Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

Табакмахер Валентин Михайлович

Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa

02.00.10 - Биоорганическая химия

29 тщ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Владивосток-2014 Z ¿ ЯЬЗ ¿015

005558335

Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководитель:

кандидат физико-математических наук Зелепуга Елена Александровна

Научный консультант:

доктор химических наук, доцент Монастырная Маргарита Михайловна

Официальные оппоненты:

Ефимов Александр Васильевич

доктор химических наук, заведующий группой моделирования белковых структур Института белка РАН

Муронец Владимир Израилевич

доктор биологических наук, профессор, заведующий отделом биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Биолого-почвенный институт ДВО РАН,

г. Владивосток

Защита состоится «13» марта 2015 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423) 231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ru

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН). Тексты диссертации и автореферата размещены на сайте www.piboc.dvo.ru

Автореферат разослан Ж января 2015

года

Ученый секретарь / -

диссертационного совета, Черников О В

'<7

к.б.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Яды животных представляют собой сложные смеси низко- и высокомолекулярных биологически активных соединений, среди которых наибольший интерес для исследователей представляют нейротоксины, цитолитические токсины, а также ингибиторы протеиназ. Ядовитые секреты многих животных содержат десятки и даже сотни высокогомологичных полипептидов, имеющих разную специфичность и функциональную активность (комбинаторные библиотеки полипептидов). Изучение структурной организации компонентов ядов и молекулярных механизмов их взаимодействия с биологическими мишенями является актуальной задачей физико-химической биологии ввиду возможности использования этих соединений в качестве инструментов исследования молекулярной организации живых систем, а также создания на их основе лекарственных препаратов направленного действия и эффективных антидотов против действия биологических ядов. Кроме того, анализ структуры и функциональной активности полипептидных токсинов ядов вносит большой вклад в понимание их молекулярной эволюции и позволяет пролить свет на филогенетические взаимосвязи продуцирующих их ядовитых организмов.

Полипептиды структурного семейства Кунитца - широко распространенная группа соединений, обнаруженных в ядах животных самого разнообразного систематического положения. Исследовательский интерес к полипептидам данной группы, продуцируемым актиниями, обусловлен их способностью ингибировать протеолитические ферменты, модулировать ионотропные рецепторы и блокировать потенциалзависимые ионные каналы. Так, обнаружено, что некоторые представители комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа тропической актинии Heteractis crispa не только ингибируют сериновые протеиназы, но и модулируют болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, а также оказывают антигистаминное действие /л vivo. Такое разнообразие биологической активности указывает на возможный терапевтический потенциал данных полипептидов для лечения болевых и воспалительных состояний и патологий, связанных с нарушениями регуляции системы протеолиза. Однако молекулярные механизмы биологического действия, проявляемого этими соединениями, остаются в настоящее время слабоизученными и, несомненно, требуют выяснения.

Цели и задачи исследования. Данная работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью исследования является установление структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов Кунитц-типа актинии Н. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить и идентифицировать нативные полипептиды Кунитц-типа из актинии Н. crispa.

2. Провести биоинформационный анализ представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa с целью выявления молекул, перспективных для получения их рекомбинантных форм.

3. С помощью расчетных методов идентифицировать структурные детерминанты полипептидов, ответственные за взаимодействие с биологическими мишенями.

4. Создать генетические экспрессионные конструкции и получить отобранные полипептиды в рекомбинантной форме.

5. Определить физико-химические характеристики рекомбинантных полипептидов, установить их функциональную и биологическую активность.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе впервые были построены компьютерные модели пространственных структур 36 представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa и 15 полипептидов других видов актиний семейств Actiniidae и Stichodactylidae. Расчетными методами проведен анализ их физико-химических характеристик и выявлены принципиальные различия между ними в распределении молекулярного электростатического потенциала, что позволило, с учетом структурно-функциональных и филогенетических данных, сделать прогноз функциональной активности полипептидов.

Впервые построены компьютерные модели пространственных структур комплексов полипептидов комбинаторной библиотеки Н. crispa с трипсином, химотрипсином, эластазой нейтрофилов человека и болевым ваниллоидным рецептором TRPV1. На основании

многофакторного анализа комплексов выявлены структурные детерминанты, играющие ключевую роль в белок-белковых взаимодействиях полипептидов с их биологическими мишенями, сериновыми протеиназами и рецептором TRPV1. Предложена гипотеза, объясняющая молекулярный механизм анальгетической активности полипептидов Н. crispa АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ in vivo их модулирующим действием на болевой рецептор TRPV1 в сочетании с ингибирующим эффектом, оказываемым на протеиназы воспаления.

Получены в рекомбинантной форме и охарактеризованы новые представители комбинаторной библиотеки полипептидов Н. crispa. Показано, что данные соединения являются компетентными ингибиторами трипсина и могут образовывать устойчивые комплексы с химотрипсином. Впервые установлено, что они формируют также устойчивые комплексы с эластазой нейтрофилов человека. Расчетными методами впервые показана возможность образования межмолекулярных комплексов полипептидов с трипсином, имеющих как каноническое, так и альтернативное строение. Установлено, что полипептиды HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36 и HCRS 21 оказывают достоверное обезболивающее действие in vivo.

Результаты, полученные в ходе выполнения данного исследования, вносят значительный вклад в понимание связи между структурой и функцией полипептидов Кунитц-типа и причин их полифункциональности, а также расширяют базис знаний, необходимых для создания на их основе новых высокоэффективных анальгетических препаратов направленного действия.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гены мультигенного суперсемейства, кодирующие полипептиды Кунитц-типа Н. crispa, экспрессируются в тканях актинии, и полипептиды могут быть обнаружены в хроматографически очищенных белковых фракциях, проявляющих трипсинингибирующую активность.

2. Согласно данным биоинформационного анализа, представители комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa принципиально различаются по распределению молекулярного электростатического потенциала.

3. Согласно данным исследований in siiico, полипептиды способны образовывать устойчивые межмолекулярные комплексы с трипсином, а-химотрипсином и эластазой нейтрофилов человека и ингибировать их ферментативную активность. Полипептиды комбинаторной библиотеки HCGS 1.11, HCGS 2.17, HCGS 2.34, HCGS 2.2, HCGS 2.23, HCGS 2.32, HCGS 1.14, HCGS 2.27, HCGS 1.4, HCGS 1.13, HCGS 1.20, HCGS 1.25 и HCGS 1.48 взаимодействуют с трипсином с образованием межмолекулярных комплексов как с каноническим, так и с альтернативным строением.

4. Согласно данным исследований in siiico, модулирующее действие анальгетических полипептидов H. crispa на рецептор TRPV1 может быть обусловлено увеличением времени релаксации TRPV1, находящегося в связанном состоянии.

5. Рекомбинантные полипептиды HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36, HCRS 21 и HCRS 21 (P12L) являются компетентными ингибиторами трипсина, а также образуют устойчивые межмолекулярные комплексы с другими сериновыми протеиназами.

6. Рекомбинантные полипептиды HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36 и HCRS 21 обладают анальгетическим действием на модели тепловой стимуляции боли in vivo.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIII, XIV и XV Всероссийских молодежных школах-конференциях по актуальным проблемам химии и биологии, Владивосток, Россия, 2010, 2012 и 2014 гг. соответственно; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Петрозаводск, Россия, 2011 г.; 9-ом Международном конгрессе по токсиам животных, растений и микроорганизмов, Владивосток, Россия, 2011 г.; 5-ой Международной конференции по биоинформатике и биомедицинской инженерии (ICBBE 2011), Ухань, КНР, 2011 г.; 5-ой Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, химии, физики», Новосибирск, Россия, 2011 г.; Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы», Тамбов, Россия, 2011; XIV Международной заочной научно-практической конференции «Инновации в науке», Новосибирск, Россия, 2012 г.; 2-ом Международном симпозиуме по наукам о жизни, Владивосток, Россия, 2013 г.; V Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные

и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, Россия, 2013 г.; Всероссийской молодежной конференции «Взгляд в будущее», Владивосток, Россия. 2013 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 статей, из них 5 в журналах, определенных списком ВАК, 7 в сборниках научных трудов по материалам конференций, а также 9 тезисов докладов.

Личный вклад соискателя в проведение исследования. Соискателем был выполнен анализ литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, подготовлены статьи в научные журналы и доклады на конференции. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором совместно с сотрудниками лаборатории химии пептидов и других лабораторий ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и лаборатории межмолекулярных взаимодействий ИБМХ им. В.Н. Ореховича. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.

Структура диссертации. Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальную часть, заключение, выводы и список литературы, который включает 276 источников. Диссертация изложена на 140 страницах, содержит 54 рисунка и 15 таблиц.

Благодарности. Автор выражает благодарность научному руководителю, к.ф.-м.н. Елене Александровне Зелепуга, и научному консультанту, д.х.н. Маргарите Михайловне Монастырной, за руководство и поддержку на всех этапах выполнения настоящей работы. Автор признателен за помощь в выполнении данной работы сотрудникам лаборатории химии пептидов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова ДВО РАН д.х.н. Козловской Э.П., к.х.н. Гладких И.Н., к.х.н. Лейченко Е.В., Синцовой О.В., Калиной P.C., Кветкиной А.Н. и Терентьевой A.A. Автор выражает благодарность за сотрудничество и помощь к.х.н. Чаусовой В.Е., к.б.н. Ткачёвой Е.С., к.б.н. Кривошапко О.Н., Тищенко Н.М., Быстрицкой Е.П., Голотину В.А., Гончарову Н.В., Чернышевой Н.Ю., к.х.н. Сильченко A.C., к.х.н. Сидоровой О.В., к.х.н. Анастюку С. Д. (ТИБОХ ДВО РАН, Владивосток), д.х.н., академику РАН Гришину Е.В., к.б.н. Андрееву Я.А., к.х.н. Осмакову Д.И. (ИБХ РАН, Москва), д.б.н. Иванову A.C., к.б.н. Гнеденко О.В. (ИБМХ, Москва), к.б.н. Киселёву К.В. и к.б.н. Тюнину А.П. (БПИ ДВО РАН, Владивосток).

