Изучение связывания первого компонента системы комплемента с низкомолекулярными соединениями методами компьютерного моделирования тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

□□3486586

На правах рукописи

КАРЛИНСКИЙ ДАВИД МИХАЙЛОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА С НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ МЕТОДАМИ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

02.00.10. -Биоорганическая химия 03.00.04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

з ЛЕН 2009

Москва-2009

003486586

Работа выполнена на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и лаборатории химии протеолитическнх ферментов Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

кандидат химических наук, Попов Михаил Евгеньевич

старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Плетнев Владимир Захарович

кандидат химических наук, Шойбонов Батожаб Батожаргалович

ведущий научный сотрудник

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится "21" декабря 2009 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В.Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова. С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан "20" ноября 2009 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук,

86.

старший научный сотрудник

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система комплемента получила свое название в конце XIX века. Она считалась дополнительной (англ. "complement") к клеточному иммунитету. Система комплемента состоит из более 30 белков плазмы крови и является частью врожденной иммунной системы, которая обеспечивает неспецифическую защиту организма от бактерий и прочих возбудителей болезней. Большинство белков комплемента неактивны до запуска системы, осуществляемого тремя путями: классическим, альтернативным и лектиновым.

Действие комплемента осуществляется также тремя путями: через хемотаксис, через опсонизацию и через лизис. При хемотаксисе некоторые компоненты комплемента служат для привлечения клеток иммунной системы, которые связываются с бактериями и фагоцитируют их.' При опсонизации компоненты комплемента присоединяются непосредственно к бактерии, также привлекая фагоцитирующие клетки. При лизисе из компонентов комплемента происходит сборка мембрано-атакующего комплекса, создающего отверстие в мембране. При значительном количестве таких отверстий атакуемая клетка подвергается лизису за счет осмотических сил.

Комплемент состоит из компонентов (факторов) комплемента (С1-С9, В, D). В частности, компонент С1 состоит из субкомпонентов Clq, Clr и Cls, связывание первого из которых с антителом инициирует активацию комплемента по классическому пути.

Несвоевременная или чрезмерная активация системы комплемента способна оказывать негативное влияние на организм. Она играет роль в развитии таких патологических состояний как отторжение донорских органов при трансплантации, ишемические повреждения, сепсис, астма, аллергия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, миастения, рассеянный склероз и др.

Потенциальную полезность создания местных ингибиторов системы комплемента можно оценить как высокую. Разработка наиболее эффективных ингибиторов является важной проблемой, представляющей значительный научный интерес. Наше исследование направлено на поиск низкомолекулярных ингибиторов классического пути комплемента, которые замедляют его активацию, осуществляющуюся при связывании Clq, субкомпонента С1, с иммуноглобулином G (IgG). Данные низкомолекулярные ингибиторы смогут быть использованы для разработки лекарственных препаратов.

На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова поиск эффективных ингибиторов активации классического пути комплемента проводится уже давно и успешно, по большей части in vitro. Результаты работы этого направления могут быть найдены в работах лаборатории А.П. Каплуна кафедры биотехнологии и

бионанотехнологии. Эмпирически было установлено, что эффективно ингибиторами являются молекулы вида К-А-Я, где К — группы, несущие отрицательный заряд, А — гидрофобная (например, ароматическая) группировка. Однако место связывания (сайт связывания) этих молекул на глобуле СЦ, отвечающее за ингибирование связывания С1ч с было неизвестно. Также неизвестен алгоритм поиска новых, более эффективных ингибиторов активации классического пути комплемента. Поэтому было решено провести исследования методами моделирования т зШсо для исследования механизма действия ингибиторов взаимодействия С1ц с ^О и разработки метода быстрого предсказания их активности.

Данная работа посвящена исследованию механизма действия низкомолекулярных ингибиторов при помощи компьютерного моделирования, а также созданию и отработке алгоритма предсказания их активности Ы $Шсо. Она представляет собой часть направления, развиваемого на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова по созданию новых, высокоэффективных ингибиторов взаимодействия СЦ с антителами и направления разработки вычислительных методов, развиваемого в лаборатории химии протеолитических ферментов Института биоорганической химии им. академиков ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Работа является частью научных исследований, проводимых на кафедре биотехнологии и бионанотенологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова в рамках госбюджетной темы 1Б-5-356 "Исследования липидов, нуклеозидов, пептидов, ретиноидов методами биотехнологии и химического синтеза с целью создания препаратов медицинского назначения (онкологические и вирусные болезни, возрастные патологии)", а также в рамках РНП "Развитие потенциала высшей школы" (проект №2.1.1.3243), госконтрактов с Роснаукой №№ 02.445.11.7355, 02.512.11.2144, 02.522.11.20011, при поддержке гранта РФФИ 06-04-49795.

Цели и задачи исследования.

1. На примере gClq разработать расчетный метод определения неизвестных сайтов связывания конкурентных низкомолекулярных ингибиторов, которые затрудняют взаимодействие глобулярных белков с природными лигандами.

2. Провести поиск "ключевого" сайта среди сайтов связывания, полученных в п.1, определив активность каждого из этих сайтов в системе "гибкий лиганд - полужесткий рецептор". В подобных условиях точность расчетов выше, чем в п.1, но требует отдельного рассмотрения каждого сайта связывания.

3. Теоретически предсказать активность ряда потенциальных ингибиторов взаимодействия СЦ и на основе компьютерного скрининга на модели сайта Для этого необходимо решить следующие задачи:

Научная новизна работы.

Работа посвящена исследованию механизма взаимодействия глобулярной части СЦ с отрицательно заряженными низкомолекулярными ингибиторами и компьютерному предсказанию их активности для поиска новых, более эффективных ингибиторов взаимодействия СЦ с На основе инструментария «слепого» компьютерного докинга низкомолекулярных лигандов был впервые разработан метод предсказания места связывания низкомолекулярных конкурентных ингибиторов с макромолекулами, не имеющими выраженного сайта связывания. В процессе исследований построена модель связывания глобулярной части С1я с низкомолекулярными ингибиторами. Были найдены ранее неизвестные сайты связывания низкомолекулярных лигандов, потенциально ответственные за ингибирование взаимодействия С1я с ^О. На основе моделирования связывания с этими сайтами была предсказана ГС50 ряда лигандов с неизвестной активностью и отработан механизм данного предсказания.

Практическая значимость работы.

Ингибиторы классического пути комплемента могут быть использованы при лечении таких болезней как инфаркт миокарда, отторжение органов при трансплантации, болезнь Альцгеймера и др. Нами предложен и реализован механизм предсказания активности низкомолекулярных лигандов как потенциальных ингибиторов активации классического пути комплемента, и для ряда веществ была теоретически рассчитана их ингибирующая активность.

Положения, выносимые на защиту.

1. Данные о расположении на глобулярной части С 1ц сайтов связывания низкомолекулярных лигандов, ответственных за ингибирование взаимодействия С1я и

2. Метод предсказания ГС50 потенциальных ингибиторов активации классического пути комплемента при помощи компьютерного молекулярного докинга.

3. Рассчитанные теоретические значения Ю50 для ряда лигандов с ранее неизвестной активностью как ингибиторов взаимодействия СЦ и 1§в.

Публикации. По материалам работы опубликованы: 2 статьи, тезисы к 7 конференциям.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на III Международном симпозиуме "АН About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)" (Плевна, Болгария, 2005), X Европейском конгрессе "Complement in Health and Disease" (Гейдельберг, Германия, 2005), XVIII Зимней молодежной научной школе "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, Россия, 2006), Национальном симпозиуме " Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (СМТР1-2007)" (Москва, Россия, 2007), II Молодежной Научно-Технической Конференции "Наукоемкие химические Технологии" (Москва, Россия, 2007), научной конференции "Химическая биология -Фундаментальные проблемы бионанотехнологии" (Новосибирск, Россия, 2009), III Международном симпозиуме " Methods and applications of computational chemistry " (Одесса, Украина, 2009).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на_страницах, содержит_рисунков и_таблиц.

Список литературы включает_источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование сайтов связывания глобулярной части Clq с низкомолекулярными ингибиторами активации классического пути комплемента

В 2003 году С. Garboriaud и другие исследователи методом рентгеноструктурного анализа была определена трехмерная структура глобулярной части Clq (gClq); она доступна в базе данных Protein Data Bank (код lpk6).

