКАГЕЛЕ

02.00.02.- аналитическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: д.х.н., профессор Штыков С.Н.

Саратов - 2012

Работа выполнена на кафедре аналитической химии и химической экологии Института химии Саратовского государственного университета имени

Н.Г.Чернышевского

ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. Введение.........................................................................................................5

1. Обзор литературы.......................................................................................9-43

1.1 Краткая характеристика методов хроматографического

разделения и определения аминокислот...........................................9-16

1.2. Детектирование пятен и возможности улучшения

селективности, разделения веществ в ТСХ..................................................16-21

1.2.1. Детектирование аминокислот..............................................................21-25

1.3. Сравнение методов ТСХ и ВЭТСХ.........................................................26-28

1.4. Характеристика элюентов, применяемых в ТСХ..................................29-30

1.4.1. Классификация ПФ...............................................................................30-34

1.5. Технические приёмы, используемые в ТСХ аминокислот..................35-43

1.5.1. Применение силикагеля в ТСХ аминокислот....................................35-37

1.5.2 Роль модификаторов в водно-органических подвижных фазах........37-40

1.5.3. Модификаторы на основе мицеллярных ПАВ...................................40-43

2. Методика и техника проведения эксперимента.......................................43-49

2.1. Реактивы и аппаратура............................................................................43-46

2.2 Техника и методика проведения эксперимента.....................................47

2.3. Расчет параметров эффективности и селективности разделения. Полуколичественный анализ.........................................................................47-49

2.4. Полуколичественный анализ препаратов, содержащих аминокислоты..49

3. Результаты и их обсуждение.................................................................... 50-103

3.1 Хроматографическое поведение аминокислот в системе модификатор : этанол : ледяная уксусная кислота : вода.....................................................50-63

3.2. Хроматографическое поведение аминокислот в системе модификатор : ДМФА : ледяная уксусная кислота : вода....................................................64-80

3.3 Хроматографическое поведение аминокислот в мицеллярных подвижных

фазах...............................................................................................................81-103

3.3.1. Влияние анионного ПАВ - ДДС........................................................81-91

3.3.2. Влияние катионного ПАВ - ЦПХ.......................................................91-96

3.3.3. Влияние неионного ПАВ - ТРИТОНА Х-100..................................96-103

4. Практическое применение ТСХ в мицеллярных и водно-органических подвижных фазах........................................................................................ 104-122

4.1. Методика подготовки объекта к хроматографированию...................106

4.2. Результаты количественного определения аминокислот в исследуемых объектах........................................................................................................106-118

4.3. Статистическая обработка полученных результатов.......................118-122

Выводы........................................................................................................123-124

Список литературы..................................................................................... 125-136

Приложение................................................................................................. 137-170

ВВЕДЕНИЕ

Важная биохимическая роль и широкое применение аминокислот в фармацевтике, медицине, биотехнологии, пищевой промышленности, спортивной практике, широкий ассортимент выпускаемых на их основе коммерческих продуктов достаточно стандартного состава требуют разработки простых методов разделения, идентификации и количественного определения аминокислот в различных смесях. Одним из таких методов является тонкослойная хроматография. Несмотря на принадлежность к одному классу химических соединений, признаком которого является присутствие в молекулах а-аминокислот одних и тех же функциональных групп, их химические и сорбционные свойства, вследствие различной природы и структуры основной части углеводородного остова молекулы, могут существенно различаться. В связи с этим аминокислоты подразделяют на несколько родственных групп.

