Поиск природных лигандов протонактивируемых рецепторов

Осмаков, Дмитрий Игоревич

Поиск природных лигандов протонактивируемых рецепторов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Осмаков, Дмитрий Игоревич АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Москва МЕСТО ЗАЩИТЫ

2013 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Поиск природных лигандов протонактивируемых рецепторов»

Автореферат диссертации на тему "Поиск природных лигандов протонактивируемых рецепторов"

Осмаков Дмитрий Игоревич

ПОИСК ПРИРОДНЫХ ЛИГАНДОВ ПРОТОНАКТИВИРУЕМЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

31 ОКТ 2013

Москва-2013

005536818

Работа выполнена в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Научный руководитель: Гришин Евгений Васильевич

академик, доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты: Уткин Юрий Николаевич

доктор химических наук, профессор, руководитель лаборатории молекулярной токсинологии ИБХ РАН;

Теренин Илья Михайлович

кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории регуляции синтеза белка Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ им. М. В. Ломоносова.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук

Защита диссертации состоится в !{?ч 20 ноября 2013 г. на заседании диссертационного совета Д.002.019.01, на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук по адресу: 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Автореферат разослан октября 2013.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор физико-математических наук

В.А. Олейников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Неприятные болевые ощущения и в первую очередь хронические болевые синдромы значительно снижают качество жизни людей. Они часто вызывают физические и эмоциональные страдания, сопровождающиеся депрессией, подавленным настроением и чувством безнадежности. Детальные механизмы возникновения патологических болей до конца не выяснены, но известен ряд клеточных рецепторов, отвечающих за восприятие болевых стимулов и генерацию болевых ощущений. По современным представлениям одними из важнейших рецепторов болевого каскада являются кислоточувствительные ионные каналы (ASICs). Было показано, что они ответственны за восприятие снижения рН в тканях (состояние, называемое ацидоз), которое может происходить как в норме (при накоплении молочной кислоты в связи с усилением анаэробного метаболизма глюкозы и высвобождении протонов при гидролизе АТФ), так и при патологии (воспалительные процессы в тканях, ишемический инсульт, черепно-мозговая травма, опухоли, повреждение тканей и эпилептический припадок).

Впервые, рецепторы нервных клеток, способные воспринимать экстрацеллюлярное снижение рН, были обнаружены в лаборатории под руководством О. Кришталя еще в 1980 году. Однако клонированы и охарактеризованы данные рецепторы были только в 1997 году группой под руководством М. Лаздунского. Каналы ASIC относятся к надсемейству амилорид-чувствительных дегенерин/эпителиальных (DEG/ENaC) №+-канапов и представлены в организме в виде 6 изоформ: ASIC la, lb, 2а, 2Ь, 3 и 4. Они в большом количестве встречаются в нейронах центральной нервной системы, где было обнаружено по крайней мере три (ASICla, ASIC2a и ASIC2b) из шести субъединиц. Из всех субъединиц, представленных в мозге, ASIC 1а является основной. Показано, что ASIC 1а и ASIC2 принимают непосредственное участие в процессах синаптической пластичности, обучении, передаче нервного возбуждения, ишемических процессах, эпилепсии, кислотоопосредованного нейронального повреждения.

В нейронах периферической нервной системы в основном представлены ASIC3 и Л51СЗ-содержащис каналы. Способность этих каналов воспринимать сигналы в виде небольшого снижения рН внеклеточной среды (до значений 7.0 - 6.7), интегрировать различные воспалительные и ишемические стимулы, такие как АТФ, молочная и арахидоновая кислоты, повышение осмотического давления, позволяет рассматривать ASIC3 в качестве основных участников процесса развития боли. Характерной особенностью при активации ASIC3 является их способность проводить токи двух видов - быстрые, инактивирующиеся в течение нескольких миллисекунд, и медленные, продолжительностью в

несколько десятков секунд. Для периферических ASIC3 каналов было показано, что они: а) участвуют в восприятии кислотоопосредованной, воспалительной и постоперационной боли; б) вносят вклад в развитие первичной и/или вторичной механогиперчувствительности в мышцах; в) участвуют в кожной и висцеральной механочувствительности и восприятии боли от механических стимулов; г) участвуют в восприятии болевых сигналов от легких и желудочно-кишечного тракта.

Было также показано, что ASICs играют важную роль при некоторых нейродегенеративных расстройствах, включая ишемический инсульт, болезнь Паркинсона, эпилепсия, болезнь Хантингтона, и аутоиммунный энцефалит. ASICs обнаруживаются не только в нейронах, но также и в раковых клетках, костной ткани, клетках эпителия и мочевого пузыря, в клетках гладких мышц.

Удобным и распространенным способом изучения как физиологической роли каналов в организме, так и молекулярных механизмов их функционирования является использование лигандов, модулирующих работу ASIC каналов. Особенно это касается высокоспецифичных соединений, с помощью которых можно как идентифицировать и охарактеризовать данный тип канала, так и управлять его работой. Фармакология ASICs на данный момент представляет собой относительно небольшой набор лигандов. Потенциаторы активности ASIC каналов представлены как низкомолекулярными компонентами, так и молекулами пептидной природы, как, например, MitTx, выделенный в лаборатории Д. Джулиуса. Ингибиторы активности ASIC каналов представлены как неспецифическими низкомолекулярными молекулами, такими как диуретический препарат амилорид, аспирин, так и высокоспецифичными компонентами пептидной природы. К последним относятся PcTxl и АРЕТх2, выделенными из ядов беспозвоночных в лаборатории М. Лаздунского. Комбинированием методов биохимии, молекулярной биологии, а также с помощью структурных и функциональных исследований, удалось достичь прогресса в установлении механизмов действия модуляторов активности ASIC каналов. Дальнейшие исследования в данном направлении могут оказать значительную помощь в понимании роли данных каналов в физиологических/патологических процессах, а также позволят создать новые лекарственные препараты.

Цель и задачи работы

Цель работы состояла в поиске, выделении и изучении свойств природных веществ, модулирующих активность ASIC3 рецепторов.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) тестирование экстрактов растений и ядов беспозвоночных на наличие искомой активности;

2) идентификация и выделение активных компонентов при помощи хроматографических методов;

3) анализ активности выделенных компонентов на ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих канал ASIC3;

4) изучение физико-химических свойств выделенных компонентов;

5) разработка системы гетерологической экспрессии для лиганда пептидной природы;

6) проверка анальгетических эффектов новых лигандов в болевых моделях in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые из природных источников были выделены лиганды, обладающие ингибирующим действием на обе компоненты тока ASIC3 канала, не описанным ранее ни для природных низкомолекулярных соединений, ни для соединений пептидной природы.

Новое низкомолекулярное соединение, представитель класса полифенольных соединений лигнанов - севанол, было обнаружено и структурно охарактеризовано в ходе этого исследования. Из морских анемон были выделены два новых пептида - я-AnmTX Her lb-1 и 7i-AnmTX Ugr 9-1. Her lb-1 гомологичен другому изученному инигибитору ASIC3, в то время как Ugr 9-1 является пептидным модулятором с уникальной структурой. На примере рекомбинантного аналога Ugr 9-1 впервые установлено пространственное строение для токсинов данного класса.

Все выделенные лиганды проявляли ингибирующую активность в отношении ASIC3 канала, при этом характер действия севанола и Ugr 9-1 был абсолютно новым. В тестах in vivo новые лиганды продемонстрировали способность значительно подавлять величину болевых стимулов, что является еще одним подтверждением немаловажной роли ASIC3 в восприятии сигналов при патологических состояниях. Таким образом, все найденные в ходе работы природные вещества ранее не были известны, и воздействие двух новых лигандов на изучаемый рецептор ASIC3 имеет уникальный характер.

Полученные результаты могут внести существенный вклад в фундаментальном плане, позволяя изучить молекулярные основы функционирования ASIC3 канала и исследовать физиологическую роль данных каналов в организме. Кроме того, результаты могут иметь

практическое применение в области разработки новых высокоэффективных и безопасных обезболивающих лекарственных средств.

На данный момент на все обнаруженные в ходе данной работы лиганды поданы заявки на патенты РФ как на перспективные соединения с анальгетической активностью.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011); XXIV зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012); 1 Оксфордский симпозиум по веномике (Оксфорд, 2012); VI Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 106 страницах, содержит 33 рисунка и 3 таблицы, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов, списка сокращений и списка литературы, включающего 255 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Методика проведения работы

Поиск природных веществ, проявляющих активность по отношению к каналу ASIC3, проводился среди животных (морские анемоны) и растительных организмов. Для этого либо получали образцы ядов морских анемон, либо подготавливали экстракты из растительного материала. Полученные таким образом образцы тестировали на наличие искомой биологической активности. Тестирование биологической активности проводили методом электрофизиологического измерения тока ASIC3 канала человека, экспрессированного в ооцитах Xenopus laevis. Токи через мембрану ооцитов в ответ на активацию агонистом измерялись методом двухэлектродной фиксации потенциала. По результатам сравнения амплитуд токов без добавления образца и после его совместной аппликации с агонистом определяли присутствие в образцах компонентов, обладающих модулирующим действием на ASIC3 канал.

