Выделение и изучение антибиотика - полипептида 3802 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет - ' - им. М. В. Ломоносова " г"

ХИМИЧЕСКИП ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

«ЭЧ-арвегаг»-л*-**

УДК 015.332

ЯССЕИН

Мохй Эль Дин Абдель Фаттах Абд Эль Ати

-.................. ВЫДЕЛЕНИЕИИЗУЧЕНИЕ----------- ----------------

АНТИБИОТИКА - ПОЛИПЕПТИДА 3 802

Специальность — 02.00.10 — Биоорганическая химия, кимия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

д"и«ёртаниина~сойска>гаеученойс кандидата химических наук

Москва -г 1992

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор Г. С. Катруха; кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г. Б. Федорова.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор А. С. Мезенцев; доктор биологических наук Т. "Й. Орлова.

Ведущая организация — ВНЦА^ВНИИ антибиотиков.

Защита состоится 25 февраля 1992 г. в 16 час. на заседании специализированного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: ГСП 119899 Москва В-234, Ленинские горы, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан ■ _ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного coi кандидат химических на.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Антибиотики продолжают оставаться важнейшими химиотерапевтическими препаратами, получившими широкое применение в медицинской практике для лечения тяжелых заболеваний. Возникновение устойчивых форм патогенных бактерий, необходимость снижения побочного действия лекарственных средств на микроорганизмы требуют постоянного развития исследований по скринингу новых антибиотиков, разработке методов их выделения и идентификации.

В ходе скрининга антибактериальных антибиотиков во ВНИИНА АМН была выделена редкая культура актиномицета - штамм ИНА-3802, близкая по некоторым таксономическим признакам к роду Асипор1апез. Было показано также, что антибиотик 3802, продуцируемый этим актиномицетом, обладает выраженным терапевтическим эффектом при лечении стафилококкового сепсиса белых мышей, что представляет значительный интерес для практики. Кроме того, важно было знать особенности химического строения нового антибиотического вещества и групповую принадлежность по принятой классификации биологически активных веществ.

Цель работы заключалась в разработке оптимального способа выделения и очистки антибиотика 3802, определение его компонентного состава, а также в изучении физико-хиг*ических свойств компонентов и их идентификации. Для этого необходимо было: I) Разработать рациональный способ выделения антибиотика 3802 из куль-туральной жидкости (К1), позволяющий наиболее полное извлечение его как из мицелия, так и из нативного раствора продуцента; 2) Разработать оптимальные условия очистки антибиотика 3802, позволяющие получать препараты высокой степени чистоты; 3) Изучить

- г -

компонентный состав антибиотического комплекса 3802 и разработать условия разделения его на индивидуальные компоненты; 4) Разработать методы контроля за стадиями получения и очистки препаратов антибиотика, включающие электрофоретические, хроматографичес-кие (ТСХ, ВЭЖХ), спектрофотометрические и другие методы анализа; 5) Определить химическую природу антибиотика и найти его место в химической классификации биологически активных веществ, разработанной Я.Верди (Венгрия); 6) Изучить физико-химические и биологические свойства антибиотика и его компонентов; 7) Провести идентификацию основного компонента антибиотического комплекса по химическим показателям.

Научная новизна и практическая ценность работы. В результате проведенного исследования выделен антибактериальный антибиотик полипептидной природы, представляющий собой комплекс по крайней мере б компонентов. Установлено, что основным компонентом комплекса является антибиотик 3802-1У-3, идентифицированный с актагардином - серусодержащим полипептидом группы лантибиотиков; компоненты 3802-У-^ и 3 802гУ1-7 являются новыми антибиотиками этой группы и представляют собой соответственно N-ацетил- и метиловый гфир N-ацетил-производного актагардина с высокой активностью в отношении грамположительных микроорганизмов. Впервые обнаружено, что при кислотном гидролизе в присутствии солей Ре3+ (но не Ре2+) остатки лантионина (Lan) и метиллантионина (иeLan) окисляются до циствиновой КИСЛОТЫ (CyS03U), которую количественно можно определить На аминокислотном анализаторе; в этих'условиях цистинсодержащие пептиды дают cyso3H и аспа-рагиновую кислоту, а в присутствии солей ге2+ - цистин полностью раарущается, a Lan - не изменяется. Показано также, что в компоненте 3802-1У-3 сера одного из остатков Lan (MeLan), а в компо-

ненте 38С£-1У-4 - трах остатков Lan (меьап) окислены до суль-фоксида.

Результаты работы имеют значение для проведения селекционных работ по направленному биосинтезу высокоактивного компонента 3802-ЗТ-7 и др., а такке для развития работ по выяснению взаимосвязи между структурой и функцией в ряду антибиотиков группы ланти биотиков.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на П Всесоюзном семинаре "Актуальные направления поиска антибиотиков" (г. Алма-Ата, 1989 г.), на Всесоюзной конференции "Современные методы выделения, очистки и. идентификации микробных метаболитов" (Пущино-на-Оке,. 1991 г.), на Ш Всесоюзном семинаре "Актуальные направления в технологии получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степно-горск, 1991 г.), на заседании кафедры химии природных соединений Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова (Москва, 1991 г.).

