Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

00504574»

--'í'.'.tí

Чаусова Виктория Евгеньевна

Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 4 IÍI0H 2012

Владивосток - 2012

005045748

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН

Научный руководители:

доктор химических наук, старший научный сотрудник Монастырная Маргарита Михайловна

кандидат медицинских наук, доцент

Исаева Марина Петровна

Официальные оппоненты:

Булгаков Виктор Павлович д.б.н., член-корреспондент РАН

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Биолого-почвенный институт ДВО РАН заведующий отделом биотехнологии

Новикова Ольга Даниловна Д.Х.Н., с.н.с.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН ведущий научный сотрудник лаборатории молекулярных основ

антибактериального иммунитета

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г. Москва

Защита состоится «28» июня 2012 г. в/¿¿-часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: dissovet@piboc.dvo.ni.

С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).

Текст автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru Автореферат разослан мая 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н.

Черников О. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди структурно разнообразных ингибиторов сериновых протеиназ, описанных на сегодняшний день, наиболее интенсивно исследуются представители семейства Кунитна. обнаруженные во всех живых организмах и обладающие широким спектром биологической активности. Для них характерно наличие шести консервативно расположенных остатков пистеипа. которые стабилизируют пространственную структуру, названную Кунитн-фолдом. Установлено, что полипептиды Кунитц-типа имеют два функциональных участка (реактивный сайт и сайт слабых взаимодействий). непосредственно взаимодействующих с активным центром сериновых протеиназ и определяющих их ингибиторную специфичность.

Интерес к изучению структурно-функциональных особенностей полипептидов Кунитц-типа связан с обнаружением у некоторых из них способности модулировать функциональную активность различных типов ионных каналов (Nav-, Cav-, Kv- и TRPV1-каналы). В этой связи их принято называть токсинами Кунитц-типа. Морские кишечнополостные, актинии, продуцируют яд. содержащий полипептиды Кунитц-типа в виде ряда изоформ, которые функционально представлены как ингибиторами сериновых протеиназ. так и токсинами ионных каналов. Следует отметить, что яд исследуемой нами тропической актинии Heleractis crispa (=Radianthus macrodactyhis) является источником новых представителей полипептидов Кунитц-типа. обладающих также антигистаминной и модулирующей TRPVl-каналы активностями.

Соединения белковой природы, выделяемые из яда актиний различных видов, интенсивно исследуются на протяжении последних десятилетии, но. несмотря па значительное количество публикаций, практически ничего не известно о природе разнообразия продуцируемых изоформ полипептидов Кунитц-типа. а также структуре кодирующих их генов. В связи с этим изучение полиморфизма полипептидов Кунитц-типа актиний представляет научный и практический интерес, поскольку обеспечивает понимание взаимосвязи между их структурными особенностями и полифункциональностью. Необходимо отметить, что способность взаимодействовать с различными мишенями указывает на возможный терапевтический потенциал полипептидов Кунитц-типа при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеиназ или дисфункцией ионных каналов. Полипептиды Кунитц-типа также могут рассматриваться в качестве потенциальных инструментов исследования молекулярных механизмов функционирования ионных каналов.

Цель н задачи исследования. Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью настоящего исследования являлось получение, структурно-функциональный анализ и изучение природы разнообразия полипептидов Кунитц-типа актинии Н. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать новые полипептиды. проявляющие трипсинипгибирующую активность, установить полноразмерные последовательности кодирующих их кДНК.

Г

2. Установить первичные структуры зрелых HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептидов, провести их структурно-функциональный и филогенетический анализ.

3. Установить структурную организацию генов полипептидов Кунитц-типа.

4. Создать -экспрессионные конструкции некоторых полипептидов и провести их гетерологичную экспрессию в Escherichia coli. Получить функционально активный рекомбипантнмй полипентпд.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Бифункциональный полипептид HCPG из Н. crispa обладает помимо трипсинингибирующей активности анальгетическим действием на тепловой модели in vivo.

2. Полипептиды HCPRI и HCPR2 проявляют более высокую трипсиниигибирующую активность по сравнению с активностью ранее выделенных из Н. crispa изоформ ингибиторов сериновых протеиназ.

3. Полипептиды Кунитц-типа, присутствующие в ядовитом секрете щупалец актинии Н. crispa, образуют комбинаторную библиотеку близких по структуре, но отличающихся по физико-химическим характеристикам соединений.

4. HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептиды Кунитц-типа кодируются разными мультигенными семействами. Гены этих полипептидов содержат интрон, который разделяет области последовательности с высокой и низкой консервативностью.

5. Рекомбинантный полипептид идентичен по функциональной активности нативному ингибитору протеиназ InhVJ.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе данной работы выделены и охарактеризованы новые представители полипептидов Кунитц-типа из актинии Н. crispa, один из которых является бифункциональным полипептидом. Впервые установлены нуклеотидные последовательности и на их основе выведены аминокислотные последовательности HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептидов, которые образуют комбинаторную библиотеку близких по структуре, но отличающихся по физико-химическим характеристикам полипеитидов. Показано, что представители комбинаторной библиотеки кодируются генами разных мультигенных HCGS-/HCRG- и НСТХ семейств. Впервые установлено, что гены полипептидов Кунитц-типа актиний имеют экзон-интронную организацию и характеризуются наличием одного нитрона в области, соответствующей С-концевому участку сигнального пенгида. Выделен и охарактеризован функционально-активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам нативному ингибитору протеиназ InhVJ.

Результаты, полученные в ходе выполнения данной работы, имеют как теоретическое, так и практическое значение. Установленные первичные структуры значительно расширяют существующую базу последовательностей полипептидов Кунитц-типа п создают молекулярную основу для получения новых фармакологических агентов направленного действия, а также инструментов исследования структуры и функциональной активности ионных каналов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на: III Международной конференции «Химия, структура и функция биомолекул», г. Минск, 2008; XII и XIII Всероссийской молодежной школе-конференции «Актуальные проблемы химии и биологии», г. Владивосток, 2009, 2010; Международном семинаре по морским природным ресурсам, г. Ханой. 2010; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск. 2011; 9-ом Международном конгрессе по токсинологии

«Токсины животного, растительного и микробного происхождения», г. Владивосток. 2011.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статен, из них 3 в журналах, определенных списком ВАК. 2 в сборниках научных трудов по материалам конференций, 8 тезисов докладов и получен один патент Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, материалов и методов исследования, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 185 публикаций. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста и содержит 14 таблиц и 63 рисунка.

Благодарности. Автор выражает благодарность научным руководителям д.х.н. Монастырной М.М. и к.м.н. Исаевой М.П. за помощь, поддержку и ценные советы при выполнении и оформлении данной работы. Автор глубоко признателен за оказанную помощь в выполнении отдельных этапов работы к.х.н. Гладких И.II. и к.ф-м.н. Зелепуга Е.А.. а также м.н.с. Гузеву К.В., к.х.н. Лейченко Е.В.. м.н.с. Ли И.А., к.х.н. Анастюку С.Д.. к.х.н. Дмитренку П.С., к.б.н. Черникову О.В.. аспиранту Табакмахеру В.М. и студентке Фокиной И. Автор выражает свою искреннюю благодарность заведующему лабораторией д.х.н. Козловской Э.П. за ценные замечания и рекомендации при выполнении данной работы.

Используемые сокращения: а.о. - аминокислотный остаток. АН -аминокислотная последовательность. ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография. МЭП - молекулярный электростатический потенциал, НП -нуклеотидная последовательность, п.н. - пар нуклеотидов. ПЦР - полимеразная цепная реакция, ТФУ - трифторуксусная кислота, ВРТ1 - бычий панкреатический ингибитор трипсина, DTX - дендротоксин. классический лиганд Кч-каналов, Kv -потенциалзависимый калиевый канал. TRX - тиоредоксин, белок бактериального происхождения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Выделение н характеристика природных полипептндов Куннтц-типа нз H. crispa

1.1. Выдсленне бифункционального полнпептида Куннтц-типа

Ранее из экстрактов актинии H. crispa были выделены традиционными методами белковой химии ингибиторы сернновых протеиназ: Jn-IV, InhVJ, бифункциональные Rmln I, Rmln II и модуляторы функциональной активности TRPV1-канала АРНС1-АРНСЗ.

В данной работе для получения новых природных представителей полипептндов Кунитц-типа из этанолыюго экстракта H. crispa была использована схема выделения, включающая гидрофобную хроматографию полипептидов на полихроме-1 в статическом варианте, ионообменную хроматографию на Cellulose СМ-32 и обращенно фазовую ВЭЖХ на колонке Nucleosil CiS. Полипептиды, проявляющие трипсинингнбирующую активность, элюировали с полихрома-1 20%-ным этанолом (после элюции балластных белков и полипептидов 15%-ным этанолом). После хроматографического разделения полипептидов на Cellulose СМ-32 (не показано) дальнейшую очистку активной фракции полипептидов проводили обращепно-фазовой ВЭЖХ (рис. 1. А) и последующей рехроматографией (рис. 1. Б), в результате которой был получен бифункциональный полипептид Кунитц-типа, названный HCPG

(первые две буквы обозначают вид Н. crispa). Полипептид проявлял как трипсинингибирующую активность, так и анальгетическое действие на тепловой модели т vivo (в дозе 0.1 мг/кг). Полипептиды остальных белковых фракций (пики 25) обладали только трипсинингибирующей активностью (рис. 1, Л).

А

I

0,2-

20 30

Время, мин

20 30 Время, мин

В

6000

6600

6000 6200 6400 6600 пг'г им 6и0 гч'г

Рис. I. Профили Э.ИОЦ1Ш и масс-спектры ингибиторов протеиназ. А. ВЭЖХ полипептидов активной фракции, полученной в результате нонообмепноП хроматографии, на обращенной фазе носителя >)ис1ео511 Сц (4.6^250 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (5-60%) в присутствии 0,1% ТФУ. Скорость элюции - 0.5 мл'мпн. Б. Рехроматофафия белковой фракции (1 пик) в тех же условиях. Отмечены границы объединения фракций, проявляющих трипсинингибирующую активность (сплошная линия) и анальгетическое действие (звездочки). В, Г, Д, Е. Масс-спектры полипептидных фракций пиков 1, 2. 3 (рис. I, А) и НСРС (рпс. 1,Б, пик 1) соответственно.

Гомогенность HCPG подтверждена масс-спектрометрическим анализом и установлением АП N-концевого фрагмента. Согласно данным MALDI TOF MS молекулярная масса полипептида составила 6085.6 Да (рис. 1. Е). в то время как белковые фракции (рис. 1. А. пики 2 и 3) содержали от 2-х до 3-х мажорных изоформ. значения молекулярных масс которых варьировали от 6084 до 6201 Да (рис. 1. Г. Д).

Показано, что фракции, проявляющие трипсинингибирующую активность, представляют собой смеси изоформ полипептидов Кунитц-типа с близкими физико-химическими характеристиками, что значительно осложняет их хроматографическое разделение и получение в индивидуальном состоянии. Таким образом, модифицированная в данной работе схема выделения позволила получить бифункциональный полипептид HCPG Кунитц-типа, N-концевая последовательность которого высоко гомологична последовательностям анальгетических полипснтидов АРНС1-АРНСЗ, ранее выделенных из H. crispa.

1.2. Выделение HCRG-полнпептндов Кунитц-тнпа m H. crispa

Ранее было обнаружено, что водный экстракт H. crispa, используемый для выделения а-пороформирующих токсинов (актинопорипов). показывает наличие значительной трипсинингибирующей активности и при ацетоновом осаждении, наряду с цитолитическими полипептидами, в осадок переходят ингибиторы протеиназ Купитц-типа. Для выделения этих полипептидов была использована схема, включающая ацетоновое осаждение, хроматографию на Akrilex Р-4. Cellulose СМ-32 (не показаны) и Nucleosil С]8. В результате хроматографии на Cellulose СМ-32 была получена фракция полипептидов, обладавших помимо гемолитической активности и трипсинингибирующей. При дальнейшем разделении иолипептидов этой фракции обращенно-фазовой ВЭЖХ было получено два нолипептида. названные HCPR1 (пик 1) и HCPR2 (пик 2), проявляющие только трипсинингибирующую активность (рис. 2. А). По данным масс-спектрометрического анализа молекулярная масса ингибиторов HCPR1 и HCPR2 составила 6196.0 и 6148.7 Да соответственно (рис. 2. В. Г).

в 2000 и

3 ,

35 -10 Время, мнн

50

5 400

Рис. 2. Профили элюции и масс-спектры ингибиторов протеиназ. Л. ВЭЖХ ингибиторов протеиназ активно» фракции, полученной в результате ионообменной хроматографии, на обращенной фазе носителя Nucleosil Сщ (4,6x250 мм) в линейном градиенте концентрации ацетонитрила (10-70%) в 0,1% ТФУ. Скорость элюции - 0,5 мл/мин. Отмечены границы объединения белковых фракций, проявивших трипсинингибирующую активность. D, Г. Масс-спектры полипептидов HCPRI (В) и 1ICPR2 (Г) (пики 1 и 2 соответственно).

Показано, что степень сродства выделенных полипептидов HCPR1 и IICPR2 к трипсину (1С5о = 0,25 и 0,12 мкг соответственно) выше в 12 и 25 раз. чем у ингибитора протеиназ InhVJ (ICjo = 3 мкг). ранее выделенного из Н. crispa.

1.3. Установление N-концевых последовательностей HCPG, HCPR1 и HCPR2

Для установления N-концевых фрагментов трех выделенных полипептидов Кунитц-типа, 11CPG. HCPR1 и HCPR2, было проведено восстановление дисульфидных связей дитиотреитолом и алкилирование образовавшихся сульфгидрильных групп 4-винилпиридином. Модифицированные полипептиды выделяли из реакционной смеси с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Nucleosil C|S. N-концевая ЛИ выделенных ингибиторов протеиназ (по 20 а.о.) была установлена методом автоматической деградации по Эдману и соответствовала для HCPG - GSICLEPKVVGPCTAYFRRF-, HCPR1 - RGICSEPK.VVGPCKARIRRF- и HCPR2 - RGICLEPKVVGPCKARIRRF-. Интересной особенностью полипептидов IICPRI и HCPR2. не характерной для представителей ингибиторов из других видов актиний, является наличие на N-конце остатка Arg. В соответствие с этой особенностью полипептиды, имеющие N-концевые остатки Gly-Ser, были названы HCGS-полипептидами, a Arg-Gly - HCRG-полипептидами. Сравнительный анализ N-концевых фрагментов новых полипептидов и ингибиторов протеиназ. выделенных из этой же актинии ранее, показал, что они высоко гомологичны друг другу (от 85% до 100%), и. следовательно, являются изоформами полипептидов Кунитц-типа Н. crispa.

2. Структурно-функциональная характеристика представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa

Близкие значения физико-химических характеристик нативных полипептидов Кунитц-типа актинии Н. crispa создают серьезную проблему при получении данных соединений в индивидуальном состоянии. Кроме того, поиск и установление первичной структуры минорных изоформ полипептидов Кунитц-типа сложно осуществить методами белковой химии, которые требуют значительного количества исходною сырья. В то же время применение методов молекулярной биологии позволяет получить полную генетическую информацию о многообразии существующих изоформ, а использование небольших количеств биологического материала способствует сохранению численности популяций морских гидробионтов.

