Синтез и исследование влияния низкомолекулярных отрицательно заряженных веществ на классический путь активации комплемента тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

БУРЕЕВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА КЛАССИЧЕСКИЙ ПУТЬ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА

02.00.10. - Биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2005

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и кафедре биохимии факультета биологии Университета Св. Климента Охридского, г. София, Болгария.

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Каплун Александр Петрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

Мочалин Всеволод Борисович

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Жердев Анатолий Витальевич

Ведущая организация:

Московский НИИ медицинской экологии департамента здравоохранения г. Москвы

Защипа диссертации состоится 2005 года в 15 часов на

заседании Диссертационного совета Д 212120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им.М.В.Ломоносова

Автореферат разослан " 2005 года.

Ученый секретарь Диссертационно! о Совета, кандидат химических наук,

старший научный сотрудник ^ Лютик А.И.

¿.аа£ г- У ПУ X 3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Система комплемента является частью иммунной системы, которая активируется при попадании в организм чужеродных бактерий и других антигенов. Комплемент, получивший свое название благодаря тому, что он дополняет и усиливает действие антител, является главным механизмом, с помощью которого антитела защищают организм от большинства антигенов. Он представляет собой систему сывороточных белков, которые активируются комплексами антиген-антитело (классический путь) или микроорганизмами (альтернативный путь) и претерпевают каскад протеолити-ческих реакций, конечный результат коюрого - сборка мембраноатакующего комплекса, вызывающего лизис патогена. В то же время протеолитические фрагменты анафила токсины, освобождаемые в процессе активации, усиливают защитную реакцию, путем расширения кровеносных сосудов и привлечения фагоцитирующих клеток к очагу воспаления. Таким образом, система комплемента обеспечивает связь между врожденным и адаптивным иммунитетами, усиливает гуморальный ответ, поддерживает внутренний воспалительный гомеостаз.

Несмотря на то, что активность комплемента регулируется системой белков-ингибиторов, атака комплемента против здоровых клеток возможна, и является причиной заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма: ишемиче-ские повреждения, сепсис, астма, аллергия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, миастения, рассеянный склероз и др. Часто нежелательная активация системы комплемента, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца. Активация комплемента - одна из причин отторжения ксено- и аллотрансплантатов.

В настоящее время в мире не существует лекарственных препаратов комплемент-ингибирующего действия; ряд низкомолекулярных модуляторов, а также несколько терапевтических агентов на основе рекомбинантных форм белков-ингибиторов комплемента находятся на разных стадиях клинических испытаний. Однако, создание ингибиторов для селективного блокирования одного из путей активации комплемента, сохраняющее активность другого для иммунной защиты организма, а также ингибирования ранних стадий активации, предотвращающее развитие анафилактических реакций, остается актуальной задачей. Так, усилия нашей лаборатории сосредоточены на создании селективных ингибиторов классического пути комплемента, блокирующих первую стадию активации, а именно взаимодействие узнающего белка комплемента С Ц с антителами.

Несколько лет назад было обнаружено, что заряженные полимеры и липосомы ин-

гибируют это взаимодействие. Упрощающей модифика

юны низ-

комолекулярные отрицательно заряженные вещества с аналогичными свойствами, ди-сульфат бетулина (2.1) и дисульфат бисфенола А, и выявлены важнейшие параметры, определяющие эффективность ингибирования комплемента (О.О.Бурделев, 2000). На примере производных бисфенола А с различными анионными группами было показано, что среди отрицательно заряженных остатков две фосфатные или сульфатные группы обеспечивают наибольшую комплсмснт-ингибирующую активность (Ю.Э.Андия-Правдивый, 2004). Исследования ряда дисульфатов бисфенолов, а также алифатических и ароматических дикарбоновых кислот позволили установить структурные критерии, существенно увеличивающие биологическую активность. На основе этих критериев было выведено уравнение количественной взаимосвязи «структура-активность» (QSAR) для дисульфатов бисфенолов (уравнение I), позволяющее предсказывать активность новых соединений этого класса.

Данная работа является продолжением ранее проведенных исследований и посвящена как получению новых ингибиторов комплемента, так и изучению механизма действия наиболее активных соединений полученных ранее Работа выполнена на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы НИР 1.5.00 "Синтез новых фармакологически активных веществ и изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, про i ивовирусных, антииаркинсониче-ских средств" и фантов РФФИ (№99-04-48793, №05-04-589103), MAC №01-04-06328, 1ранта Минобразования для аспирантов ВУЗов №А04-2.11-1171.

Цели и задачи исследования.

1. Получение новых ингибиторов системы комплемента (расширение уже изученных классов соединений, в том числе за счет модификации известных лидерных структур, и синтез ингибиторов новой природы) на основе структурных критериев установленных ранее. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

• конструирование новых дисульфатов бисфенолов, предсказание их активности с помощью выведенного ранее уравнения QSAR и синтез структур с наиболее высокими значениями предсказанной активности;

• получение сульфатов ряда стероидов и тритерпеноидов как аналогов дисульфата бетулина, наиболее активного на сегодняшний день ингибитора комплемента;

• конструирование и синтез ингибиторов системы комплемента на основе аминокислот;

• получение ингибиторов на основе лекарственной субстанции унитиол;

• расширение ряда изученных ранее дикарбоновых кислот и установление количественной взаимосвязи «структура - активность» в этом ряду;

• получение и изучение комплемент-модулирующих свойств дисперсий нанодиапазо-на: липосом на основе сульфата холестерина и амфифильного дисульфата бисфенола, нанокристаллов бетулиновой кислоты.

2. Исследование влияния наиболее активных соединений на систему комплемента. Для этого предполагалось:

• установить возможность блокирования ингибиторами взаимодействия белка Clq с антителами, определить сайт связывания ингибиторов на Clq молекулярным докингом и подтвердить локализацию сайта связывания экспериментально;

• определить влияние исследуемых ингибиторов на активацию альтернативного пуги комплемента.

Научная новизна работы. Получены новые высокоактивные низкомолекулярные ингибиторы системы комплемента разных классов, а также солюбилизированная форма сульфата холестерина, способные эффективно блокировать комплемент. Установлено, что дисульфат бетулина и дисульфаты бисфенолов блокируют первую стадию активации классического пути комплемента. Молекулярным докингом определен наиболее вероятный сайт связывания эффекторов на глобулярном домене белка Clq и выдвинута гипотеза о возможном механизме ингибирования функций этого белка изученными соединениями. Для наиболее активных ингибиторов показана высокая селективность ингибирования классического пути активации комплемента по отношению к альтернативному пути.

Практическая значимость работы. Обнаружены низкомолекулярные соединения, обладающие высокой способностью ингибировать комплемент, что дает основания для их дальнейшего изучения как потенциальных терапевтических препаратов комплемент-ингибирующего действия. Высокая селективность данных соединений по отношению к классическому пути комплемента позволяет блокировать его активацию с сохранением антибактериальных функций альтернативного пути. Данные препараты могут применяться как для блокирования активации системы комплемента при вызывающих се острых состояниях (инфаркт миокарда, менингит, септический шок и т.п.), так и для покрытия материалов, используемых в экстракорпоральных устройствах и протезах. Получен патент РФ «Производные бетулина как ингибиторы комплемента».

Положения, выносимые на защиту.

1. Дисульфаты бетулина и бисфенолов блокируют первую стадию активации классического пути комплемента (связывание Clq с антителами), взаимодействуя с Clq, а также оказывают влияние на взаимодействие Clq с его другими активаторами в организме (пентраксином CRP, липополисахаридами).

2. Наиболее вероятный сайт связывания дисульфатов бетулина и бисфенолов локали-

зован на вершине глобулярного домена белка Clq рядом с аминокислотными остатками LysA17\ Lyscl?0 и H¡sC167.

3. Гипотеза о возможном механизме блокирования ингибиторами высвобождения Са2+ из глобулярного домена Clq, приводящем к ингибированию первой стадии активации системы комплемента.

4. Комплемигт-ингибирующая активность сульфатов бетулиновой и урсоловой кислот, пептида D,L-W-Fm0cTyr(0S03H)Trp0Me, вероятно, является следствием действия этих соединений в составе надмолекулярных образований (фибрилл).

5. Уравнение количественной взаимосвязи «структура-активность» в ряду алифатических и ароматических дикарбоновых кислот.

Публикации. По материалам работы опубликованы: 4 статьи, 1 патент РФ, тезисы 10 докладов на научных конференциях.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002), II и III Московских международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2003, 2005), II Всемирном конгрессе по иммунопатологии и аллергии (Москва, Россия, 2004), X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004» (Волгоград, Россия, 2004), III Международном симпозиуме «All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)» (Плевна, Болгария, 2005), X Европейском конгрессе «Complement in Health and Disease» (Хайдельберг, Германия, 2005).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц. Список литературы включает источников.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. СИНТЕЗ НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ АКТИВАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА 1.1. Синтез и комплемент-ингибирующая активность дисульфатов

бисфенолов

Исследования комплемент-ингибирукмцей активности ряда дисульфатов бисфено-лов (Ю.Э.Андия-Правдивый, 2004) дозволили установить структурные критерии, обуславливающие увеличение биологической активности: присутствие в структуре двух отрицательных зарядов на расстоянии >0.8 нм, наличие объемных гидрофобных заместителей и экранирование заряженных групп от водной среды замещением смежных к ним положений электроноакцепторнымр заместителями, например, галогенами (эффект увеличивается в ряду CI < Br < I). Установленные закономерности позволили выявить коли-

Табл. 1. Комплемеит-ннгибирующая активность дисульфатов бисфенолов по отношению к классическому пути (в скобках приведены значения активности, предсказанные с помогцью уравнения I).

№ Соединение 10», мкМ' № Соединение ГС», мкМ'

' Соединения были получены ранее в нашей лаборатории (Ю Э Андия-Правяивый, 2004), их активность приведена для сравнения.

* ICW - концентрация вещества, вызывающая 50% активность Определение сенсибилизированные антителами бараньи эритроциты инкубировали с сывороткой морской свинки в присутствии ингибиторов Активность фиксировали как снижение комплемент-зависимого лизиса эритроцитов ' ED» - концентрация вещества, вызывающая 50% лизис эритроцитов (гемолиз) Определение бараньи эритроциты инкубировали с разными концентрациями эффектора

чественную взаимосвязь «структура-активность» для ряда дисульфатов бисфенолов на основе классического метода QSAR. Так, была обнаружена корреляция с гидрофобно-стыо молекулы (cLogP), поляризуемостью центрального радикала (я) и величиной частичных отрицательных зарядов на атомах углерода в орто-положениях по отношению к заряженной группе (Sq) (уравнение I).