Активные образцы разделяли далее на отдельные компоненты при помощи методов хроматографии, включающей в себя от 2 до б стадий в зависимости от степени сложности компонентного состава. После каждой стадии разделения проводили тестирование биологической активности всех получаемых фракций.

Индивидуальность выделенных активных компонентов после финальной стадии очистки оценивали с помощью аналитической хроматографии и масс-спектрометрии.

Структуру лигандов определяли методами iV-концевого секвенирования по Эдману и генной инженерии (в случае лигандов пептидной природы), масс-спектрометрии и ЯМР (для лигандов пептидной и непептидной природы). Анальгетическую активность проверяли на болевых моделях in vivo. При этом нарабатывали лиганды, либо выделяя из природного источника, либо получая рекомбинантный аналог.

Полипептидный ингибитор ASIC3 из анемоны Heteractis crispa

Поиск активных компонентов в экстракте морской анемоны Н. crispa проводили по схеме, включающей последовательное многостадийное фракционирование. Начиная с исходного природного экстракта, в электрофизиологических экспериментах на ооцитах X. laevis одна из получаемых при разделении фракций устойчиво показывала достоверное ингибирование регистрируемых токов, вызываемых закислением среды. Измеренный эффект колебался в пределах 25-70% уменьшения амплитуды измеряемого интегрального тока. Всего было проведено шесть последовательных стадий хроматографического разделения, для которых использовали гидрофобные, ионообменные, гель-фильтационные и обращенно-фазовые сорбенты. Профили разделений приведены на рис.1. Использование столь сложной

схемы для разделения компонентов емшо с наличием большого количества полипентидных компонентов со сходным строением, что характерно для многих ядовитых жнвотных. синтезирующих обширные природные комбинаторные библиотеки пептидных токсинов.

Рисунок I. >тапы хромаtoiрафнческоїо ражений скиртової« іксіракга морской анемоны //. crispa. А. Рилменнг суммарною экстракта на тонп И»лтром-| (4.8x9$ см) (Хром.1аб, Россия) со скоростью ілюини 120 мл/час в ступсичаточ градиенте концентрации этилового спирта. Б. Раиеленне активной фракции на колонке СМ-.Ч (2.5*60 см) (Whatman, США), уравновешенной в 0.05 M аммоиий-аііеіаіном буфере (pH 4.5), при скорости тлюиин 20 мл/час и линейном іралиемге KoiiiieuipauiiH NaCI. В. Гель-фильтрации на колонке lliogel P-é (1.4*60 см) (Bio-Rad, США), уравновешенной в 0.1 M ачмоиий-аиетатном буфере (pli 8.6), при скорости ыюцни 8 мл/час. Г. Ионообменная tpoMaioi рафия на колонке BtoKei ТО (1.9*27 см) (Bio-Kail, США), уравновешенной в 0.01 M аммоннй-аиетатиом буфере (pli 6.0), при скорости тлюими 15 мл/час и іралиеите концентрации ацетата аммония (0.01 - 0.2 М). Д. ОФ-В')ЖХ на колонке Jupiter С5 (10»250 мм) (Phenomenet, США) в присутствии 0.1% ТФУ, скорости і.імиїни 5 мл/мин и линейном іралменте концентрации ацетониірила. F- ОФ-ВЧЖХ на колонке Vydac CI8 (4.6x250 мм) (Grace, США) в присутствии 0.1% ТФУ, скоросіїї і.тюиии І мл/ми и и линейном гралиеше кон нен і рл НИН аистоиитрпла. Время мишш активных фракций на кажлом этане выделено серым прямоугольником.

В итоге из спиртового экстракта H. crispa был получен в индивидуальном виде

единственный активный компонент. Установленная методом масс-спсктромстрического

анализа молекулярная масса выделенного пат и пептида равнялась 4537 Да.

Алкиллнрошшный по аминокислотным остаткам (а.о.) цнетеина продукт по массе отличался

от природного полипептида ровно на 6 добавленных групп этилпиридина, что дало

основание предположить наличие трех дисульфилных связей, стабилизирующих структуру

пептида. Полна* аминокислотная последовательность была установлена методами последовательной деградации алкилированного по остаткам цистеина пептида ію 'ідману, а также анализом С-конновой последовательности с помощью карбоксипептидазы Y. Первичная структура полипептида, состоящего из 41 а.о. оказалась следующей: GTPCKCHGYIGVYWFMI.AGCPNGYGYNLSCPYFLGICCVDR.

В соответствии с новой, улучшенной номенклатурой для полнпептидов морских анемон, выделенный иолипептид получил название х-АпшТХ Her ПИ. Отличие расчетной массы от измеренной составляло 0.3 Да, что свидетельствовало об отсутствии в полипсптнде моднфипиропамиых аминокислотных остатков.

Проведенное сравнение по алгоритму BLAST аминокислотной последовательности выделенного полипептида с известными ранее выявило ряд гомологичных послеловзтелыюсгей, также принадлежащих токсинам, выделенным из морских анемон. Семь подобных последовательностей приведены иа рис. 2.

*-ЛлвТХ Her ІЬ-l CTPCKCHCYICVYtfVNLAC-CPNGYCYNLSCPYFlCICCVDR Beg tu 31.16 r,TTc*cesTLni»wF»vs;i-rrj<;i«GYTGHcorru;Lcc... ií./r»

Рисумок 2. ( равнение аминокислотной вослсммтмыюста я-АвпГГХ llcr Ib-I с полипентилиыми токсинами ni MopcKui аисмом: Всц III .11.16, Beg III 28.78 и lies III 29.21 in В. tannic um, (P8646I, 1*86462 и 1*86464); BcIV, BcV hi B. cahutrum <l>849|9 н 1*86470); APETxl -модулмгор Kv11.1-капала (llf K(i) (1*615411 II АРЕТж2 - модули!op ASIO канала (1*61542) и> Л. elegantísima. Серым цветом выделены остатки, не совпадающие с последомie.ii.iiocii.k) llcr Ib-I; темно-серым цветом нокаииы ракшчакнаиесн а.о. a последовательности функционально родственного нолипешн.» A PET» 2. Приведенный справа % смлстаа нгрпичныг ctpyKiyp рассчитан по алгоритму BLAST.

Среди представленных компонентов из яда морских анемон, три токсина Beg 111 ХХ.ХХ были обнаружены в ходе протеомных исследований морской анемоны BunoJosoma canjiicum. Структура ¡t-AnmTX Пег ПИ также гомологична частичной аминокислотной последовательности полипептида BcV и полноразмерной структуре пептида BcIV, найденных в яде морской анемоны Bunodasoma caissarum. И, наконец, выявлена гомология с двумя детально охарактеризованными токсинами из морской анемоны Anioplcura elcyanlissima APlíTxl и АРЕТх2, для которых известна их способность специфично ингнбировать каналы HKRG и ASIC3, соответственно. У всех перечисленных выше полнпептидов, несмотря на относительно невысокий процент сходства их строения, просматриваются общие структурные мотивы. В соответствии с принятой номенклатурой и мотивами распределения остатков цистеина - это полипептнлы, принадлежащие структурной группе Ib. К этой iруппс также относятся токсины - блокаторы К*-каналов,

GVrcKCGSKKGVYMFOQITGCPGGBCYlteSCKYLLGI GVS С KCGSKKCV Y и FGOITGC РСОИС Y КС-': С J YV LC. GTTCKCOSfbCIYIIFIlVTS-CPPG*<-.YTT«C«Yr. . .

«в* «к*

4*. J» 41.5%

Вед III 2».21 BcV

именуемые BDS, из яда морской анемоны Anemonia viridis. Очевидно, что биологические мишени у токсинов этой структурной группы разнообразны, и определит!, их можно только экспериментально.

Один из структурных гомологов - токсин ЛРЕТх2. имеет с я-ЛптТХ Her lb-1 не только структурное, но и функцнонатьнос сходство. Оба полипептнда оказывают иигибнрующее действие на вызванный изменением pH среды ток через экспрсссированныс в ооцнтах лягушки ASIC3 каналы.

Действие полипептида на AS1C3 каналы человека измеряли при шести различных концентрациях исследуемого образца в пяти повторах. Токи ASIC3 канала индуцировали быстрой сменой pH внешнего раствора с 7.8 до 4.0. Из-за отраннченною количества природного образца, исследование проводили только по одному протоколу, позволяющему оценивать степень ннгибирояания обеих составляющих ASIC3 тока. Иш-ибирующая активность л-AnmTX Her lb-l зависела от концентрации полипептида и при 40 мкМ ингибирование амплитуды быстрой компоненты тока составляло более 75%. Взаимодействие было обратимым и эффект пропадал после отмывки пептида (рис. ЗА).