Цель работы состояла в оценке влияния природы модификаторов водно-органических и водных подвижных фаз на хроматографическое разделение различных групп аминокислот методом ТСХ на силикагеле.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

изучить влияние природы и концентрации гидрофобных нелокализующихся (дихлор-, трихлор-, тетрахлорметана) и локализующихся протонных (этанол) и апротонных (диметилформамид) модификаторов ПФ, на подвижность и разделение аминокислот на силикагеле;

- изучить влияние природы и концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) различных типов (катионные, анионные и неионные) на подвижность аминокислот в водных ПФ;

- рассчитать количественные характеристики, характеризующие эффективность хроматографического разделения и разрешение хроматографических зон для всех исследованных подвижных фаз и сорбатов;

- выявить зависимость подвижности аминокислот от рН среды и ионной силы в мицеллярных подвижных фазах;

Научная новизна работы:

рассчитаны параметры, характеризующие эффективность и селективность хроматографического разделения аминокислот методом ТСХ на силикагеле в водно-органических и мицеллярных водных ПФ;

найдены оптимальные условия разделения аминокислот, принадлежащих разным группам, в водно-органических и водных ПФ на основе динамических модификаторов и показана возможность применения в ТСХ всех видов ПФ для разделения и определения аминокислот.

На защиту выносятся;

Апробация работы. Основные результаты работы изложены на V Международной научной конференции «Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов» (Элиста, 2006), VI-VIII Всероссийских конференциях молодых

ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов 2007, 2010, 2011), Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), I Всероссийском симпозиуме с международным участием по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, включая введение, 4 главы, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 138 источников и приложение. В работе содержится 45 таблиц и 61 рисунок.

1. Обзор литературы

1.1 Краткая характеристика методов хроматографического разделения и определения аминокислот

Основными требованиями, применяемыми к хроматографическим методам разделения и определения аминокислот и их производных, являются простота аппаратуры, высокая производительность, дешевизна и удовлетворительная точность результатов анализа. Основными методами разделения и определения аминокислот в различных объектах являются хроматографические и капиллярный электрофорез [1-4]. В 70-80-х годах наиболее часто использовали:

- ионообменную колоночную хроматографию с послеколоночной обработкой нингидрином и фотометрическим детектированием (реализовано в аминокислотном анализаторе);

- газо-жидкостную хроматографию дериватизированных аминокислот [5];

- бумажную хроматографию;

- тонкослойную хроматографию (ТСХ).

В 90-х годах, в связи с появлением новых инструментальных методов, к упомянутым методам добавились следующие [6-9]:

- высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) [1,6];

- высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [7,8];

- газовая хромато-масс-спектрометрия после дериватизации аминокислот

[9];

- капиллярный электрофорез в варианте зонного электрофореза и мицеллярной электрокинетической хроматографии [10,11].

Наиболее современные варианты включают использование «сухого пятна крови, dry blood spot" и тандемной ВЭЖХ с электроспрей ионизацией [12]. Особенно большое внимание стали уделять разделению энантиомеров аминокислот [11]. Рассмотрим указанные методы более подробно.

Ионообменная хроматография. Ионообменным и экстракционным процессам с участием аминокислот значительное внимание уделяется в

Воронежской школе ионообменной хроматографии, в которой систематически защищаются кандидатские и докторские диссертации, издаются монографии, проводятся международные конференции [13-18].

В современных аминокислотных анализаторах, основанных на использовании ионного обмена, процесс анализа автоматизирован, однако занимает около 1 часа на один образец. В зависимости от задачи в аминокислотных анализаторах используют как постколоночную дериватизацию реакцией с нингидрином, так и более высокочувствительную предколоночную дериватизацию с ортофталевым альдегидом (ОФА) и 9-флуоренилметилхлороформиатом (FMOC) [2-4]. Классический анализ с постколоночной дериватизацией заключается в разделении аминокислот на ионообменной колонке при ступенчатом градиенте рН и последующей реакции с нингидрином в реакторе системы Pinnacle PCX. Обнаружение окрашенных производных аминокислот проводится спектрофотометрическим детектором на длинах волн 570 и 440 нм. При определении аминокислот с предколоночной дериватизацей и флуоресцентными маркерами (ОФА, FMOC и др.) их обрабатывают, например, ОФА в реакторе системы Pinnacle PCX или автосамплере, затем разделяют на обращенно-фазовой колонке в режиме бинарного градиента. Для регистрации аминокислот используют флуоресцентный детектор, количественный анализ проводят при возбуждении при 330 нм и измерении флуоресценции при 450 нм [2-4].

