Синтез модифицированных аналогов стероидных эстрогенов

Цогоева, Светлана Батразовна

Синтез модифицированных аналогов стероидных эстрогенов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Цогоева, Светлана Батразовна АВТОР

кандидата химических наук УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ

Санкт-Петербург МЕСТО ЗАЩИТЫ

1998 ГОД ЗАЩИТЫ

02.00.10 КОД ВАК РФ

Диссертация по химии на тему «Синтез модифицированных аналогов стероидных эстрогенов»

Автореферат диссертации на тему "Синтез модифицированных аналогов стероидных эстрогенов"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

. г.) о л

на правах рукописи

- з СЕН ¡390

ЦОГОЕВА Светлана Батразовна

СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ ЭСТРОГЕНОВ

02.00.10 — Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Шавва А.Г.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Ивин Б.Л. доктор биологических наук, Пиотровский Л.Б.

Ведущая организация: Институт органической химии имени П.Д. Зелинского РАН, г. Москва

Защита состоится 04МО. 1998 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 063.57.03 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора химических наук в Санкт-Петербургском государственном университет по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, (БХА).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке имени A.M. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан /в. 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

Ю.П. Арцыбашева.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. За последние 10 лет значительно активизировались исследования по расширению практического применения в медицине аналогов эстрогенов. Использование эстрогенов при заместительной терапии подтвердило их значимость для профилактики ряда сердечнососудистых заболеваний (в частности, атеросклероза), остеопороза, болезни Алцгеймера и т.д. Эстрогены и их частичные агонисты рекомендованы для профилактики и лечения эстрогенозависимых онкологических болезней.

В то же время, отношение клиницистов к эстрогенам продолжает оставаться настороженным. Это связано с небольшим, но статистически достоверным увеличением числа опухолевых заболеваний у больных, в течение длительного времени (порядка 15 лет) применявших данную группу гормонов, хотя и признается, что их польза при заместительной терапии существенно выше потенциального вреда.

Создание моделей гормон-рецепторного связывания должно помочь в отборе соединений с избирательным биологическим действием, лишенных гормональных эффектов. Предложено несколько таких моделей, наиболее известная принадлежит Катценелленбогену с соавторами. Она имеет ряд ограничений, например, не описывает эффекты 8-изоаналогов стероидных эстрогенов. Это является существенным недостатком, поскольку представители данного стереохимического ряда могут обладать улучшенным соотношением между гипохолестеринемической и утеро-тропной активностями. Единственная модель, позволяющая предвидеть изменения гормональных свойств в результате модификации 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, предложена в 1987 г А.Г. Шаввой, однако ее предсказания носят чисто качественный характер и поэтому она нуждается в уточнении.

Настоящая работа является подготовительным этапом в создании модели гормон-рецепторного связывания, которая позволила бы полуколичественно описывать гормональные эффекты аналогов стероидных эстрогенов с неприродным сочленением колец.

Цель работы:

1) синтезировать новые 8-изоаналоги стероидных эстрогенов для расширения базы данных по их биологической активности;

2) исследовать направление реакции ионного гидрирования 6-окса-1,3,5(10),8,14-эстрапентаенов, допуская возможность синтеза, в результате этой реакции и последующих превращений, соответствующих 8,14-изоаналогов;

3) изучить пространственную структуру ряда стероидных эстрогенов

с неприродным сочленением колец для последующего анализа связывающего центра рецепторов эстрадиола.

Научная новизна. Синтезированы новые 8-изоаналоги стероидных эстрогенов, получены данные о некоторых их биологических свойствах. Проведено полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 'Н и ,3С ацетата 3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17р-ола (30), ацетата 3-метокси-6-окса-0-гомо-1,3,5(10)-эстратриен-17аР-ола (60), ацетата 3-метокси-6-окса-7а-метил-0-гомо-8,14-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17аР-ола (65) и выявлены критерии, позволяющие относить аналогичные соединения к тому или иному стереохимическому ряду. Изучены молекулярные структуры ряда 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, уточнены расстояния между атомами кислорода О1 и О2 и выявлены некоторые закономерности по связи между строением этих веществ и их биологической активностью.

Практическая ценность. Получены соединения, нормализующие содержание холестерина в сыворотке крови крыс в условиях экспериментальной гиперлипидемии и лишенные эстрогенной активности. Такие вещества перспективны при поиске потенциальных лекарственных препаратов для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний (в частности атеросклероза).

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Синтез 8-изоаналогов стероидных эстрогенов с ацетильной группой при С2, лишенных гормональной активности, при сохранении гипо-холестеринем ической.

2. Синтез 6-оксааналогов стероидных эстрогенов с различным сочленением колец в результате ионного гидрирования 6-окса-1,3,5(10),8,14-эстрапентаенов.

3. Выявление критериев, позволяющих относить к тому или иному стереохимическому ряду 6-оксааналоги стероидных эстрогенов по данным *Н и 13С ЯМР-спектроскопии.

4. Особенности строения 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, имеющих заместители в кольцах А и В (по данным рентгеноструктурного анализа).

общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), 10 Международной конференции: «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Суздаль, 1998г).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 стр. и состоит из литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и приложения (32 страницы).

В обзоре литературы рассмотрены ключевые работы по исследованию взаимосвязи структура - биологическая активность и механизма действия стероидных эстрогенов, обсуждены их достоинства и недостатки.

В главе «Обсуждение результатов» обосновывается выбор модельных соединений, необходимых для решения поставленных задач, и схем синтеза, необходимых для их получения, доказательство строения новых соединений. Подробно обсуждаются данные по определению пространственной структуры полученных веществ.

Диссертация содержит 8 схем, 9 рисунков и 16 таблиц, список литературы состоит из 202 наименований.