2.1. Установление нолноразмерных последовательностей, кодирующих HCGS- и HCRG-полнпептиды Н. crispa

Для идентификации полноразмерных последовательностей кДНК полученных в данной работе полипептидов Н. crispa была применена разновидность технологии быстрой амплификации 3'- и 5'-концов кДНК - Step-Out RACE. В качестве матрицы была использована амплифицированная кДНК. ранее синтезированная на основе тотальной РНК, выделенной из щупалец актинии Н. crispa. Для проведения З'-RACE были сконструированы вырожденные прямые праймеры на основе консервативных N-концевых фрагментов природных ингибиторов протеиназ HCPG, InhVJ, Jn-IV и АРНС1 из Н. crispa. В результате были установлены НП 13 изоформ. Все З'-RACE фрагменты имели стоп-кодоны (ТАА), сайты полиаденилирования (ААТААА) и поли(А)-тракты. Для транслированных последовательностей обнаружена высокая степень гомологии как между собой (80-98%), так и с последовательностями природных полипеитидов (64-84%). Сравнительный анализ З'-RACE последовательностей показал, что в основном аминокислотные замены локализованы в области реактивного сайта и сайта слабых взаимодействий.

Далее на основе З'-RACE последовательностей были сконструированы прямые ген-спецнфичные праймеры для проведения 5'-RACE. На каждом шаге проведения амплификации использовали несколько таких праймеров с целью идентификации

максимального количества изоформ. В результате установлены МП 14 изоформ (рис. 3). Все 5'-RACE последовательности содержали 5'-нетранслируемые области и участки, кодирующие сигнальные пептиды и N-концевые фрагменты зрелых полипептидов. АП которых отличались высокой вариабельностью в области реактивного сайта (рис. 3). Уровень гомологии 5 -RACE последовательностей составил 56-98%. при этом первые 15 кодируемых остатков в сигнальных пептидах являлись высококонсервативными. Как видно из рисунка 3. N-концевые фрагменты зрелых полипептидов отличаются первыми а.о.. согласно которым они были названы HCGS-, HCRG-, HCGG- и HCGN-полипептидами. Представители GG- и GN-rpynn ранее не были выделены из H. crispa в нативном состоянии, в отличие от HCGS- и впервые полученных в данной работе HCRG-полипептидов. Сигнальные пептиды представителей GS- и GG-групп отличались от представителей RG-группы только одной заменой - Serl9 на Thr. Группа GN была представлена всего одной НП - S14, уникальность которой заключается в кодировании вставки из 7 а.о. в конце сигнального пептида. Эта дополнительная последовательность может рассматриваться как прочасть полипептида ввиду присутствия двух положительно заряженных а.о. Lys и Arg. служащих потенциальным сайтом расщепления субтилизиноподобными протеиназами в процессе созревания токсина.

si

52

53

55

56

54

57

58

511

512

513

59 s10

514

mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfs fkttqa-mkgtflicliliagfsfkttqa-mkgtflicliliagfsfkttqa-mkgtflicliliagfsfkstqä-mkgtflicliliagfsfkstqa-mkgtflicliliagfyfrsiqqfyf

-gsi -gsi -gsi -gsi -gsi -gsi -gsi -gsi -rgi -rgi -rgi -ggi -ggi

prfyfdsetgk prfyfdsetgk prfyfdsetgec ikari rrfyfdsetgec !kagi rrfyfdsetgec ikari rrfyfdsetgk

:kagi rrfyldsetgk

kagirrfyfdsetgk

:kari rrfyydsetgk

ikari rrfyydsetgec .1 rrfyydsetgec 1kagi rrfyfdsetgk prfysdsetgk irgse prfyfdsetgk

YFKRIQGNI

Рис. 3. Множественное выравнивание 5 -RACE последовательностей полипептидов Куннтц-тииа H. crispa. Вариабельные а.о. показаны на сером фоне, а остатки Cys - на темно-сером. Области сигнального пептида и реактивного сайта выделены рамками.

Для установления полноразмерных последовательностей было проведено множественное выравнивание 3 - и 5 -RACE кДНК. В результате были получены полноразмерные кДНК всего лишь для трех HCGS- (GSP1-GSP3) и трех HCRG-полипептидов (RGP1-RGP3) (рис. 4). Полноразмерные кДНК содержали 427-435 п.н. с открытой рамкой считывания из 234 п.н., кодирующих белок-предшественник длиной 78 а.о. Все выведенные АП состояли из сигнального пептида (22 а.о.) и зрелой части (56 а.о.). Степень идентичности полноразмерных НП внутри GS-группы составила 95-97%, RG - 95-99%, а между группами - 91-98%. На основании идентичности АП установлено, что НП GSP3 кодирует природный ингибитор InhVJ из H. crispa. Показано, что АГ1 зрелых HCGS- и HCRG-полипептидов имеют высокую степень гомологии (70-95%) с полипептидами АРНС1 (Swiss-prot B2G331) и Jn-IV (Swiss-prot PI 6344) из H. crispa, a также с SHPl-1 (Swiss-prot P31713), SHPI-2 (Swiss-prot P81129) из Stichodactyla helianthus. Выведенные АП зрелых HCGS-полипептидов имели в положении Pi остатки Lys (GSP1 и GSP2) и Thr (GSP3). a Al l зрелых HCRG-полипептидов -только Lys. Следует отметить, что GSP1 и RGP1-RGP3 полипептиды характеризовались идентичной BPTI (Swiss-prot Р00974) последовательностью в области реактивного сайта (-PCKARI-).

gsp1 1 aaccacaacagagagcaaagacaaga7aacaag (itgaagggaacttttcttatttgtctgatcctaattgcaggtttctct

gsp2 1 aaccacaacagagagcaaagacaaga7aacaag fc7gaagggaac7tttcttat7tgtctgatcc7aa7tgcaggtt7ctc7

gsp3 1 aaccacaacagagagcaaagacaagataacaag htgaagggaacttttcttatttgtctgatcctaattgcaggtttctct

aphc1 1 aaccacaacagagagcaàagacaagataacaag htgaagggaacttttcttat7tg7c7gatcctaattgcaggtttctc7

rgp1 1 aaccacaacagagagcaaagacaaga7aaaaag ^tgaagggaacttttcttatttgtctgatcctaattgcaggtttctct

bgp2 1 aaccacaacagagagcaaagacaaga7aaaaag m,gaagggaac7tttct7at7tgtctgatcctaattgcaggtttctct

rgp3 1 aaccacaacagagagcraagacaagataaaaagfitgaagggaacttttgttatttgt

f l

a g

l e p к

v g p с x, a x;

gsp1 82 ttcaaaagcactcaagcc

gsp2 82 77caaaagcac7caagcc

gsp3 82 ttcaaaagcactcaagcc

арнс1 82 ttcaaaagcactcaagcc

rgp1 82 ttcaaaaccactcaagcc

rgp2 82 ttcaaaaccactcaagcc

rgp3 82 ttcaaaaccactcaagcc

tagcatttgt7 7agaacc caaag7ag77ggc gtagcatttgtttagaacccaaagtagttggc s7agcatttgtt7agaacccaaag7ag7tggc g7agca7ttgt77agaacccaaag7ag77ggc

X, R F Y

:gaagattctac

:cgtgtaaagcacgtatt 5

:cgtgtaaagcaggtatt :gaagattctac

:cgtgtaccgcgtatt7t î xgtgtaccgcgtatttt 5

gtggcatttgtc7agaacccaaag7ag77ggcxg7g7aaagcacgtatt

IATTTGTC7AGAACCCAAAG7AG77GGC ZCGTGTAAAGCACGTATT ÍGAAGATTCTAC ^CATTTGTTCAGAACCCAAAGTAGTTGGCPCGTGTAAAGCACGTATTCGAAGATTCTAC С Xi EPXVVGPCKARIRRFY

:caagattctac ígaagattctac x3aagattctac

162 162 162 162 162 162 162

f d s

t g к с

f x.

g g с

x,gngnnfe7 lx, tgaaatgggaataactttgagaccctgcat

gs pi 163 7tcgattcagagactggaaagtgcacaccg77cí17c7acgg7gga7gtggg gsp2 163 ttcgattcagagactggaaagtgcacactgttc ^tctacggtggatgcaag xïaaatgggaataactttgagaccctgcat gsp3 163 ttcgattcagagactggaaaatgcacaccg77cïv7c7acgg7gga7gcgag aphc1 163 7tcgattcagagactggaaagtgcacagtg77cî17c7acgg7gga7gcgag rgp1 163 tacgattcagagactggaaagtgcacaccg77ch7c7acgg7gga7gtggg rgp2 163 7acgattcagagactggagagtgcaaaccgt7c a7c7acgg7gga7gcaag

rgp3 163 7acgat7cagagac7ggagag7gcaaaccg77cft7c7acggtgga7gcaagîgaaa7aagaa7aac7ttgagaccc7gca7

»gaaatggaaataactttgagaccctgcat îgaaa7ggaaataactttgagaccctgcgt ïgaaatgggaataactttgagaccctgcat îgaaataagaataactttgagaccctgcat

e t g x, с x3

y g

x, g n x, n n

H

243 243 243 243 243 243 243

324 324 324 324 324 324 324

405 405 405 405 405 405 405

ACRA1CRA stop GSP1 244 GCATGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCTTGTTAGAAGAGCAATGAGAAGTTCCAAATTGCTACAAAAAGTCAAGTAAAG GSP2 244 GCATGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCTTGTTAGAAGAGCAATGAGAAGTTAGAAAT7GCTACAAAAAGTCAAGTAAAG GSP3 244 GCATGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCTTGTTAGAAGAGCAA7GAGAAG7TAGAAA77GC7ACAAAAAG7CAAG7AAAG APHC1 244 GCATGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCTTG7TAGAAGAGCAATGAGAAGTTCCAAATTGCTACAAAAAGTCAAGTAAAG RGP1 244 GC^TGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCTTGTTAGAAGAGCAATGAGAAG77AGAAA77GC7ACAAAAAC7CAAATAAAG RGP2 244 CAATGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCT7G77AGAAGAGCAA7GAGAAG77AGAAA77GC7ACAAAAAG7CAAGTAAAG RGP3 244 CAATGCCGAGCTATATGCAGGGCGTAATCTTG77AGAAGAGCAA7GAGAAG77AGAAA77GC7ACAAAAAG7CAAGTAAAG X, CRAICRA stop

GSPI 325 A7AAAAA7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AG7AA77G7A77AAGAGAAAA7GGGAArAAAAGGA7GCCAA7CC

GSP2 325 A7AAAAA7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AG7AA77G7A77AAGAGAAAA7GGGAArAAAAGGA7GCCAA7CC

GSP3 325 A7AAAAA7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AG7AA77A7A77AAG7GAAAA7GGGAATAAAAGGA7GCCAA7CC

APHC1 325 A7AAAAA7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AG7AA77G7A77AAG7GAAAA7GGGAATAAAAGGA7GGCAA7CC

RGP1 325 A7AAAAA7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AA7AA77G7A77AAG7GAAAA7GGGAArAAAAGGA7GCCAA7GG

RGP2 325 A7AAAAG7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AG7AA77G7G77AAG7GAAAA7GTGAArAAAAGGA7G7CAA7CC

RGP3 325 A7AAAAG7AAAAGA7G7AAA77CA77AACG7GGA777AG7AA77G7G77AAG7GAAAA7GTGAATJAAAAGGA7G7CAA7CC

GSP1 406 АС7ААААААААААААААААААААААААЛАА 435

GSP2 406 ACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 435

GSP3 406 actgaaaaaaaaaaaaaaaaaa----------------427

APHC1 406 АС7АДАААААААААААААААААААААААААА 436

RGP1 406 ---AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------428

RGP2 406 ACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 435

RGP3 406 ACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 435

Рис. 4. Множественное выравнивание полноразмерных последовательностей, кодирующих полипептиды GSP1-GSP3, RGP1-RGP3 и АРНС1 (Swiss-prot B2G331). Область сигнального пептида, реактивного сайта и сайта слабых взаимодействий с сериновыми протеиназами выделена рамками. Сайт полиаденилирования и поли (А)-тракт выделены курсивом и подчеркиванием. Консенсусная АГ1 представлена над НП для HCGS-полипептидов, под НП - для HCRG-полипептидов, где знаком X отмечены вариабельные а.о. Для HCGS-полипептидов: Х\ соответствует P, а.о. Lys (GSP1. 2) и Thr (GSP3, АРНС1 ), X, - Arg (GSP1 ), Gly (GSP2) и Туг (GSP3, АРНС1 ), X, - Ile (GSP1, 2) и Phe (GSP3, APHC1), X4- Arg (GSP1, 2, APHC1) и Pro (GSP3), X5 - Pro (GSPI, 3) Leu (GSP2), Val (APHC1), X6 - Ile (GSP1, 3, APHC1) и Leu (GSP2), X7-Gly (GSPÍ), Lys (GSP2) и Glu (GSP3, APHC1); Xs - His (GSP1-GSP3) и Arg (APHC1). Для HCRG-полипептидов: X, - Ser (RGP3) и Leu (RGP1, 2), X2 - Lys (RGP1) и Glu (RGP2, 3); X3 - Thr (RGP1) и Lys (RGP2, 3); X4 и X5 - Gly (RGP1 ) и Lys (RGP2, 3), X6- Ala (RGP1 ) и Gin (RGP2, 3).

2.2. Установление первичных структур зрелых HCGS-полипептидов

Для амплификации зрелых форм HCGS-полипептидов использовали ген-специфичные праймеры. сконструированные на основе установленных полноразмерных последовательностей кДНК. Полученные ПЦР фрагменты длиной около 180 п.н. выделяли из геля, клонировали и секвенировали. В результате были выведены 33 АН изоформ HCGS-полипептидов (рис. 5), десять из которых были

представлены несколькими копиями МП (от 2 (2.5%) до 17 копий (18.5%)) (рис. 6). Наиболее представленные последовательности НСОБ 1.20 (18,5%), НСвБ 1.27 (13,5%) и НСвБ 2.2 (8.6%) были идентичны зрелым полипептидам полноразмерпых кДНК СЭР 1 -СБРЗ (рис. 4). Для всех НСОБ-полипептидов характерна высокая степень гомологии как между собой (78-98%), так и с известными полипептидами Кунитц-типа актиний - 43-93%.

