Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного резонанса тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

На правах рукописи

)0553492І>

Юминова Алина Валерьевна

Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного резонанса.

02.00.10- биоорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва 2013

1 О 0К Г 2013

005534925

Диссертационная работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович

доктор химических наук, ведущий научный сотрудник

Кубарева Елена Александровна

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего

профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией

Позмогова Галина Евгеньевна

Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «29» октября 2013 года в 16 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д. 1, стр. 40, МГУ, НИИФХБ,, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 27.

Автореферат диссертации размещен на сайте Высшей Аттестационной Комиссии (vak.ed.gov.nj).

1 > г

Автореферат разослан _^2013 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 501.001.41 к.х.н, доцент

И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Тромбин это фермент класса гидролаз, важнейший компонент системы свертывания крови человека и животных; в крови присутствует в виде неактивного предшественника протромбина и активируется протромбиназой (активным тромбопластином). Основная функция тромбина - превращение фибриногена в фибрин.

Тромбин - гликопротеид с молекулярной массой около 40000; содержит около 5% углеводов. Он относится к классу сериновых пептидаз (трипсин и другие) и состоит из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью: А-цепь и Б-цепь, которая формирует активный центр фермента и содержит углеводный компонент. Тромбин существует в нескольких активных формах, которые различаются конформацией Б-цепи.

В крови тромбин инактивируется антитромбинами плазмы: а2-макроглобулином, антитромбином III и гепарином. Специфический неплазменный ингибитор тромбина -полипептид гирудин, который содержится в слюнных железах медицинской пиявки. В последние годы был получен новый тип ингибиторов тромбина - ДНК-аптамеры. Аптамерами называют олигомеры нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с заданной мишенью - будь то низкомолекулярные соединения или целые клетки.

Аптамерная ДНК dGGTTGGTGTGGTTGG (15TGT), ингибирующая тромбин, впервые была получена методом SELEX (Bock L.C 1992). В отличие от широко применяемых в настоящее время ингибиторов тромбина, таких как гепарин, 15TGT обладает низкой иммуногенностью и малым временем жизни в организме, что определяет возможность получения нового лекарственного препарата. 15TGT имеет структуру внутримолекулярного G-квадруплекса, образуемого двумя G-квартетами, находящимися в стэкинге и соединенными одной TGT-петлей и двумя ТТ-петлями. G-квартеты состоят из четырех гуанинов, взаимодействующих по хугстиновскому типу. Кроме внутримолекулярных (мономолекулярных) G-квадруплексов, из двух или четырех молекул ДНК могут образовываться димерные или тетрамерные межмолекулярные комплексы. Тип G-квадруплекса может быть определен с помощью характеристических спектров кругового дихроизма.

Пространственная структура тромбин-связывающего аптамера может стать основой для разработки улучшенных ингибиторов тромбина с G-квадруплексной структурой фармакофора. В стадии клинических испытаний находится один аптамерный ингибитор тромбина - NUI72, разработанный "Archemix" в 2007 году. Данный ДНК-аптамер также имеет в своей первичной структуре G-квадруплексный паттерн, однако структура его неизвестна. Более того, как было впервые показано в данной работе, наличие квадруплексного паттерна у NUI 72 не определяет автоматически образование квадруплексной структуры в растворе. Понимание причин, влияющих на структуру и свойства аптамеров к тромбину, необходимо для эффективной разработки антикоагулянтных препаратов.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение структуры ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека, имеющих в своей первичной структуре в-квадруплексный паттерн 00МХССМУ00М2СС, где N - любой нуклеотид, а х, у, г - количество нуклеотидов в петлях О-квадруплекса. Кроме изучения предполагаемого фармакофора - минимального ДНК-аптамера, соответствующего паттерну, необходимо было исследовать влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов структуры на стабильность О-квадруплексных аптамеров и кинетику связывания аптамеров с тромбином человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

I. Исследовать структуру ДНК-аптамеров, имеющих в первичной структуре два паттерна: в-квадруплексный и дуплексный. Изучить условия существования в растворе структур, соответствующих этим паттернам.

II. В условиях, когда одновременно существуют О-квадруплексный и дуплексный элементы структуры в растворе, изучить их взаимное влияние на структуру аптамера и способность связываться с тромбином человека.

III. Количественно описать кинетику взаимодействия ДНК-аптамеров с тромбином человека с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса и визуализации поверхностного плазмонного резонанса.

IV. Изучить влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов вторичной структуры на взаимодействие с тромбином человека.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе исследована серия ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека: 15ТОТ (15-мер), №172 (26-мер), 31 ТОТ (31-мер) и их производные, которые обладают разным набором потенциальных структурных элементов. Впервые показано, что аптамер 31ТОТ, который имеет два патерна - дуплексный и О-квадруплексный, в растворе образует два элемента структуры: О-квадруплексный паттерн формирует антипараллельный мономолекулярный О-квадруплекс, а концевые участки с комплементарными последовательностями образуют дуплекс. В работе впервые показано, что оба структурных мотива — О-квадруплекс и дуплекс, в единой структуре 31 ТОТ взаимно влияют друг на друга. А именно, в случае, когда не формируется дуплекс, О-квадруплекс также не образуется. На примере аптамера Ыи172, имеющего в первичной структуре два структурных мотива, аналогичных 31 ТОТ, впервые показано, что наличие структурного паттерна не

4

гарантирует образование самой структуры в растворе. В работе показано влияние на структуру и свойства G-квадруплекса других типов изменения структуры: изменение состава петель, соединяющих G-квартеты, влияние дополнительных участков на 5'- и 3'- концах G-квадруплекса, как с нецелевыми некомплементарными последовательностями, так и с последовательностями, формирующими G-квадруплексную структуру.