Содержание работы

1. Синтез и исследование биологической активности новых 8-изоаналогов стероидных эстрогенов

Мы решили изучить две модификации, имеющие принципиальное значение для уточнения модели гормон^дрецепторногэ взаимодействия. Первая из них - введение ацетильной^в положение 2 8-изоаналогов стероидных эстрогенов. Выбор этой модификации связан с публикацией О.М. AboulWafa с соавторами (Steroids. - 1992. - V. 57, N 4. - Р. 199-204), показавшими, что введение ацетильной группы в положение 2 эстрогенов природного ряда не вызывает падения гормональной активности. Поскольку по модели А.Г. Шаввы (1987 г) данная модификация должна привести к сильному падению утеротропной активности, представлялось целесообразным проверить на достаточно широком круге объектов предсказательную способность этой модели.

При синтезе 8-изоаналогов эстрогенов с ацетильной группой при С2 (11, 15, 18, 21, 23, 31, 38, 40) применили реакцию Фриделя-Крафтса, получив исходные стероиды по схеме Торгова-Ананченко (AB-D-C) в модификации Вендлера (схемы 1-2). Ацилирование проводили под действием уксусного ангидрида в нитробензоле в присутствии хлористого алюминия при 0°С. Полученные стероиды очищали методом флэш-хроматографии или кристаллизацией до тех пор, пока, по данным ВЖЭХ,

чистота препаратов оказывалась не менее 99.5%. Выходы продуктов реакции составили 68% (11), 44% (15), 79% (18), 45% (21), 58% (23), 79% (31), 80% (38), 64% (40).

Состав и строение всех целевых соединений подтверждены данными элементного анализа, ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

В литературе описаны случаи осложненного протекания каталитического гидрирования 6-оксааналогов стероидных эстрогенов с 8(9)- или 9(11)-двойной связью (из-за предварительной изомеризации двойной

ын2

Э-С^ +АсО-ЫН,

СН,0

снр ^^ о

(34)

снр

] I Ас I;- .

Н Т н Ас;0, РУ> Т ]Г н Т н о^ с6н5мо2 снр^^сГ

СН.О" "О" с Н N0 СНз° /лт

(39) (40)

связи под действием Рс1/С) и неверного установления строения целевых продуктов. Поэтому возникла необходимость исследования спектров ПМР и ЯМР |3С 6-оксааналогов стероидных эстрогенов и выявления критериев, по которым новые соединения могут быть отнесены к тому или иному стереохимическому ряду.

Методом гетероядерной корреляционной спектроскопии, ЖШБУ эксперимента и методик двойных гомоядерных резонансов нами исследован ацетат (±)-3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17Р-ола (30). В результате, проведено полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 13С и 'Н и определены все геминальные и вицинальные КССВ. Сравнение

Схема 2

полученных спектральных характеристик со спектрами известных кар-боаналогов 8-изоряда показывает, что величины химических сдвигов ядра С1 весьма близки и, следовательно, этот параметр может использоваться для отнесения близких по строению соединений к 8-изоряду и в случае 6-оксааналогов эстрогенов.

Таблица 1. Химические сдвиги сигналов 13С и 'Н (м.д.) в ацетате 3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17Р-ола (30) при 20 °С.

Атом "С 'II Атом "С 'Н

1 130.1 6.98 12 36.6 1.33(12а), 1.75(12(3)

2 107.3 6.47 13 41.4 -

3 158.8 - 14 45.3 1.77

4 101.3 6.36 15 22.1 1.62(15(3), 1.7(15а)

5 155.2 - 16 26.7 1.48(16Р), 2.2(16а)

7 64.1 4.07(7р), 4.17(7а) 17 81.9 4.63

8 36.1 2.38 18 13.5 0.83(с)

9 36.9 2.55 МеО-3 55.1 3.74(с)

10 119.5 - СН3СОО-17р 21.0 170.9 2.04(с)

И 28.1 1.65(11(3), 1.85(11а)

Данные биологических исследований, проведенных в лаборатории эндокринологии НИИ онкологии, показали, что соединения 8-изоряда, содержащие ацетильную группу при С2, практически не имеют утеро-тропного действия, что выражено как в отсутствии влияния препаратов на «влажный» вес матки, так и на индукцию синтеза рецепторов прогестерона. Некоторые из этих веществ обладают гипохолестеринемической активностью и могут представлять интерес при создании лекарственных препаратов для лечения атеросклероза.

Представлялось целесообразным синтезировать 8-изоаналоги стероидных эстрогенов с ацетоксигруппой при С2 для изучения их утеротроп-ной активности и оценки потенциальной опасности их применения, т.к. известно, что катехолэстрогены могут вызывать пролиферативные процессы в тканях репродуктивных органов.

Из 8-изоаналогов эстрогенов с ацетильной группой при С2 (11), (18), (31) синтезированы аналоги (12), (19) и (32) окислением по Байеру-

Виллигеру под действием м-хлорнадбе изо иной кислоты в СН2С12 в присутствии Ыа2НР04 (схема 1, 2). Выходы целевых продуктов составляют 80%, 75% и 58%, соответственно.

Биологические испытания этих соединений свидетельствуют об отсутствии у них утеротропной активности.

2. Синтез 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, содержащих формильную группу в ароматическом кольце

8-Изоаналоги эстрогенов с формильной группой в ароматическом кольце могут служить промежуточными соединениями для частичного синтеза эстрогенов с различными заместителями при С2 или С4.

При формилировании 6-оксааналога (30) а,сс-дихлордиметиловым эфиром под действием хлористого алюминия в нитробензоле происходит

(44)

ОАс

СНаОН (45)

преимущественное образование 2-формильного аналога (41). Выход целевого продукта после очистки методом флэш-хроматографии составляет 37%.

Форматирование в тех же условиях соответствующего карбоаналога (10) приводит к образованию 4-формилыюго производного (44) с выхо-

дом 51%. Альдегидные группы в соединениях (41) и (44) восстанавливали боргидридом натрия в водном диоксане с последующим ацетилиро-ванием продуктов реакции уксусным ангидридом в пиридине, получали ацетаты (43) и (46) с выходами 54% и 73%, соответственно (в расчете на исходные формильные аналоги). Строение целевых соединений установлено по данным спектров ЯМР 13С и 'Н.