В результате этого для нас стало возможным проведение моделирования взаимодействия gClq с веществами, проявившими активность в качестве ингибиторов взаимодействия Clq и IgG. На основе предоставленных Ю.Э. Авдия-Правдивым и C.B. Буревой данных по структуре и измеренной in vitro активности ряда таких лигандов, мы приступили к моделированию взаимодействия gClq с низкомолекулярными ингибиторами.

В случае взаимодействия Clq с низкомолекулярными лигандами расчет осложняется отсутствием структурно обособленного сайта связывания. Глобула Clq равномерно покрыта положительно заряженными остатками Lys и Arg, боковые цепи которых экспонированы в раствор и могут участвовать в связывании отрицательно заряженных лигандов.

Рис. 1. Трехмерная модель глобулярной части Clq (lpkö.pdb), вид в Swiss pdb viewer (Deep View).

Для поиска на gClq потенциальных ключевых сайтов связывания с низкомолекулярными ингибиторами при помощи программного пакета Autodock 3 был осуществлен так называемый "слепой" докинг, то есть докинг без заранее известного сайта связывания. При этом рецептор (gClq) фигурировал в расчетах как жесткий, а лиганды - как гибкие, с возможностью вращения двугранных углов. В базе данных Protein Data Bank содержится кристаллографическая структура lpkö.pdb с разрешением 1.85Ä. Как видно на рисунке 1, gClq состоит из трех цепей: А, В и С. Внизу рисунка справа можно наблюдать "окончания" цепей; на самом деле они продолжаются далее, образуя фибриллярную часть Clq.

С помощью программы AutoDock Tools (ADT) координатный файл lpkö.pdb был дополнен данными о парциальных зарядах и доступности атомов растворителю.

С помощью Dundee PRODRG Server (Schuttelkopf A.W., van Aalten D.M.F. PRODRG: a tool for high-throughput crystallography of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr. D Biol. Crystal logr. - 2004. - V.60. - P. 1355-1363, http://davapcl.bioch.dundee.ac.uk/), использующего полуэмпирические методы расчета молекулярной топологии и парциальных зарядов, структурные формулы интересующих лигандов были преобразованы в трехмерные модели в форматах pdb и .pdbq (protein data bank with partial charges, формат Protein Data Bank с учетов частичных зарядов).

Рис. 2. Трехмерная модель дисульфата бисфенола, вид в Swiss pdb viewer.

Таблица 1. Лиганды, для которых был проведен докинг.

№ И. 1*2 1*з 1*4 -X- 1С5(ь мкМ

1 ОН ОСН2СООЫа Н н -С(СНз)2- 541+15

2 0Р03Ыа2 0Р031Ча2 н н -С(СНз)2- 219±12

3 ОН ОЭОзМа н н -С(СН3)2- 380+15

4 |_ ОБОзИа ОБОзИа н н -С(СНз)2- 247+10

5 ОБОзИа 05031Ма СНз н -С(СН3)2- 391+34

6 ОБОзЫа ОБОзКа СН3 СНз -С(СНз)2- 468±44

7 0503Ыа ОЗОзИа Н н сн3 125±32

8 0503Ш 0Б03№ Н н б 45+21

9 ОБОзЫа ОБОзИа Н н сйо 43+4

10 ОЗОзИа 0503№ н н 0^0 о 40±11

11 ОБОзЫа ОБОзИа н н 169+3

12 СК; СК; н н -С(СН3)2- 273±9

13 0503№ 0503№ н н -802- 660±10

14 О О 80±9

15 СООЫа ССХЖа н н 0*0 183

16 ,сосм» <>р МдООС' 22701230

17 НС« ¿^ '-«к» Д/Ч^^ <.К- «> сиЛ.и, 6.9±3.1

18 о а О 31071520

19 к о 0 T* 3341±650

20 0S03Na 0S03Na H H 0 199±5

21 0S03Na 0S03Na I H о 9.5+0.4

22 OSQ3Na 0S03Na H H c£o 28.5+1.8

Компьютерный «слепой» докинг указанных здесь лигандов на gClq был произведен на вычислительных мощностях Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (рабочие станции: Athlon 2000+ и вычислительные кластеры). В результате докинга нами были получены как трехмерные модели связывания лигандов с глобулярной частью Clq (рис. 3.), так и расчетные свободные энергии связывания для этих лигандов.

Непосредственным результатом докинга 22 отрицательно заряженных низкомолекулярных лигандов на поверхность глобулы Clq явились компьютерные трехмерные модели с 500 вариантами возможного связывания каждого из исследованных лигандов. Для каждой из этих моделей связывания лиганда с рецептором была известна расчетная свободная энергия связывания (Estimated Free Energy of Binding).

Поиск на gCIq возможных сайтов связывания с низкомолекулярными лигандами на основе совпадения этих сайтов для рассматриваемых лигандов

По результатам докинга наблюдалось явное сосредоточение лигандов в одних областях и избегание других областей. Проведя кластеризацию результатов с параметром 6 А, мы проанализировали совпадение сайтов связывания для разных лигандов. Так как каждый из этих лигандов является ингибитором связывания Clq и IgG, то сайт или сайты,

Рис. 3. Трехмерная модель глобулярной части Clq с 500 вариантами связывания лигандов на ее поверхности, вид в Swiss pdb viewer.

ответственные за ингибирование, в модели должны связываться с каждым или почти с каждым из 22 рассмотренных лигандов (почти — с учетом возможных неточностей моделирования). Сайты, на которых происходило связывание не менее 80% лигандов, были рассмотрены на предмет минимального значения свободной энергии связывания.

Таких сайтов получилось 15, включая два раза учтенный кальций-связываюший сайт (с присутствующим и отсутствющим ионом Са2+), а также еще 13 сайтов. Один из них, находящийся на месте крепления глобулярной части С^ к фибриллярной, был исключен как невозможный. Таким образом, потенциальных ключевых сайтов осталось 14 (см. Табл. 2.).

Таблица 2 представляет собой описание полученных нами моделей потенциальных "ключевых" сайтов связывания СЦ с низкомолекулярными лигандами. Во втором столбце указано, сколько из 22 рассмотренных нами лигандов, согласно модели, связываются с данным сайтом. На включенных в таблицу рисунках показаны одновременные отображения моделей связывания gClq и по одной конформации каждого из этих лигандов, которой соответствует лучшая расчетная свободная энергия связывания.

Таблица 2. Потенциальные "ключевые" сайты связывания С1ц с низкомолекулярными лигандами.

№ сайга связы вания

Число лиганд

Ближайшие положительно

заряженные аминокислоты

Трехмерная модель связывания глобулярной части Clq с лигандами, обладающими наилучшей свободной энергией связывания, вид в Swiss pdb viewer

1

(без Са2+)

22

LysA Hiscl Lysc

fat ij-y, cjs8

i u %%-J

|ж|

£

He

Ca2+)

22

LysA His0' Lysc

,-W

S с .

• \ V ■;. yy

M

> i vt

ж

( I

Vk %

ю oo СГ\

Ю o ЧО '•O

> > > > ^ "i tro во ста tro CD ОТ ГО ГО ГО ;> i» К К s > > > s S ä fr>ï> m ВО w (Я n n Eô " S ~ > > w ftQ o o ou4n 5Г KJ — 4:1 s„ s. =. »

T-v ' ' ' * r^tv ■ > Ji: -S*"'* V ¿ с ■ • vr^f'fc^ "v \ fv' .J^'W ts V 4

;•" > ,. ... ¡ >-' •• v. л i "£.-. "'-г* кЖ-i, wfôv"2' CJí^ * лЖк s . /'.,/ \¿ l ^-••¿•-¡a-î й-х^ч^Рт ¿•Ц : Щ v ' ■• >• Лжкч, s " - . -f-^'j i •f -'^'fffp Z

10

21

Arg

HisBI

Argcl

Lysci

Arsc

h

t *■ V • vi, % .

