Исследование механизма ингибирования гемолиза заряженными субстанциями тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ
|
Андия-Правдивый, Юлиан Энрикевич
АВТОР
|
||||
|
кандидата химических наук
УЧЕНАЯ СТЕПЕНЬ
|
||||
|
Москва
МЕСТО ЗАЩИТЫ
|
||||
|
2004
ГОД ЗАЩИТЫ
|
|
02.00.10
КОД ВАК РФ
|
||
|
|
||||
На правах рукописи
АНДИЯ-ПРАВДИВЫЙ ЮЛИАН ЭНРИКЕВИЧ
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ИНГИБИРОВАНИЯ ГЕМОЛИЗА ЗАРЯЖЕННЫМИ СУБСТАНЦИЯМИ
02.00.10. - Биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва-2004
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени M B. Ломоносова.
Научный руководитель:
доктор химических наук, профессор
Каплун Александр Петрович
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор
Варламов Валерий Петрович
кандидат химических наук, ст.научный сотрудник
Водовозова Елена Львовна
Ведущая организация:
Институт Биохимии им. А.Н.Баха РАН
Защита диссертации состоится 2004 года в 15 часов на
заседании Диссертационного совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии (119831, Москва, М. Пироговская, 1).
Автореферат разослан 2004 года.
Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук
Лютик А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Система комплемента (набор более 30 белков плазмы крови), появившаяся 600-700 миллионов лет назад, является важнейшей частью иммунной системы Система комплемента обеспечивает связь между врожденным и адаптивным иммунитетами, усиливая гуморальный ответ. Атака комплементом сенсибилизированных антителами клеток приводит к их лизису. При этом выделяются факторы воспаления (СЗа, С5а), которые индуцируют хемотаксис лейкоцитов к очагу воспаления, опсо-низируют чужеродные бактерии, способствуя их фамоцитозу. Очищая организм от иммунных комплексов, система комплемента поддерживает внутренний воспалительный гомеостаз. После уничтожения чужеродных тел фагоцитами активация комплемента прекращается. Однако широкий спектр иммунных, аутоиммунных и иммунодефицит-ных заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма, связан с чрезмерной и/или несвоевременной активацией системы комплемента (В. Morgan, 1994) К группе острых состояний можно отнести респираторный дистрессиндром взрослых, ишемические повреждения (инфаркт миокарда, скелетных мышц, легких), сепсис, ожоговую, раневую болезнь, астму, повторный (послеоперационный) стеноз сосудов, синдром множественной органной недостаточности, кровотечения, синдром Гийена-Барре В группу хронических состояний входят пароксизмальная ночная гемо-глобинурия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, отторжение органов при трансплантациях, миастения, рассеянный склероз. Часто активация системы комплемента, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца и др.
Создание ингибиторов комплемента, способных предотвращать его деструктивное действие, - важная задача современной биоорганической химии. Разрабатываются терапевтические препараты на основе природных и рекомбинантных форм естественных ингибиторов системы комплемента (C1-ING и sCRl) (S S. Asghar, 1996) Привлекательность рекомбинантных белков как терапевтических агентов заключена в уже заложенных биологических свойствах Однако высокая стоимость рекомбинангных белков и их возможная иммуногенность делают перспективными поиск и создание простых и дешевых низкомолекулярных ишибиторов системы комплемента. На сегодняшний день среди противоопухолевых, противовоспалительных, антифибринолитических агентов найдено много ишибиторов активации комплемента in vitro. Однако, одни из известных ингибиторов очень токсичны, другие малоактивны. В настоящеее время не существует препаратов одобренных FDA (H Assefa, 1999, J D Lambus, 2003) <<1|Лл
briixlHUTEKA
Несколько лет назад было обнаружено, что заряженные полимеры и липосомы ин-гибируют систему комплемента. В нашей лаборатории было показано влияние плотности заряда на антигемолитическую активность. Упрощающей модификацией были сконструированы низкомолекулярные заряженные вещества с аналогичными свойствами, и выявлены важнейшие параметры, определяющие эффективность ингибирования комплемента: жесткий гидрофобный скелет с отрицательными зарядами на концах (О.О.Бурделев, 2000).
Данная работа посвящена не просто поиску новых ингибиторов системы комплемента, хотя нам удалось обнаружить высокую антигемолитическую активность дисуль-фата бетулина (1050=6.9±3.1 мкМ). Мы исследовали структурные критерии взаимодействия системы комплемента с низкомолекулярными соединениями и установили количественную взаимосвязь «структура - активность» на основе классического метода QSAR для создания более активных эффекторов. Работа выполнена на кафедре биотехнологии МИТХТ в рамках госбюджетной темы НИР 1.5.00 "Синтез новых фармакологически активных веществ и изучение их биологических свойств и методов направленного транспорта с целью создания противоопухолевых, противовирусных, антипаркин-сонических средств" и грантов РФФИ №99-04-48793, MAC № 01-04-06327. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании структурных критериев взаимодействия системы комплемента с низкомолекулярными соединениями. Главным критерием проявления высокой активности, по нашему мнению, является наличие заряженной группы в молекуле ингибитора. Тахим образом, было необходимо установить дополнительные структурные критерии эффективного ингибирования, а именно: количество зарядов в структуре, их природа, расстояние между ними, особенности строения углеродного скелета между зарядами. Важнейшими задачами работы стали установление количественной взаимосвязи «структура - активность» в ряду полученных соединений и поиск возможных молекулярных мишеней.
Для этого предполагалось:
• синтезировать производные бисфенола А с различными анионными группами (карбоксильными, фосфатными, сульфатными), определить анионный заместитель, обеспечивающий проявление наибольшей АА1, и модифицировать им серию бис-фенолов, ароматических спиртов и бетулина;
• получить эффекторы с э;т>анированными с помощью гидрофобных радикалов за-
1 Список сокращений АЛ - антигемолит.:ческая активность, Юм - концентрация ингибитора,
обеспечивающая 50%-ное снижение лизиса, яФХ-яичный фосфатидилхолин, КС1а - сыворотка » * ■•и ••!> '..!•.
4 <
I V»« V I- , .
ряженными группами;
• получить амфифильный ингибитор для встраивания в бислой липосом, установить зависимость между АА и мольной долей активного вещества в липосоме, и определить оптимальное расстояние между парами заряженных групп для создания би-дснтатного эффектора;
• поскольку среди алифатических дикарбоновых кислот (от С2 до С12) наибольшей АА обладает малоновая кислота (О. О. Бурделев, 2000), для изучения влияния гид-рофобности спейсера между зарядами на АА планировалось модифицировать малоновую кислоту гидрофобными заместителями, а именно: бензильным, циклопен-тильным, фенильным;
• определить АЛ полученных соединений и ряда дикарбоновых кислот аналогичного с бисфенолами строения, установить количественную взаимосвязь между структурой полученных соединений и проявляемой активностью;
• для полученных эффекторов определить возможные молекулярные мишени среди компонентов системы комплемента.
Научная новизна работы. Разработан новый метод сульфатирования бисфенолов, ароматических спиртов и бетулина с высокими выходами при использовании простых и доступных реагентов. Синтез большинства описанных в данной работе соединений осуществлен впервые. Изучена антигемолитическая активность 53 новых низкомолекулярных ингибиторов системы комплемента, установлены структурные критерии для проявления веществами высокой АА:
- наличие одной или двух отрицательно заряженных ^упп (предпочтительны сульфатная и фосфатная);
- жесткий скелет с объемными гидрофобными заместителями;
- расстояние между заряженными группами должно находиться в пределах 0.9-1.4 нм;
- для двух серий соединений (дисульфатов бисфенолов и ароматических дикарбоновых кислот) предложены уравнения количественной взаимосвязи «структура — активность». Значения АА, рассчитанные по этим уравнениям хорошо согласуются с экспериментальными данными;
- с помощью ИФА установлено снижение функциональной способности субкомпонентов первого компонента комплемерта Ог и Cls в присутствии дифосфата бисфенола А (5), дисульфата 9,9-бис-(4'-гидроксифенил)-флуорена (20) и 9,9-бис-(4'-карбоксифенил)-флуорсна (40), что указывает на С1 как на молекулярную мишень для исследованных соединений.
Практическая значимость работы. Обнаружены низкомолекулярные соединения, обладающие высокой антигемолитической активностью, что даст основания для их дальнейшего изучения как потенциальных терапевтических препаратов комплемент-ингибирующего действия. Установленные в результате работы структурные критерии взаимодействия системы комплемента с низкомолекулярными соединениями и уравнения количественной взаимосвязи «структура - активность» могут быть использованы для направленного синтеза высокоактизных ингибиторов нового поколения с целью их дальнейшего использования как терапевтических препаратов. Данные препараты могут применяться как для блокирования активации системы комплемента при вызывающих ее острых состояниях (инфаркт миокарда, менингит, септический шок и т.п.), так и для покрытия материалов, используемых в экстракорпоральных устройствах и протезах. Установленная нами высокая АА дисульфата бетулина стала основой заявки на получение патента РФ. Предложен метод определения и расчета АА, позволяющий снизить относительную ошибку измерения АА. Положения, выносимые на защиту.
1. Метод сульфатирования бисфенолов, ароматических спиртов и бетулина серной кислотой и уксусным ангидридом в пиридине.
2. Метод определения и расчета АА, предусматривающий использование эталонного соединения в каждой серии измерений, что позволяет учитывать отклонение значения АА эталонного вещества от истинного.
3. Субстанции, имеющие жесткий скелет, несущие объемные гидрофобные заместители и отрицательные заряды (предпочтительно сульфатные и фосфатные группы), расположенные на расстоянии 0.9-1.4 нм, обладают свойством эффективно инги-бировать комплемент-зависимый гемолиз.
4. Уравнения количественной взаимосвязи «структура-активность» в рядах дисуль-фатов бисфенолов и ароматических дикарбоновых кислот.
5. Снижение функциональной способности субкомпонентов первого компонента комплемента С1г и Cls в присутствии дифосфата бисфенола А (5), дисульфата 9,9-бис-(4'-гидроксифенил)-флуорена (20) и 9,9-бис-(4'-карбоксифенил)-флуорена (40).
Публикации. По материалам работы опубликованы: 2 статьи и тезисы 5 докладов на научных конференциях. Подана заявка на патент РФ.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на: V конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана" (Москва, Россия, 1999), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, Россия, 2000), международной конференции молодых ученых "От фундаментальной науки к новым техно-
логиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии" (Москва-Тверь, Россия, 2001), III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, Россия, 2002), II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2003).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена
на_страницах, содержит_рисунков и_таблиц. Список литературы включает
_источников.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. СИНТЕЗ ПРОИЗВОДНЫХ БИСФЕНОЛА Ас РАЗЛИЧНЫМИ АНИОННЫМИ ГРУППАМИ
Для установления структурных критериев проявления веществами высокой АА, необходимо было определить закономерности влияния природы заряженной группы на активность. В качестве исходного соединения для получения молекулярных моделей был выбран бисфенол А (1), как структура с жестким гидрофобным скелетом, позволяющая вводить одну или две сульфатные, фосфатные или карбоксимстильные группы.
О-Карбоксиметилбисфенол А (3) и ди-О-карбоксиметилбисфенол А (2) получали апеллированием бисфенола А хлоруксусной кислотой (схема 1) в щелочной среде при 95°С.
Для получения 2,2-бис-(4'-фосфонооксифенил)-пропана (5) (схема 1) в качестве фосфорилирующуго агента использовали хлорокись фосфора. Синтез проводили при температуре 90-95°С. Полученный в ходе реакции тетрахлорфосфат растворяли в теплой воде (при этом происходил гидролиз до дифосфата (5)).