Сокращения и условные обозначения: а.о. - аминокислотный остаток; БПТИ (BPTI) -бычий панкреатический ингибитор трипсина; ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактозид; МЭП -молекулярный электростатический потенциал; н.п. - нуклеотидные пары; ОФ ВЭЖХ -обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография; ПЦР - полимеразная цепная реакция; AASA - изменение площади поверхности молекулы, доступной растворителю (в результате образования комплекса); К, - константа ингибирования; MALDI MS - масс-спектрометрия с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией; RMSD - среднеквадратичное отклонение; TRPV1 (Transient Receptor Potential cation channel, subfamily V, member 1) - ваниллоидный рецептор/канал (управляет неселективным ионным каналом, является полимодальным детектором многих болевых стимулов); TRX -тиоредоксин.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выделение ингибиторов Кунитц-типа из актинии Н. crispa

Ранее из водно-этанольного и водного экстрактов Н. crispa был выделен ряд индивидуальных полипептидов, Jn-IV, InhVJ, АРНС1, АРНС2, АРНСЗ и Rmln-I и Rmln-ll соответственно. В данной работе для выделения ингибиторов протеиназ из цельных актиний была использована модифицированная схема, включающая гидрофобную, ионообменную хроматографию и последующую очистку полипептидов ОФ ВЭЖХ. На стадии гидрофобной хроматографии на полихроме-1 (в статическом варианте) во фракциях, элюированных 20 % этанолом (рис. 1, А), была идентифицирована трипсинингибирующая активность. Фракции объединяли и после упаривания этанола полипептиды хроматографировали на колонке с катионообменным носителем Cellulose СМ-32 (рис. 1, Б). Фракции, в которых была обнаружена трипсинингибирующая активность, объединяли, обессоливали, концентрировали и хроматографировали с помощью ОФ ВЭЖХ на носителе Nucleosil Cie(pnc. 1, В).

Ж Аг„„.

2500' 2000'

[CHjCN],"/!

3 Агким

19»

2600' л 1900 Ь S14«

2000- 0,200 §1М0

1500' й te;

1000' S МО t 8 «о

500' 5 ю

[CHîCNJ,«.

30 40 50 60 Время, мин Время, мин

Рисунок 1. А - Профиль элюции полипептидов H. crispa на колонке с полихромом-1 (180x140 мм), уравновешенным водой. Элюция полипептидов в ступенчатом градиенте этанола (0-40 %), скорость элюции - 100 мл/мин. Б - Профиль элюции белковых компонентов суммарной фракции (А, пик 3) на колонке (26*500 мм) с Cellulose СМ-32, уравновешенной 100 мМ аммонийно-ацетатным буферным раствором, рН 5,14, в линейном градиенте концентрации NaCI (0-0,5 M) в рабочем буферном растворе. Скорость элюции - 24 мл/ч. В - Профиль элюции белковых компонентов фракций (Б, пик 5) на колонке с Nucleosil Cie (4,6*250 мм), уравновешенным 10% ацетонитрилом в 0,1 % ТФУ, рН 2,2, в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 60 % в 0,1 % ТФУ (рН 2,2) за 60 мин. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Пунктиром показаны границы фракций, проявивших трипсинингибирующую активность. Г, Д, Е - Масс-спектры полипептидов в белковых фракциях (В, пики 1, 2 и 3 соответственно). Ж, 3 - Профили элюции, полученные в результате рехроматографии полипептидов белковых фракций пика 2 (В) в тех же условиях. Серым цветом показаны границы объединения фракций. Приведены масс-спектры полипептидов объединенных фракций, проявивших трипсинингибирующую активность.

В результате были получены три фракции (рис. 1, В, пики 1, 2, 3). Масс-спектрометрический анализ показал, что во фракциях содержатся полипептиды, значения молекулярных масс которых лежат в интервале 5800-7000 Да (рис. 1, Г, Д, Е), характерном для молекулярных масс ингибиторов Кунитц-типа из актиний. Фракции 2-го пика с максимальным содержанием белка (рис. 1, В), рехроматографировали на колонке с Nucleosil Cíe (рис. 1,Ж).

По данным масс-спектрометрического анализа полипептидов объединенных фракций (рис. 1, Ж, пик 1) их молекулярные массы соответствовали 6106 и 6332 Да. Рехроматография позволила получить гомогенный трипсинингибирующий полипептид с молекулярной массой 6106 Да (рис. 1, 3), которая соответствует массе ингибитора Кунитц-типа InhVJ, выделенного из Н. crispa ранее.

Белковые фракции, соответствующие пикам 1 и 3 (рис. 1, В), были рехроматографированы на колонке с носителем Nucleosil Cía (данные не приведены), однако выделить из них трипсинингибирующие полипептиды в индивидуальном состоянии не удалось. Очевидно, что в водно-этанольном экстракте Н. crispa содержится несколько десятков полипептидов с молекулярными массами порядка 6000-7000 Да, обладающих трипсинингибирующей активностью. Сложность их выделения в индивидуальном состоянии указывает на близкие физико-химические характеристики полипептидов. Дальнейшее изучение структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов семейства Кунитца Н. crispa проводили, используя молекулярно-биологические, биофизические, физико-химические, биоинформационные и вычислительные методы.

2. /л silico исследование структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов комбинаторной библиотеки актинии Н. crispa

2.1. Сравнительная структурная и функциональная характеристика полипептидов

Ранее в генетическом материале актинии Н. crispa с помощью техники ПЦР-амплификации и методов молекулярного клонирования было обнаружено мультигенное суперсемейство, состоящее из четырех (GS-, RG-, GG- и GN-) семейств, гены которых кодируют HCGS-, HCRG-, HCGG- и HCGN-полипептиды Кунитц-типа (Чаусова, 2012). Высокая степень идентичности выведенных аминокислотных последовательностей HCGS-полипептидов (рис. 2) и HCRG-полипептидов (данные не опубликованы), наличие последовательностей, отличающихся лишь точечными заменами, свидетельствовало о том, что полилептиды являются высокогомологичными изоформами и образуют природную комбинаторную библиотеку. Основное внимание в данной работе уделено исследованию семейства HCGS-полипептидов (рис. 2).

Высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей HCGS-полипептидов с последовательностями известных нативных ингибиторов протеиназ из Н. crispa (Jn-IV, InhVJ, АРНС1, АРНС2, АРНСЗ) и Stichodactyla helianthus (SHPI-1, SHPI-2) позволила предположить, что они могут обладать ингибирующей активностью по отношению к сериновым протеиназам. Наиболее гомологичной аминокислотным последовательностям HCGS-полипептидов, в частности, аналыетическим полипептидам АРНС1-АРНСЗ, оказалась последовательность HCRS 21, принадлежащая семейству HCRG-полипептидов, в связи с чем в работе была проведена структурно-функциональная характеристика и этого полипептида.

Расчетные значения молекулярных масс ряда HCGS-полипептидов (рис. 2) соответствуют значениям, определенным в результате масс-спектрометрического анализа соединений, содержащихся во фракциях, полученных в процессе выделения нативных ингибиторов из экстракта Н. crispa (рис. 1). Это указывает на то, что десятки генов мультигенного суперсемейства, кодирующих полипетиды Кунитц-типа Н. crispa, экспрессируются в тканях актинии.

Выяснение деталей молекулярного механизма взаимодействия с биологическими мишенями известных соединений комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa и установление функциональной активности ее новых представителей вызывает большой научный интерес. Наиболее простой подход к решению этой задачи -сравнительный анализ структур новых и уже охарактеризованных полипептидов.

hcgs 2.2 hcgs 2.23 hcgs 2.17 hcgs 2.27 hcgs 2.34 hcgs 1.11 hcgs 1.20 hcgs 1.25 hcgs 1.32 hcgs 1.4 hcgs 1.13 hcgs 1.1 hcgs 1.3 hcgs 1.24 hcgs 1.44 hcgs 1.46 hcgs 1.28 hcgs 1.30 hcgs 1.45 hcgs 1.14 hcrs 21 hcgs 1.36 hcgs 1.34 InhVJ hcgs 2.3 jn-iv hcgs 1.10 APHC1 APHC2 APHC3 hcgs 1.26 hcgs 1.6 hcgs 2.1 hcgs 1.61 hcgs 1.48 hcgs 1.19 shpi-1 shpi-2 BPTI

-rgicsepkwgpi -gsiclepkwgpi

— GS ICIjEPKWQP< -GSICLEl -GSICLEl -GSICLEl -GSICLEl -GSICLEl -gsk -gsicle:

-GSICLEl -GSICLEJ -GSICLEl -GSICLE] -GSICLEl -GSIi

— sicse!

— sfclepk1 rpdfclepp:

iSETGKCTPFIYi ¡IRRFYFDSETGKCTPS IY( -GSICLEPKWGPCKARIRRFYFDSKTGKCTPFlYi GSICLEPKWGPCKARIRRFYFDSETGKCTP1 -GSICLEPKWGPCKARIRRFYFDSETGKCTP1 -GSICLEPKVAGPCKARIRRFYYDSETGKCTP1 -GSICLEPKAVGPCKARIRRFYYDSETGKCTPFI' GS I CLEPKWG PCKARIRRFYYDSETGKCTPFI Y< -GSICLEPKWGPCKARIE^RFYYDSETGKCKPEjl--GSICLEPKWG PCKARIRRFYYDSETÍ GSICLEPKWGPCKARIRRLYYDSETI - GS I CLE PKWG PCKARI RRFY*D PET( -GSICLEPKWGLCKARIRRFYYDSETÍ -GSICLEPKWD PCKARI RRFYYDI -GSICLEPKWG PCKARI RRFYFDi GS ICLEPKWGPCKARIRRFYFDSETGKCTPFIYGGCK GSICLEPKAVGPCKARIRRFYYDSETGKCTPFIYGGO] " iYEpRFYFDSETGKCTPE IY( iSETGKCTPFIHl

iSETGKCTPFIYf 'SETGKCTPE IYGGi IFYFDSETGKCTPFIYGRO] iSETGKCTPFIYGGi ISETGKCTPFI Y( 'FDSETGKCTVFIYC iSETGKCTPFIYI tSETGKCTPBjIY( SETGKCTPF I Y( SETGKCTPFIYI .SETGKCTPFI Y( YFDSETGKCTPi IY< iSETGKCTPFIYI iSETGKCTPFIYGGi iSETGKCTPFIYC iSKTGKCTPFIY« :ryf*nakaglcqtb{vy(

¡tlhacraicra-ilhacraicra-

:cra-:cra-

icraicra-[gnnfetlhacraicra-ignnfetlhacraicra-craicra-IGNNFETLHACRAICRA-ignnfetlhacraicra-ignnfetlhacraicra-¡craicra-nnfetlhqcraicra-:cra-

nnfetlhqcraicra-nnfetlhqcraicra-nnfetlhqcraicra-nnfe tlhqc raicra -nnfetlhacraicra-¡tlhacraicra-:cra-

ignnfetlracraicra-ignnfetlhacraicra-¡tlhacraicra-icraicra-syvdeklhacraicra-3ngnnfetlracraicra-3ngnnfetlracraicra-icraicra-

;icra-

1tlhacraicra-ignnfetlhacraicra-ignnfetlhacraicra-

ignnfetlhacraicra-ignnfetlhacraicra-

:cra-:cra-

iaedcmrtcgga

NGNNFETL1

6068 6080 6140 6053 5981

6079

6080 6068 6068 6068 6096 6340 6323 6289 6333 6339 6381 6307 6222 6140 6228 6175 6080 6106" 6107 6165" 6151 6187* 6185* 6111* 6166

6058

6059 6028 6028 6088 6110* 6195* 6518*

Рисунок 2. - Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей полипептидов Кунитц-типа: SHPI-1 и SHPI-2 (UniProt AN Р31713, Р81129) из S. helianthus, БПТИ (UniProt AN Р00974) из Bos taurus, АРНС1, АРНС2, АРНСЗ, Jn-IV (UniProt AN B2G331, C0HJF4, C0HJF3, P16344), InhVJ и остальных полипептиов из Н. crispa. На сером, темно-сером, желтом, голубом и черном фонах показаны идентичные остатки. Красной рамкой выделен реактивный сайт взаимодействия с протеиназа-ми, зеленой - сайт слабых взаимодействий. Справа указаны расчетные значения молекулярных масс полипептидов. * -Отмечены молекулярные масс-сы, определенные экспериментальными методами. Показан остаток в положении Р-|.