LoJ —!— = 0 214(± 0.018) х clogP + 0 031(± 0 004) х л - 3 984(± 0 585) х Sq - 4 764(+ 0.195)

UC50j (I)

„ = 24, /-2 =0938, j = 0.107, F = 92 082

Учитывая ключевое влияние гидрофобности на комплемент-ингибирующую активность, для конструирования новых дисульфатов бисфенолов были выбраны стратегии, приводящие к увеличению линофильности или объема спейсера между заряженными группа-

ми получение гидрофобных производных фенолашрона, создание бисфенолов с цикло-алкилиденовыми заместителями путем конденсации фенола с некоторыми циклическими кетопами (циклогептаноном и циклооктаноном). замещение алифатическими и ароматическими аминами фталидного кольца фенолфталеина Последующая модификация полученных бисфенолов йодом и сульфатными группами приводи та к конечным дисульфагам бисфенолов Активность синтезированных веществ, установленная экспериментально и предскашнная с помощью уравнения I, представлена в табл 1

Дисульфат фенолантрона (1.2). показал самую высокую комплемент-ингибирующую активность среди дисульфашв бисфенолов. исследованных ранее Его аналоги 1.3 и 1.4 были сишезированы. так как с помощью уравнения I дчя них была претсказана высокая ак1ивность Дийо.шрошводное фенолантрона (1.3') получали прикапывая раствор йоди-да кашя и йота к раствору фенопантрона (1.2') в 25% вотном аммиаке (схема I) Кето-группу антроновою цикла соединения 1.2' восстанавливали действием никель-алюминиевого сплава в едком натре с получением бисфенола 1.4' (схема 1) Последующим сульфатированием серной кислотой и уксусным ангидридом в пиридине синтезировали дисульфаты 1.3, 1.4 соответственно Активность соединений 1.3, 1.4 превышает активность родоначальной структуры, кроме того, бпизка предсказанным значениям

Значительный ишерес представляло создание активных эффекторов на основе бисфенолов с циклоалкилиденовыми заместителями путем конденсации фенола с цикюгеп-таноном и циклооктаноном, так как полученный ранее дисульфат бисфенола на основе циклогексанона проявит значительную активность (1ГЧ) 45 мкМ) Попьпки поучить соединение 1.5' методами, описанными для получения биефено юв на основе циклогексанона. с использованием в качестве катализаторов сильных кислот и основании, не привели к получению целевого продукта Однако, применение в качестве промотора тио! ликолекой кислоты позволило получить соединение 1.5' с выходом 27% (схема 2) Дийодпро-изводное 1.6' получали вышеописанным спосо-

Схеча 1

бом.

При конденсации фенола с циклооктаноном мы столкнулись с еще большими трудностями. Использование смеси сильных кислот в качестве катализатора и тиогликолевой кислоты в качестве промотора привело к образованию небольшого количества продукта, который по физико-химическим характеристикам оказался моногидроксифенилзамещенным циклооктаном. Низкие выходы продуктов, небольшие скорости реакций, а также образование монозамещенного циклооктана обусловлены, вероятно, стерическим фактором. Известно, что экранирование карбонильного атома углерода в циклических кетонах увеличивается в ряду циклогексанон < циклогептанон < циклооктанон. Интересно, что сульфат гидроксифенилциклооктана (1.7) оказался довольно активным, несмотря на единственную заряженную группу, что позволяет рассматривать его в качестве новой лидерной структуры.

Дисульфат фенолфталимида (1.8), как было показано ранее, имеет слабую компле-мент-ингибирующую активность (1С50 405 мкМ), однако, модификация ею структуры могла привести, согласно расчетам, к получению значительно более активных соединений 1.9, 1.10. Соединение 1.9' получали взаимодействием фенолфталеина (1.9") со смесью анилина и солянокислого анилина (схема 3). Йодирование соединения 1.9' проводили аналогично йодированию бисфенола 1.2'. Однако, несмотря на то, что йодированное производное 1.10, как и ожидалось, проявило большую активность по сравнению с соединением 1.9, активность обеих структур оказалась значительно ниже расчетных значений.

Реакцией фенолфталеина (1.9") с этилендиамином был получен удобный синтон (1.13") для создания амфифильного (1.13) и бидентатного (1.14) эффекторов (схема 3). Так, эффектор 1.13' был получен ацилированием олеиновой кислотой с использованием в качестве конденсирующего агента МЛ'-карбонилдиимидазола (схема 3). Взаимодействие соединения 1.13" с хлорангидридом пимелиновой кислоты привело к получению бидентатного эффектора 1.14'. Сульфатированием бисфенолов 1.13' и 1.14' получали соответствующие сульфаты 1.13 и 1.14. Эффектор 1.13 был сконструирован для получения на

Сим» 3

1.9"

"""Х/""- <СН2)7СН=СН(СН2)7СНз

I 1.13'

его основе липосомного ингибитора (см. раздел 2). Его высокая литическая активность (ЕГ>50 2.3 мкМ) не допускает исследование его комплемент-ингибирующих свойств в гемолитической системе. Активность полученного бидентатного эффектора 1.14 (1С50 63 мкМ) более чем в шесть раз превысила активность его монодентатного аналога, дисуль-фата фенолфталимида (1.8), что указывает на хорошие перспективы создания нолиден-татных эффекторов на основе дисульфатов бисфенолов. Такие эффекторы будут способны связывать не только разные сайты, расположенные на одном глобулярном домене С1 я, но и при длине спейсера более чем 5 нм блокировать сайты на соседних глобулярных доменах СЦ, что может значительно увеличить комплемент-ингибирующую активность.

1.2. Синтез сульфатов некоторых стероидов и тритерпеноидов Наиболее активным соединением, полученным в нашей лаборатории, является ди-сульфат природного тритерпеноида бетулина (2.1, ГС50 6.9 мкМ). Жесткий скелет этой молекулы обладает более высокой липофильностью по сравнению с дисульфатами бисфенолов, кроме того, обеспечивает большее расстояние между зарядами, что может являться ключом к проявлению такой высокой активности Предполагая, что близкие аналоги дисульфата бетулина могут проявлять подобный комплемент-ингибирующий эффект, мы решили модифицировать сульфатными группами ряд доступных нам гидро-ксилсодержащих стероидов (Д5-3|3-гидроксихоленовую, Д5-ЗР-гидрокситгиохоленовую, холевуто, дезоксихолевую кислоты) и тритерненоидов (бетулин, бетулиновую. олеаноло-

вую, урсоловую кислоты) так, чтобы конечные структуры содержали две и более заряженные группы (рис. 1). Как пример соединения с другими анионными заместителями была изучена активность дифосфата бетулина (2.3). Сульфатирование проводили по методу, разработанному в нашей лаборатории для получения дисульфатов бисфенолов. используя в качестве реагентов серную кислоту и уксусный ангидрид в пиридине. Дисуль-фат 20,29 - дигидро - 20,29-дихлорметиленбетулина (2.2) получали по методу Макоши из

Табл. 2. Свойства сульфатов стероидов и тритерпеноидов № Соединение с1оеР - ЕО*>. мкМ 1С», мкМ

2.1 Дисульфат бетулина 9.55 850 69±3.1

Дисульфат 20,29-дигидро-20,29-' дихлорметиленбетулина 9 29 85 6 8±0 2

23 Дифосфат бетулина 7.27 >800 42 6±2 9

2.4 Сульфат бетулиновой кислоты 921 35 726 >900 9.9±1.5

^ д Сульфат Д5-3 р-гидроксихоленовой 6.63 >400 23.7±6.5

кислоты

Сульфат Д5-3[5- 5.03 >1600 409 5±16 5

гидроксиэтиохоленовой кислоты

2.7 Трисульфат холевой кислоты 3 42 >1400 100 8+12 9

2.8 Дисульфат дезоксихолевой кислоты 5.20 >1500 185 6±6.5

2.9 Сульфат олеаноловой кислоты 9 33 14 67 15 -

2.10 Сульфат урсоловой кислоты 9.28 276 540 >900 25 2+0.3

а Критическая концентрация мицеллообраювания

ь Измерения проведены в вероналовом буфере, в котором проводили определение биологической активности

бетулина с использованием трихлорацетата натрия в качестве источника карбена и хлорида триэтилбензиламмония (ТЕВА) как катализатора межфазного переноса (А.В.Сымон, 2004) с последующим сульфатированием.

Более высокий комплемент-ингибирующий эффект (табл. 2) проявляют наиболее гидрофобные соединения: дисульфаты бетулина (2.1) и 20,29-дигидро-20,29-дихлорметиленбетулина (2.2), сульфат бетулиновой кислоты (2.4). Более гидрофильные структуры, сульфаты Д5-ЗР-гидроксиэтиохоленовой (2.6), холевой (2.7) и дезоксихолевой кислот (2.8), проявляют меньшую активность, подтверждая закономерность, установленную нами для всех ранее изученных классов соединений. Сравнение активностей сульфатов А5-3р-гидроксихоленовой (1С50 23.7 мкМ), дезоксихолевой (Ю50 185.6 мкМ) и холевой (1С50 100.8 мкМ) кислот, имеющих почти одинаковый углеводородный скелет, но разное количество заряженных групп, показывает, что увеличение количества заряженных групп не приводит к увеличению активности, по-видимому, также вследствие снижения липофильности. Этот фактор может являться причиной и для меньшего эффекта дифосфата бетулина по сравнению с дисульфатом бетулина.

Сильный гемолитический эффект сульфата олеаноловой кислоты (2.9) не позволил определить комплемент-ингибирующую активность этого соединения в гемолитической системе. Такой эффект был неожиданным, так как близкие аналоги сульфата олеаноловой кислоты, сульфаты бетулиновой (2.4) и урсоловой кислот (2.10), показали высокую активность и отсутствие литических свойств до концентрации 900 мкМ. Наблюдая при работе с этими веществами гелеобразование в вероналовом буфере, мы предположили, что исследуемые соединения способны образовывать надмолекулярные структуры раз-

Рис. 2. Микрофотографии (негативное контрастирование) наноструктур в воде А: сульфат олеа-воловой кислоты (360 мкМ); В: сульфат урсоловой кислоты (360 мкМ); С: сульфат бетулиновой кислоты (480 мкМ) (Фотографии получены в н.с., д.б.н. Поленко В А в лаборатории электронной микроскопии ИМБ им В А.Энгсльгардта РАН.)

ной морфологии, что могло объяснить различия в биологических свойствах. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы определили критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) и исследовали образование наночастиц электронной микроскопией. ККМ определяли, как это показано в табл. 2, в условиях измерения комплемент-иигибирующей активности и микрофотосъемки, проведение которой в среде вероиалового буфера затруд-пено. Как и следовало ожидать, появление наночастиц в вероналовом буфере наблюдается при меньших концентрациях, что может являться следствием более высокой ионной силы буфера и присутствия дизаряженных катионов.

Микрофотографии наночастиц. образованных сульфатами олеаноловой, урсоловой и бетулиновой кислот, демонстрируют коренные различия в их морфологии (рис 2). Нам представляется, что различие в биологических свойствах этих гомологов является следствием различия их надмолекулярных образований, а не их химического строения непосредственно. Обладающий гемолитическими свойствами сульфат олеаноловой кислоты образует острые кристаллы склонные к агрегации в пластины, тогда как не обладающие такой активностью сульфаты урсоловой и бетулиновой кислот собираются в длинные гибкие фибриллы толщиной 10-40 нм и 4 нм соответственно Близкие значения ККМ сульфата олеаноловой кислоты в вероналовом буфере (14 мкМ) и концентрации 50% его гемолитического эффекта (Ж>5о 15 мкМ) подтверждают нашу гипотезу.