Ш

22

Lys LysBI Argc Argc

V1 .

if*

ïi

Ш

12

22

Arg

ArgB

Arg8

ArgB

LysB

■Ju

. - W-'.Л ¡t-V^r-t-í

13

19

Arg Lysc Hisc

ЛЧ

-Vi

Оценка корреляции между известными 1п1С5о лигандов и рассчитанными свободными энергиями связывания

Для конкурентного ингибирования соотношение между Гиббсовой свободной энергией связывания и Ю50 (концентрацией ингибитора, вызывающей 50% ингибирование) выражается следующей формулой:

ДО - Гиббсова свободная энергия связывания, Т - температура (Т = 298.15 К), Я -универсальная газовая постоянная (Я = 8,314 Дж/(моль*К) = 1,987 кагг/(моль*К)), К<| -сродство еС1ц к Таким образом, поскольку при переходе от одного лиганда к другому значение в скобках формулы (2) неизменно, то Дв прямо пропорционально 1п ГС50, а значит, по корреляции расчетной свободной энергии связывания лиганда с сайтом связывания и 1п Ю50 можно оценить, является ли этот сайт ключевым для ингибирования.

Наибольший наш интерес первоначально привлек кальций-связывающий сайт 1 (без Са2+), поначалу обладая коэффициентом соответствия Я2=0.84. Однако с повышением количества исследуемых лигандов до 22 коэффициент соответствия К2 упал до 0.55 (после проверки на "промахи" - 0.64).

Стала понятна необходимость новых, более точных расчетов. Система "гибкий лиганд - жесткий рецептор" хорошо подходит для "слепого" докинга, который нам было необходимо провести для определения потенциальных "ключевых" сайтов связывания. Зная месторасположение этих сайтов, стало возможным провести более подробный расчет в системе "гибкий лиганд - полужесткий рецептор" уже для каждого сайта в отдельности.

Тем не менее, полученной нами на этом этапе корреляции уже было достаточно, чтобы грубо оценить активность потенциальных ингибиторов. На основе корреляции экспериментально полученных значений 1п ГС50 и теоретически рассчитанной Дв для ряда лигандов стало возможно оценить ГСм для новых лигандов, которые участвовали только в вычислительном эксперименте и не проходили исследований т \itro.

ДО = -ЯТ х 1п К;

0)

(2)

2. Предсказание активности потенциальных ингибиторов взаимодействия Clq и IgG в системе "гибкий лпганд - жесткий рецептор"

После того, как в п.1 были найдены сайты связывания низкомолекулярных лигандов, предположительно, ответственные за ингибирование связывания Clq и IgG, задачей стала разработка расчетного метода предсказания IC50 низкомолекулярных веществ, являющихся потенциальными ингибиторами связывания Clq с IgG.

С помощью докинга гибких лигандов на найденные в п.1 сайты связывания на gClq (модель жесткого рецептора) была оценена IC50 67 новых, не подвергавшихся исследованию in vitro молекул. Для этого были использованы двумерные структуры молекул, предложенных Ю.Э. Андия-Правдивым, C.B. Буреевой, Е. Лесовой и Н. Рукосуевой, исходя из их потенциального удобства для последующего синтеза. Процесс получения трехмерных структур выполнен как в ni. В таблицах 3-9 представлены результаты скрининга (отбора наиболее перспективных молекул) с использованием сайта связывания 1, который был предварительно отобран как ответственный за ингибирование взаимодействия Clq с IgG.

После того, как нами была предсказана активность ряда лигандов в качестве ингибиторов активации классического пути комплемента, на кафедре биотехнологии было in vitro проведено измерение IC50 нескольких из них.

/и2

/

О-

ИЧ

О-

Рис. 4. Общая структурная Рис. 5. Общая структурная Рис. 6. Общая структурная формула лигандов 1-17. формула лигандов 18-27. формула лигандов 28-30.

Таблица 3. Предсказание ГС50 [мкМ] лигандов 1-17 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккал/моль] с сайтом 1 (без Са2+).

№ лиган да Я, (см. Рис. 4) Еггее 1С,а тсор № лиган да Я, (см. Рис. 4) Е(гсе 1С50 тсор

1 \Ю -12,80 0,26 10 1ЧН -11,34 3,06

2 оо -12,97 0,19 11 0 -11,33 3,11

3 Чо 0 -11,20 3,88 12 -11,44 2,58

4 О О -11,28 3,39 13 -11,17 4,08

5 4—N О У -10,82 7,39 14 0 -11,49 2,37

6 ■ч> О -10,71 8,90 15 р -11,04 5,09

7 -ЧХ} он -10,75 8,32 16 -10,42 14,6

8 он -12,52 0,41 17 р -10,47 13,4

9 хмэ -10,05 27,3

Таблица 4. Предсказание Ю50 [мкМ] лигандов 18-30 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккал/моль] с сайтом 1 (без Са2+).

X» лига нда R Efrcc IC50 теор № лнган да R Е&ес IC50 тсор

R=R2 (см. Рис. 5) 24 -С(С6Н5)3 -9,64 55,0

18 -СН2-С6Н5 -10,08 27,8 25 СЮ -12,18 1,06

19 -10,48 14,9 26 VO -9,91 36,2

20 О -11,45 3,30 27 V-rO -10,83 8,65

21 -О -10,65 11,4 RsR3 (см. Рис. 6)

22 Н -9,07 134 28 -СН2-С6Н5 -10,83 8,65

23 -10,73 10,1 29 -СН(С6Н5)2 -12,49 0,65

30 н -9,91 36,2

Таблица 5. Предсказание ГС50 [мкМ] лигандов 31-40 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккал/моль] с сайтом 1 (без Са2+).

№ лиган- да Структурная формула лиганда Efrcc 1С50 тсор № лиганда Структурная формула лиганда Efree IC50 теор

31 ЦТ*? -8,39 454 36 О -10,85 7,02

32 ДА чХХГ -9,41 80,6 37 *о о -12,65 0,33

33 9 (К NN л 11,62 1,90 38 -10,80 7,64

34 10,10 25,0 39 . .X) . "'ХХДХГ4 -14,03 0,03 2

35 4 13,48 0,08 40 -9,30 93,4

Таблица 6. Предсказание Ю50 [мкМ] лигандов 41-48 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккап/моль] с сайтом 1 (с Са2+).

№ лиганда Я, (см. Рис. 4) Еггсс 1С5„ тсор № лиганда Я, (см. Рис. 4) 1С50 теор

41 -№):-!ЧН-С(0)-СН1 -12,25 69,7 45 ЧСНЖ-Ш-ССОНСН,),-сн, -13,00 41,9

42 -<СН:);->Ш-С(0)-С:Н, -11,95 85,5 46 ЧСНгЬ-ЫН-СЮНСН,),- сн, -11,75 98,0

43 -(СН,)Г1МН-С(0)-(СН,)~СН, -11,49 117 47 ЧСНгЬ-Ш-ОДЧСН;),- сн, -11,34 129

44 -(СН;)г^Н-С(0)-(СН:),-СН) -12,02 81,5 48 ЧСН;Ь^Н-С(ОНСН,)г сн, -12,11 76,7

Таблица 7. Предсказание ГС50 [мкМ] лигандов 49-59 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккал/моль] с сайтом 1 (с Са2+).

№ лиган да Я4 (см. Рис. 7) Еггее 1С5о тсор № лиган да 1*4 (см. Рис. 7) Е&ее 1С50 тсор

49 -Ш-СНг-СОО- -14,03 20,8 53 -Ш-(СН2)2-С(0)0-СН3 -12,86 46,1

50 -ЫН-(СН2)2-СОО" -13,31 33,9 54 -МН-(СН2)з-С(0)0-СНз -12,42 62,1

51 -ЫН-(СН2)з-СОО" -13,57 28,4 55 -Ш-(СН2)4-С(0)0-СН3 -12,11 76,7

52 О ^ си -13,47 30,4 56 -Ш-(СН2)5-С(0)0-СНз -11,23 139

57 -ЫН-СН2-С(0)0-С2Н5 -12,67 52,4

58 -ЫН-(СН2)2-С(0)0-С2Н5 -12,59 55,3

59 -ЫН-(СН2)з-С(0)0-С2Н5 -12,58 55,7

Рис. 7. Общая структурная формула лигандов 49-67.

Таблица 8. Предсказание Ю50 [мкМ] лигандов 60-63 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккал/моль] с сайтами 1 (с Са и без Са2+), 5 и 11.