Р1

----Й31СЬ РК\Д/ОРСТАУГРКГУР Б

| Jn-IV --—GSICL PKWGPC7AYFPRFYF S TGKCTPFIYGGCEG

HCGS 1.27----GSICL PKWGpCTAYFPRFYF S TGKCTPFIYGGCE

HCGS 2.3 ----GSICL PKWGPC7AYFPGFYF S TGKCTPFÍXGRCE

4SYVD KLHACRAICRA-JGNKF tlhacraicra-«3NNF TLHACRAICRA-

HCGS 1.34----GSICL PKWGPC AYFPRFYF S TGKCTPFIYGGCEGSGNNF TLHACRAICRA-

HCGS 1.26----GSICL PKWGPC"AYFRRFYF S TGKCTPFIYGGCE

APHC3 ----GSICL PKWGPC7AYFPRFYFNS TGKCTPFIYGGC

HCGS 1.10----GSICL PKWGPC"AYLRRFYF S TGKCTPF|lYGGC

APHC1

----gsicl pkwgpctayfrrfyf s tgkctvfiyggct

HCGS HCGS HCGS HCGS

TGKCTPFIHGGCEG TGKCTPFÍtYGGCEfc TGKCTPFÍYGGCE¡3 TGKCTPFIYGGCE

HCGS 1.36----GSICL PKWGPCAYFRRFYY S

HCGS 2.5 ----GSICL PKWGPCTAYFRRFYF S

APHC2 ----GSICL PKWGÍPCTAYFRRFYF S

HCGS 2.27----GSICL PKWGPCKAGIRRFYF S

HCGS 2.34----GSICL PKWGPCKAGIRRFYF S

2.2 ----GSICL PKWGPCKAGIRRFYF S

2.23----GSICL PKWGPCKAGIRRFYF S

2.17----GSICL PKWGPCKAGIRRFYF S

2.31----GSICL PKWGPCKTGIRRFYF S

HCGS 1.20----GSICL PKWGPCKARIRRFYF S

HCGS 1.11----GSICL PKWGPCKARIRRFYF SKTGKCTPFIYGGCG

HCGS 1.2S----GSICL PKWGPCKARIRRFYF S TGKCTPFÍTYGGCGÍ

HCGS 1 .13----GSICL PKWGPCKARIRRFYY S

HCGS 1.32 ----GSICL PKVAGPCKARIRRFYY S

HCGS 1.14----GSICL PKAVGPCKARIRRFYY S

HCGS 1.4 ----GSICL PKAVGPCKARIRRFYY S

HCGS 1.28----GSICL PKWD^CKARERRFYY S

HCGS

GNNF TLHACRAICRA-GNNF TLRACRGICRA-GNNF TLPACRAICRA-GNNF TLRACRAICRA-GNNF TLPACRAICRA-GNNF TLBACRAICRA-GNNF TLrACRAICRA-:GNNF TLHACRAICRA-TGKCTPFtYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-TGKCTLFLYGGCKGNGNNF TLHACRAICRA-TGKCTLFLYGGCKGNGNNF ILHACRAICRA-TGKCTLFLYGGCKENGNNF TLHACRAICRA-TGKCTLFLYGGCKGNGNNF TLHACRAICRA-TGKCTPFtlYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-ÍGNNF TLHACRAICRA-IGNNF TLHACRAICRA-TGKCTPFÍYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-TGKCTPFtl YGGCGÍSNGNNF TLHACRAICRA-TGKCTPFtlYGGCr.GNGNKF TLHACRAICRA-TGKCTPFjlYGGCGGNGNNF ALHACRAICRA-TG CKPFIYGGCKGNKNNF TLHQCRAICRA-

HCGS HCGS HCGS

1.3

HCGS 1.30

HCGS HCGS HCGS HCGS

HCGS 1.48

HCGS HCGS BPTI

1.44----GSICL PKWGPCKARIRRFYY P TGECKPFIYGGCKGNKNNF TLHQCRAICRA-

1.24----GSICL PKWGPCKARIRRLYY S TGECKPFIYGGCKGNKNNF TLHQCRAICRA-

1.46----GSICL PKWGLCKARIRRFYY S TGñCKPFtTYGGCKGNKNNF TLHQCRAICRA-

----GSICL PKWGPCKARIRRFYY S TGECKPFIYGGCKGNKNNF TLHQCRAICRA-

----GSICL PKWGPCKARIRRFYF S TGECKPFIYGGCKGNKNNF TLHQCRAICRA-

----GSICL PKWGPCKARIRRFYY S TGKCKPFIYGGCK¡»IENNY TLHECRAICRA-

----GSICL PKWGPCKARIRRFYF S TGKCTPF¡tYGGCKGNKNNF TLHACRAICRA-

----GSICL PKWGRCP.GSFPRFYF S TGKCTPFIYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-

----GSICL PKKVGRCP.GGFPRFYF S TGKCTPFIYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-

----GSICL PKKVGRCPGSSPRFYF S TGKCTPFIYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-

----GSICL PKKVGRCRGSFPRFYF S TGKCTPFIYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-

----GSICL PKKVGRCRGSFPRSYF S TGKCTPFIYGGCGGNGNNF TLHACRAICRA-

---RPDFCL PPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGC"AKRNNFKSAEDCMRTCGGA

1.1 1.45 2.1 1.6

1.19 1.61

310 |tl p: «

Рис. 5. Множественное выравнивание HCGS-полипептидов и природных ингибиторов протеиназ Jn-IV (Р16344) и АРНС1-АРНСЗ из Н. crispa, BPTI (Swiss-prot Р00974) из В. laurus. Идентичные и консервативные а.о. показаны на сером фоне, остатки Cys - на желтом. Красной рамкой выделен реактивный сайт полипептидов, синей - сайт слабых взаимодействий. Ниже показана топология элементов вторичной структуры.

С целью выполнения структурно-функционального анализа для HCGS-полипептидов методом гомологичного моделирования были построены ЗЭ-модели. Показано, что HCGS-полипептиды, подобно структуре ВРТ1, имеют Кунитц-фолд: содержат две спирали, расположенные на N- и С-концах молекулы, два антипараллельных (5-стренда и две протяженные петли. Как видно из рисунка 5. в

и

HCGS-полппептидах основные замены приходятся на участки двух сайтов, отвечающих за специфичность взаимодействия с еериновыми протеиназами.

Известно, что Р, остаток, расположенный в центре реактивного сайта, взаимодействует с S| остатком активного центра сериновых протеиназ и вносит основной вклад в энергию ассоциации комплекса ингибитор-фермент (отвечает за 50% специфического связывания). На мутантных формах BPTI ранее было показано, что положительно заряженные Pi остатки Arg или Lys отвечают за высокое аффинное связывание с трипсином и трипсиноподобными протеиназами, в то время как полярный Р| остаток Thr снижает сродство полипептидов к этим протеиназам, но повышает специфичность к эластазе нейтрофилов человека. В соответствии с химической природой ?! остатка все HCGS-полипептиды были разделены на три группы: I (P| Lys), II (Р[ Thr) и III (Р[ Arg) (рис. 5). Среди HCGS-полипептидов также наблюдалась вариабельность в отношении остатка 38, расположенного в сайте слабых взаимодействий с еериновыми протеиназами. Так. представители всех трех групп имели отрицательно заряженный Glu и нейтральный Gly, а среди представителей I группы в этом положении дополнительно встречался положительно заряженный Lys. Установлено, что HCGS-нолипептиды этих групп различаются между собой представленностью транскриптов, числом кодируемых ими основных и минорных изоформ. а также формой их молекулярного электростатического потенциала (рис. 6).

Молекулярный электростатический потенциал (МЭП) является важной характеристикой белковой молекулы и определяет ее специфичность и кинетику молекулярного связывания. Как правило, полипептиды с близкими электростатическими свойствами имеют сходный механизм связывания с мишенями и. возможно, одинаковую биологическую активность. Мы предполагаем, что HCGS-полипептиды образуют комбинаторную библиотеку полипептидов Кунитц-типа актинии Н. crispa (рис. 6). Наиболее многочисленной и структурно разнообразной является I (F, Lys) группа. На ее долю приходится 66,1% уникальных АП с 82-98% гомологии. Для всех полипептидов этой группы характерно несколько типов МЭП (рис. 6). Общий заряд молекул варьирует от +2,03 до +6.02. Присутствие положительно заряженных остатков. Lysl4, Argl8 и Argl9, приводит к формированию большого положительного заряда в области реактивного сайта полипептидов, a Argl6, Lys28, Lys30, Lys38 и Lys41 - к разнообразию форм эквипотенциальных поверхностей (рис. 6). Поскольку из Н. crispa полипептиды I группы еще не выделены, можно только предположить, что они будут более эффективными ингибиторами сериновых протеиназ, чем ранее исследованные Jn-IV, InhVJ и АРНС1-АРНСЗ, ввиду присутствия у них в позиции Pj остатка Lys, а также наличия идентичной с BPTI последовательности реактивного сайта (-PCKARI-). Возможно, полипептиды HCGS 2.2, HCGS 1.20, HCGS 1.13 и HCGS 1.30 являются гомологами природного ингибитора сериновых протеиназ Rmln II из Н. crispa, проявляющего антигистаминную активность, на это указывает высокая степень гомологии их N-концевых последовательностей, включая Lys в положении Рь

Второй но представленности АП (24%) является группа II (Pt Thr), члены которой имеют высокую гомологию (84—98%) с природными ингибиторами протеиназ Jn-IV, InhVJ и АРНС1-АРНСЗ. Представители этой группы характеризуются точечным распределением МЭП. а общий заряд молекул варьирует от +0.02 до +2,15. Замены Pro 18 и His48 па аргинин приводят к формированию протяженного положительного заряда у «основания» молекулы и в области ßl-стренда (рис. 6). В отличие от BPTI, наличие Thr в позиции Р! и Glu в положении 38 «снимает» положительный заряд в области сайта слабых взаимодействий. На уровне третичной структуры у полипептидов существует отрицательно заряженная область, образованная остатками Glu6, Asp23 и Glu25. Предполагается, что HCGS-полипептиды этой группы способны

не только ингибировать сериновые протеиназы (подобно ,1п-1У и InhVJ). но и модулировать функциональную активность ТЯРУ1-канала (подобно АРНС1-АРНСЗ). АП полипептида НСОБ 2.5 соответствует последовательности АРНС2. а НС05 1.27 —

rvii I IUJ Irl 11С 11 I пда I VJO ¿..J CUUIBCICIIIVCI 1IV V„ _ 1V__1V I, ¡ I K.I l>NUL I H П I 11

InhVJ, которые являются природными HCGS-изоформами H. crispa.

к

70

I группа

III группа

К Т R

Р, остаток

Рис. 6. Диаграмма представленности HCGS-транскриптов в щупальцах Н. crispa. Минорные изоформы представлены оранжевым цветом на диаграмме. Для основных изоформ показана форма молекулярного электростатического потенциала. Модели пространственных структур полипептидов представлены в виде ленточных диаграмм (обозначены зеленым цветом) с эквипотенциальными поверхностями (положительный потенциал обозначен синим цветом, отрицательный - красным). Визуализация выполнена с помощью SPDBV программы. Круговая диаграмма отражает распределение HCGS-полипептидов на группы согласно Р, остатку.

Наименьшее число изоформ наблюдается в III (Р, Arg) группе - 9,9% (рис. 6). АП которых высоко гомологичны последовательностям полифункциональных ингибиторов протеиназ SHPI-1 и SHPI-2 из актинии S. helianthiis. В отличие от HCGS-полипептидов, АГ1 этих ингибиторов имеют в центре реактивного сайта Lys. Степень гомологии последовательностей III группы составляет 86-96%, значение суммарного заряда для них варьирует от +3.03 до +4.06. Характерными особенностями представителей этой группы является наличие остатков Gly в 15 и 38 и Pro в 18 положениях (рис. 6). Распределение МЭП определяется положительной триадой -Lys9, Arg 12 и Arg 14, которая формирует высоко заряженную положительную область вокруг связывающей петли, включая N-концевой участок молекулы (с 1 по 10 а.о.). Последовательности полипептидов HCGS 2.1, HCGS 1.19 и HCGS 1.61 содержат остатки Argl2, Serió и Phel7. которые, как установлено для ингибитора HWTX-XI (GenBank ABY77743) из паука Haplopelma schmidti, играют ключевую роль в его эффективном связывании с трипсином. По-видимому, эти HCGS-полииептиды, подобно ингибиторам протеиназ SHPI-1 и SHPI-2, должны ингибировать широкий спектр протеиназ и, подобно HWTX-XI, более эффективно, чем BPTI, ингибировать трипсин.

Сравнительный анализ расчетных физико-химических характеристик IICGS-полипептидов показал, что они имеют близкие, а в некоторых случаях и равные

значения молекулярной массы (5702,2 - 6386.9 Да), но различаются значениями заряда молекулы (+0,01 - +6,02) и изоэлектрической точки (07,01 - 11,49), а также количеством заряженных (20 - 27) и гидрофобных (13 - 18) остатков. Обнаружено, что для представителей комбинаторной библиотеки наблюдается следующая закономерность: общий заряд сгруппированных HCGS-полипептидов, в целом, отражает их разделение в соответствии с химической природой Pi остатка.

Таким образом, установлены первичные структуры тридцати трех зрелых изоформ HCGS-нолипептидов (из них тридцать одна — новая), некоторые из которых являются минорными. Показано, что первичные структуры HCGS-полипептидов характеризуются высоким полиморфизмом, отличаются электростатическими свойствами и величиной заряда молекул.

2.3. Установление первичных структур зрелых HCRG-полнпептпдов

Первичные структуры HCRG-полипептидов были установлены методом гнездовой ПЦР (nested PCR) с использованием ген-специфичных праймеров, сконструированных с учетом высокой гомологии НП HCGS- и HCRG-полипептидов. В результате проведения двух раундов ПЦР были получены специфичные фрагменты длиной 180 пл., которые затем клонировали и секвенировали. Первичные структуры 33 изоформ HCRG-полипептидов были выведены на основе анализа их НП (рис. 7). Процентное содержание некоторых изоформ варьировало от 2,5 (2 копии) до 17,5% (14 копий). Для всех первичных структур HCRG-полипептидов наблюдалась высокая степень гомологии как между собой (79-98%), так и с известными ингибиторами прогеиназ Кунитц-типа других видов актиний (67-86%). Следует отметить, что N-концевые фрагменты большинства HCRG-полипептидов высоко гомологичны природным ингибиторам HCPR1 и HCPR2. выделенным в данной работе. Обнаружено, что HCRG-полипептиды различаются по окружению первого остатка Cys. а именно а.о. в пятом положении. На этом основании выделены две группы: первую группу образу ют HCRL-полипептиды с Leu5, а вторую - HCRS-полипептиды с Ser5. Наиболее многочисленной по числу изоформ является HCRS-rpynna (22 полипептида), a HCRL-rpynna образована одиннадцатью изоформами. Среди HCRG-полипептидов наиболее представленными были HCRL 1 (17,5%) и HCRS 2 (11,3%), идентичные зрелым полинептидам полноразмерных кДНК RGP1 и RGP3 соответственно. У всех HCRG-полипептидов основные отличия наблюдаются в сайте слабых взаимодействий, главным образом, в 38 положении: в обеих группах в основноу! встречаются остатки Lys и Gly. тогда как в HCRS-группе дополнительно появляются Glu и Arg. В то же время высокая консервативность остатков обнаружена в области реактивного сайта, включая Р, остаток. В 97% случаев в позиции Р| присутствовал Lys и только в 3% - Thr (HCRS 21). Практически все HCRG-полипептиды имели идентичную с BPTI последовательность реактивного сайта (-PCKARI-).

С целью выполнения структурно-функционального анализа для HCRG-иолппептидов методом гомологичного моделирования были построены ЗО-моделн. Показано, что подобно структураУ1 HCGS-полипептидов и ВРТ1, они имеют Кунитц-фолд. Установлено, что между N-концевыУ! остаткоу1 Argl и 11е53, расположенным в С-концевом участке молекулы, образуется водородная связь, которая вносит дополнительный вклад в стабильность молекулы и способствует формированию взаимодействий между спиралями N- и С-концевых участков молекулы, что также характерно для BPTI. но не для HCGS-полипептидов. Для всех HCRG-полипептидов были рассчитаны физико-химические характеристики: значения молекулярной массы варьировали от 6055.6 до 6399.85 Да, значения изоэлектрической точки - от 8,56 до 9.54. а величины заряда молекулы - от 2,71 до 7,79.