Схема 1
1. CICHjCOOH, 6
3 4
Разработка метода сульфатировяния бисфенола А. Обычно в качестве сульфатирукщих агентов для модификации фенолов используют комплекс SO3 с пиридином или хлорсульфоновую кислоту. Однако, мы обнаружили, что использование этих реагентов для сульфагирования бисфенолов имеет ряд недостатков: низкая конверсия исходного соединения, значительная примесь моносульфата, выделение целевого продукта осложняется присутствием в реакционной смеси большого количества полярных примесей. Разработанный в настоящей работе способ позволяет получать дисульфаты бисфенолов с высоким выходом при использовании простых и доступных реагентов.
Было найдено, что сульфатирование бисфенола А (1) (схема 1) эффективно протекает при использованиии шестикратного избытка серной кислоты и уксусного ангидрида в пиридине. При перемешивании в течение 30 мин при 55-60°С наблюдалась полная конверсия исходного соединения. В реакционной смеси присутствовал преимущественно дисульфат (7) со следовыми количествами моносульфата (6) и продукта О-ацетилирования. Существенное влияние на ход реакции оказывает количество пиридина и порядок прибавления реагентов. По-видимому, до прибавления субстрата в реакционной смеси должны быть созданы условия для образования активного сульфати-рующего комплекса - ацетилсульфата.
По окончании реакции смесь охлаждали в ледяной бане и нейтрализовали рас-
твором аммиака. Дисульфат бисфенола Л (7) выделяли в виде аммониевых солей колоночной хроматографией на силикателе. По аналогичной методике (схема 1) был получен сульфат О-карбоксиметилбисфенола А (4).
2. СИНТЕЗ ДИСУЛЬФАТОВ БИСФЕНОЛОВ, АРОМАТИЧЕСКИХ СПИРТОВ И БЕТУЛИНА
Определение АА производных бисфенола А с различными анионными заместителями показало, что введение в молекулу бисфенола А сульфатной или фосфатной групп обеспечивает наибольший антигемолитический эффект. Для установления влияния особенностей структуры дисульфатов на активность был выбран для модификации ряд бисфенолов и других диолов, различающихся гидрофобностью заместителей, их объемом, жесткостью скелета, расстоянием между заряженными группами. Таким образом, были синтезированы: ряд дисульфатов бисфенолов (8-34), с различной структурой центрального заместителя и заместителями в бензольных ядрах, но с практически одинаковым расстоянием между заряженными группами; а также дисульфаты резорцина (50), пирокатехина (51), гидрохинона (52), а также дисульфат бетулина (53).
Перечисленные соединения получали по разработанной нами методике сульфати-рования бисфенола А (схема 1) с выходами 58-95% (табл.1). Для определения АА сульфаты переводили в натриевые соли прибавлением эквивалентного количества КаОЫ в метаноле. Получить дисульфаты бисфенолов (35-37) не удалось, по-видимому, не только из-за пониженной нуклеофильности фенолыюго гидроксила в силу большого элек-троноакцепторного эффекта заместителей, но и из-за возможных стерических препятствий.
Попытки получить бисфенолы на основе а-нафтола и ацетона, О^нафгола и пропа-наля не привели к успеху.
3. ПОЛУЧЕНИЕ ДИСУЛЬФАТОВ «тр/ло-зАМЕЩЕнных ПРОИЗВОДНЫХ БИСФЕНОЛА А
Для изучения влияния на активность заместителей в бензольных ядрах бисфенола А были синтезированы ор/яо-замещенные производные бисфенола А (схема 2). Мы предположили, что гидрофобные «зонтики» рядом с заряженными группами создадут экран от сольватной «шубы», усиливая электростатическое взаимодействие эффектора с мишенью.
Схема 2.
13а
195°С, ДМЛ
Для получения 2,2-бис-(4'-гидрокси-3'-хлорфенил)-нропана (Па) перемешивали смесь бисфенола А, 30%-ного раствора Н2О2 и концентрированной соляной кислотой при комнатной температуре в диэтиловом эфире. Реакцию проводили до полной конверсии Н2О2, содержание которой определяли йодометрическим методом.
2,2-Бис-(4'-гидрокси-3'-йодфенил)-пропан (13а) получали взаимодействием бисфенола А с раствором йодида калия и йода в 25%-ном водном аммиаке.
Диаллильное производное бисфенола А (31а) получали перегруппировкой Кляйзена из О-аллилового эфира бисфенола А кипячением в дичетиланилине (ДМА). Последующим гидрированием получали дипропильное производное (30а).
Синтезированные орmо-замещенные производные бисфенола А (11а, 13а, 30а, 31а) сульфатировали по вышеописанной методике с получением соответствующих ди-сульфатов (11,13, 30,31).
Попьпки ввести трет-бутильную группу в молекулу бисфенола А (подбор алкилирующих агентов с различной алкилирующей силой, катализаторов различной активности, растворителей) окончились неудачей. Несмотря на то, что в литературе имеются сведения о получении таких продуктов (выходы до 9%, остальное - продукты разложения), нам удалось выделить лишь моно и ди-трет-бутилфенолы
Модифицировать бисфенол А ацетильными группами в opmo-положенис так же не удалось. Реакция в условиях перегруппировки Фриса предварительно полученно-
го ди-О-ацетилбисфенола А приводила к 4-ацетилфенолу и исходному бисфенолу Л. По-видимому, в присутствии катализаторов Фриделя-Крафтса молекула бисфенола А неустойчива и распадается.
4. ПОЛУЧЕНИЕ 2-ЗАМЕЩЕННЫХ МАЛОНОВЫХ КИСЛОТ Ранее в нашей лаборатории было установлено, что из ряда алифатических ди-карбоновых кислот (от С2 до С12) наибольшей активностью обладает малоновая кислота (О.О.Бурделев, 2000). Для изучения влияния гидрофобное™ спейсера на проявляемую активность были синтезированы следующие 2-замещенные аналоги: 2-бензилмалоновая кислота (55), 2-фенилмалоновая кислота (56), 2-циклопентилмалоновая кислота (57). Эфир 2-фенилмалоновой кислоты получали конденсацией Кляйзена с последующим декарбонилированием (схема 3). Для получения эфира 2-бензилмалоновой кислоты бензальдегид конденсировали с малоновым эфиром по Кневенагелю с последующим гидрированием. Алкилированием малонового эфира циклопентилбромидом в присутствии гидрида натрия получали эфир 2-циклопентилмалоновой кислоты. Полученные эфиры гидролизовали до динатриевых солей.
5. СИНТЕЗ АМФИФИЛЬНОГО ДИСУЛЬФАТА БИСФЕНОЛА ДЛЯ ВСТРАИВАНИЯ В ЛИПОСОМЫ Одним из важнейших этапов конструирования лекарственных препаратов является определение молекулярной мишени, с которой взаимодействует лекарственная субстанция. Так как известно, что отрицательно заряженные полимеры взаимодействуют с СЦ, очень вероятно, что и исследуемые эффекторы имеют ту же мишень. У этой молекулы 6 функциональных участков (рис. 2, 3), поэтому связывание эффектора с несколькими из них может приводить к получению более прочного комплекса и, следовательно, к лучшему ингибированию. Для проверки этой гипотезы мы синтезировали дисульфат аналога бисфенола А с жирным хвостом (34) для инкорпорации его в липо-сомы.
Предлагаемая модель удобна тем, что простым изменением соотношения эф-фектор.липид можно изменять расстояние между парами заряженных групп равномерно распределенных в бислое (рис. 3).
Синтез дисульфата 1,1-ди-(4'-гидроксифенил)-гексадекана (34) проводили по схеме 4. Окислением пальмитинового спирта диметилсульфоксидом в присутствии пя-тиокиси фосфора получали соответствующий альдегид, который конденсировали с фенолом в кислой среде. В результате получали смесь изомерных бисфенолов. После третьей перекристаллизации из толуола выделяли конечный продукт с выходом 7.5%. Выход реакции сульфатирования составил 67%.
Схема 4. он
С,5Н3,
Структуру всех полученных соединений подтверждали данными 'Н-ЯМР спектроскопии, хроматомасс-спектрометрии и элементного анализа.
6. АНТИГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ АЛ определяли in vitro в гемолитической системе, содержащей бараньи эритроциты, сенсибилизированные кроличьими антителами, вероналовый буфер (рН 7.4), комплемент морской свинки и раствор исследуемого вещества в различных концентрациях. В результате лизиса эритроцитов происходит высвобождение гемоглобина из эритроцитов в раствор, по интенсивности окраски которого судят о степени гемолиза. ЛА вычисляли по формуле:
где Ав - оптическое поглощение при 414 нм в эксперименте,
А<; - оптическое поглощение при 414 нм в контрольном образце системы при 70-
80%-ном гемолизе, среднее арифметическое из трех измерений, Acs - оптическое поглощение при 414 нм в кошрольном образце испытуемого
вещества (только для окрашенных или светорассеиваюших образцов), Асе - оптическое поглощение при 414 нм в контрольном образце на спонтанный лизис эритроцитов.
В связи со сложностью системы для детектирования АА наблюдается значительный разброс определяемых значений в различных сериях экспериментов. Для учета неконтролируемых изменений условий эксперимента каждая серия определения ЛА включала тестирование эталонного соединения - сульфетрона (49), активность которого составляет 3tICso=I30±22 МкМ и определена в более 50 опытах. Для сравнения АА измеряемых соединений рассчитывали значения, приведенные к АА эталона
- экспериментальное значение для исследуемого образца данной серии, - значение активности сульфетрона, найденное в этой же серии). Значения АА, представленные в табл. 1, являются произведением ААпр и 3tICso- В результате такой обработки результатов экспериментов удалось значительно сократить разброс получаемых значений.
В результате тестирования было установлено, что все исследованные соединения проявляют АА (табл. 1). Мы установили следующие закономерности.
• Бисфенол А при рН 7.4 не заряжен и не проявляет активности даже при максимальных концентрациях (более 5000 мкМ) Введение одной заряженной группы приводит к появлению активности (541 мкМ, 380 мкМ для карбоксиметилыюй и сульфатной групп соответственно). Добавление еще одной такой же группы в случае с ди-О-карбоксиметилбисфенолом А (2) ухудшает активность (1022 мкМ), а в случае с дисуль-фатом бисфенола А (7) улучшает (247 мкМ) Дифосфат показал самую высокую активность (219 мкМ). Добавление карбоксильной группы к моносульфату не изменяет активности.
Таким образом, впервые показано, что для проявления АА достаточно одной анионной группы. Добавление второй отрицательно заряженной группы оказывает положительный, но не очень значительный эффект. Исключение составляет карбоксиме-тильная группа.
• Установлено, что по сравнению с дисульфатом дифенилолметана (8) (643 мкМ) соединения с объемными гидрофобными заместителями (циклогексильным, флуоренильным, антроновым) при центральном атоме углерода проявляют на порядок большую АА (40-45 мкМ, (19-21)). Этильные группы дисульфата тетрагидродиэтил-
стильбестрола (25), перфторированная углеродная цепь (16), бинафтиловый скелет (33) также обеспечивают высокую АЛ.
• Мы установили, что введение атомов галогена в бензольные ядра также значи-
тельно увеличивает активность (46-48), причем она возрастает в ряду С1< Вг< I (11-13). Наибольшую активность проявляет дисульфат бисфенола, модифицированный более объемными и гидрофобными атомами йода (13).
Введение в бензольные ядра двух и четырех метальных групп (9, 10) вызвало неожиданное снижение активности при увеличении общей гидрофобности остова. По-видимому, на АА дисульфатов бисфенолов оказывают влияние электронные свойства заместителей в орmо-положениях к сульфатной группе: донорные заместители вызывают снижение АЛ (9, 10), акцепторные - увеличение (11-13). Несмотря на элсктронодо-норные свойства пропильного и аллильного радикалов (30, 31) их более высокая по сравнению с метильными заместителями гидрофобность и способность экранировать заряженные группы придают соединениям (30) и (31) высокую АА.