№ лиган да Структурная формула лиганда Сайт 1 без Са2+ Сайт 1 с Са2+ Сайт 5 Сайт 11

Е&ее 1С50 теор Е&сс 1С50 теор Еггее 1С50 теор Еггее 1С30 теор

60 -11,8 0,33 - - - - -9,05 3,72

61 ар Ч" -9,36 103 -10,56 220 -7,57 35,4 -8,46 16,9

62 ОХП4 -7,66 5623 -9,41 481 -7,82 20,7 -7,27 358

63 -7,79 4142 -9,36 497 -7,69 27,4 -7,06 614

Таблица 9. Предсказание Ю50 [мкМ] лигандов 64-67 на основе расчетной свободной энергии связывания [ккал/моль] с сайтами 1 (с Са2, и без Саг+), 5 и 11.

№ лиган да Я4 (см. Рис. 7) Сайт 1 без Са2+ Сайт 1 с Са2+ Сайт 5 Сайт 11

Ейгее 1С50 теор Е&се 1С50 теор Еггее 1С5о теор Еггее 1С5о теор

64 -М(СН3)-СНГС6Н5 -14,09 0,0015 -12,06 79,3 -8,26 8,04 -9,41 1,48

65 -КН-СПГС6Н, -13,43 0,0072 -12,77 49,0 -8,74 2,87 -10,4 0,11

66 -8-С6Н5 -14,10 0,0015 -11,98 83,8 -8,82 2,41 -10,1 0,22

67 -К(СН2-С6Н5)2 -14,60 0,0005 -11,65 105 -9,10 1,32 -9,55 1,03

Таблица 10. Результаты экспериментального измерения Ю50 нескольких из лигандов, чья активность была предсказана методом компьютерного скрининга в системе "гибкий лиганд-жесткий рецептор".

№ лиганда IC50 тсор. морск.свин., МКМ (Сайт 1 С Са2+) IC50 эксп, чел., МкМ

1 48,0 120,5

41 69,7 428,8

42 85,5 285,1

45 41,9 182,9

62 481 295

63 497 258

Из табл. 10 видно, что предсказания на основе сайта 1 с ионом кальция показали себя не очень близкими к эксперименту. С их помощью можно отличить хороший ингибитор от плохого, но они недостаточны для более точных предсказаний. Требовалось получить более точный метод предсказания активности лигандов, поэтому с момента выхода программного пакета Autodock 4, поддерживающего работу в системе "гибкий лиганд - полужесткий рецептор" для отдельных сайтов (не для "слепого" докинга по всей поверхности gClq), мы решили воспользоваться тем, что из п.1 нам уже известно расположение потенциальных "ключевых" сайтов связывания. Мы приступили к расчетам в системе "гибкий лиганд -полужесткий рецептор" для каждого из 14 найденных сайтов.

3. Исследование связывания отдельных потенциальных «ключевых» сайтов глобулярной части Clq с низкомолекулярными ингибиторами активации классического пути комплемента

Поскольку программный пакет Autodock 3 работает с моделью жесткого рецептора, в результаты расчетов в п. 1 были подвергнуты уточнению с помощью докинга на полужесткий рецептор, учитывающего подвижность некоторых боковых цепей Clq. Для этого нами был использован программный пакет Autodock 4.

В п.1 мы провели расчеты "слепого" докинга, в которых на весь рецептор (gClq) приходилось по из 500 заходов докинга каждого из двадцати двух исследуемых лигандов (итого около 22 расчета по 500 заходов докинга), и затем, при анилизе результатов, были выявлены сайты связывания и результаты по конформациям и свободным энергиям связывания (Estimated Free Energy of Binding) были упорядочены на основе этих сайтов. В п.З нас ожидала существенно более трудоемкая работа. Поскольку недавно вышедший к тому времени программный пакет Autodock4 учитывал подвижность только очень ограниченного (3-5) числа боковых цепей рецептора, то для каждого из 14 найденых нами в п.1 сайтов связывания надо было провести отдельный расчет для 22 лигандов (итого около

18

300 расчетов по 50-100 заходов докинга лиганда на рецептор). Для каждого из исследуемых сайтов была сделана модель рецептора, в которой ближайшие к потенциальному месту связывания (см. п.1) боковые цепи положительно заряженных аминокислотных остатков моделировались как гибкие, а остальной рецептор - как жесткий.

Аналогично п.1, для каждого из рассматриваемых сайтов нами были получены лучшие энергии связывания ряда лигандов (см. Табл. 11).

Таблица 11. Расчет лучшей свободной энергии (Estimated Free Energy of Binding, ккал/моль) связывания 22 лигандов на 14 сайтах связывания в системе "гибкий лиганд - полужесткий

рецептор".

№ лиганда 1С50 Estimated Free Energy of Binding, ккал/моль

ЭКСП., мкМ Сайт 1 (без Ca24) Сайт 1 (с Са2+) Сайт 2 СайтЗ Сайт 4 Сайт 5 Сайт 6

1 6,3 -14,76 -15,52 -12,56 -15,98 -11,86 -16,30 -16,84

2 5,4 -15,78 -14,77 -13,05 -16,38 -11,47 -16,77 -18,70

3 5,9 -16,60 -16,91 -14,88 -16,02 -12,45 -16,77 -16,37

4 5,5 -15,04 -15,76 -14,60 -18,31 -12,80 -18,42 -18,38

5 6,0 -16,46 -15,20 -14,04 -17,71 -12,67 - -18,04

6 6,1 -16,49 -16,12 -15,92 -16,90 -11,82 -17,22 -17,17

7 4,8 -16,67 -15,79 -14,60 -16,83 -11,78 -17,91 -17,75

8 3,8 -15,65 -16,18 -13,53 - -12,92 - -19,45

9 3,8 -15,01 -15,48 -17,15 - -13,24 -18,50 -18,10

10 3,7 -15,29 -15,83 -14,75 - -12,23 -18,57 -17,12

11 5,1 -14,04 -15,06 -13,70 -16,57 -11,04 -17,35 -17,89

12 5,6 -13,21 -13,36 -15,45 -17,29 -10,19 -18,75 -17,54

13 6,5 -14,99 -15,85 -15,57 - -12,73 -18,62 -17,02

14 4,4 -15,72 -16,72 -16,05 - -13,03 -17,45 -19,45

15 5,9 -15,61 -15,41 -16,04 -16,19 -13,30 -17,79 -16,92

16 7,7 -13,78 -14,52 -14,87 -15,85 -12,29

17 1,9 -16,51 -16,84 -16,34 -17,66 -12,97 -19,46

18 8,0 -8,31 -14,97 -14,50 -16,18 -11,85 -

19 8,1 -16,15 -15,05 -12,98 -15,70 -11,78 -

20 5,3 -14,91 -17,60 -15,76 -17,22 -11,85 -16,89

21 3,3 -15,60 -16,66 -15,94 -16,46 -12,64 -19,34

22 2,3 -15,58 -17,03 -19,01 -19,48 -14,33 -18,54

0,17 0,28 0,29 0,43 0,21 0,13 0,45

№ лиганда IC50 Estimated Free Energy of Binding, ккал/моль

ЭКСП.? мкМ Сайт 7 Сайт 8 Сайт 9 Сайт 10 Сайт 11 Сайт 12 Сайт 13

1 6,3 -17,65 -11,68 - -10,08 -14,24 -15,58 -11,39

2 5,4 -17,47 -12,71 -22,59 -17,39 -15,62 -17,28 -13,37

3 5,9 -19,54 -12,25 -20,55 -16,39 -15,12 -17,15 -11,53

4 5,5 -18,28 -14,29 -20,90 -11,35 -15,16 -18,11 -14,09

5 6,0 -18,99 -13,30 -20,21 - -17,35 -17,23 -13,60

6 6Д -18,97 -13,57 -21,71 -9,53 -15,10 -18,86 -13,67

7 4,8 -18,97 -12,99 -20,45 -16,52 -15,57 -18,51 -12,86

8 3,8 -18,90 -13,73 -20,90 -10,69 -16,29 -19,08 -13,93

9 3,8 -18,22 -13,68 -20,40 -16,59 -14,71 - -14,60

10 3,7 -18,00 -14,11 -20,20 -9,84 -16,43 -17,02 -13,61

11 5,1 -17,31 -12,29 -19,13 -9,88 -13,82 -17,48 -13,17

12 5,6 -17,77 -11,76 -17,75 -8,63 - - -13,33

13 6,5 -19,00 -13,35 -21,12 -11,49 - -19,60 -13,23

14 4,4 -19,33 -13,82 -21,14 -17,28 -17,79 -18,29 -14,68

15 5,9 -17,93 -13,85 -20,35 -10,47 -15,75 - -12,62

16 7,7 -15,64 -11,90 - -9,79 -14,78 -17,43 -10,09

17 1,9 -19,45 -14,16 -19,98 -8,69 -17,84 -19,15 -14,26

18 8,0 -14,40 -10,77 -19,72 -8,37 -15,42 -16,73 -10,20

19 8,1 -15,56 - -20,21 -9,38 -15,44 - -10,42

20 5,3 -18,61 -13,79 -19,88 -17,35 -16,15 -18,31 -12,57

21 3,3 -17,70 -13,46 -19,55 -18,57 -15,52 -19,66 -14,10

22 2,3 -20,37 -16,37 -20,85 -18,01 -16,18 -18,87 -16,57

R' 0,46 | 0,53 | 0,0001 ] 0,17 | 0,19 | 0,26 | 0,71

После того, как на каждом потенциальном "ключевом" сайте для каждого лиганда была найдена конформацня с наилучшей свободной энергией связывания (Estimated Free Energy of Binding), нами была проанализирована корреляция значений расчетной свободной энергии связывания лигандов с рецептором и натурального логарифма экспериментальной ICso, полученных in vitro в лабораториях кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ. Была получена корреляция следующего вида (рис. 8).