2.2. Компьютерные модели пространственных структур полипептидов

Модели пространственных структур (рис. 3) полипептидов Кунитц-типа Н. crispa (35 HCGS-полипептидов и HCRS 21) и других видов актиний семейств Actiniidae и Stichodactylidae (15 полипептидов, рис. 4, кластер А) были построены на основе их аминокислотных последовательностей методом гомологичного моделирования с помощью сервера SWISS-MODEL, программ Chimera и MODELLER. В качестве прототипа была использована пространственная структура полипептида SHPI-1 из S. helianthus (PDB ID 1SHP, степень идентичности последовательности от 74 до 92 % - для поли пептидов Н. crispa, и от 42 до 64 % для полипептидов из актиний других видов). Разрешение моделей составило от 1,7 до 1,5 А. Минимизацию энергии молекул полипептидов осуществляли с помощью программы SPDBV с использованием силового поля GROMOS 96.

Рисунок 3. - Ленточная диаграмма модели пространственной структуры полипептида HCGS 1.19. Цветом выделены элементы вторичной структуры: красным - спирали, голубым - (3-стренды, зеленым - |3-изгибы, серым - участки неупорядоченной структуры. Желтым цветом показаны •ys54 дисульфидные связи. Указаны N- и С-конец, (3-1 и (3-2 стренды, Зю-спираль, а-спираль, остаток в положении Pi 4 (Arg14). На голубом фоне показана предполагаемая область связывания с сериновыми протеиназами, по аналогии со строением связывающей петли БПТИ.

Суперпозиция полученных моделей и ЗО-структуры прототипа SHPI-1 показала, что величина RMSD для 55 Са-атомов не превышает 0,2 А, что говорит о высокой точности моделей. С помощью карты Рамачандрана и сервера PROCHECK полученные модели были протестированы на наличие стерических и конформационных затруднений. Установлено, что в моделях все а.о. имеют благоприятную или допустимую конформацию. Таким образом, были получены высокоточные модели ЗО-структур HCGS-полипептидов комбинаторной библиотеки Н. crispa, а также полипептидов семейства Кунитца других видов актиний, которые применимы для структурно-функциональных исследований.

2.3. Расчетные физико-химические характеристики полипептидов

Расчет физико-химических характеристик HCGS-полипептидов показал, что полипептиды имеют близкие (а в некоторых случаях - идентичные) значения молекулярных масс. Весьма близкими оказались также величина заряда и значение изоэлектрической точки ряда полипептидов. Таким образом, было установлено, что полипептиды семейства Кунитца Н. crispa имеют высокую степень гомологии структур и близкие физико-химические характеристики, что объясненяет сложность их хроматографического разделения и выделения в индивидуальном состоянии.

2.4. Анализ молекулярного электростатического потенциала полипептидов

С помощью программы SPDBV для всех полипептидов семейства Кунитца актиний (см. п. 2.2) были построены эквипотенциальные поверхности, представляющие собой трехмерную визуализацию молекулярного электростатического потенциала (МЭИ). Было отмечено, что для HCGS-полипептидов характерно несколько типов распределения МЭИ. Качественный анализ подобия распределения МЭП, проведенный с помощью сервера webPIPSA, позволил сгруппировать полипептиды в три кластера (рис. 4). Все полипептиды Кунитц-типа актиний, за исключением полипептидов Н. crispa и S. helianthus, формируют вместе с БПТИ из В. taurus отдельный кластер (рис. 4, А). Полипептиды Н. crispa и S. helianthus формируют два кластера (рис. 4, Б, В), представители которых принципиально различаются по распределению МЭП. Показано, что полипептиды кластера В отличаются от своих аналогов в кластере Б точечным распределением МЭП.

Рисунок 4. - Дендрограмма полипептидов Кунитц-типа, построенная на основании подобия распределения МЭП: АРНС1, АРНС2, АРНСЗ, Jn-IV (UniProt AN B2G331, C0HJF4, C0HJF3, Р16344), InhVJ и остальные HCGS-полипептиды из H. crispa; SHPI-1 и SHPI-2 (UniProt AN P31713, P81129) из S. helianthus-, SHTX-3 (UniProt AN B1B5I8) из S. haddoni; AXPI-I, AXPI-II (UniProt AN P81547, P81548), AXPI-II! из Anthopleura aff. xanthogrammica\ AEPI-I, AEPI-II, AEAPI из Actinia equina; AFAPi-i. AFAPI-II! из A. fuscoviridis; SA5 II, AsKC1, AsKC2, AsKC3 (UniProt AN P10280, Q9TWG0, Q9TWF9, Q9TWF8) из Anemonia sulcata; APEKTxl (UniProt AN P86862) из A. elegantissima; BPTI (UniProt AN P00974) из В. taurus. Показаны эквипотенциальные поверхности некоторых представителей кластеров А (BPTI, PDB ID 2РТС), Б и В (HCGS 2.23 и InhVJ). Модели пространственных структур полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм (показаны зеленым цветом). Области потенциала, создаваемого положительно и отрицательно заряженными а.о., показаны синим и красным цветами соответственно.

НССЗ-полипептиды, близкие по электростатическим характеристикам ингибиторам протеиназ ЭНР1-1 и 5НР1-2, формируют подгруппу в кластере Б (рис. 4, Б1).

Предположительно они могут проявлять, подобно SHPI-1 и SHPI-2, ингибирующую активность в отношении трипсина, химотрипсина, эластазы, калликреина и плазмина.

Особый интерес среди представителей данной подгруппы представляет полипептид HCGS 1.19, структура которого наиболее гомологична структурам ингибиторов протеиназ SHPI-1 и SHPI-2. Однако наличие аминокислотной замены Tyr16Ser в его реактивном сайте (рис. 2) может оказывать влияние на кинетику комплексообразования и устойчивость комплексов HCGS 1.19 с протеолитическими ферментами. Получение рекомбинантного HCGS 1.19 и исследование особенностей его связывания с сериновыми протеиназами имеет большое значение для сравнительного изучения структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов семейства Кунитца.

Две другие подгруппы кластера (рис. 4, Б2 и БЗ) составляют HCGS-полипептиды, которые не группируются по подобию МЭП ни с одним из функционально охарактеризованных ранее полипептидов Кунитц-типа. Предположительно, эти соединения могут проявлять биологическую активность, отличную от активности полипептидов других кластеров. С целью установления активности представителей погруппы Б2 был отобран полипептид HCGS 1.20 (рис. 2) представляющий интерес для получения его рекомбинантной формы и определения биологической активности.

Кластер представителей комбинаторной библиотеки, характеризующихся точечным распределением МЭП, (рис. 4, В), объединяет две подгруппы, одну из которых образуют полипептиды, гомологичные ингибиторам Jn-IV и InhVJ (рис. 4, В1) со степенью идентичности аминокислотных последовательностей внутри подгруппы 88-98%, а другую - гомологи модуляторов болевого ваниллоидного рецептора TRPV1, анальгетических полипептидов АРНС1-АРНСЗ (рис. 4, В2), степень идентичности последовательностей которых составляет 91-98%. В отличие от других представителей комбинаторной библиотеки эти полипептиды одновременно имеют остатки Thr14 (в Р^положении реактивного сайта) и Glu38 (в сайте слабых взаимодействий с сериновыми протеиназами) (рис. 2). На основании столь высокой структурной гомологии аминокислотных последовательностей и общего характера распределения МЭП было выдвинуто предположение, что новые HCGS-полипептиды могут являться полифункциональными соединениями, способными помимо ингибирования сериновых протеиназ модулировать болевой рецептор TRPV1 in vitro и оказывать анальгетическое действие in vivo. Поэтому внимание было сконцентрировано на исследовании представителей данной группы полипептидов (рис. 4, В2) с целью установления молекулярных детерминант, ответственных за взаимодействие с биологическими мишенями.

2.5. Установление структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов комбинаторной библиотеки Н. crispa

2.5.1. Структурные модели комплексов с а-химотрипсином

Теоретические модели комплексов полипептидов-представителей комбинаторной библиотеки Н. crispa с а-химотрипсином были построены методом жесткого молекулярного белок-белкового докинга с использованием алгоритма программы PIPER и кластеризации результатов на веб-сервере ClusPro 2.0. В качестве рецептора использовали структуру а-химотрипсина, изолированную из комплекса БПТИ-а-химотрипсин (PDB ID 1CBW). Показано, что полученные комплексы всех полипептидов комбинаторной библиотеки Н. crispa имеют аналогичную архитектуру. Механизм взаимодействия представителей комбинаторной библиотеки с а-химотрипсином рассмотрен на примере комплекса HCRS 21-а-химотрипсин (рис. 5). Его пространственная организация близка к экспериментально установленной структуре комплекса БПТИ-а-химотрипсин. При суперпозиции комплексов величина RMSD для Са-атомов составляет 4,82 А.

Использование ресурсов сервера ProtorP позволило охарактеризовать поверхность контактов комплекса HCRS 21-а-химотрипсин (табл. 1) и определить вклады в связывание отдельных а.о., участвующих в образовании межмолекулярного интерфейса. Поверхность контактов образована 122 атомами 42 а.о., ее площадь составляет 1408,92 А2, что соответствует экспериментально установленным параметрам для устойчивых фермент-ингибиторных комплексов, порядок Kd которых составляет в среднем 10~12 М.

Рисунок 5. А - Суперпозиция структурной модели комплекса НСРЭ 21-а-химотрипсин со структурой кристаллического комплекса БПТИ-а-химотрипсин (РОВ Ю 1СВ\Л/). Б - Остатки в положении Р, комплексно связанных НО^в 21 (ТИг14) и БПТИ (Ьуэ15). Структуры полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм. Показаны аминокислотные остатки активного центра фермента (шаровые модели) и остатки в положении Рт ингибиторов (шаро-стержневые модели).