9 ОБОзШ ОБС^а СНз н <|н, сн, 68 5.14 391±34
10 ОБОзЫа OSOзNa СНз СНз си, 86 6.07 468±44
11 ОЭОзЫа 0Б03Ыа С1 н -г- с н 1 82 5.24 218±65
12 С^ОзИа ОБС^а Вг н ч н, сн. 83 5.79 103±11
13 0503Ыа ОБОзКа I н си, сн, 88 6.72 50±5
14 ОБОзЫа ОБС^а II н 69 5.03 222
( г,
15 0803№ 0Я03№ С1 н г, 62 6.07 37(1С30)2
Р 3
16 ОБОзИа ОБОзИа н н н <ср 2),и 68 5.8 95+8
17 ОБОзМа OSOзNa н н о 78 2.58 756+37
18 ОБОзЫа ОБС^а н н 75 5.42 125+32
19 ОБОзКа ОБОзЫз н н 6 85 4.89 45121
20 ОБС^а OSOзNa н н оЪ 84 6.27 43±4
21 ОЯОзЫа ОБОзЫа н н сйо о 69 5.81 40+11
22 0503Ыа 0503Ка н н —сн— _з 4.47 237±38
23 ОБС^а ОБОзЫа н II о 69 4.18 278±9
24 OSOзNa ОВОзИа II н 0 78 3.53 405134
25 ОБОзЫа ОБОзМа н II "'Уч 79 5.29 169±3
26 OSOзNa ОБОзЫа н н -о- 85 2.79 837±69
27 СНз СНЗ н н сн, 98 4.9 27319
28 0803Иа OSOзNa н н 72 3.66 568+60
29 0503Ыа 0503Ка н н -БОг- 63 2.18 660110
2 Вещество обладает гемолитической способностью
3 Пикосульфат натрия - субстанция препарата «Гутгалакс»
30 ОБОзЫа ОБОзЫа Рг и СН| 67 6.72 122±34
31 ОБО^а ОБОзЫа А11у1 н СМ» 63 6.29 175±37
32 ОБОз^ ОБОзКа Н н - 81 3.04 494±158
33 -"О О^' 86 5.05 80±9
34 ОБОзКа ОБОзЫа Н н 67 10.16 10(1Сзо)2
35 0Б03Ка 0503Иа С1 С1 он, - 6.27 -
36 ОБОзКа ОБОзЫа Вг Вг <|н, С Н1 - 7.37 -
37 ОБОзИа ОБОзЫа N0, н -БОг- - 2.09 -
Дикарбоновые кислоты
38 СООЫа COONa Н н о 2.66 1709±185
39 СООКа СООЫа н н о - 4.26 382
40 COONa СООЫа н н сйэ - 6.36 183
41 С00№ СООЫа н н - - 3.13 584+58
42 СОО№ СООКа н 11 -о- - 2 87 1110±48
43 С 004« б-р N»000 - 3.13 2270±230
44 .Ж" - 2.45 1200+190
45 ^Ч^СООШ - 1.93 1440+160
46 - 1.15 3297±499
47 Вг - 2.73 697±120
48 а ? а ■к^чк. а а - 3.22 352±18
4
Дикарбоновые кислоты любезно предоставлены проф Васневым В А (ИНЭОС им Несмеянова РАН)
Другие заряженные структуры
49 on« ОЫ» о О S«0 о o=s»o naos-/nh/-5-on» 6 о s О4 j 5.16 130±31
50 Дисульфат резорцина 58 1.36 1633+218
51 Дисульфат пирокатехина 62 1.36 I831±I54
52 Цисульфат гидрохинона 65 1.36 1656±195
53 Дисульфат бетулина 95 9.55 б.9±3.1
2-Замещенные малоновые кислоты
54 Малоновая кислота - -0.52 2418±160
55 2-Бензилмалоновая кислота 55 1.87 2756±430
56 2-Фенилмалоновая кислота 37 1.47 3107±520
57 2-Циклопентилмалоновая кислота 78 1.27 3341±650
Активность полученных 2-замещенных малоновых кислот (55-57), содержащих гидрофобные заместители, не превысила значений АА исходной малоновой кислоты (54). Можно предположить, что малоновые кислоты с расстоянием между зарядами 0.24 нм имеют другую мишень связывания и закономерности, установленные для дисульфа-тов бисфенолов (расстояние между заряженными группами 0.9-1.4 нм) и дикарбоновых кислот аналогичного бисфенолам строения (0.6-1.3 нм), для 2-замещенных малоновых кислот не выполняются.
Самым активным соединением оказался дисульфат бетулина (53), наиболее гидрофобное соединение. Многие производные выделяемого из березовой коры тритерпе-на бетулина обладают противораковой, противотуберкулезной (APodgrebnyak, 2003), противогрибковой (P.Krasutsky,2003), анти-ВИЧ (K.Lee, 2003) активностью. Их отличают высокие терапевтические индексы и низкая токсичность. Установленная нами высокая АА дисульфата бетулина стала основой оформленной нами заявки на патент РФ.
7. Количественная взаимосвязь «структура-активность» (QSAR)
В последние десятилетия лекарственная химия широко использует методы математического моделирования для создания новых активных соединений. Компьютерное молекулярное моделирование на основе фрагментного подхода, молекулярный докинг и исследование количественных соотношений «структура-активность» (QSAR) позволяют изучать рецептор-лигандные взаимодействия, предсказывать активность соединений, объединенных в электронные банки данных, оптимизировать уже известные структуры, направлено синтезировать активные соединения.
Сульфетрон любезно предоставлен проф. Голощаповым Н.М (ОЭП «Иммунопрепарат» пос. Зеленая Дубрава, п/о Краснозаводск)
В основе классического метода QSAR лежит регрессионный анализ взаимосвязи между биологической активностью ряда подобных соединений и описывающих их свойства дескрипторов. Среди этих дескрипторов - гидрофобность (LogP), молекулярная рефракция (MR), донорно-акцепторные свойства молекулы, поляризуемость, объем и площадь поверхности молекулы и т. п. Вывести регрессионное уравнение QSAR означает найти физико-химические свойства, оказывающие наибольшее влияние на проявляемую биологическую активность и вычислить значения коэффициентов при описывающих эти свойства дескрипторах (уравнение II).
Log(MC50) « А*Х1 + В*Х2 + ... + Y*Xn + D (II), где
XI...Хп - переменные (дескрипторы), описывающие структурные особенности молекул и физико-химические свойства эффекторов;
A,Bf-Y, D - коэффициенты и свободный член регрессионного уравнения.
В качестве возможных дескрипторов мы рассматривали гидрофобность (cLogP)e, расстояние между зарядами, объем и площадь молекулы, молярную рефракцию (MR), поляризуемость (Pol), энергию гидратации (Eh), энергии высшей заселенной и низшей незанятой молекулярных орбиталей частичные заряды на различных
атомах молекулы. Большинство параметров рассчитывались как для всей молекулы, так и для ее фрагментов. Из всего множества дескрипторов для выборки из 21 соединения необходимо было выбрать не более 4-х, значения которых максимально коррелировали с экспериментальными данными, и вывести математическую модель, параметры адекватности которой были бы наилучшими: коэффициент корреляции г2 стремился к единице, а критерий Фишера F был выше своего табличного значения Р^й,.
В результате построения ряда моделей и оценки их адекватности нами были выбраны следующие значимые структурные переменные:
• для ряда дисульфатов бисфенолов (7-14, 16-23, 25-29) - вычисленная гидрофобность молекулы (cLogP), поляризуемость радикала -Х- при центральном атоме углерода (Pol), сумма частичных отрицательных зарядов - на углеродных атомах в орто-положении относительно сульфатной группы (Sz). После нормировки значений дескрипторов регрессионное уравнение имеет вид: Log(l/IC50)=0.647(±0.093)*cLogP+0.616(±0.098)*Pol-0.643(±0.101)*Sz+15.242(±6.604)
Значения дескриторов были рассчитаны метолом РМЗ в программе HyperChem Pro 7 О
Хорошую корреляцию экспериментальных и вычисленных значений АА иллюстрирует рис.1. Найденные коэффициенты регрессионного уравнения III показывают, что существует положительная корреляция АА со всеми значимыми дескрипторами. При этом дескрипторы имеют примерно равный вес, что указывает на то, что и гидрофобные, и электростатические (меру которых выражают Pol и S ) взаимодействия эффектора с мишенью имеют большое значение.
Соединения (24, 30, 31) составили контрольную группу, значения активности которых были предсказаны с помощью уравнения III: cIC5o(24) 218 мкМ (ошибка 85%), с1С50(30) 191 мкМ (36%), с1С50(31) 234 мкМ (25%).
• Для ряда ароматических дикарбоновых кислот (38-48) значимыми дескрипторами оказались гидрофобность молекулы (cLogP) и расстояние между зарядами (R). После нормировки значений дескрипторов регрессионное уравнение имеет вид: Log(mC50)=1.008(±0.191)*cLogP+0.334(±0172)*R-10.458(±3.248) (IV),
n=ll, Г2=0.791, s=0.195, F=15 2
Найденные коэффициенты регрессионного уравнения IV показывают, что гидрофоб-
ность вносит наибольший вклад в проявляемую А А.
900 800 700 600 500 400 300 200 100
12°
s
о*
О
i
■ f
--- г ¡J
— — — — i
■ "" * < 3
т 1 . в
6 ■ — — 1 i t] > 1 > 1
1 С i 1 Е i 1 ■ <? ф 1
ш з г -1— и —1— W > с 3 Г — 3 1 —1— 4
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 Номер соединения
cIC50
IC50
Рис. 1. Корреляция значений активности экспериментальных (IC50) и вычисленных (clCso) по >равнению III.
8. ПОИСК БИОЛОГИЧЕСКОЙ МИШЕНИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ СРЕДИ
Известно, что полианионные соединения, в частности полисульфаты, ингибируют большинство стадий активации комплемента (D.Walb, 1971). Lauenstein (1965) и Raepple (1976) установили, что сульфатированные полисахариды ингибируют действие компонента С1, взаимодействуя с его субкомпонентом Clq. Это действие сохранил ближайший низкомолекулярный аналог сурамин, имеющий 6 сульфогрупп. В нашей лаборатории также было показано, что отрицательно заряженные полимеры взаимодействуют с Clq (О. Buгdelev, 1998).
Clq состоит из 18 полипентидных цепей (6А, 6В и 6С цепей), каждая из которых содержит N-концевсй коллагеноподобный участок и С-концевую глобулярную область. Цепи ассоциированы вместе таким образом, что полная молекула содержит шесть глобулярных головок, прикрепленных к центральному участку посредством гибких стеблей и внешне напоминает букет тюльпанов (Н R.Knobel, 1975).
Поскольку молекула Clq состоит из шести идентичных функциональных субъединиц и, следовательно, содержит шесть мест связывания с отрицательно заряженными субстанциями, эффекторы, способные взаимодействовать с двумя и более фрагментами Clq должны быть на порядок активней. Так, Anderson (1999) включил дипептид Тгр-Туг, ингибирующий комплемент путем связывания с Clq (IC5o=15 мМ), в состав полимерной матрицы (в качестве матрицы использовались бычий сывороточный альбумин и декстран) и показал увеличение АА в 115 раз
КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА
Рис. 2. Структура комплекса CJ. Коллагеновые стебли Clq переплетены гетеродимером из С1г и
С1ь.
Л Б
Рис. 3. Схема связывания эффекторов с глобулярными головками С^.
А. Бидеитатный эффектор. Б. Амфифильный эффектор (34) в составе липосомы.