Полученные результаты поднимают вопрос: проявляемая сульфатами урсоловой и бетулиновой кислот комплемент-ингибирующая активность является следствием действия этих соединений в составе фибрилл или на уровне отдельных молекул'' Очевидно, что результаты определения ККМ в нашем случае не отражают реальную концентрацию появления первых надмолекулярных структур из-за низкой опалесценции фибрилл-

содержащих растворов. Так как в вероналовом буфере, в котором проводятся определения активности образование агрегатов происходит при меньших концентрациях, с большой вероятностью можно предположить, что наблюдаемая активность - следствие действия сульфатов урсоловой и бетулиновой кисло! в составе фибрилл Что касается других соединений этого класса, для них образование наночастиц не наблюдалось. Так, микрофотографии дисульфата бстулина не выявили их присутствие при концентрациях ниже ЗмМ.

1.3. Конструирование и синтез ингибиторов системы комплемента на

основе аминокислот

Аминокислоты и пептиды традиционно используются как терапевтические агенты. Они обладают низкой токсичностью и представляют собой удобный конструктор для сборки структур с заданными параметрами.

При изучении активности дисульфатов бисфенолов нами были установлены параметры низкомолекулярных соединений для эффективного ингибирования системы комплемента (см. главу 1), которыми мы воспользовались для конструирования ингибиторов

Табл. 3. Активность ингибиторов комплемента на на основе аминокислот. В качестве основе аминокислот.

начальной структуры был выбран тирозин, обладающий слабой ком-племент-ингибирующей активностью (Ю50 3330 мкМ). Его структура позволяет модифицировать молекулу второй отрицательно заряженной группой на расстоянии 0.84 нм суль-фатированием фенольного гидрокси-ла, вводить йод, а также модулировать гидрофобность ацилированием аминогруппы. Также было получено несколько производных дипептида ТугТгр (триптофан позволял дополнительно ввести одну объемную группу) (табл. 3).

Для модификации тирозина по аминофункции и образования пептидной связи использовали классические методы, применяемые в пептидном синтезе (схема 4). Сульфа-тирование производных тирозина проводили аналогично сульфатированию бисфенолов. Лучшие выходы продуктов достигаются при использовании большего избытка сульфати-рующих агентов (до пяти эквивалентов). Этот метод подходит для сульфатирования

№ Соединение 10», мкМ

3.1 0,Ь-Тирозин 3.2 ОД.-Л'-РИГГуг 33 0,Ь-У-РтосТуг 3330±690 482±49 230±6 3

3.4 0,Ь- Л,-ВосТуг(0503Н) 3.5 ,У-РЫТуг(050зН) 3.6 0,Ь-Лг-РшосТуг(080зН) 3392±99 780±75 212±10

3.7 0,1_-ТугТгр 3.8 ДЬ-ЛГ-ВосТугТгр 3.9 0,ЬЛГ-ВосТуг(05СЬН)Тгр 3.10 ^Ь-ЛЧчпосТугТгрОМе 3.11 0,Ь-Лг-Рш0сТуг(0803Н)Тгр0Ме 513±60 710+14 663±62 >940 21 3±3 8

3.12 3-Йод-0,Ь-тирозин 760+75

3.13 О.ЫДистеиновая кислота 3.14 Вос-0,Ышстеиновая кислота 3.15 РЬЮ,Ь-цистеиновая кислота >10000 32201260 1725±170

3.5

Схема 4

гидроксильной группы тирозина в присутствии защитных групп, лабильных как в кислой, так и в щелочной среде.

Большинство синтезированных соединений проявили слабую активность (табл. 3), за исключением дипептида 0,Ь-Л,-Рт0сТуг(0803Н)Тгр0Ме (3.11), который оказался очень эффективным (1С50 21.3 мкМ). Данное соединение - единственное из исследованных производных тирозина образует нанофибриллы (рис. 5А), и, возможно, не случайно именно оно проявляет комплемент-ингибирующий эффект того же порядка, что сульфаты урсоловой и бетулиновой кислот, также образующие нанофибриллы.

1.4. Получение ингибиторов комплемента на основе унитиола Унитмол (4.1, табл. 4) - малотоксичное лекарственное соединение, применяемое как антидот при острых и хронических отравлениях соединениями мышьяка, ртути, хрома, висмута и других металлов, а также для лечения алкоголизма. Структура унитиола, содержащая сульфогруппу и две сульфгидрильные группы, представляет широкие возможности для получения эффекторов с отрицательно заряженными группами. Так, конденсацией унитиола с карбонильными соединениями в кислой среде были получены заряженные структуры с различными спейсерами. Из полученных производных только соедине-

ние 4.4, продукт конденсации унитиола с янтарным альдегидом, проявило активность выше родоначального соединения и может являться лидерным соединением для создания более активных ингибиторов этого класса.

2. КОМПЛЕМЕНТ-МОДУЛИРУЮЩИЕ

СВОЙСТВА НАНОДИСПЕРСИЙ

Как было показано выше, значительный вклад в комплемент-ингибирующую активность вносит способность веществ образовывать структуры нанодиапазона. В случае сульфатов урсоловой и бетулиновой кислот, а также пептида 3.11 способность к образованию наночастиц была обнаружена случайно, однако, в ходе данной работы были изучены нанодисперсии, специально полученные для ингибирования комплемента: липосомы на основе сульфата холестерина и ам-фифильного дисульфата бисфенола (1.13), а также нанокристаллы бетулиновой кислоты, соединения проявляющего противоопухолевую активность.

Недавно в нашей лаборатории был разработан эффективный метод солюбилизации бетулиновой кислоты и ее производных, обладающих плохой растворимостью в воде (А.В.Сымон, 2004 г.). Он заключается в прибавлении 25-кратного объема воды к раствору солюбилизируемого соединения и яичного фосфатидилхолина (яФХ) в органическом растворителе. Последующее концентрирование с периодической обработкой на ультразвуковой бане позволило получать дисперсии нанокристаллов, подобно дисперсии, представленной на рис. 5В. Мы использовали этот метод для получения дисперсий сульфата холестерина, определение комплемент-ингибирующей активности которого было затруднено ограниченной растворимостью в воде. Рис. 5С показывает, что дисперсия, полученная при равном соотношении сульфат холестерина : яФХ, представляет собой дисперсию липосом, активность которой оказалась очень высокой (1С50 6.3 мкМ).

Для получения липосомных дисперсий на основе амфифильного дисульфата бисфенола 1.13 использовали метод экструзии. Однако, какой-либо комплемент-ингибирующей активности при тестировании липосом на основе смеси эффектора и яФХ, а также эффектора и димиристоилфосфатидилхолина (ИМРС), имеющего более короткие остатки жирных кислот и позволяющего увеличить экспонирование заряженных групп на поверхности липосом, обнаружено не было.

Табл. 4. Активность производных унитиола _Соединение_1С», мкМ

4-1 ^ХА 29Ш

4.2 (ЗчХД-0" 1590+90

О

4.3 (К1> 1600+54

4.4 ДГ^УУ'ЧХЗУ™ 138±18

^^нм^а- 5о2±1о°

Рис. 5. Микрофотографии (негативное контрастирование) наноструктур в воде. A: TS.L-N-FmocTyr(OSOjH)TrpOMe (500 мкМ); В: нанокристаллы бетулиновой кислоты, стабилизированные яФХ (1.1); С: липосомы из сульфата холестерина и яФХ (1:1). (Фотографии получены в.н.с., д.б и Попенко В А в лаборатории электронной микроскопии И МБ им В АЭнгельгардта РАН)

Нанокристаллы бетулиновой кислоты (рис. 5 В) также были исследованы с целью определения возможной комплемент-ингибирующей активности, однако, эта дисперсия проявила противоположный эффект. Так, при концентрациях бетулиновой кислоты выше 150 мкМ наблюдается активация системы комплемента по классическому пути. Эффект установлен при инкубировании несенсибилизировашшх бараньих эритроцитов с сывороткой морской свинки. Так как развитие альтернативного пути комплемента в этих условиях невозможно, можно сделать вывод о антитело-независимой активации классического пути комплемента нанокристаллами бетулиновой кислоты. Эффект многоточечного связывания белка Clq, приводящего к его активации и последующему развитию классического пути, был описан ранее для ряда полимеров с анионными группами (S .Asghar, 1984 г.). По-видимому, полизаряженная поверхность нанокристаллов бетулиновой кислоты также способна активировать Clq, и этот эффект может накладывать ограничения на использование подобных дисперсий в терапевтических цепях из-за возможности нежелательной активации системы комплемента.

3. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ВЗАИМОСВЯЗЬ «СТРУКТУРА - АКТИВНОСТЬ» В РЯДУ ДИКАРБОНОВЫХ КИСЛОТ (QSAR)

В последние десятилетия лекарственная химия широко использует методы математического моделирования, которые позволяют изучать лиганд-рецепторные взаимодействия, предсказывать активность соединений, объединенных в электронные банки данных, оптимизировать уже известные структуры, направлено синтезировать активные соединения. В случае, когда ЗБ-структура биологической мишени недоступна или сайт связывания лиганда неизвестен, широко применяется метод количественной взаимосвязи «струк-

Табл. 5. Активность дикарбоновых кислот

_ №_

5.1 5.2*

5.3

5.4

5.5 5.6'

5.7

5.8

5.9

5.10

5.11

5.12

5.13 5.14" 5.15' 5.16 5.17*

5.18

5.19

5.20

5.21

Соединение

Щавелевая кислота Малоновая кислота 2-Бензилмалоновая кислота 2-Фенилмалоновая кислота 2-Циклопентилмалоновая кислота 1,1-Циклопропандикарбоновая кисл Янтарная кислота Глутаровая кислота Адипиновая кислота Пимелиновая кислота Субериновая кислота Азслаииовая кислота Иминодиуксусная кислота Д'-Бензоилиминодиуксусная кислота Фуран-2,5-дикарбоновая кислота Пиридин-2,5-дикарбоновая кислота Пиридин-2,6-дикарбоновая кислота Нафталин-2,6-дикарбоновая кислота Хинолин-2,6-дикарбоновая кислота Ьифенил-4,4'- дикарбоновая кислота Бифенил-2,2'- дикарбоновая кислота

1С50 _мМ_ з I Г+о 01

2 42±0 16

2 76±0 43

3 11+0 52

3 34+0 65

4 31±0 17 4 31±0 39 4 24±0 28

8 36±0 50 4 99+0 70 4 95+1 10 3 81+0 56

9 13+0 72 213+0 12 0 56±0 48 2 17±0 13

0 33+0 02

1 20±0 19

1 44±0 16 0 58±0 06

2 27±0 23

№

Соединение

1С», мМ

У соон 1 71±0 19

5.22

5.23 ноос^^-0-^у-соон 1 11+0 ^

НООС^^ ^^сосн,

с 1 1 ]

5.24 0 56+0 17

См

^^ о

.^ХООН

Т л г У

5.25

5.26

5.27

5.28"

0 42±0 08 -о сн,о-<ч )-< 3 ЗОЮ 50

л ОН

о 8г.