HCRL 1

HCRL 10

HCRL 11

HCRL 15

HCRL 18

HCRL 34

HCRL 36

HCRL 4

HCRL 40

HCRL 41

HCRL 9

HCRS 1

HCRS 11

HCRS 14

HCRS 15

HCRS 17

HCRS 2

HCRS 21

HCRS 22

HCRS 23

HCRS 25

HCRS 27

HCRS 28

HCRS 3

HCRS 30

HCRS 32

HCRS 33

HCRS 35

HCRS 36

HCRS 39

HCRS 4

HCRS 41

HCRS 7

BPTI

s tgkctpf s tgeckpf s tgeckpl s tgeckpf

-rgicl:: pkwgpckarirrfyy s tgkctp] -rgicl pkwgpckarirrfyy s tgkcts: -rgicl pkwgpcktrirrfyy s tgkctp] -rgicl2pkwgpckarirrfyf s tgkctp] -rgicl pkwgpckarirrfyy sgtgkctp1 -rgicl pkwgpckarirrfyy s tgkctp: -rgicl pkwgpckarirrfyy -rgicl pkwgpckarirrfyy -rgicl: pkwgpckarirrfyy -rgicl pkwgpckarirrfyy -rgicl pkwgpckagirrfyf -rgics pkwgpckarirrfyy -rgics pkwgpckarirrfyy -rgics pkwgpckarirrfyy -rgics pkwgpckartrrfyy s tgkctp: -rgics pkwgpckartrrfyy s tgeckp: -rgics pkwgpckarirrfyy s tgeckp] -rgics pkwgpc: ayfrrfyf s tgkctp] -rgics piwgpckarirrfyy s tgeckp] -rgics pkavgpckarirrfyy s tgeckp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tggckp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgeckp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgeckp] -rgics pkwgpckarirrfyy l tgecep] -rgics pkwgpckarirrsyy s tgeckp! -rgics pkwgpckarirrfyy s tgeckp] -rgics pkwgpckarirrfyh s tgeckp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgkctp] -rgics pkwgpckarirrfyy sgtgeckp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgkctp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgkctp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgdckp] -rgics pkwgpckarirrfyy s tgeckp] rpdfcl ppytgpckariiryfynakaglcqt]

yggcg3ngnnf tlhacraicra-]yggcg gngnnf tlhacraicra-] yggcgsngnnf tlhacraicra-yggcg5ngnnf tlhacraicra-yggcg3ngnnf tlhacraicra-yggcg3ngnnf tlhacraicra-s tgkctpfftyggcg 5ngnnf tlhacraicra-s tgeckpfiyggck 3nknnf tlhqcraicra-s tgeckpsiyggck 3nknnf tlhqcraicra-s tgkctpfiyggcgjngnnl tlhqcraicra-yggcg 3ngnnf tlhacraicra-yggck jnkdnf tlhqcraicra-yggck3nknnf tlhqcraicra-yggck snrnnf tlhqcraicra-yggcgsngnnf tlhacraicra-yggck3nknnf tlhqcraicra-yggck5nknnf tlhqcraicra-yggc- 3ngnnf tlkacraicra-yggck 3nknnf tlhqcraicra-yggck 3nknnf tlhqcraicra-yggck jnkknf tlhqcraicra-ggck3nknnf tlhqcraicra-yggcs3nknnf tlhqcraicra-yggck2nknnf tlhqcraicra-yggck inknnf tlhqcraicra-]yggcrsnknif tlhqcraicra-yggc:- jnknnf tlhqcraicra-]yggcg 3ngnnf tlhacraicra-]yggck 3nrnnf tlhqcraicra-]yggcg 3sgnnf tlhacraicra-]yggck 3hknnf tlhqcraicra-]yggck 3nknnf tlhqcraicra-yggckpnknnf tlrqcraicra-'ggc akrnnfksaedcmrtcgga

Рис. 7. Множественное выравнивание HCRG-полипептидов и BPTI (Swiss-prot P00974). Идентичные и консервативные а.о. показаны на сером фоне, остатки Cys - на желтом фоне. Красной рамкой выделен реактивный сайт полипептидов, синей - сайт слабых взаимодействий.

Таким образом, установлены первичные структуры тридцати трех зрелых изоформ HCRG-полипептидов. N-концевые фрагменты которых высоко гомологичны новым природным ингибиторам HCPR1 и HCPR2. Первичные структуры изоформ HCRG-полипептидов характеризуются меньшим полиморфизмом, чем таковые HCGS-полипептидов.

2.4. Установление первичных структур зрелых НСТХ-полннептидов

Недавно из актинии Stichodactyla haddoni был выделен бифункциональный полипептид Кунитц-типа, SHTX III, который относится к токсинам К„-каналов II типа. Для этого токсина наряду с трипсинингибирующей активностью характерно блокирование связывания I-a-DTX с Кх,-каналом. Мы полагаем, что актиния Н. crispa также может быть источником новых полипептидов Кунитц-типа с K.v-блокирующей активностью, т.к. она принадлежит к тому же семейству Stichodactylidae, что и 5. haddoni. Для идентификации новых полипептидов, мы использовали генетический материал актинии И. crispa, яд которой был недоступен в препаративном количестве.

Для установления последовательностей, кодирующих НСТХ-полипептиды (первые две буквы в аббревиатуре обозначают вид, последние буквы - «токсин»), были сконструированы ген-специфичные праймеры на основе последовательности

SHTX III (Swiss-prot B1B5I8). Генетический материал из актинии Stichodactyla mertensii был использован в качестве контроля. В результате только для кДНК Н. crispa получены ПЦР-фрагменты длиной около 250 п.н. Изменение условий ПЦР на кДНК S. mertensii не привело к появлению специфичного продукта реакции. В то же время на геномных ДНК Н. crispa и S. mertensii были амплифицированы специфичные фрагменты длиной около 1000 п.н. Наблюдаемая разница (около 750 п.н.) в длине фрагментов свидетельствует о наличии интрона/ов в структуре генов, кодирующих НСТХ-полипептиды. Тот факт, что нам не удалось получить фрагменты на кДНК S. mertensii, может указывать на отсутствие транскрипции мРНК этих полипептидов в щупальцах данного организма на момент выделения генетического материала. Все ПЦР фрагменты были выделены из геля, клонированы и секвенированы.

В результате были установлены НП шести изоформ зрелых полипептидов Кунитц-типа Н. crispa (рис. 8). Наиболее представлена была НП, кодирующая полипептид НСТХ1. На ее долю приходилось 67,7% (42 НП) от общего числа клонов. НП только этой изоформы встречалась и на геномном, и на транскриптомном уровнях. Второй по частоте встречаемости была НП. кодирующая НСТХ5 (15 копий, 24,2%), представленная только на геномном уровне. Секвенирование 20 клонов геномной ДНК S. mertensii позволило установить НП, кодирующие 3 изоформы зрелых полипептидов, обозначенных как - SMTX1-SMTX3 (рис. 8). Наиболее представленной была SMTX1 (90%. 18 копий).

НСТХ5 НСТХ1 НСТХ6 НСТХ2 НСТХ4

нстхз

SMTX2 SMTX1 SMTX3

ТЕЕМРА С QPWGKC.

ТЕЕМРА С QPVAGKCRGYFPRYYYNPEVGKCEQí EYGGCG GNKNNFESFEACRATCIIPL

ТЕЕМРА С QPVAGKCR

ТЕЕМРА,С QPVAöKCF

ТЕЕМРА С 1

ТЕЕМРА С: QPVADKCR

ТЕЕМРА_С QPWGKC RGYSPRYYYNPEAGKCEQF tYGGCC GNKNNFASFEACRATCIIPL

ТЕЕМРА jC] ТЕЕМРА jC1

qpwg 1С.

SHTX III ТЕЕМРА С

APEKTxl ---INS 1С

AsKCl ASKC2 АзКСЗ Jn-IV HCRL 1 DTX К BPTI

p.

:CEQE tYGGCC GNKNNFESFEACRATCIIPL

QPWGKC RGYFPRYYYNPEAGKCVQF tYGGCC GNKNNFASFEACRATCII PL------

QPDVPKCRGYFPRYYYNPEVGKCEQF tYGGCG GNKNNFVSFEACRATCIIPL------

Е PKKQG FC PARFPRFYYNS S T RCEMF ÍYGGCC GNANNFNTLEECEKVCLGYGEAWKAP

---INKDC L['MDVC 4CPASHk>RYYYNSSS RCEKE tYGGCI GNAHMFHTLEECEKVCGVE-------

-- 1NK1XJ , MDVC RCRARHPRYYYNSSS RCEKF tYGGCI GNAHHFITKKECEKVCGVR-------

---INGDCELPKWGRCRARI^RYYYNLSSrRCEKE tYGGCC GNANNFHTLEECEKVCGVRS------

C4GNKNNFGSFEACRATCIIPL-FGACRATC11 PL -FEACRATCIIPL IIPL-

CIIPL-

----GSICLEPKWGpCTAYPPRFYFDSETOtCTPF tYGGCI GNSYVDEKLHACRAICRA--------

----RGICLEPKWGPCKARIRRFYYDSETCT^CTPF tYGGCC GNGNNFETLHACRAICRA--------

---AAKYCKXPLRIC PCKRK1 PSFYYKW 'Ar QCLPE DYSGCC GNANRFKTIEECRRTCVG--------

---RPD FCLE PPYTGPC KART I RYFYNAKAGLCQTIf/YGGC HAKRNNFKSAEDCMRTCGGA-------

Рис. 8. Множественное выравнивание полипептидов Кунитц-типа актиний Н. crispa и S. mertensii. Ингибиторы протеиназ Jn-IV (Swiss-prot PI6344) и HCRL 1 из Н. crispa, BPTI (Swiss-prot P00974) из В. taurus. Токсины Кт-каналов: DTX К (Swiss-prot Р00981) из змеи Dendroaspis polylepis, APEKTxl (Swiss-prot P86862) из актинии Anthopleura elegantissima, AsKCl-AsKC3 (Swiss-prot: Q9TWG0, Q9TWF9 и Q9TWF8 соответственно) из актинии Anemonia sulcata, SHTX III (Swiss-prot B1B5I8) из актинии S. haddoni. Консервативные a.o. выделены серым фоном, а остатки Cys -желтым. Красной рамкой выделен реактивный сайт полипептидов, синей - сайт слабых взаимодействий. Остатки, отвечающие за Кч.-блокирующую активность, выделены красным цветом.

Следует отметить, что НСТХ- и SMTX-полипептиды имеют высокую степень гомологии с SHTX III (от 90 до 98%), но крайне низкую - с токсинами актиний семейства Actiniidae (от 38 до 54%), величина которой сравнима с таковой для токсина DTX К (от 34 до 37%) из змеи D. polylepis. Следует отметить, что степень гомологии НСТХ-полипептидов с представителями HCGS- и HCRG-полипептидов

составляет лишь 42—18%. что указывает на существование разных кодирующих их мультигенных семейств.

Проведенный сравнительный анализ полипептидов НСТХ1-НСТХ6 и SMTX1-SMTX3, и токсинов К%-каналов 11 типа из других видов актиний и DTX К из змеи D. polylepis позволил установить наличие в N-концевом участке молекул функционально важных для проявления Ку-блокирующей активности остатков, входящих в главный сайт связывания с Ку-каналами. Обнаружено, что остатки Leu7 и LeulO идентичны таковым SHTX III и гомологичны остаткам Ие4 и Leu7 APEKTxl, в то время как Arg9 гомологичен Lys6 DTX К и менее заряженному H¡s9 SHTX III (рис. 8). Возможно, что эти полипептиды будут проявлять и трипсинингибирующую активность, поскольку подобно SHTX III имеют Pi остаток Arg (рис. 8).

Сравнительный анализ расчетных физико-химических характеристик НСТХ- и SMTX-полипептидов показал, что значение молекулярной массы варьирует от 6916,3 до 7062,3 Да, величина заряда молекулы - от -0,29 до +2,71 и значение изоэлектрической точки - от 6,35 до 8,62. Для большинства полипептидов-гомологов Н. crispa и S. mertensii характерно наличие одинакового количества отрицательно и положительно заряженных остатков и, в отличие от токсинов Кунитц-типа актиний семейства Actiniidae и HCGS- и HCRG-полипептидов Н. crispa, они являются менее заряженными молекулами (рис. 8).

Таким образом, впервые идентифицированы первичные структуры 6 высокогомологичных изоформ зрелых НСТХ-полипептидов, которые характеризуются меньшим значением заряда молекулы и крайне низкой степенью полиморфизма в сравнении с HCGS- и HCRG-полипептидами.

Итак, при анализе кДНК библиотеки из щупалец Н. crispa обнаружено множество транскриптов, кодирующих гомологичные изоформы, что указывает на существование комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и, очевидно, функциональной активностью. Полученные данные свидетельствуют о наличии двух отдельных мультигенных семейств (HCGS/HCRG и НСТХ), кодирующих полипептиды Кунитц-типа. Судя по разнообразию и представленности транскриптов, их экспрессия не только по-разному регулируется, но и их гены эволюционируют с разной скоростью.

2.5. Филогенетический анализ и молекулярная эволюция полипептидов Кунитц-тнпа актиний

С целью идентификации эволюционных взаимоотношений между представителями комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa и филогенетических связей с известными полипептидами Кунитц-типа других актиний было построено филогенетическое дерево по методу минимальной эволюции (ME), где последовательность BPTI использовалась в качестве внешней группы (рис. 9). Анализ полученного дерева показал, что представители комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа актинии H. crispa группируются в четыре кластера. Пятый кластер образован только полипептидами актиний семейства Actiniidae.

Кластер I состоит из HCRG- и HCGS-полипептидов (только представители I группы) H. crispa, для которых характерно наличие Pi остатка Lys. Большинство членов кластера имеет идентичную BPTI последовательность реактивного сайта (-PCKARI-) и остаток Lys в 38 положении сайта слабых взаимодействий.

Кластер II сформирован только HCGS-полипептидами II группы (в которую входят также природные ингибиторы InhVJ и Jn-IV и бифункциональные полипептиды АРНС1-АРНСЗ H. crispa), а также одним HCRG-полипептидом - HCRS

21. Отличительной особенностью является наличие в Р, положении полярного Thr и отрицательно заряженного Glu в 38 позиции.

Кластер III образован HCGS-полипептидами III группы, а также природными полифункциональными ингибиторами протеиназ SHPI-1 и SHPI-2 актинии S. helianthus. Представители этого кластера отличаются остатком в Pi положении: АП HCGS-полипептидов H. crispa имеют Arg, в то время как их гомологи в актинии 5. helianthus - Lys. У всех представителей этого кластера в 38 положении находится Gly.

Кластер IV содержит бифункциональные полипептиды актиний семейства Stichodactylidae (НСТХ- и SMTX-полипептиды образуют отдельную группу с бутстреп-поддержкой 100%) и ингибиторы сериновых протеиназ актиний семейства Actiniidae. Все представители этого кластера, несмотря на принадлежность к разным семействам и функциональную гетерогенность, имеют идентичные остатки в Р, (положительно заряженный Arg) и 38 (нейтральный Gly) положениях.