Мы предположили, что липосома, в бислой которой включен отрицательно заряженный амфифильный эффектор (34), будет связываться с Clq на порядок эффективнее (рис. ЗБ). Изменение концентрации эффектора при формировании липосом позволяет менять расстояние между парами заряженных групп на поверхности мембраны. Из графика зависимости между ЛА и мольной долей активного вещества в липосоме можно будет определить оптимальное расстояние между заряженными молекулами и создать бидентатный эффектор, расстояние между парами заряженных групп которого будет соответствовать максимально эффективному (рис. ЗА).
Значительное увеличение активности линосомных и бидентантых эффекторов по сравнению с монодентатными могло бы косвенно подтвердить, что дисульфаты бисфе-нолов ингибируют комплемент посредством связывания с Clq.
Для синтезированного амфифильного дисульфата 1,1-ди-(4'-гидроксифенил)-гексадекана (34) удалось установить только 1С30=Ю мкМ, так как эффектор кроме АА проявляет свойства детергента и при более высоких концентрациях
преимущественно лизировал эритроциты. Включение дисульфата 1,1-ди-(4'-гидроксифенил)-гексадекана (34) в липосомы частично нивелировало гемолитические свойства, что позволило изучить зависимость АЛ от содержания активного вещества в бислое. Максимальная активность проявляется при мольной доле эффектора в липосо-мах 0.049-0.069, что соответствует расстоянию 4.2-3.5 нм между парами зарядов на поверхности мембраны.
1С30 для дисульфата 1,1-ДИ-(4'-гидроксифенил)-гексадекана (34) в составе липосом составляет 385 мкМ'. Низкая ЛА может объясняться не только гемолитическими свойствами амфифильного бисфенола, который, по-видимому, частично находился в растворе, но и тем, что СЦ не является биологической мишенью для дисульфатов бисфе-нолов.
Для формирования более активных и стабильных полидентатных липосом необходимо использовать эффекторы с меньшей ККМ. Такими свойствами может обладать, например, аналог (34) с двумя алифатическими углеродными цепями (возможно частично ненасыщенными).
Мы использовали еще один подход для поиска мишеней для синтезированных соединений. Он основан на определении функциональной способности С1г и С1в с помощью ИФА. К иммобилизованным на плашках молекулам СЦ добавляли ЯС1д и эффектор либо смесь предварительно инкубированных ЯСЦ и эффектора. Во всех случаях фиксировали уменьшение активности С1г и С1в. Причем для сульфетрона (4 сульфо-группы) эффективность ингибирования для двух вариантов не различалась, что можно идентифицировать как отсутствие ингибирования С1г и С1в. Следовательно, его действие связано лишь с взаимодействием с СЦ. Эффекторы (5), (20), (40) ингибировали активность С1г и С1в лучше при предварительной инкубации с ЯСЦ (содержащей С1г и С1в). Это может свидетельствовать о том, что эти вещества могут ингибировать также С1г и Ск8.
8. Выводы
1. Разработан метод сульфатирования бисфенолов, ароматических спиртов и бетулина действием серной кислоты и уксусного ангидрида в пиридине.
2. Синтезированы производные бисфенола Л с различными анионными заместителями (сульфатными, фосфатными, карбоксиметильными), ряд дисульфатоз бис-фенолов, ароматических спиртов и бетулина.
3. Определена АЛ полученных соединений, а также ряда дикарбоновых кислот аналогичного с бисфенолами строения. Установлены следующие закономерности.
• Впервые показано, что для проявления АА достаточно одной анионной группы.
Добавление второй отрицательно заряженной группы оказывает положительный,
7 Липосомы ич яФХ, диаметр 200 нм, мольная доля эффектора в бислое 0 069. Значение 1С3о представлено в пересчете на индивидуальное вещество
8 Эксперимент проведен в лаборатории проф Л В Козлова (НИИ Эпидемиологии и микробиологии им Габричевского)
но нс очень значительный эффект, исключение составляет карбоксиметильная группа. Наибольшую активность обеспечивают две фосфатные группы.
• Установлено, что введение в структуру объемных гидрофобных заместителей (циклогексильного, флуоренильного, антронового) приводит к существенному увеличению активности.
• Показано, что электронодонорные заместители (метальные группы) в бензольных ядрах в орmо-положениях к сульфатной группе вызывают снижение АА, электроноакцепторные (атомы галогена) - увеличение. Несмотря на электронодо-норные свойства пропильного и аллильного радикалов, их высокая гидрофоб-ность и способность экранировать заряженные группы оказывают активирующее воздействие.
4. Выявлена количественная взаимосвязь «структура - активность» (QSAR) в ряду дисульфатов бисфенолов. Значимыми дескрипторами являются сумма частичных отрицательных зарядов на орmо-углеродных атомах бензольных ядер относительно сульфатной группы, гидрофобность молекулы и поляризуемость центрального радикала. С помощью этого уравнения для трех соединений контрольной группы была предсказана ЛА с ошибкой 25-85%.
В уравнении количественной взаимосвязи «структура - активность» для ароматических дикарбоновых кислот значимыми дескрипторами являются расстояние между зарядами и гидрофобность молекул.
5. Изучена зависимость АА дисульфата 1Д-ди-(4'-гидроксифенил)-гексадскана (34) в составе липосом от содержания активного вещества. Показано, что максимальная активность проявляется при мольной доле эффектора 0.049-0.069, что соответствует расстоянию 4.2-3.5 нм между парами зарядов на поверхности мембраны.
6. С помощью ИФА показано взаимодействие сульфетрона (49) с Clq и снижение функциональной способности С1г и Cls в присутствии дифосфата бисфенола А (5), дисульфата 9,9-бис-(4'-гидроксифенил)-флуорена (20) и 9,9-бис-(4'-карбоксифенил)-флуорена (40), что позволяет рассматривать эти белки наряду с Clq в качестве возможных молекулярных мишеней.
7. Разработан методический прием, позволяющий уменьшить разброс экспериментальных значений при определении АА. Он заключается в тестировании эталонного соединения — сульфетрона (49) в каждой серии экспериментов для учета неконтролируемых изменений условий опыта Для сравнения АА измеряемых соединений рассчитывали значения, приведенные к АА эталона.
8. Установлена высокая АА дисульфата бетулина (Ю50=6.9±3.1 мкМ).
БЛАГОДАРНОСТИ Благодарим проф. Васнева В А (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) за любезно предоставленные образцы бисфенолов и дикарбоновых кислот, проф. Голощапова Н.М. (ОЭП «Иммунопрепарат» пос. Зеленая Дубрава, п/о Краснозаводск) за предоставлен-
Э-ЗЧ98
ный препарат сульфетрон, фирму «Биолек» Харьков, проф. Козлова Л.В (НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Габричевского) за предоставленные биологические материалы. Благодарим Лапина А. и компанию «ChemBridge Corp.» за техническую помощь, в.н.с. Веселовского А.В. (ИБМХ) за консультации в области молекулярного моделирования.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Каплун А.П., Бурделев О.О., Андия-Правдивый Ю.Э. Модулирование активности комплемента заряженными субстанциями. // Материалы 5 конференции "Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана".- Москва.-1999.- С. 146-148.
2. Андия-Правдивый Ю.Э., Бурделев О.О., Цвсткова Т.Н., Буреева СВ., Каплун А.П.
Подходы к направленному конструированию ингибиторов активации комплемента. // Материалы школы-конференции "Горизонты физико-химической биологии".-Пущино.- 28.05-02.06.2000.- Т.1.- С.76.
3. Андия-Правдивый Ю.Э., Бурделев О.О., Буреева СВ., Безруков Д.А., Орищенко Д.А., Голицына Ю.В., Каплун А.П. Изучение механизма ингибирования гемолиза заряженными субстанциями. // Материалы Ш съезда биохимического общества. -Санкт-Петербург.- Россия.- 2002.- С.133.
4. Буреева СВ., Андия-Правдивый Ю.Э., Орищенко Д.А., Каплун А.П. Исследование структурных критериев взаимодействия белков комплемента с заряженными субстанциями. // Материалы II Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития».- Москва.- Россия.- 2003.- Т.1.- С. 136.
5. Лидия-Правдивый Ю.Э., Буреева СВ., Каплун А.П., Швец В.И. Получение и антигемолитическая активность дисульфатов бисфенолов. // Ученые записки МИТХТ.-2003.- Вып. 8.- С.51-55.
6. Андия-Правдивый Ю.Э., Буреева СВ., Каплун А.П., Швец В.И., Козлов Л.В. Производные бетулина как ингибиторы комплемента. // Приоритетная справка от 24 декабря 2003 г на выдачу патента РФ №2003136931.
7. Лндия-Правдивый Ю.Э., Буреева СВ., Каплун А.П., Швец В.И. Получение и антигемолитическая активность дисульфатов бисфенолов и ряда дикарбоновых кислот. //Хим.-Фарм. Журнал. -2004. -В печати.
Подписано в печать 9.03.2004 Формат 60*84/16. Бумага писчая.
Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов 1,6. Тираж 90 экз. Заказ № 32
Лицензия на издательскую деятельность ИД № 03507 от 15.12.2000
Московская государственная академия тонкой химической технологии им
М.В.Ломоносова.
Издательско-полиграфический центр. 119571 Москва, пр. Вернадского, 86.
Оглавление.
Список сокращений.
Введение.
1.,Обзор литературы. Эффекторы системы комплемента.
1.1. Введение. Роль системы комплемента в организме человека.
1.2. Пути активации системы комплемента.
1.2.1. Альтернативный путь активации системы комплемента.
1.2.1.1. Белок СЗ.
1.2.1.2. Инициирующая СЗ-конвертаза.
1.2.1.3. Связанная СЗ/С5-конвертаза.
1.2.1.4. Узнавание и усиление ответа.
1.2.2. Классический путь активации системы комплемента.
1.2.2.1. С1. Структура, активация и регуляция.
1.2.2.2. Образование, структура и регуляция СЗ/С5-конвертазы.
1.2.3. Пентаксиновый путь активации системы комплемента.
1.2.4. Пектиновый путь активации системы ¿сомплемеита.
1.2.5. Терминальный этап. Мембрано-атакующий комплекс.
1.2.5.1. С5Ь-7.
1.2.5.2. С5Ь-8.
1.2.5.3. С5Ь-9.
1.2.5.4. Поли-С9.
1.2.5.5. Регуляция образования МАК.
1.3. Ингибиторы классического пути.
1.3.1. Полипептиды.
1.3.2. Компстатин.
1.3.3. Полиионы.
1.3.4. Бензамидины, гуанидины и сульфонилфториды.
1.3.5. Антранилаты.
1.3.6. Производные левопимаровой кислоты.
1.3.7. Фенотиазины.
1.3.8. Фенилиндандионы.
1.3.9. Аминокислоты и их производные.
1.3.10. Диамины.
1.3.11. Производные олеановой кислоты.
1.3.12. Другие органические соединения различной структуры.
1.3.13. Неорганические соединения.
1.4. Стимуляторы природного С1-ингибитора.
1.5. Соединения, которые индуцируют выработку С1-ингибитора.
1.6. Ингибиторы альтернативного пути.
1.6.1. Полипептиды.
1.6.2. Полиионы.
1.6.3. Аминокислоты и их производные.
1.6.4. Амидины и гуанидины.
1.6.5. Другие органические соединения различной структуры.
Система комплемента (СК) (набор более 30 белков плазмы крови), появившаяся 600700 миллионов лет назад, является важнейшей частью иммунной системы. СК обеспечивает связь между врожденным и адаптивным иммунитетами, усиливая гуморальный ответ. Атака комплементом сенсибилизированных антителами клеток приводит к их лизису. При этом выделяются факторы воспаления (СЗа, С5а), которые индуцируют хемотаксис лейкоцитов к очагу воспаления, опсонизируют чужеродные бактерии, способствуя их фагоцитозу. Очищая организм от иммунных комплексов, СК поддерживает внутренний воспалительный гомеостаз. После уничтожения чужеродных тел фагоцитами активация комплемента прекращается. Однако широкий спектр иммунных, аутоиммунных и иммунодефицитных заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма, связан с чрезмерной и/или несвоевременной активацией системы комплемента [1]. К группе острых состояний можно отнести респираторный дистрессипдром взрослых, ишемические повреждения (инфаркт миокарда, скелетных мышц, легких), сепсис, ожоговую, раневую болезнь, астму, повторный (послеоперационный) стеноз сосудов, синдром множественной органной недостаточности, кровотечения, синдром Гийена-Барре. В группу хронических состояний входят пароксизмальная ночная гемоглобинурия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, отторжение органов при трансплантациях, миастения, рассеянный склероз. Часто активация СК, приводящая к осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца и др.