7 0 70±0 12

Вт

С1 О С1

У^Ль-Ы"

, , , сн^Ч М 0 3510 02 но ч={ }-? он

а а

' Соединения не использованы для выведения уравнения П- соединения 5.6, 5.14, 5.15 - тестовая выборка, активность соединений 5.2, 5.17, 5.28 не описывается уравнением П

тура - активность» (С^АД), математический подход, позволяющий проводить корреляции между структурой соединений и их биологической активностью При этом структурные свойства молекул и физико-химические свойства веществ выражаются количественно в виде дескрипторов. Получаемое в итоге уравнение взаимосвязи «структура-активность» дает возможность предсказывать активность новых аналогов того же класса, хотя и не позволяет судить о механизме действия веществ.

Рапсе в нашей лаборатории был изучен ряд алифатических и ароматических дикарбоновых кислот (О.О.Бурделев, 2000; Ю.Э.Андия-Правдивый, 2004), который в рамках данной работы был дополнен шестью новыми соединениями (табл 5) Изученная палитра эффекторов позволяет вывести уравнение ОЯАЛ, которое может бьггь использовано для получения более активных аналогов в будущем В качестве возможных дескрипторов, которые могут быть ключевыми для расчета комплемент-ингибирующей активности данного ряда структур, мы рассматривали гидрофобность (с!^Р), расстояние между зарядами, объем и площадь молекулы, молярную рефракцию (МЯ), поляризуемость, энергию гидратации молекулы, энергии высшей заселенной и низшей незанятой молекулярных орбиталей (Еномо ЕШмо)- частичные заряды на различных атомах молекулы В результате построения ряда моделей и оценки их адекватности наилучшую корреляцию показали гидрофобность (сЬо§Р) и значение частичного положительного заряда на карбонильных атомах углерода (д). Полученное регрессионное уравнение имеет вид-

Ш —- = 0.137(±0 025) х сЛо£/> + 4 46<5(± 1.235)* 4 - 2.34 ¡(±0.457)

\!С501 (Н)

и = 22, л2 =0.853, 5 = 0 151, ^ = 55.353 Установленная положительная корреляция активности с гндрофобностью является подтверждением закономерности, показанной для других изученных классах соединений: с ростом липофильности структуры активность возрастает. Так, в целом более гидрофобные ароматические дикарбоновые кислоты проявляют более высокую активность (рис. 4А). Значения ц также выше для ароматических кислот из-за делокализации электронной плотности в ароматической системе. Делокализация лармда приводи! к уменьшению сольватных оболочек вокруг заряженных групп, вызывая увеличение силы электростатических взаимодействий лигандов с рецептором, и, как следствие, рост активности. Использование дескриптора q в уравнении II позволило объединить в одну математическую модель разные классы кислот, что является несомненным преимуществом, увеличивающим предсказательную ценность уравнения.

Для проверки адекватности полученной математической модели было использовано два метода: построение модели на основе нормированных значений дескрипторов и перекрестная проверка «1еауе-опс-оиЬ>, при которой одно соединение исключается из выборки, а оставшиеся служат для генерации модели, с помощью которой предсказывается активность исключенного. Полученные в ходе проверки данные, значение коэффициента корреляции для модели на основе нормированных дескрипторов г2 = 0.853 и значение коэффициента перекрестной проверки с? — 0.744, подтверждают адекватность построенной модели. Для оценки предсказательной способности полученного уравнения три соединения 5.6, 5.14, 5.15, выбранные случайным образом, составили тестовую выборку (рис. 4С). Близкие значения активности для соединений 5.6 и 5.14, рассчитанные по уравнению II и полученные экспериментально, подтверждают возможность использова-

Рнс. 4. А, В: взаимосвязь между комплемент-ингибирующей активностью и А - липофилыюстъю (с1м%Р), В - значениями частичных положительных зарядов на карбонильных атомах углерода (д) Кружками обозначены значения параметров алифатических кислот, квадратами - ароматических. С: Корреляция значений активности полученных экспериментально (1/1Сй) и вычисленных по уравнению П (1ЛС»)) Сплошные квадраты - обучающая выборка, полые квадраты -соединения, активность которых не описывается данной моделью, кружки - тестовая выборка.

Соединение Ч 1С»,, мМ' с1С», мМ'

Аспарагиновая кислота 0.381 -1 15 2-5 63

Глутаминовая кислота 0 374 -0 90 2-5 6.2

Глутатион 0 371 -2.72 10-40 11.4

ния полученной модели для Табл. 6. Активность дикарбоновых кислот предсказания активности новых структур. Также с помощью

уравнения II была предсказана „„ , , ,„„„ ,

Получены экспериментально (У.Такаоа, 1978 г)

активность дикарбоновых ки- " Значения рассчитаны но уравнению II слот, экспериментальные значения которой были найдены в литературе (У.Такаёа, 1978 г., табл. 6). Хорошие результаты, полученные для аспарагановой кислоты, глутаминой кислоты и глутатиона, показывают возможность использования уравнения II для аминокислот Значения активности трех дикарбоновых кислот 5.2, 5.17, 5.28 описывались уравнением И со значительной ошибкой (до 500%), что может указывать на механизм их действия, отличный от механизма действия остальных кислот. Так, дипиколиновая кислота (5.17) обладает способностью связывать ионы Са2+, необходимые для функционирования сериновых протеаз системы комплемента, что придает этому соединению дополнительную активность Пока нет хорошего объяснения для соединений 5.2, 5.28, а также кислоты 5.15 из тестовой выборки, однако, учитывая, что комплемент - сложная система белков, значительное превышение значений активности, полученных экспериментально, над расчетными значениями может свидетельствовать о взаимодействии данных лигандов более чем с одной мишенью.

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ НИЗКО МОЛЕКУЛЯРНЫХ

ОТРИЦАТЕЛЬНО ЗАРЯЖЕННЫХ ВЕЩЕСТВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ БЕЛКА СЦ

В ходе предыдущих исследований было установлено, что отрицательно заряженные полимеры ингибируют первую стадию классического пути активации комплемента (связывание первого компонента классического пути белка С1я с иммуноглобулинами), взаимодействуя с глобулярным доменом белка С1ц (О.О.Бурделев, 2000). Предполагая подобный механизм действия для изученных низкомолекулярных субстанций, мы оценили способность наиболее активных ингибиторов, дисульфата бетулина (2.1) и 3,3-бис-(4'-гидрокси-3'-йодфенил)антрона (13), блокировать связывание СЦ с антителами. Полученные при этом значения константы ингибирования Ю, хорошо коррелируют со значениями 1С5(ь полученными для общей активности всех стадий классического пути, что может свидетельствовать о специфичности действия изученных ингибиторов на первой стадии классического пути комплемента (табл. 7).

На следующем этапе было необходимо определить сайт связывания ингибиторов на С1ц. Структура белка С1 я напоминает букет тюльпанов (рис 6А), включая М-концевой коллагеноподобный участок и шесть сферических С-концевых глобулярных областей,

Табл. 7. Комплемент-ингибирующая активность изученных соединений

№ Соединение Первая стадия классического пути комплемента, Kl, мкМ ' Классический путь ICso, мкМ

13 Дисульфат 3,3-бис-(4'-гидрокси-3'-йодфенил)антрона 2.1 Дисульфат бетулина 18.0±9.0 8.6±1 8 9.5±0.4 6.9±3.1

" На первой стадии в присутствии ингибитора формировали комплексы EAClq (сенсибилизированные эритроциты со связанным с антителами белком Clq) Прибавление на следующей стадии Clq-дефицитной сыворотки человека приводило к развитию каскада комплемента в степени, соответствующей количеству Clq, связавшегося с иммунными комплексами в присутствии ингибитора Активность фиксировали как снижение лизиса эритроцитов

состоящих из трех цепей А, В и С. Характерной особенностью глобулярного домена Clq (gClq), ответственного за связывание белка Clq с его лигандами, является присутствие внутри канала между цепями иона Са2+, локализованного ближе к вершине домена (рис. 6В).

В 2003 г. ЗБ-структура глобулярного домена Clq была определена рентгенострук-турным анализом и опубликована в базе данных белковых структур. Это дало возможность определения сайтов связывания ингибиторов, используя докинг, компьютерное моделирование посадки лигандов на рецептор В результате моделирования взаимодействия ингибиторов с глобулярным доменом Clq с помощью программного пакета AutoDock З1, было обнаружено несколько кластеров связывания эффекторов, характеризующихся разной заселенностью и энергией связывания (рис. 7А). Для девяти изученных лигандов, среди которых дисульфат бетулина и наиболее активные дисульфаты бисфено-лов, кластеры лигандов на вершине gClq характеризовались наибольшей энергией связывания. При этом наблюдалась хорошая корреляция (г2 = 0.85) между энергией связывания лигандов и их активностью, что говорит о высокой вероятности правильного определения сайта. Связывание лигандов на вершине gClq (рис. 7В) соответствует взаимодействию ингибиторов с двумя цепями gClq, а именно, связыванию одной сульфатной группы с положительно заряженными аминокислотными остатками LysAm и Lyscno, и другой сульфатной группы - с HisC167.

1 Расчет был произведен в лаборатории химии протеолитических ферментов ИБХ им

M M Шемякина и Ю А Овчинникова студентом Карлинским Д M под руководством ст н.с, к х.н Попова M Е.

Рис. 6. А: Структура белка С1я В: Структура глобулярного домена СЦ Полипептидные цепи А, В и С показаны разными оттенками серого. Ион Са2+ показан схематично в виде черного шара.

Хотя локализация сайта связывания IgG на gClq продолжается в настоящее время не выявлено чтобы указанные аминокислотные остатки принимали участие в IgG-Clq взаимодействии (С Gabonaud 2003; M S Kojouharova 2004). блокирование которого было установлено нами для ингибиторов Поэтому было необходимо подтвердить локализацию сайта связывания ингибиторов экспериментально и. в случае успеха ответить на вопрос, как связывание ингибиторов на вершине gClq может приводить к блокированию IgG-Clq взаимодействия Для этого на следующем этапе работы с помощью иммунофер-ментного анализа (ИФА) было изучено влияние соединений 1.2 и 2.1 на взаимодействие белка Clq а также его рекомбинантных фрагментов с различными природными мишенями-активаторами Clq в организме IgGl. пентраксинами CRP и РТХЗ, а также липопо-лисахаридами (LPS) В качестве фрагментов Clq были использованы: глобулярные части цепей А. В и С (ghA. ghB ghC) а также мутант глобулярной части цепи С (LysC170Glu) в котором Lys0170 определенный докингом как остаток принимающий участие в связывании ингибиторов был заменен сайт-направленным мутагенезом на глутамат2

Рис 8А демонстрирует что дисульфат бетулина блокирует взаимодействие ghA. ghB и ghC с IgGl, при этом наибольшая активность наблюдается по отношению к цепям А и С взаимодействие с которыми «показал» докинг Эта специфичность не прослеживается при взаимодействии глобулярных фрагментов gClq с белком CRP (рис 8В) где дисульфат бетулина демонстрирует равное отношение к ghA ghB и ghC. и пентраксином РТХЗ (рис 8С) где ингибитор проявляет большую активность по отношению к ghB. Известно. что сайт связывания липополисахаридов локализован на цепи В, и фрагменты А и С с LPS не взаимодействуют. Поэтому была изучена способность ишибиюров блокировать ghB-LPS взаимодействие где также наблюдалось значительное ингибирование (рис 8D). Вероятно, блокирование взаимодействия ghB с мишенями происходит в резуль-jaie связывания ингибиторов в сайтах с меньшими энергиями связывания, локализованными на цепи В. Однако, резкое снижение эффективности