А 1

ИсгІЬ-ІІМмМі

Рисунок X II ічсрсние иитбнруюшей

активности токсина и-ДпшТХ Her lb-l на ASIC'J каналах человека, жспрсссироваииых в ооцнтах .гагушки X. laevts. А. Записи итмсрсниых токов чгреї мембран* клетки, вышанных мічснгннем pH буфера со тиачення 7.8 ло 4.0. И (меряемые клетки были фиксированы при потенциале -30 мВ, скорость протока около I мл/мин. К. Зависимость величины амплитуды быстрой компоненты тока по сравнению с контролем от " ™ концентрации токсина, построенная по

реї).платам б нпависнмых щмерсиий.

По результатам проведенных измерений была построена зависимость величины ингнбирования быстрой компоненты тока от концентрации пептида, а также определены

значення 50%-й ингибируюиісй концентрации 1С»" 5.5±1.0 мкМ н коэффициент Хилла nil = I (рис. ЗБ). lia основании того, что значение пН равно I можно предположить, что ингибнрованнс токов через каналы ASIC3 обусловлено взаимодействием молекулы токсина только с одним специфическим участком связывания на канале.

Полнпептилы ні яла морской анемоны L'lricina greMnyi

Второй пептидный ингибитор ASIC3 был выделен из яла морской анемоны U. grebelnyi. Ял данной анемоны был получен в результате механической стимуляции их стрекательных клеток.

Первоначально яд U. grebelnyi фракционировали с помощью гсль-фнльтрации на колонке TSK 2000SW (рис. 4А). Далее пять объединенных фракций тестировали на наличие биологической активности. Ингибирующая активность была отмечена только у мажорной фракции. Далее активная фракиин была подвергнута следующей стадии разделения методом ОФ-ВЭЖХ на колонке Jupiter С5 (рис. 4Ь). Единственная полученная активная фракция затем была разделена на индивидуальные компоненты с помощью ОФ-ВЭЖХ на колонке Vydac С18 (рис. 411). Ингибирующая активность в отношении ASIC3 была обнаружена только у одного компонента.

J L

їм» V

і _J >—

"S-S--A-—

Рисунок 4. >iапы »рочаклрафнческш« раиелення M.la морской анемоны V.grrbrlnyt. A. Гель-фи.11*Iрация яла на колонке TSK 2CKKISH (7.5"600 мм, 125 Л, 10 fim; То»о Soda Manufacturing Co., Япония), уравновешенной 10%-имм aucioiiHipii.ioM в присутствии 0.1% ТФУ, при скоросш ММИН 0.5 мл/мин. Б. ОФ-В1ЖХ активной и>иы на колонке Jupiter CS (4.6*250 мм, .100 А, 5 fini) (Phcnonicnci, США) в ирисуicikhii 0.1% ТФУ, скорости киоини I мл/мин н .кшгнним i радисте концеи фаиии ацеюнитрила. В. ОФ-В КК'Х активной фракиин на колонке Vydac CIS (4.6»250 мм) (Grace, США) в н рясу Tel внм 0.1% ТФУ, скоросш МИШИН I мл/мин и ланейноч гралненте концентрации аистоиитрила. Время i.moiiiih активны« фракций на кажлом ттвп« выделено черным прямоугольником.

В итоге из яда морской анемоны U. grebehyi был получен единственный активный компонент. Установленная метолом масс-спектрометрического анализа молекулярная масса выделенного полипелтила равнялась 313S.I Да- Алкнллированный го аминокислотным остаткам цистеина продукт по массе отличатся от природного полинептнда ровно на 4 добавленных группы этилпирилнна, что дало основание предположить наличие двух днеульфидных связей, стабилизирующих структуру исшила. Метолом /У-концсвого секкенирования по Эдману молипептида, алкилированного по остаткам цистеина, была установлена последовательность первых 25 аминокислотных остатков, среди которых - три остатка цистеина. На основании выясненной частичной аминокислотной последовательности были подобраны вырожденные праимеры Ugt и Ug2, с помощью которьк метолом 3' RACE-ПЦР установили З'-кониевую последовательность кДНК. кодирующую данный полипептид. В качестве матрицы использовали препарат кДНК. полученный на основе суммарной РНК щупалец морской анемоны U. grebelnyi. В результате был получен фрагмент ДНК (-150 нуклеотидиых пар (и.п.)). в ходе ссквснировання которого было установлено, что он содержит в себе участок, кодирующий искомый полипептид, а также стоп-кодон и 3'-нетранслирусмую область. Полную последовательность кДНК устанавливали методом 5' RACE-ПЦР. Полученный фрагмент ДНК (-600 н.п.) был клонирован в плазмиду pAL-TA. Секвенированнс показало, что полиоразмерная кДНК, состояния из 5'- и 3'-нстранслируемых областей и открытой рамки считывания, кодирует длинный белок-прелтественник (127 а.о.) (рис. 5).

ИВА- •f(ttfUMtfoafqcUte4et«<4Canute«gM|<4«uti<t«tt0UCU44 •Uli

HU; AXCIXAAOOCCTATCASCATOIATCOXC: тит:оо*гттоттАТ7»с»гйлд*г-*дс*от

♦ let .«..М»..Ц(|1..|..1Щ..|.Ч'. .с.........................

рид олАК1ь|ц.цпсеюгагсоспцттаоассооссцдацтттаАласст ■ Hl .В.«..с..»..г..0..»..1..д..ем0..1!..л..»м«,.»..у..»..|..».

ОМА ATCAOCATCGATCIV UL1lAOGACTTCTTATrACCGAflACAOCACTOCTAACTCTCll

• lit:

•ill

MA: СССССТТСТАвйАСТТСТТАТТАССОАЙАСАОСАОТООТААСТвТОТвТЛЛСАСООГТТС _

• lit Рисунок S. Структура фрагмеша

«л ссстотеоАосьжесАнжетксс»^ «ДНК- «"»"W""^

• 1«! ■ >С" 0..0. .к— »..а..»..*..р..*.. г. •!••(•• 1..Р..Г..Г..С"«. нрмшгпяснии! полипещмда I ßr

9-1 и .1PYX ГГО ГОНОЛВГО! |]*г 9-2 и MA: IИ 1С! ТАТСАСС<^Ц^ЦГйОСАСТ007А*^ТСТСТСТА/ГСАС'УСТАСДОСТОТОй*ССА __ „ , „___________

• lit >r>iC»r»l"ll-<Di*9»«>C'>l»C»V<>T"»it"T»C<>C«<»t' 1 «Г IIOC.WMMIt.lUHKtli

chi hm.ift.Moi о nmui подчеркну ia, ,р,.,ые АМНИОНИС-ЮТНЫС

последом ГСЛЫИеУИ по.шпгптмлоп ША: .......................................выделены серыч налом.

На основании общего атгоритма поиска зрелых последовательностей было

обнаружено три зрелые последовательности пептидов, каждая из которых содержала по 29

остатков. Первичной структуре искомого токсина соответствовала только одна последовательность, которая располагалась в Г-кониснон области белка предшественника. В соответствии с улучшенной номенклатурой для токсинов из морских анемон новый полнпептил получил название д-АптТХ 19а-1 (или 9-1). Разница расчетной и измеренной молекулярной массы составила 0.35 Да, что может являться свидетельством отсутствия посттрансляционных модификаций у пептида.

Два других пептида, представленные в бслкс-прсдшественникс, также были найдены в яде и выделены в индивидуальном виде. Данные пептиды получили названия х-АптТХ ирг 9а-2 (или 9-2) (представлен двумя копиями в белке-предшественнике) и я-АптТХ 9а-3 (или и^г 9-3). Они обладают высоким структурным сходством с пептидом и^г 9-1 (рис. 6).

Известные в настоящее время полипептиды морских аисмон. содержащие 4 остатка цистснна, объединены в одни структурный класс 9а. Выделенный полинептнд ицг 9-1 полностью соответствует характерному для этого класса мотиву распределения остатков цисгеина и проявляет средний уровень сходства с первичной структурой других полнпептилов морских анемон из этого класса (рис. 6). Так, 9-1 проявляет гомологию с токсинами Вс£1Н 23.41 (Р86467) и Вс^Ш 21.75 (Р86465). выделенными из яла морской анемоны ВипоЛомтш сапукит и, вероятно, являющимися ингибиторами потенциал-зависимых К'-каналов. Другой гомолог - токсин 5НТХ-Н (РОС7\\'7) из морской анемоны $псЫк1асГу1а ЫиМот. проявлял активность по отношению к К'-каналам на модели синаптосомапьных мембран крыс.