Кластер V образован ингибиторами сериновых протеиназ и бифункциональными полипептидами Кунитц-типа актиний семейства Actiniidae. В Р] положении АП всех представителей располагается Arg, в то время как остаток в 38 положении представлен как Gly, так и положительно (Arg и His) и отрицательно (Asp) заряженными остатками.

Обращает на себя внимание тот факт, что у представителей семейства Actiniidae в положении Р) АП полипептидов расположен только положительный остаток Arg, а у представителей семейства Stichodactylidae, наряду с Arg и Lys, встречается также полярный остаток Thr (рис. 9). По-видимому, в последовательностях полипептидов Кунитц-типа актиний семейства Stichodactylidae происходит функциональная диверсификация по Pi остатку.

На основании анализа полученного филогенетического дерева нами предположен следующий сценарий ключевых событий в эволюции полипептидов Кунитц-типа актиний: (1) происхождение от общего предкового гена, кодирующего в Р! положении реактивного сайта Arg, а в сайте слабых взаимодействий в позиции 38 -Gly; данное утверждение основано на присутствии этих функционально важных остатков у представителей III—V кластеров; (2) дупликация анцестралыюго гена и его дальнейшая дивергенция сопровождалась появлением двух паралогичных семейств, -ингибиторов сериновых протеиназ и бифункциональных полипептидов (токсинов); данное предположение основывается на присутствии практически во всех родах актиний (Heteractis, Síichodactyla, Aníhopleura и Actinia) двух групп полипептидов Кунитц-типа. степень гомологии между которыми не превышает 40-45%; (3) появление положительно заряженного остатка Lys и полярного Thr в положении Pi способствовало субфункционализации и неофункционализации молекул; субфункционализация проявляется у полифункциональных ингибиторов SHPI-1 и SHPI-2 (с Р| остатком Lys), которые ингибируют не только сериновые, но цистеиновые и аспарагиновые протеиназы. Неофункционализация заключается в возникновении нового вида биологической активности — модулирование функциональной активности TRPVl-канала у АРНС1-АРНСЗ полипептидов H. crispa, являющихся представителями II кластера (Pi Thr); (4) действие ускоренной эволюции в рамках отдельного вида привело к появлению комбинаторной библиотеки полипептидов. Молекулярное разнообразие HCGS- и HCRG-полипептидов, составляющих основу этой библиотеки, является серьезным доказательством вышеприведенного постулата. Мы считаем, что появление комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа у актинии H. crispa произошло в результате

замены Р) остатка Arg в реактивном сайте, и. как следствие, «ослабления» действия очистительной селекции на эти ген(ы).

Рис. 9. Филогенетическое дерево АП полипептидов Кунитц-типа актиний семейства Actiniidae и Stichodactylidae, построенное методом минимальной эволюции. HCGS-полипептиды на дереве обозначены красными кругами, HCRG-полипептиды - зелеными и HCTX/SMTX-полипептиды -голубыми. Ингибиторы протеиназ актиний: АЕАР1, AEPI-I, AEPI-II из Actinia equina; AFAPI-I, AFAPl-III из Anthopleura fiiscoviridis; AXPI-I, AXPI-II, AXPI-1II из Anthopleura aff. xanthogrammica; APEKTxl из A. elegantissima; AsK.Cl-AsK.C3 и SA5 II из A. sulcata: Jn-IV, APHC1-APHC3 изЯ. crispa; SHPI-1, SHPI-2 из 5. helianthus; SHTX 111 из S. haddoni. АП полипептидов, имеющих в Р| положении остаток Lys, представлены на синем фоне, остаток Thr - на розовом фоне, остаток Arg - на зеленом фоне.

Таким образом, комбинаторная библиотека Н. crispa имеет полифилетическое происхождение. Она состоит не только из HCGS-, HCRG-полипептидов. но также и из НСТХ-полипептидов, проявляющих, как мы полагаем, и ингибиторную, и каналоблокирующую активности. Молекулярное разнообразие и функциональная диверсификация представителей комбинаторной библиотеки Н. crispa свидетельствуют о том. что полипептиды Кунитц-типа могут обеспечивать взаимодействие с широким спектром биологических мишеней, обусловленным экологической нишей тропической актинии Н. crispa.

3. Установление структуры генов, кодирующих полипептиды Кунитц-типа

Для исследования структуры генов полипептидов Кунитц-типа были сконструированы праймеры. фланкирующие границы белок-кодирующих частей генов HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептидов. ПЦР выполняли параллельно, используя в качестве матриц геномную ДНК и кДНК актинии И. crispa. В ходе I НДР-амплификации были получены фрагменты, отличающиеся по длине: около 200 п.н. для кДНК и около 800 п.н. для геномной ДНК (рис. 10, А). Разница в длинах фрагментов свидетельствует о присутствии интрона/ов в изучаемых группах генов. Все ПЦР фрагменты были клонированы и секвенированы. Сравнительный анализ НП, полученных с кДНК и геномной ДНК. показал, что белок-кодирующая часть содержит только один интрон в области, соответствующей С-концевому участку сигнального пептида. Установлено, что все гены HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептидов имеют одинаковую экзон-интронную организацию (рис. 10. Б).

Интрон GT. „ .. AG

Экзон

Экзон II

Рис. 10. А. Электрофореграмма продуктов амплификации генов, кодирующих HCGS- и HCRG-полипептиды, на кДНК и геномной ДНК Н. crispa. 1 - ДНК маркер 100 п.н.; 2 - продукт амплификации на кДНК; 3 - продукт амплификации на геномной ДНК. Б. Схематическое изображение экзон-интронной структуры генов, кодирующих полипептиды Кунитц-типа. Область сигнального пептида обозначена блоком серого цвета, а область зрелого пептида - темно-серого цвета.

Для всех экзон-интронных границ НП выполнялось правило GT/AG. Во всех генах интрон условно разделял высоко и менее консервативные области сигнального пептида, включая высоковариабельную область зрелого белка. Данная особенность характерна для генов, кодирующих разные токсины ядовитых животных, таких как гены токсинов скорпионов и конусов. Известно, что участки генов, разделенные интроном, эволюционируют с различной скоростью. Высокий уровень гомологии последовательностей, как между интронами. так и между сигнальными пептидами, может указывать на принадлежность генов к одному мультигенному семейству. Следует отметить, что интроны генов HCGS- и HCRG-полипептидов имеют низкую гомологию с интронами НСТХ-полипептидов Кунитц-типа (31%), что еще раз подтверждает принадлежность этих генов к разным мультигенным семействам.

Известно, что молекулы полипептидов Кунитц-типа содержат шесть консервативно расположенных остатков Cys. которые стабилизируют Кунитц-фолд. Поэтому был выполнен анализ использования кодонов для остатков Cys в

последовательностях зрелых HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептидов. Установлено, что все остатки Cys в последовательностях полипептидов комбинаторной библиотеки Н. crispa характеризуются высокой позиционно-специфичной консервативностью, а их кодоны сохраняют инвариантность. Несмотря на высокий полиморфизм зрелых HCGS- и HCRG-полипептидов, остатки Cys в их последовательностях сохраняют одинаковое использование кодонов. за исключением полиморфного остатка Cys IV (у некоторых HCGS-полипептидов). Кодоны цистеинов в последовательностях НСТХ-полипептидов инвариантны, но не идентичны таковым у HCGS- и HCRG-полипептидов. Полученные данные свидетельствуют о «защите» цистеиновых кодонов от мутационного процесса при ускоренной эволюции полипептидов Кунитц-типа и хорошо согласуются с литературными данными - кодоны цистеинов в гипервариабельных последовательностях зрелых полипептидов, являющихся представителями одного мультигенного семейства, высоко консервативны и сохраняют строгую инвариантность. Эти результаты еще раз подтверждают существование двух отдельных мультигенных семейств, кодирующих HCGS- и HCRG-полипептиды и НСТХ-полипептиды Н. crispa.

4. Гетерологичная экспрессия и выделение рекомбинантного полипептида

Кунитц-типа

При выборе системы экспрессии мы отдали предпочтение вектору рЕТ32Ь(+), который предназначен для получения гибридных белков в составе с белком TRX в Е. coli. Преимущество данной экспрессионной конструкции заключается в том, что вектор обеспечивает высокий выход целевого белка, a TRX — правильность замыкания дисульфидных связей, необходимых для формирования биологически активной структуры дисульфид-содержащих белков, к которым относятся полипептиды Кунитц-типа. С целью дальнейшего структурно-функционального исследования рекомбинантных аналогов HCGS-полипептидов были созданы генно-инженерные конструкции на основе четырех НП наиболее представленных в комбинаторной библиотеке HCGS-полипептидов (HCGS 1.27 (соответствует природному InhVJ), HCGS 1.20, HCGS 1.3 и HCGS 1.19), отличающихся расчетными физико-химическими характеристиками и остатками в Р! и 38 положениях. Все НП уже содержали на 5'-конце сайт для EcoRl и метиониновый кодон, а на З'-конце -стоп-кодон ТАА и сайт для XhoI. необходимые для субклонирования в вектор рЕТ32Ь(+). Фрагменты HCGS-полипептидов встраивали после trx и His6-tag (для аффинного связывания с Nr'-содержащей смолой). Остаток Met был введен перед последовательностью целевого продукта для эффективного гидролиза бромцианом гибридного белка и отщепления белка-носителя TRX. Затем полученными конструкциями, обозначенными как pET32-HCGS1.27 (InhVJ), pET32-HCGS1.20, pET32-HCGS1.3 и pET32-HCGS1.19, трансформировали штамм Е. coli BL21(DE3). Для проведения аналитической экспрессии наработку целевых слитных белков индуцировали добавлением ИПТГ. Электрофоретическое разделение компонентов клеточных лизатов в ДСН-ПААГ показало, что молекулярные массы рекомбинантных гибридных полипептидов соответствовали расчетным данным (рис. 11). В результате анализа фракций бактериальных лизатов обнаружено, что рекомбинантные HCGS-полипептиды содержатся только в растворимых фракциях.

Для оптимизации условий проведения гетерологичной экспрессии рекомбинантных HCGS-полипептидов был выбран штамм-продуцент Е. coli BL21(DE3)pET32-rInhVJ. В результате проведения серии экспериментов были подобраны оптимальные условия для экспрессии рекомбинантного полипептида rlnhVJ в растворимом виде и с высоким выходом: концентрация индуктора составила 0,2 мМ, температура инкубации культуры - 25 °С, время инкубации - 12-14 часов.

Установлено, что понижение температуры культивирования (до 25 °С) позволило достичь большего выхода растворимого белка.

Рис. 11. Анализ экспрессии гибридных белков в ДСН-ПААГ. Клеточные лизаты BL2KDE3) штаммов-продуцентов Е. coli: 1 -TRX-rlnhVJ; 2 - TRX-rHCGS 1.20; 3 - TRX-rHCGSl .3; 4 -TRX-rHCGS1.19; 5 - контроль (pET32b(+)-TRX без добавления ИПТГ); 6 - белки-стандарты молекулярной массы; 7 - контроль rTRX.

Общий выход гибридного белка составил 16 мг/л клеточной культуры, что соответствует средней продуктивности рЕТ-систем. Гибридный белок таХ-г1пЬУ.1 выделяли при помощи аффинной хроматографии на №2+-сорбенте в нативных условиях, далее расщепляли по метиониновому остатку бромцианом на ТЯХ и г1пЬУ.1. Целевой полипептид г1пЬУ.! выделяли из гидролизата при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ (рис. 12, А).

Б

л

Ь ¡

S 2000

¡

Г

6

7000 m/z

Рис. 12. Профиль элюции и масс-спектр рекомбинантного полипептида rlnhVJ. А. Обращенно-фазовая ВЭЖХ гидролизата химерного белка TRX-rlnhVJ на колонке Nucleosil С¡* (4,6*250 мм), уравновешенной 10%-ным ацетонитрилом в 0,1% ТФУ. Элюцию осуществляли в градиенте концентрации ацетонитрила от 10 до 70% в 0,1% ТФУ со скоростью 0,5 мл/мин в течение 60 минут. Б. Масс-спектр рекомбинантного полипептида rlnliVJ.

Чистоту и молекулярную массу rlnhVJ определяли с помощью MALDI TOF IMS (рис. 12, Б). Нативный и рекомбинантный полипептиды имели одинаковую хроматографическую подвижность и значение молекулярной массы (6117,23 Да). Выход целевого rlnhVJ составил 8 мг/л клеточной культуры.

Определение ингибиторной активности rlnhVJ проводили по отношению к трипсину, используя в качестве контроля нативный ингибитор InhVJ. Установлено, что значение K¡ rlnhVJ составило 0,73x10"9 М. а нативного InhVJ - 0,65x10"9 М.

Таким образом, созданы генетические конструкции для экспрессии представителей разных групп HCGS-полипептидов. Получен функционально активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам и величине активности природному ингибитору протеииаз Кунитц-типа актинии Н. crispa.

Заключение

Проведенное исследование на транскриптомном и геномном уровнях показало, что актиния H. crispa является богатым и перспективным источником новых структурно и функционально разнообразных полипептидов Кунитц-типа, образующих комбинаторную библиотеку соединений, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и, очевидно, функциональной активностью. Разработанные подходы для получения рекомбинантных полипептидов позволяют изучить функциональную активность, в том числе и минорных компонентов комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа, и создают основу для их дальнейшего использования в качестве инструментов исследования функциональной активности протеолитических ферментов и ионных каналов (Kvl- и TRPV1-каналов) и разработки лекарственных препаратов нового поколения.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и функционально охарактеризованы три новых полипептида Кунитц-типа актинии H. crispa, HCPG, HCPR1 и HCPR2. На основе N-концевых аминокислотных последовательностей полипептиды отнесены к группе ранее исследованных HCGS-полипептидов, а также новой группе HCRG-полипептидов актинии. Установлены полноразмерные последовательности HCGS- и HCRG-полипептидов, характеризующиеся высокой степенью гомологии.

2. Установлено, что ингибитор HCPG является бифункциональным полипептидом, проявляющим, наряду с трипсинингибирующей активностью, анальгетическое действие на тепловой модели in vivo. Показано, что трипсинингибирующая активность полипептидов HCPR1 и HCPR2 на порядок выше активности ранее изученных ингибиторов протеиназ Н. crispa.

3. Установлена первичная структура зрелых 33-х HCGS-, 33-х HCRG- и шести НСТХ-полипептидов, которые образуют комбинаторную библиотеку полипептидов Кунитц-типа, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и функциональной активностью. Комбинаторная библиотека представлена десятью мажорными и 23-мя минорными изоформами HCGS, двумя основными и 31-й минорной изоформами HCRG и двумя мажорными и четырьмя минорными изоформами НСТХ.

4. Впервые установлено, что HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептиды кодируются разными мультигенными семействами, и доказано, что их гены имеют экзон-интронную организацию: интрон разделяет высококонсервативную и вариабельную области гена.

5. Показано, что представители комбинаторной библиотеки Н. crispa формируют на филогенетическом дереве четыре кластера: три из них представлены HCGS-/ HCRG- полипептидами и один - НСТХ.