Создание ингибиторов комплемента, способных предотвращать его деструктивное действие, - важная задача современной биоорганической химии. Разрабатываются терапевтические препараты на основе природных и рекомбинантных форм естественных ингибиторов системы комплемента (C1-ING и sCRl) [2]. Привлекательность рекомбинантных белков как терапевтических агентов заключена в уже заложенных биологических свойствах. Однако высокая стоимость рекомбинантных белков и их возможная иммуногенность делают перспективными поиск и создание простых и дешевых низкомолекулярных ингибиторов СК. На сегодняшний день среди противоопухолевых, противовоспалительных, антифибринолитических агентов найдено много ингибиторов активации комплемента in vitro. Однако, одни из известных ингибиторов очень токсичны, другие малоактивны. В настоящеее время не существует препаратов одобренных FDA [3,4].
Несколько лет назад было обнаружено, что заряженные полимеры и липосомы ингибируют СК. В нашей лаборатории было показано влияние плотности заряда на антигемолитическую активность. Упрощающей модификацией были сконструированы низкомолекулярные заряженные вещества с аналогичными свойствами, и выявлены важнейшие параметры, определяющие эффективность ингибирования комплемента: жесткий гидрофобный скелет с отрицательными зарядами на концах [5].
Данная работа посвящена поиску новых ингибиторов системы комплемента и исследованию структурных критериев взаимодействия СК с низкомолекулярными соединениями для установления количественной взаимосвязи «структура - активность» на основе классического метода РБАЯ.
1. обзор литературы. эффекторы системы комплемента
4. Выводы
1. Разработан метод сульфатирования бисфенолов, ароматических спиртов и бетулина действием серной кислоты и уксусного ангидрида в пиридине.
2. Синтезированы производные бисфенола А с различными анионными заместителями (сульфатными, фосфатными, карбоксимстильиыми), ряд дисульфатов бисфенолов, ароматических спиртов и бетулина.
3. Определена АА полученных соединений, а также ряда дикарбоновых кислот аналогичного с бисфенолами строения. Установлены следующие закономерности.
• Впервые показано, что для проявления АА достаточно одной анионной группы. Добавление второй отрицательно заряженной группы оказывает положительный, но не очень значительный эффект, исключение составляет карбоксиметильная группа.
• Установлено, что введение в структуру объемных гидрофобных заместителей (циклогексилиденового, флуоренилиденового, антронилиденового) приводит к существенному увеличению активности.
• Показано, что электронодонорные заместители (метильные группы) в бензольных ядрах в ор/ло-положениях к сульфатной группе вызывают снижение АА, электроноакцепторные (атомы галогена) - увеличение. Несмотря на электронодонорные свойства пропильного и аллильного радикалов, их высокая гидрофобность и способность экранировать заряженные группы оказывают активирующее воздействие.
4. Выявлена количественная взаимосвязь «структура - активность» (ОБЛИ.) в ряду дисульфатов бисфенолов. Значимыми дескрипторами являются сумма частичных отрицательных зарядов на ор/ноуглсродных атомах бензольных ядер относительно сульфатной группы, гидрофобность молекулы и поляризуемость центрального радикала. С помощью этого уравнения для трех соединений контрольной группы была предсказана АА с ошибкой 25-85%.
В уравнении количественной взаимосвязи «структура - активность» для ароматических дикарбоновых кислот значимыми дескрипторами являются расстояние между зарядами и гидрофобность молекул.
5. Изучена зависимость АА дисульфата 1,1-ди-(4'-гидроксифенил)-гексадекана (34) в составе липосом от содержания активного вещества. Показано, что максимальная активность проявляется при мольной доле эффектора 0.049-0.069, что соответствует расстоянию 4.2-3.5 нм между парами зарядов на поверхности мембраны.
6. С помощью ИФА показано взаимодействие сульфетрона (49) с С1ц и снижение функциональной способности С1г и С1в в присутствии дифосфата бисфенола А (5), дисульфата 9,9-бис-(4'-гидроксифенил)-флуорепа (20), что позволяет рассматривать эти белки наряду сСЦв качестве возможных молекулярных мишеней.
7. Разработан методический прием, позволяющий уменьшить разброс экспериментальных значений при определении АА. Он заключается в тестировании эталонного соединения - сульфетрона (49) в каждой серии экспериментов для учета неконтролируемых изменений условий опыта. Для сравнения АА измеряемых соединений рассчитывали значения, приведенные к АА эталона.
8. Установлена высокая АА дисульфата бетулина (1С5о=6.9±3.1 мкМ).
Благодарности
Благодарим проф. Васнева В.А. (ИНЭОС им. Несмеянова РАН) за любезно предоставленные образцы бисфенолов и дикарбоновых кислот, проф. Голощапова Н.М. (ОЭП «Иммунопрепарат» пос. Зеленая Дубрава, п/о Краснозаводск) за предоставленный препарат сульфетрон, фирму «Биолек» Харьков, проф. Козлова JI.B (НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Габричевского) за предоставленные биологические материалы. Благодарим Лапина А. и компанию «ChemBridge Corp.» за техническую помощь, в.н.с. Веселовского A.B. (ИБМХ) за консультации в области молекулярного моделирования.
1. Morgan В.Р. Clinical complementology: Recent progress and future trends. //Eur. J. Clin. Invest. 1994. V.24. P.219-228.
2. Asghar S.S. Pharmacological manipulation of the complement system in human diseases. //Front. Biosci. 1996. V.l. P. 15-25.
3. Assefa H. Synthesis and evaluation of potential complement ingibitory semisynthetic analogs of oleanolic acid. //Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999. V 9. P. 1889-1894.
4. Lambris J.D. Complement: structure, functions, evolution and viral molecular mimicry. //Immunol. Research. 2003. V.27. N.2-3. P.367-385.
5. Бурделев O.O. Исследование влияния заряженных полимеров и липосом на комплемент-зависимый лизис эритроцитов. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 2000.
6. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология, //пер. с англ. «Мир». Москва. 2000.
7. Ward Р.А., Czermak B.J., Huber-Lang М., Diehl К., Friedl II.P. Use of animal models to define complement functions. //Humana Press. Totowa. 2000. P.538.
8. Frank M.M. Complement in the pathophysiology of human disease. //Engl. J. Med. 1987. V.316. P. 1525-1529.
9. Morgan B.P. Complement: Clinical Aspects and Relevance to Disease. //Academic Press. Boston. 1990. P.349.
10. Morgan B.P., Gasque P., Singhrao S.K., Piddlesden S.J. Role of complement in inflammation and injury in the nervous system. //Exp. Clin. Immunogenet. 1997. V.l4. P.19-23.
11. Asghar S.S. Membrane regulators of complement activation and their aberrant expression in disease. //Lab. Invest. 1995. V.72. P.254-271.
12. Liszewski M.K., Fairies T.C., Lublin D.M. Control of the complement system. //Adv. Immunol. V.61.P.327-344.
13. Pangburn M.K., Muller-Eberhard H.J. The alternative pathway of complement. //Springer Semin. Immunopathol. 1984. V.7. P. 163-192.
14. Lachmann P.J., Hughes-Jones N.C. Initiation of complement activation. //Springer Semin. Immunopathol. 1984. V.7. P.143-162.
15. Pangburn M.K., Morrison D.C., Schreiber R.D., Muller-Eberhard H.J. Activation of the alternative complement pathway: recognition of surface structures on activators by bound C3b. //J. Immunol. 1980. V.124. P.977-982.
16. Pangburn M.K., Muller-Eberhard H.J. Complement C3 convertase: cell surface restriction of betalH control and generation of restriction on neuraminidase-treated cells. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. V.75. P.2416-2420.
17. Fujita T., Takata Y., Tamura N. Solubilization of immune precipitates by six isolated alternative pathway proteins. //J. Exp. Med. 1981. V.154. P. 1743-1751.
18. Schreiber R.D., Muller-Eberhard H.J. Assembly of the cytolytic alternative pathway of complement from 11 isolated plasma proteins. //J. Exp. Med. 1978. V.148. P.1722-1727.
19. Pangburn M.K., Muller-Eberhard H.J. Relation of putative thioester bond in C3 to activation of the alternative pathway and the binding of C3b to biological targets of complement. //J. Exp. Med. 1980. V.152. P.l 102-1114.
20. Sim R.B., Twose T.M., Paterson D.S., Sim E. The covalent-binding reaction of complement component C3. //Biochem. J. 1981. V.193. P.l 15-127.
21. Law S.K., Minich T.M., Levine R.P. Binding reaction between the third human complement protein and small molecules. //Biochemistry. 1981. V.20. P.7457-7463.
22. Smith C.A., Vogel C.W., Muller-Eberhard H.J. MHC Class III products: an electron microscopic study of the C3 convertases of human complement. //J. Exp. Med. 1984. V.159. P.324-329.
23. Pangburn M.K., Muller-Eberhard H.J. The C3 convertase of the alternative pathway of human complement. Enzymic properties of the bimolecular proteinase. //Biochem. J. 1986. V.235. P.723-730.
24. Fishelson Z., Pangburn M.K., Muller-Eberhard H.J. Characterization of the initial C3 convertase of the alternative pathway of human complement. //J. Immunol. 1984. V.132. P.1430-1434.
25. Isenman D.E., Podack E.R., Cooper N.R. The interaction of C5 with C3b in free solution: a sufficient condition for cleavage by a fluid phase C3/C5 convertase. //J. Immunol. 1980. V.124. P.326-331.
26. Whaley K., Ruddy S. Modulation of the alternative complement pathways by beta 1 H globulin. //J. Exp. Med. 1976. V.144. P.l 147-1163.
27. Pangburn M., Muller-Eberhard H. Kinetic and thermodynamic analysis of the control of C3b by the complement regulatory proteins factors H and I. //Biochemistry. 1983. V.22. P. 178—185.
28. Medof M.E., Walter E.I., Rutgers J.L., Knowles D.M., Nussenzweig V. Identification of the complement decay-accelerating factor (DAF) on epithelium and glandular cells and in body fluids. //J. Exp. Med. 1987. V.165. P.848-864.
29. Schumaker V.N., Zavodszky P., Poon P.H. Activation of the first component of complement. //Annu. Rev. Immunol. 1987. V.5. P.21-42.
30. Tschopp J., Villiger W., Fuchs H., Kilchherr E. Engel Assembly of subcomponents Clr and Cls of first component of complement: electron microscopic and ultracentrifugal studies. //J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. P.7014-7018.
31. Weiss V., Fauser C., Engel J. Functional model of subcomponent CI of human complement. //J. Mol. Biol. 1986. V.189. P.573-581.
32. Ziccardi R.J. Spontaneous activation of the first component of human complement (CI) by an intramolecular autocatalytic mechanism. //J. Immunol. 1982. V.128. P.2500-2504.
33. Ziccardi R.J. A new role for CI-inhibitor in homeostasis: control of activation of the first component of human complement. Hi. Immunol. 1982. V.128. P.2505-2508.
34. Hughes-Jones N.C., Gorick B.D. The binding and activation of the Clr-CIs subunit of the first component of human complement. //Mol. Immunol. 1982. V.19. P.l 105-1112.