Таблица 1. - Характеристики поверхности контактов теоретически рассчитанного комплекса НСКЭ 21-а-химотрипсин_

Параметр

Значение

HCRS 21

Количество сегментов 7 7

Площадь ДАЭА (А2) 643,67 765,25

% ДАЭА 6,27 21,21

Количество атомов 63 59

Количество а.о. 27 15

% полярных а.о. 62,96 33,33

% неполярных а.о. 37,04 53,33

% заряженных а.о. 0,00 13,33

Планарность (А) 2,856 2,608

Элементы вторичной структуры петля 3

% а-структурированных участков 0,00 0,00

% Р-структурированных участков 18,52 33,33

Водородные связи 2

Солевые мостики 8

Объем полостей (А3) 3253,50

Индекс объема полостей (А) 2,53 2,13

Показано, что в комплексообразовании участвуют остатки активного центра а-химотрипсина His57, Gly193 и Ser195. Согласно результатам молекулярного докинга, полипептид HCRS 21 и другие полипептиды Кунитц-типа Н. crispa, рассматриваемые в данной работе, образуют устойчивые комплексы с а-химотрипсином, блокируя его активный центр и, тем самым, ингибируя его каталитическую активность. Очевидно, в комплексно связанном состоянии а-химотрипсин не может выполнять протеолитическую функцию. Комплексы имеют архитектуру, близкую строению комплекса БПТИ-а-химотрипсин, что указывает на канонический характер взаимодействия.

2.5.2. Структурные модели комплексов с трипсином

Теоретические модели комплексов исследуемых полипептидов с трипсином были построены аналогично (см. п. 2.5.1). В качестве рецептора использовали структуру трипсина из комплекса БПТИ-трипсин (PDB ID 2РТС). Механизм взаимодействия представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Н. crispa с трипсином рассмотрен на примере комплекса HCGS 2.23-трипсин. Архитектура полученных комплексов аналогична архитектуре комплекса БПТИ-трипсин. Однако в процессе кластеризации результатов молекулярного докинга для группы HCGS-полипептидов, входящих в кластер Б (рис. 4), были получены густозаселенные кластеры решений с низкими значениями поисковой энергетической функции (scoring function), соответствующие как каноническому строению комплексов, так и альтернативному. Так, для комплексов HCGS 1.11-, HCGS 2.17-, HCGS 2.34-, HCGS 2.2-, HCGS 2.23-, HCGS 2.32-, HCGS 1.14-, HCGS 2.27-, HCGS 1.4-, HCGS 1.13-, HCGS 1.20-, HCGS 1.25- и HCGS 1,48-трипсин наблюдалось два типа архитектуры, в которых задействованы или связывающая петля ингибитора (рис. 6, А), или С-концевая а-спираль (рис. 6, Б). На основе данных, полученных в результате анализа поверхностей контактов комплексов (табл. 2), можно сделать вывод, что комплекс HCGS 2.23-трипсин с альтернативным строением по большинству характеристик сопоставим с комплексом канонической архитектуры, а по некоторым даже превосходит его.

Рисунок 6. А - Суперпозиция структурной модели комплекса НСвв 2.23-трипсин (каноническая архитектура) со структурой кристаллического комплекса БПТИ-трипсин (РОВ Ю 2РТС). Б - Структурная модель комплекса НССЭ 2.23-трипсин (альтернативная архитектура). Структуры полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм. Аминокислотные остатки активного центра фермента показаны шаровыми моделями.

Таблица 2. - Характеристики поверхности контактов теоретически рассчитанных комплексов НСОЭ 2.23-трипсин с канонической и альтернативной архитектурой_

Каноническая архитектура Альтернативная архитектура Трипсин_HCGS 2.23 Трипсин_HCGS 2.23

Количество сегментов 11 11 11 11

Площадь ДАБА (А2) 716,61 814,43 823,99 953,91

% ДАЭА 7,97 23,59 9,20 28,66

Количество атомов 136 69 161 75

Количество а.о. 27 18 32 20

% полярных а.о. 70,37 22,22 65,62 25,00

% неполярных а.о. 25,93 55,56 28,12 55,00

% заряженных а.о. 3,70 22,22 6,25 20,00

Планарность (А) 6,603 2,557 6,148 2,735

Элементы вторичной структуры а Р а/р Р

% а-структурированных участков 22,22 0,00 31,25 0,00

% 3-структурированных участков 18,52 55,56 21,88 25,00

Водородные связи 10 7

Солевые мостики 11 6

Объем полостей (А3) 135,00 270,00

Индекс объема полостей (А) 0,09 0,08 0,16 0,14

С целью дискриминации данных структурных моделей и поиска наиболее выгодной архитектуры комплекса HCGS 2.23-трипсин был проведен более глубокий анализ всех 97 наиболее предпочтительных моделей, полученных после кластеризации результатов геометрического докинга. Для этих моделей были рассчитаны изменение свободной энергии Гиббса (AG) и теоретические константы диссоциации в системе HCGS 2.23-трипсин. Согласно расчетным данным, комплексы с обеими архитектурами, канонической и альтернативной (рис. 6), соответствуют глобальному энергетическому минимуму данной системы (рис. 7) и имеют близкие значения Kd. Разница в расчетном изменении свободной энергии Гиббса при образовании комплексов с каноническим (AG = -15,09 ккал/моль, Kd = 9.78 Ю"12) и альтернативным (AG =-15,19 ккал/моль, Kd= 8,26-10"12 М) строением не превышает пределов стандартной погрешности вычислений при использовании экспериментальных методов. Это служит основанием для предположения о том, что обе архитектуры комплексов могут быть реализованы и существовать одновременно.

В интерфейс расчетных комплексов ингибитор-трипсин в обоих случаях со стороны фермента входят а.о. His57, Gly193, Ser195, принимающие участие в его каталитическом действии. Очевидно, в комплексно связанном состоянии трипсин не может осуществлять катализ гидролитического расщепления полипептидного субстрата. При этом падение активности фермента, по-видимому, может наблюдаться в случае реализации обоих вариантов архитектуры комплекса.

Наибольшой вклад в образование комплекса HCGS 2.23-трипсин с канонической архитектурой вносят остатки Lys14, Gly16, Пе17 и Arg18, что коррелирует с экспериментальными данными, полученными для БПТИ. Совокупность представленных расчетных данных указывает на субстратоподобный механизм ингибирования HCGS 2.23 при взаимодействии с классическим сайтом связывания трипсина.

В образование комплекса с альтернативным строением со стороны ингибитора наибольший вклад вносят а.о. N- и С-концевых спиралей попипептида: Gly1, Ser2, ПеЗ, His 48, Arg51, !le53, Ala56, при этом наблюдается увеличение поверхности контактов при уменьшении комплементарности белковых поверхностей в области интерфейса.

Поля молекулярных взаимодействий (в частности, МЭП) играют одну из важнейших ролей в белок-белковом связывании. Тем не менее, теоретическая возможность образования комплексов трипсин-ингибитор с двумя типами архитектуры для полипептидов, отнесенных в один кластер по параметру подобия распределения МЭП, говорит о том, что взаимную ориентацию элементов комплекса и его строение обуславливают и другие взаимодействия.

При сравнении эквипотенциальных поверхностей БПТИ и HCGS 2.23 (рис. 4) выявлено, что МЭП полипептида HCGS 2.23, создаваемый его положительно заряженными остатками, распределен более равномерно как в области петли связывания с сериновыми протеиназами, так и в области N- и С-концевых спиралей. Очевидно, это определяется более равномерным распределением положительно и отрицательно заряженных а.о. в структуре полипептида. Вероятно, при отсутствии явного преимущества электростатических взаимодействий в области петли связывания возрастает роль других типов взаимодействий, в частности, гидрофобных.

Сравнительный анализ молекулярных поверхностей (рис. 8) показал, что относительная площадь поверхности, сформированной гидрофобными а.о. HCGS 2.23 (в частности, в районе С-концевой a-спирали), превышает таковую для БПТИ на 6 %. Видимо, увеличение площади гидрофобной поверхности в этой области приводит к появлению у молекулы ингибитора дополнительного центра связывания, и, как следствие, возможности образования комплекса с трипсином альтернативного строения.

Таким образом, методом молекулярного докинга были получены теоретические пространственные модели комплексов представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Н. crispa с трипсином. Показано, что полипептиды образуют устойчивые комплексы (Kd - 10"12 М), блокируя активный центр фермента, и, тем самым, ингибируя его каталитическую активность. При этом для группы полипептидов (HCGS 1.11, HCGS 2.17, HCGS 2.34, HCGS 2.2, HCGS 2.23, HCGS 2.32, HCGS 1.14, HCGS 2.27, HCGS 1.4, HCGS 1.13, HCGS 1.20, HCGS 1.25 и HCGS 1.48) наблюдается не только канонический тип связывания (с участием канонической петли), но и альтернативный (с участием а.о. концевых а-спиралей). Установлено, что в комплексах канонического строения со стороны сериновой протеиназы во взаимодействии участвуют, по крайней мере, три а.о. активного центра фермента, что говорит о конкурентном типе ингибирования. Ключевую роль играют а.о. ингибитора Lys14, Gly16, lie 17 и Arg18, что указывает на субстратоподобный механизм действия.

«sÉ Ж *

2®

«v •••

& эе

№ .¿fe

т

>а >2

&Á

Рисунок 7. - Зависимость расчетных значений К„ от архитектуры молекулярного комплекса НСвв 2.23-трипсин. Структуры полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм. Трипсин показан серым цветом, НССЭ 2.23 - синим. Наиболее выгодные варианты комплекса выделены зеленой рамкой.

Рисунок 8. - Молекулярные поверхности НСбв 2.23 и БПТИ, окрашенные по степени гидрофобности поверхностных а.о. А, А' -БПТИ; Б, Б' - НСвв 2.23. Гидрофобность поверхности уменьшается при переходе от синего цвета к красному.

2.5.3 Структурные модели комплексов с эластазой нейтрофилов человека

Эластаза является одним из основных участников воспалительного процесса и, следовательно, соединения, способные ингибировать ее действие, представляют интерес для создания на их основе лекарственных препаратов нового поколения, обладающих противовоспалительным действием. Для установления способности HCGS-полипептидов взаимодействовать с протеолитическими ферментами воспаления было проведено моделирование структур их комплексов с эластазой нейтрофилов человека (HNE). Генерацию моделей структур комплексов проводили методом жесткого молекулярного докинга с использованием алгоритма программы PIPER и кластеризации результатов на вебсервере ClusPro 2.0. В качестве рецептора использовали структуру HNE, изолированную из кристаллической структуры ее комплекса с С-концевым доменом секреторного ингибитора протеазы лейкоцитов SLPI (PDB ID 2Z7F). Механизм взаимодействия HCGS-полипептидов с эластазой нейтрофилов человека рассмотрен на примере комплекса с полипептидом Jn-IV (рис. 9).