группа токсинов 9а ¿ХХ^........6.....•"•<]

идт 9-1 ІБIСРРСЯ ГСЇ НКШЗОіСУУ СЛУ -<ХОМ

всдШ 23.41 Д1:МРст|сг'|К[|ЗОКСУУ[ (ЗЬ-^ОЗАУ 72*

всдІІІ 21.76 (ЯМрсЯсУ^ЧБЯКСУУиЙ!^« ¿А бвч SHTX.II НТ аІРСгЛсу нррэр^Вс^сДРуоздД $6%

Рисунок 6. Сравнение аминокислотой последовательности полых полюкнтнлов ні ни

морской анемоны V. цгеЬеІпуі с мівссі ні.імн но......гимнами морских анемон структурною

класса 9. Кылслсны нссовналаюшис с последовательностью 1'цг 9-І амннокислоіиьіс оеіаїкн. Рассчиїаннос но алюрніму В1.ЛМ' схолеіно нервнчных структур покатано справа. Над аминокислотными последовательности!! нрниглгна оГшии для структурною класса 9 схема іаммкання лисульфнлных свян-й.

Рекомбинантный аналог Ugr 9-1

В данной работе из ядов морских анемон было выделено два пептидных лиганда, обладающих ингибирующим действием на ASIC3 каналы. Наибольший интерес представлял пептид Ugr 9-1, поскольку он относился к группе токсинов анемон с малоизученной функцией и неизвестной пространственной структурой. Для получения искомого пептида в количестве, достаточном для всестороннего исследования его функциональных свойств и структурных особенностей был выбран относительно простой и дешевый метод его синтеза в бактериальной системе экспрессии.

Из трех специфических праймеров, подобранных на основании установленной аминокислотной последовательности с учетом оптимизации кодонов для экспрессии в Е. coli, методом ПЦР синтезировали ген, кодирующий искомый пептид. Для проведения контролируемой экспрессии синтетический ген клонировали в бактериальный вектор рЕТ-32b (Novagen, США). Данная генно-инженерная конструкция позволяет получать нужный продукт в виде химерного белка, состоящего из целевого пептида и вспомогательного белка тиоредоксина, между которыми находится последовательность из шести гистидиновых остатков, позволяющая выделять белок с помощью аффинной хроматографии. При разработке конструкции также был введен остаток метионина, примыкающий непосредственно к Л*-концу целевого пептида, что позволило получать целевой пептид в чистом виде из химерного белка в результате реакции гидролиза BrCN. Уровень экспрессии, наличие экспрессируемого белка в растворимом виде, а не в тельцах включения, а также чистоту выделенной после аффинной хроматографии фракции белка определяли по результатам электрофоретического разделения соответствующих образцов в ПААГ в присутствии SDS-Na (рис. 7А). На рис. 7А видно, что химерный белок находился во фракции растворимых компонентов после лизирования клеток. Методом аффинной хроматографии была проведена очистка целевого белка от примесных компонентов.

Рисунок 7. Получение рекомбинаитиоі о аналога Ііцг 9-І. А. 'ілекгрофорстичсскос раїлеленис в 12% ІІААГ в присутствии SDS-Na odpamoi бакісриаліліьіі клеток яо индукции жсмрсссни ІІПТГ (І) и после иилукиии (2). оЛрашы суікрнаїаніа (4) и осатка (5), полученные после ультратвуковой леїиитеграиии и гіенірифуі ировании лиіаіа клеток, а также обратеп vwna, полученного в реіультате аффинной і рама tot рафии (6). Дорожка і - белки-маркеры. Ь. ОФ-ВЭЖХ на колонке Jupiter С5 (10*250 мм) (Phenomenei, ( ІІІЛ) 14 мі химерною белка после гидролиза BrCN, Ратделсние проводили в линейном градиенте аиетоиитрила в присутствии 0.1 % ТФУ при скорости потока 5 мл/мин. Время тлюиип І'кг 9-І выделено серым. В. ОФ-ВЭЖХ на колонке І.апа СІК (ISOxJ мм) (Phenomenei, США) обратив смеси природного I'gr 9-І и его рекомбинаитиого аналога. Раї деление проводили в линейном градиенте аистошнрила н присутствии 0.1 % ТФУ при скорости потока 0.5 мл1 мни,

В итоге, после проведения гидролиза BrCN образна химерного белка и очистки с помощью ОФ-ВЭЖХ был получен ислспой пептид recUgr 9-І в индивидуальном виде (рис. 7Б). Выход recUgr 9-І составил 9-10 мг с I л культуры бактериальных клеток. Но результатам масс-спсктрометрического анализа, а также сравнения хроматографической подвижности на ОФ-ВЭЖХ аналитической колонке (рис, 7В) была установлена идентичность природного пептида IJyr 9-І н его рекомбинпнтногп аналога

Установленная метолом ЯМР-спектроскопни (сотрудниками лаб. биомолекулярной

ЯМР-сисктроскоиии под рук. проф. А.С. Арссньева) пространственная структура recUgr 9-І

представляет собой р-шпильку (участок I ITyr-22Asp) с р-поворотами в участках 8Arg-l ITyr,

14Asp-l7Gly, 22Asp-25Gly, 23Ala-26Cys и 25Gly-28Ala. стабилизированную двум*

лисульфидными связями, образуемыми остатками lOCys-26Cys и 7Cys-19Cys, а также

восемью водородными связями (рис. 8А). Как можно видеть, из плотной центральной

области р-структуры выдаются длинный JV-коииевой и короткий C-коніісвой участки. В

сомой же центральной части можно выделить гидрофобную область, образуемую аминокислотными остатками 9Phc, НТут, 21 Тут и 24Туг, и гидрофильную область, образуемую остатками 8Arg, 13Arg. l4Asp и 22Asp, а также основно-ароматический кластер, образуемый остатками 8Arg. 9Phe, ПТуг и 21Туг (рис. 8Б), который также выделяется у других пептидных ингибиторов канатов ASIC и, предположительно, траст существенную роль в их функциональной активности.

Рисунок 8. Пространственная структура rcclgr 9-1. А. Лсшочиаа mdic.il пенима. (№oihi4«iu ароматические. а также положительно и отрицательно иряжемнме (мжопмс псин. I». Модель поверхности nein tua. ВЫ.1СЛСНЫ предполагаемые функционально нажиме остатки - 8Arg. 9Che. ПТут и 21 Туг.

Представленная структура пептида Ugr 9-1 являете* первым примером установления пространственного строения для токсинов данного класса. Она не имеет сходства с пространственным строением других известных на данный момент токсинов морских анемон.

Для определения количественных характеристик действия recUgr 9-1 на проводимость ASIC3 канатов человека проводили его тестирование в различных концентрациях. Токи ASIC3 каната нндуцировати быстрой сменой pli внешнего раствора с 7.8 до 4.0, при этом наблюдалось обратимое концентроционнозавнеимое ннгнбирование не только быстрой составляющей тока AS1C3, но н его медленной компоненты (рис. 9А).

Количественную характеристику далее проводили отдельно для обеих компонент. Для изучения быстрой составляющей ASIC3 тока активацию каналов проводили короткими импульсами (1 с) понижения pH буферного раствора с 7.8 до S.S. Эффект оценивали по снижению амплитуды вызванного тока после 5 с предварительной инкубации рецепторов с полипептидом в различных концентрациях. Ингибированис было обратимым и зависело от концентрации rccUgr 9-1; при концентрации 40 мкМ наблюдаемые токи блокироватнсь полностью (рис. 9Б).

І'ислнок 9, Иімеренис

ииіибируюінсй активности

reellgr 9-1 і» ASIC3 канала« человека, жспрессирокамных в ооііи і а* ля і у піки .V. laevis. Л. Записи щмсрсиныт гоков череї мембрану клетки, вміваііии\ изменением рН буфера со іначсннн 7.8 до 4.0. Б. Записі, быстрой компоненты тока ASICA, ■міваииой иіменением pli бу фера со іиачснии 7Л ло 5.J. В. Запись медленной компоненты тока ASIC3, вы іваниой и їмсіїсиием pli буфера со шачеиии 7J ло 4.0. Время добавления истинен і и.та rccl!gr 9-І в раствор обозначено ПрЯМОу Ю.ТЫ1ИКОМ. Измеряемые клетки были фиксированы при потенциале -50 мВ, скорость протока около I мл/мни.

Для изучения медленной составляющей АЯІСЗ-опосредованного тока активацию каналов проводили шинными импульсами (3 с) понижения значения рН буфера от 7.3 до 4.0. При таком протоколе активации изучаемых рецепторов не происходит возникновения быстрого компонента тока, а медленная компонента за 2-3 секунды выходит на свос максимальное значение. Эффект оценивали по снижению амплитуды максимального тока, rcclJgr 9-І добавляли в течение самого импульса. Ингибирование было обратимым и зависело от концентрации rccUgr 9-І, однако полностью ток не ннгнбировался. Максимальное ингибирование амплитуды тока (48±2%) наблюдали при концентрации полнпептила 50 мкМ (рис. 9В).