Публикации. Содержание работы опубликовано в двух работах, две статьи находятся в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного выделению и изучению триптофан-содержащих антибиотиков-полипептидов, обсуждения результатов,, экспериментальной части, выводов и списка цитированной лите^Йу-ры. Работа изложена на страницах машинописного текста^

содержит- таблиц, схем и рисунков. Список литературы включает наименований.

- 4 -

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Выделение антибиотического комплекса 3802 ив культуральной жидкости Асапор1апез эр. шт. ЙНА-3802

Антибиотик 3 802 накапливается как в мицелии, так и в натив-нои растворе (НР) продуцента и «окет быть выделен из обоих источников экстракционным методом. Из НР после отделения мицелия антибиотик экстрагировали органическими растворителями различной полярности (н.-бутанолоы, хлороформом, этилацетатом) при различных значениях рН (4,5; 7,0; 8,5). Наиболее полное извлечение антибиотика происходит при экстракции н.-бутанолом при рН = 4,5; при щелочных значениях рН антибиотик практически не переходит в органическую фазу, что указывает на присутствие в его молекуле кислых функциональных групп.

Для извлечзния антибиотика из мицелия проводится обработка мицелия ацетоном с последующей фильтрацией и отгонкой ацетона в вакууме, а антибиотик переводился в н.-бутанол при рН = 4,5. Из суммарного бутанольного экстракта, после его концентрирования в вакууме антибиотик осаждали избытком ацетона (схема I).

Электрофоретический анализ при рН 1,7-2,4 полученного таким образом препарата с последующим биоавтографическим проявлением показал, что обнаруживаются два биологически активных вещества -одно нейтральное - остающееся в точке нанесения, и второе - основной природы, мигрирующее к катоду (рис. I). Оба вещества имели положительную реакцию с реактивом Эрлиха на триптофан и иод-азидным реагентом на серу, основной компонент проявляется также нингидрином, что указывает на присутствие в нем свободной аминогруппы. Однако, помимо двух биологически активных компонентов,

Схема I.

Схема выделения и фракционирования антибиотика 3802

ТГЗГ +НС1

Водная фаза

Ра с тв орениа в 50% спирте

Упаривание +водн.спирт

+Ацетон

Препарат-сырец

1)

2)

X

+1н НС1

Экстракция эфироы

Эфирный зкст ракт

Этилацетатный Экстракция этилацетатом

экстракт

Упаривание

3802-Н

Водная фаза

С

Экстракция]

НВиОН-ЕСАс

3:1

Водная

фаза

I

Органическая фаза

| упарн панне 3802-00

- б -

препарат на данной стадии получения содержит еще значительные количества примесей, проявляющихся нингидриковыи и С^-бензидино-вым реактивами. Для выделе щш небольших количеств активных нейтрального (3802-Н) и основного (3802-00) компонентов использовали метод препаративного электрофореза на бумаге в 30#-й СН3С00Н, 600 В, 3 час. с последующей элюцией компонентов уксусной кислотой той же концентрации.

9

Рис. I. Электрофореграмма компонентов из нативного раствора. Электролит 30%-к СН3С00Н, 600 В, 2 час.

Реакткв Эрошха

Нигтодрлн

Злюагго -гра'та

На основании данных электрофоретического анализа была разработана дальнейшая схема экстракционной очистки препарата-сырца 3802 и разделения его на две фракции - нейтральную и основную. С 8хой целью мы также использовали органические растворители различной полярности, однако экстракцию проводили из растворов антибиотика в 0,5-1,0 н.соляной кислоте.

Экстракция этиловым эфиром позволила освободить препарат от примесей липидной природы; фракция 3802-Н, содержащая нейтральный антибиотик, переходит в этилацета тный экстракт. Смесью этилаце-тат-н.-бутанол (1:3) экстрагируется основной антибиотик 3802-00, обладающий положительным зарядом. Контроль за разделением на фракции и очисткой препарата-сырца 3 802 осуществляли методами электрофореза на бумаге и ТСХ на силикагеле с биоавтографическим и хими-

I

г

ь

ческии проявлением с использованием реактивов Зрлиха, нингидрина, С^-бензидина и раствора кипо4 (рис. 2).

Б

0

V"

1 г

Реактив Зрлпха

Реактив Зрлпха

Рис. 2. Электрофорез (А) и ТСХ (Б) этилацетатного (точка I) и иВиОН-ЕШАс (точка 2) экстрактов из порошков-сырдов антибиотика 3802. Проявление -биоавюграфия (обведено пунктиром). Электролит - 2 н. СН3СООН, 600 В, 2 час.

Таким образом, методом избирательной экстракции нам удалось разделить препарат-сырец антибиотика на нейтральную (3802-Н) и основную (3802-00) фракции, однако эти фракции еще содержали различное количество неактивных примесей и поэтому требовалась их дополнительная очистка, что необходимо для определения компонентного состава антибиотика, получения индивидуальных компонентов в хроматогрзфически чистом виде и изучения их физико-химических свойств.