: Фрдгменты молекулы Clq любезно предоставили Lubka Т Коишешш и Mihaela S Kojoharova (Sofia University, Bulgaria), Mihaela Ciadjeva и L'day Kishore (I 'niversity of Oxford, ГК)

Рис. 7. А: Глобулярный домен белка С1ц с четырьмя наиболее вероятными кластерами связывания дисульфата бетулина В: Дисульфат бетулина в сайте связывания на вершине gClq

20 40 Ю SO 100 Дисульфат бетртима, мкМ

Дисульфат бетулина. мкМ

Дисульфат бетулина. мкМ

Рис. 8. Влияние дисульфата бетулина (2.1) на взаимодействие рекомбинактных фрагментов gClq. цепей A (ghA), В (ghB), С (ghC) и мутанта LysC170Glu, а также белка Clq с одной стороны, и активаторами белка Clq (IgGl, CRP, РТХЗ, LPS) с другой стороны Белки IgGl, CRP, и РТХЗ, а также LPS, сорбировали на плашку и инкубировали с рекомбинантными фрагментами gClq или Clq в присутствии дисульфата бетулина Активность фиксировали как уменьшение или увеличение связывания мишеней с Clq по сравнению с контролем в отсутствии ингибитора (принято за 100% связывание) Кривые для соединения 1.1 имеют аналогичный вид

0 20 40 «о >0 100

Дисульфат бетулина, мкМ

связывания дисульфата бетулина с мутантным белком 1.узС170Сг!и, где положительно заряженный лизин заменен на отрицательно заряженный глутамат, (рис. 8А, В), - очень сильный аргумент в пользу сайта связывания ингибиторов, определенного докингом.

При изучении взаимодействия между активаторами и целой молекулой СЦ мы получили неожиданные результаты. Оказалось, что с ростом концентрации ингибитора связывание СЦ с его мишенями не уменьшается, что наблюдается для всех его фрагментов £ЬВ и $>ЬС, а, наоборот, увеличивается в несколько раз (рис. 8А, В, О) (исключение - взаимодействие СЦ с РТХЗ, на которое дисульфат бетулина влияния не оказал (рис. 8С)). Так как ранее гемолитическим методом мы доказали, что ингибиторы блокируют первую стадию активации классического пути, возникает вопрос, как увеличение связывания СЦ с его мишенями в присутствии ингибиторов приводит в итоге к блокированию активации каскада комплемента. Последние исследования показывают (Ь.Иоитепша, 2005), что при связывании §СЦ с мишенью, ион Са2+, локализованный около вершины §СЦ, покидает свой сайт, что приводит к изменению конформации СЦ, способствующей активации сериновых протеиназ С1г и С1в, входящих вместе с СЦ в белковый комплекс С1. В связи с этим, можно предположить, что связывание ингибиторов на вершине £СЦ не препятствует связыванию СЦ с мишенями, а препятствует высвобождению иона Са2+, в результате чего активация С1г и С1з, а следовательно, после-

дующее развитии каскада комплемента становится невозможным. 1'аким образом, ингибиторы, которые обладают значительной гидрофобностью, связываясь с С1ц и увеличивая его способность взаимодействовать с аетиваторами (например, стабилизируя комплекс С ^-активатор), могут вовлекать СЦ в непродуктивные комплексы и блокировать развитие каскада

5. АКТИВНОСТЬ ИЗУЧЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К

АЛЬТЕРНАТИВНОМУ ПУТИ АКТИВАЦИИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

Полисахариды клеточных стенок микроорганизмов даже в отсутствии антител могут активировать альтернативный путь системы комплемента. Активация классического пути тоже активирует альтернативный путь с помощью механизма положительной обратной связи. Таким образом, альтернативный путь обеспечивает первую линию защиты от инфекции, пока не сформировался иммунный ответ, и усиливает действие классического пути после начала иммунного ответа. При целом ряде аутоиммунных заболеваний, именно активация классического пути лежит в основе комплемент-опосредованного разрушения тканей, и ингибирование альтернативного пути, которое лишает организм антибактериальной защиты, опасно. Селективное блокирование ранних стадий классического пути (ингибирование С1, С2, С4) способно остановить развитие заболевания и предотвратить нежелательную активацию альтернативного пути комплемента. Табл. 8. Активность изученных соединений Чтобы сделать выводы о терапевти-

№ Альтернативный путь Классический пуп, ческих перспективах наиболее активных 1С», мкМ 1С», мкМ ______соединений, изученных в настоящей ра-

1.1 462.0±23 0 43.0±4.0

1.2 775 0±37.0 40.0± 11.0 б01е, мы определили их способность бло-

кировать альтернативный путь системы

1.3 512.0±77.0 9 5±0 4 2.1 414.5*13.5 6 9±3 1

2.4 640 0±86.0 9 9±1.5 комплемента (табл. 8). Представленные

_ü!_644.5±49 5_21 3±3 8 значения показывают, что эффекторы

способны ингибировать альтернативный путь, однако, активность по отношению к этому способу активации значительно слабее, чем по отношению к классическому пути. Так, для дисульфата бетулина (2.1) активность различается в 60 раз. Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что ингибиторы способны селективно блокировать классический путь активации комплемента, не лишая организм антибактериальной защиты альтернативного пути.

6. выводы

1. Синтезированы и исследованы на способность ингибировать активацию классического пути комплемента низкомолекулярные соединения различных классов, в каждом из которых обнаружены высокоактивные ингибиторы: дисульфат 3,3-бис-(4'-гидрокси-3'-йодфенил)антрона, (1С50 9.5 мкМ), сульфаты бетулиновой (1С5о 9.9 мкМ), Д5-3ß-гидроксихоленовой (IC50 23.7 мкМ) и урсоловой кислот (1С50 25.2 мкМ), пептидный ингибитор D,L-Ar-Fm0cTyr(0S03H)Trp0Me (1С50 21.3 мкМ).

2. Выявлена количественная взаимосвязь «структура-активность» (QSAR) в ряду дикар-боиовых кислот. Значимыми дескрипторами являются гидрофобность и значение частичного положительного заряда на карбонильных атомах углерода.

3. При изучении комплемент-модулирующих свойств ряда дисперсий нанодиапазона получена и охарактеризована липосомная дисперсия на основе сульфата холестерина, обладающая высокой комплемент-ингибирующей активностью (1С50 6.3 мкМ).

4. Установлено, что дисульфаты бетулина и бисфенолов блокируют первую стадию активации классического пути комплемента, связываясь с белком Clq, а также оказывают влияние на взаимодействие Clq с его активаторами (IgGl, пентраксином CRP, липополисахар идами).

5. С помощью молекулярного докинга определено, что сайт связывания дисульфатов бетулина и бисфенолов локализован на вершине глобулярного домена белка Clq между цепями А и С рядом с положительно заряженными аминокислотными остатками LysA17î, Lyscno и His0167. Обнаружено, что мутаитная глобулярная часть цепи С, в которой остаток Lys0170 заменен на глутамат, не взаимодействует с ингибиторами, что подтверждает локализацию сайта связывания экспериментально.

6. Определено, что активность изученных ингибиторов по отношению к классическому пути комплемента значительно выше активности по отношению к альтернативному пути, что позволяет использовать синтезированные ингибиторы для селективного блокирования активации классического пути комплемента, не ослабляя антибактериальной защиты организма.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает свою признательность Lubka T. Routnenina и Mihaela S Kojoharova (Sofia University, Bulgaria), Mihaela Gadjeva и Uday Kishore (University of Oxford, UK) за сотрудничество и любезно предоставленные фрагменты молекулы Clq и другие белки, д.х.н. Б.П.Атанасову (ИОХ БАН, София, Болгария) за сотрудничество и обсуждение результатов работы, в н.с, д.б.н. В И.Попенко (ИМБ им. В.А.Энгельгардта) за электронные микрофотографии, Д.Карлинскому и ст.н.с., к.х.н. М.Е Попову (ИБХ им М.М.Шемякина

и Ю.А.Овчинникова) за компьютерный докинг, д.б.н. проф. Л.В.Козлову и А.М.Бичучер

(МНИЭиМ им. Г.Н.Габричевского) за сотрудничество и биологические реактивы, НИЧ

МИТХТ им. М.В.Ломоносова и лично В.В.Фомичеву за финансирование зарубежных

командировок, фирме «Биолек» (Харьков, Украина) за биологические реактивы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. S.V. Bureeva, J.E. Andia-Pravdivy, G.N. Petrov, M.A. Igumnov, S.V. Romanov, E.A. Kolesnikova, A.P. Kaplun, L.V. Kozlov. Inhibition of Classical Pathway of Complement Activation with Negative Charged Derivatives of Bisphenol A and Bisphenol Disulphates. // Bioorg. Med. Chem. 2005. V.13. N.4. P.1045-1052.

2. S. Bureeva, J. Andia-Pravdivy, A. Kaplun. Drug design using the example of the complement system inhibitors' development. // Drug Discov. Today. 2005. V.10. N.22. P. 15351542.

3. Ю.Э.Андия-Правдивый, С.В.Буреева, А.П.Каилун, В.И.Швец. Получение и антигемолитическая активность дисульфатов бисфенолов и ряда дикарбоновьгх кислот. // Хим.-Фарм. Журнал. 2004. Том 38 №3 С.9-12.

4. Ю.Э. Андия-Правдивый, С.В. Буреева, А.П. Каплун, В.И. Швец. Получение и антигемолитическая активность дисульфатов бисфенолов. // Ученые записки МИТХТ-2003.-Вып. 8.- С.51-55.

5. А.П. Каплун, Ю.Э. Ацция-Правдивый, С.В. Буреева, Л.В. Козлов, В.И. Швец. Производные бетулина как ингибиторы комплемента. // Патент РФ № 2243233. Бюллетень изобретений № 36.27.12.2003.

6. S.V.Bureeva, A.M.Bichucher, J.E.Andia-Pravdivy, M.AIgumnov, V.V.Moskaleva, N.V.Rukosueva, D.M.Karlinsky, M.E.Popov, L.V.Kozlov, A.P.Kaplun. Synthetical immunomodulators: inhibition of Clq-IgG interaction by negative charged low weight compounds. // Abstracts of III International Symposium "All About Intravenous Immunoglobulin Therapy (IVIG)". - Pleven. - Bulgaria. 2-5 June 2005,- P.53.

7. Орищенко Д А., Буреева С.В , Андия-Правдивый Ю.Э., Игумнов M.A. Количественная взаимосвязь "структура-активность" для ряда дикарбоновых кислот как ингибиторов активации системы комплемента. // Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- Москва.- Россия,- 14-18 марта 2005.- Т.1.- С.140.

8. Игумнов М.А., Буреева С.В., Андия-Правдивый Ю.Э., Орищенко ДА., Рукосуева Н.В., Москалева В.В. Анионные соединения, модулирующие активность системы комплемента. // Материалы III Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- Москва - Россия.- 14-18 марта 2005,- Т.1.-С.159.