Использование методов спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса позволило получить кинетические параметры взаимодействия G-квадруплексной структуры с тромбином, при этом предполагалось, что изменение структуры G-квадруплекса должно сказаться и на параметрах взаимодействия с тромбином. Показано, что ведение дополнительного дуплексного элемента структуры позволяет увеличить скорость ассоциации с тромбином, по-видимому за счет существования предсобранных молекул аптамера в растворе.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей международной конференции «International Conference of nanoscience and nanotechnologies», (2010, Гавана, Куба), 5-ой международной конференции «International Conference on Drug Discovery & Therapy», (2013, Дубай, ОАЭ) и 8 международном конгрессе «Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology» (2011, Пекин, Китай). А также на ряде российских конференций: Всероссийской школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», (2008, Белгород, РФ), XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ, (2011, Москва, РФ).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи, 11 тезисных сообщений и подана заявка на патент.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Ведение», «Обзор литературы», «Экспериментальная часть», «Результаты», «Заключение», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на 113 страницах и включает в себя 89 рисунков, 14 таблиц и список литературы, содержащий 126 ссылкок.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для того, чтобы определить влияние дополнительных элементов к фармакофорной группе аптамерных ингибиторов тромбина, содержащих G-кадруплексный паттерн аптамера 15TGT, рассмотрим все возможные направления изменений структуры минимального G-квадруплекса 15TGT (рисунок 1).

Рисунок 1. Возможные изменения структуры аптамерного минимального квадруплекса.: II. Увеличение числа й-квартетов; І.1І. Изменение длины и структуры петель О-квадруплекса; II. Введение дополнительных элементов структуры, представленных взаимокомплементарными фланкирующими последовательностями и внутренними петлями; ІІ.І. Введение дополнительных элементов структуры, представленных некомплементарными фланкирующими последовательностями; II.II. Уменьшение длины фланкирующих взаимокомплементарных и некомплементарных последовательностей; II. III. Изменение дуплексного элемента структуры и структуры внутренных петель; II. Использование дополнительного структурного элемента, имеюіцего предполагаемый й-квадруплексный паттерн.

I.I. Реализация вариантов описана в литературе. Увеличение числа G-квартетов было рассмотрено в работе Prislan el al (Prislan I, Khutsishvili I, Marky LA, 2011). Введение дополнительного третьего G-квартета приводит к увеличению стабильности G-квадруплексной структуры, причем происходит потеря фармакофорной группы, так как образуется параллельный G-квадруплекс. Уменьшение длины петель, а также изменение их структуры, ведет к изменению типа G-квадруплекса, т. е. формируется параллельный, а не антипараллельный G-квадруплекс 15TGT (Peng, Damh 2007).

I.II. В данной работе, выполненной совместно с Zhu J (National Center for NanoScience and Technology, Пекин, Китай) использован метод визуализации поверхностного плазмонного резонанса (SPRi), поскольку он позволяет одновременно анализировать взаимодействие серии аптамеров с тромбином.

Были получены сенсограммы связывания (рисунок 2) тромбина человека с аптамерами, представленными в таблице 1. Первичная структура аптамеров была изменена путем вариации структуры внутренних петель, а иммобилизация аптамеров на подложке обеспечивалась использованием биотин-стрептавидиновой системы, где стрептавидин был ковалентно связан со стеклянной подложкой чипа, а биотин был модифицирован через линкер Т5 на 5'-конце аптамера.

Расчет кинетических констант проводили «вручную» в несколько этапов:

1. Линеаризация экспериментальных данных сенсограммы связывания аптамера с тромбином проводится в координатах: зависимость отрицательного натурального логарифма отношения (RU„aKc-RU)/ RU„aicc от времени (рис. ЗА)

2. Аппроксимация прямой зависимости углового коэффициента К от концентрации тромбина. По оси абсцисс отложена концентрация тромбина, по оси ординат константа К= ко„*[Тромбин] + kofr.

• 12,5 нМ

О 50 100 150 200 250

Время, сек

Рисунок 2. (А) Фотоизображение поверхности биочипа с нанесенными образцами аптамеров. Система позволяет одновременно анализировать множество проб, включая эксперименты с повторами и контролями. (Б) Сенсограммы взаимодействия иммобилизованных аптамеров с тромбином.

Рисунок З (А) Линеаризаг/ия начальной скорости связывания тромбина по экспериментальным данным, по оси абсцисс отпожено время, по оси ординат — Ьп(1-Ки/Яи^акс)- (Б) Зависимость углового коэффициента К от концентрации тромбина. По оси абсцисс отложена концентрация аптамера, по оси ординат константа К= коп*[Тромбин] + кф

Таблица 1. Дезоксирибоолигонуклеотиды с изменениями структуры петель минимального О-квадруплекса 15ТОТ. Замены обозначены подчеркиванием и выделены цветом.

Название олигонуклеотида Первичная структура.

01 5'-биотин-ТТТТТССТТССС1ШССТТСС

02 5'-биотин-ТТТТТССТТСССТТССОТСС

ИЗ 5,-биотин-ТТТТТССГГССШТССТТСС

т 5'-биотин-ТТТТТССТТССТОТССОТСС

05 5'-биотин-ТТТТТССТТССТТСССТТСС

Об 5'-биотин-ТТТТТССТТССТТГССОТСС

07 5'-биотин-ТТТТТССТТССТТТССТТСС

Таблица 2 Кинетические константы взаимодействия тромбина человека с аптамерами, имеющими различную структуру петель.

Аптамер кот [М"'*сек"' ]*10"3 коп [сек"']*104 К0 [нМ]

! 01 Не опред. 2,05 ±1,1 Не опред.

т \ \ 1,98 ±0,24 5,22 ± 0,24 37,9

оз 2,34 ± 0,67 10,3 ±0,66 22,8

1 1)4 2,41 ±0,96 6,56 ± 0,93 36,7

1 1,91 ±0,6 11,3 ±0,78 16,9

Об Не опред. 5,82 ± 0,52 Не опред.

| О! 1,27 ±0,5 9,7 ± 0,92 13,1

Контроль - - Не детект.

5'-Т5-15ТОТ 0,11 ±0,023 7,29 ±0,11 12,3

Рассчитанные кинетические константы связывания тромбина человека с аптамерами приведены в таблице 2. При расчете констант коЯ для и 06 ошибка превышает значение константы, поэтому константа диссоциации Ко указана как «не определена». Любая замена в структуре петель негативно сказывается на связывании с тромбином, особенно при введении точечных замен одновременно в двух петлях или при полном изменении петли ТОТ. Это означает, что структура петель аптамера 15ТОТ (две ТТ и одна ТвТ петли) является оптимальным.