6. Установлено, что появление положительно заряженного Lys и полярного Pi Thr в реактивном сайте способствовало субфункционализации и неофункционализации полипептидов Кунитц-типа, а действие ускоренной эволюции на их гены в рамках отдельного вида H. crispa привело к появлению комбинаторной библиотеки.

7. Созданы генетические конструкции для экспрессии представителей разных групп HCGS-полипептидов. Получен функционально активный рекомбинантный полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам и величине активности природному ингибитору протеиназ.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Isaeva М.Р., Chausova V.E., Zelepuga Е.А., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P. A new multigene superfamily of Kunitz-type protease inhibitors from sea anemone Heteractis crispa II Peptides. 2012. V. 34. P. 88-97.

2. Зелепуга H.A., Табакмахер B.M., Чаусова B.E., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1: in silico исследование // Биоорганическая химия. 2012. Т. 38, N2. С. 185-198.

3. Чаусова В.Е., Табакмахер В.М. Функциональная экспрессия ингибитора сериновых протеиназ Кунитц-типа InhVJ из тропической актинии Heteractis crispa II Актуальные проблемы биологии, химии, физики: материалы международной заочной научно-практической конференции, г. Новосибирск: Изд. «ЭКОР-книга», 2011. С. 17-22.

4. Монастырная М.М., Чаусова В.Е., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П. Способ получения полипептида из актинии Heteractis crispa, обладающего анальгетическим действием // Патент РФ №2415866. БИ.№10. 10.04.2011.

5. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya М.М., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Eskov A.A., Chausova V.E., Tkacheva E.S., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from sea anemones: prospects of investigation // Intem.vvorkshop on marine living resources of Vietnam, Hanoi: Inst. Nat. Prod. Chem.,Vietnam Acad. Sci. Technol. 2011. P. 101-110.

6. Табакмахер B.M., Чаусова B.E., Зелепуга E.A., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. In silico исследование взаимодействия полипептидов Кунитц-типа комбинаторной библиотеки актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором TRPV1 // V Российский симпозиум «Белки и пептиды»: сб. тез. докл. г. Петрозаводск: Карельский науч. центр РАН. 2011. С. 332.

7. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya М.М., Chausova V.E., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Likhatskaya G.N., Kozlovskaya E.P. Multifunctional group of PI Thr Kunitz-type inhibitors from the sea anemone Heteractis crispa II 9th 1ST Asia Pacific meet, on animal, plant and microbial toxins: proceed. Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 49.

8. Isaeva M.P., Chausova V.E., Stenkova A.M., Kozlovskaya E.P. Molecular evolution of Kunitztype toxin genes in sea anemones // 9th 1ST Asia Pacific meet, on animal, plant and microbial toxins: proceed. Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 50.

9. Chausova V.E., Gladkikh I.N., Monastyrnaya M.M., Isaeva M.P., Kozlovskaya E.P. Gene families of Kunitz-type toxins from Stichodactylidae sea anemones // 9th 1ST Asia Pacific meet, on animal, plant and microbial toxins: proceed. Vladivostok: FEB RAS, 2011. P. 55.

10. Чаусова B.E. Получение полноразмерной последовательности гена hcp_G3, кодирующего ингибитор протеиназ из актинии Heteractis crispa II Вестник ДВО РАН. 2010. № 4. С. 138-142.

11. Leychenko E.V., Gladkikh I.N., Monastyrnaya M.M., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Eskov A.A., Tkacheva E.S., Chausova V.E., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from sea anemones: prospects of investigation // Intern, workshop on marine living resources of Vietnam. Hanoi. 2010. P. 34.

12. Чаусова B.E., Гузев K.B., Зелепуга E.A., Табакмахер В.М., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Исаева М.П. Комбинаторная библиотека RG-полипептидов со структурой Кунитц-типа из актинии Heteractis crispa II XIII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 2010. С. 78.

13. Чаусова В.Е., Гладких И.Н., Гузев К.В., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Исаева М.П. Клонирование генов, кодирующих ингибиторы сериновых протеиназ из актинии Heteractis crispa II XII Всероссийская молодежная школа-конференция по актуальным проблемам химии и биологии. Владивосток. 2009. С. 81.

14. Гладких И.Н., Лейченко Е. В., Монастырная М.М., Чаусова В.Е., Исаева М П., Вакорина Т.И., Козловская Э.П. Ингибиторы сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus: структура и механизм действия // III Международная конференция «Химия, структура и функция биомолекул». Минск. 2008. С. 67.

Соискатель:

Чаусова В.Е.

Чаусова Виктория Евгеньевна

Полппептпды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Подписано в печать 23.05.12. Формат 60x84/16. Тираж 120 экз. Усл. печ. л. 1.0 Заказ № 999

Отпечатано в печатном салоне «Оперативная полиграфия». ИП Матусевич Ю.И. 690013, г. Владивосток, ул. Трамвайная 14Б, тел. (423)2694987

ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Сериновые протеиназы и их ингибиторы.

2.1.1. Классификация сериновых протеиназ.

2.1.2. Механизм катализа сериновых протеиназ.

2.1.3. Регуляция активности сериновых протеиназ ингибиторами.

2.2. Ингибиторы сериновых протеиназ: классификация и механизм ингибирования

2.3. BPTI - классический представитель ингибиторов сериновых протеиназ Кунитц-типа.

2.3.1. Структурные особенности и физико-химические характеристики ингибиторов Кунитц-типа.

2.3.2. Сайт связывания с сериновыми протеиназами, роль Pj остатка

2.4. Ионные каналы - мишени токсинов Кунитц-типа.

2.5. Полипептиды Кунитц-типа как компоненты ядов.

2.5.1. Полипептиды Кунитц-типа из змей.

2.5.2. Полипептиды Кунитц-типа из пауков.

2.5.3. Полипептиды Кунитц-типа из скорпионов.

2.5.4. Полипептиды Кунитц-типа из земноводных.

2.5.5. Полипептиды Кунитц-типа из конусов.

2.5.6. Полипептиды Кунитц-типа из актиний.

2.6. Эволюционные аспекты полипептидов Кунитц-типа.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Выделение и характеристика природных полипептидов Кунитц-типа из Н. crispa.

3.1.1. Выделение бифункционального полипептида Кунитц-типа.

3.1.2. Выделение HCRG-полипептидов Кунитц-типа.

3.1.3. Установление N-концевых последовательностей полипептидов HCPR1 и HCPR2.

3.1.4. Влияние полипептидов HCPR1 и HCPR2 на активность трипсина.

3.2. Структурно-функциональная характеристика представителей комбинаторной библиотеки полипептидов Кунитц-типа Н. crispa.

3.2.1. Установление полноразмерных последовательностей, кодирующих HCGS-и HCRG-полипептиды.

3.2.2. Установление первичных структур зрелых HCGS-полипептидов.

3.2.3. Установление первичных структур зрелых HCRG-полипептидов.

3.2.4. Установление первичных структур НСТХ-полипептидов.

3.2.5. Филогенетический анализ и молекулярная эволюция полипептидов Кунитц-типа актиний.

3.3. Структурная организация генов полипептидов Кунитц-типа Я. crispa.

3.3.1. Установление структуры генов, кодирующих полипептиды Кунитц-типа.

3.4. Гетерологичная экспрессия рекомбинантного полипептида Кунитц-типа.

3.4.1. Создание генно-инженерных конструкций, несущих гены полипептидов Кунитц-типа, на основе экспрессионной системы рЕТ.

3.4.2. Гетерологичная экспрессия и выделение рекомбинантного полипептида.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы исследования.

4.2.1. Выделение природного полипептида HCPG.

4.2.2. Выделение природных полипептидов HCPR1 и HCPR2.

4.2.3. Методы исследования физико-химических характеристик и установления первичной структуры полипептидов Кунитц-типа.

5. ВЫВОДЫ.

Исследование структурно-функциональных взаимосвязей полипептидов Кунитц-типа, обнаруженных во всех живых организмах и обладающих широким спектром биологической активности, является одной из интереснейших и важнейших задач биоорганической химии и ряда смежных наук. Обнаружено, что некоторые представители полипептидов Кунитц-типа, выделенные из ядов животных различных систематических групп, наряду с ингибированием активности сериновых протеиназ, проявляют способность модулировать функциональную активность различных типов ионных каналов (Nav-, Cav-, Kv- и TRPV1-каналы), которые участвуют во многих важных физиологических процессах организма. В этой связи их принято называть токсинами Кунитц-типа. Морские кишечнополостные, актинии, продуцируют яд, содержащий полипептиды Кунитц-типа в виде ряда изоформ, которые функционально представлены как ингибиторами сериновых протеиназ, так и токсинами ионных каналов. Следует отметить, что яд исследуемой нами тропической актинии Heteractis crispa (=Radianthus macrodactylus) является источником новых представителей полипептидов Кунитц-типа, обладающих также антигистаминной и модулирующей TRPV1 -каналы активностью.

Соединения белковой природы, выделяемые из яда актиний различных видов, интенсивно исследуются на протяжении последних десятилетий, но, несмотря на значительное количество публикаций, практически ничего не известно о природе разнообразия продуцируемых изоформ полипептидов Кунитц-типа, а также структуре кодирующих их генов. В связи с этим изучение полиморфизма полипептидов Кунитц-типа актиний представляет научный и практический интерес, поскольку обеспечивает понимание взаимосвязи между их структурными особенностями и полифункциональностью. Необходимо отметить, что способность взаимодействовать с различными мишенями указывает на возможный терапевтический потенциал полипептидов Кунитц-типа при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеиназ или дисфункцией ионных каналов. Полипептиды Кунитц-типа также могут рассматриваться в качестве потенциальных инструментов исследования молекулярных механизмов функционирования ионных каналов.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, посвященных изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Целью настоящего исследования являлось получение, структурно-функциональный анализ и изучение природы разнообразия полипептидов Кунитц-типа актинии Н. crispa. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Выделить и охарактеризовать новые полипептиды, проявляющие трипсинингибирующую активность, установить полноразмерные последовательности кодирующих их кДНК.

2. Установить первичные структуры зрелых HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептидов, провести их структурно-функциональный и филогенетический анализ.

3. Установить структурную организацию генов полипептидов Кунитц-типа.

4. Создать экспрессионные конструкции некоторых полипептидов и провести их гетерологичную экспрессию в Escherichia coli. Получить функционально активный рекомбинантный полипептид.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Природа создала стратегию управления протеолизом белковых компонентов в клетках и организмах, которая включает пространственное и временное регулирование транскрипции генов, активации зимогенов, деградации протеиназ, а также ингибирование протеиназ специфичными ингибиторами белковой природы [1, 2]. Любое нарушение регуляции активности протеиназ вызывает изменения гомеостаза биологической системы и может приводить к полному протеолизу ее компонентов [1]. Ключевые регуляторные функции ингибиторов протеиназ позволяют использовать эти соединения в качестве инструментов исследования структурно-функциональных взаимосвязей в ферментных системах, системах мембранного транспорта, модельных системах для изучения белок-белковых взаимодействий, а также для создания лекарственных препаратов направленного действия при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеолитических ферментов [2, 3, 4]. Они находят применение в различных областях медицины в качестве противовирусных, противобактериальных, противопаразитарных, противогрибковых и противоопухолевых агентов, а также регуляторов системы гомеостаза, в частности иммунной [3]. Богатым источником ингибиторов белковой природы являются яды животных. В настоящем обзоре будут проанализированы данные о строении, функции и эволюции ингибиторов сериновых протеиназ Кунитц-типа, продуцируемых ядовитыми организмами.

5. ВЫВОДЫ

1. Выделены и функционально охарактеризованы три новых полипептида Кунитц-типа актинии H. crispa, HCPG, HCPR1 и HCPR2. На основе N-концевых аминокислотных последовательностей полипептиды отнесены к группе ранее исследованных HCGS-полипептидов, а также новой группе HCRG-полипептидов актинии. Установлены полноразмерные последовательности HCGS- и HCRG-полипептидов, характеризующиеся высокой степенью гомологии.

2. Установлено, что ингибитор HCPG является бифункциональным полипептидом, проявляющим, наряду с трипсинингибирующей активностью, анальгетическое действие на тепловой модели in vivo. Показано, что трипсинингибирующая активность полипептидов HCPR1 и HCPR2 на порядок выше активности ранее изученных ингибиторов протеиназ Я. crispa.

3. Установлена первичная структура зрелых 33-х HCGS-, 33-х HCRG- и шести НСТХ-полипептидов, которые образуют комбинаторную библиотеку полипептидов Кунитц-типа, близких по структуре, но отличающихся физико-химическими характеристиками и функциональной активностью. Комбинаторная библиотека представлена десятью мажорными и 23-мя минорными изоформами HCGS, двумя основными и 31-й минорной изоформами HCRG и двумя мажорными и четырьмя минорными изоформами НСТХ.

4. Впервые установлено, что HCGS-, HCRG- и НСТХ-полипептиды кодируются разными мультигенными семействами, и доказано, что их гены имеют экзон-интронную организацию: интрон разделяет высоко консервативную и вариабельную области гена.

5. Показано, что представители комбинаторной библиотеки Я. crispa формируют на филогенетическом дереве четыре кластера: три из них представлены HCGS-/HCRG-полипептидами и один - НСТХ.

6. Установлено, что появление положительно заряженного Pi Lys и полярного Pi Thr в реактивном сайте способствовало субфункционализации и неофункционализации полипептидов Кунитц-типа, а действие ускоренной эволюции на их гены в рамках отдельного вида Я. crispa привело к появлению комбинаторной библиотеки.

7. Созданы генетические конструкции для экспрессии представителей разных групп

HCGS-полипептидов. Получен функционально активный рекомбинантный

110 полипептид, идентичный по физико-химическим характеристикам и величине активности природному ингибитору протеиназ.

Заключение

Суммируя вышесказанное, можно отметить, что полипептиды Кунитц-типа широко представлены среди как наземных, так и морских ядовитых организмов и являются компонентами не только ядов, но и секрета кожи. Они проявляют разнообразные виды биологической активности, действуют на различные биологические мишени, могут играть важную роль в выживании животных, защите от деградации полипептидных токсинов и других белковых компонентов яда и/или в формировании синергетического эффекта действия компонентов яда. Согласно литературным данным ряд полипептидных молекул с разнообразными функциями, продуцируемых ядовитыми организмами, имеют Кунитц-фолд. Таким образом, природа «отбирала» этот мотив как общий каркас для проявления различных видов биологической активности. Установлено, что в некоторых организмах полипептиды Кунитц-типа продуцируются в виде многочисленных изоформ. В настоящее время эти соединения представляют фундаментальный интерес, заключающийся в получении на их основе высокоспецифичных инструментов исследования различных биологических мишеней и создания лекарственных препаратов нового поколения.

1. Farady C.J., Craik C.S. Mechanisms of macromolecular protease inhibitors // ChemBioChem. 2010. V. 11. P. 2341-2346.

2. Scott C.J., Taggart C.C. Biologic protease inhibitors as novel therapeutic agents // Biochimie. 2010. V. 92, N 11. P. 1681-1688.

3. Joanitti G.A., Freitas S.M., Silva L.P. Proteinaceous protease inhibitors: structural features and multiple functional faces // Current Enzyme Inhibition. 2006. V. 2, N 3. P. 199-217.

4. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Eur. J. Biochem. 1992. V. 204, N 2. P. 433-451

5. Di Cera E. Serine proteases // IUBMB Life. 2009 V. 61, N 5. P. 510-515.

6. Rawlings N.D., Morton F.R., Kok C.Y., Kong J., Barrett A.J. MEROPS: the peptidase database // Nucleic Acids Res. 2008. V. 36. P. D320-D325.

7. Rawlings N.D. Peptidase inhibitors in the MEROPS database // Biochimie. 2010. V. 92. P.1463-1483.

8. Lesk A.M., Fordham W.D. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family // J. Mol. Biol. 1996. V. 258, N 3. P. 501-537.

9. Siezen R.J., Leunissen J.A. Subtilases: the superfamily of subtilisin-like serine proteases // Protein Sci. 1997. V. 6, N 3. P. 501-523.

10. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B., Frolow F., Franken S.M., Harel M., Remington S.J., Silman I., Schrag J., Sussman J.L., Verschueren K.H.G., Goldman A. The ct/p hydrolase fold // Protein Eng. 1992. V. 5, N 3. P. 197-211.

11. Page M.J., Di Cera E. Serine peptidases: classification, structure and function // Cell Mol. Life. Sci. 2008. V. 65. P. 1220-1236.

12. Fehlhammer H., Bode W. The refined crystal structure of bovine /3-trypsin at 1.8 A resolution. I. Crystallization, data collection and application of patterson search technique // J. Mol. Biol. 1975. V. 98. P. 683-692.

13. Blow D.M. Structure and mechanism of chymotrypsin // Acc. Chem. Res. 1976. V. 9, N4. P. 145-152.

14. Dodson G., Wlodawer A. Catalytic triads and their relatives // Trends Biochem. Sci. 1998. V. 23, N9. P. 347-352.

15. Krem M.M., Di Cera E. Molecular markers of serine protease evolution // EMBO J. 2001. V. 20, N 12. P. 3036-3045.

16. Apostoluk W., Otlewski J. Variability of the canonical loop conformations in serine proteinases inhibitors and other proteins // Proteins. 1998 V. 32, N 4. P. 459-474.

17. Krowarsch D., Cierpicki Т., Jelen F., Otlewski J. Canonical protein inhibitors of serine proteases // Cell. Mol. Life Sci. 2003. V. 60. P. 2427-2444.

18. Zani M.L., Moreau T. Phage display as a powerful tool to engineer protease inhibitors // Biochimie. 2010. V. 92, N 11. P. 1689-1704.

19. Rawlings N.D., Tolle D.P., Barrett A.J. Evolutionary families of peptidase inhibitors // Biochem. J. 2004. V. 378. P. 705-716.

20. Laskowski M.J., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Ann. Rev. Biochem. 1980. V. 49. P. 593-626.

21. Read R.J., James M.N. Introduction to protein inhibitors: X-ray crystallography. In Protease Inhibitors (Barrett, A. J. & Salvesen, G., eds). Elsevier Science Publishers, Amsterdam. 1986. P. 301-336.

22. Laskowski M., Qasim M.A. What can the structure of enzyme-inhibitor complex tell us about the structure of enzyme substrate complexes? // Biochim. et Biophys. Acta. 2000. V. 1477, N 1-2. P. 324-337.

23. Schechter I., Berger A. On the size of the active site in proteases. I. Papain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1967. V. 27. P. 157-162.

24. Мосолов В.В. Ингибиторы белковой природы протеолитических ферментов // Биоорг. химия. 1994. Т. 20, № 2. С. 153-160.

25. Czapinska H., Otlewski J. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases // Eur. J. Biochem. 1999. V. 260. P. 571-595.

26. Kraunsoe J.A., Claridge T.D., Lowe G. Inhibition of human leukocyte and porcine pancreatic elastase by homologues of bovine pancreatic trypsin inhibitor // Biochemistry. 1996. V.35.P. 9090-9096.

27. Gherardini P.F., Wass M.N., Helmer-Citterich M., Sternberg M.J. Convergent evolution of enzyme active sites is not a rare phenomenon // J. Mol. Biol. 2007. V. 372, N 3. P. 817-845.

28. Cardie L., Dufton M.J. Foci of amino acid residue conservation in the 3D structures of the Kunitz BPTI proteinase inhibitors: how do variants from snake venom differ? // Protein Eng. 1997. V. 10, N 2. P. 131-136.

29. Pritchard L., Dufton M.J. Evolutionary trace analysis of the Kunitz/BPTI family of proteins: functional divergence may have been based on conformational adjustment // J. Mol. Biol. 1999. V. 285, N 4. P. 1589-1607.

30. Kunitz M., Northrop J.H. Isolation from beef pancreas crystalline trypsinogen, trypsin, a trypsin inhibitors and an inhibitors trypsin compound // J. Gen. Physiol. 1936. V. 19. P. 991-1001.

31. Ascenzi P., Bocedi A., Bolognesi M., Spallarossa A., Coletta M., De Cristofaro R., Menegatti E. The bovine basic pancreatic trypsin inhibitor (Kunitz inhibitor): a milestone protein // Curr. Protein Peptide Sci. 2003. V. 4. P. 231-251.

32. Sun Z., Lu W., Jiang A., Chen J., Tang F., Liu J.N. Expression, purification and characterization of aprotinin and a human analogue of aprotinin // Protein Expr. Purif. 2009. V. 65, N2. P. 238-243.

33. Zhao R., Dai H., Qiu S., Li T., He Y., Ma Y., Chen Z., Wu Y., Li W., Cao Z. SdPI, the first functionally characterized Kunitz-type trypsin inhibitor from scorpion venom // PLoS One. 2011. V. 6, N 11. P. e27548.

34. You D., Hong J., Rong M., Yu H., Liang S., Ma Y., Yang H., Wu J., Lin D., Lai R. The first gene-encoded amphibian neurotoxin // J. Biol. Chem. 2009. V. 284, N 33. P. 22079-22086.

35. Hu H., Bandyopadhyay P.K., Olivera B.M., Yandell M. Characterization of the Conus bullatus genome and its venom-duct transcriptome // BMC Genomics. 2011. V. 12. P. 60.

36. Helland R., Otlewski J., Sundheim O., Dadlez M., Smalas A.O. The crystal structures of the complexes between bovine beta-trypsin and ten Pi variants of BPTI //J. Mol. Biol. 1999. V. 287, N 5. P. 923-942.

37. Buczek O., Koscielska-Kasprzak K., Krowarsch D., Dadlez M., Otlewski J. Analysis of serine proteinase-inhibitor interaction by alanine shaving // Protein Sci. 2002. V. 11, N 4. P. 806-819.

38. Czapinska H., Helland R., Smalas A.O., Otlewski J. Crystal structures of five bovine chymotrypsin complexes with P, BPTI variants // J. Mol. Biol. 2004. V. 344, N 4. P. 10051020.

39. Marquart M., Walter J., Deisenhofer J., Bode W., Huber R. The geometry of the reactive site and of the peptide groups in trypsin, trypsinogen and its complexes with inhibitors // Acta Crystallogr. 1983. V. 39. P. 480.

40. Узденский А.Б. Ионные каналы в биологических мембранах. Учебное пособие. Ростов-на Дону: Южный федеральный университет, 2008. 44 с.

41. Димитриев Д.А., Сапёрова Е.В. Электрофизиология кардиомиоцита. Учебное пособие. Чебоксары: Чуваш, гос. пед. ун-т, 2009. 102 с.

42. Кодиров С.А., Журавлев В.Л., Сафонова Т.А., Курилова Л.С., Крутецкая З.И. Суперсемейство потенциалзависимых К+-каналов: структура, функции и патология // Цитология. 2010. Т. 52, № 9. С. 697-714.

43. Yu F.H., Catterall W.A. Overview of the voltage-gated sodium channel family // Genome Biology. 2003. V. 4, N. 3. P. 207.

44. Waxman S.G. Transcriptional channelopathies: an emerging class of disorders // Nat. Rev. Neurosci. 2001. V. 2, N. 9. P. 652-659.

45. Василевский A.A., Козлов C.A., Гришин Е.В. Молекулярное разнообразие яда пауков // Успехи биологической химии. 2009. Т. 49. С. 211-274.

46. Bohlen C.J., Priel A., Zhou S., King D., Siemens J., Julius D. A bivalent tarantula toxin activates the capsaicin receptor, TRPV1, by targeting the outer pore domain // Cell. 2010. V. 141, N5. P. 834-845.

47. Wang J.M., Roh S.H., Kim S., Lee C.W., Kim J.I., Swartz K.J. Molecular surface of tarantula toxins interacting with voltage sensors in K(v) channels // J. Gen. Physiol. 2004. V. 123, N4. P. 455-467.

48. Mouhat S., Jouirou В., Mosbah A., De Waard M., Sabatier J.M. Diversity of folds in animal toxins acting on ion channels // Biochem. J. 2004. V. 378. P. 717-726.

49. Mebs D. Toxicity in animals. Trends in evolution? // Toxicon. 2001. V. 39, N 1. P. 87-96.

50. Olivera B.M., Hillyard D.R., Marsh M., Yoshikami D. Combinatorial peptide libraries in drug design: lessons from venomous cone snails // Trends Biotechnol. 1995. V. 13, N 10. P. 422-426.

51. Froy O., Sagiv T., Poreh M., Urbach D., Zilberberg N., Gurevitz M. Dynamic diversification from a putative common ancestor of scorpion toxins affecting sodium, potassium, and chloride channels // J. Mol. Evol. 1999. V. 48. P. 187-196.

52. Escoubas P., Rash L. Tarantulas: eight-legged pharmacists and combinatorial chemists // Toxicon. 2004. V. 43. P. 555-574.

53. Sollod B.L., Wilson D., Zhaxybayeva O., Gogarten J.P., Drinkwater R., King G.F. Were arachnids the first to use combinatorial peptide libraries? // Peptides. 2005. V. 26. P. 131-139.

54. Fry B.G. From genome to «venome»: molecular origin and evolution of the snake venom proteome inferred from phylogenetic analysis of toxin sequences and related body proteins // Genome Res. 2005. V. 15, N 3. P. 403^20.

55. Escoubas P. Molecular diversification in spider venoms: a web of combinatorial peptide libraries // Mol. Divers. 2006. V. 10. P. 545-554.

56. Kozminsky-Atias A., Bar-Shalom A., Mishmar D., Zilberberg N. Assembling an arsenal, the scorpion way // BMC Evol. Biol. 2008. V. 8. P. 333-346.

57. Wang Y., Yap L.L., Chua K.L., Khoo H.E. A multigene family of Heteractis magnificalysins (HMgs) // Toxicon. 2008. V. 51. P. 1374-1382.

58. Duda T.F., Palumbi S.R. Molecular genetics of ecological diversification: duplication and rapid evolution of toxin genes of the venomous gastropod Conus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96, N 12. P. 6820-6823.

59. Kordis D., Gubensek F. Adaptive evolution of animal toxin multigene families // Gene. 2000. V. 261, N 1. P. 43-52.

60. Duda T.F., Palumbi S.R. Evolutionary diversification of multigene families: allelic selection of toxins in predatory cone snails // Mol. Biol. Evol. 2000. V. 17. P. 1286-1293.

61. Zupunski V., Kordis D., Gubensek F. Adaptive evolution in the snake venom Kunitz/BPTI protein family // FEBS Lett. 2003. V. 547. P. 131-136.

62. Zhu S., Bosmans F., Tytgat J. Adaptive evolution of scorpion sodium channel toxins // J. Mol. Evol. 2004. V. 58. P. 145-153.

63. Ma Y., He Y., Zhao R., Wu Y., Li W., Cao Z. Extreme diversity of scorpion venom peptides and proteins revealed by transcriptomic analysis: implication for proteome evolution of scorpion venom arsenal // J. Proteomics. 2012. V. 75, N 5. P. 1563-1576.

64. Wong E.S., Belov K. Venom evolution through gene duplications // Gene. 2012. V. 496, N l.P. 1-7.

65. St Pierre L., Earl S.T., Filippovich I., Sorokina N., Masci P.P., De Jersey J., Lavin M.F. Common evolution of waprin and kunitz-like toxin families in australian venomous snakes // Cell Mol. Life Sci. 2008. V. 65. P. 4039^1054.

66. He Y-Y., Liu S.B., Lee W.H., Qian J.Q., Zhang Y. Isolation, expression and characterization of a novel dual serine protease inhibitor, OH-TCI, from king cobra venom // Peptides. 2008. V. 29, N 10. P. 1692-1699.

67. Lu J., Yang H., Yu H., Gao W., Lai R., Liu J., Liang X. A novel serine protease inhibitor from Bungarus fasciatus venom // Peptides. 2008. V. 29, N 3. P. 369-374.

68. Strydom D.J. Protease inhibitors as snake venom toxins // Nature New Biol. 1973. V. 243, N 124. P. 88-89.

69. Gilquin B., Lecoq A., Desne F., Guenneugues M., Zinn-Justin S., Menez A. Conformational and functional variability supported by the BPTI fold: Solution structure of the Ca2+ channel blocker calcicludine // Proteins. 1999. V. 34, N 4. P. 520-532.

70. Stotz S.C., Spaetgens R.L., Zamponi G.W. Block of voltage-dependent calcium channel by the green mamba toxin calcicludine // J. Membr. Biol. 2000. V. 174, N 2. P. 157-165.

71. Wang X., Du L., Peterson B.Z. Calcicludine binding to the outer pore of L-type calcium channels is allosterically coupled to dihydropyridine binding // Biochemistry. 2007. V. 46, N 25. P. 7590-7598.

72. Harvey A.L. Twenty years of dendrotoxins // Toxicon. 2001. V. 39, N. 1. P. 15-26.

73. Skarzynski T. Crystal structure of alpha-dendrotoxin from the green mamba venom and its comparison with the structure of bovine pancreatic trypsin inhibitor // J. Mol. Biol. 1992. V. 224, N3. P. 671-683.

74. Foray M.F., Lancelin J.M., Hollecker M., Marion D. Sequence-specific 1H-NMR assignment and secondary structure of black mamba dendrotoxin I, a highly selective blocker of voltage-gated potassium channels // Eur. J. Biochem. 1993. V. 211, N 3. 813— 820.

75. Berndt K.D., Guntert P., Wuthrich K. Nuclear magnetic resonance solution structure of dendrotoxin K from the venom of Dendroaspis polylepis polylepis II J. Mol. Biol. 1993. V. 234. P. 735-750.

76. Katoh E., Nishio H., Inui T., Nishiuchi Y., Kimura T., Sakakibara S., Yamazaki T. Structural basis for the biological activity of dendrotoxin-I, a potent potassium channel blocker // Biopolymers. 2000. V. 54, N 1. P. 44-57.

77. Yoshida S., Matsumoto S. Effects of alpha-dendrotoxin on K+ currents and action potentials in tetrodotoxin-resistant adult rat trigeminal ganglion neurons // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005. V. 314, N 1. P. 437^145.

78. Peigneur S., Billen B., Derua R., Waelkens E., Debaveye S., Beress L., Tytgat J. A Afunctional sea anemone peptide with Kunitz type protease and potassium channel inhibiting properties // Biochem. Pharmacol. 2011. V. 82, N 1. P. 81-90.