Рисунок 9. А - Суперпозиция структурной модели комплекса Jn-IV-HNE со структурой кристаллического комплекса 1/2 SLPI-HNE (PDB ID 2Z7F). Б - Остатки в положении Р- комплексно связанных Jn-IV (Thr14) и 1/2 SLPI (Leu72i). Структуры полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм. Показаны аминокислотные остатки активного центра фермента (шаровые модели), углеводные компоненты HNE (стержневые модели) и остатки в положении Рт (шаро-стержневые модели).

Показано, что HNE имеет единственный центр связывания с исследуемыми полипептидами, который локализован в области активного центра фермента и в значительной степени перекрывается с таковым для 1\2 SLPI. Установлено, что боковая цепь остатка в положениии Р, ингибитора (Thr14) высоко комплементарна субцентру Si активного центра фермента. Согласно полученным данным взаимодействие носит канонический характер. Для валидации полученной структурной модели комплекса Jn-IV с HNE с использованием ресурсов сервера ProtorP проведен анализ поверхности контактов (табл. 3).

Таблица 3. - Характеристики поверхности контактов комплексов HNE с Jn-IV и 1\2 SLPI

Параметр Комплекс HNE с Jn-IV Комплекс HNE с 1\2 SLPI

HNE Jn-IV HNE 1\2 SLPI

Количество сегментов 9 9 10 10

Площадь ДАБА (А2) 560,46 671,15 615,29 798,37

% ДАБА 5,65 19,20 6,10 19,35

Количество атомов 138 50 71 48

Количество а.о. 23 17 27 11

% полярных а.о. 39,13 29,41 37,04 36,36

% неполярных а.о. 52,17 52,94 55,56 63,64

% заряженных а.о. 8,70 17,65 7,41 0,00

Планарность (А) 6,248 2,208 2,627 1,669

Элементы вторичной структуры а ß а ß

% а-структурированных участков 26,09 0,00 22,22 0,00

% ^-структурированных участков 13,04 47,06 7,41 45,45

Водородные связи 10 28

Солевые мостики 3 2

Объем полостей (А3) 162,00 2801,25

Индекс объема полостей (А) 0,14 0,12 2,28 1,75

Недоступная растворителю площадь поверхности молекулярных контактов (¿ASA) для HNE и Jn-IV составляет 5,65 % и 19,20 % всей поверхности белка соответственно, что превышает площадь контактов короткоживущих комплексов и соответствует значению AASA для достаточно устойчивых комплексов. Установлено, что поверхности фермента в области контакта в сайте связывания высоко комплементарны, и показатель соответствия поверхностей сопоставим с таковым для постоянных комплексов (т.е. белков, которые длительное время находятся в связанном состоянии или выполняют свои биохимические

функции только в виде комплексов). Отмечено, что площадь поверхности контактов для системы HNE-Jn-IV несколько меньше, чем для комплекса HNE и 1\2 SLPI (табл. 3). Однако поверхности молекул HNE и Jn-IV в области контакта обладают более высокой комплементарностью по сравнению с таковой для системы HNE-1\2 SLPI, на что указывает меньшее на порядок значение индекса объема полостей межмолекулярного интерфейса (0,14 и 2,28 для комплексов HNE с Jn-IV и 1\2 SLPI соответственно). Это свидетельствует о том, что полипептид Jn-IV может обладать большей аффинностью в отношении данного фермента и являться достаточно компетентным ингибитором HNE.

Теоретическое исследование межмолекулярных взаимодействий, возникающих между полипептидными цепями в комплексе, показало, что его образование происходит при участии Ван-дер-Ваальсовых, гидрофобных, электростатических взаимодействий и водородных связей. Структуру данного комплекса стабилизирует 3 солевых мостика и 10 водородных связей. Среднее число водородных связей пропорционально площади поверхности контактов и составляет более одной на каждые 100-200 А2, что соответствует параметрам, полученным при экспериментальном исследовании известных устойчивых комплексов.

Проведен детальный анализ межмолекулярных гидрофобных взаимодействий в комплексе Jn-IV с эластазой (рис. 10) с помощью программы CLuD. Сайт связывания Jn-IV с

HNE отличается высоким содержанием неполярных а.о. (52,17 и 52,94 % на поверхности контактов для рецептора и лиганда соответственно), которые образуют четыре гидрофобных кластера. Поскольку в данной области связывания преобладают неполярные а.о., что обуславливает формирование обширных областей гидрофобных контактов, логично предположить, что гидрофобные взаимодействия вносят значительный вклад в образование белок-белкового комплекса и важны для его стабилизации.

Анализ взаимодействий Jn-IV и HNE показал, что движущими силами комплексообразования данных белков выступают электростатические и гидрофобные взаимодействия. Вероятно, дальнодействующие электростатические взаимодействия являются инициирующими при образовании комплекса, а затем стабилизация его тонкой архитектуры происходит при участии гидрофобных взаимодействий и водородных связей.

Анализ аминокислотных остатков, участвующих в формировании поверхности контактов фермента и ингибитора, показал, что во взаимодействии с Jn-IV со стороны фермента участвуют четыре а.о., составляющие реакционный центр (Hls57, Asp102, Ser195 и Gly193). Структурными элементами Jn-IV, ответственными за связывание с HNE, являются две петли, в области которых расположены центры связывания с другими сериновыми протеиназами. Ключевыми а.о. полипептида, определяющими архитектуру комплекса с HNE, являются Рго12, Туг16, которые образуют водородные связи с молекулой фермента, а также Cys13 и Phe17, входящие в состав гидрофобного кластера 3 (рис. 10). Одна из важнейших ролей во взаимодействии Jn-IV с HNE принадлежит остатку в Pi-положении Thr14, который участвует в образовании шести водородных связей с молекулой фермента, три из которых связывают молекулу ингибитора с активным центром HNE. Совокупность полученных расчетных данных указывает на то, что Jn-IV может конкурировать с субстратом HNE за сайт связывания (активный центр) фермента, взаимодействуя аналогично другим ингибиторам сериновых протеиназ Кунитц-типа по субстратоподобному механизму, и, следовательно, ингибирует его каталитическую активность. На основании результатов многофакторного анализа вышеописанной модели комплекса Jn-IV с HNE можно сделать вывод, что данная молекулярная модель взаимодействия полипептида Кунитц-типа Н. crispa с эластазой является достоверной, а сам комплекс Jn-IV с HNE, имеющий предложенную архитектуру, достаточно прочным. Безусловно, полученные данные требуют экспериментальной проверки.

Результаты проведенного исследования указывают на то, что представители исследуемой группы полипептидов могут эффективно воздействовать на воспалительный процесс и являться основой для создания противовоспалительных лекарственных

Кластер 2

Рисунок 10. - Межмолекулярные гидрофобные взаимодействия в комплексе ип-1У с НМЕ. Зй-структуры молекул представлены в виде ленточных диаграмм. Атомы, образующие гидрофобные контакты, представленны в виде шаров.

препаратов. Таким образом, использование методов вычислительного моделирования для изучения взаимодействия ингибиторов сериновых протеиназ из Н. crispa с эластазой нейтрофилов человека дает возможность получения адекватной модели структуры комплекса системы «фермент воспалительного процесса - полипептидный ингибитор» и, следовательно, предсказания возможных свойств исследуемых полипептидов.

2.5.4. Структурные модели комплексов с рецептором TRPV1

Известно, что ионотропные рецепторы TRPV1 принимают прямое участие в механизмах восприятия и передачи болевого сигнала. С функциональной точки зрения TRPV1 является неселективным Са2*-каналом, который активируется повышением температуры, кислотами, капсаицином и капсаициноидами (ваниллоидами), резиниферотоксином, медиаторами воспаления липидной природы, а также при механическом повреждении тканей. Исследования низкомолекулярных ингибиторов TRPV1 подтверадают, что фармакологическая блокада этого рецептора может быть использована при устранении болевых синдромов, сопровождающих различные патологические состояния.

Ранее было обнаружено, что полипептиды Кунитц-типа из Н. crispa, АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ, помимо трипсинингибирующей активности обладают способностью ингибировать in vitro болевой ваниллоидный рецептор TRPV1, а также оказывать анальгетическое действие на экспериментальных животных. Однако механизм купирования болевого синдрома полипептидами АРНС1-АРНСЗ к настоящему времени не установлен. В связи с этим было проведено in silico исследование их взаимодействия с рецептором TRPV1. В настоящей работе модель взаимодействия TRPV1 с HCGS-полипептидами рассмотрена на примере комплекса TRPV1-APHC1.

В качестве рецептора была использована модель TRPV1, находящегося в закрытом состоянии, так как именно в этом состоянии рецептор способен воспринимать различные стимулы, включая действие ваниллоидов. В результате молекулярного докинга рассчитана предполагаемая пространственная структура комплекса (рис. 11) и определен возможный сайт связывания АРНС1 с TRPV1. Полученная модель комплекса APHC1-TRPV1 впервые объясняет модулирующее действие исследуемых полипептидов Кунитц-типа на TRPV1 и хорошо согласуется с результатами электрофизиологических экспериментов, полученных

ранее. Согласно этой модели, полипептид взаимодействует с регуляторным субдоменом внутриклеточной части рецептора.

Анализ модели показал, что сайт связывания анальгетического полипептида не затрагивает а.о. Туг511, Ser512 и Тгр549, важные для взаимодействия рецептора с ваниллоидами. Более того, этот сайт локализован достаточно далеко, и полипептид, находясь в составе комплекса, не может создавать стерических препятствий для связывания его с агонистом. Эти данные свидетельствуют об отсутствии конкурентного ингибирования и указывают на иной, возможно аллостерический, механизм действия анальгетического полипептида на функциональную активность ваниллоидного рецептора. Показано, что при связывании АРНС1 с TRPV1 во взаимодействие с полипептидом вступают две (или более) субъединицы канала, что, вероятно, и определяет модулирующее действие полипептида на рецептор. Полученная структурная модель комплекса АРНС1-TRPV1 впервые позволила предложить гипотетический механизм связывания АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ с болевым рецептором, 16

Субъединица С

Анкириновые повторы

Субъединица А

\

TRP-субдомен

Трансмембранный домен

Корзиноподобный домен

■г» ) Регуляторный 'V субдомен

Рисунок 11. - Структурная модель комплекса АРНС1-ТЯР\/1. А - вид со стороны цитозоля, Б - вид параллельно плоскости клеточной мембраны. ТРР\/1 представлен в виде ленточной диаграммы, АРНС1 - в виде молекулярной поверхности.

согласно которому это взаимодействие препятствует свободному открытию и закрытию канала, что увеличивает время его релаксации и выражается в ингибировании рецептора (до 35 % для АРНС1).