3. Синтез 4-метил-6-окса-8-изоаналогов стероидных эстрогенов

Для получения модельных соединений (53) и (55) мы воспользовались схемой полного синтеза по Торгову-Ананченко в модификации Вендлера. Обычным путем нз (47) получали изотиурониевую соль (49)

(выход 77%), из которой легко синтезировали секосоединение (50) (выход 86%). Циклодегидратацию провели под действием соляной кислоты в метаноле. Эстрапентаен (51), полученный с выходом 80%, превращали в ацетоксианалог (52). Каталитическое гидрирование соединения (52) на никеле Ренея в бензоле при температуре 60-100°С и давлении 80-150 атм приводит, как и ожидалось, к получению соответствующего 8-изоаналога (53) с выходом 67%. Эстрапентаен (51) гидрировали в тех же условиях, продукт реакции окисляли реактивом Саретта, с выходом 61% получали кетосоединение (55).

Строение целевых соединений следует из их спектральных характеристик. Сигналы в спектрах ЯМР 'н и 13С отнесены на основании экспе-

риментов по гомоядерному двойному резонансу и гетероядерной корреляционной спектроскопии.

Введение метальной группы в положение 4 приводит к смещению сигналов атомов С1, С2, С3 и С5 в сильнопольную область спектра на ~2-3.3 м.д., в то время как сигнал атома С4 сдвигается в более слабое поле.

4. Синтез ацетата 3-метоксн-6-оксо-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17р-ола (16)

Важной модификацией, имеющей принципиальное значение для уточнения модели гормон-рецепторного взаимодействия, является введение кетогруппы в положение 6 8-изоаналогов стероидных эстрогенов. Причиной этого выбора является точка зрения Катценелленбогена с соавторами (G.M. Anstead et al. Steroids. - 1997. - V.62. - N 3. - Р. 268-303) о том, что данная модификация в соединениях природного ряда вызывает падение сродства к рецепторам эстрадиола за счет неблагоприятного пространственного взаимодействия рецептора с карбонильной группой (наблюдалось падение сродства примерно в 5 раз). С нашей точки зрения, это изменение в сродстве вполне могло быть вызвано влиянием на кислотные свойства фенольной гидроксштьной группы.

На примере модельного соединения (16) представлялось интересным выяснить, как скажется введение кетогруппы в положение 6 8-изоаналогов эстрогенов, содержащих метоксигруппу при С3, на величине утеротропной активности.

Целевой 6-кетоаналог (16) синтезировали обычным путем, а именно окислением соответствующего ацетата 3-метокси-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17р-ола (10) бихроматом натрия в уксусной кислоте в присутствии уксусного ангидрида с выходом 10% (схема 1). Спектральные характеристики целевого продукта совпали с литературными данными.

Изучение биологической активности соединения (16) показало, что введение кетогруппы в положение 6 8-изоаналогов стероидных эстрогенов с метоксигруппой при С3 не приводит к уменьшению утеротропной активности, наблюдается даже тенденция к ее росту. Такой результат определил необходимость исследования аналога (16) методом рентгено-структурного анализа для изучения взаимосвязи между его строением и биологической активностью.

5. Ионное гидрирование 6-окса-1,3,5(10),8,14-эстрапентаенов

На примере ионного гидрирования модельных соединений (29) и (57) мы показали, что основными продуктами реакции являются 6-окса-

Схема 5

ОАс

снр

14-изо-1,3,5(10),8(9) эстратетраены (56) и (58) (выходы 81% и 90%, соответственно).

Однако, при гидрировании 6-окса-0-гомо-1,3,5(10),8,14-эстрапента-ена (59) наблюдается восстановление обеих двойных связей с образованием аналога природного ряда (60) (выход 30%).

Ионное же гидрирование Б-гомоаналога с метальной группой при С7 (64) приводит к образованию производного 8,14-изоряда (65) с выходом 64%. Гидролиз соединения (65) гидроокисью натрия в смеси метиловый спирт-бензол с последующим окислением продукта реакции реактивом Саретта приводит к образованию стероида (66).

снр

сн,о

о * * сн3о о сн3 3 сн3о ^ о

(64) 0 3 (65) (66)

Ионное гидрирование проводили в течение 24 ч при комнатной температуре в бензоле.

Строение стероидов (56) и (58) доказано методами спектроскопии ЯМР 'Д^и 13С и масс-спектрометрии. Для доказательства строения соеди-неншниспользована методика гомоядерных двойных резонансов, что позволило определить большинство констант спин-спинового взаимодействия и отнести сигналы протонов. Методом гетероядерной корреляционной спектроскопии проведено полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 13С (табл. 2). Сопоставление спектральных характеристик соединений природного ряда (60) и 8-изоряда (30) (табл. 1 и 2) позволяет сделать

сн,

заключение, что при установлении строения подобных соединений удобнее всего ориентироваться на величины химических сдвигов атомов С1, С7,С9,Сп,С13иС18.

Таблица 2. Химические сдвиги сигналов 13С и *Н (м.д.) в ацетате З-метокси-б-окса-О-гомо-1,3,5( 10)-эстратриен-17ар-ола (60).

Атом "С ■н Атом "С 'Н

1 126.0 7.05 12 36.2 1.30(12а), 1.82(120)

2 106.4 6.44 13 38.0 -

3 159.0 - 14 45.4 1.12

4 100.9 6.34 15 22.7 1.18(15р), 1.48(15а)

5 154.5 - (6 23.6 1.8(160), 1.34(16а)

7 69.7 3.73(7 а), 4.38(73) 17 26.4 1.58(17Р), 1.75(17а)

8 35.8 1.70 17а 80.7 4.57

9 39.5 2.37 18 11.6 0.94(с)

10 118.0 - МеО-3 55.2 3.75(с)

11 24.6 1.40(11Р), 2.21(11а) СН3СОО-17ар 21.1 170.7 2.04(с)

Установленное строение стероида (60) подтверждено методом рент-геноструктурного анализа (РА).