2. Разработка способа очистки антибиотиков 3802-Н и 3802-ОС

План дальнейшей очистки выделенных антибиотиков основывался на полученных данных по их электрофоретической и ТСХ-подвикности в различных электролитах и хроматографических системах и растворимости в органических растворителях при экстракции из кислых водных растворов. Эти д^ные указывают на неполлршй характер их молекул и, по предварительным масс-спектрометрическим данным 1\>л)

на достаточно высокую мол. массу 1900 а.е.м.). Поэтому били испытаны два различных метода - метод гельфильтрации на сорбенте тоуореаг1 ш-50, позволяющий провести разделение по мол.массам и метод гидрофобной и ионо-обменной хроматографии на концентрирующих "патронах" с модифицированными сяликагелем или макропористым стеклом, з именно: "Диапав-С16", "Диапак-Сульфо", "Диапак-Фенил" и "ШС-2000". Эти сорбенты характеризуются различным соотношением гидрофобных и полярных свойств. "Патроны" "Диэпак-С16" и "Диапак-Фенил" сорбируют вещества гидрофобной природы; вещества, обладающие полярными свойствами, можно удалить в ходе промывания подходящим буферным раствором; "Диапак-Сульфо" - сильный катио-нит, а сорбент "МПС-2000" используется для обращенно-фазовой хроматографии низкомолекулярных пептидов.

В ходе исследования было обнаружено, что на патроне "Диапак-Сульфо" основной компонент десорбируется одновременно с нингид-ринполоштельными примесями водой и более интенсивно - в кислой среде - смесью сн3сн - 0,1% ТФУ (40:60), что свидетельствует о неиабиратвльности процесса. При работе с патроном "!ШС-2000" была обнаружена его низкая емкость по отношению к основному компоненту 3802-0С. В этом случае проблемой было накопление в достаточных количествах целевого продукта. Аналогичные результаты были получены на патроне "Диапак-С16". С другой стороны, на патроне "Диапак-Фенил" сорбируются как нейтральное (3802-Н), так и основное (3802-00) вещества, и поэтому ваяно было найти условия избирательной десорбции биологически активных компонентов и отделение их от примесей. С этой целью испытывались различные элюен-.ты - вода, буферные растворы с рН 2,0-6,0, водные растворы ТФУ, смеси, содержащие воду, ТФУ и ацетонитрил различной концентрации. Было установлено, что, если вначале проводить последовательно

элюцвю водой, раствором 0,1% ТФУ, водным 20% ацетонитрилом, то нокно выпить С колонии вез примеси - шшгидрин и бензидкнполозя-тельныевещества, а компоненты 3802-Н и -ОС остаются на сорбента. Вали же посла этого проводить злюцшо смесью ацетонитрил - 0,1% водная ТФУ в соотношении 40:60 - начинает выходить нейтральный компонент 3802-Н, а затеи его смесь с компонентом 3802-0С. После полной десорбции компонента 3802-Н, содержание ацетонитрила увеличивали до 50-70$ и в этом случае наблюдалась десорбция индивидуального компонента 3802-0С. Контроль за ходом разделения осу-' ществляли с помощью метода электрофореза па бумаге и ЗО^-й СН^СООН с последующим биоавтографическим проявлением на Bac.subti.iis

и параллельно - нингидрином и реактивом Эрлиха на тгр (рис. 3).

_ ®> 12 3 Ж 6

э © О 1 & м 1 & Ш ^ 4 _

Шиичщрпи + оиоаьтог^афия. Реактив Орллха + бпеавтографпя.

Рис. 3. Электрофореграша динамики хроматографического анализа порошка-сырца на патроне "Диапак-Фенил". I. Раствор после нанесения антибиотика. 2. Элмцин водой. 3. Элюция 0,1% ТФУ. Элюция 20% сн3сн. 5. Здгация 40% сн3сн + 60% 0,1% ТФУ. 6. Элюция 70% сн3сн + 30% 0,1% ТФУ. Электролит - 2 н. СН?С00Н, 600 В, 2 час.

Таким образом, с помощью метода твердофчзчой экстракции гидрофобной сорбенте "Диапак-Фенил" паи удалось 'очистить оырцч антабпо'шыв 3802-Н и 3 802-00 и накопить их в .<олвчогтв'а, ¡ч.обло-дикнх для дальнейших исследований.

3. Исследование компонентного состава антибиотиков 3802-Н и 3802-0С

Электрофоретический анализ полученных после очистки на патроне "Диапак-Фенил" антибиотиков 3802-Н и 38CI2-0C показал, что они электрофоретически однородны и проявляются одним пятном в районе точки наносения (3802-Н) и в 2-3 см от старта (3802-0С) (рис. 3).

Однако, хорошо известно, что большинство антибиотиков продуцируются в виде комплекса (5-15 соединений) близкородственных веществ, которые можно разделить только с использованием современных методов анализа. Прежде всего мы провели ТСХ-анализ антибиотиков на пластинках 20x20 см rieselgel 60 F254 ("Merck", ФРГ) в различных системах растворителей. Оптимальной оказалась система н.-бутанол-метанол-вода (4:1:3), в которой оба антибиотика разделялись на несколько компонентов с близкими значениями Rf.