Анализ характеристик поверхности контактов и расчетных данных о вкладе различных молекулярных взаимодействий в изменение свободной энергии при образовании комплекса АРНС1 с болевым рецептором выявил, что движущими силами в связывании полипептида с рецептором Т(?Р\/1 являются Ван-дер-Ваальсовы и электростатические взаимодействия. Важная роль в стабилизации комплекса принадлежит также гидрофобным взаимодействиям и водородным связям: комплекс стабилизируется 8-ю водородными связями, 39-ю солевыми мостиками и 10-ю гидрофобными кластерами (рис. 12).

Lys719

АРНС1-

Arg51

Pro733

Asp734

TRPV1-

субъединица D

Lys719

GIU812V

<, 4— субъединица В

val31

Рисунок 12. - Межмолекулярные взаимодействия в комплексе АРНС1-Т(*РУ1. А - Водородные связи АРНС1 с двумя субъединицами ТР?Р\/1. Аминокислотные остатки, участвующие в образовании межмолекулярных водородных связей (показаны зеленым пунктиром), представлены в виде стержневых моделей. Б - Гидрофобные взаимодействия АРНС1 на поверхности контактов с ТРР\/1. Атомы, образующие межмолекулярные гидрофобные кластеры, представлены в виде шаров.

Анализ межмолекулярных контактов в предложенной модели подтвердил высказанное ранее предположение о функциональной значимости Arg48 и Val31 для связывания с TRPV1 (Andreev et al„ 2008), а также выявил важную роль еще нескольких аминокислотных остатков. Таковыми, помимо Gly1 и Glu6, присутствующих в последовательностях всех представителей комбинаторной библиотеки HCGS-полипептидов, являются а.о. Glu38 и Агд51. Так, для модулирующего действия полипептида на TRPV1 необходимо присутствие положительно заряженного остатка в положении 48 (Arg) в непосредственной близости от Агд51, что способствует формированию области взаимного притяжения с противоположно заряженными остатками Asp734 и Asp737 субъединицы D рецептора TRPV1. Остатки Gly1, Glu6 и Val31 вносят вклад во взаимодействие с субъединицей В болевого рецептора в результате образования водородных связей с Glu812, Lys715 и Lys719 соответственно. Роль Arg51 заключается также в стабилизации образовавшегося комплекса за счет четырех водородных связей с Рго733 и Asp734 субъединицы D рецептора (рис. 12, А). Присутствие отрицательно заряженного остатка Glu38 обеспечивает «благоприятное» электростатическое взаимодействие с положительно заряженной областью, образованной Lys715, Arg718 и Lys719 субъединицы В.

Согласно модели Зй-структуры TRPV1, регуляторный и примыкающий к нему TRP-субдомены внутриклеточного корзиноподобного домена несут положительный заряд, причем внутренняя часть этого домена, образующая пору канала, характеризуется точечными включениями отрицательно заряженных областей, создаваемых, в частности, остатками Glu812, Asp734, Asp737. Отрицательный заряд локализуется преимущественно во внешнем вестибюле трансмембранного домена и вокруг анкириновых повторов внутриклеточной части рецептора. Принимая во внимание такое распределение электростатического потенциала рецептора, уместно сделать вывод, что для большинства положительно заряженных HCGS-полипептидов (рис. 4, А, Б) взаимодействие с центральной частью внутриклеточного домена

TRPV1 электростатически не выгодно, и они не могут быть распознаны рецептором. Скорее всего, эти полипептиды проявляют, подобно полипептиду SHPI-1 из S. heiiantus, сродство к сериновым протеиназам, для связывания с которыми наличие положительного заряда является необходимым условием. Предположительно, эффективно воздействовать на болевой рецептор TRPV1 способны только HCGS-полипептиды, характеризующиеся точечным распределением МЭП. Вероятно, отсутствие заряда в области петель связывания с протеиназами позволяет молекуле АРНС1 проникать в полость между двумя субъединицами в области регуляторного субдомена в центральной части внутриклеточного домена и далее к поре канала, что открывает путь к комплементарному связыванию.

Следует отметить, что принципиальным отличием HCGS-полипептидов кластера В от других представителей структурного семейства Кунитца актиний является наличие Туг и Phe в положениях 16 и 17 аминокислотной последоватедности, а также Thr вместо Lys в положении 14, что снижает их сродство к сериновым протеиназам на 3-4 порядка по сравнению с SHPI-1. Однако именно это приводит к отсутствию положительного заряда в области петли связывания с протеиназами и дает возможность для возникновения новой функции, а именно, способности модулировать рецептор TRPV1. Роль ароматических остатков Туг16 и Phe17 во взаимодействии с болевым рецептором еще предстоит выяснить.

HCGS-полипептиды кластера В (рис. 4) имеют очень высокую степень идентичности а.о. в положениях, функционально значимых для взаимодействия с TRPV1. Это является дополнительным основанием для предположения, что данные полипептиды полифункциональны и так же, как и АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ, могут, помимо ингибирования протеиназ, модулировать рецептор TRPV1 и оказывать анальгетический эффект in vivo. Однако в экспериментах in vitro недавно показано, что полипептид InhVJ, представитель подгруппы В1 (рис. 4), не оказывает модулирующего действия на болевой ваниллоидный рецептор TRPV1. Принимая во внимание общий характер распределения МЭП внутри данной подгруппы, логично предположить, что и другие ее представители окажутся неспособными модулировать TRPV1. В связи с этим внимание было сфокусировано на in silico исследовании взаимодействия полипептидов HCGS 1.10 и HCGS 1.36 (подгруппа В2, рис. 4) с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1.

Механизм взаимодействия HCGS 1.10 и HCGS 1.36 с рецептором TRPV1 был предложен на основании описанной выше структурной модели комплекса APHC1-TRPV1, а также проведенного in s/7/со-мутагенеза АРНС1 в комплексе с болевым рецептором. Согласно расчетам, единичные аминокислотные замены в полипептидах HCGS 1.36 и HCGS 1.10 не должны создавать стерических или электростатических препятствий для взаимодействия с TRPV1 и, следовательно, для проявления ими анальгетического действия in vivo. Поэтому данные полипептиды были отобраны для получения рекомбинантных форм и исследования их биологической активности и структурно-функциональных взаимосвязей экспериментальными методами.

Проведенное исследование позволило предложить теоретическую модель взаимодействия модулятора пептидной природы с рецептором TRPV1 в одном из его состояний (закрытом). С помощью этой модели можно объяснить механизм действия анальгетических HCGS-полипептидов на передачу сигнала через болевой рецептор. Вероятно, при взаимодействии с анальгетическим полипептидом рецептор сохраняет способность принимать и обрабатывать информацию о болевых и воспалительных стимулах, но частично утрачивает способность к ее передаче вследствие невозможности быстрого перехода связанных с анальгетическим полипептидом субъединиц в иное конформационное состояние. Это выражается в том, что рецептор сохраняет способность к пропусканию тока ионов в экспериментах in vitro на -65%.

Хорошо согласуясь с современными данными о структурно-функциональных взаимосвязях рецептора и лиганда, построение этой модели дает основание выбрать одно из направлений дальнейших исследований механизмов действия ионных каналов, и, в частности, рецептора TRPV1. Безусловно, необходима ее экспериментальная проверка, в том числе биохимическими и электрофизиологическими методами, что приведет к получению новых данных о действии полипептидных модуляторов на TRPV1 и более глубокому пониманию механизмов функционирования рецептора.

Проведенный анализ структурных моделей молекулярных комплексов полипептидов комбинаторной библиотеки с молекулярными мишенями позволяет высказать

предположение, что купирование боли полипептидами Н. crispa (в частности, АРНС1, АРНС2 и АРНСЗ) является результатом их совместного действия как на сам болевой рецептор TRPV1, так и на воспалительный процесс благодаря ингибированию протеиназ воспаления, в частности, эластазы, катепсина-G и протеиназы 3. Именно полифункциональность делает полипептиды из Н. crispa особенно привлекательными для их использования в качестве терапевтических агентов при лечении болевых и воспалительных состояний.

3. Получение рекомбинантных полипептидов семейства Кунитца Н. crispa

3.1. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе кДНК

Гены полипептидов HCGS 1.10, HCGS 1.36, HCGS 1.19 и HCGS 1.20 были амплифицированы с использованием ген-специфичных праймеров на матрице генов полученной ранее библиотеки кДНК Н. crispa и субкпонированы в вектор рЕТ-32Ь(+). Результирующими конструкциями (рЕТ-32Ь(+)-НССЭ-полипептид) трансформировали клетки Escherichia coli штамма XL1. Колонии, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирали с помощью метода ПЦР-скрининга «на колониях». Плазмиды выделяли из клеточной массы и проверяли на отсутствие мутаций прямым секвенированием. Плазмидами трансформировали клетки Е. coli штамма BL21(DE3). Целевые рекомбинантные полипептиды получали в составе гибридных белков с тиоредоксином и гистидиновым тегом и выделяли из клеточного лизата при помощи металлоаффинной хроматографии на Ni2*-arapo3e. Электрофоретическое разделение белков клеточного лизата в полиакриламидном геле (рис. 13, А) показало, что молекулярные массы гибридных белков соответствуют расчетным данным (~ 26 кДа). Гибридные белки гидролизовали действием BrCN и целевые полипептиды очищали ОФ ВЭЖХ (рис. 13, Б). В результате были получены полипептиды с молекулярными массами 6151, 6088, 6080 и 6176 Да (для HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20 и HCGS 1.36 соответственно, рис. 13, В), что согласуется с расчетными данными.

2500 30 ОФ

1 2 3 4 Время, мин

Рисунок 13. А - Электрофореграмма белковых компонентов клеточных лизатов штаммов-продуцентов, полученных в результате трансформации штамма Е. coli BL21(DE3). 1 - pET-32b(+)-HCGS 1.36; 2 -контроль pET-32b(+) (без добавления ИПТГ); 3 - маркеры молекулярных масс белков; 4 - контроль рЕТ-32Ь(+) (с добавлением ИПТГ). Б - Профиль элюции полипептидов, полученных в результате гидролиза гибридного белка HCGS 1.36-Тгх, на колонке с Jupiter С4 (10*250 мм), уравновешенным 0,1 % раствором ТФУ, pH 2,2, в градиенте концентрации ацетонитрила от 0 до 70 % в 0,1 % ТФУ (pH 2,2) за 70 мин. Скорость элюции - 3 мл/мин. Пик, выделенный серым цветом, соответствует фракциям с трипсинингибирующей активностью, которые содержали зрелый полипептид HCGS 1.36. В - Масс-спектры рекомбинантных полипептидов HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20 и HCGS 1.36.