6. Каталитическое гидрирование ацетата 3-метокси-6-окса-14-изо-1,3,5(10),8(9)-эстратетраен-17р-ола (56)

Известно, что каталитическое гидрирование 1,3,5(10),8(9)-эстратетраенов чаще всего протекает с а-стороны молекулы, независимо от конфигурации хирального центра С14. Из соответствующих 14ос-изомеров образуются аналоги 8-изоряда, а 14р-изомеров - 8а,14Р-аналоги. Представлялось интересным провести каталитическое гидрирование 6-окса-1,3,5(10),8(9)-эстратетраенов 14-изоряда. При гидрировании стероида (56) на никеле Ренея в бензоле при повышенном давлении получен уникальный результат: соединение 14-изоряда превращается не в 8а,143-аналог, как ожидалось, а в 8-изоаналог. Одним из возможных объяснений такого необычного результата может быть протекание реакции дегидрирования с образованием промежуточного эстрапентаена (29).

Спектральные характеристики полученного стероида и соединения (30), для которого проведено полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР 'Н и "С и определены все КССВ, полностью совпали, что позволило приписать целевому продукту структуру (30).

7. Конформационнын анализ ацетата 3-метокси-6-окса-7а-метил-0-гомо-8,14-нзо-1,3,5(10)-эстратрисн-17а р-ола (65)

Методом рентгеноструктурного анализа установлено, что стероид (65), полученный в результате ионного гидрирования 6-оксаэстрапентаена (64), существует в кристалле в конформации (65а).

В спектре ЯМР 13С ацетата 3-метокси-6-окса-7сс-метил-0-гомо-8,14-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17аР-ола (65), снятом при частоте 50.33 МГц (300°К, CDC13) ряд сигналов был значительно уширен. Это могло указывать на присутствие в растворе различных конформации. Для более тщательного изучения данной молекулы были сняты спектры ЯМР 13С (125.77 МГц) и 'Н (500.13 МГц) в температурном интервале 233-333°К, анализ которых позволил выявить существование двух конформеров.

При 233 °К удалось зарегистрировать все пары обменивающихся 'Н и 13С сигналов, соответствующие двум конформерам (65а) и (656) и провести полное отнесение линий в их спектрах.

Эксперименты по гомоядерному ^н двойному резонансу позволили установить основные константы спин-спинового взаимодействия между протонами в обоих конформерах.

Мы рассчитали наиболее вероятные конформации исследуемой мо-лекулыметодом неограниченной молекулярной механики (ММ). Для кон-формаций, обладающих минимальной энергией, была проведена полная оптимизация геометрии с использованием полуэмпирических методов расчета молекулярных орбиталей (AMI и РМЗ). Сравнение полученных результатов с данными рентгеноструктурного анализа показало, что методы РМЗ и AMI не позволяют предсказывать преимущественную кон-формацию молекулы, несмотря на то, что рассчитанные геометрические параметры оказались близки соответствующим величинам, полученным с помощью рентгеноструктурного анализа.

Впервые обнаруженное явление конформационного равновесия в ряду стероидных гормонов является первым шагом в поиске факторов, определяющих существование аналогов эстрогенов в различных конфор-

Н,С о Ас.

мациях, и выявлении модификаций, вызывающих значительную конфор-мационную перестройку. Такие соединения могут представлять интерес с точки зрения перспективности получения антиэстрогенов, антиандроге-нов и, возможно, сильных ингибиторов ряда ферментов стероидного метаболизма.

Таблица 3. Химические сдвиги сигналов 13С и 'Н (м.д.) в (65) при 233°К

конформер (65а) конформер (656)

Атом "С 'Н "С 'II

1 127.2 7.12 129.9 6.98

2 106.9 6.48 107.3 6.46

3 158.3 - 158.2 -

4 101.0 6.3 100.0 6.32

5 153.16 - 154.7 -

7 70.2 4.58(7Р) 72.4 4.31(7|3)

7а 18.9 1.23 19.9 1.45

8 33.9 1.93 46.4 1.63

9 27.9 3.15 32.1 2.85

10 114.5 - 119.4 -

11 22.1 2.1(ПР), 1.92(11а) 29.7 1.78(11Р), 1.40(11а)

12 29.5 0.93(12Р), 1.29(12а) 29.3 1.84(12Р), 1.07(12а)

13 36.9 - 36.1 -

14 40.4 1.44 36.7 1.96

15 20.7 1.66(15(3), 1.70(15а) 28.3 1.83(15р), 1.66(15а)

16 19.9 1.58(16Р), 1.43(16а) 20.1 1.47(16Р), 1.57(16«)

17 27.4 1.56(17(3), 1.74(17а) 25.8 1.63(170), 1.55(17«)

17а 70.6 5.3 78.9 4.52

18 22.6 0.873(с) 24.3 0.924(с)

МеО-3 55.1 3.74(с) 55.2 3.73(с)

СН3СОО-17ар 21.5 171.4 2.05(с) 21.5 170.8 2.10(с)

8. Структуры молекул 8-изоаналогов стероидных эстрогенов

Известно, что 8-изоаналоги стероидных эстрогенов могут обладать высоким сродством к цитоплазматическим рецепторам эстрадиола (С.Н. Ананченко с сотр. 1975). Сродство к рецептору может определяться как расстоянием между атомами О1 и О2, так и пространственной структурой

стероида. Методом рентгеноструктурного анализа нами изучены структуры молекул 8-изоаналогов стероидных эстрогенов (10), (16), (30), (31), (67), (68), (69), (70) в целях выявления закономерностей по связи между их строением и биологической активностью.