С 2 ^ 2 о ю о с -1 8

* а п

8 -16 -14 -12 -10 Е free Aulodock (ККЭЛ/МОЛЬ)

Рис. 8. Корреляция между расчетной свободной энергией связывания и экспериментально известными 1п1С5о для сайта 13.

Построив для каждого из 14 потенциально "ключевых" сайтов связывания

корреляцию между расчетной свободной энергией связывания и экспериментально

известными 1п1С5о, мы получили значения коэффициента соответствия Я2 для этих сайтов

(см. таблицу 11). Наиболее сильная корреляция (Я2= 0,71, стандартная ошибка расчета

20

свободной энергии — 0,90 Ккал/моль) соответствует сайту связывания 13 (см. таблицу 2), находящемуся на границе цепей В и С глобулы Clq вблизи положительно заряженных остатков Arg8150, LysC160 и HisCI67. Рисунки 9-11 демонстрирует расположение в этом сайте связывания исследованных лигандов в конформациях, соответствующих минимальной свободной энергии связывания.

Рис. 9. Связывание лиганда Рис. 10. Связывание лиганда Рис. 11. Связывание лиганда 4 с на сайте 13. 17 с яСЦ на сайте 13. 22 с gClq на сайте 13.

Анализ низкоэнергетических конформацией показывает, что на сайте 13 лиганды связываются на границе цепей В и С и координируются электростатическими взаимодействиями отрицательно заряженных групп лиганда с положительно заряженными боковыми группами остатков Arg5150, Lyscl6° и HisCI67' Лиганд всегда связывается с LysC160. Для одного из них, небольшого лиганда 16, это - единственное взаимодействие с одним из трех положительно-заряженных аминокислотных остатков сайта, но этот лиганд обладает низкой активностью как ингибитор. Гидрофобное ядро лигандов образует низкоэнергетические ван-дер-Ваальсовы взаимодействия с остатками Gly0210, AIamn' ТугС1% и с образующими дисульфидный мостик остатками Cys и Cysc165, Кроме LysC160 они связываются либо с Hiscl67 (например, лиганд 17), либо с Arg®150 (например, лиганд 4), либо со всеми тремя положительно-заряженными аминокислотными остатками сайта (например, лиганд 22).

Анализ подвижности боковых цепей Arg5150 и Lys0160 показал, что с точки зрения электростатических взаимодействий с этими остатками оптимальное расстояние между отрицательно заряженными атомами лиганда подобрано достаточно оптимально и в рамках данной модели уже не является основополагающим элементом само по себе.

При конструировании ингибиторов de novo необходимо также учитывать подвижность лигандов (вращение вокруг двугранных углов), которая может менять расстояние между отрицательно заряженными группами, а также профиль сайта связывания, определяющий ван-дер-Ваальсовы взаимодействия с лигандом.

21

Переход к системе "гибкий лиганд-полужесткий рецептор" означает повышение точности предсказания активности низкомолекулярных ингибиторов. Нами был проведен дополнительный компьютерный скрининг нескольких лигандов с использованием результатов докинга в системе "гибкий лиганд-полужесткий рецептор", и получены следующие данные (см. таблицу 12).

Таблица 12. Результаты экспериментального измерения 1С50 нескольких из лигандов, чья активность была предсказана методом компьютерного скрининга в системе "гибкий лиганд-полужесткий рецептор".

№ лиганда IC5Q теор. морск. евин*» МкМ (интервал с учетом стандартной ошибки) IC50 эксп. чел., МкМ

1 161 (72,2-359) 120,5

41 153 (68,5-341) 428,8

42 228 (102-509) 285,1

45 81,8 (36,7-183) 182,9

62 642 (288-1431) 295

63 542 (243-1208) 258

После определения ключевого сайта связывания, по его координатам нами был проведен компьютерный скрининг нескольких лигандов в системе "гибкий лиганд-полужесткий рецептор". В таблице 12 указаны значения расчетной IC50 и их сопоставление с результатами эксперимента in vitro. В среднем, результаты нового компьютерного скрининга оказались более близкими к экспериментальным данным, чем расчеты в системе "гибкий лиганд жесткий рецептор" (см. табл. 10), показывая более высокую точность нового метода.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый расчетно-экспериментальный метод определения неизвестных сайтов связывания конкурентных низкомолекулярных ингибиторов, которые препятствуют взаимодействию глобулярных белков с природными лигандами. В основе метода — соотнесение результатов «слепого молекулярного докинга» с экспериментальными данными по активности ингибиторов.

2. На глобулярной части первого компонента комплемента Clq определены 14 сайтов связывания, общих для отрицательно-заряженных низкомолекулярных лигандов, ингибирующих взаимодействие между Clq и IgG (см. таблицу 2). Проведено предсказание степени участия каждого из

указанных сайтов в процессе ингибирования. Сайт связывания на границе цепей В и С (ключевые аминокислоты ArgB'50, Lys0160, His0167) демонстрирует наиболее сильную корреляцию (R2=0,71) теоретически рассчитанных и экспериментальных параметров связывания. Связывание низкомолекулярных лигандов именно с этим сайтом, предположительно, вносит самый существенный вклад в ингибирование связывания Clq с IgG.

3. На основе полученной модели проведено теоретическое предсказание IC50

для потенциальных ингибиторов с неизвестной активностью. Экспериментально измеренные величины IC50 в 5 случаев из 6 попадают в интервал теоретического предсказания с учетом стандартной ошибки.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит Ю.Э. Андия-Правдивого, C.B. Бурееву, Е. Лесовую и Н. Рукосуеву (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) за предоставленные результаты экспериментов in vitro и предложение формул лигандов для скрининга; Л.В. Козлова (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского) за плодотворные идеи и дискуссии, заведующего лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН Л.Д. Румша за организацию моей продуктивной работы в лаборатории, заведующего кафедрой биотехнологии и бионанотехнологии В.И. Швеца за организацию учебного процесса, Д.Е. Нольде (ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова) за помощь в высокопроизводительных вычислениях; а также коллективы кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ и лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН. Часть работы выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-04-49795.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Карлинский ДМ., Каплун А.П., Попов М.Е. Предсказание активности низкомолекулярных ингибиторов активации классического пути комплемента методом компьютерного скрининга. // Вестник МИТХТ. - 2009. - Т. 4., №3. - С.57-63.

2. Lubka Roumenina, Svetlana Bureeva, Alexander Kantardjiev, David Karlinsky, Julian E. Andia-Pravdivy, Robert Sim, Alexander Kaplun, Michael Popov, Uday Kishore and Boris Atanasov. Complement Clq-target proteins recognition is inhibited by electric moment effectors. // J. Mol. Recognit. - 2007. - V.20., N5. - P.405-415.

3. D.M. Karlinsky, M.E. Popov, A.P. Kaplun. Computational screening in analysis of low-molecular inhibitors of Clq-IgG interaction. H Book of Abstracts. Methods and applications of computational chemistry. 3rd international symposium. - Odessa. - Ukraine. 28 June - 2 July 2009. -P.86.

4. Карлинский Д.М., Попов M.E., Каплун А.П. Предсказание активности низкомолекулярных ингибиторов активации классического пути комплемента методом компьютерного скрининга. // Сб. трудов научной конференции "Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии". - Новосибирск. - Россия. 10-14 июня 2009. - С. 115.