Па основании полученных данных были построены две зависимости ишнбироваиия от концентрации пептида для быстрой и медленной компоненты, а также определены основные параметры взаимодействия recUgr9-l с каналами ASIC3 (рис. 10).

too

■

I-

Рисунок 10. Зависимое изменения величины II МП. Ш| VIM быстрой (А) и медленной (Б) компонент гока ASIC3 по еравненню с кон i рол см от коинентраиии rccL'gr 9-1 (по результатам 7 иемпнсимьи шмсрсиий).

oí i ю too

100

|С|шМ

(C1—W

Ишнбирование быстрой компоненты тока характеризовалось значением ICjo ~ 10±0.6 мкМ и пН ■ 1.86*0.19. Неполное подавление меженной компоненты тока ASIC3 характериэоваюсь значением 1С» ~ 1.44±0.19 мкМ и nil ■ 1.48*0.27. Сравнение биологической активности recUgr 9-1 с природным полипептилом Ugr9-1 подтвердило их идентичность. Значение nil больше I и неполное ингнбирование медленной компоненты дало основания предположить, что эффект может быть обусловлен действием пептида на несколько регуляторных сайтов ASIC3 канала. Следует отметить, что ннтибируюшее действие, которое rccUgr 9-1 оказывает на обе компоненты тока AS1C3 отличается от эффекта. оказываемого другим, единственно известным на данный момент полипептидным блокатором данного типа канатов - токсином АРЕТх2, который ингибирует только быструю компоненту тока.

Ннзкомолекулирный компонент hi чабрепа (Thymus armeniacus)

В предварительных экспериментах было обнаружено ингибируюшсс действие уксунокислого экстракта чабреца Thymus armcniacus на ASIC3 канаты. При концентрации 1 мг/мл экстракт полностью подавлял быструю составляющую тока ASIC3 каната и частично его медленную составляющую.

Уксуснокислый экстракт чабреца был подвергнут разделению на отдельные компоненты при помощи ОФ-ВЭЖХ (рис. II). Первую стадию фракционирования проводили на колонке Luna С18 (рис. ПА). Тестирование фракций, полученных после первой стадии разделения, позволило выявить только одну фракцию, ннгибирующую ASIC3. Активный компонент в индивидуальном виде (>95%) удаюсь получить на второй стадии раздел синя на колонке Luna PFP (2) с сорбентом, содержащим пентафторфенильные группы (рис. МБ).

V> — ^ «оке» д..»— ^ коосн

Рисунок II. Утапы ныл ел синя севанола. Л. Первая стали я ратлелеиия уксуснокислого же тракт а чабреца иа обратсио-фатовой колонке Luna CI8 (4.6ilS0mm) (Phenoraene*. США) в линейном градиенте концентрации аист они г рила н присутствии 0.1% ТФУ; скорость потока - I мл/мни. Время тлюции активной фракции укатано стрелкой. Б. Финальная стадия очистки активной фракции иа обрашсио-фатовой колонке Luna PFP (2) (4.6x250mm) (l'henomcnei, США) in 0.1% a линейном градиенте концентрации аиетоннтрнла в присутствии 0.1% ГФУ; скорость потока - 0.S мл/мнн. Время тлмнтин севанола покатано стрелкой.

Выделенный нами компонент, который был назван «севанол». наиболее представлен в уксуснокислом экстракте но сравнению с другими компонентами. Его содержание в пересчете на массу сухого экстракта составляет 14% (w/w). Спектр поглощения севанола в растворе 0.1% ТФУ в ультрафиолетовой и видимой областях имел максимумы поглощения при длинах волн 212 нм, 254 им и 340 им, что свидетельствовало о том, что данный компонент имеет непептидную природу. Измеренный коэффициент молярной экстннкцнн в растворе 0.1% ТФУ при длине волны 254 нм составил значение 48йО М'см"1. Измеренная методом LC-ESI-MS масса севанола составила 706.5 Да. Установленная метолом ЯМР-спсктроскопии (сотрудниками лаб. биомолекулярной Я.М1'-спектроскопии) структура представляет собой сложный эфир эмифилловой кислоты и двух остатков иэолимонной кислоты (рис. 12).

Севанол является новым представителем класса полифенольиых соединений -лигнанов. Представители данного класса соединений были обнаружены во всех частях сосудистых растений многих семейств. Для них была показана противораковая, антмоксиламтная, противовирусная и противогрибковая функции. Севанол относится к подгруппе лигнанов с фенилдигидронафталсиовмм скелетом, являющимся производным кофейной кислоты. Среди структурных аналогов севанола можно выделить рабдозиин, для которого была показана противовирусная, антиоксилантная и антиаллергенная активности.

СООИ

соои

1'нонок 12. Структура сгпамоля.

ко

Для определения количественных характеристик действия севанола на А$1СЗ каналы человека проводили тестирование испытуемого образца в различных концентрациях. ЛЯЮЗ токи индуцировали быстрой сменой рН внешнего раствора с 7.8 до 4.0, при этом наблюдалось обратимое концснтрационнозависимое ишибирование не только быстрой составляющей тока /\SIC3, но и его медленной компоненты (рис. 13Л).

Количественную характеристику далее проводили отдельно для обеих компонент. Для изучения быстрой составляющей А81СЗ тока активацию каналов проводили короткими импульсами (1 с) понижения рН буферного раствора с 7.8 до $.5. 'Эффект оценивали по снижению амплитуды вызванного тока после 5 с предварительной инкубации рецепторов с ссванолом в различных концентрациях. Ингибированнс быстрой компоненты зависело от концентрации севанола и достигало 100% при концентрации 2 мМ (рис. 13Б). Также было установлено, что ингибируюший эффект севанола проявлялся в широком диапазоне рН, при котором канал активируется. Величина ингибирования. измеренная при концентрации I мМ севанола, составляла ~ 80% и была постоянна (несмотря на то, что амплитуда тока уменьшалась при увеличении значения р!1 активирующего буфера) (рис. 13В). Для изучения медленной составляющей А81СЗ-опосредованного тока активацию каналов проводили длинными импульсами (3 с) понижения значения рН буфера от 7.3 до 4.0. Эффект оценивали по снижению амплитуды максимального тока, севанол добавляли в течение самою импульса. Максимальное ингибированнс медленной компоненты достигало $0% и также зависело от концентрации севанола (рис. 13Г)-

'"YJFS- 7jI_ГЇТ"

К і

і: ї-

Сіті »fi «Ml

(ІмМ)

jm ті

1_Г~.о

І'нсунок 13. И змсреннс иииібируюшей активности севано.ііі на ASIC3 каналы человека, зкспрессироваииьк в оопизаі X latvii. А. Записи иімереиньїі токов череї мембрану КЛСТКЩ вызванных изменением pli буфера со значения 7.» ло 4.0. Ь. Запись быстрой компоненты тока ASIO, вызванной изменением pli буфера со значения 7.8 до S.5. В. Запись быезрой компоненты тока ASIO, вызванной изменением р|| буфера со значении 7Л ло 6.0 и со значении 7.8 до 6J. Г. Записі, медленной компоненты тока ASIO, вызванной изменением pli буфера со значения 7J до 4.0. Время добавления севанола в раствор обо значено прямоутольником. Измеряемые клетки были фиксированы при позенциалс -50 мВ, скорость протока около I мл/мни.

Ma основании полученных данных были построены две зависимости ингибирования от концентрации для быстрой и медленной компонент, и определены основные параметры взаимодействия севанола с каналами ASIC3. Полное ингнбированис быстрой компоненты характеризовалось значением 1С» = 353± 23 мкМ и nll - 2.2±0.28 (рис. І4А). Неполное подавление медленной компоненты тока ASIC3 характеризовалось значением 1С» - 234±53 мкМ и пН = 1.8±0.61 (рис. І4Б).

>нп.шпзы быстрой (А) її

МСДЛСИИОЙ (В) КОМІІОІІСІІІ І UK«

ASIC3 по сравнению с контролем от концентрации ссваиола, (no реіультатач 7 немаисимы* нтмереиий).

Рисунок 14. иіменсния

Зависимость величним

КІ. ч.М

D КСС

KL-W

Специфичность действия ссваиола проверяли также и на других типах ASIC каналах крысы, экспрессированных в ооцитах X luevis. Ьыло обнаружено, что севанол проявлял ингибируюіцую активность в отношении ASICla, локализованного в основном в нейронах головного мозга. Измеренные значения ICjo и nil составили 2.2±0.6 мМ и 2.4±0.14, соответственно, т. е. севанол более чем в 6 раз слабее действовал на ASICla, чем на ASIC3 канал. В отношении остальных представителей ASIC каналов. ASICIb н ASIC2a, севанол при концентрации I мМ не проявлял заметной активности.

В настоящее время известны некоторые ннзкомолскулярныс соединения нспсптидноП природы, оказывающие ингнбнрующее действие на канал ASIC3: амилорид (ингибируст быструю компоненту тока, IC50 60 мкМ). А-317567 (ннгибирует обе компоненты тока. ~30 мкМ), противовоспалительные препараты нссгероидной природы аспирин (ICjo 260 мкМ) и диклофенак (ICjo 92 мкМ) (ингибируют медленную компоненту тока). Севанол является первым природным низкомолскулярным компонентом, действующим в физиологически допустимых концентрациях и проявляющим эффект на обе компоненты тока ASIC3 канапа. Значение nil больше 1. а также тот факт, что севанол не полностью блокирует медленную компоненту, дало основания полагать, что на рецепторе имеется более одного специфичного сайта к лиганду.