Разделение на компоненты было достигнуто также с помощью метода ВЭЖХ на колонке zorbax ods с1д (250x4,6 мм) с размером частиц 5 мкм и с использованием в качестве подвижной фазы системы ацетонитрил - 0,05% ТФА в градиентном режиме 38$ - 100% ацетонит-рила и детекции при 280 нм. Как видно из рис. 4А, в этих условиях антибиотик 3802-0С, содержащий небольшое количество 3802-Н, разделяется на 8 компонентов. Причем, компоненты имеют близкие значения rt, и преобладающим в количественном отношении является компонент 1У, в значительно меньших количествах содержатся компоненты I-Ш, У1-УП. Четкого разделения пиков УП и УШ достичь не удалось, возможно, из-за элюции в используемых условиях гидрофобных примесей липидного характера.

Для исследования химической природы основного (3802-1У) и других компонентов <йло проведено их накопление с помощью кегода

0.5-

0

Рис

-Ь МИН

4. Анализ компонентного состава антибиотика 3802.

А. Препаративная ВЭЖХ на колонке С-18 "Весктап", градиент 38% - 100% ацзтонитрила в 0,05$ ТФУ. Б. ТСХ на сили-кагеле компонентов антибиотика 3802 после повторной очистки методом ВЭЖХ. Система: н.Бутанол-Нетанол - Н20 (4:1:3). Проявители: реактив Эрлиха и биоавтография (обведено пунктиром). '11 1Д

I и

Рис. 5. УФ-спектры (в 505 этаноле) отдельных компонентов антибиотика 3802, пслученных препаративной

препаративной ВЭЖХ. В ходе хроматографии элюат каждого из восьми пиков разгуляли на 2-3 фракции, которые собирали на коллектор:, а затей анализировали методами ТСХ и электрофореза с использованием для выявления активных веществ биоавтографии с као.и-усо!^;;

- и -

в качестве тест-организиа, а также химическое проявление с помощью нингидрина и реактива Орлиха» Параллельно были получены Уф-спектры в области 220-300 им в водном спирте. Результаты анализа фракций представлены га рис. 4 Б и 5.

Из данных электрофоретичсского анализу следует, что полученные компоненты делятся на два типа - нейтральной и основной природы, однако по данный ТСХ они различаются ко-аду собой: с увеличением номера фракций увеличивается значение ^ компонента. Причем компоненты П-1У имеют близкие значения , а у компонентов У-УП - значения ^ существенно увеличиваются как медду собой, 18К и в сравнении с компонентами 1-1У. Это свидетельствует о возрастании гидрофобных свойств компонентов о высокими номерами. Наблюдается различие и в УФ-апектрах: компоненты 1У-У1 имеют УФ-спектр типичный для трипго^ансодераащих полиг.ептидов, в то же время максимум поглощения компонента ПВ спешен в коротковолновую область, а у компонента ЕВ - четкий какезмуи отсутствует, что по-аволяет сделать вывод о наличии в этих ф;якчнях примесей непредельного, характера. Компоненты 1-Ш, УП и УО излучены с низким выходом и в дальнейшем не изучались.

4. Физико-химическая характеристика пе.'.'гтенептов 1У-УП антибиотика 36С?.

Основные физико-хпг.нс.кие свойства креоЗладзпщих в количественном отношении биологически активных киинонентов антибиотика 3802 представлены в твбязце I, Из таблинк следует, что компоненты имеют мол.массу в 'ирлдсли 1890-1946 о, ядонтиччий УФ-спектр с максимумами поглощен;?я, /-(г&ктерннаи.длн гидолыый группы и ИК-спектр, указштвадй «з гпличие в уоя? куле овидккх группировок (полосы поглощении 1<*Л) ) и 1^30 я-Н). Дно и а я.гии-зи-

Таблица I.

5изико-хии;;~гские сз ойстза некоторых компонентов 3802 и акта гардина

".IHÎEC/OTHK

Брутто-*орнула,j(М+Н)+!УФ-спектр, (мол.масса)

Ямах,

jFAB-KS, ЗИН0Л ! 1

! "El

(система)Jb см от т.н.! (квг)

!ИК-спекгр, '.Качественные реакции

Sio,

¡(электролит) U

Шингид- ! реактив ¡реактив ! рин .'Эрлиха .'на s

3S02-r-

3SO;

3802-

3s02-

; 1S8&)

'Н12бК22°гА; n915

(1918)

"i 26*'20^25^4 ! 19315

;ô4Hl28N20°i5S4 1946

(1945)

27 5

£7 3 279

280 2Б6

273 280 290

0,44(T-1) (+)1,3(E-1) 0,32(T-7) (+)l,8(E-2) (-)1,0(Е-4)

0,37(T-7) (+)1,3(E-1) (+)1,0(Е-4)

:,45(T-7)

0,63(T-7)

(E-1 ) ( S-2)

(E-1) (E-2)