II. Изменение структуры минимального О-квадруплекса также возможно путем присоединения к в-квадруплексному паттерну дополнительного структурного элемента из комплементарных фланкирующих участков.

Рассмотрим аптамер 31 ТОТ, имеющий первичную структуру 5'-СА СГО'ОТАООТТООТОТООТТООООССЛ ОТв-У. Его й-квадруплексный паттерн идентичен таковому 15ТОТ (выделен подчеркиванием), а участки, способные формировать дуплекс (выделены курсивом), присоединены внутренними петлями длиной 2 н. Структуру 31 ТОТ изучали УФ-спектроскопией и спектроскопией кругового дихроизма (рисунок 4). Согласно спектрам КД (рисунок 5Б), 31 ТОТ образует в растворе мономолекулярный антипараллельный О-квадруплекс: распределение характеристических экстремумов соответствует таковым 15ТОТ (рисунок 5А). Термическая стабильность отдельных элементов структуры 31 ТОТ, определенная методами УФ-спектроскопии и кругового дихроизма, приведена в таблице 3. Термическая стабильность О-квадруплекса была определена по кривым УФ-плавления и КД-плавления при 294 нм, термическая стабильность дуплекса была определена по кривым УФ-плавления при 260 нм.

/

+

¥ {

элементов.

пространственной структуры аптамера ЗІТЄТи ее отдельных

Рисунок 4 Схематическое изображение предполагаемой

Спектры КД 15ТСТ при разных температурах пересекаются в двух изобестических точках, что указывает на существование в растворе только двух структур — денатурированной и й-квадруплексной. Спектры КД 31 ТОТ имеют одну изобестическую точку, следовательно, введение дополнительного к фармакофорной группе дуплекса приводит к существованию в растворе промежуточных структурных форм. Наличие дуплексного элемента не изменяет термическую стабильность й-квадруплекса, Тпл = 39 °С; дуплекс 31ТОТ более стабилен, чем О-квадруплекс. Отдельный дуплекс в составе шпильки имеет температуру плавления 65 °С (рисунок 6), включенный же в структуру 31ТОТ - 54 °С. Можно предположить, что О-квадруплекс при повышении температуры, являясь менее стабильным элементом структуры, разрушается первым и тем самым дестабилизирует дуплекс, в то время как дуплекс сам по себе в составе шпильки с петлей Т4 остается стабильным, по видимому, за счет меньших кинетических характеристик петли. Таким образом, 31ТОТ при условиях, дестабилизирующих О-квадруплекс, может иметь структуру шпильки за счет сформированного дуплекса.

Рисунок 5 Спектры кругового дихроизма 15TGT (А) и 31TGT (Б) в буфере 20 мМ Трис-НС1, рН=7,5, 140 mMNqCI, 5 мМ KCl, в диапазоне температур от 5"С до 80°С с шагом 5"С.

Температура °С

I

Рисунок 6. . УФ-плавления (260 нм) 31ЮТ (1), шпильки с дуплексным паттерном с ; петлей Т4 (2), и !5ТСТ(3).

Таблица 3. Термическая стабильность элементов вторичной структуры 31 ТОТ

Температура плавления, °С

Метод УФ-спектроскопия КД-спектроскопия

Аптамер дуплекс О-квадруплекс О-квадруплекс

15 ТОТ - 38±1 39±1

31 ТОТ 54±1 39±1 39±1

Взаимодействие 31ТСТ с тромбином человека.

В данной работе изучали связывание 15ТОТ и 31 ТОТ с иммобилизованным тромбином человека методом поверхностного плазмонного резонанса (БРЯ). Прямая иммобилизация тромбина на сенсорном чипе была реализована впервые, что позволило описать кинетику связывания с тромбином без модификации аптамеров. Полученные сенсограммы связывания аптамеров 15ТОТ и 31 ТОТ приведены на рисунках 7а и 76, соответственно. Рассчитаны кажущиеся кинетические константы (таблица 4), при помощи математических подходов, описанных в пункте 1.11.

Рисунок 7 Сенсограмма взаимодействия 15ТСТ (А) и 31ТСТ (Б) с иммобилизованным тромбином.

Таблица 4. Кажущиеся кинетические константы связывания 31ТОТ и 15ТОТ с иммобилизованным тромбином человека.

Кажущиеся кинетические константы Аптамеры

15ТСТ 31ТСТ

коп,, [сек1]* 104 0,71 ±0,13 99,6 ± 19,2

кот [М*сек"' ]*10"2 1,58 ± 0,1 0,97 ± 0,2

К0, нМ 2238 9,7

Очевидно, что кинетические константы диссоциации комплекса с тромбином для обоих аптамеров примерно одинаковы, в то время как ассоциация 31 ТОТ с тромбином происходит на два порядка быстрее, чем 15ТОТ. Присоединение к квадруплексу дуплекса ускоряет связывание аптамера с тромбином. По-видимому, это связано с тем, что сборка О-квадруплекса 31 ТОТ происходит быстрее, чем 15ТОТ, за счет дуплекса.

11.1 Исследовано влияние дополнительных к фармакофору некомплементарных участков на структуру О-квадруплекса на примере 31ТОТ-с11Г. Спектры КД представлены на рисунке В. Дополнительные участки на концах квадруплекса длиной 8 н. ведут к отсутствию существования О-квадруплекса, предположительно за счет динамического фактора.

■ 500 ткв/т|

■ 100ткв/т|

■ 70 гпкй/т[ И 50 ткй/т! □ 30 ткв/т| И 10 тк^т|

■ 7 ткв/т|

■ 3 тк^т|

■ 1ткв/т| И 0.5 ткй/т И 0.1 ткв/т!

В 500 тк(/т1

■ 100тка/т1 70тк(/т1

■ 50 тк(/т1

■ Э0тк(/т1 В10 ткв/т!

■ 7 тк(/|г!