Лналы етичсскнс эффекты лнтанлов ASIC3 каналов в тестах in vivo

В экспериментах на животных и людях с использованием неспсцифнческих блокаторов, таких как амилорид, противовоспалительные препараты нестсрондной природы и А-317567, а также на мышах, нокаутных по гену ACCN3, кодирующему ASIC3, была продемонстрирована ключевая роль ASICs, н особенно ASIC3 канала, в генерации высокоинтенснвных болевых стимулов, таких как кнелотоиндуцированная кожная боль н развитие гиперчувствитсльности к механическим стимулам при воспалительном процессе в

мышцах. Для изучения аналыетичсского эффекта двух выделенных нами новых лигаплов ASIC3, севаиола и пептида recUgr 9-І. были выбраны тесты тепловой гмперчуасгвктелыюсти и кислотной стимуляции бати («уксусные корчи»), в которых немаловажный вклад в восприятие боли вносят ASIC3 каналы. Тестирование анальгстической активности проводилось в сотрудничестве с лаб. биолотческих испытаний ФИЬХ (г. Пушино) пол рук. проф. А.Н. Мурашева.

В первом тесте вызывали воспалительную реакцию введением в полушечку задней лапы мыши полного ацьюванта Фрейнда (CFA), что приводило к развитию тепловой гиперчувствитсльностн. Группа мышей, котором вводили физраствор через 24 часа после введения CFA, демонстрировала латентное время отдергивания задней лапы от горячей пластины (54°С) вдвое меньше (7.7±0.7 с), чем группа мышей, которым оба раза вводили физраствор (13.8*0.6 с), и у которых не наблюдалось развития гиперчувствительности.

Эффект снижения гиперчувствитсльностн оценивали против группы мышей, которым вводили CFA н физраствор. Внутривенное введение мышам севаиола в дозах I и 10 мг/кг за 30 мин до начала тестирования при водило к увеличению латентного времени отдергивания до 10.9±0.3 с (т.е., 53±5% в пересчете на % снижения гнпсрчувствитсльносги) и 12.8±0.6 с (или 83±12%), соответственно (рис. 15А),

Группа мышей, которым внутривенно вводили пептид recUgr 9-І в дозах 0.1 и 0.5 мг/кг за 30 мин. до начала тестирования, демонстрировала латентное время отдергивания 11.4±| с (или 62±14% снижения гиперчувствитсльностн) и 12.6±1.2 с (или 82±18%). соответственно (рис. І5Б).

А Б

Рисунок 15. Тест тепловой гннерчуастмгтслыюсти,

« ^^.....л».---------------и ---•>----вьмванной CFA. А.

I „ ^И flB.....—......................« -^И—ЯВ—+_ Действие севаиола п

¡ Y ^И і ' I ¡-r-i концентрация! 10 и I

* ^Н ^Н В--------------------« ^Н—Ц} I * I мг/кг (серые столбики); п

.■Иг • И I Я_І— К. Действие recU*r 9-І

Ml ' И lili * К0"ненграііият 0.5 п 0.1

* ^Н III I y j ' —[;' I—j — мг/кг (серые столбики); n 4. ^H ^H H, , _і 7. Статистически

^ І ¡Я достоверные ратлнчни

Я Sí Oí мечены от труппы «фи».

Il I,-L, . І Ш НІ .1 I ..1 _ _. р-р» "* - р<0.00|. « -

«•о» >-» •» и вист» о»«« «ш о» р<0.005.

Для сравнения, другие ингибиторы AS1C каналов, такие как амилорнл. А-317567 и пегггид АРЕТх2, в схожих экспериментах проявляли аналогичные аналитические эффекты в дозах 40-50 мг/кг (для амилорида), 5-Ю мг/кг (для A-3I7567) и 0.05-0.5 мг/кг (для АРЕТх2).

Морфин, известный своими анальгетическими н наркотическими свойствами, демонстрировал в этих тестах схожие результаты в дозах 1-5 мг/кг.

В качестве другой болевой модели был выбран тест кислотной стимуляции боли, которая развивается в результате внутрнбрюшннного введения раствора уксусной кислоты и приводит к непроизвольным сокращениям брюшных мышц (эффект, называемый «уксусные корчи»).

Количество судорог у контрольной группы мышей, которым предварительно вводили физраствор, составляло в данном тесте 42.0±6.6. У труппы мышей, которым предварительно вводили ссванол в дозах 1 и 10 мг/кг, количество судорог сокращалось до значений 13.7±0.3 и 10.5±1.7 (для 1 и 10 мг/кг ссванола. соответственно) (рис. 16А). Т.о.. ссванол более чем на 70% снижал величину ответа на кислотную стимуляцию. Предварительное введение мышам пептида гсс11(5г 9-1 в дозах 0.1 и 0.5 мг/кг сокращало количество судорог до значений 27.3±0.7 и 23±1.1 (для 0.1 и 0.5 мг/кг геси^9-1, соответственно) (рис. 16Б), т. с. величина ответа снижалась более чем на 40%.

Аспирин, днклофенак, для когоры> была показана способность ингнбировать медленную компоненту тока ASIC3 катала, и пептид АРЕТх2 также проявляли аиальгетическую активность в данном тесте. Значительное уменьшение количества судорог (40-90%) наблюдалось в дозах: от 20 до 130 мг/кг для аспирина, от 5 до 10 мг/кг для диклофсиака и от 0.01 до 0.5 мг/кг для АРЕТх2. Морфин в данном тесте обладал наибольшим ингибируюшим эффектом, практически полностью подавляя судороги в дозах 1-3 мг/кг.

Результаты активности севанола и rccUgr 9-І в болевых моделях in vivo, а также сравнение с другими широко известными алалыстическими агентами, свидетельствуют о том, что новые компоненты обладают эффективным обезболивающим эффектом, который они проявляют в физиологически допустимых концентрациях. В пересчете на молярную концентрацию в плазме крови, которая оценивалась как -50 мл/кг веса животного, дозы для

oi-w'.i-»" р<0.005.

Рисунок 16. Тсст кислотной стимуляции боли («уксусные корчи»). А. Действие ссванола в коиисніраиняі 10 и I мг/кг (серые столбики); п - 10. Ь. Действие reclígr 9-І в концентрациях 0.5 и 0.1 мг/кг (серые столбики); п - 10. Статистически достоверные раыичия отмечены от (рупиы «фит. р-р» *" - р<0.00|, •• -

севанола соответствовали значениям -300 мкМ (для дозы 10 мг/кг) и ~30 мкМ (1 мг/кг), а для пептида recUgr 9-1 соответствовали значениям ~1 мкМ (для дозы 0.1 мг/кг) и ~5 мкМ (0.5 мг/кг), что вполне соотносится со значениями действующих концентраций, полученных в электрофизиологических тестах на ооцитах X. laevis, экспрессирующих человеческий канал ASIC3. Это может свидетельствовать о полной биодоступности тестируемых веществ, а также о более эффективном их действии в моделях in vivo.

ВЫВОДЫ:

1. Из яда морских анемон с помощью различных хроматографических методов выделено два новых пептида Her lb-1 и Ugr 9-1, обладающих ингибирующим действием на каналы ASIC3.

2. Установлена аминокислотная последовательность выделенных пептидов; для пептида Ugr 9-1 разработана система получения его рекомбинантного аналога и определена уникальная пространственная структура.

3. Из чабреца Thymus armeniacus выделено низкомолекулярное соединение «севанол», ингибирующее работу ASIC3. Определена уникальная структура «севанола», что позволило отнести его к классу полифенольных соединений лигнанов.

4. Измерена биологическая активность трех выделенных лигандов каналов ASIC3 в электрофизиологических экспериментах. Для Ugr 9-1 и севанола была показана уникальная способность подавлять амплитуду как быстрой, так и медленной составляющей тока ASIC3.

5. В тестах тепловой гиперчувствительности и кислотной стимуляции боли in vivo продемонстрирован анальгетический эффект для севанола и пептида Ugr 9-1.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Осмаков Д.И.. Андреев Я А., Козлов С. А. Получение рекомбинантных биологически активных полипептидов морских анемон. Вестник МГОУ, Серия «Естественные науки» 2010, №3, стр. 7-11.

2. Козлов С.А., Осмаков Д.И.. Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Полипептидный токсин из морской анемоны, ингибирующий протон-чувствительный канал ASIC3. Биоорганическая химия, 2012, 38(6): 653-659.

3. Dubinnyi MA*, Osmakov DI*. Koshelev SG, Kozlov SA, Andreev YA, Zakaryan NA, Dyachenko IA, Bondarenko DA, Arseniev AS, Grishin EV. Lignan from thyme possesses inhibitory effect on ASIC3 channel current. J Biol Chem. 2012; 287(39):32993-33000.