5. Карлинский ДМ., Попов М.Е., Каплун А.П. Докинг как инструмент поиска сайтов связывания первого компонента системы комплемента с лигандами. // Тезисы докладов II молодежной научно-технической конференции "Наукоемкие химические Технологии". -Москва. - Россия. 16-18 октября 2007. - С. 45.

6. D.M. Karlinsky, M.E. Popov, A.P. Kaplun. Finding binding sites for (ow-molecular ligands on the surface of Clq with molecular docking. // Abstr. of the Fourth Int. Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007)". -Moscow. - Russia. 1-5 September 2007. - P. 105.

7. Д.М. Карлинский, А.П. Каплун, M.E. Попов. Докинг как инструмент для поиска сайта: изучение взаимодействия низкомолекулярных ингибиторов с первым компонентом системы комплемента. // Тезисы докладов XVIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - Москва. - Россия. 7-10 февраля 2006.

8. S.V. Bureeva, J.E. Andia-Pravdivy, A.M. Bichucher, M.A. Igumnov, V.V. Moskaleva, N.V. Rukosueva, D.M. Karlinsky, M.E. Popov, V.I. Popenko, L.V. Kozlov, A.P.Kaplun. Negative charged low weight compounds inhibit classical pathway of complement activation blocking Clq-IgG interaction. // Abstr. of the 10th European Meeting on Complement in Health and Disease. -Heidelberg, Germany. - 9-13 September 2005. Mol. Immunol. 2006. V.43. - P.188.

9. S.V. Bureeva, A.M. Bichucher, J.E .Andia-Pravdivy, M.A. Igumnov, V.V. Moskaleva, N.V. Rukosueva, D.M. Karlinsky, M.E. Popov, L.V. Kozlov, A.P. Kaplun. Synthetical ^mmunomodulatorsi-inhibition^f-Glq-lgG-interaction-by-negative-cJmgedJowjveighLcompounds^ // Abstr. of the III Int. Symposium "All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IV1G)". -Pleven. - Bulgaria. 2-5 June 2005. - P.53.

Подписано в печать: 18.11.2009

Заказ №3081 Тираж-100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1. Ключевые слова и условные обозначения.

Ключевые слова.

Сокращения и условные обозначения.

Цели и задачи исследования.7

Научная новизна работы.7

Практическая значимость работы.8

Положения, выносимые на защиту.8

Публикации.9

Апробация работы.9

3. Обзор литературы.10

3.1. Строение Clq и предполагаемые сайты связывания.10

3.1.1. Строение Clq.10

3.1.2. Предположительные сайты связывания Clq с IgG.11

3.2. Молекулярный докинг как инструмент для поиска сайта связывания лигандов.13

3.2.1. Современные подходы к компьютерному моделированию в разработке лекарственных средств.13

3.2.2. Схема молекулярного докинга.14

3.2.3. Терминология докинга.15

3.2.4. Возможности молекулярного докинга.15

3.2.5. Рецепторы и лиганды для докинга.17

3.2.6. Моделировование структур рецептора и лиганда в молекулярном докинге.18

3.2.7. Подходы к молекулярному докингу.22

3.2.8. Механика докинга.24

3.2.9. Методы комплементарности формы при докинге "белок-лиганд".27

3.2.10. Проектирование лекарственных препаратов при помощи докинга.30

3.2.11. Основные проблемы молекулярного докинга и их решение.35

3.2.12. Перспективы метода.38

4. Оборудование, программы и материалы.40

4.1. Оборудование.40

4.2. Программы.40

4.3. Материалы.40

4.3.1. Файл с моделью рецептора в формате .pdb.40

4.3.2. 89 файлов с моделями лигандов в формате .pdbq.40

5. Результаты и обсуждение.41

5.1. "Слепой" докинг в системе "гибкий лиганд - жесткий рецептор".41

5.1.1. Получение из файла рецептора в формате .pdb файла рецептора в формате .pdbqs .44

5.1.2. Создание GPF и DPF - файлов, содержащих параметры для проведения AutoGrid 3 и AutoDock 3 соответственно.45

5.1.3. Запуск программы AutoGrid 3 (создание GRID).47

5.1.4. Запуск программы AutoDock 3 (докинг).47

5.2. Обработка результатов докинга.47

5.2.1. Промежуточная визуальная обработка результатов докинга.;.47

5.2.2. Перекластеризация.48

5.2.3. Сопоставление кластеров.54

5.2.4. Анализ корреляции расчетной свободной энергии связывания с IC50.56

5.3. Корреляции между 1п(1С5о) и расчетной свободной энергией связывания для сайта 1 с Са2+ в системе "гибкий лиганд - жесткий рецептор" методом компьютерного скрининга. 64

5.4. Итоги поиска потенциальных ключевых сайтов связывания в системе "гибкий лиганд жесткий рецептор".66

5.4.1. "Слепой" докинг.66

5.4.2. Поиск на gClq возможных сайтов связывания с низкомолекулярными лигандами на основе совпадения этих сайтов для рассматриваемых лигандов.67

5.4.3. Оценка корреляции между известными 1п(1С5о) лигандов и рассчитанными свободными энергиями связывания.71

5.5. Предсказание активности потенциальных ингибиторов взаимодействия Clq и IgG в системе "гибкий лиганд - жесткий рецептор".73

5.6. Исследование связывания отдельных потенциальных "ключевых" сайтов глобулярной части Clq с низкомолекулярными ингибиторами активации классического пути комплемента.80

5.7. Предсказание активности потенциальных ингибиторов взаимодействия Clq и IgG в системе "гибкий лиганд - полужесткий рецептор".86

6. Экспериментальная часть.88

6.1. "Слепой" докинг в системе "гибкий лиганд — жесткий рецептор".88

6.1.1. Получение файлов с моделью рецептора в формате .pdbqs (protein data bank with partial charges and solvation).88

6.1.2. Получение файлов с моделями исследуемых лигандов в формате .pdb.88

6.1.3. Создание GPF (grid parameter file) и DPF (docking parameter file) - файлов, содержащих параметры для проведения AutoGrid 3 и AutoDock 3 соответственно.89

6.1.4. Запуск программы AutoGrid 3 (создание GRID).90

6.1.5. Запуск программы AutoDock 3 (докинг).90

6.2. Обработка результатов докинга.90

6.2.1. Промежуточная визуальная обработка результатов докинга.90

6.2.2. Перекластеризация.91

6.2.3. Сопоставление кластеров.92

6.2.4. Анализ корреляции расчетной свободной энергии связывания с IC50.93

6.3. Скрининг в системе "гибкий лиганд - жес гкий рецептор".94

6.3.1. Исследование корреляции между 1п(1С5о) и расчетной свободной энергии связывания для сайта 1 со смоделированным ионом кальция.94

6.3.2. Расчет теоретических значений IC50 для новых лигандов - потенциальных ингибиторов взаимодействия gClq и IgG при помощи скрининга.95

6.4. Докинг по сайтам связывания.95

6.4.1. Подготовка файлов, содержащих трехмерную модель молекулы рецептора.95

6.4.2. Подготовка файлов, содержащих трехмерную модель молекулы лиганда.97

6.4.3. Создание GPF-файла (grid parameter file).98

6.4.4. Создание DPF-файла (docking parameter file).99

6.4.5. Запуск AutoGrid.100

6.4.6. Запуск AutoDock.100

6.4.7. Получение значений свободной энергии связывания.101

6.4.8. Визуализация результатов докинга.101

6.4.9. Выбор ключевого сайта связывания.101

6.5. Скрининг по сайтам связывания в системе "гибкий лиганд - полужесткий рецептор" .102

7. Выводы.103

8. Благодарности.104

9. Список опубликованных работ.105

10. Список литературы.107

7. Выводы

7.1. Разработан новый расчетно-экспериментальный метод определения неизвестных сайтов связывания конкурентных низкомолекулярных ингибиторов, которые препятствуют взаимодействию глобулярных белков с природными лигандами. В основе метода — соотнесение результатов "слепого молекулярного докинга" с экспериментальными данными по активности ингибиторов.