Сопоставление особенностей структур исследованных 8-изоаналогов с таковыми, известными в литературе, подтвердило наличие характерного для 8-изоаналогов эстрогенов, скручивания стероидного ядра в области сочленения колец В и С. Сочленение колец В и С - цис-1\т&, а С и D - 13р,14а-/ира«с-типа. Положения атомов Н при С8, С9 и С14 относительно фрагмента С9С8С14 аналогичны их положениям в эстрогенах 8-изоряда. В молекулах (34) и (35) углеродный атом СЗа метоксигруппы имеет /п/?а/(с-ориентацию относительно связи С2-СЗ, тогда как в остальных молекулах он находится в г/ис-положении к этой связи.

Сравнение геометрических параметров соединений (16), (30), (31),

(67), (68), (69), (70) с параметрами наименее модифицированного аналога (10) дает возможность заключить, что наличие заместителей в кольцах А

и В соединений 8-изоряда оказывает незначительное влияние на конформацию стероидного скелета в целом. Наблюдаются лишь незначительные искажения в кольцах В и D.

Рис.1. Перспективный вид молекулы соединения (10) поданным РСА. Расстояние между

О и О в исследованных 8-изоаналогах равно, соответственно, 10.938 А в (10), 10.896 А в (30), 10.866 Á в (31), 10.956(8) А в (67), 10.973 А в (68), 10.927 А в (69), 11. 050 А в (70), что сравнимо с расстоянием 10.93 А в молекуле эстра-диола. Исключение составляет соединение (16), где атомы О1 и О2 находятся на расстоянии 10.789 А. Существующее в литературе представление о более коротком расстоянии О1 - О2 в соединениях 8-изоряда (-10.3 А) не соответствует действительности.

Результаты биологических исследований свидетельствуют о сильном уменьшении утеротропной активности соединений (30), (31), (67),

(68), (69), (70) по сравнению с (10). Гормональная активность аналога

(16) сохраняется такой же как в (10), несмотря на некоторое изменение расстояния О1 - О2. Полученные данные позволяют предположить, что снижение гормональной активности модифицированных аналогов (30), (31), (67), (68), (69), (70) является результатом неблагоприятного пространственного взаимодействия заместителей в кольцах А и В с рецептором эстрадиола, т.к. структурная комплементарность стероидных эстрогенов рецепторам эстрадиола предусматривает определенное строение молекул стероидов. Вопрос же о характере влияния кетогруппы при С6 на образование гормон-рецепторного комплекса остается открытым. Для однозначного объяснения полученного результата необходимы данные рентгеноструктурного анализа рецептора эстрадиола в комплексе с соединением (16).

Выводы

1. Введение ацетильной группы в положение 2 8-изоаналогов стероидных эстрогенов может приводить к образованию соединений с гипохо-лестеринемической активностью при полном отсутствии утеротропного действия, в отличие от той же модификации в соединениях природного ряда. Падение эстрогенной активности в результате такой модификации находится в соответствии с предложенной ранее моделью гормон-рецепторного связывания.

2. На примере 17р-ацетокси-3-метокси-6-оксо-8-изо-1,3,5(10)-эстратриена показано, что введение кетогруппы в положение 6 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, содержащих метоксигруппу при С3, не приводит к уменьшению утеротропной активности, в отличие от соединений с природным сочленением колец и их 8-изоаналогов, имеющих гидроксильную группу при С3.

3. Исследованы спектры ЯМР 'н и 13С 6-оксааналогов стероидных эстрогенов и выявлены критерии, позволяющие легко устанавливать стереохимию подобных соединений методом ЯМР-спектроскопии.

4. Установлено, что результат ионного гидрирования 6-окса-1,3,5(10),8,14-эстрапенгаенов под действием триэтилсилана и трифторук-сусной кислоты определяется как величиной кольца Э, так и заместителем при С7.

5. Для уточнения модели гормон-рецепторного связывания исследованы молекулярные структуры ряда 8-изоаналогов стероидных эстрогенов. Выяснено, что введение метильных групп в положение 1, 4 и 7а не вызывает значительных изменений конформации молекул.

Расстояния О'-О2 в соединениях 8-изоряда и аналогичных эстрогенах природного ряда очень близки.

Основное содержание диссертации изложено

в следующих работах:

1) Г.Л. Старова, С.Б. Цогоева, А.Г. Шавва. Рентгеновское исследование молекулярной структуры ацетата (±)-3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17р-ола. // Национальная конф. по применению рентгеновского, синхротронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов: Тез. докл., 25-29 мая 1997 г., Москва-Дубна, 1997 г. - С. 155.

2) С.И. Селиванов, С.Б. Цогоева, А.Г. Шавва. Особенности определения межпротонных расстояний в малых молекулах на основе >ЮЕ8У-спектров. // 5 Всерос. семинар по спектроскопии ЯМР: Материалы семинара, 9-10 декабря 1997 г., Москва, 1997. - С. 17.

3) С.И. Селиванов, С.Б. Цогоева, А.Г. Шавва. Полное отнесение в спектрах 'Н и 13С ЯМР ацетата рацемического 3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17р-ола // 5 Всерос. семинар по спектроскопии ЯМР: Материалы семинара, 9-10 декабря 1997 г., Москва, 1997. - С. 57.

4) Г.Л. Старова, С.Б. Цогоева, А.Г. Шавва. Молекулярная структура ацетата (±)-3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17Р-ола. // Кристаллография. - 1998. Т. 43. - N 1. - С. 36-38.

5) С.Б. Цогоева, Г.Л. Старова, А.Г. Шавва. Рентгеноструктурный анализ 8-изоаналого стероидных эстрогенов. // II Научная сессия УНЦХ: Тез. докл., 2-6 марта 1998 г., Санкт-Петербург, 1998. - С. 201-203.