9. Буреева С.В., Андия-Правдивый Ю.Э., Петров Г.Н., Орищенко ДА., Игумнов М.А.,

Каплун А.П. Модулирование активности системы комплемента заряженными субстанциями. // Материалы II всемирного конгресса по иммунопатологии и аллергии. -Москва. -Россия. - 14-17 мая 2004. -Т.5. - Xsl. - С.49.

10. Буреева C.B., Андия-Правдивый Ю.Э., Петров Г.Н., Каплун А.П. Математические модели (QSAR) в химии и технологии БАС на примере ингибиторов активации комплемента // Материалы X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004». - Волгоград. - Россия. - 7-10 сентября 2004. -Т.1. -С.231.

11. Каплун А.П., Андия-Правдивый Ю.Э., Буреева C.B., Безруков Д.А. Конструирование ингибиторов комплемента на основе заряженных субстанций. // Материалы X Международной научно-технической конференции «Наукоемкие химические технологии - 2004». - Волгоград. - Россия. -7-10 сентября 2004. -Т.1. -С.259.

12. Буреева C.B., Андия-Правдивый Ю.Э., Орищенко Д.А., Каплун АП Исследование структурных критериев взаимодействия белков комплемента с заряженными субстанциями. // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология-состояние и перспективы развития».- Москва.- Россия,- 10-14 ноября 2003.- Т.1.-С.136.

13. Андия-Правдивый Ю.Э., Бурделев О.О., Буреева C.B., Безруков Д.А., Орищенко Д.А., Голицына Ю.В., Каплун A.II. Изучение механизма ингибирования гемолиза заряженными субстанциями. // Материалы III съезда биохимического общества.- Санкт-Петербург.- Россия. - 26 июня - 1 июля 2002,- С. 133.

14. Андия-Правдивый Ю.Э., Бурделев О.О., Буреева C.B.. Безруков Д.А., Орищенко Д.А., Голицина Ю.В., Каплун А.П. От изучения механизма ингибирования активации комплемента к созданию лекарственных субстанций. // Тезисы докладов конференции «Химия и технология биологически активных веществ, пищевых продуктов и доба-вок».-Москва-Тверь.-Россия.- 25-29 сентября 2001. - С.5.

Принято к исполнению 19/10/2005 Исполнено 20/10/2005

Заказ № 1150 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш , 36 (095) 975-78-56 (095) 747-64-70 www.autoreferat.ra

93 de

РНБ Русский фонд

2006-4 17483

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ОСНОВЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ.

I. I Стратегии и подходы к созданию лекарстве) шых соединений на примере ингибиторов активации системы комплемента. /. 1 Этапы создания лекарственных препаратов.

1. 1.2 Система комплемента.

1. 1.3 Ингибиторы комплемента, найденные скринингом.

1.1.4 Молекулярная модификация соединений-лидеров.

1.1.5 Метод QSAR.

1.1.6 Случайные открытия лекарственных соединений.

1.1.7 ЗО-Структура белков как ююч к созданию ингибиторов комплемента.

1.1.8 Ингибиторы, найденные методом фагового дисплея.

1.1.9 Белковые ингибиторы системы комплемента.

Система комплемента является частью иммунной системы организма, которая активируется при попадании в организм чужеродных бактерий и других антигенов. Комплемент, получивший свое название благодаря тому, что он дополняет и усиливает действие антител, является главным механизмом, с помощью которого антитела защищают организм от большинства антигенов. Он представляет собой систему сывороточных белков, которые активируются комплексами антиген-антитело (классический путь) или микроорганизмами (альтернативный путь) и претерпевают каскад протеолитических реакций, конечный результат которого - сборка мембраноа-такующего комплекса, вызывающего лизис патогена. В то же время протеолитические фрагменты анафилатоксины, освобождаемые в процессе активации, усиливают защитную реакцию, путем расширения кровеносных сосудов и привлечения фагоцитирующих клеток к очагу воспаления. Таким образом, система комплемента обеспечивает связь между врожденным и адаптивным иммунитетами, усиливает гуморальный ответ, поддерживает внутренний воспалительный гомео-стаз.

Несмотря на то, что активность комплемента регулируется системой белков-ингибиторов, атака комплемента против здоровых клеток возможна, и является причиной заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма: ишемические повреждения, сепсис, астма, аллергия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, миастения, рассеянный склероз и др. Часто нежелательная активация системы комплемента, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца. Активация комплемента - одна из причин отторжения ксено- и аллотрансплантатов. В настоящее время в мире не существует лекарственных препаратов комплемент-ингибирующего действия; ряд низкомолекулярных модуляторов, а также несколько терапевтических агентов на основе рекомбинантных форм белков-ингибиторов комплемента находятся на разных стадиях клинических испытаний. Однако, создание ингибиторов для селективного блокирования одного из путей активации комплемента, сохраняющее активность другого для иммунной защиты организма, а также ингибирования ранних стадий активации, предотвращающее развитие анафилактических реакций, остается актуальной задачей. Так, усилия нашей лаборатории сосредоточены на создании селективных ингибиторов классического пути комплемента, блокирующих первую стадию активации, а именно взаимодействие узнающего белка комплемента Clq с антителами.

Несколько лет назад было обнаружено, что заряженные полимеры и липосомы ингибиру-ют это взаимодействие. Упрощающей модификацией были сконструированы низкомолекулярные отрицательно заряженные вещества с аналогичными свойствами, дисульфат бетулина и дисуль-фат бисфенола А, и выявлены важнейшие параметры, определяющие эффективность ингибиро-вания комплемента [1]. На примере производных бисфенола А с различными анионными группами было показано, что среди отрицательно заряженных остатков две фосфатные или сульфатные группы обеспечивают наибольшую комплемент-ингибирующую активность [2]. Исследования ряда дисульфатов бисфенолов, а также алифатических и ароматических дикарбоновых кислот позволили установить структурные критерии, существенно увеличивающие биологическую активность. На основе этих критериев было выведено уравнение количественной взаимосвязи «структура-активность» (QSAR) для дисульфатов бисфенолов, позволяющее предсказывать активность новых соединений этого класса.

Данная работа является продолжением ранее проведенных исследований и посвящена как получению новых ингибиторов комплемента, так и изучению механизма действия наиболее активных из изученных соединений.

4 Выводы

1. Синтезированы и исследованы на способность ингибировать активацию классического пути комплемента низкомолекулярные соединения пяти различных классов, в каждом из которых обнаружены высокоактивные ингибиторы: дисульфат 3,3-бис-(4'-гидрокси-3'-йодфенил)антрона, (IC50 9.5 мкМ), сульфаты бетулиновой (IC50 9.9 мкМ), Д5-Зр-гидроксихоленовой (IC50 23.7 мкМ) и урсоловой кислот (IC50 25.2 мкМ), пептидный ингибитор D,L-Ar-FmocTyr(OS03H)TrpC>Me (IC50 21.3 мкМ).

2. Выявлена количественная взаимосвязь «структура-активность» (QSAR) в ряду дикарбоновых кислот. Значимыми дескрипторами являются гидрофобность и значение частичного положительного заряда на карбонильных атомах углерода.

3. При изучении комплемент-модулирующих свойств ряда дисперсий нанодиапазона получена и охарактеризована липосомная дисперсия на основе сульфата холестерина, обладающая высокой комплемент-ингибирующей активностью (IC50 6.3 мкМ).

4. Установлено, что дисульфаты бетулина и бисфенолов блокируют первую стадию активации классического пути комплемента, связываясь с белком Clq, а также оказывают влияние на взаимодействие Clq с его активаторами (IgGl, пентраксином CRP, липополисахаридами).

5. С помощью молекулярного докинга определено, что сайт связывания дисульфатов бетулина и бисфенолов локализован на вершине глобулярного домена белка Clq между цепями А и С рядом с положительно заряженными аминокислотными остатками LysA173, Lyscl70 и HisC167. Обнаружено, что мутантная глобулярная часть цепи С, в которой остаток LysC170 заменен на глу-тамат, не взаимодействует с ингибиторами, что подтверждает локализацию сайта связывания экспериментально.

6. Определено, что активность изученных ингибиторов по отношению к классическому пути комплемента значительно выше активности по отношению к альтернативному пути, что позволяет использовать синтезированные ингибиторы для селективного блокирования активации классического пути комплемента, не ослабляя антибактериальной защиты организма.

Благодарности

Автор выражает свою признательность Lubka Т. Roumenina и Mihaela S. Kojoharova (Sofia

University, Bulgaria), Mihaela Gadjeva и Uday Kishore (University of Oxford, UK) за сотрудничество и любезно предоставленные фрагменты молекулы Clq и другие белки, д.х.н. Б.П.Атанасову

ИОХ БАН, София, Болгария) за сотрудничество и обсуждение результатов работы, в.н.с., д.б.н.

В.И.Попенко (ИМБ им. В.А.Энгельгардта) за электронные микрофотографии, Д.Карлинскому и ст.н.с., к.х.н. М.Е.Попову (ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова) за компьютерный до-кинг, д.б.н. проф. Л.В.Козлову и А.М.Бичучер (МНИЭиМ им. Г.Н.Габричевского) за сотрудничество и биологические реактивы, НИЧ МИТХТ им. М.В.Ломоносова и лично В.В.Фомичеву за финансирование зарубежных командировок, фирме «Биолек» (Харьков, Украина) за биологические реактивы, Ю.Э.Андия-Правдивому за кровь.

1. Бурделев О.О. Исследование влияния заряженных полимеров и липосом на комплемент-зависимый лизис эритроцитов. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2000. МИТХТ.

2. Андия-Правдивый Ю.Э. Исследование механизма ингибирования гемолиза заряженными субстанциями. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2004. МИТХТ.

3. Зефирова О.Н., Зефиров Н.С. Медицинская химия (Medicinal chemistry) II. Методологические основы создания лекарственных препаратов. // Вестн. МГУ. Сер. 2. Химия. 2000. Т.41. №.2. С.103-108.

4. Fernandes Р.В. Technological advances in high-throughput screening. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V.2. P.597-603.

5. Laskowski R.A., Hutchinson E.G., Michie A.D., Wallace A.C., Jones M.L., Thornton J.M. PDBsum: a Web-based database of summaries and analyses of all PDB structures. // Trends Biochem. Sci. 1997. V.22. P.488-490.

6. Goodford P. A computational procedure for determining energetically favorable binding sites on biologically important macromolecules. //J. Med. Chem. 1985. V.28. P.849-857.

7. Miranker A., Karplus M. Functionality maps of binding sites: a multiple copy simultaneous search method. // Proteins. 1991. V. 11. P.29-34.

8. DeWitte R., Shakhnovich E. SMoG: de novo design method based on simple, fast, and accurate free energy estimates. 1. Methodology and supporting evidence. // J. Am. Chem. Soc. 1996. V.l 18. P. 1173311744.

9. Bohacek R.S., McMartin C. Multiple highly diverse structures complementary to enzyme binding-sites results of extensive application of a de-novo design method incorporating combinatorial growth. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V.l 16. P.5560-5571.