4. Osmakov PI. Kozlov SA, Andreev YA, Koshelev SG, Sanamyan NP, Sanamyan KE, Dyachenko IA, Bondarenko DA, Murashev AN, Mineev KS, Arseniev AS, Grishin EV. Sea anemone peptide with uncommon р-hairpin structure inhibits acid-sensing ion channel 3 (ASIC3) and reveals analgesic activity. J Biol Chem. 2013; 288(32):23116-27.

* авторы внесли равный вклад в работу Патенты РФ:

1. Козловская Э.П., Монастырная М.М., Гладких И.Н., Табакмахер В.М., Кривошапко О.Н., Козлов С.А., Осмаков Д.И.. Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Гришин Е.В. Полипептид из морской анемоны Heteractis crispa, обладающий анальгетическим действием. №2475497 (2012).

2. Козлов С.А., Осмаков Д.И.. Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Гришин Е.В., Дьяченко И.А., Бондаренко Д.А., Мурашев А.Н. Лигнан, обладающий анальгетическим действием. №2491950 (2012).

Тезисы докладов:

1. Осмаков Д.И.. Козлов С.А., Кошелев С.Г., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Полипептидный аналог блокаторов ионных каналов из яда морской анемоны Heteractis crispa. V Российский симпозиум «Белки и пептиды». Петрозаводск, 8-12 августа 2011 года, стр 288.

2. Осмаков Д.И.. Дубинный М.А., Кошелев С.Г., Козлов С.А., Гришин Е.В. Новый компонент из растения Thymus sp., ингибирующий работу кислоточувствительного ионного канала 3 типа. Тезисы докладов и стендовых сообщений XXIV Зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2012 г., стр. 83.

3. Sergey Kozlov, Dmitry Osmakov. Sergey Koshelev, Yaroslav Andreev, Konstantin Mineev, Alexander Arseniev and Eugene Grishin. Natural compounds acting on ASIC3 receptor. 1st Oxford Symposium on venoms 18-20 September 2012, St Hilda's college Oxford, UK p. 19.

4. Андреев Я.А., Осмаков Д.И.. Козлов C.A., Гришин Е.В. Природные модуляторы протонактивируемого канала ASIC3. VI Российский симпозиум «Белки и пептиды». Уфа, 11-15 июня 2013 года, стр. 53.

Заказ № 44-Р/10/2013 Подписано в печать 15.10.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; e-mail: info@cfr.ru

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Осмаков, Дмитрий Игоревич, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской

академии наук

На правах рукописи

04201363645

Осмаков Дмитрий Игоревич ПОИСК ПРИРОДНЫХ ЛИГ АНД ов ПРОТОНАКТИВИРУЕМЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Специальность 02.00.10 — Биоорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: академик, профессор, д.х.н.

Гришин Е.В.

Москва-2013

Оглавление

1. Введение.....................................................................................................................................5

Цель и задачи работы.....................................................................................................................6

2. Обзор литературы....................................................................................................................7

2.1. Введение...............................................................................................................................7

2.2. Структура канала ASIC.......................................................................................................8

2.3. Электрофизиологические свойства и распределение в тканях ASIC каналов.............13

2.4. Модуляторы активности ASIC каналов........................................................................... 16

2.4.1. Ди- и поливалентные катионы..................................................................................16

2.4.2. Низкомолекулярные компоненты.............................................................................19

2.4.3. Модуляторы пептидной природы.............................................................................22

2.5. Роль каналов ASIC в физиологических и патологических процессах.........................29

2.5.1. Участие в физиологических процессах в органах ЦНС.........................................29

2.5.2. Роль каналов ASIC в нейродегенеративных заболеваниях....................................30

2.5.3. Роль ASIC3 в физиологических и патологических процессах...............................33

2.6. Заключение.........................................................................................................................38

3. Материалы и методы исследования...................................................................................39

3.1. Материалы и оборудование..............................................................................................39

3.1.1. Реактивы и материалы...............................................................................................39

3.1.2. Биологический материал и животные......................................................................39

3.1.3. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы.....................................................40

3.1.4. Среды для выращивания бактерий...........................................................................40

3.1.5. Оборудование.............................................................................................................40

3.2. Методы................................................................................................................................42

3.2.1. Обработка биологического материала.....................................................................42

3.2.2. Выделение активных компонентов из биологических смесей..............................43

3.2.2.1. Выделение из экстрактов растений...................................................................43

3.2.2.2. Выделение из экстракта морской анемоны......................................................43

3.2.2.3. Выделение из ядов, полученных механической стимуляцией морских анемон ...............................................................................................................................44

3.2.3. Масс-спектрометрический (МС) анализ..................................................................44

3.2.4. УФ-спектрофотометрия.............................................................................................45

3.2.5. Установление первичной структуры активных соединений..................................45

3.2.5.1. Алкилирование полипептидных компонентов.................................................45

3.2.5.2. Определение А^-концевой аминокислотной последовательности..................46

3.2.5.3. Определение С-концевой аминокислотной последовательности..................46

3.2.6. ЯМР-спектроскопия...................................................................................................46

3.2.7. Измерение биологической активности.....................................................................47

3.2.7.1. Электрофизиологические измерения................................................................47

3.2.7.2. Экспрессия генов, кодирующих каналы ASIC, в ооцитах Xenopus laevis.....47

3.2.7.3. Измерение модулирующей активности на токи каналов ASICla, ASIClb, ASIC2a и ASIC3 (общий протокол)....................................................................................48

3.2.7.4. Измерение модулирующей активности на быструю составляющую тока ASIC3 ...............................................................................................................................48

3.2.7.5. Измерение модулирующей активности на медленную составляющую тока ASIC3 ...............................................................................................................................49

3.2.8. Тестирование анальгетической активности.............................................................50

3.2.8.1. Испытание анальгетической активности в тесте тепловой гиперчувствительности........................................................................................................50

3.2.8.2. Испытание анальгетической активности в тесте кислотной стимуляции боли ...............................................................................................................................50

3.2.9. Получение кДНК из морских анемон.......................................................................51

3.2.10. 3'и 5'RACE-ПЦР...................................................................................................51

3.2.11. Получение рекомбинантного аналога полипептида............................................52

3.2.11.1. Синтез гена полипептида с помощью ПЦР......................................................52

3.2.11.2. Агарозный гель-электрофорез...........................................................................53

3.2.11.3. Получение векторов............................................................................................54

3.2.11.4. Приготовление компетентных клеток..............................................................54

3.2.11.5. Трансформация компетентных клеток электропорацией...............................55

3.2.11.6. Отбор клонов, содержащих плазмиду со вставкой интересующего гена.....55

3.2.11.7. Экспрессия клонированных генов....................................................................56

3.2.11.8. Выделение гибридных белков. Аффинная хроматография............................56

3.2.11.9. Белковый электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)..........................57

3.2.11.10. Гидролиз гибридных белков. Очистка рекомбинантных полипептидов .... 57

3.2.12. Биоинформационные методы................................................................................58

4. Результаты исследования и их обсуждение.......................................................................59

4.1. Выделение и установление структуры лигандов канала ASIC3...................................59

4.1.1. Полипептид из спиртового экстракта анемоны Heteractis crispa..........................60

4.1.2. Полипептиды из яда морской анемоны Utricina grebelnyi.....................................63

4.1.3. Низкомолекулярный компонент из чабреца (Thymus armeniacus)........................67

4.2. Рекомбинантный аналог пептида Ugr 9-1 .......................................................................71

4.3. Действие лигандов на AS1C3 канал, экспрессированный в ооцитах X. laevis.............74

4.3.1. Электрофизиологическое тестирование пептида я-АптТХ Her lb-1...................74

4.3.2. Электрофизиологическое тестирование пептида Ugr 9-1......................................75

4.3.3. Сравнение пептидов л-АпшТХ Her lb-1 и Ugr 9-1 с известными пептидными лигандами ASIC каналов.........................................................................................................79

4.3.4. Электрофизиологическое тестирование севанола...................................................80

4.4. Анальгетические эффекты лигандов ASIC каналов в тестах in vivo............................84

4.4.1. Анальгетический эффект севанола и recUgr 9-1 в тесте тепловой гиперчувствительности............................................................................................................85

4.4.2. Анальгетический эффект севанола и recUgr 9-1 в модели «уксусные корчи».....86

5. Заключение..............................................................................................................................89

6. Выводы.....................................................................................................................................90

7. Список сокращений...............................................................................................................91

8. Список литературы:..............................................................................................................92

1. Введение

Неприятные болевые ощущения и в первую очередь хронические болевые синдромы значительно снижают качество жизни людей. Они часто вызывают физические и эмоциональные страдания, сопровождающиеся депрессией, подавленным настроением и чувством безнадежности. Детальные механизмы возникновения патологических болей до конца не выяснены, но известен ряд клеточных рецепторов, отвечающих за восприятие болевых стимулов и генерацию болевых ощущений. По современным представлениям одними из важнейших рецепторов болевого каскада являются Ка+-селективные кислоточувствительные ионные каналы (ASICs). Было показано, что они ответственны за восприятие снижения рН в тканях, которое может происходить как в норме, так и при патологии. Особое внимание уделяется одному из представителей данных рецепторов -кислоточувствительному каналу 3 типа (ASIC3), который играет ключевую роль среди остальных типов ASICs в периферической нервной системе.