3500-3300

a1.-60, i67o

-,540,1470 1400,1240 1150,1050

3500,2960 1670 1560,1460 1380,1050

3500., 296u 1730,i570 1560,1460 1360,10 50

3500,?98C 1730,1670 1560,1460 1380,1230 1050

l

n VjJ

- JOi It T p Cru

ZJH ICI: T-I: aBuOH - Ac0H-H20 (4:1:1), T-7: nBut0H-Me0H-H20 (4:i:3). j

оретическая подвижность, "+" - миграция к катоду, - миграция к аноду, электролиты: E-I: ."H-;-ï2D (28:20:52), 300 В, 3 час; Е-2 - 2 н.АсОН, 600 В, 2 час. Е-4: Пиридин-Ас0Н-Н20

Г - pûO В, 2 час. [

руеннх компонентов (1У-3 и 1У-4) обладают положительным зарядом и мигрируют в кислой области рН к катоду, у двух других (У-4 и У1-7) аминогруппа отсутствует, поскольку они остаются при электрофорезе на линии старта и не проявляются нингидрином.

Положительная реакция Эрлиха для всех компонентов подтверждает наличие остатка триптофана, а 12-нан3- реакция - атомов серы, что следует также из данных элементного анализа основного компонента, на основании которого определена брутто-формула преобладающего в количественном отношении компонента 3802-1У-3. Исходя из данных рав-из - анализа сделан вывод, что компонент 3802-1У-4 является диамидом дисульфоксида исходного компонента 3802-1У-3, компонент 3802-У-4 - N-ацетильным производным этого же компонента, а компонент 3802-У1-7 - метиловым эфиром компонента 3802-У-4. Увеличение гидрофобных свойств в направлении от компонента 1У-3 к компоненту У1-7 наблюдается также при ТСХ и ВЭЖХ-анализе полученных антибиотиков (рис. 4, 8). В последнем случае для уменьшения времени удерживания при изократической обри ценно-фазовой ЪЬАХ требуется увеличить концентрацию ацетонитрила в подвижной фазе с 44% до 60%.

Анализ полученных данных позволил нам сделать вывод, что выделенные антибиотики 3802-1У-3 - 3 802-У 1-7 являются высокомолекулярными серусодержащими полипептидами.

Для подтверждения этого предположения и дальнейшей идентификации антибиотиков необходимо было определить их качественный ч количественный аминокислотный состав.

5. Аминокислотный анализ компонентов 3802-1У-3 - 3802-У1-7

, Для определения аминокислотного состава компонентов проводили их кислотйый и щелочной гидролиз в течение 24-96 часов при

106 С, а также кислотный гидролиз в б н.НС! в присутствии тио-гликолевой кислоты для определения триптофана. Гидролизатн анализировали методами одномерной и двумерной хроматографии на силика-геле и бумаге, электрофореза на бумаге при pH 2,4 и 4,3, а~такне на аминокислотном анализаторе (рис. 6, 7). В результате проведенного анализа установлено наличие в каждом из компонентов следующих аминокислот: Ser (1)К, Glu (I), Gly (2), Ala (I), Val (2), île (2), Leu (I), тгр (I). Количественное содержание триптофана было определено методом спектрофотометрического титрования ы-бромсукцикимидом • (tras).

ь •

Ci.*

'Л'Ш

О,-

fl'j.

W.'ï

41 ir,

• >1«

»V

« Ihr

- Ji.o

flipOB

Thr& dys

Trp es

Wo О ®

«i GIM • 6ju ca Sm* 3le®>Lw «Э Leu

f3bVat es Val

CD

Й-tetíla О AI« <a» Ly s

о

К'/нгкдркн

Нингидрин

Рис. б. Анализ-кислотного гидролизата антибиотика 3802-У1-3 (6 н.НС1 + 4/5 тиогликолевой кислоты, Юб°С, 24 час.). А. Хроматография на бумаге в системе н. вион-сн3соон-н2о (4:1:1). Б. Электрофорез на бумаге в электролите НС00Н-СН3С00Н-Н20 (28:20:52), 400 В, 3 час. В. Электрофорез на бумаге в электролите пиридин-СН3С00Н-Н20 (2:4:994), 600 В, 2 час.

в

о i

Ci

* Число остатков на уоль антибиотика.

-Ь мин

Рис. V. Аминокислотный анализ п;ь'оолизатов 3802-1У-3 и актагаид^-на,- полученных:А. с 6н.НС1, Е. ц Ь. - с 6Н.ИС1+0,Щ106

Постепенное прибавление реагента ивз приводит к изменении характерного спектра антибиотика, а появление поглощения в области 250-260 ни указывает на образование оксиндола. По полученным кривым было найдено, что антибиотик 3802-1У-3 содержит I остаток триптофана. Кроме того, в гидролизатах по данным электрофореза и хроматографии присутствовали небелковые аминокислоты Х^ и Х^, совладеющие по положению на карте аминокислотного анализа с местоположением пролива. Поэтому дли его идентификации в кислотной гидролизате были проведены две специфические реакции I) дезаыиш;-роватгя -аминокислот с азотистой кислотой и 2) тринитрофенилп-рования с 2,4,6-тринитробинзол'Сулгфокиилот(й (ТНБС):

I попса .»> I -г ' нн2

С^-^'У1—-

•(1 ' ;

I

и (Г<СНСО..,И) ■* I ^ п

он

тш.ч

-«- ШСНСП

ы\ * "