Средний выход целевых попипептидов не превышал 1,5 мг из 1 литра клеточной культуры. В связи с этим была проведена серия экспериментов, позволивших подборать оптимальные условия получения рекомбинантных полипептидов и повысить выход целевых продуктов. В результате увеличения времени инкубации бактериальной культуры (с 4 до 5 часов) до и (с 10 до 16 часов) после добавления индуктора, а также понижения температуры инкубации после добавления индуктора (с 23 до 18 °С) средний выход зрелых рекомбинантных продуктов из 1 литра клеточной культуры удалось увеличить до 4,5 мг (на 200 %).

3.2. Получение рекомбинантных полипептидов с использованием генетических конструкций на основе синтетических генов

С целью увеличения выхода целевых рекомбинантных продуктов на основе аминокислотных последовательностей полипептидов HCGS 1.10 и HCRS 21 были предложены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов, не содержащие редких кодонов и оптимизированные для гетерологичной экспрессии в Е. coli. На их основе были сконструированы прямые и обратные олигонукпеотидные праймеры. С использованием техники ПЦР из полученных праймеров были собраны и амплифицированы фрагменты ДНК длиной 190 н.п. Фрагменты субклонировали в вектор рЕТ-32Ь(+). Полученными рекомбинантными плазмидами (pET-32b(+)-sHCGS 1.10 и pET-32b(+)-sHCRS 21) трансформировали клетки Е. coli штамма XL-1. Для подтверждения наличия этих конструкций в клетках проводили ПЦР-скрининг «на колониях». Полученные плазмиды выделяли из бактериальной массы и секвенировали.

В результате секвенирования плазмидной ДНК было выявлено, что в одной из колоний, трансформированных pET-32b(+)-sHCRS 21, содержатся рекомбинантные плазмиды с уникальной мутацией в гене полипептида HCRS 21, изменяющей Pro на Leu в положении 12 аминокислотной последовательности полипептида (обозначенного HCRS 21 (P12L)). Данная мутация затрагивает реактивный сайт, участвующий в связывании с сериновыми протеиназами. Изучение биологической активности полипептида, содержащего такую мутацию, уменьшает необходимость проведения дополнительных мутагенетических работ при исследовании структурно-функциональных взаимосвязей соединений данной группы. Поэтому в подобранных ранее условиях (п. 3.1) наряду с полипептидами HCGS 1.10 и HCRS 21 в рекомбинантной форме был получен и HCRS 21 (P12L) для дальнейшего исследования активности.

Согласно результатам масс-спектрометрического анализа рекомбинантные полипептиды не содержали примесей, а их молекулярные массы составляют 6151, 6228 и 6244 Да для HCGS 1.10, HCRS 21 и HCRS 21 (P12L) соответственно (рис. 14), что согласуется

с расчетными данными. Средний выход зрелых полипептидов из 1 литра клеточной культуры составил 9 мг. Использование генетических конструкций на основе синтетических генов позволило увеличить эффективность экспрессии в прокариотической системе и повысить средний выход целевых рекомбинантых продуктов еще в 2 раза (на 500 % по сравнению с выходом целевых полипелтидов в исходных условиях).

Таким образом, в рекомбинантной форме получено шесть новых полипептидов семейства Кунитца в количествах, достаточных для последующих структурно-функциональных исследований in vitro и in vivo.

I s°° 8

-6151.194 HCGS 1 10

/—6228.122 HCRS 21

—6244 212 HCRS 21 (P12L)

J JL-, —.

5Э00 6800 m/z

Рисунок 14. - Масс-спектры рекомбинантных полипептидов HCGS 1.10, HCRS 21 и HCRS 21 (P12L).

4. Исследование физико-химических характеристик и биологической активности рекомбинантных полипептидов in vitro

4.1. Определение констант ингибирования трипсина рекомбинантными полипептидами

Таблица 4. - Константы ингибирования трипсина рекомбинантными полипептидами

Полипептид Kj, M

HCGS 1.10 2,1 x 10"7

HCGS 1.19 3,0 x 10"8

HCGS 1.20 2,1 x 10"8

HCGS 1.36 1,0 x 10"7

HCRS 21 2,0 x 10"7

HCRS 21 (P12L) 2,3 x 10'7

Константы ингибирования трипсина

рекомбинантными полипептидами определяли по методу Диксона (табл. 4). Результаты кинетических исследований показали, что все полипептиды являются компетентными ингибиторами трипсина. Это согласуется с прогнозами, сделанными на основе анализа их аминокислотных последовательностей и моделей комплексов с сериновыми протеиназами (см. п. 2.1-2.5.3).

4.2. Исследование кинетики взаимодействия рекомбинантных полипептидов с сериновыми протеиназами методом поверхностного плазмонного резонанса

Взаимодействие рекомбинантных полипептидов с сериновыми протеиназами изучали с помощью оптического ЭРК-биосенсора. Установлено, что полипептиды формируют устойчивые комплексы с трипсином, а-химотрипсином и эластазой нейтрофилов человека (рис. 15). Показано, что полипептид НССЭ 1.19 также способен связываться с плазмином и калликреином (рис. 15), что хорошо согласуется с прогнозами о его функциональной активности. Полученные результаты подтверждают данные проведенных вычислительных экспериментов и показывают применимость использованных методов компьютерного моделирования.

I

Время, с

Трипсин Хнмотрипски Эластаза Плэзмин Калликреин

Рисунок 15. А - Сенсограмма взаимодействия химотрипсина с иммобилизованным полипептидом НССБ 1.19. Б - Константы диссоциации комплексов НССЭ 1.19 с сериновыми протеиназами. Ошибка определения Ка не превышает 0,03 М.

5. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов in vivo

Исследование анальгетического эффекта рекомбинантных HCGS-полипептидов на модели тепловой стимуляции боли проводили на мышах линии CD-1 с использованием теста отдергивания хвоста. Полипептиды, растворенные в 100 мкл физиологического раствора, при введении внутрибрюшинно не оказывали токсического действия в концентрациях до 5 мг/кг. Было показано, что полипептиды HCGS 1.36 и HCGS 1.10, как и предполагалось, оказывают анальгетическое действие на модели тепловой стимуляции боли (в концентрации 0,5 мг/кг) (рис. 16, А).

0,5 мг/кг 2,5 мг/кг

концентрация

Рисунок 16. - Анальгетические эффекты рекомбинантных полипептидов НССБ 1.10, НССБ 1.19, НСвв 1.20 и НССЭ 1.36 на модели тепловой стимуляции боли (тест отдергивания хвоста). А - Величины анальгетического эффекта полипептидов (концентрация 0,5 мг/кг). Б, Г - динамика развития анальгетического эффекта полипептидов в течение часа (концентрация 0,5 мг/кг). В - величины анальгетического эффекта НСКБ 21 при концентрациях 0,5, 2,5 и 5 мг/кг. По оси ординат - время реакции на болевой стимул. Контроль - физиологический раствор (0,9 % ЫаС1). Достоверность отличий от контроля определяли тестом Тьюки (р < 0.05). * — Статистически достоверные различия.

Несмотря на высокую структурную гомологию (рис. 2), обезболивающее действие HCGS 1.36 значительно выше, чем действие HCGS 1.10. Выявлено, что статистически достоверный обезболивающий эффект HCGS 1.36 и HCGS 1.10 развивается в течение первых 10-20 минут и продолжается, по меньшей мере, в течение часа (рис. 16, Б). Подобная динамика развития анальгетического действия наблюдается и для полипептидов HCGS 1.19 и HCGS 1.20.

Наряду с общей высокой гомологией аминокислотных последовательностей полипептидов Кунитц-типа актиний Н. crispa и S. helianthus (более 74 %), последовательности HCGS 1.20 и HCGS 1.19 отличаются от таковых группы АРНС1 по ряду положений (14, 38, 48 и 9, 12, 14, 38, 48 сооответственно). Однако именно в этих положениях последовательности HCGS 1.20 и HCGS 1.19 имеют идентичные остатки с последовательностями ингибиторов сериновых, аспарагиновых и цистеиновых протеиназ SHPI-1 и SHPI-2 из S. helianthus (рис. 2). Логично предположить, что полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20 могут проявлять аналогичную активность.

Согласно результатам анализа электростатических свойств (см. п. 2.4), HCGS 1.10 и HCGS 1.36 входят в одну группу с анальгетическими полипептидами Н. crispa АРНС1-АРНСЗ, которые характеризуются точечным распределением зарядов на поверхности молекулы. Полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20, напротив, попадают в группу с положительно заряженными полипептидами SHPI-1 и SHPI-2 (рис. 3). В рамках предложенной модели взаимодействия АРНС1 с TRPV1 такой характер распределения заряда препятствует, согласно расчетам, распознаванию полипептидного лиганда рецептором. Вопреки ожиданиям, было показано, что полипептиды HCGS 1.19 и HCGS 1.20 оказывают достоверное обезболивающее действие в экспериментах in vivo (рис. 16, А), сравнимое с действием HCGS 1.10 и HCGS 1.36. Этот факт косвенно свидетельствует о том, что анальгетическое действие полипептидов Кунитц-типа Н. crispa обусловлено не только модуляцией болевого рецептора TRPV1. Стоить отметить, что полипептид HCRS 21 также оказывает обезболивающее действие на модели тепловой стимуляции боли (рис. 16, В), сравнимое с действием HCGS 1.36 и HCGS 1.20 (рис. 16, А), и динамика развития его анальгетического действия подобна таковой для HCGS-полипептидов (рис. 16, Г). Таким образом, нами впервые показано наличие анальгетической активности у HCRG-полипептида.

Принимая во внимание результаты компьютерного анализа структуры, оценки физико-химических характеристик и электростатических свойств исследуемых полипептидов, нельзя утверждать, что их анальгетическое действие обусловлено лишь взаимодействием с TRPV1. Возможно, данные полипептиды повышают барьер болевой чувствительности, взаимодействуя с другими молекулярными мишенями. Полученные данные хорошо согласуются с предложенной нами гипотезой о том, что купирование боли анальгетическими полипептидами Кунитц-типа является результатом их совместного действия как на болевой рецептор TRPV1, так и на протеиназы нейтрофилов, эластазу, катепсин G и протеиназу 3, которые играют ключевую роль в воспалительных процессах. Выяснение характера взаимодействия полипептидов данной группы с TRPV1 на молекулярном уровне остается предметом дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. Показано наличие десятков полипептидов Кунитц-типа с близкими значениями молекулярных масс в хроматографически очищенных белковых фракциях актинии Н. crispa. Это указывает на то, что кодирующие их гены мультигенного суперсемейства, обнаруженного ранее, активно экспрессируются в тканях животного. В индивидуальном состоянии выделен полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам и биологической активности известному ингибитору протеиназ InhVJ.

2. В результате биоинформационного анализа установлено, что представители комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa принципиально различаются по распределению молекулярного электростатического потенциала. Сделан прогноз биологической и функциональной активности полипептидов.