7.2. На глобулярной части первого компонента комплемента Clq определены 14 сайтов связывания, общих для отрицательно-заряженных низкомолекулярных лигандов, ингибирующих взаимодействие между Clq и IgG (см. таблицу 2). Проведено предсказание степени участия каждого из указанных сайтов в процессе ингибирования. Сайт связывания на границе цепей В и С (ключевые аминокислоты Arg3150,

С160 • С167 2

Lys , His ) демонстрирует наиболее сильную корреляцию (R =0,71) теоретически рассчитанных и экспериментальных параметров связывания. Связывание низкомолекулярных лигандов именно с этим сайтом, предположительно, вносит самый существенный вклад в ингибирование связывания С1 q с IgG.

7.3. На основе полученной модели проведено теоретическое предсказание 1С5о для потенциальных ингибиторов с неизвестной активностью. Экспериментально измеренные величины IC50 в 5 случаев из 6 попадают в интервал теоретического предсказания с учетом стандартной ошибки.

8. Благодарности

Приношу глубокую благодарность своим научным руководителям, Александру Петровичу Каплуну и Михаилу Евгеньевичу Попову за постановку задачи и поддержку при ее выполнении. Автор также благодарит Ю.Э. Андия-Правдивого, C.B. Бурееву, Е. Лесовую и Н. Рукосуеву (МИТХТ им. М.В. Ломоносова) за предоставленные результаты экспериментов in vitro и предложение формул лигандов для скрининга; Л.В. Козлова (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского) за плодотворные идеи и дискуссии, заведующего лабораторией химии протеолитических ферментов ИБХ РАН Л.Д. Румша за организацию моей продуктивной работы в лаборатории, заведующего кафедрой биотехнологии и бионанотехнологии В.И. Швеца за организацию учебного процесса, Д.Е. Нольде (ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова) за помощь в высокопроизводительных вычислениях; а также коллективы кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ и лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ РАН. Часть работы выполнена при поддержке гранта РФФИ 06-04-49795.

9. Список опубликованных работ

1. Карлинский Д.М., Каплун А.П., Попов М.Е. Предсказание активности низкомолекулярных ингибиторов активации классического пути комплемента методом компьютерного скрининга // Вестник МИТХТ. - 2009. - Т. 4., № 3. - С. 57-63.

2. Roumenina L., Bureeva S., Kantardjiev A., Karlinsky D., Andia-Pravdivy J.E., Sim R., Kaplun A., Popov M., Kishore U. and Atanasov B. Complement Clq-target proteins recognition is inhibited by electric moment effectors // J. Mol. Recognit. -2007. - V. 20., № 5. - Pp. 405-415.

3. Karlinsky D.M., Popov M.E., Kaplun A.P. Computational screening in analysis of low-molecular inhibitors of Clq-IgG interaction // Book of Abstracts. Methods and applications of computational chemistry. 3rd international symposium. - Odessa. — Ukraine. 28 June - 2 July 2009. - Pp. 86.

4. Карлинский Д.М., Попов M.E., Каплун А.П. Предсказание активности низкомолекулярных ингибиторов активации классического пути комплемента методом компьютерного скрининга // Сб. трудов научной конференции "Химическая биология - Фундаментальные проблемы бионанотехнологии". -Новосибирск. - Россия. 10-14 июня 2009. - С. 115.

5. Карлинский Д.М., Попов М.Е., Каплун А.П. Докинг как инструмент поиска сайтов связывания первого компонента системы комплемента с лигандами // Тезисы докладов II молодежной научно-технической конференции "Наукоемкие химические Технологии". - Москва. - Россия. 16-18 октября 2007. -С. 45.

6. Karlinsky D.M., Popov М.Е., Kaplun A.P. Finding binding sites for low-molecular ligands on the surface of Clq with molecular docking // Abstr. of the Fourth Int. Symposium "Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007)". - Moscow. - Russia. 1-5 September 2007. - P. 105.

7. Карлинский Д.М., Каплун А.П., Попов М.Е. Докннг как инструмент для поиска сайта: изучение взаимодействия низкомолекулярных ингибиторов с первым компонентом системы комплемента // Тезисы докладов XVIII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - Москва. - Россия. 7-10 февраля 2006.

8. Bureeva S.V., Andia-Pravdivy J.E., Bichucher A.M., Igumnov M.A., Moskaleva V.Y., Rukosueva N.V., Karlinsky D.M., Popov M.E., Popenko V.I., Kozlov L.V., Kaplun A.P. Negative charged low weight compounds inhibit classical pathway of complement activation blocking Clq-IgG interaction // Abstr. of the 10th European Meeting on Complement in Health and Disease. - Heidelberg, Germany. - 9-13 September 2005. -Mol. Immunol. - 2006. -V. 43. - P. 188.

9. Bureeva S.V., Bichucher A.M., .Andia-Pravdivy J.E., Igumnov M.A., Moskaleva V.V., Rukosueva N.V., Karlinsky D.M., Popov M.E., Kozlov L.Y., Kaplun A.P. Synthetical immunomodulators: inhibition of Clq-IgG interaction by negative charged low weight compounds // Abstr. of the III Int. Symposium "All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)". - Pleven. - Bulgaria. 2-5 June 2005. -P. 53.

1. Андия-Правдивый Ю.Э. 2004. Исследование механизма ингибирования гемолиза заряженными субстанциями, автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук // Биоорганическая химия. Москва.

2. Буреева С.В. 2005. Синтез и исследование влияния низкомолекулярных отрицательно заряженных веществ на классический путь активации комплемента // Биоорганическая химия. Москва.

3. Kishore U., Gaboriaud C., Waters P., Shrive A., Greenhough Т., Reid K.B., Sim R. and Arlaud G. Clq and tumor necrosis factor superfamily: modularity and versatility // Trends in Immunology. 2004. - V. 25, № 10. — Pp. 551-561.

4. Кольман Я., Рём К.-Г. Наглядная биохимия // М. : Мир., 2000. С. 294295.

5. Marques G.,. Anton L.C, Barrio E., Sanchez A., Ruiz S., Gavilanes F., Vivanco F. Arginine residues of the globular regions of human Clq involvedin the interaction with immunoglobulin G // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268, № 14.-Pp. 10393-10402.

6. Kishore U., Gupta S., Perdikoulis M., Kojouharova M., Urban B. and Reid K.B. Modular Organization of the Carboxyl-Terminal, Globular Head Region of Human Clq A, B, and C Chains // J. Immunol. 2003. - V. 171. - Pp. 812820.

7. Joseph-McCarthy D. Computational approaches to structure-based ligand design // Pharmacology & Therapeutics. 1999. - V. 84. - Pp. 179-191.

8. Lengauer T., Rarey M. Computational methods for biomolecular docking // Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. - V. 6, № 3. - Pp. 402-406.

9. Rarey M. Protein-Ligand Docking // GMD German National Research Center for Information Technology Institute for Algorithms and Scientific Computing (SCAI). - Sankt Augustin, Germany, rarey@gmd.de.

10. Kitchen D.B., Decornez H., Furr J.R., Bajorath J. Docking and scoring in virtual screening for drug discovery: methods and applications // Nature reviews, Drug discovery. 2004. - V. 3, № 11. - Pp. 935-949.

11. Kuntz I.D., Blaney J.M., Oatley S.J., Langridge R., Ferrin T.E. A geometric approach to macromolecule-ligand interactions // J. Mol. Biol. 1982. - V. 161.-Pp. 269-88.

12. Rarey M., Kramer B., Lengauer T., Klebe G. A fast flexible docking method using an incremental construction algorithm // J. Mol. Biol. 1996. - V. 261. -Pp. 470-89.

13. Jones G., Willett P., Glen R.C., Leach A.R., Taylor R. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking // J. Mol. Biol. 1997. -V. 267. - Pp. 727-748.

14. Abagyan R., Totrov M., Kuznetsov D. ICM a new method for protein modelling and design. Applications to docking and structure prediction from the distorted native conformation // J. Comput. Chem. - 1994. - V. 15. — Pp. 488-506.

15. Mohan V., Gibbs A.C., Cummings M.D., Jaeger E.P. and DesJarlais R.L. Docking: Successes and Challenges // Curr. Pharm. Design. 2005. — V. 11, № 3. - Pp. 323-333.

16. Muegge I. The effect of small changes in protein structure on predicted binding modes of known inhibitors of influenza virus neuraminidase: PMF-scoring in DOCK4 // Med. Chem. Res. 1999. - V. 9. - Pp. 490-500.

17. McGovern S.L., Shoichet B.K. Information decay in molecular docking screens against holo, apo, and modeled conformations of enzymes // J. Med. Chem. 2003. - V. 46. - Pp. 2895-2907.