10. Lauri G., Bartlett P. A. Caveat a program to facilitate the design of organic-molecules. // J. Comput. Aided Mol. Des. 1994. V.8. P.51-66.

11. Bohm H.J. On the use of Ludi to search the Fine Chemicals Directory for ligands of proteins of known 3-dimensional structure. //J. Comput. Aided Mol. Des. 1994. V.8. P.623-632.

12. Veselovsky A.V., Ivanov A.S. Strategy of computer-aided drug design. // Curr Drug Targets Infect Disord. 2003. V.3. P.33-40.

13. Yu H., Adedoyin A. ADME-Tox in drug discovery: integration of experimental and computational technonologies. // Drug Discov. Today. 2003. V.8. N.18. P.852-861.

14. Hansch C., Leo A. Exploring QSAR. Fundamentals and Applications in Chemistry and Biology. // American Chemical Society.: Washington. 1995.

15. Артеменко H.B., Баскин И.И., Палюлин B.A., Зефиров Н.С. Искусственные нейронные сети и фрагментный подход в прогнозировании физико-химических свойств органических соединений. // Изв. АН, Сер. Хим. 2003. Т.1. С. 19-28.

16. Rishton G.M. Nonleadlikeness and leadlikeness in biochemical screening. // Drug Discov. Today. 2003. V.8. N.2. P.86-96.

17. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология (пер. с англ). // Мир.: М. 2000.

18. Frank M.M. Complement in the pathophysiology of human disease. // Engl. J. Med. 1987. V.316. P. 1525-1529.

19. Morgan B.P. Complement: Clinical Aspects and Relevance to Disease. // Academic Press.: Boston. 1990. P.349.

20. Morgan B.P., Gasque P., Singhrao S.K., Piddlesden S.J. Role of complement in inflammation and injury in the nervous system. // Exp. Clin. Immunogenet. 1997. V.14. P.19-23.

21. Asghar S.S. Membrane regulators of complement activation and their aberrant expression in disease. // Lab. Invest. 1995. V.72. P.254-271.

22. Becker E.L. Synthetic inhibitors of complement in Inflammation: Mechanisms and Control (Lepow I.H. and Ward P.A. eds.).// Academic Press.: New York. 1972. pp 281-299.

23. Kilgore K.S., Homeister J.W., Satoh P.S., Lucchesi B.R. Sulfhydryl compounds, captopril, and MPG inhibit complement-mediated myocardial injury. // Am. J. Physiol. 1994. V.266. N.1:2. P.28-35.

24. Sim E., Gill E.W., Sim R.B. Drugs that induce systemic lupus erythematosus inhibit complement component C4. // Lancet. 1984. V.2. N^8400. P.422-424.

25. Sim E., Stanley L., Gill E.W., Jones A. Metabolites of procainamide and practolol inhibit complement components C3 and C4. // Biochem. J. 1988. V.251. N.2. P.323-326.

26. Harrity T.W. Goldlust M.B. Anti-complement effects of two anti-inflammotory agents, niflumic and flufenamic acids. // Biochem. Pharmacol. 1974. V.23. P.3107-3120.

27. Kashyap A. Sehgal V.N., Sahu A., Saha K. Anti-leprosy drugs inhibit the complement-mediated solubilization of pre-formed immune complexes in vitro. // Int. J. Immunopharmacol. 1992. V.14. N.2. P.269-273.

28. Mao T.S.S., Moval J.J., Pellerin P., Plescia O.J. Inactivation of hemolytic activities of serum complement by phenothiazines. // Can. J. Biochem. 1969. V.47. P.547-552.

29. Sim E., Dodds A.W., Goldin A. Inhibition of the covalent binding reaction of complement component C4 by penicillamine, an anti-rheumatic agent. // U.K.Biochem. J. 1989. V.259. N.2. P.415-419.

30. Makrides S.C. Therapeutic inhibition of the complement system. // Pharmacol. Rev. 1998. V.50. N.I. P.59-87.

31. Grabley S., Thiericke R. eds. Drug Discovery from Nature. // Springer-Verlag. Berlin. 1999.

32. Lauenstein K., Siedenstopf H.G. Fischer H. Ober die Wirkung von Heparin, Heparinoiden und Car-rageenan auf die Komponenten des Meerschweinchen Komplements in vitro. // Z. Naturforsch. 1965. V.20b. P.575-581.

33. Yachnin S. Biological properties of polynucleotides. I. The anticomplementary activity of polynucleotides.//J. Clin. Invest. 1963. V.42. P.1947-1955.

34. Yachnin S. Biological properties of polynucleotides. III. The anticomplementary properties of polyriboguanylic acids. //J. Immunol. 1964. V.93. P.155-156.

35. Baker P.J., Osofsky S.G. Isolation and characterization of a low molecular weight inhibitor present in normal and human scrum. // Clin. Exp. Immunol. 1981. V.43. P.549-556.

36. Cimanga K., De Bruyne Т., Lasure A., Van Poel В., Pieters L., Vanden Berghe D., Vlietinck A., Kambu К., Tona L. In vitro anticomplementary activity of constituents from Morinda morindoides. // J. Nat. Prod. 1995. V.58. N.3. P.372-378.

37. Allan R., Rodrick M., Knobel H.R., Isliker H. Inhibition of the interaction between the complement component Clq and immune complexes. // Int. Arch. Appl. Immunol. 1979. V.58. P.140-148.

38. Takada Y., Arimoto Y., Mineda H., Takada A. Inhibition of the classical and alternative pathway by aminoacids and their derivatives. // Immunology. 1978. V.34. P.509-515.

39. Assefa H., Nimrod A., Walker R., Sindelar R. Synthesis and evaluation of potential complement ingibitory semisynthetic analogs of oleanolic acid. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V 9. P. 1889-1894.

40. Sahu A., Rawal N., Pangburn M.K. Inhibition of complement by covalent attachment of rosmarinic acid to activated C3b. // Biochem. Pharmacol. 1999. V.57. P. 1439-1446.

41. Hong K., Kinoshita Т., Miyazaki W., Izawa Т., Inoue K. An anticomplementary agent, K.-76 mono-carboxylic acid: Its site and mechanism of inhibition of the complement activation cascade. // J. Immunol. 1979. V.112. P.2418-2423.

42. Packard B.D., Weiler J.M. Steroids inhibit activation of the alternative-amplification pathway of complement. // Infect. Immunol. 1983. V.40. P. 1011-1014.

43. Raepple E., Hill H., Loos M. Mode of interaction of different polyanions with the first (CI), the second (C2) and the fourth (C4) component I. // Immunochemistry. 1976. V.13. P.251-255.

44. Ю.Э.Андия-Правдивый, С.В.Буреева, А.П.Каплун, В.И.Швец. Получение и антигемолитическая активность дисульфатов бисфенолов и ряда дикарбоновых кислот. // Хим.-Фарм. Журнал. 2004. Т.38. №3 С.9-12.

45. Каплун А.П., Андия-Правдивый Ю.Э., Буреева С.В., Козлов JI.B., Швец В.И. Производные бетулина как ингибиторы комплемента. Патент РФ № 2243233. Бюллетень изобретений № 36, 27.12.2004.

46. Hansch С., Yoshimoto М. Structure-activity relationship in immunochemistry. 2. Inhibition of complement by benzamidines. Hi. Med. Chem. 1974. V.17. P.l 160-1167.

47. Hansch C., Yoshimoto M., Doll M. Structure-activity relationship in immunochemistry. . Inhibition of complement by benzylpyridinium ions. On the predective value of correlation equations. // J. Med. Chem. 1976. V.19. P.1089-1093.

48. Burger A. A Guide to the chemical basis of drug design. // John Wiley & Sons.: New York. 1983. pp. 15-16.

49. Grazer F.M.; Clemente C.D. Developing blood brain barrier to trypan blue. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. V.94. P.758-760.

50. Nutall G.H.F., Hadwen S. // Parasitology. 1909. V.2. P.236-238.

51. Mayer M., Zeiss H. //Arch. Schiffs Tropen-Hyg. 1920 V.24. P.257-261.

52. Eisen, V.; Loveday, C. Effect of suramin on clotting, fibrinolysis and kinin formation. // Br. J. Pharmacol. 1973. V.49. P.678-687.

53. Conrow R.B., Bauman N., Brockman J.A., Bernstein S. Synthetic mediators of complement system.

54. Synthesis and biological activity of 5,5',5" (1,3,6-napthalene-triyl tris (sulfonylimino))-tris(l,3-benzenedisulfonic acid) hexasodium salt. Hi. Med. Chem. 1980. V.23. P.240-242.

55. Козлов JI.B. Особенности функционирования протеиназ комплемента. // Биоорган, химия. 1995. Т.20. № 3. С.229-241.

56. Calcott М.А., Muller-Eberhard H.J. Clq protein of human complement. // Biochemistry. 1972. Vol.1.. P. 3443-3450.

57. Knobel H.R., Villiger W., Isliker H. E. Chemical analysis and electron microscopy studies of human Clq prepared by different methods. Hi. Immunol. 1975. Vol. 5. P. 78-82.

58. Burton D.R., Boyd J., Brampton A.D., Easterbrook-Smith S.B., Emanuel E.J., Novotny J., Rade-maeher T.W., Van Schraven M.R., Sternberg M.J.E., Dwek, R.A. The Clq-receptor site on immunoglobulin G. // Nature (Lond.). 1980. V.288. P.338-344.

59. Boackle R.J., Joknson B.J., Caughman G.B. An IgG primary sequence exposure theory for complement activation using synthetic peptides. // Nature (Lond.). 1979. V.282. P.742-743.

60. Bumhouse R., Cebra J. Isotypes of IgG: Comparison of the primary structures of the three pairs of isotypes which differ in their ability to activate complement. // J. Mol. Immunol. 1979. V.16. P.907-917.

61. Prystowsky M.B., Kehoe J.M., Erickson B.W. Inhibition of classical complement pathway by synthetic peptides from the second constant domain of the heavy chain of IgG. // Biochemistry. 1981. V.21. P.6349-6358.

62. Anderson B.E., Fryer J.P. (1999) Method and material for inhibiting complement. U.S. Patent Number 5,977,076.

63. Takada A., Shirahama S. Inhibition by various peptides of the activation of CI, the first component of complement, and the interaction of С gamma 2 domain of IgG with Clq. // Immunopharmacology. 1985. V.9. P.87-95.

64. Gaboriaud C., Rossi V., Bally I., Arlaud G.L., Fontecilla-Camps J.C. Crystal structure of the catalytic domain of human complement С Is: a serine protease with a handle. // EMBO J. 2000. V.19. P.1755-1765.

65. Perona J.J., Craik C.S. Evolutionary divergence of substrate specificity within the chymotrypsin-like serine protease fold. Hi. Biol. Chem. 1997. V.272. P.29987-29990.

66. Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. // Science. 1985. V.228. P. 1315-1322.

67. Kay B.K, Winter J., McCaferty J. Phage display of peptides and proteins. A laboratory manual. // Academic Press.: San Diego. 1996.

68. Sahu A., Kay B.K., Lambris J.D. Inhibition of human complement by a C3-binding peptide isolated from a phage displayed random peptide library. // J. Immunol. 1996. V.157. P.884-891.