Чч }■

/кь

Т-со н ж . н

ч 1-со.,н Ч/ н

- 17 -

Обе реакции необратимо модифицируют <=<.-аминокислоты, в то время как иминокислоты в реакции не вступают и могут быть легко отделены от производных »(-аминокислот и определены методами хроматографии. Таким путем было показано, что пролин, октшролин и н-метиламинокислоты в гидролизате компонента 3802-1У-3 отсутствуют. Следовательно, на оганокислотном анализаторе вместо лро-лина выходят небелковые аминокислоты. Для их идентификации Шло проведено препаративное выделение аминокислот Х^ и методом бумажной хроматографии и изучены их физико-химические свойства, приведенные в таблице 2. В качестве свидетеля был взят лзнтионин (^ап;, поскольку предварительно было показано, что Х| и дают положительную иод-азидную реакцию на серу.

Таблица 2.

Физико-химические свойства аминокислот Х^, и лэнтионина

№ 1

«М.

Метод исследован'/л

Ч

! ban i

I. Хроматография на бумаг'', pf, система T-I*

?. ТОХ, si02 I) система 'I-! Rf 2) система Т-

5. Аминокислотный анализа" >* ,

RT , МИН.

Ц. FAB-M31 (М + 1 ) +

1'ол.массч расчетная

с. Качественные реакции: -нчнгилрин - х2 + Mali,

-литропруссид Na

-!!;П'| олр.усспл Na + tlíi.N

0,05

0,08 О, If,

с. 1,50

2 09

208 +

+

' 0,09

0,10 0,20

20,¿5

223 222

0,05

0,08 0,16

а,50

209

208 +

+

i-I: nBuOH-AruH-HgO i-4: паион - цпридин-АсОч-Г.

' ^ :1С!:5:Т? !.

Сравнение полученных данных позволило заключить, что в состав антибиотика 3802-1У-3 входят небелковые аминокислоты лантио-нин (Х|) и ^-метиллантионин (Х2):

сн3

ноос^ ,соон ноос. | ^соон

^CH-CH.-S-CH -СН' ^CH-CH-S-CH2-CH4

gH ¿ ¿ WHg H2tJX nNH2

Lan (x^ • MeLan (x2) —S-1 Г— S-1

Ala Ala »(.-Abu Ala

Другие серусодержащие аминокислоты в гидролизатах компонентов íy-yn обнаружены не были. Количественное определение серы (6,3%) свидетельствует, что при мол. массе компонента 3802-1У-3 равной 1889 в, в его молекуле содержится 4 атома серы и, следовательно, четыре аминокислоты лантионинового ряда. Из них - один остаток лантионина и 3 остатка р -метиллантионина, что следует из соотношения высот пиков этих аминокислот на аминокислотной карте с аминокислотного анализатора и расчета числа остатков, исходя из мол, массы 1889 D. Одновременно было установлено, что рекомендуемые в литературе условия окислительного кислотного гидролиза в присутствии ДМСО или после окисления антибиотика надмура-вьиной кислотой, не приводят к полному окислению и распаду лантион нов, что затрудняет количественное определение на анализаторе глу-таминсвой кислоты и пролина. Мы предположила, что при гидролизе антибиотика в присутствии более сильного окислителя - хлорного иелеза (Fe3+), окисление s-содержащих аминокислот до Cyso3H будет более полным. Это предположение подтвердилось в опытах с модельным Lan, окисленным глутатионом, компонентом 3802-1У-3 и . антибиотиками низином и актагардином, в которых содержатся остатки Lan и HeLan. .На рис. 7 видно, что в Hci/Feci3 гидролизатах 3802-1У-3 и актогардина кики MeLan и Lan полностью ис-

чезают и появляются большие пики, отнесенные к cyso3h и аммиаку. Очевидно, в присутствии Fe3+ происходит разрыв s-c - связи по -остатку-<¿-Abu - или Ala с последующим окислением серы до so3h-группы (образование cyso3H) и образованием <¿,p -непредельных аминокислот (<(.,р-й Abu идА1а) , которые распадаются с выделением аммиака по схеме:

"а"-ноос' ноо с\

h_n

а

-СН —R

-СК'

Fe3+/HCl 10бвС

SOjH

СИ

Н2н

к

•I

сн

с

/\ h2n соон

R

I

сн

2

+ нн

3

о=а-соон .

чсоон С/503Н

В присутствии соли закисного железа геБ04 такой распад не наблюдается. Однако, в гидролизате окисленного глутатиона, содержащего один остаток пистина, полностью отсутствовали цистин и сузо3н. Эти данные позволяют предположить, что кислотный гидролиз в присутствии яе3* и отдельно - с ге2+ можно будет использовать для идентификации в полипептидах остатков цистина и лантио-нинов.

Результаты аминокислотного анализа компонентов 1У-У1 антибиотика 3 302 представлены в таблице 3.

Из данных таблицы следует, что по аминокислотному составу компоненты антибиотике 3802 практически не р0зА)чаются между собой. Лишь в компоненте 1У-4 обнаруживается небольшое количество суэо^н, обраэовавцееся, очевидно, при гидролизе из сульфона лан-тионина.