35. Sim R.B., Porter R.R., Reid K.B., Gigli I. The structure and enzymic activities of the Clr and Cls subcomponents of CI, the first component of human serum complement. //Biochem. J. 1977. V.163. P.219-227.
36. Schumaker V.N., Calcott M.A., Spiegelberg H.L., Muller-Eberhard H.J. Ultracentrifuge studies of the binding of IgG of different subclasses to the Clq subunit of the first component of complement. //Biochemistry. 1976. V.15. P.5175-5181.
37. Ziccardi R.J., Cooper N.R. Active disassembly of the first complement component, C-l, by C-l inactivator. //J. Immunol. 1979. V.123. P.788-792.
38. Ziccardi R.J. Activation of the early components of the classical complement pathway under physiologic conditions. //J. Immunol. 1981. V.126. P. 1769-1773.
39. Law S.K., Dodds A.W., Porter R.R. A comparison of the properties of two classes, C4A and C4B, of the human complement component C4. //EMBO J. 1984. V.3. P.1819-1823.
40. Muller-Eberhard H.J., Polley M.J., Calcott M.A. Formation and functional significance of a molecular complex derived from the second and the fourth component of human complement. //J. Exp. Med. 1967. V.125. P.359-380.
41. Vogt W., Schmidt G., Von Buttlar B., Dieminger L. A new function of the activated third component of complement: binding to C5, an essential step for C5 activation. //Immunology. 1978. V.34. P.29-40.
42. Takata Y., Kinoshita T., Kozono H., Takeda J., Tanaka E., Hong K., Inoue K. Covalent association of C3b with C4b within C5 convertase of the classical complement pathway. //J. Exp. Med. 1987. V.165. P.1494-1507.
43. Pepys M.B., Baltz M.L., deBeer F.C., Dyck R.F., Holford S., Breathnach S.M., Black M.M., Tribe C.R., Evans D.J., Feinstein A. Biology of serum amyloid P component. //Ann. New York Acad. Sci. 1982. V.389. P.286-298.
44. Ying S.-C., Gewutz A.T., Jiang H., Gewutz H. Human serum amyloid P component oligomers bind and activate the classical complement pathway via residues 14-26 and 76-92 of the A chain collagen-like region of CI q.//J. Immunol. 1993. V.150. P.169-176.
45. Vankis J.E., Kaplan M.H. Specificity of C-reactive protein for choline phosphate residues of pneumococcal C-polysaccharide. //Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1971. V.136. P.612-614.
46. DiCamelli R., Potempa L.A., Siegel J., Suyehira L., Petras K., Gewurz H. Analysis of the binding of C-reactive protein to histones and chromatin. //J. Immunol. 1980 V.125. P. 19331938.
47. Ohta M., Okada M., Yamashina I., Kawasaki T. The mechanism of carbohydrate-mediated complement activation by serum mannan-binding protein. //J. Biol. Chem. 1990. V.265. P. 19801984.
48. Ji Y.H., Matsushuta M., Okada H., Fujita T., Kawakami M. The C4 and C2 but not CI components of complement are responsible for the complement activatin triggered by the Ra-reactive factor. Hi. Immunol. 1988. V.141. P.4271-4275.
49. Super M., Levinsky R.J., Turner M.W. The level of mannan-binding protein regulatesthe binding of complement-derived opsonins to mannan and zymosan at low serum concentrations. //Clin. Exp. Immunol. 1990. V.79. P. 144-150.m
50. Bhakdi S., Tranum-Jensen J. Membrane damage by complement. //Biochim. Biophys. Acta. 1983. V.737. P.343-372.
51. Preissner K.T., Podack E.R., Muller-Eberhard H.J. The membrane attack complex of complement: relation of C7 to the metastable membrane binding site of the intermediate complex C5b-7. Hi. Immunol. 1985. V.135. P.445-451.
52. Silversmith R.E., Nelsestuen G.L. Interaction of complement proteins C5b-6 and C5b-7 with phospholipid vesicles: effects of phospholipid structural features. //Biochemistry 1986. V.25. P.7717-7725.
53. Preissner K.T., Podack E.R., Muller-Eberhard H.J. The membrane attack complex of complement: relation of C7 to the metastable membrane binding site of the intermediate complex C5b-7. Hi. Immunol. 1985. V.135. P.445-451.
54. Esser A.F., Kolb W.P., Podack E.R., Muller-Eberhard H.J. Molecular reorganization of lipid bilayers by complement: a possible mechanism for membranolysis. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. V.76. P.1410—1414.
55. Silversmith R.E., Nelsestuen G.L. Fluid-phase assembly of the membrane attack complex of complement. //Biochemistry. 1986. V.25. P.841-851.
56. Silversmith R.E., Nelsestuen G.L. Assembly of the membrane attack complex of complement on small unilamellar phospholipid vesicles. //Biochemistry. 1986. V.25. P.852-860.
57. Martin D.E., Chiu F.J., Gigli I., Muller-Eberhard H.J. Killing of human melanoma cells by the membrane attack complex of human complement as a function of its molecular composition. Hi. Clin. Invest. 1987. V.80. P.226-233.
58. Scand Tranum-Jensen J., Bhakdi S., Bhakdi-Lehnen B., Bjerrum O.J., Speth V. Complement lysis: the ultrastructure and orientation of the C5b-9 complex on target sheep erythrocyte membranes. Hi. Immunol. 1978. V.7. P.45-46.
59. Tschopp J., Muller-Eberhard H.J., Podack E.R. Formation of transmembrane tubules by spontaneous polymerization of the hydrophilic complement protein C9. //Nature. 1982. V.298. P.534-538.
60. Podack E.R., Preissner K.T., Muller-Eberhard H.J. Inhibition of C9 polymerization within the SC5b-9 complex of complement by S-protein. //Acta. Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Suppl. 1984. V.284. P.89-96.
61. Zalman L.S., Wood L.M., Frank M.M., Muller-Eberhard H. Deficiency of the homologous restriction factor in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. //J. Exp. Med. 1987. V.165. P.572-577.
62. Zalman L.S., Wood L.M., Muller-Eberhard H.J. Inhibition of antibody-dependent lymphocyte cytotoxicity by homologous restriction factor incorporated into target cell membranes. //J. Exp. Med. 1987. V.166. P.947-955.
63. Asghar S.S. Pharmacological manipulation of complement system. //Pharm. Reviews. 1984. V.36. N.4. P.223-244.
64. Boackle R.J., Joknson, B.J., Caughman, G.B. An IgG primary sequence exposure theory for complement activation using synthetic peptides. //Nature (Lond.). 1979. V.282. P.742-743.
65. Burnhouse R., Cebra J. Isotypes of IgG: Comparison of the primary structures of the three pairs of isotypes which differ in their ability to activate complement. //J. Mol. Immunol. 1979. V.16. P.907-917.
66. Burton D.R., Boyd J., Brampton A.D., Easterbrook-Smith S.B., Emanuel E.J., Novotny J., Rademacher T.W., Van Schraven M.R., Sternberg M.J.E., Dwek, R.A. The Clq-receptor site on immunoglobulin G. //Nature (Lond.). 1980. V.288. P.338-344.
67. Prystowsky M.B., Kehoe J.M., Erickson B.W. Inhibition of classical complement pathway by synthetic peptides from the second constant domain of the heavy chain of IgG. //Biochemistry. 1981. V.21. P.6349-6358.
68. Johnson B.J., Thames K.E. Investigations of the complement fixing sites of immunoglobulins. //J. Immunol. 1976. V.117. N. 1491-1494.
69. Johnson B.J., Thames K.E. Complement consuming compounds: Synthetic peptides corresponding to fragments of the Cn4 and Cn2 domains of IgM and IgG. //Fed. Proc. 1976. V.35. P.494.
70. Lukas T.J., Munoz H., Erickson B.W. Inhibition of Cl-mediated immune hemolysis by monomeric and dimeric peptides from the second constant domain of human immunoglobulin G. //J. Immunol. 1981. V.127. P.2555-2560.
71. Messmer B.T., Thaler D.S. Clq-binding peptides share sequence similarity with C4 and induce complement activation. //Mol. Immunol. 2000. V.37. P.343-350.
72. Takada Y., Arimoto Y., Mineda H., Takada A. Inhibition of the classical and alternative pathway by aminoacids and their derivatives. //Immunology. 1978. V.34. P.509-515.
73. Caporale L.H., Graber S., Kell W., Gotze O. A fluorescent assay for complement activation. //J. Immunol. 1981. V.126. P. 1963-1965.
74. Fletcher D.S., Lin T. Inhibition of immune complex mediated activation of complement. Effects of agents modulating activation and the activated CI complex. //Inflammation. 1980. V.4. P.l13-123.
75. Sahu A., Kay B.K., Lambris J.D. Inhibition of human complement by a C3-binding peptide isolated from a phage displayed random peptide library. //J. Immunol. 1996. V.157. P.884-891.
76. Sahu A., Morikis D., Soulika A.M., Spruce L., Moore W.T., Lambris J.D. Species specificity, structural functional analysis and biotransformation studies on Compstatin, a potent complement inhibitor. //Mol. Immunol. 1998. V.35. P.371-371.
77. Fiane A.E., Mollnes T.E., Videm V., Hovig T., Hogasen K., Mellbye O.J., Spruce L., Moore W.T., Sahu A., Lambris J.D. Compstatin, a peptide inhibitor of C3, prolongs survival of ex vivo perfused pig xenografts. //Xenotransplantation. 1999. V.6. P.52-65.
78. Nilsson B., Larsson R., Hong J., Elgue G., Ekdahl K.N., Sahu A., Lambris J.D. Compstatin inhibits complement and cellular activation in whole blood in two models of extracorporeal circulation. //Blood. 1998. V.92. P. 1661-1667.
79. Borsos T., Rapp, H.J., Crisler C. The interaction between carrageenan and the first component of complement. //J. Immunol. 1965. V.94. P.662-666.
80. Davies G.E. Inhibition of guinea pig complement in vitro and in vivo by carrageenan. //Immunology 1963. V.6. P.561-568.
81. Raepple E., Hill H., Loos M. Mode of interaction of different polyanions with the first (CI), the second (C2) and the fourth (C4) component I. //Immunochemistry. 1976. V.13. P.251-255.
82. Loos M., Vanakis J.E., Stroud R.M. Mode of interaction of different polyanions with the first (CI), the second (C2) and the fourth (C4) component of complement. II. //Immunocheroistry 1976. V.13. P.257-261.
83. Walb D., Loos M., Haddinc U. In vitro-Untersuchungen liber Angriffspunkt und Wirkungsunterscheide zum Heparin. Antikomplemen-tare Wirkung eines semisynthetischen Pentosan-Polysulfo-Esters. //Z. Naturforsch. (B). 1971. V.26. P.403-408.
84. Yachnin S. Biological properties of polynucleotides. I. The anticomplementary activity of polynucleotides. //J. Clin. Invest. 1963. V.42. P.1947-1955.
85. Yachnin S. Biological properties of polynucleotides. III. The anticomplementary properties of polyriboguanylic acids. //J. Immunol. 1964. V.93. P. 155-156.
86. De Clercq E., Torrence P.F., Hobbs J., Janik В., De Somer P., Witkop B. Anticomplementary activity of polynucleotides. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1975. V.67. P.255-263.
87. Renk C.M. Hoffman E.M. Identification of RNA a complement inhibitory component in an extract of Ehrlich ascites tumor cells. Hi. Immunol. 1977. V.l 19. P.263-270.
88. Eisen V., Loveday C. Effect of suramin on clotting, fibrinolysis and kinin formation. //Br. J. Pharmacol. 1973. V.49. P.678-687.
89. Fong J.S.C., Good R.A. Suramin—A potent reversible and competitive inhibitor of complement system. //Clin. Exp. Immunol. 1972. V.10. P.127-138.