69. Mastellos D., Morikis D., Isaacs S.N., Holland M.C., Strey C.W., Lambris J.D. Complement: structure, functions, evolution, and viral molecular mimiciy. // Immunol. Research. 2003. V.27. N.2-3. P.367-385.

70. Nilsson В., Larsson R., Hong J., Elgue G., Nilsson Ekdahl K., Sahu A., Lambris J.D. Compstatin inhibits complement and cellular activation in whole blood in two models of extracorporeal circulation. // Blood. 1998. V.92. P. 1661-1667.

71. Lauvrak, V., Brekke O.H., Ihle O., Lindqvist B. Identification and characterization of Clq-binding phage displayed peptides. // Biol. Chem. 1997. V.378. P.1509-1519.

72. Mulligan M.S., Yeh C.G., Rudolph A.R., Ward P.A. Protective effects of soluble CRI in complement" and neutrophil-mediated tissue injury // J. Immunol. 1992. V.148. P.1479-1485.

73. Levin J.L., Marsh H.C.Jr., Rudolph A.R. Principles of drug development in transplantation and autoimmunity (R.Lieberman and A.Mukherjee eds.). // R.G.Landes Company.: Texas. 1996. pp. 695-702.

74. Capon D.J., Chamow S.M., Mordenti J., Marsters S.A., Gregory Т., Mitsuya H., Byrn R.A., Lucas C., Wurm F.M., Groopman J.E., Broder S., Smith D.H. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy. // Nature. 1989. V.337. P.525-531. '

75. Kalli K.R., Hsu P., Fearon D.T. Therapeutic uses of recombinant complement protein inhibitors. // Springer. Semin. Immunopathol. 1994. V.15. P.417-431.

76. Greenwald R.B.; Choe Y.H., McGuire J., Conover C.D. Effective drug delivery by PEGylated drug conjugates. // Adv Drug Deliv Rev. 2003. V.55. P.217-250.

77. Wang Y., Youngster S., Bausch J., Zhang R., McNemar C., Wyss D.F. Identification of the major positional isomer of PEGylated IFN alpha-2b. // Biochemistry. 2000. V.39. P. 10634-10640.

78. Ross S.C., Densen P. Complement deficiency states and infection: epidemiology, pathogenesis and consequences of neisserial and other infections in an immune deficiency // Medicine. 1984. V.63. P.243-273.

79. Khazaeli M.B., Conry R.M., LoBuglio A.F. Human immune response to monoclonal antibodies. // J. Immunother. 1994. V.15. P.42-52.

80. Mole J.E., Anderson J.K., Davison E.A., Woods D.E. Complete primary structure for the zymogen of human complement factor B. Hi. Biol. Chem. 1984. V.259. P.3407-3412.

81. Buckel P. Recombinant proteins for therapy. // Trends. Pharmacol. Sci. 1996. V.17. P.450^156.

82. Krogsgaard-Larsen P., Liljefors Т., Madsen U. Textbook of drug design and discovery. // Taylor & Francis.: London and New York. 2002. pp.117-131.

83. Hansch C., Steward A.R., Anderson S.M., Bentley D. The parabolic dependence of drug action upon lipophilic character as revealed by a study of hypnotics. Hi Med Chem. 1968. V.l 1. N.l. P. 1-11.

84. Fujita Т., Hansch C. Analysis of the structure-activity relationship of the sulfonamide drugs using substituent constants. // J. Med. Chem. 1967. V.I0. N.6. P.991-1000.

85. Box G.E.P., Hunter W.G., Hunter J.S. Statistics for experiments. // New York.: Wiley. 1978.

86. Hansch C., Leo A.J. Substitution constants for correlation analysis in chemistry and biology. // New York.: Wiley. 1979.

87. Donovan S.F., Pescatore M.C. Method for measuring the logarithm of the octanol-water partition coefficient by using short octadecyl-poly(vinyl alcohol) high-performance liquid chromatography columns.'//J. Chromatogr. A. 2002. V.952. N.l-2. P.47-6I.

88. Mannhold R., Rekker R.F., Sonntag C., ter Laak A.M., Dross K., Polymeropoulos E.E. Comparative evaluation of the predictive power of calculation procedures for molecular lipophilicity. //J. Pharm. Sci. 1995. V.84. N.l2. P.1410-1419.

89. Leo A., Jow P.Y., Silipo C., Hansch C. Calculation of hydrophobic constant (log P) from pi and f constants. //J. Med. Chem. 1975. V.18. N.9. P.865-868.

90. Taillandier G., Domard M., Boucherle A. Application of Verloop parameters. Comparison with other steric parameters and problems of choice of parameter. // Farmaco Sci. 1980. V.35. N.2. P.89-109.

91. Yoshitomi H., Nakayama Т., Goto S. Relationship between hypoglycemic activity and binding ability with bovine serum albumin of sulfonylurea related compounds. // Yakugaku Zasshi. 1981. V.101. N.I0. P.926-931.

92. Miyagawa H., Fujita T. Quantitative structure-activity study for inhibition of acetylcholinesterase by m-substituted benzyltrimethylammonium salts. // Farmaco Sci. 1982. V.37. N.12. P.797-804.

93. Testa В., Seiler P. Steric and lipophobic components of the hydrophobic fragmental constant. // Arzneimittelforschung. 1981. V.31. N.7. P.1053-1058.

94. Wold S. Cross-validatory estimation of the number of components in factor and principal components models. // Technometrics. 1979. V.20. P.379-405.

95. Norinder U., Hogberg Г. A quantitative structure-activity relationship for some dopamine D2 antagonists of benzamide type. // Acta Pharm. Nord. 1992. V.4. P.73-78.

96. Doweyko A.M. The hypothetical active site lattice. An approach to modelling sites from data on inhibitor molecules. //J. Med. Chem. 1988. V.31. N. 1396-1406.

97. Cruciani G., Watson K.A. Comparative molecular field analysis using GRID force-field and GOLPE variable selection methods in a study of inhibitors of glycogen phosphorylase b. // J. Med. Chem. 1994. V.37. P.2589-2601.

98. Gramer R.D., Patterson D.E., Bunce J.D. Comparative molecular field analysis (CoMFA). I. Effect of shape on binding of steroids to carrier proteins. // J. Am. Chem. Soc. V.l 10. P.5959-5967.

99. Kubinyi H. (ed.) 3D-QSAR in drug design. Theory, methods and applications. // Leiden: ESCOM Science Publishers. 1993.

100. Jain A.N., Koile K., Chapman D. Compass: predicting biological activities from molecular surface properties. Performance comparisons on a steroid benchmark. // J. Med. Chem. 1994. V.37. P.2315-2327.

101. Norinder U. 3D-QSAR investigation of the tripos benchmark steroids and some protein-tyrosine kinase inhibitors of styrene type using the TDQ approach. // J. Chemometrics. 1996. V.10. P.533-545.

102. Wilcox R.E., Tseng Т., Brusniak M.-Y.K., Ginsburg В., Pearlman R.S., Teeter M., DuRand Starr C.S., Neve K.A. CoMFA-based prediction of agonist affinities at recombinant D1 vs. D2 dopamine receptors. //J. Med. Chem. 1998. V.41. P.4385-4399.

103. Klebe G., Abraham U. On the prediction of binding properties of drug molecules by comparative molecular field analysis. //J. Med. Chem. 1993. V.36. P.70-80.

104. Kubinyi H (ed.) 3D-QSAR in drug design. Volume 3: resent advances. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 1998.

105. Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Kaplun A. Drug design using the example of the complement system inhibitors' development. // Drug Discov. Today. 2005. V.10. N.22. P.1535-1542.

106. Вейганд-Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии (пер. с нем.) //М.: Химия. 1968. с.944.

107. Физер Л. Физер М. Реагенты для органического синтеза (пер. с англ.). // М.: Мир. 1971. т.2. с. 157-167.

108. Carvill В., Glasgow К., Roland М. Process for the synthesis of bisphenol. US Patent Number 020081. 2004. WO 2005/005358.

109. Стилл Д. Мономеры для поликонденсации (пер. с англ.). // М.: Мир. 1976.

110. Гершкович А.А., В.К.Кибирев. Химический синтез пептидов. // Наукова Думка.: Киев. 1992. с. 164.

111. Джильберт Э.Е. Сульфирование органических соединений (пер. с англ.). //М.: Химия. 1969.

112. Burckhardt G.N. //J. Chem. Soc. 1933. P.337.

113. Демлов Э., Демлов 3. Межфазный катализ. // М.: Мир. 1987. с.485.

114. Сымон А.В. Молекулярная модификация бетулиновой кислоты как антимеланомного средства и подходы к ее солюбилизации. // Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2004. МИТХТ.

115. Hillman A., Hillman-Elies P. Synthese des 3-Jod-L-tyrosins. //Z. Physiol. Chem. 1956. V.305. P.l 77-181.

116. Синтезы органических препаратов. Сборник 3 (пер. с англ.). // М.: Иностранная литература. 1952. с.498-499.

117. Habbuch I., Danho М., Zahn N. Synthese N-geschutzter cysteinsaurederivate und ihrer aktivierten ester. // Liebigs Ann. Chem. P.776-783. 1979.

118. Sahu A., Pangburn M.K. Tyrosine is a potential site for covalent attachment of activated complement component C3. // Mol. Immunol. 1995. V.32. P.711 -716.

119. Asghar S.S. Pharmacological manipulation of complement system. // Pharm. Reviews. 1984. V.36. N.4. P.223-244.

120. Bureeva S., Andia-Pravdivy J., Bichucher A., Orishchenko D., Kaplun A. QSAR of inhibition of classical pathway of complement activation by dicarboxylic acids. // Mendeleev Commun. N.6. 2005. In press.

121. Takada Y., Arimoto Y., Mineda H., Takada A. Inhibition of the classical and alternative pathways by amino asids and their derivatives. // Immunology. V. 34. P. 509-515. 1978.

122. A. S. Kamat, N. F. Lewis, D. S. Pradhan. Mechanism of Ca2+ and dipicolinic acid requirement for L-alanine induced germination of Bacillus cereus BIS-59 spores. // Microbios. 1985. V.44. N.177. P.33-44.

123. Gaboriaud С., Juanhuix J., Gruez A., Lacroix M. et all. The crystal structure of the globular head of complement protein Clq provides a basis for its versatile recognition properties. // J. Biol. Chem. 2003. V.278. N.47. P.46974-46982.

124. Jle Банг Шон. Синтез бетулиновой кислоты и разработка ее липосомапьной формы. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 1999. МИТХТ.

125. Бояринова С.В. Молекулярная модификация бетулиновой кислоты по положению С-28. Магистерская диссертация. 2004. МИТХТ.

126. Стилл Д. Мономеры для поликонденсации (пер. с англ.) // М.: Мир. 1976. с. 632.

127. Catalogue of Fluka supply house 2003-2004. P.764.

128. Catalogue of Fluka supply house 2003-2004. P.254.

129. Козлов Л.В., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н., Гузова В.А. Патент №2128509. Бюллетень изобретений №10. 1999.

130. Agrawal A., Shrive А.К., Greenhough T.J., Volanakis J.E. Topology and structure of the Clq-binding site on C-reactive protein. //J. Immunol. 2001. V.166. P.3998-4004.