На основании данных аминокислотного анализа компоненетов, определения мол.массы методом гав-мз, их хроматографического (ТСХ и ВЭ1Х, см.рис. 8) и электрофоретического поведения можно сделать вывод, что основным компонентом антибиотического комплек-

Таблица 3.

Аминокислотный состав некоторых компонентов антибиотика 3802 и актагардина (число остатков/моль)

Аминокислота ! 1У-3 ! 1У-4 ! У-4 ! У1-7 ¡Актагардин

Эег I I I I I

I I I I I

2 2 2 2 2

А1а I I I I I

Уа1 2 2 2 2 2

Не 2 2 2 2 2

Ьеи I I I I I

тгр I I I I I

(Ьап+ НеЬап) 4 3 4 4 4

А1а-302-А1а - I - - -

Нол.масса 1889 1919 1931 1945 1889

са 3802 является компонент 1У-3 с мол.массой 1889 ю. Тогда компонент 1У-4 с мол. массой 1919 о представляет собой диамид-сульфон-ХУ-З, компонент У-4 - н -ацетильное производное компонента 1У-3, а У1-7 - метиловый зфир компонента У-4.

Для подтверждения строения двух последних компонентов мы провели обработку антибиотика 3802-1У-3 уксусным ангидридом в метаноле, а часть полученного продукта - смесью Ме0Н/НС1 для его этери-фикации. Продукты реакции исследовали методами ТСХ икав-из*.

■ 1. , — ' —-

Соединение | ТСХ, , Т-7С | рав-иэ (и+н)+

V-4 " М5 1932 ~~

1У-3 + Ас20 0,48 1932.

• 1У-3 + Ас20 + МеОН/НС1 0,63 1946

VI-7 0,63 1946

Данные этой таблицы подтверждают выводы о строении компонен-' тоя У-4 и У1-7.

Ванным этапом в исследовании антибиотиков-полипептидов явля-ится определение их и- и С-копцевых аминокислот. Однако, примене-

46Й - СН30М 5

7-ч -

Рис. 8. ВЭКХ на при борз нИилихром-1В" отдельных компонентов антибиотика ЗВ02 и актагардина. Колонка "Сепарои С-18", 5 шш. Детекция при 280 им. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1% КУ с содертнкем адстоиитрила для А - дйя Б -для 3 - 602. Над ликаии указано вреия' выхода з сек.

нив для определения к-концевой группы в 1У-3 распространенных в аналитической химии пептидов динитрофенильного и данейльного методов, несмотря на широкое варьирование условий, не дало положительных результатов: полного модифицирования аминогруппы компонента 1У-3 достичь не удалось, всегда оставался свободный антибиотик. Это наводит на мысль о стерической недоступности аминогруппы для таких объемных реагентов как 2,4-динитрофторбензол и 5-диметилами-но-нафталин-1-сульфохлорид. Поэтому в дальнейшем мы использовали высокоактивный реагент - метилизотиоцианат (ШТЦ), который нашел применение в пептидной химии для определения н-концевой последовательности по методу Эдмана (Степанов, 1968 г.):

Ч1 I2 V I2

I. сн.ксэ + н„ыснсоынснсо-... рН сн нс-ынснсоынснсо-... -—

3 * I

г

н,о+ 1г

—_ - н-сн — С=0 + Н Н-СНСО-...

II I I 2

лн ы-сн3

II

МТГ-аминокислоты Контроль за ходом карбамилирования (I стадия) и циклизацией (П стадия) осуществляли методом электрофореза на бумаге. Было установлено, что I стадия проходит полностью и к-метилтиокарбамил-3802-1У-3 при электрофорезе остается в точке нанесения. После П стадии метода Эдмана на электрофореграмме появляется нингидрин-положительное пятно с зарядом +1, что свидетельствует об.образовании метилтиогидантиона N-концевой аминокислоты. Однако обнаружить МТГ-производное с помощью ТСХ нам не удалось. Поэтому было проведено исследование кислотного гидролиэата ЫТГ-3802-1У-3, в результате которого было установлено, что после циклизации на хромато-графической карте с анализатора уменьшается пик ^-метилантионина. Следовательно, один из остатков ^-Ьап в антибиотике 3802-1У-3

- 23 -

занимает н-концевое положение.

Для идентификации полученных антибиотиков мы провели поиск аналогов по компьютерной базе данных природных биологически активных веществ, разработанной Я.Верди (Венгрия). На 1991 год в базе____

данных содержались сведения о свыше 16 тыс. антибиотических веществ природного происхождения. Поиск проводили путем введения В' компьютер полученных аналитических данных по мол.массе, УФ-спектру и элементному составу компонентов антибиотика 3802.

В результате компьютерного поис;;а мы вышли на антибиотик-полипептид актагардин, который относится к новой группе антибиоти-. ков - лантибиотиков. Актагардин представляет собой 19-члзяпыЯ полипептид, строение которого (см. рис. Э) было установлено недавно итальянскими исследователями (л.к.ке^епг^пд « а1., 1990 г.) с использованием современных методов го ЯМР,

.£и п1иГ л*1 Звг\ Л1

I

Рис. Строение актагардина и компонентов антибиотика 3802.