6) С.Б. Цогоева, И.И. Елисеев, С.И. Селиванов, Г.Л. Старова, А.Г. Шавва. Конформационный анализ 8,14-изоаналогов стероидных эстрогенов. // II Научная сессия УНЦХ: Тез. докл., 2-6 марта 1998 г., Санкт-Петербург, 1998. - С. 203-204.

7) С.Б. Цогоева, А.Г. Шавва. Ионное гидрирование 6-оксааналогов стероидных эстрогенов. // II Научная сессия УНЦХ: Тез. докл., 2-6 марта 1998 г., Санкт-Петербург, 1998. - С. 204-205.

8) Г.Л. Старова, С.Б. Цогоева, И.И. Елисеев, А.Г. Шавва. Изучение взаимосвязи между строением и биологической активностью 8-изоаналогов стероидных эстрогенов. // 16 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, посвященный 250-летию отечественной химической науки: Рефераты докладов и сообщений № 4, 25-29 мая 1998 г., Москва, 1998 г. - С. 148-149.

9) Г.Л. Старова, С.Б. Цогоева, И.И. Елисеев, А.Г. Шавва. Молекулярные структуры ацетатов 3-метокси-7а-метил-8,14-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17р-ола и 3-метокси-6-окса-7а-метил-0-гомо-8,14-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17аР-ола. // Национальная кристаллохимическая конференция: Тез. докл., 24-29 мая 1998 г., Черноголовка, 1998 г. - С. 297.

10) С.И. Селиванов, С.Б. Цогоева, А.Г. Шавва. Конформационное равновесие 17аР-ацетокси-7а-метил-3-метокси-6-окса-0-гомо-8,14-изо-1,3,5( 10)-эстратриена в растворах, изученное методами 'Н и 3С ЯМР. // 10 Международная конференция: "Магнитный резонанс в химии и биологии": Тез. докл., 1-7 июня 1998 г., Суздаль, 1998 г. - С. 191.

Текст научной работы диссертации и автореферата по химии, кандидата химических наук, Цогоева, Светлана Батразовна, Санкт-Петербург

✓

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

СИНТЕЗ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ СТЕРОИДНЫХ

ЭСТРОГЕНОВ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата химических наук

на правах рукописи

ЦОГОЕВА СВЕТЛАНА БАТРАЗОВНА

Научный руководитель: док. хим. наук, профессор А.Г. Шавва

Санкт-Петербург

1998

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. За последние 10 лет значительно активизировались исследования по расширению практического применения в медицине аналогов эстрогенов. Использование эстрогенов при заместительной терапии подтвердило их значимость для профилактики ряда сердечно-сосудистых заболеваний (в частности, атеросклероза), остеопороза, болезни Алцгеймера и т.д. Эстрогены и их частичные агонисты рекомендованы для профилактики и лечения эстрогенозависимых онкологических болезней.

Создание моделей гормон-рецепторного связывания должно помочь в отборе соединений с избирательным биологическим действием, лишенных гормональных эффектов. Предложено несколько таких моделей, наиболее известная принадлежит Катценелленбогену с соавторами. Она имеет ряд ограничений, например, не описывает эффекты 8-изоаналогов стероидных эстрогенов. Это является существенным недостатком, поскольку представители данного стереохимического ряда могут обладать улучшенным соотношением между гипохолестеринемической и утеротропной активностями. Единственная модель, позволяющая предвидеть изменения гормональных свойств в результате модификации 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, предложена в 1987 г А.Г. Шаввой, однако ее предсказания носят чисто качественный характер и поэтому она нуждается в уточнении.

Настоящая работа является подготовительным этапом в создании модели

гормон-рецепторного связывания, которая позволила бы полуколичественно описывать гормональные эффекты аналогов стероидных эстрогенов с неприродным сочленением колец. Цель работы:

3) изучить пространственную структуру ряда стероидных эстрогенов с неприродным сочленением колец для последующего анализа связывающего центра рецепторов эстрадиола.

Научная новизна. Синтезированы новые 8-изоаналоги стероидных эстрогенов, получены данные о некоторых их биологических свойствах. Проведено полное отнесение сигналов в спектрах ЯМР и 13С ацетата 3-метокси-6-окса-8-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17(3-ола (54), ацетата 3-метокси-б-окса-Б-гомо-1,3,5(10)-эстратриен-17аР-ола (89), ацетата З-метокси-6-окса-7а-метил-0-гомо-8,14-изо-1,3,5(10)-эстратриен-17а(3-ола (94) и выявлены критерии, позволяющие относить аналогичные соединения к тому или иному стереохимическому ряду. Изучены молекулярные структуры ряда 8-изоаналогов стероидных эстрогенов, уточнены расстояния между атомами

1 9

кислорода О и О и выявлены некоторые закономерности по связи между строением этих веществ и их биологической активностью. Практическая ценность. Получены соединения, нормализующие содержание холестерина в сыворотке крови крыс в условиях экспериментальной гиперлипидемии и лишенные эстрогенной активности. Такие вещества перспективны при поиске потенциальных лекарственных препаратов для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний

(в частности атеросклероза).

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Синтез 8-изоаналогов стероидных эстрогенов с ацетильной группой при С2, лишенных гормональной активности, при сохранении гипохолестеринемической.

3. Выявление критериев, позволяющих относить к тому или иному стереохимическому ряду 6-оксааналоги стероидных эстрогенов по

1 13

данным Ни СЯМР-спектроскопии.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в виде статьи и тезисов докладов. Результаты исследований докладывались на городском семинаре по ЯМР-спектроскопии (Санкт-Петербург, 1997 г), Национальной конференции по применению рентгеновского, синхронного излучений, нейтронов и электронов для исследования материалов (Москва-Дубна, 1997 г), У Всероссийском семинаре по спектроскопии ЯМР (Москва, 1997), II Научной сессии Учебно-Научного Центра Химии (Санкт-Петербург, 1998), Национальной кристаллохимической конференции (Черноголовка, 1998 г), 16 Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт-Петербург, 1998), 10 Международной конференции: «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Суздаль, 1998г). Структура и объем работы. Диссертация изложена на 166 стр. и состоит из литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов, списка цитированной литературы и приложения.