18. Schapira M., Abagyan R., Totrov M. Nuclear hormone receptor targeted virtual screening // J. Med. Chem. 2003. - V. 46. - Pp. 3045-3059.

19. Davis A.M., Teague S.J., Kleywegt G.J. Application and Limitations of X-ray Crystallographic Data in Structure-Based Ligand and Drug Design // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2003. - V. 42. - Pp. 2718-2736.

20. Kleywegt G.J., Henrick K., Dodson E.J., van Aalten D.M. Pound-wise but penny-foolish: How well do micromolecules fare in macromolecular refinement? // Structure (Camb). 2003. - V. 11. - Pp. 1051-1059.

21. Bostrom J. Reproducing the conformations of protein-bound ligands: a critical evaluation of several popular conformational searching tools // J. Comput. AidedMol. Des. -2001. V. 15.-Pp. 1137-1152.

22. Hopkins S.C., Vale R.D., Kuntz I.D. Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening // Biochemistry. 2000. - V. 39. - Pp. 2805-2814.

23. Tondi D., Slomczynska U., Costi M.P., Watterson D.M., Ghelli S., Shoichet B.K. Structure-based discovery and in-parallel optimization of novel competitive inhibitors of thymidylate synthase // Chem. Biol. 1999. - V. 6. -Pp. 319-331.

24. Perola E., Xu K., Kollmeyer T.M., Kaufmann S.H., Prendergast F.G., Pang Y.P. Successful virtual screening of a chemical database for farnesyltransferase inhibitor leads // J. Med. Chem. 2000. - V. 43. - Pp. 401-408.

25. Burkhard P., Hommel U., Sanner M., Walkinshaw M.D. The discovery of steroids and other novel FKBP inhibitors using a molecular docking program // J. Mol. Biol. 1999. - V. 287. - Pp. 853-858.

26. Olson A.J., Goodsell D.S. Automated docking and the search for HIV protease inhibitors // SAR QSAR Environ Res 1998. V. 8. - Pp. 273-285.

27. Powers R.A., Morandi F., Shoichet B.K. Structure-based discovery of a novel, noncovalent inhibitor of AmpC beta-lactamase // Structure (Camb). 2002. -V. 10.-Pp. 1013-1023.

28. Doman T.N., McGovern S.L., Witherbee B.J., Kasten T.P., Kurumbail R., Stallings W.C., et al. Molecular docking and high-throughput screening for novel inhibitors of protein tyrosine phosphatase-IB // J. Med. Chem. — 2002. -V. 45.-Pp. 2213-2221.

29. Pieper U., Eswar N., Stuart A.C., Ilyin V.A., Sali A. MODBASE, a database of annotated comparative protein structure models // Nucleic Acids Res. 2002. -V. 30.-Pp. 255-259.

30. Diller D.J., Li R. Kinases, homology models, and high throughput docking // J. Med. Chem. 2003. - V. 46. - Pp. 4638-4647.

31. Chen Y.Z., Zhi D.G. Ligand-protein inverse docking and its potential use in the computer search of protein targets of a small molecule // Proteins. 2001. — V. 43.-Pp. 217-226.

32. Meng E.C., Shoichet B.K., Kuntz I.D. Automated docking with grid-based energy evaluation // J. Comput. Chem. 2004. - V. 13, № 4. - Pp. 505-524.

33. Morris G.M., Goodsell D.S., Halliday R.S., Huey R., Hart W.E., Belew R.K., Olson A.J. Automated docking using a Lamarckian genetic algorithm and an empirical binding free energy function // J. Comput. Chem. 1998. - V. 19, № 14.-Pp. 1639-1662.

34. Shoichet B.K., Kuntz I.D., Bodian D.L. Molecular docking using shape descriptors // J. Comput. Chem. 2004. - V. 13, № 3. - Pp. 380-397.

35. Cai W., Shao X., Maigret B. Protein-ligand recognition using spherical harmonic molecular surfaces: towards a fast and efficient filter for large virtual throughput screening // J. Mol. Graph. Model. 2002. - V. 20, № 4. - Pp. 313-328.

36. Morris R.J., Najmanovich R.J., Kahraman A., Thornton J.M. Real spherical harmonic expansion coefficients as 3D shape descriptors for protein binding pocket and ligand comparisons // Bioinformatics. 2005. — V. 21, № 10. - Pp. 2347-2355.

37. Kahraman A., Morris R.J., Laskowski R.A., Thornton J.M. Shape variation in protein binding pockets and their ligands // J. Mol. Biol. 2007. - V. 368, № l.-Pp. 283-301.

38. Taylor R.D., Jewsbury P.J., Essex J.W. A review of protein-small molecule docking methods // J. Comput. Aided Mol. Des. 2002. - V. 16. - Pp. 151166.

39. Wang R., Lu Y., and Wang S. Comparative Evaluation of 11 Scoring Functions for Molecular Docking // J. Med. Chem. 2003. - V. 46, № 12. -Pp. 2287-2303.

40. Jorgensen W.L. Rusting of the lock and key model for protein-ligand binding // Science. 1991. - V. 254, № 5034. - Pp. 954-955.

41. Wei B.Q., Weaver L.H., Ferrari A.M., Matthews B.W., Shoichet B.K. Testing a flexible-receptor docking algorithm in a model binding site // J. Mol. Biol. -2004.-V. 337, №5.-Pp. 1161-1182.

42. Tame J.R. Scoring functions: a view from the bench // J. Comput. Aided Mol. Des. 1999. - V. 13. - Pp. 99-108.

43. Charifson P.S., Corkery J.J., Murcko M.A., Walters W.P. Consensus scoring: A method for obtaining improved hit rates from docking databases of three-dimensional structures into proteins // J. Med. Chem. 1999. - V. 42. - Pp. 5100-5109.

44. Halperin I., Ma B., Wolfson H., Nussinov R. Principles of docking: An overview of search algorithms and a guide to scoring functions // Proteins. — 2002. V. 47. - Pp. 409-443.

45. Shoichet B.K., McGovem S.L., Wei B., Irwin J.J. Lead discovery using molecular docking // Curr. Opin. Chem. Biol. 2002. - V. 6. - Pp. 439-446.

46. Muegge I., Rarey M., Lipkowitz K.B.L, Boyd D.B. Reviews in Computational chemistry // John Wiley & Sons. 2001. - V. 17. - Pp. 1-60.

47. Abagyan R., Totrov M. High-throughput docking for lead generation // Curr. Opin. Chem. Biol. -2001. -V. 5. Pp. 375-382.

48. Hetenyi C., van der Spoel D. Efficient docking of peptides without prior knowledge of the binding site // J. Protein science. 2002. - V. 11.- Pp. 17291737.

49. Filikov A.V., Mohan V., Vickers T.A., Griffey R.H., Cook P.D., Abagyan R.A., et al. Identification of ligands for RNA targets via structure-based virtual screening: HIV-1 TAR // J. Comput. Aided Mol. Des. 2000. - V. 14. - Pp. 593-610.

50. Klebe G., Bohm H.J. Energetic and entropic factors determining binding affinity in protein-ligand complexes // J. Recept. Signal Transduct Res.'- 1997. -V. 17.-Pp. 459-473.

51. Morris G., Goodsell D., Huey R., Hart W., Halliday S., Belew R., and Olson A. Automated Docking of Flexible Ligands to Receptors Version 3.0.5 User's guide // The Scripps Research Institute Molecular Graphics Laboratory. -2001.

52. Huey R., Morris G. Using AutoDock 4 with AutoDockTools: A Tutorial // The Scripps Research Institute Molecular Graphics Laboratory. 2007.

53. Докинг: методы, проблемы, программы, 2006, http://medchem.ru/docking

54. Rigid and Flexible Docking Methods http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il

55. Dundee PRODRG2 Server http://davapcl.bioch.dundee.ac.uk/

56. RCSB Protein Data Bank http://www.rcsb.org

57. The Scripps Research Institute http://www.scripps.edu

58. Finding the Flaws http://www.phy.cam.ac.uk/camphy/dna/dnal3 1 .htm1. Composer www.tripos.com1. МОЕ www.chemcomp.com1. Modeler www.accelrys.com

59. GeneMine www.bioinfonnatics.ucla.edu/genemine/ RCSB Protein Data Bank http://www.rcsb.org