Изучение ингибирования тромбина аптамерными олигонуклеотидами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ



На правах рукописи

Завьялова Елена Геннадиевна

ИЗУЧЕНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ ТРОМБИНА АПТАМЕРНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ

02.00.10 - биоорганическая химия

б и:ен ¿013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2013

005060976

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор

Копылов Алексей Михайлович

Официальные оппоненты"-

Банков Александр Андреевич, доктор химических наук, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», профессор.

Позмогова Галина Евгеньевна, доктор химических наук, Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России, профессор, заведующий лабораторией.

Ведущая организация- Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 25 июня 2013 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, НИИФХВ, ауд. 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан ÀPJ-ШЯ 2013 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Тромбин - ключевая пептидаза каскада свертывания крови, катализирующая гидролиз фибриногена до фибрина. Фибрин ассоциирует в фибриновые нити — каркас тромба. Избыточное тромбообразование приводит к сердечно-сосудистым заболеваниям с высокой смертностью и инвалидизацией, что обуславливает неугасающий интерес к антитромботическим препаратам, в частности, к ингибиторам тромбина.

Для клинического применения одобрены ингибиторы тромбина разной природы: полисахариды (гепарины), белки (гирудин, антитромбин III, бивалирудин) и пептидомиметики (аргатробан, дабигатран). Они обладают рядом недостатков^ гепарин вызывает геморрагические осложнения, а остальные не имеют «антидота», что осложняет корректировку неудачно подобранной дозы; белковые ингибиторы могут вызывать иммунный ответ.

Поиск безопасных антикоагулянтов привел к получению ингибитора тромбина на основе дезоксирибоолигонуклеотида — 15-ТВА (минимального фармакофора). Этот 15-мер образует G-квадруплексную структуру, которая связывается с фибриноген-связывающим сайтом (экзосайтом I) тромбина с кажущейся константой диссоциации 24 нМ и ингибирует свертывание крови in vitro-я in vivo. Однако, клиническое применение 15-ТВА ограничено его малым временем выведения - 5 минут! повышение массы олигонуклеотидов увеличивает этот параметр. Поэтому дополнительные элементы вторичной структуры к 15-ТВА могут улучшить его свойства: примеры более активных ингибиторов - аптамеры 31-ТВА и NU172. Низкая токсичность и иммуногенность, возможность масштабного химического синтеза и направленной модификации, наличие «антидота» (комплементарной последовательности) - это преимущества нового поколения ингибиторов тромбина.

Поскольку гидролиз низкомолекулярных субстратов не ингибируется лигандами к экзосайтам тромбина, кинетика ингибирования аптамерами не изучена. Потому представляется актуальной разработка метода, основанного на гидролизе фибриногена, для изучения эффективности и механизма действия аптамеров. Изучение кинетики ингибирования тромбина серией аптамеров позволит выяснить роль дополнительных элементов вторичной структуры,

оптимальные условия для образования G-квадруплексного фармакофора, механизмы ингибирования и исследовать действие «антидота».

Цель и задачи исследования. Цель - изучение кинетики ингибирования тромбина аптамерами в сравнении с известными ингибиторами, выявление механизма и детерминант ингибирующей активности.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. Разработать метод, основанный на гидролизе фибриногена тромбином, для изучения аптамеров к тромбину.

2. Верифицировать метод на хорошо изученных ингибиторах тромбина.

3. Сравнить ДНК- и РНК-аптамеры с известными ингибиторами.

4. Выявить влияние катионов и дополнительных элементов вторичной структуры на активность фармакофора.

5. Изучить особенности ингибирования тромбина аптамерами в биологических жидкостях in vitro и in vivo.

Научная новизна и практическая значимость работы. Обзор литературы показал, что тромбин-катализируемый гидролиз фибриногена может быть основой эффективного метода оценки ингибиторов тромбина, включая аптамеры. Изучение гидролиза фибриногена несколькими методами — разделение фибринопептидов, исследование фибриновых ассоциатов, получение турбидиметрических кривых и теоретическое моделирование реакции - показало, что поставленная задача может быть реализована турбидиметрическим методом при условии его параметризации. Показано, что параметр / /тах (где Wmax - максимальная скорость прироста мутности

раствора, a fmax - соответствующее время) пропорционален активности тромбина. Метод позволяет охарактеризовать все классы ингибиторов тромбина, а также ингибиторы ассоциации фибрина. Полученные данные согласуются с данными других методов, а данные о типах ингибирования существенно углубляют понимание механизмов ингибировании гидролиза для низко- и высокомолекулярных субстратов.

Впервые изучено ингибирование тромбина аптамерами. ДНК-аптамеры отличаются от РНК-аптамера к экзосайту II тромбина по типу ингибирования (полное vs неполное ингибирование). В аптамерах 31-ТВА, NU172 и RA-36 дополнительные элементы вторичной структуры к G-квадруплексному

фармакофору уменьшают константу ингибирования и определяют тип ингибирования. Высокая активность аптамеров определяется сочетанием элементов: петли с фармакофором (NU172) либо петли и дуплекса (31-ТВА). Для нового аптамера RA-36, показано, что он содержит два G-квадруплексных фармакофора с разной функциональной активностью.