В обзоре литературы рассмотрены ключевые работы по исследованию

взаимосвязи структура - биологическая активность и механизма действия стероидных эстрогенов, обсуждены их достоинства и недостатки.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рецепторы эстрадиола

Строение рецептора

Рецепторы эстрогенов являются внутриклеточными транскрипционными факторами, которые, главным образом, локализованы в ядрах, цитоплазме [1] ив мембранах [2] органов-мишеней.

С середины 80-х годов, благодаря клонированию молекул ДНК, кодирующих рецепторы стероидных эстрогенов, была выяснена первичная структура рецепторов эстрадиола (РЭа) [3-9]. Анализ аминокислотной последовательности и мутационные исследования внутриклеточных рецепторов (РЭа) показали [1], что молекула рецептора состоит из нескольких функциональных областей:

1 | > : '•'•' .. : |_

М-концевая А/В область имеет переменную длину и последовательность. Обычно она содержит гормононезависимую трансактивационную функцию (АР-1), которая, по всей вероятности, активирует гены в мишенях посредством взаимодействия с элементами аппарата транскрипции [10]. Участок С отвечает за узнавание ДНК и димеризацию [3, 11] - это область связывания ДНК (содержит ~70 АК). Благодаря области О, белок может изгибаться и менять конформацию (шарнирная область). Е - гормонсвязывающий участок (ГСУ), содержит ~250 аминокислотных остатков. ГСУ играет важную роль при димеризации и активации рецептора [3, 10]. И, наконец, в С-концевой области рецептора, локализован вариабельный участок Б, для которого не установлена специфическая функция.

До недавних пор считалось, что существует только один тип рецепторов эстрадиола - РЭа. В 1996 г Купер с соавторами [12] обнаружили

существование нового члена семейства ядерных стероидных рецепторов в простате и яичниках крысы, обладающего высоким сродством к эстрадиолу. Уникальность этого белка заключается в том, что он высоко гомологичен рецепторам эстрадиола, особенно в ДНК-связывающем участке и в С-концевой гормон-связывающей области [12, 13]. Для отличия нового типа РЭ от ранее клонированных рецепторов из матки крысы (РЭа), он был назван РЭр.

Сравнительный анализ содержания РЭа и РЭР в различных тканях крысы показал, что в почках, например, присутствуют исключительно РЭа, в матке, молочных железах и гипофизе наблюдается преимущественное содержание РЭа, а в мозге, яичниках и простате - РЭР [13].

Следует отметить, что до момента открытия РЭР для изучения лигандной специфичности использовалась смесь рецепторов. Авторы работы [13] впервые исследовали сродство различных лигандов к а и р рецепторам по отдельности. Показано, что некоторые аналоги эстрогенов обладают разным относительным сродством к РЭа и РЭ(3 (табл. 1). Для эндогеных эстрогенов убывание сродства происходит в следующем порядке: эстрадиол > эстрон, 17а-эстрадиол (РЭа) > эстриол > катехолэстрогены, 17а-эстрадиол (РЭР). Стильбеновые эстрогены обладают высоким сродством к обоим подтипам рецепторов эстрадиола. Однако, порядок убывания сродства различается: диэтилстильбэстрол > гексэстрол

> диенэстрол > Е2 для РЭа и диенэстрол > диэтилстильбэстрол > гексэстрол

> Е2 для РЭр. Наличие Р-МеО-заместителя при С11 и этинильной группы при С17а в моксэстроле (1Ш 2858) уменьшает сродство к РЭа по сравнению с Е2 только в 2 раза, а к РЭр - в 20 раз (табл. 1). Интересно, что порядок убывания сродства трифенилэтиленовых (анти)эстрогенов к обоим подтипам РЭ одинаков: 4-ОН-тамоксифен » нафоксидин > кломифен > тамоксифен. Стероидный антиэстроген 1С1 164,384 имеет высокое сродство

Табл. 1. Относительное сродство (ОС) аналогов эстрогенов к РЭа человека и РЭ(3 крысы.

Продолжение табл. 1.

к РЭа и РЭр: объемистый заместитель при С7а не препятствует взаимодействию лиганда с рецептором [14].

Известно, что аналоги андрогенов могут связываться с РЭ и индуцировать соответствующие биологические эффекты [15, 16]. Сравнение величин сродства аналогов андрогенов показало (табл.1), что для эффективного связывания с а и (3 РЭ необходимо наличие 3(3- и 17(3-ОН групп.

Наиболее существенные различия в сродстве к а и Р РЭ наблюдаются для моксэстрола и 17а-эстрадиола (сродство к РЭа выше в 8 и 5 раз, соответственно). Это означает, что изменение структуры лиганда может привести к образованию агентов, селективно связывающихся с одним из подтипов РЭ и к возможности создания тканеселективных лекарственных препаратов.

Гормон-связывающий участок рецептора

Мутационный анализ ГСУ показал, что для связывания гормона необходим весь участок [17]. Даже небольшие делеции и точечные мутации в этой области уменьшали способность связывать гормон. До недавних пор были известны данные ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа только ДНК-связывающей области рецептора эстрадиола [11, 18]. Гормон-связывающий участок рецептора очень гидрофобен. Это осложняет получение активных растворимых образцов для его изучения методами ЯМР-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа. Тем не менее, в 1997 группе авторов [19] удалось провести рентгеноструктурный анализ гормон-связывающего участока РЭа в комплексе с эндогенным эстрогеном - 17(3-эстрадиолом (1) и селективным модулятором - ралоксифеном (23) [20, 21].

Кристаллы были получены после проведения карбоксиметилирования исследуемого участка.