■ 3 тк(,'пЧ

■ --г'-

■ 05 тка/т! ■О.) тк(/т1 ■0.1 тк(/т1

■

Длина в о.тны. им Длина в о.тны. км

Рисунок 8 Спектры кругового дихроизма 31TGT(А) и UTGT-dü (Б) в буфере 20 мМ Трис-HCI, рН=7.5, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, температура 5°С (1) и 8(ГС (2).

II.II Следующим шагом по изменению структуры аптамеров, имеющих G-кадруплексный и дуплексный паттерны, является изменение длины последовательностей, дополнительных к фармакофорной группе. В работе показано, что при уменьшении длины фланкирующих последовательностей комплементарность имеет меньшее влияние на состояние G-квадруплекса. Аптамеры 25TGT и 25TGT-du~ (последовательности dTGGTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCA и dCCCTAGGTTGGTGTGGTTGGGGCCA, соответственно) имеют одинаковый G-квадруплексный паттерн и фланкирующие последовательности, соответствующие половине таковых 31TGT и 31TGT-du". Согласно спектрам КД 25TGT и 25TGT-du" (рисунки 9А и 9Б) в обоих случаях формируется антипараллельный G-квадруплекс, температуры плавления составляют 28,5 °С и 25,0 °С, соответственно. Таким образом, при уменьшении длины дуплекса G-квадруплекс дестабилизируется, а при уменьшении длины некомплементарных дополнительных последовательностей их негативное влияние на G-квадруплекс уменьшается, что подтверждает гипотезу о кинетическом факторе.

Рисунок 9 Спектры кругового дихроизма аптамера 25TGT (А) и 25TGT-dü (Б) в буфере 20 мМ Трис~НС1, pH =7,5, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, в диапазоне температур от 5° С до 80° С с шагом 5° С.

о

О 10 20 30 40 50 60 Температура. °С

-100

Я .'« »0 .10 300 I» м хо

Длина волны, нм

Температура. °С

Рисунок 10 Спектры КД Nul72 (А) и 31TGT (В), в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН=7,5, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, в диапазоне температур от 5" С до 80° С с шагом 5° С; кривая КД-плавления (294 нм) NU 172 (Б) и 31 ТОТ (Г).

Факт подтверждается о структуре аптамера №172, имеющего первичную структуру аСО'ССГАООТТОООТЛОООТООТб'б'СО' (в-квадруплексный паттерн выделен подчеркиванием, взаимокомплементарные фланкирующие последовательности выделены курсивом). Согласно спектрам КД (рисунок 10А) О-квадруплекс данного аптамера малостабилен (температура плавления 21° С), а дуплекс в нативных условиях не существует (УФ-плавление, данные приведены в диссертации). Следовательно, наличие взаимокомплементарных последовательностей не может однозначно указывать на формирование дуплексного элемента структуры, причем отсутствие сформированного дуплекса ведет к дестабилизации О-квадруплекса.

II.HI Следующим шагом по изменению структуры аптамеров является комбинирование элементов структуры разных аптамеров. Введем понятие трех типов элементов структуры аптамерных ингибиторов тромбина (рисунок 11).

Элемент структуры типа №1, представленный в-квадруплексным паттерном; элемент структуры типа №2 в виде взаимокомплементарных фланкирующих последовательностей; элемент структуры типа №3, представленный внутренними петлями, обеспечивающий соединение дуплексного и С-квадруплесного элементов.

В работе были рассмотрены структуры, полученные комбинированием элементов структуры ЗІТйТ и Ми172, а также изменением структуры дуплекса 31 ТОТ с сохранением распределения пар, т.е. при т.н. «повороте» дуплекса относительно в-квадруплеса. При комбинировании дуплексного элемента N1)172 и двух типов элементов ЗІТСГ, а также при «повороте» только дуплексного или соединяющего элементов образуются более стабильные

Рисунок 11. Схематическое изображение трех типов элементов структуры на примере аптамера 31 ТйТ: №1 -О-квадруплекс, №2 - дуплекс, №3 - внутренние петли; стрелками показаны вариации структуры, исследованные в эксперг1менте.

й-квадруплексные структуры, однако другого типа — параллельные или смешанные О-квадруплексы (рисунки 12А, Б, В, Г). Вероятно, это происходит ввиду наличия в первичной структуре 6 гуанинов подряд. При одновременном «повороте» элементов №2 и №3 относительно й-квадруплекса этого не происходит. Согласно спектрам КД (рисунок 12Д, Е) формируется антипараллельный в-квадруплекс с термической стабильностью 40 °С. Таким образом, при комбинировании элементов структуры 31ТОТ и ]\[Ш72 для образования фармакофорной группы необходимо рассматривать соединяющий и дуплексный элементы структуры как неразделимый структурный модуль.

) А

А

240 260 280 ЗОО 320 340 36С длина волны, им

10 20 30 4D 50 60 70 Температура, °С

Рисунок 12. Спектры КД N7 (А), N9 (Б) и N3 (В) в буфере 20 мМ Tpuc-HCl. рН=7.5, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, в диапазоне температур от 5° С до 80° С с шагом 5° С; . Кривая КД-плавления (294 нм) N1 (Б), N2 (Г) и N3 (Е). Последовательность N7 5'-GTGAССТАGGTTGGTGTGGTTGGGGGGTCAС-3'. N9 5'-

САСТССССгОС'1'1СС,ТСТССТТССАУССЛСТС-3 7 N3 5-

ОТСАССООССТТССТСГСОГГОСАТСОТСАС-З \

III. В работе изучено влияние дополнительного структурного элемента, имеющего О-квадруплексный паттерн. Аптамер ЯА36 (5'-

ООТТОСТОТвОТТОСТООТТССТСТООТТОО-З''). имеет два й-квадруплексных паттерна 15ТСТ, которые соединены Т. Методом поверхностного плазмонного резонанса получены сенсограммы взаимодействия ЯА36 с иммобилизованным тромбином человека (рисунок 13). При сравнении рассчитанных кинетических констант можно сказать, что данный аптамер свзяывается с тромбином быстрее, чем 15ТСТ, и сопоставимо по скорости с 31 ТОТ (3,73*105 М*С"' против 7,06* 103 М*С"' и 9,96*105 М*С'\ соответственно).