Одним из современных методов, применяемых для анализа смесей аминокислот, является метод капиллярного электрофореза [19, 20]. Первые работы по электрофорезу были опубликованы в конце 70-х, начале 80-х годов прошлого века и были связаны, в основном, с разделением биомакромолекул (ДНК, белков) [19]. Возможность применения этого метода для анализа аминокислот обусловлена существованием их в водном растворе в виде заряженных частиц. Бесспорным преимуществом метода является простота проведения анализа: возможность исключения стадии химической

модификации аминокислот и дополнительных устройств для их идентификации.

Известно несколько вариантов реализации метода капиллярного электрофореза - капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) [21-25,], мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) [26-27] и капиллярная электрохроматография (КЭХ) [28, 29]. В последних двух методах принципы капиллярного электрофореза объединяются с достоинствами хроматографии, образуя новые самостоятельные методы.

Капиллярный электрофорез обеспечивает очень высокую эффективность разделения (число теоретических тарелок достигает 2 ООО ООО) [19, 30]. Время анализа смеси аминокислот в указанных методах изменяются от 9 до 40 мин. В методе капиллярного электрофореза для идентификации аминокислот и их производных используют практически все известные способы детектирования - флуориметрический [26, 27], прямой [10] и косвенный фотометрический [23], электрохимический [31] и даже масс-спектрометрический [32].

Существенными недостатками капиллярного электрофореза является относительно плохая воспроизводимость, сложность управления электроосмотическим потоком и адсорбция анализируемых веществ на стенках капилляра, приводящая к потере эффективности. Также следует отметить, что перед капиллярным электрофорезом аминокислоты, как правило, модифицируют различными реагентами. Выбор реагента зависит от способа детектирования и используемого варианта капиллярного электрофореза [30] .

При обсуждении использования масс-спектрометрии для определения аминокислот и пептидов необходимо учитывать важную особенность метода, заключающуюся в том, что в общем случае ионизации молекул должно предшествовать испарение образца. Это требование, относящееся в первую очередь к ионизации электронным ударом, а также в какой-то степени и к химической ионизации, значительно сужает область применения масс-

спектрометрии [33]. Кроме того, для идентификации по МС-спектру требуется знание механизма реакции разложения ионизированной аминокислотной молекулы. Характерное для а-аминокислот разложение на стабилизированные мезомерией иминиевые ионы и относительно устойчивый радикал 'СООН и радикал боковой цепи Я' идет по следующей схеме:

н2н -.-—г и2к - сн ~ • * I + о

А. ,

* I [МЧ - М-45] I [МЧ ««45;

Ф « 1 ,

Н2м - СН - СООН ......- (■ - ч 1 | 4*

" [ да/ШМ

Рис. 1. Схема образования ионов при масс-спектрометрическом определении треонина

Кроме указанных реакций дальнейшее фрагментирование зависит от строения боковой цепи. Кроме пика нормальных фрагментов (МЧ = 74 и МЧ = 45), можно наблюдать ещё два пика относительно высокой интенсивности. Они обусловлены протекающей реакцией:

КД он _ он

\ ' •(*) у * ф ,,СН-С --—• Н3М-СН-С -------------н3м-сн=с-о

Н,С-НС> '""Ъ чон

О - Н

{[мч^ 57)

сн3снс н2о

МЧ г- 44

Рис. 2. Схема образования дополнительных пиков аминокислот высокой интенсивности

В связи с трудной летучестью аминокислот проба вносится в ионный источник масс-спектрометра при 10"4 - 10"5 Па и 100-150°С. Масс-спектрометрия приобрела особое значение при анализе аминокислотных последовательностей белков [34].

К сожалению, стоит отметить, что столь информативные методы определения аминокислот и их производных в силу дороговизны оборудования и

необходимости иметь специалистов высокой квалификации, для большинства отечественных научных и прикладных лабораторий не доступны.

Газовая_хроматогр