Цель и задачи работы

Цель работы состояла в поиске, выделении и изучении свойств природных веществ,

модулирующих активность ASIC3 рецепторов.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1) тестирование экстрактов растений и ядов беспозвоночных на наличие искомой активности;

2) идентификация и выделение активных компонентов при помощи хроматографических методов;

3) анализ активности выделенных компонентов на ооцитах Xenopus laevis, экспрессирующих канал ASIC3;

4) изучение физико-химических свойств выделенных компонентов;

5) разработка системы гетерологической экспрессии для лиганда пептидной природы;

6) проверка анальгетических эффектов новых лигандов в болевых моделях in vivo.

2. Обзор литературы 2.1. Введение

На сегодняшний день, одной из актуальных задач биохимии и биоорганической химии является поиск и/или создание молекулярных инструментов для исследования механизмов функционирования сенсорных систем живых организмов как в нормальном, так и патологическом состояниях. Сенсорные нейроны, отвечающие за восприятие и развитие ряда физиологических и патологических процессов в организме, экспрессируют различные типы ионотропных рецепторов, каждый из которых, в свою очередь, ответствен за восприятие определенного стимула. Одним из стимулов, приводящих к развитию болевых процессов, является снижение рН внеклеточной среды в организме (состояние, называемое ацидоз), которое имеет место при таких состояниях, как воспалительные процессы в тканях, ишемический инсульт, черепно-мозговая травма, опухоли, повреждение тканей и эпилептический припадок, а также при накоплении молочной кислоты в связи с усилением анаэробного метаболизма глюкозы и высвобождении протонов при гидролизе АТФ [2-4]. Ацидоз может активировать особый тип рецепторов - кислоточувствительные ионные каналы (ASICs) [5], которые в значительном количестве представлены в периферических сенсорных нейронах и нейронах центральной нервной системы (ЦНС) [6-11]. Каналы ASIC относятся к надсемейству амилорид-чувствительных дегенерин/эпителиальных (DEG/ENaC) Na^-каналов [12].

ASICs в большом количестве встречаются в нейронах центральной нервной системы (ЦНС) [13-14], где было обнаружено по крайней мере три (ASICla, ASIC2a и ASIC2b) из шести субъединиц. Из всех субъединиц, представленных в мозге, ASICla является основной. Гомомерные ASICla и гетеромерные ASICla/2b каналы способны проводить как ионы Na^, так и Са2+ [15-16]. Показано, что ASICla и ASIC2 принимают непосредственное участие в процессах синаптической пластичности, обучении, передаче нервного возбуждения [14, 17], ишемических процессах [18-19], эпилепсии [20], кислотоопосредованного нейронального повреждения [21-23].

В нейронах периферической нервной системы в основном представлены ASIC3 и А81СЗ-содержащие каналы [24-25]. Способность этих каналов воспринимать сигналы в виде небольшого снижения рН внеклеточной среды (до значений 7.0 - 6.7), интегрировать различные воспалительные и ишемические стимулы, такие как протоны, АТФ, молочная и

арахидоновая кислоты, повышение осмотического давления [26-29], позволяет рассматривать ASIC3 в качестве одного из основных участников в развитии боли [26, 30-31]. Для периферических ASIC3-содержащих каналов было показано, что они: а) участвуют в восприятии кислотоопосредованной, воспалительной и постоперационной боли [26, 32-33]; б) вносят вклад в развитие первичной и/или вторичной механогиперчувствительности в мышцах [11]; в) участвуют в кожной и висцеральной механочувствительности и восприятии боли от механических стимулов [34-36]; г) участвуют в восприятии болевых сигналов от легких и желудочно-кишечного тракта [37].

Было также показано, что ASICs играют важную роль при некоторых нейродегенеративных расстройствах [10], включая ишемический инсульт [38], болезнь Паркинсона [39], эпилепсию [20, 40], болезнь Хантингтона [41] и аутоиммунный энцефалит [22]. ASICs обнаруживаются не только в нейронах, но также и в раковых клетках [42], костной ткани [43], клетках эпителия и мочевого пузыря [44], в клетках гладких мышц [4546].

Фармакология ASICs на данный момент представляет собой относительно небольшой набор лигандов, по сравнению с потенциал-зависимыми натриевыми каналами [47]. Потенциаторы активности ASIC каналов представлены как низкомолекулярными компонентами, так и молекулами пептидной природы. Ингибиторы активности ASIC каналов представлены как неспецифическими низкомолекулярными молекулами, такими как диуретический препарат амилорид, аспирин, так и высоко специфичными природными токсинами пептидной природы, выделенными из ядов беспозвоночных.

2.2. Структура канала ASIC

Впервые, рецепторы нервных клеток, способные воспринимать экстрацеллюлярное снижение рН, были обнаружены в лаборатории под руководством О. Кришталя еще в 1980 году [48]. Однако клонированы и охарактеризованы данные рецепторы были только в 1997 году группой под руководством М. Лаздунского [5]. Каналы ASIC относятся к надсемейству амилорид-чувствительных дегенерин/эпителиальных (DEG/ENaC) Ыат-каналов. Были клонированы четыре гена {ACCN1 - 4), кодирующие, по меньшей мере, шесть субъединиц данных каналов (ASICla, ASIClb, ASIC2a, ASIC2b, ASIC3 и ASIC4) [8]. Функциональные ASICs представляют собой тримерные комплексы этих субъединиц [49-50], и большинство из

данных субъединиц могут формировать гомомерные и/или гетеромерные каналы [14, 16, 21, 51-54].

ASIC каналы довольно консервативны у различных представителей класса млекопитающих (крыс, мышей и человека). Изоформы крысиных ASICs имеют сходство аминокислотной последовательности от 45 до 80%. Также были охарактеризованы ASICs из других организмов, таких как лягвы (жабовидная рыба), миноги, акулы и данио рерио (представитель карповых) [55-56]. Как и у всех представителей Deg/ENaC каналов, мембранная топология индивидуальной субъединицы ASIC канала представляет собой два трансмембранных домена (ТМ1 и ТМ2), связанных большой цистеин богатой экстрацеллюлярной петлей, с короткими внутриклеточными амино- и карбокси- концевыми участками (рис.1) [57]. Домен jV-концевого участка участвует в селективности и открывании канала [58-59]. ТМ2 домен и С-концевой участок ТМ1 домена участвуют в формировании поры в мембране. ТМ1 спиральный сегмент взаимодействует с ТМ2 спиралью той же субъединицы, а также контактируют с ТМ1 и ТМ2 спиралями соседних субъединиц [60]. В поре, формируемой ASIC каналом, выделяют четыре участка - верхний, центральный, внеклеточный и внутриклеточный [50].

Экстрацеллюлярный участок канала имеет форму «сжатой кисти», состоящей из

доменов «запястье» (wrist), «ладонь» (palm), «палец» (finger), «кулак» (knuckle), «Р-шар» (Р-

ball) и богатого цистинами домена «большой палец» (thumb) (рис.1 А) [49-50]. Весь участок

занимает 2/3 части всей субъединицы. В нем содержится 7 а-спиралей (а 1-7) и 12 Р-слоев ф1-

12) [49], а также 14 дисульфидных связей, которые являются довольно консервативными

среди DEG/ENaC каналов [61]. Домен «ладонь» содержит 7 Р-тяжей и является центральным

элементом в экстрацеллюлярной части, формируя больше всего контактов с остальными

участками канала. Домен «запястье», состоящий из двух упорядоченных петель, соединяет

остальную экстрацеллюлярную часть с ТМ доменами. Первая часть экстрацеллюлярной

петли, идущая после ТМ1 (остатки 63-185 у канала ASIC 1а) более вариабельна, чем высоко

консервативная вторая часть (остатки 186—432). В piO-слое в домене «ладонь», и в участке,

расположенном между аб и а7-спиралями в домене «кулак», находятся два консервативных

сайта гликозилирования Asn367 и Asn394, играющих важную структурную роль в процессе

восприятия протонов [49, 57, 62-63]. Также установлена важная структурная роль для

аминокислотных остатков (а.о.): Aspl07 в al и Argl53 в аЗ-спиралях домена «палец» у ASIC3

канала формируют кислотно-основное взаимодействие [64]; Тгр287 домена «большой палец»

и Туг71 домена «кисть» у ASIC1 взаимодействуют между собой и участвуют в процессе открывания канала (рис.1 А) [65]. Пара остатков Asp79-Glu80 являетс