3. Методами компьютерного молекулярного моделирования построены структурные модели комплексов полипептидов с трипсином, а-химотрипсином и эластазой нейтрофилов человека и идентифицированы структурные детерминанты полипептидов и ферментов,

играющие ключевую роль во взаимодействии. Показано, что детали механизма взаимодействия полипептидов с трипсином различаются: для ряда представителей библиотеки возможно образование устойчивых межмолекулярных комплексов с ферментом, как канонической, так и альтернативной архитектуры.

4. Расчетными методами впервые показано, что полипептиды Кунитц-типа актиний могут являться компетентными ингибиторами эластазы, их взаимодействие с ферментом носит канонический характер.

5. Методами компьютерного молекулярного моделирования построены структурные модели комплексов полипептидов, обладающих анальгетической активностью in vivo, с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1. Высказано предположение, что их модулирующее действие на TRPV1 обусловлено увеличением времени релаксации рецептора, находящегося в связанном состоянии.

6. Создано семь генетических конструкций, несущих гены представителей комбинаторной библиотеки Н. crispa, и подобраны оптимальные условия для получения полипептидов в прокариотической системе экспрессии.

7. Получено шесть новых рекомбинантных полипептидов (HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36, HCRS 21 и HCRS 21 (P12L)), которые являются компетентными ингибиторами трипсина. Методом поверхностного плазмонного резонанса показано, что они способны образовывать устойчивые комплексы с трипсином, а-химотрипсином и эластазой нейтрофилов человека, а полипептид HCGS 1.19 - также с плазмином и калликреином. Полученные экспериментальные результаты согласуются с прогнозом о функциональной активности полипептидов данной группы, сделанным расчетными методами.

8. Установлено, что новые рекомбинантные полипептиды HCGS 1.10, HCGS 1.19, HCGS 1.20, HCGS 1.36 и HCRS 21 оказывают достоверное анальгетическое действие на модели тепловой стимуляции боли in vivo.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России:

1. Isaeva М., Chausova Е., Zelepuga Е., Guzev К., Tabakmakher V., Monastyrnaya М., Kozlovskaya Е. A new multigene superfamily of Kunitz-type protease inhibitors from sea anemone Heteractis crispa II Peptides. 2012. V. 34, N 1. P. 88-97.

2. Зелепуга E.A., Табакмахер B.M., Чаусова B.E., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1: in siiico исследование II Биоорган, химия.

2012. Т. 38, № 2. С. 185-198.

3. Табакмахер В.М., Монастырная М.М., Лейченко Е.В., Гладких И.Н., Зелепуга Е.А., Чаусова В.Е., Ткачёва Е.С., Агафонова И.Г., Козловская Э.П. Биологически активные полипептиды актиний: структура, функции, перспективы использования // Биология моря.

2013. Т. 39, № 5. С. 311-319.

4. Монастырная М.М., Лейченко Е.В., Гладких И.Н., Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Синцова О.В., Калина P.C., Кветкина А.Н., Козловская Э.П. Полипептиды актиний, их взаимодействие с биологическими мишенями // Вестн. ДВО РАН. 2014. № 1. С. 103-119.

5. Табакмахер В.М., Синцова О.В. Создание генетической экспрессионной конструкции для получения нового полипептида Кунитц-типа актинии Heteractis crispa И Вестн. ДВО РАН.

2014. № 5. С. 139-143.

Статьи в сборниках трудов конференций:

1. Zelepuga Е., Tabakmakher V., Monastyrnaya М., Lukyanov P., Kozlovskaya E. /п siiico investigation of interaction between human neutrophil elastase and sea anemone Heteractis crispa Kunitz polypeptide // Proceedings of the 5th International conference on bioinformatics and biomedical engineering (ICBBE 2011), Wuhan, China, May 10-12, 2011, Wuhan. 2011. P. [1-4]. doi: 10.1109/icbbe.2011.5780140.

2. Чаусова B.E., Табакмахер B.M. Функциональная экспрессия ингибитора сериновых протеиназ Кунитц-типа InhVJ из тропической актинии Heteractis crispa И Актуальные

проблемы биологии, химии, физики: материалы междунар. заоч. науч.-практ. конф., Новосибирск, 27 дек. 2011 г. - Новосибирск : Изд-во ЭКОР-книга, 2011. С. 49-53.

3. Табакмахер В.М., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Зелепуга Е.А. Теоретические пространственные модели молекулярного комплекса полипептида HCGS-2.23 из актинии Heteractis crispa с трипсином // Актуальные проблемы биологии, химии, физики: материалы междунар. заоч. науч.-практ. конф., Новосибирск, 27 дек. 2011 г. -Новосибирск : ЭКОР-книга, 2011. С. 107-114.

4. Гладких И.Н., Монастырная М.М., Табакмахер В.М., Кривошапко О.Н., Синцова О.В., Сухова И.Г., Ткачева Е.С., Чаусова В.Е., Костина Е.Е., Попов A.M., Козловская Э.П. Поиск анальгетических компонентов, продуцируемых морскими актиниями // Актуальные научные вопросы: реальность и перспективы: сб. науч. тр. по материалам междунар. заоч. науч.-практ. конф. [Тамбов], 26 дек. 2011 г. : в 7 частях. Тамбов : Изд-во «Бизнес-Наука-Общество», 2012. Ч. 2. С. 29-33.

5. Гпадких И.Н., Чаусова В.Е., Табакмахер В.М., Зелепуга Е.А., Ткачева Е.С., Синцова О.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Анальгетические полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa I/ «Инновации в науке» : материалы XIV междунар. заоч. науч.-практ. конф., Новосибирск, 19 нояб. 2012 г. - Новосибирск : Изд-во СибАК, 2012. Ч. 1. С. 14-26.

6. Табакмахер В.М., Зелепуга Е.А., Гладких И.Н., Синцова О.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Анальгетические полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa'. прогнозирование и получение новых представителей методами генной инженерии [Электронный ресурс] // Всероссийская молодежная конференция «Взгляд в будущее», Владивосток, 7-14 нояб. 2013 г. : сб. работ. - Владивосток, 2013. С. 52-65. 1 CD-ROM. Регистрац. свид-во Na 34774. То же: Режим доступа: http://www.piboc.dvo.nj/conf/vzglad.php.

7. Табакмахер В.М., Синцова О.В., Чаусова В.Е., Гладких И.Н. Новые полипептиды семейства Кунитца из актиний, потенциальные блокаторы калиевых каналов // Физиология и медицина. Высокие технологии, теория, практика : сб. ст. Пятой междунар. науч.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», 14-15 нояб. 2013 г., Санкт-Петербург, Россия. - СПб. : Изд-во Политехи, ун-та, 2013. Т. 1. С. 98-102.

Тезисы докладов:

1. Чаусова В.Е., Гузев К.В., Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Исаева М.П. Комбинаторная библиотека RG-полипептидов со структурой Кунитц-типа из актинии Heteractis crispa [Электронный ресурс] // XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7-14 сент. 2010 г. : материалы конф. -Владивосток : ДВО РАН, 2010. С. 78. - То же. - 1 CD-ROM. Регистрац. свид-во № 20469.

2. Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Структурные модели комплексов анальгетических полипептидов из актинии Н. crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1 [Электронный ресурс] // XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7-14 сент. 2010 г. : материалы конф. - Владивосток : ДВО РАН, 2010. С. 21. - То же. - 1 CD-ROM. Регистрац. свид-во № 20469.

3. Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Зелепуга Е.А., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. In sHico исследование взаимодействия полипептидов Кунитц-типа комбинаторной библиотеки актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1 // V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8-12 авг. 2011 г. : тез. докл. Петрозаводск : Карел, науч. центр РАН, 2011. С. 332.

4. Tabakmakher V., Zelepuga Е., Monastyrnaya M., Kozlovskaya E. How does Heteractis crispa Kunitz polypeptides suppress inflammation? // 9lh IST Asia Pacific meeting on Animal, Plant and Microbial Toxins, Vladivostok, Russia, Sept. 4-8, 2011 : progr., abstrs. Vladivostok, 2011. P. 24.

5. Zelepuga E., Tabakmakher V., Monastyrnaya M., Kozlovskaya E. Feasible mechanism of Heteractis crispa Kunitz polypeptides action on TRPV1 signal transduction in silico investigation // 9lh IST Asia Pacific meeting on Animal, Plant and Microbial Toxins, Vladivostok, Russia, Sept. 4-8, 2011 : progr., abstrs. Vladivostok, 2011. P. 75.

6. Tabakmakher V.M., Gladkikh I.N., Zelepuga E.A., Monastyrnaya M.M., Osmakov D.I., Kozlovskaya E.P. New recombinant Kunitz-type polypeptides of sea anemone Heteractis crispa II 2nd International symposium on Life Sciences, Vladivostok, Russia, Sept. 4-9, 2013 : progr. and abstrs. Vladivostok, 2013. P. 78.

7. Табакмахер B.M., Гладких И.Н., Зелепуга E.A., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Получение новых рекомбинантных полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa [Электронный ресурс] // Всероссийская молодежная конференция «Взгляд в будущее», Владивосток, 7-14 нояб. 2013 г. : сб. работ. Владивосток, 2013. С. 20-21. 1 CD-ROM. Регистрац. свид-во № 34774. То же Режим доступа: http://www.piboc.dvo.ru/conf/vzglad.php.

8. Табакмахер В.М., Синцова О.В., Терентьева A.A. Получение новых биологически активных полипептидов структурного семейства Кунитца методами генной инженерии [Электронный ресурс] // XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 5-15 сент. 2014 г. : сб. тез. докл. Владивосток ДВО РАН, 2014. С. 45. Режим доступа: http://www.piboc.dvo.ru/conf/School2014.php.

9. Терентьева A.A., Синцова О.В., Схабюк В.П., Табакмахер В.М. Исследование анальгетической активности рекомбинантных полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa [Электронный ресурс] // XV Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 515 сент. 2014 г. : сб. тез. докл. Владивосток : ДВО РАН, 2014. С. 49. Режим доступа: http://www.piboc.dvo.ru/conf/School2014.php.

Отдельные этапы работы выполнены при частичной финансовой поддержке грантов ДВО РАН № 12-Ш-В-05-074, № 13-Ш-В-05-077, № 14-Ш-В-05-102, РФФИ № 11-04-01179-а, № 11 -04-16044-моб_з_рос, № 12-08-31567-МОЛ_А_2012, РНФ № 14-25-00037, а также ГК № 16146-576 и комплексной программой фундаментальных исследований ДВО РАН «Дальний Восток» 42П.

Соискатель

Табакмахер В.М.

Табакмахер Валентин Михайлович

Структурно-функциональные взаимосвязи полипептидов Кунитц-актинии //е/егасг« стра

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 27.12.2014. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 120 экз. Заказ 656.

Отпечатано в типографии Дирекции публикационной деятельности ДВФУ 690990, Владивосток, ул. Пушкинская, 10