Рисунок 13 Сенсограмма взаимодействия ЯА36 с иммобилизованным тромбином человека.

Структура ЯА36 описана методами КД и УФ-спектроскопии. Согласно спектрам КД (рисунок 14А), ЯА36 формирует антипараллельный мономолекулярный й-квадруплекс. Термическая стабильность О-квадруплексной структуры, согласно КД- и УФ-плавлениям, равна 30° С и 32,7° С, соответственно, что значительно ниже температуры плавления О-квадруплексов 15ТОТ и 31 ТОТ (39 °С). Таким образом, дополнительный в-квадруплексный паттерн не изменяет тип О-квадруплексной структуры, но уменьшает ее стабильность.

Рисунок 14 Спектры КД RA36 (А) и 15TGT (Б), буфер в буфере 20 мМ Трис-HCl, рН=7,5, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, в диапазоне температур от 5° С до 80° С с шагом 5° С; кривая КД-плавления (294 нм) RA36 (В) и 15TGT (Г)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Исходя из полученных в работе данных можно заключить, что фармакофорной группой, обуславливающей афинность ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека является мономолекулярный антипараллельный О-квадруплекс. G-квадруплекс ДНК-аптамера 15TGT по длине и составу петель является эффективным; но присоединением дополнительных структурных элементов и модулей можно варьировать его свойства. Так, например, присоединение взаимно комплементарных участков не влияет на термическую стабильность G-квадруплекса, однако увеличивает скорость связывания с тромбином за счет существования конформационного спектра молекул. Дополнительные к G-квадруплексу не комплементарные участки дестабилизирует G-квадруплекс при длине 5 нуклеотидов, а уже при длине 8 нуклеотидов делают сборку невозможной. Nul72 (как 31TGT) имеет участки, отвечающие за образование G-квадруплекса, дуплекса и соединение двух элементов структуры, однако у этого аптамера дуплекс не образуется и G-квадруплекс дестабилизирован дополнительными последовательностями. Элементы структуры модульных аптамеров являются взаимозависимыми. Наличие структурного паттерна в

первичной структуре не гарантирует образования соответствующей пространственной структуры в растворе.

ВЫВОДЫ.

1. Мономолекулярный антипараллельный G-квадруплекс с двумя петлями ТТ и петлей TGT является эффективным минимальным ДНК-аптамером к тромбину человека: изменения в структуре петель(С—>Т, Т—>G) приводят к снижению афинности к тромбину.

2. Присоединение взаимно комплементарных участков на 5'- и 3'- концы минимального квадруплекса приводит к формированию в 31-звенной аптамерной ДНК (31TGT) двух структурных элементов: дуплекса и G-квадруплекса.

3. Существование обоих структурных элементов у 31TGT взаимозависимо. Введение в структуру аптамера дуплекса не стабилизирует G-квадруплекс, но стимулирует его сборку; при этом наличие дополнительных комплементарных участков приводит к образованию ансамбля конформеров.

4. Наличие у 15TGT дополнительных некомплементарных участков с обоих концов G-квадруплексного паттерна дестабилизирует G-квадруплекс при длине 5 нуклеотидов, а при длине 8 нуклеотидов делает сборку невозможной. Поэтому наличие G-квадруплексного паттерна в первичной структуре не гарантирует образования такой структуры в растворе.

5. Nul 72 образует в растворе малостабильный G-квадруплекс, фланкирующие участки, несмотря на взаимокомплементарность, не образуют дуплекс. Поэтому наличие дуплексного паттерна в первичной структуре также не гарантирует образования такой структуры в растворе.

6. Наличие в первичной структуре блока из шести G подряд, перекрывающего все три элемента структуры модульного аптамера, дает возможность аптамеру образовывать спектр структур, отличных от мономолекулярного антипараллельного G-квадруплекса.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Dolinnaya N. G, Yuminova А. У.. Spiridonova V. A., Kopylov А. М. . Independent monitoring of G-quadruplex and duplex domains within the overall structure of 31-nt thrombin-binding aptamer. // Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2012 30(5):524-531.

2. Юминова А. В.. Спиридонова В. А., Арутюнян A.M., Копылов A.M. Изучение структуры ДНК-аптамеров к тромбину методом кругового дихроизма. // Доклады академии наук, 2012, 442(1):36-38.

3. Копылов А. М., Юминова А. В.. Головин А. В., Павлова Г. В. Комбинаторный способ получения ДНК-аптамерных тромбина и аптамерные олигонуклеотиды (варианты), патент №2013112680,22 марта 2013.

4. Alexey Kopylov, Elena Zavyalova, Andrey Golovin, Roman Reshetnikov, Ekaterina Lapsheva, Timur Turchaninov, Alina Yuminova. and Galina Pavlova Apta-minilego for thrombin inhibitors new insights into nano-module construction. // 5th International Conference on Drug Discovery & Therapy, 2013, Dubai, UAE P. 61.

5. Kopylov A. M., Golovin A., Reshetnikov R., Lapsheva E., Turchaninov Т., Yuminova A.. Zavyalova E. Modular construction of aptameric nanostructures: antithrombin aptamers. // 4th International Conference on Drug Discovery and Therapy, 2012, Dubai, UAE, P. 97.

6. Kopylov A. M., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov Т., Yuminova A.. Zavyalova E., Mudrik N., Panteleyev D., Pavlova G Anticoagulant activity of thrombinbinding DNA aptamers. // 9th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology, 2011, Shenzhen, China, P. 296.

7. Kopylov A., Khairulina, G, Yuminova, A..Reshetnikov. R., Zavyalova, E., Golovin A. Nucleic acids - protein recognition: what we have learned from aptamers, // The EMBO Meeting, 2011, Vienna, Austria, P. 23.

8. Юминова A.B. Аптамерные ингибиторы тромбина: описание кинетики взаимодействия с тромбином методом поверхностного плазмонного резонанса. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ, 2011, Москва, РФ. Р. 83.

9. Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Yuminova A., Zavyalova E., Spiridonova, V., Arutyunyan A. Studying of Structure and Function of Modular Thrombin Binding DNA Aptamers. // BIT's 8th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology, 2010, Beijing, China, P 464.

10. Yuminova AY. Golovin AV, Reshetnikov RV, Turchaninov TR, Spiridonova VA, Arutyunyuan AM, Kopylov AM, Modular constractions of thrombin binding DNA aptamer as molecular recognition nanoelement, // Abstracts of 3-th International Conference of nanoscience and nanotechnologies, 2010, Habana, Cuba. P. 213.

11. Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Yuminova A.. Spiridonova, V., Arutyunyan A. Structural studying of conformational interplay within two-module thrombin binding DNA aptamers. 34th FEBS Congress, 2010, Prague, Czech Republic, P 319-320.

12. Юминова A.B. Изучение структуры двухмодульного аптамера к тромбину методом кругового дихроизма. // Материалы докладов XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» МГУ, 2009, Москва, РФ. Р. 38.

13. Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Rassokhina О., Zavyalova E., Turchaninov T., Yuminova A.. Spiridonova V. and Arutyunyan A. Structural studying of G-quadruplex based thrombin binding DNA aptamers. // Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface, 2009, Manchester, UK P. 313.

14. Юминова A.B.. Спиридонова B.A., Арутюнян A.M. Аптамерные ингибиторы тромбина: изучение структуры методом кругового дихроизма. // Материалы Всероссийской школы-семинара для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы», 2008, Белгород, РФ. Р. 52.

Заказ № 112-Р/09/2013 Подписано в печать 24.09.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,0

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; е-таИ: info@cfr.ru

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет

Кафедра химии природных соединений

На правах рукописи

Юминова Алина Валерьевна

Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного

резонанса

диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

02.00.10 - биоорганическая химия

Научный руководитель^ проф., д.х.н. А.М. Копылов

Москва-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений..........................................................................5

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................6

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ТРОМБИН ЧЕЛОВЕКА И АПТАМЕРНЫЕ ИНГИБИТОРЫ..................................................8

I.I. Способы ингибирования коагуляционного каскада, применяемые в терапии...........................................................8

I.II. Основные препятствия в дизайне прямых ингибиторов тромбина............................................................................................9

I.III. Тромбин как мишень для антикоагулянтов в системе свертывания крови............................................................................11

I.IV. Строение тромбина человека........................................11

I.V. Получение аптамерных ингибиторов тромбина...............13

I.VI. Модифицированные аптамеры к тромбину......................15

I.VII. Пространственная структура аптамера 15TGT.............20

I.VIII. Структура комплекса аптамера 15TGT и тромбина человека..........................................................................27

I.IX. Ингибирование тромбина человека аптамером 15TGT в модельных системах и in vivo.............................................32

I.X. Влияние структуры петель на функцию и структуру аптамера 15TGT..............................................................36

I.XI. Влияние структуры 5'- или З'-концевого участка аптамера

на функцию и структуру 15TGT..........................................40

I.XII. Влияние структуры двух концевых участков аптамеров на функцию и структуру 15TGT............................................49

Глава II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. Изучение аптамерных ингибиторов тромбина методами спектроскопии кругового дихроизма и поверхностного плазмонного резонанса........61

II.I. Определение влияния структуры петель 15TGT на связывание с тромбином человека..............................................62

II.II. Дополнительные структурные модули................................71

Влияние двух дополнительных к G-квадруплексу комплементарных участков..................................................71

Кинетика связывания двух-доменного аптамера 31TGT с тромбином человека..........................................................74

Влияние на структуру двух дополнительных к G-квадруплексу некомплементарных участков....................78

Влияние длины двух дополнительных участков на структуру.....................................................................................78

Комбинирование элементов структуры аптамеров 31TGT и Nu 172..........................................................................................82

Влияние дополнительного участка, имеющего G-квадруплексный паттерн........................................................94

Глава III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..................................96

III.I. МАТЕРИАЛЫ.............................................................96

з

III.II. МЕТОДЫ.................................................................97

ЗАКЛЮЧЕНИЕ..................................................................................101

ВЫВОДЫ.................................................................................102

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................103

БЛАГОДАРНОСТИ......................................................................113

ДНК

КД

о.е.

осч

чда

РНК

РСА

ЯМР

G-квадруплекс

IU RU

SELEX

ТВА

ППР

вППР

FRET

TAMRA FAM

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

дезоксирибонуклеиновая кислота круговой дихроизм оптические единицы особо чистый чистый для анализа рибонуклеиновая кислота рентгеноструктурный анализ ядерный магнитный резонанс

неканоническая вторичная структура ДНК, обогащенной гуанином и способной образовывать структуры из двух, трёх или четырех цепей

international units (международные единицы активности) response units (единица изменения поверхностного плазмонного резонанса)

Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением)

thrombin-binding aptamer (тромбин-связывающий аптамер)

поверхностный плазмонный резонанс визуализация поверхностного плазмонного резонанса Fluorescence resonance energy transfer - резонансный перенос энергии флуоресценции Тетраметилкарбоксиродамин Карбоксифлуоресцеин

ВВЕДЕНИЕ

Тромбин - это фермент класса гидролаз, важнейший компонент системы свертывания крови человека и животных; в крови присутствует в виде неактивного предшественника протромбина и активируется протромбиназой (активным тромбопластином). Основная функция тромбина - превращение фибриногена в фибрин.

Тромбин - гликопротеид с молекулярной массой около 40000; содержит около 5% углеводов. Данный фермент относится к классу сериновых пептидаз (трипсин и другие). Он состоит из двух полипептидных цепей, соединенных дисульфидной связью: А-цепи и Б-цепи, которая формирует активный центр фермента и содержит углеводный компонент. Для него существует несколько активных форм, которые различаются конформацией Б-цепи.

В крови тромбин инактивируется антитромбинами плазмы: а2-макроглобулином, антитромбином III и гепарином. Специфический неплазменный ингибитор тромбина - полипептид гирудин, который содержится в слюнных железах медицинской пиявки. В последние годы был получен новый тип ингибиторов тромбина - ДНК-аптамеры. Аптамерами называют олигомеры нуклеиновых кислот, которые специфически связываются с заданной мишенью - будь то низкомолекулярные соединения или целые клетки.