79. Bogin O. Venom toxins as ion channel research tools // Modulator. 2006. N 21. P. 28-31.

80. Harvey A.L. Recent studies on dendrotoxins and potassium ion channels // Gen. Pharmacol. 1997. V. 28. P. 7-12.

81. Harvey A.L., Robertson B. Dendrotoxins: structure-activity relationships and effects on potassium ion channels // Curr. Med. Chem. 2004. V. 11. P. 3065-3072.

82. Jin L., Wu Y. Molecular mechanism of 5-dendrotoxin-potassium channel recognition explored by docking and molecular dynamic simulations // J. Mol. Recognit. 2011. V. 24, N. l.P. 101-107.

83. Doley R., Kini R.M. Protein complexes in snake venom // Cell. Mol. Life Sci. 2009. V. 66. P. 2851-2871.

84. Kwong P.D., McDonald N.Q., Sigler P.B., Hendrickson W.A. Structure of beta 2-bungarotoxin: potassium channel binding by Kunitz modules and targeted phospholipase action// Structure. 1995. V. 3. P. 1109-1119.

85. Benishin C.G. Potassium channel blockade by the B subunit of beta-bungarotoxin // Mol. Pharmacol. 1990. V. 38. P. 164-169.

86. Yuan C.H., He Q.Y., Peng K., Diao J.B., Jiang L.P., Tang X., Liang S.P. Discovery of a distinct superfamily of Kunitz-type toxin (KTT) from tarantulas // PLoS One. 2008. V. 3, N. 10. P. e3414.

87. Possani L.D., Rodriguez de la Vega R.C. Scorpion venom peptides. In Handbook of Biologically Active Peptides Edited by: Kastin AJ. San Diego, Academic Press. 2006. P. 339-354.

88. Schwartz E.F., Diego-Garcia E., Rodriguez de la Vega R.C., Possani L.D. Transcriptome analysis of the venom gland of the Mexican scorpion Hadrurus gertschi (Arachnida: Scorpiones) // BMC Genomics. 2007. V. 8. P. 119.

89. Schweitz H., Bruhn Т., Guillemare E., Moinier D., Lancelin J.M., Beress L., Lazdunski M. Kalicludines and kaliseptine. Two different classes of sea anemone toxins for voltage sensitive K+ channels // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N 42. P. 25121-25126.

90. Bevins C.L., Zasloff M. Peptides from frog skin // Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 395-414.

91. Conlon J.M., Kim J.B. A protease inhibitor of the Kunitz family from skin secretions of the tomato frog, Dyscophus guineti (Microhylidae) // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000. V. 279, N 3. P. 961 -964.

92. Ibrahim H.R., Aoki Т., Pellegrini A. Strategies for new antimicrobial proteins and peptides: lysozyme and aprotinin as model molecules // Curr. Pharm. Des. 2002. V. 8, N 9. P. 671-693.

93. Pellegrini A., Thomas U., von Fellenberg R., Wild P. Bactericidal activities of lysozyme and aprotinin against gram-negative and gram-positive bacteria related to their basic character // J. Appl. Bacterid. 1992. V. 72, N 3. P. 180-187.

94. Wei L., Dong L., Zhao Т., You D., Liu R., Liu H., Yang H., Lai R. Analgesic and anti-inflammatory effects of the amphibian neurotoxin, anntoxin // Biochimie. 2011. V. 93, N 6. P. 995-1000.

95. Dib-Hajj S.D., Black J.A., Waxman S.G. Voltage-gated sodium channels: therapeutic targets for pain // Pain Med. 2009. V. 10. P. 1260-1269.

96. Dib-Hajj S.D., Cummins T.R., Black J.A., Waxman S.G. Sodium channels in normal and pathological pain // Annu. Rev. Neurosci. 2010. V. 33. P. 325-347.

97. Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. а-Конотоксины в исследовании структуры и функций никотиновых рецепторов // Успехи биологической химии. 2009. Т. 49. С. 275-318.

98. Dy C.Y., Buczek P., Imperial J.S., Bulaj G., Horvath M.P. Structure of conkunitzin-Sl, a neurotoxin and Kunitz-fold disulfide variant from cone snail // Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 2006. V. 62. P. 980-990.

99. Elliger C.A., Richmond T.A., Lebaric Z.N., Pierce N.T., Sweedler J.V., Gilly W.F. Diversity of conotoxin types from Conus californicus reflects a diversity of prey types and a novel evolutionary history // Toxicon. 2011. V. 57, N 2. P. 311-322.

100. Macek P. Polipeptide cytolytic toxins from sea anemones (Actinaria) // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. V. 5. P. 121-129.

101. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxicon. 2002. V. 40. P. 111-124.

102. Ishida M., Minagawa S., Miyauchi K., Shimakura K., Nagashima Y., Shiomi K. Amino acid sequences of Kunitz-type protease inhibitors from the sea anemone Actinia equina // Fish. Sci. 1997. V. 63. P. 794-798.

103. Minagawa S., Sugiyama M., Ishida M., Nagashima Y., Shiomi K. Kunitz-type protease inhibitors from acrorhagi of three species of sea anemones // Сотр. Biochem. Physiol. B. 2008. V. 150. P. 240-245.

104. Wunderer G., Machleidt W., Fritz H. The broad-specificity proteinase inhibitor 5 II from the sea anemone Anemonia sulcata II Methods. Enzymol. 1981. V. 80. P. 816-820.

105. Minagawa S., Ishida M., Shimakura K., Nagashima Y., Shiomi K. Isolation and amino acid sequences of two Kunitz-type protease inhibitors from the sea anemone Anthopleura aff. xanthogrammica II Сотр. Biochem. Physiol. B. 1997. V. 118. P. 381-386.

106. Minagawa S., Ishida M., Shimakura K., Nagashima Y., Shiomi K. Amino acid sequence and biological activities of another Kunitz-type protease inhibitor from the sea anemonq Anthopleura aff. xanthogrammica II Fish. Sci. 1998. V. 64. P. 157-161.

107. Зыкова T.A., Винокуров JI.M., Маркова Л.Ф., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность ингибитора трипсина IV из Radianthus macrodactylus II Биоорг. химия. 1985. Т. 11, С. 293-301.

108. Сокотун И.Н., Ильина А.П., Монастырная М.М., Лейченко Е.В., Еськов А.А., Анастюк С.Д., Козловская Э.П. Ингибиторы протеиназ тропической актинии Radianthus macrodactylus: выделение и характеристика // Биохимия. 2007. Т. 72, вып. 3. С. 368-374.

109. Гладких И.Н. Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus: Диссертация канд. хим. наук. Владивосток. 2008. 109 с.

110. Козлов C.A., Андреев Я.А., Мурашев A.H., Скобцов Д.И., Дьяченко И.А., Гришин Е.В. Новые полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa II Биоорг. химия. 2009. Т. 35. С. 789-798.

111. Honma Т., Kawahata S., Ishida М., Nagai Н., Nagashima Y., Shiomi К. Novel peptide toxins from the sea anemone Stichodactyla haddoni II Peptides. 2008. V. 29. P. 536-544.

112. Antuch W., Berndt K.D., Chavez M.A., Delfin J., Wuthrich K. The NMR solution structure of a Kunitz-type proteinase inhibitor from the sea anemone Stichodactyla helianthus И Eur. J. Biochem. 1993. V. 212. P. 675-684.

113. Андреев Я. А. Исследование природных модуляторов функциональной активности TRPV1 рецепторов: Диссертация канд. биол. наук. Москва. 2009. 109 с.

114. Honma Т., Shiomi К. Peptide toxins in sea anemones: structural and functional aspects // Mar. Biotechnol. 2006. V. 8, N 1. P. 1-10.

115. Kozlov S., Grishin E. The mining of toxin-like polypeptides from EST database by single residue distribution analysis // BMC Genomics. 2011. V. 12. P. 88.

116. Mebs D., Gebauer E. Isolation of proteinase inhibitory, toxic and hemolytic polypeptides from the sea anemone Stoichactis sp. // Toxicon. 1980. V. 18. P. 97-106.

117. Lewis S.M. Evolution of immunoglobulin and T-cell receptor gene assembly // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1999. V. 870. P. 58-67.

118. Cooper M.D., Alder M.N. The evolution of adaptive immune systems // Cell. 2006. V. 124, N4. P. 815-822.

119. Niimura Y. Olfactory receptor genes: evolution // Encyclopedia of life sciences. 2008. P. 1-9.

120. Kishida T. Pattern of the divergence of olfactory receptor genes during tetrapod evolution // PLoS One. 2008. V. 3, N 6. P. e2385.

121. Lundell N., Schreitmuller T. Sample preparation for peptide mapping a pharmaceutical quality-control perspective // Analytical Biochem. 1999. V. 266, N 1. P. 3147.

122. Монастырная M.M., Зыкова Т.А., Козловская Э.П. Выделение и характеристика высокомолекулярных цитолизинов морской актинии Radianthus macrodactylus II Биоорг. химия. 1998. Т. 25, № 10. С. 733-741.

123. Вакорина Т.И., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Конформационная стабильность ингибитора сериновых протеиназ InhVJ из актинии Heteractis crispa II Биоорг. химия. 2011. Т. 37, № 3. С. 310-318.

124. Монастырная М.М., Чаусова В.Е., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Козловская Э.П. Способ получения полипептида из актинии Heteractis crispa, обладающего анальгетическим действием // Патент РФ №2415866. БИ. №10. 10.04.2011.

125. Matz M.V., Alieva N.O., Chenchik A., Lukyanov S. Amplification of cDNA ends using PCR suppression effect and step-out PCR // Methods Mol. Biol. 2003. V. 221. P. 4149.

126. Il'ina A., Lipkin A., Barsova E., Issaeva M., Leychenko E., Guzev K., Monastyrnaya M., Lukyanov S., Kozlovskaya E. Amino acid sequence of RTX-A's isoform actinoporin from the sea anemone, Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2006. V. 47. P. 517-520.

127. Anderluh G., Podlesek Z., Macek P. A common motif in proparts of Cnidarian toxins and nematocyst collagens and its putative role // Biochem Biophys Acta. 2000. V. 1476. P. 372-376.

128. Castaneda O, Harvey AL. Discovery and characterization of cnidarian peptide toxins that affect neuronal potassium ion channels // Toxicon. 2009. V. 54, N 8. P. 1119-1124.

129. Зыкова Т.А. Исследование первичной структуры биологически активных пептидов актинии Radianthus macrodactylus: Диссертация канд. хим. наук. Владивосток. 1987. 130 с.

130. Richter S., Wenzel A., Stein М., Gabdoulline R. R., Wade R.C. webPIPSA: a web server for the comparison of protein interaction properties // Nucleic Acid Res. 2008. V. 36. P.276-280.

131. Uechi G., Toma H., Arakawa Т., Sato Y. Molecular characterization on the genome structure of hemolysin toxin isoforms isolated from sea anemone Actineria villosa and Phyllodiscus semoni // Toxicon. 2010. V. 56. P. 1470-1476.

132. Gendeh G.S., Chung M.C., Jeyaseelan K. Genomic structure of a potassium channel toxin from Heteractis magnifica IIFEBS Lett. 1997. V. 418. P. 183-188.

133. Jiang L., Chen J., Peng L., Zhang Y., Xiong X., Liang S. Genomic organization and cloning of novel genes encoding toxin-like peptides of three superfamilies from the spider Orinithoctonus huwena II Peptides. 2008. V. 29, N 10. P. 1679-1684.

134. Conticello S.G., Gilad Y., Avidan N., Ben-Asher E., Levy Z., Fainzilber M. Mechanisms for evolving hypervariability: the case of conopeptides // Mol. Biol. Evol. 2001. V. 18. P. 120-131.

135. Conticello S.G., Pilpel Y., Glusman G., Fainzilber M. Position-specific codon conservation in hypervariable gene families // Trends Genet. 2000. V. 16. P. 57-59.

136. Nei M., Rooney A.P. Concerted and birth-and-death evolution of multigene families // Annu. Rev. Genet. 2005. V. 39. P. 121-152.

137. Christeller J.T. Evolutionary mechanisms acting on proteinase inhibitor variability // FEBS J. 2005. V. 272, N 22. P. 5710-5722.

138. Rose Т., Di Cera E. Substrate recognition drives the evolution of serine proteases // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 19243-19246.

139. Rudolph R. Successful protein folding on an industrial scale. Protein engineering: principles and practice. New York: Wiley-Liss. 1996. P. 283-298.

140. Berndt C., Lillig C.H., Holmgren A. Thioredoxins and glutaredoxins as facilitators of protein folding // Biochim. Biophys. Acta. 2008. V. 1783, N 4. P. 641-650.

141. Yasukawa Т., Kanei-Ishii C., Maekawa Т., Fujimoto J., Yamamoto Т., Ishii S. Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin // J. Biol. Chem. 1995 V. 270, N 43. P. 25328-25331.

142. McCoy J., Lavallie E. Expression and purification of thioredoxin fusion proteins // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2001. Chapter 16: Unit 16.8.

143. Novagen. pET System Manual. 2008. 11th edition.

144. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Vassilevski A.A., Grishin E.V. Cyanogen bromide cleavage of proteins in salt and buffer solutions // Anal. Biochem. 2010. V. 407, N 1. P. 144-146.

145. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты // Изд. Иностр. Лит. М. 1961. С. 31.

146. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. V. 227, N. 5259. P. 680-685.

147. Thalhammer J.G., Vladimirova M., Bershadsky B., Strichartz G.R. Neurologic evolution of the rat during sciatic nerve block with lidocaine // Anesthesiology. 1995. V. 82. P. 1013-1025.

148. Monastyrnaya M.M., Zykova T.A., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus II Toxicon. 2002. V. 40. P. 1197-1217.

149. Lowry O.H., Rosebrrough N.J., Fearr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193, N 1. P. 265-275.

150. Sambrook J., Russel D.W. Molecular cloning: a laboratory manual (third edition) // Cold Spring Harbor, New York. 2001. P. 16.33-16.36.

151. Bas D.C., Rogers D.M., Jensen J.H. Very fast prediction and rationalization of pKa values for protein-ligand complexes // Proteins. 2008. V. 73. P. 765-783.

152. Arnold K., Bordoli L., Kopp J., Schwede T. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modeling // Bioinformatics. 2006. V. 22. P. 195-201.

153. Kiefer F., Arnold K., Kiinzli M., Bordoli L., Schwede T. The SWISS-MODEL Repository and associated resources // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. P. 387-392.

154. Laskowski R.A., MacArthur M.W., Moss D.S., Thornton J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures // J. App. Cryst. 1993. V. 26. P. 283-291.

155. Laskowski R.A., Rullman J.A., MacArthur M.W., Kaptein R., Thornton J.M. AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR // J. Biomol. NMR. 1996. V. 8. P. 477-486.

156. Peitsch M.C. Protein modeling by E-mail // Nat. Biotechnol. 1995. V. 13. P. 658660.

157. Koradi R., Billeter M., Wiithrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of macromolecular structures // J. Mol. Graph. 1996. V. 14. P. 51-55.

158. De Rienzo F., Gabdoulline R.R., Menziani M.C., De Benedetti P.G., Wade R.C. Electrostatic analysis and Brownian dynamics simulation of the association of plastocyanin and cytochrome ill Biophys. J. 2001. V. 81. P. 3090-3104.