н 1 X

Актагардин Н он

1У-3 н он

1У-4 й пнг + -Б

У-4 СН3С0 ОН

У1-7 сн3со 0СН3, ОН'

Дальнейшая идентификация проведена с помощью метода ВЭЖХ на прпборе "Милихром-1В" в изократическом режиме с изменением концентрации ацетонитрила в подвижной фазе от 44% до 60% (рис. 8). Данные анализа свидетельствуют, что компонент 1У-3 идентичен ак-тагардину, компоненты 1У-4, У-4 и У1-7 - по времени удерживания существенно отличаются от актагардина. Однако, итальянскими исследователями описан также диамид актагардина (1.к.ке«епг1пд, 1990), которому соответствует компонент 1У-4. В то же время, поскольку в компьютерной базе данных Я.Верди и в литературе отсутствуют сведения об антибиотиках с мол. массой 1931 и 1945, можно считать, что выделенные нами из антибиотического комплекса 3802 компоненты 3 802-У-4 и 3 802-У1-7 являются новыми антибиотиками. В таблице 4 приведены сравнительные данные по биологической активности полученных антибиотиков.

Таблица 4.

Антибиотическая активность компонентов антибиотика 3802 и актагардина в отношении вас.тусо1без (ЫПК, мкг/мл)

Антибиотик МПК*

3802-1У-3 0,31

3802-У-4 0,39 '

3802-У1-7 0,17

Актагардин 0,22

* Определение методом серийных разведений.

Из таблицы 4 видно, что полученные нами антибиотики,.несмотря на некоторые структурные различия, обладают близкой антибиотической активностью, сравнимой с активностью актагардина. Известно, что актагардин обладает способностью подавлять биосинтез пеп-тидогликана клеточной стенки бактерий. Антибиотики с таким механизмом действия представляют клтерес для биохимиков и практической медицины, и поэтому работы по изучению строения и взаимосвязи

- 25 - .

между строением и биологической активностью в ряду компонентов антибиотического комплекса 3802 будут продолжены.

--------------------------------ВЫВОДЫ________________.___________________

1. Разработана схема выделения и фракционирования антибактериального антибиотика 380Н из кулътуральной жидкости штамма-продуцента Асипор1апез эр. шт. ИНА—3802.

2. Методом обращенно-фазовой ВЭКХ показано, что антибиотический комплекс 3802 содержит 6-7 близкородственных компонентов, из которых преобладающим явлпзтеп антибиотик 3802-1У-3. Осущест-. влено препаративное выделение и очистка компонентов 3802-1У-3,

—1У—4, -У-4 и -У1-7, изучены их физико-химические и биологические свойства и установлено, что они являются серусодержащими антибиотиками - полипептидами группы лэнгибиотиков.

3. На основании полученных аналитических данных антибиотик 3802-1У-3 идентифицирован с антибиотиком группы лантибиотиков -актзгардином, а антибиотик 3802-1У-4 - с сульфоном' его дгамидз; антибиотики 3802-У-4 и 3802-У 1-7 не имеют аналогов в литературе

и являются новыми перспективными представителями группы лантибиотиков.

4. Впервые показана возможность дифференцированного определения в полипептидах г -с оде рта .цих аминокислот ( д,ап, меьап и цистина) путем .кислотного гидролиза в присутствии солей Ре3+ и Ре2'*: в первом случае с Ре3+ б-содержащие аминокислоты окисляются до цистеиновой кислоты, во втором - с ге2+ лантионины не модифицируются, а цистин полностью разрушается и яо обнаруживается методами хроматографии.

- 26 -

Список работ по теме диссертации:

1. Федорова Г.Б., Яссеин М., Архангельская H.H., Лайно A.B., Трифонова 1.П., Катруха Г.С. Выделение и химическая характеристика внтибиотика-полипептида 3802.//Актуальные юправления в технологии получения антибиотиков и других биологически актив- . та соединений микробного происхождения. - Тез. докл. Ш Всесоюзного семинара. - Степногорск. - 1991. - С. 35.

2. Федорова Г.Б., Яссеин U., Архангельская Н.М., Лайко A.B., Токарева Н.Л., Катруха Г.С. Выделение и определение компонентного сЬстава антибиотика 3802 из культуральной жидкости штамма продуцента ИНА-3802. //Антибиотики и химиотерапия. - 1992. -

Т. 37 (в печати).

3. Катруха Г.С., Яссеин М., Федорова Г.Б., Трифонова 1.П., Косын-кина Л.А., Архангельская Н.М., Розынов Б.В. Физико-химические свойства некоторых компонентов антибиотического комплекса 3802. //Антибиотики и химиотерапия. - 1992. - Т. 37 (в печати).

4. Катруха Г.С., Яссеин М., Федорова Г.Б., Трифонова Ж.П., Архангельская Н.М., Косынкина Л.А., Лайко A.B.' Использование метода твердофазной жидкостной экстракции для выделения и идентификации антибиотика-полипептида 3802. // Жидкостная экстракция органических соединений. - Тез. докл. Международной конференции. - Воронеж. - 1992Дв печати).