Аптамерная ДНК dGGTTGGTGTGGTTGG (15TGT), ингибирующая тромбин, впервые была получена методом SELEX (1). В отличие от широко применяемых в настоящее время ингибиторов тромбина, таких как гепарин, 15TGT обладает низкой иммуногенностью и малым временем жизни в организме, что определяет возможность получения нового лекарственного препарата. 15TGT имеет структуру внутримолекулярного G-квадруплекса, образуемого двумя G-квартетами, находящимися в стэкинге и соединенными одной TGT-петлей и двумя ТТ-петлями (рисунок 1). G-квартеты состоят из четырех гуанинов, взаимодействующих по хугстиновскому типу. Кроме внутримолекулярных (мономолекулярных) G-квадруплексов, из двух или четырех молекул ДНК могут образовываться димерные или тетрамерные межмолекулярные комплексы. Тип G-квадруплекса может быть определен с помощью характеристических спектров кругового дихроизма.

Рисунок 1. Схематическое изображение структуры аптамера 15ТОТ: антипараллельный й-квадруплекс из двух О-квартетов, соединенных петлями Т3Т4,

ТуОзТд И Т12Т13.

Пространственная структура тромбин-связывающего аптамера может стать основой для разработки улучшенных ингибиторов тромбина с О-квадруплексной структурой фармакофора. В стадии клинических испытаний находится один аптамерный ингибитор тромбина - N11172, разработанный "АгсЬегтх" в 2007 году. Данный ДНК-аптамер также имеет в своей первичной структуре О-квадруплексный паттерн, однако структура его неизвестна. Более того, как было впервые показано в данной работе, наличие квадруплексного паттерна у N11172 не определяет автоматически образование квадруплексной структуры в растворе. Понимание причин, определяющих структуру и свойства аптамеров к тромбину, необходимо для эффективной разработки антикоагулянтных препаратов.

Целью настоящей работы является изучение структуры ДНК-аптамерных ингибиторов тромбина человека, имеющих в своей первичной структуре О-квадруплексный паттерн ОО^ОО^ОО^ОО, где N - любой нуклеотид, а х, у, ъ -количество нуклеотидов в петлях О-квадруплекса. Кроме изучения предполагаемого фармакофора - минимального ДНК-аптамера, соответствующего паттерну, необходимо было исследовать влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов структуры на стабильность О-квадруплексных аптамеров и кинетику связывания аптамеров с тромбином человека.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

• Исследовать структуру ДНК-аптамеров, имеющих в первичной структуре два паттерна: в-квадруплексный и дуплексный. Изучить условия существования в растворе структур, соответствующих этим паттернам.

• В условиях, когда одновременно существуют в-квадруплексный и дуплексный элементы структуры в растворе, изучить их взаимное влияние на структуру аптамера и способность связываться с тромбином человека.

• Количественно описать кинетику взаимодействия ДНК-аптамеров с тромбином человека с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса в двух вариантах.

• Изучить влияние дополнительных к фармакофорной группе элементов структуры на взаимодействие с тромбином человека.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ТРОМБИН ЧЕЛОВЕКА И АПТАМЕРИЫЕ ИНГИБИТОРЫ

1.1. Способы ингибирования коагуляционного каскада, применяемые в терапии

Заболевания, связанные с повышенной тромбообразующей активностью тромбина, являются основной причиной высокой смертности во всем мире (2). На данный момент, лечение в большей степени проводится непрямыми антикоагулянтами, стандартная терапия основана на парентеральных антикоагулянтах, таких как гепарин. Антикоагуляционный ответ на гепарин, однако, значительно различается у пациентов, так как гепарин имеет свойства связывать белки крови, что значительно усложняет подбор схемы лечения (3). Гепарины, т.е. гепарин/антитромбин комплексы, малоэффективны против тромбина, связанного с фибрином (4). Кроме того, гепарины

показывают снижение активности в области тромба, где наблюдается высокая концентрация тромбоцитарного фактора 4 (5). Формирование комплекса гепарин/тромбоцитарный фактор 4 может приводить к появлению неоантигенов на тромбоцитарный фактор 4, что, в конечном счете, ведет к развитию гепарин-индуцированной тромбоцитопении (6). С появлением низкомолекулярных гепаринов (НМГ), которые показывают меньший уровень связывания с белками плазмы, нежелательные побочные эффекты могут быть умеренными, хотя риск геморрагических осложнений недавно был отмечен для некоторых производных гепарина, таких как фондапаринукс (7). Применение антагонистов витамина К, таких как производное кумарина варфарин, является единственным рекомендованным подходом к оральным антикоагулянтам за последние 50 лет, хотя данные препараты имеют серьезные недостатки, такие как неспецифическое действие и трудно прогнозируемая фармакодинамика. Пациентам часто требуется постоянный лабораторный мониторинг, ввиду узкого терапевтического окна препарата, т.е. риска или тромботических осложнений, или кровотечения (8). Необходимость лабораторного мониторинга также возникает из-за различных взаимодействий лекарства с другими лекарствами и диетой, и позже осложнения возникают из-за медленного начала действия антикоагулянта (6, 8). Поэтому такие лекарства как варфарин обычно вводят вместе с парентеральными антикоагулянтами, по крайней мере, в начале терапии. Поскольку данные непрямые антикоагулянты, очевидно, имеют ряд серьезных недостатков, еще в середине 80-х была поставлена задача разработать новые, преимущественно пероральные, антикоагулянты, которые в частности могли бы заменить антагонисты витамина К.