Авторы [19] показали, что, несмотря на невысокую гомологию аминокислотных последовательностей в ГСУ РЭа и первых членов семейства ядерных рецепторов, ранее изученных по данным рентгеноструктурного анализа (ос-рецептора ретиноида-Х в виде апопротеина [22], а-рецептора ретиноевой кислоты в виде комплекса с транс-ретиноевой кислотой (РК, 24) [23] и а!-рецептора тироида в виде комплекса с тироидным гормоном (ТГ, 25) [24]), эта область во всех описанных рецепторах имеет схожую топологию, что подчеркивает ее универсальную природу.

о—О

Н,С СН3 снз снз I „ I

(23) СН3 (РК, 24) (ТГ.25)

На рисунке схематично представлена общая трехмерная структура

ГСУ-ков вышеупомянутых рецептров в комплексе с гормоном. Как видно из рисунка, гормон полностью окружен белком [23, 24] и находится в тесном взаимодействии более чем с 20 АК-остатками [25]. ГСУ РЭа представляет собой трехслойный антипараллельный а-спиральный сэндвич, включающий в себя центральный слой из трех спиралей (5/6, 9 и

10), расположенных между двумя дополнительными слоями спиралей (1-4 и 7, 8,

11). В узком конце участка находится площадка связывания гормона [19]. Оставшиеся элементы

ГОРМОН-СВЯЗЫВАЮЩИИ УЧАСТОК

вторичной структуры: два небольших антипараллельных ß-складчатых листа (S1 и S2) и спираль 12 расположены в этом конце ГСУ и примыкают к основной трехслойной области. Площадка связывания гормона полностью отделена от внешнего окружения и захватывает относительно большую часть гидрофобной сердцевины ГСУ.

Она образуется из спиралей: 3 (Met 342 - Leu 354), 6 (Trp 383 - Arg 394), 7 и 8 (Val 418 - Leu 428), 11 (Met 517 - Met 528), 12 (Leu 539 - His 547) и S1/S2 шпильки (Leu 402 - Leu 410). Связывание гормона происходит за счет образования специфических водородных связей и высокой комплементарности структуры лиганда и области рецептора, осуществляющей связывание. Эстрадиол связывается диагонально поперек щели между спиралями 3, 6, 11 и приобретает энергетически наиболее выгодную конформацию. Фенольная гидроксильная группа располагается между спиралями 3 и 6 и образует прямые водородные связи с карбоксильной группой Glu 353, гуанидиновой группой Arg 394 и молекулой воды. 17Р-Гидроксильная группа кольца D образует единственную водородную связь с His 524 в спирали 11. Кольцо А, так же как планарная поверхность А/В-колец, окружено боковыми цепями Ala 350 и Leu 387 с ß-стороны и Phe 404 с его a-стороны. В другом конце связывающей щели, кольцо D вступает в неполярные взаимодействия с Не 424, Gly 521 и Leu 525. Хотя площадка связывания не содержит ориентированных молекул воды, широкий канал растворителя проходит между спиралями 3 и 5/6 от молекулы воды, связанной с гидроксильной группой кольца А, к внешней стороне ГСУ. Сочетание специфических полярных и неполярных взаимодействий объясняет способность РЭ селективно узнавать эстрадиол среди большого разнообразия эндогенных стероидов и с высоким сродством связывать его.

Исследования по связыванию аналогов эстрадиола с рецептором позволили создать модель связывания гормона с рецептором [25]. РЭ резко

Гормон-связывающий участок рецептора эстрадиола по данным рентгеноструктурного анализа

отличается от других стероидных рецепторов по способности связывать большое разнообразие нестероидных соединений. "Клещеобразное" расположение АК остатков вокруг кольца А эстрадиола определяет необходимость ароматического кольца для связывания с высоким сродством. Оставшаяся область связывающего кармана рецептора может вмещать различные гидрофобные заместители, имеющиеся в стероидном ядре [25, 26]. Эта кажущаяся беспорядочность может быть обусловлена размером кармана, доступный объем которого составляет 450 А3, что примерно в 2 раза больше объема молекулы Е2 (245 А3). Длина и ширина углеродного скелета эстрадиола строго соответствуют участку связывания рецептора, а с а-стороны кольца В и Р-области кольца С имеются свободные полости. Положение этих, заранее сформированных, свободных областей находится в соответствии с моделью связывания эстрадиола с рецептором [25], которая будет более подробно обсуждаться в следующей главе.

Взаимосвязь структуры и биологической активности

Факторы, влияющие на сродство гормона к РЭ

Как уже отмечалось, структурная комплементарность стероидных гормонов рецепторам эстрадиола предусматривает определенное строение молекул стероидов [27]. Это положение подтверждается фактом пониженной биологической активности у 17а-эстрадиола (3) по сравнению с 17Р-изомером (1), являющимся самым активным природным эстрогеном [15]. Молекула Е2 липофильна по сравнению с другими эндогенными стероидами. Из данных рентгеноструктурного анализа известно [28, 29], что кольцо А эстрадиола плоское, кольцо В - 7ос,8Р-полукресло, кольцо С -кресло. Конформация кольца Б находится между 13Р-конвертом и 13Р,14а-полукреслом. Конформационная подвижность эстратриенового скелета связана с кольцом В [30]. На основании расчетных данных по

молекулярной механике, Уэйз и Брукс [31] установили, что Е2 существует в двух конформационных состояниях.

Форма с максимумом конформационной энергии отличается от формы с минимумом энергии на 3.3 ккал/моль, и ее кольцо В находится в конформации ванны. Авторы предположили, что лиганды РЭ могут существовать в нескольких конформационных состояниях, причем при связывании с рецептором могут переходить в более предпочтительную.

Принципиальным структурным различием между гормонами, хорошо связывающимися с рецепторами эстрогенов, и стероидными гормонами других рецепторов, является наличие фенольного фрагмента в первых [32]. Стероиды, не имеющие ароматического кольца А, обладают низким сродством к рецепторам [33], даже если их конформа