90. Rommel F.A., Stolfi R. Preparation and partial characterization of sheep erythrocyteantibody complement intermediate EACla, 4, 2a, 3, 5, 6, 7. //Immunology 1968. V.15. P.469-479.
91. Stolm R.L. An analogue of guinea pig C8: in vitro generation and inhibitory activity. Hi. Immunol. 1970. V.104. P.1212-1219.
92. Lachmann P.J., Elias D.E., Miffett A. Conglutinins and immunoconglutins. In Symposia on Biological Activities of Complement, ed. by D. G. Ingram. P.202-214. Kayser. Basel. 1971.
93. Asghar S.S., Kammeijer A., Faber, W.R., Dingemans K.P. Suppression of complement-mediated vascular injury at Arthus reaction sites by complement inhibitors. //Complement. 1986. V.3. P.40-48.
94. Brackertz D., Kueppers F. A one year follow up of treatment of hereditary angioneurotic edema (IIANE) with suramin. //Allergol. Immunopathol. 1973. V.II. P. 163-168.
95. Hansch C., Yoshimoto M., Doll M. Structurc-activity relationship in immunochemistry. . Inhibition of complement by benzylpyridinium ions. On the predective value of correlation equations. //J. Med. Chem. 1976. V.19. P. 1089-1093.
96. Hansch C., Yoshimoto M. Structure-activity relationship in im-munochemistry. 2. Inhibition of complement by benzamidines. //J. Med. Chem. 1974. V.17. P. 1160-1167.
97. Baker B.R., Cory M. Irreversible enzyme inhibitors. 186. Irreversible inhibitors of the C la component of complement derived from m-(phenoxypropoxy) benzamidine by bridging to a terminal sulfonylfluoride. //J. Med. Chem. 1971. V. 14. P.805-808.
98. Hauptman J., Markwardt F. Inhibition of the hemolitic complement activity by derivaties of benzamidine. //Biochem. Pharmacol. 1977. V.26. P.325-329.
99. Asghar S.S., Pondman K.W., Cormane R.H. Inhibition of Clr, Cls and generation of Cls by amidino compounds. //Biochem. Biophys. Acta. 1973. V.317. P.539-548.
100. Bine D.H. Nature of the active site of a sununit of the first componentof human complement. //Biochemistry 1969. V.8. P.4503-4510.
101. Bing D.H. Inhibition of guinea pig complement by aromatic amidine and guanidine compounds. //J. Immunol. 1970. V.105. P.1289-1290.
102. Inagi R., Miyata T., Maeda K., Sugiyama S., Miyama A., Nakashima I. FUT-175 as a potent inhibitor of C5/C3 convertase activity for production of C5a and C3a. //Immunol. Lett. 1991. V.27. P.49-52.
103. Araida T., Frey C.F., Ruebner B., Carlson J., King J. Therapeutic regimens in acute experimental pancreatitis in rats: effects of a protease inhibitor, a beta-agonist, and antibiotics. //Pancreas. 1995. V.l 1. P.132-140.
104. Harrity T.W. Goldlust M.B. Anti-complement effects of two anti-inflammotory agents, niflumic and flufenamic acids. //Biochem. Pharmacol. 1974. V.23. P.3107-3120.
105. Jackson W.T., Sulen A. Studies on the complement mediated lysis of EAC142 cells by EDTA-serum. //Fed. Proc. 1971. V.30. P.472.
106. Kohler P.F., Martinez J.S. Inactivation of C3 and inhibition of Arthus reaction in mice by flufenamate-Na. //Fed. Proc. 1971. V.30. P.472.
107. Azar M.M., Good R.A. Effect of fumaropimaric acid on mouse complement and immunological tolerance. //Proc. Soc. Exp. Biol. Mod. 1971. V.137. P.429-432.
108. Glovsky M.M., Becker E.L., Halbrook N.J. Inhibition of guinea pig complement by maleopimaric acid and other derivatives of levopimaric acid. //J. Immunol. 1968. V.100. P.979-990.
109. Aschar S.S., Kammeuer. A. Interaction of phenothiazine sulphonate and chlorophenothiazine sulphonate with the B-determinant of the third component of complement (C3). //Mol. Immunol. 1979. V. 16. P. 117-121.
110. Mao T.S.S., Moval J.J., Pellerin P., Plescia O. J. Inactivation of hemolytic activities of serum complement by phenothiazines. //Can. J. Biochem. 1969. V.47. P.547-552.
111. Rosini S., Mazzoncini V. Anti-complementary properties of 043/ 63 and 043/13, two new anti-inflammatory drugs. //J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. (Prague). 1977. V.21. P.309-314.
112. Asghar S.S., Siddiqui A.H., van der Goot H., Timmerman H. Inhibition of complement by a series of substituted 2-aryl-l,3-indandiones: interaction with the fifth component of complement. //Mol Immunol. 1986. V.23. P.459-65.
113. Soter N.A., Austen K.F., Gigli I. Inhibition of (-aminocaproic acid of the activation of the First component of the complement system. //J. Immunol. 1975. V.l 14. P.928-932.
114. Taylor F.B., Fundenberg H. Inhibition of CI component of complement by amino acids. //Immunology 1964. V.7. P.319-331.
115. Tamura Y., Hirado M., Okamura K., Kinato Y., Fujjii S. Synthetic inhibitors of trypsin, plasmin, kallikrein, thrombin, Clr and Cl-esterase. //Biochem. Biophys. Acta. 1977. V.484. P.417-422.
116. Muramatu M., Shiraishi S., Juffii S. Inhibitory effects of ¿>-amino and гу-guanidino acid esters on the first component of human complement. //Biochem. Biophys. Acta 1972. V.285. P.224-234.
117. Vallota E.H. Inhibition of C5- convertase by (-aminocaproic acid (EACA), a limiting factor in the generation of C5a anaphylatoxon. //Immunology 1978. V.34. P.439-447.
118. Fearon D.T., Austen K.F. Inhibition of enzymes. //Ann. N.Y. Acad. Sri. 1975. V.256. P.441-450.
119. Allan R., Rodrick M., Knobel H.R., Isliker H. Inhibition of the interaction between the complement component Clq and immune complexes. //Int. Arch. Appl. Immunol. 1979. V.58. P.140-148.
120. Basch R.S. Inhibition of the third component of complement system by derivatives of aromatic amino acids. //J. Immunol. 1965. V.94. P.629-640.
121. Cooper N.R., Moller-Eberhard H.J. Quantitative relation between peptidase activity and the cell bound second (C'2), third (С*3) and fourth (C'4) component of human complement (c1). //Fed. Proc. 1967. V.26. P.361.
122. Shin H.S., Mayer M.M. The third component of the guinea pig complement system. III. Effect of inhibitors. //Biochemistry 1968. V.7. P.3003-3006.
123. Патент USA № US5977076. Method and material for inhibiting complement.
124. Takada A., Shirahama S. //Immunopharmacology. 1985. V.9. P.87-95.
125. Cuskman W.F., Becker E.L., Wirtz G. Concerning the mechanism of complement action. III. Inhibitors of complement action. //J. Immunol. 1957. V.79. P.80-83.
126. Di Perri Т., Auteri A. Anticomplementary properties ofcinnarizinc. //Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 1973. V.203. P.23-29.
127. Di Perri Т., Auteri A., Pasini F.L., Mattioli F. Inhibition by cinnarizine of the properdin dependent activation of complement. //Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 1977. V.226. P.281-285.
128. Sledge C.R., Bine D.H. Binding properties of the human complement protein Clq. Hi. Biol. Chem. 1973. V.248. P.2818-2823.
129. Baba A.S., Tamura N. Influence of aromatic compounds on the interaction of activated C4 with EAC1. //Immunology. 1977. V.32. P.251-256.
130. Hong K., Kinoshita Т., Miyazaki W., Izawa Т., Inoue K. An anticomplementary agent, K-76 monocarboxylic acid: Its site and mechanism of inhibition of the complement activation cascade. //J. Immunol. 1979. V.l 12. P.2418-2423.
131. Hong K., Kinoshita Т., Kitajama H., Inoue K. Inhibitory effect of K-76 monocarboxylic acid, an anticomplementary agent, on the C3b-inactivator system. //J. Immunol. 1981. V.l27. P.104-108.
132. Hong K., Kinoshita T., Inoue K. Simple method for preparing EAC1, 4b, 2a, 3b and EA 4b, 3b with human and guinea pig complement components using an anticomplementary agent. K-76 monocarboxylic acid.//J. Immunol. 1981. V.i27. P. 109-114.
133. Di Perri T., Forconi S., Auteri A., Vittor A., Pasini F.L., Guercini F. Sull'azone anticomplementare ed antiaggregante piastrinica della fuorsemide e dell'acido etacrinico. //Minerva Nefrol. 1974. V.21. P.147-155.
134. Oshuci Y., Matsuno T., Takacaki Y. Anti-complement activities of 2,4.bis (2-hydroxybenzamido)-benzoic acid and its diacylated derivatives. //Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1977. V.25. P. 1202-1208.
135. Giroud J.P., Timsit J. Propriétés anti-inflammatoires et anticomplementaires de quiques substances histaminoliberatrices. //C.R, Soc. Biol. (Paris). 1971. V.I65. P.69-73.
136. Mecel H., Roychaudhuri A., Bayer M., Beaver T.II. The immunopharmacologic and antiinflammatory properties of RMI 9563 with special reference to its effect on complement system. //Agents Action 1978. V.8. P.218-228.
137. Doherty N.S. The interaction of tilorone and RMI 9563 with the complement system.//Int. J. Immunopharmacol. 1982. V.4. P.67-72.
138. Levine L. Inhibition of immune hemolysis by diisopropyl fluorophosphate. //Biochem. Biophys. Acta 1955. V.I8. P.283-284.
139. Becker E.L. The relationship of the structure of phosphonate esters to their ability to inhibit chymotrypsin, trypsin, acetyl choline esterase and Cla. //Biochem. Biophys. Acta. 1967. V.I47.: P.289-296.
140. Haines A.L., Lepow I.H. Studies on human C'l-esterase. II. Function of purified C'l-esterase in the human complement system. //J. Immunol. 1964. V.92. P.468-478.
141. Lorenz D., Uebel H. Die Wirkung von Chlorophyll auf Sensibili-sierungsvorgange 1. Mitteilung: Wirkung im aktiven Anaphylaxieversuch. //Arzneim.-Forsch. 1957. V.7. P.357-360.
142. Busing K.H. Die Lemmbarkeit des komplements bei antigen-antikorper-reactionen in vitro und anaphylakitschen reactionen in vivo. //Allerg. Asthma. 1975.V.3. P. 15-22.
143. Schultz D.R., Vanakis J.E., Arnold P.I., Gottlieb N.L., Sakai K., Stroud R.M. Inactivation of Clin rheumatoid synovial fluid, purified Cl and Cl-esterase by gold compounds. //Clin. Exp. Immunol. 1974. V.I7. P.395-406.
144. Kitamura H., Inai S. Effect of sugar on the lysis of EACl-8(Abstract). //J. Immunol. 1980. V.I24. P. 1527.
145. Baker P. J., Osofsky S.G. Isolation and characterization of a low molecular weight inhibitor present in normal and human scrum. //Clin. Exp. Immunol. 1981. V.43. P.549-556.
146. Sahu A., Rawal N. Inhibition of complement by covalent attachment of rosmarinic acid to activated C3b. //Biochem. Pharmacol. 1999. V.57. P. 1439-1446.
147. Gewürz H., Wernick P.R., Quie P.G., Good R.A. Effects of hydrocortisone succinate on the complement system. //Nature (Lond.). 1965. V.208. P.755-757.
148. Brandslund I., Peters N.D., Ejstrup L., Teisner B., Ras-mussen G.G. Steroids and complement activation in rheumatoid arthritis. //Lancet 1983. V.2. P.346-347.