1.11. Основные препятствия в дизайне прямых ингибиторов

тромбина

Ингибиторы прокоагулянтной активности тромбина, которые могут стать основой лекарства, должны удовлетворять ряду требований, помимо низкой константы скорости диссоциации комплекса ингибитора с тромбином. Низкие константы ингибирования не всегда приводят к эффективному действию антикоагулянта. В частности, значительное связывание ингибиторов с белками плазмы, как следствие гидрофобности молекулы ингибитора, увеличивает эффективную дозу ингибитора и, следовательно, ухудшает эффект антикоагулянта (9-12). Кроме того, связывание с

белками плазмы является фактором, определяющим фармакокинетику данного вещества, т.е. распределение и выведение вещества в организме человека. Быстрое выведение с помощью гепатобилиарной системы является недостатком многих ингибиторов тромбина (13). Параметры молекулы, влияющие на клиренс плазмы и экскрецию были исследованы для серии аналогов Ма-(2-нафтил-сульфонил-глицил)-DL-р-амидинофенилаланил-пиперидина (NAPАР, рисунок 2). Показано, что скорость выведения может быть значительно снижены за счет введения заряженных групп, например, наиболее выраженные отличия среди производных, содержащих карбоксильную группу, показали соединения, содержащие С-концевой незамещенный 4-амидинофенилаланин, структура приведена на рисунке 3 (14, 15).

амидинофенилаланил-пиперидина (NAPAP), прямого ингибитора активного сайта тромбина человека.

Рисунок 3. Структура NAPAP-аналога, скорость выведения которого почками в 4 раза меньше скорости выведения NAP АР.

Рисунок 2. Структура Ыа-(2-нафтил-сульфонил-глицил)-ОЬ-р-

nh2

I.III. Тромбин как мишень для антикоагулянтов в системе

свертывания крови

Различные участники коагуляционного каскада могут быть мишенями для действия новых антикоагулянтов. В настоящее время, антикоагулянты, находящиеся на испытаниях, действуют на такие мишени, как факторы Vila, IXa, Xa, Villa, Va и тромбин (16). Тромбин играет центральную роль в свертывании крови и по этой причине стал одной из самых популярных мишеней для открытия новых антитромботических агентов (17, 18). Прокоагулянтная активность тромбина заключается в расщеплении фибриногена до агрегирующего фибрина, активации связанного с фибрином фактора XIII, активации кофакторов V и VIII и даун-регуляцию фибринолиза путем генерации тромбин-активированного ингибитора фибринолиза (19, 20). Кроме того, тромбин опосредует активацию и агрегацию тромбоцитов, путем взаимодействия с рецепторами, которые активируются протеазами (21, 22). Однако, тромбин человека имеет и антикоагулянтную активность. В присутствии тромбомодулина и, особенно при низких концентрациях ионов натрия, он активирует протеин С (23, 24). Эта протеаза вместе с протеином S инактивируют факторы Va и Villa и, таким образом, даун-регулируют коагуляцию крови (25, 26). Из-за его центральной роли в регуляции коагуляции и гемостаза, тромбин считается идеальной мишенью для антикоагулянтной терапии, и в последние два десятилетия идет поиск малых молекул в качестве прямых ингибиторов тромбина (27-28).

I.IV. Строение тромбина человека

Тромбин - это трипсинподобная сериновая пептидаза, которая катализирует гидролиз фибриногена в фибрин, а также еще ряд реакций с другими мишенями. Почти без исключений он расщепляет пептидную связь только после остатка аргинина (таблица 1) (29). Тромбин человека состоит из двух полипептидных цепей: цепь А из 36 а. о. и цепь Б из 259 а. о., соединенных дисульфидными связями (рисунок 4). Как и другие сериновые пептидазы, тромбин содержит каталитическую триаду Asp 102, His57 и Serl95.

Рисунок 4. Структура молекулы тромбина: фиолетовым выделена А-цепь, розовым — Б-цепъ, голубым - экзосайт II, желтым - экзосайт I.

Особенностью тромбина является наличие дополнительной петли (ТугбОА, РгобОВ, РгобОС, ТгрбСЮ), которая отсутствует в других сериновых пептидазах и ограничивает доступ, как пептидных субстратов, так и ингибиторов в область активного сайта. Область активного сайта включает три отдельных «кармана». Специфичный карман 81 в тромбине содержит вверху остаток аспарагиновой кислоты Азр189, которая определяет сродство фермента к субстрату с основными остатками, такими как аргинин. В результате наличия вставки петли, соседний карман 82 обычно вмещает относительно небольшие и гидрофобные остатки субстрата. Дистальный карман, или арил-связывающий сайт (83/4) отделен от сайта 82 остатками Ьеи99,11е174 и Тг215, данный карман может вмещать гидрофобные и ароматические группы. Для взаимодействия с природными субстратами, такими как фибриноген или рецептор тромбина, также важны участки, далекие от области активного центра (29). В частности, экзосайт I, который расположен в 20 А от активного сайта и гепарин-связывающий экзосайт, каждый из которых формируется основными боковыми цепями лизина и аргинина, и вносит значительный вклад в специфичность и аффинность связывания субстрата (29, 30). В то время как связывание природных пептидных ингибиторов тромбина, таких как гирудин (31), ботрояроцин (32), триабин (33),

родниин (34), орнитодорин (35) и дипетолагостин (36) также включает связывание с экзосайтами, дизайн низкомолекулярных ингибиторов в основном направлен на связывание только с остатками в области активного сайта тромбина. Например, многие низкомолекулярные ингибиторы, такие как агротробан или мелагатран, содержат группы, имитирующие связывание аргинина в природном субстрате с Азр189 в кармане Б1.

Таблица 1. Сайты расщепления тромбином в пептидных субстратах.

Субстрат Сайт расщепления

N3 N2 N1 1 N'1 N'2 N'3

Фибриноген, а-цепь G V R G Р R

Фибриноген, Р-цепь S А R G Н R

Рецептор тромбина, подобный PARI D Р R S F L

Рецептор тромбина, подобный PAR3 Р I К т F L

Рецептор тромбина, подобный PAR4 А Р R G Y Р

Фактор II Т Р R S Е G

Фактор II N Р R т F G

Фактор V G I R S F R

Фактор V S Р R т F А

Фактор VII Q G R I V G

Фактор VIII Q I R S V А

Фактор VIII Е Р R S F S

Фактор XI к Р R I V G

Фактор XIII V Р R G V N

Протеин