149. Jobin F., Gagnon F.T. Platelet reactions and immune processes. IV. Inhibition of complement by pyrazole compounds and other inhibitors of platelet reactions. //Can. J. Microbiol. 1970. V.16. P.63-67.
150. Whaley K., Sloane D.J.P., Davidson A.G., Brooks P.M. Studies on the action of some antiinflammatory drugs on complement mediated immune hemolysis. //Br. J. Clin. Pharmacol. 1975. V.2. P.123-129.
151. Tack B.F., Janatova J., Lorenz P.E., Schechter N., Prahl J.W. The third component of human complement: Appearance of a sulphydryl group following chemical or enzymatic inactivation (Abstract). //J. Immunol. 1980. V.124. P. 1542.
152. Schultz D.R., Arnold P.I. Cyanate as an inactivator of complement proteins. //J. Immunol. 1975. V.l 15. P.l558-1565.
153. Shaw D.R., Shaw M.W., Hickman S.E., Lamon E.W., Griffin F.M. Sodium azide inhibition of complement mediated functions. //Immunology. 1980. V.39. P.53-56.
154. Montgomery D.W., Chvapil M., Zukoski C.F. Effects of zinc chloride on guinea pig complement component activity in vitro: Concentration-dependent inhibition and enhancement. //Infect. Immun. 1979. V.23. P.424-431.
155. Bauman N., Brockman J.A. Potentiation of CI.inhibitor by synthetic compounds of low molecular weight (Abstract). //J. Immunol. 1980. V.124. P. 1513.
156. Nagaki K., Inai S. Inactivator of the first component of human complement (Cl-INH). Enhancement of Cl-INH activity against Cls by acidic mucopolysaccharides. //Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 1976. V.50. P.172-180.
157. Rent R., Myhrman R., Fiedel B.A., Gewürz H. Potentiation of Cl-esterase inhibitor activity by heparin. //Clin. Exp. Immunol. 1976. V.23 P.264-271.
158. Bauman N., Brockman J.A. In vivo and in vitro inhibition of complement by chlorazol fast pink (Abstract). //J. Immunol. 1978. V.l20 P. 1764.
159. Gadek J., Hosea S.W., Gelfand J.A., Frank M.M. Response of variant hereditary angioedema phenotypes to danazol therapy. Genetic implications. //J. Clin. Invest. 1979. V.64. P.280-286.
160. Gelfand J.A., Sherins J.R., Ailing D.W., Frank M.M. Treatment of hereditary angioneurotic edema with danazol. Reversal of clinical and biochemical abnormalities. //N. Engl. J. Med. 1976. V.295. P.1444-1448.
161. Rothbach C., Green R.L., Levine M.I., Fireman P. Prophylaxis of attacks of hereditary angioedema. //Am. J. Med. 1979. V.66. P.681-683.
162. Sheffer A.L., Fearon D.T., Austen K.F. Methyltestosterone therapy in hereditary angiedema. //Ann. Intern. Med. 1977. V.86., P.306-308.
163. Rosse W.F., Logue G.L., Silberman H.R., Frank M.M. The effect of synthetic androgens in hereditary angioneurotic edema: Alteration of Cl-inhibitor and C4 levels. //Trans. Assoc. Am. Physens. 1976. V.89. P. 122-132.
164. Lesavre P., Gaillard M., Halbwachs-Macarelli L. Inhibition of alternative pathway factor D by related synthetic hexapeptides. //Eur. J. Immunol. 1982. V.12. P.252-254.
165. Burger R., Bitter-Suerman D., Hadding U. Activation of the alternate pathway of complement: Inhibition by low molecular weight polyanion. //Immunochemistly. 1978. V.15. P.231-235.
166. Bitter-Suermann D., Zimmer B., Hadding U. Polyanionic degranulation in fluid phase: An efficient C3b-amplification model. //J. Immunol. 1980 V.124. P.1515.
167. Weiler J.M., Yurt R.W., Fearon D.T., Austen K.F. Modulation of the formation of the amplification convertase of complement, C3b, Bb, by native and commercial heparin. //J. Exp. Mod. 1978. V.147. P.409-421.
168. Kazatchkine M.D., Maillet F., Fischer E., Glotz D. Modulation of the formation of the human C3 amplification convertase of complement by polyelectrolytes. //Agents Action. 1981. V.l 1. P.645-646.
169. Vogt W., Hinsch B., Schmidt G., Von Zabern, I. Multiple effects of a diamidine (propamidine) on complement activation. //Immunology. 1979. V.36. P.131-137.
170. Vogt W., Hinsch B., Schmidt G. Interference of propamidine with binding of the fifth component of complement to surface fixed C3b, and with C5 activation. //Immunology. 1979. V.36. P.139-143.
171. Asghar S.S., Cormane R.H. Interaction of the B-determinant of the third component of complement with amidino compounds. //Immunochemistry 1976. V.13. P.975-978.
172. Ikari N., Sakai Y., Fujii S. New synthetic inhibitor to the alternative pathway. //Immunology. 1983. V.49. P.685-691.
173. Narayana S.V., Carson M„ Kabbani O., Kilpatrick J.M., Moore D., Chen X., Bugg C.E., Vanakis J.E., DeLucas L.J. Structure of human factor D: A complement system protein at 2.0 Ä resolution. //J. Mol. Biol. 1994. V.235. P.695-708.
174. Kim S., Narayana S.V.L., Vanakis J.E. Crystal structure of a complement factor D mutant expressing enhanced catalytic activity. //J. Biol. Chem. 1995. V.270. P.24399-24405.
175. Cole L.B., Chu N.M., Kilpatrick J.M., Vanakis J.E., Narayana S.V.L., Babu Y.S. Structure of diisopropyl fluorophosphate-inhibited factor D. //Acta. Crystallogr. D. 1997. V.53. P.143-150.
176. Fearon D.T., Austen K.F., Ruddy S. Properdin factor D: Characterization of its active site and isolation of the precursor form. Hi. Exp. Med. 1974. V.139. P.355-366.
177. Szalai A.J., Digerness S.B., Agrawal A., Kearney J.F., Bucy R.P., Niwas S., Kilpatrick J.M., Babu Y.S., Vanakis J.E. The arthus reaction in rodents: species-specific requirement of complement. Hi. Immunol. 2000. V.164. P.463-468.
178. Bürge J.J., Fearon D.T., Austen K.F. Inhibition of the alternative pathway of complement by gold sodium thiomalate in vitro. Hi. Immunol. 1978. V.120. P.1625-1630.
179. Packard B.D., Weiler J.M. Steroids inhibit activation of the alternative-amplification pathway of complement.//Infect. Immunol. 1983. V.40. P.1011-1014.
180. Oshugi Y., Matsuno M.R., Takagaki Y. Anti-complement activities of 2,4-bis-(2-hydroxybenzamido)-benzoic acid and its diacetilated derivatives. //Chem. Pharm. Bull. 1977. V.25. P.1202-1208.
181. Nagaki K., Matsumoto M., Inai S. A low molecular weight inhibitor (LMW-INH) of the alternatives pathway: Its isolation from urine and its reaction mechanisms. //J. Immunol. 1980. V.124. P.1533.
182. Nagaki K., Matsumoto M., Kitamura H. A low molecular weight inhibitor of the. alternative complement pathway. I. Its isolation from human urine and the reaction mechanism. //Immunology. 1980. V.41. P.789-798.
183. Baker P.J., Parker C.J., Osofsky S.G. Characterization of alternative pathway inhibition by a serum derived low molecular weight complement inhibitor. //Clin. Exp. Immunol. 1984. V.55. P.166-176.
184. Durda P.J., Pagano R.J., Bauman N., Brockman J.A. Effects of the radiocontrast agent iodipamide methyiglucamine on C3 and factor. //J. Immunol. 1980. V.24. P. 1518.
185. Morrison D.C., Jacobs D.M. Inhibition of lipopolysaccharide initiated activation of serum complement by polymyxin B. //Infect. Immun. 1976. V.13. P.298-301.
186. Diemincer L., Vogt W., Lynn R. Purification and some properties of factor D of human properdin system. IIZ. Immunitatsforsch. 1976. V.152. P.231-243.
187. Fishelson Z., Moller-Eberhard H.J. The C3/C5 convertase of the alternative pathway of complement: Stabilization and restriction of control by lanthanide ions. //Mol. Immunol. 1983. V.20. P.309-315.
188. Cochrane C.G. Mediators of Arthus and related reactions. //Prog. Allergy. 1967. V.l 1. P.l-35.
189. Gwynn C.M. Therapy in hereditary angioneurotic edema. //Arch. Dis.Child. 1974. V.49. P.636-640.
190. Kruze D., Fehr K., Menninoer H., Boni A. Effect of antirheumatic drugs on neutral protease from human leucocyte granules. //Z. Rheumatol. 1976. V.35. P.337-346.
191. Bokisch V.A., Top F.H. jr., Russel P.R., Dixon F.J., Moller-Eberhard H.J. The potential pathogenic role of complement in dengue hemorrhagic ahock syndrome. //N. Engl. J. Mod. 1973. V.285. P.996-1000.
192. Maisch В., Berg P.A., Kocksieke K. Clinical significance of immunopathological findings inpatients with postpericardiotomy syndrome. //Clin. Exp. Immunol. 1979. V.38. P,189-197.
193. Агрономов A.E., Шабаров Ю.С. Лабораторные работы в органическом практикуме. М.: Издательство МГУ. 1971
194. Физер JI., Физер М. Реагенты для органического синтеза. /Пер. с англ.//М.: Мир, 1971. Т.4. С.82-113.
195. Ilelferich, Schmidt //Ber.1959. V.92. Р.2051 2052.
196. Beilstein's Handbuch der organischen Chemie. EIV 6. 6719.
197. Джильберт Э.Е. Сульфирование органических соединений. /Пер. с англ. //М.: Химия. 1969.
198. Burckhardt G.N. //J. Chem. Soc. 1933. P.337.
199. Верховская 3. H. Дифенилолироиан. //М.: Химия, 1971, 196 с.
200. Кулиев A.M., Али-заде З.А., Азерб. хим. ж., 1963, №2, С.25; Chemical Abstracts, 1963, 59, 13855.
201. Pogrebnyak A.V., Vasilenko Yu.K., Oganesyan E.T., Glushko A.A., Suzdalev K.F., Pogrebnyak L.V. //Pharm. Chem. Journal (Translation of Khimiko-Farmatsevticheskii Zhurnal). 2002. V.36. N.10. P.535-537.
202. Патент США, № WO 2002026761
203. Sun 1-Chen; Wang Hui-Kang; Kashiwada Y.; Shen Jing-Kang; Cosentino L.M.; Chen Chin-Ho; Yang Li-Ming; Lee Kuo-Hsiung. J. Med.l Chem. 1998. V.41. N.23. P.4648-4657.
204. Reiss-Husson F. Structure des phases liquide-cristallines de différents phosphlipides, monoglycerides, sphingolipides, anhydres on en presence d'eau. //J. Mol. Biol. 1967. V.25. N.3. P.363-382.
205. Gaboriaud C., Juanhuix J., Gruez A., Lacroix M. et all. The crystal structure of the globular head of complement protein Cl q provides a basis for its versatile recognition properties//J. Biol. Chem. 2003. V.278. N.47. P.46974-46982.
206. Jle Банг Шон. Синтез бетулиновой кислоты и разработка ее липосомальной формы. //Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. 1999.
207. Beilstein's Handbuch der organischen Chemie. EIV 6. 6719.
208. Салахов M.С., Гусейнов М.М., Чалабиев Ч.А., Рзаев А.Х. Описание изобретения к авторскому свидетельству №493458. 1976.
209. Гордон А., Форд Р. Спутник химика//М., Мир, 1976.
210. Aldrich. Справочник химических реактивов и лабораторного оборудования. 20032004.