Определены оптимальные условия образования фармакофорного G-квадруплекса. Конформационная подвижность G-квадруплекса необходима для его ингибирующей активности.

Аптамеры 15-ТВА и RA-36 конкурируют за сайт связывания с гиругеном — пептидом, аффинным к фибриноген-связывающему сайту (экзосайту I) тромбина. 15-ТВА выступает активатором в гидролизе тромбином низкомолекулярного субстрата. В присутствии 15-ТВА и гиругена наибольшая активация достигается для частично деструктурированного тромбина (без натрия и с дитиотреитолом).

Видоспецифичность аптамеров определяется в большей мере дополнительными элементами вторичной структуры, чем фармакофором. Аффинность аптамеров к проформе тромбина — протромбину - также определяется дополнительными элементами вторичной структуры и падает в ряду NU172 - 31-ТВА - 15-ТВА - RA-36. Для RA-36 исследовано действие антидота (комплементарного олигонуклеотида), установлена стехиометрия 1:1. RA-36 был исследован при внутривенном, подкожном и внутримышечном введении крысам, показано сохранение активности in vivo и увеличение времени выведения по сравнению с 15-ТВА более чем в 3 раза.

Полученные в настоящей работе данные позволяют понять, как аптамеры ингибируют тромбин, и как можно их улучшить. Разработанный метод позволил изучить специфичность и видоспецифичность аптамеров. Работа дает уникальную возможность изучения аптамеров к тромбину, а также проясняет некоторые аспекты механизмов ингибирования и активации фермента.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в международных периодических изданиях, получен 1 патент. Результаты были представлены на конференциях «Ломоносов-2010» (Москва, Россия, 2010 г.), «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, Россия, 2010 г.), «V Всероссийская конференция по клинической

гемостазиологии и гемореологии» (Москва, Россия, 2011 г.), «XVIII Всероссийский национальный конгресс «Человек и Лекарство» (Москва, Россия, 2011 г.), «Ломоносов-2011» (Москва, Россия, 2011 г.), «60th International Congress of the European Society for Cardiovascular and Endovascular Surgery» (Москва, Россия, 2011 г.), «XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Hemostasis» (Киото, Япония, 2011 г.), «17th Congress of European Hematology Association» (Амстердам, Нидерланды, 2012).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 195 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы (посвящен ингибиторам тромбина), обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 84 рисунками и 23 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 295 цитированных работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка и обоснование метода определения активности тромбина

Для изучения кинетики ингибирования тромбина используется два подхода: изучение гидролиза низкомолекулярного субстрата (хромо- или флуорогенного) и фибриногена (по отщепленным фибринопептидам). Первый подход не позволяет оценить эффективность ингибиторов, влияющих не на активный сайт тромбина, а на связывание фермента с фибриногеном, происходящее дистально. Второй подход основан на гидролизе фибриногена и более полно характеризует функцию тромбина in vivo.

В данной работе разработан новый метод определения активности тромбина, удобный для скрининга ингибиторов, для определения констант и типов ингибирования. Метод основан на изучении кинетики ассоциации фибрина, образующегося при гидролизе фибриногена. Для обоснования метода проведено разделение фибринопептидов, исследование фибриновых ассоциатов, получение турбидиметрических кривых и теоретическое моделирование реакции. На рис. 1А приведено сопоставление нормализованных экспериментальных данных, которые пропорциональны друг другу согласно проведенному теоретическому моделированию: квадрат диаметра фибрилл, квадрат концентрации фибринопептида А и мутность образца. Можно

утверждать, что мутность образца пропорциональна квадрату глубины реакции, а значит квадрату концентрации тромбина. Поскольку активна лишь часть фермента, то правильнее говорить об определении активности тромбина.

Впервые осуществлена параметризация турбидиметрической кривой! показано, что теоретически предсказанный параметр / /тах (где -

максимальная скорость прироста мутности раствора, а /тах - время, соответствующее ) пропорционален количеству единиц активности

тромбина (рис. 1Б). Для изучения ингибиторов введен коэффициент ингибирования 1С равный отношению параметра / смеси без

ингибитора к параметру -у/И^ / /т1Х смеси с ингибитором. 1С показывает во сколько раз уменьшилась активность тромбина.

Время, мин Активность тромбина, Ю

Рис. 1. А — нормализованные значения квадрата диаметра фибрилл (♦), квадрата концентрации фибринопептида А (А) и мутности образца (линия); Б -линейная аппроксимация зависимости коэффициента ингибирования от активности тромбина в образце.

В координатах 1С от общей концентрации ингибитора С;° основные типы ингибирования можно описать следующим образом^ ■ полное конкурентное ингибиронание- 1С = 1 + 0 С? ;

- полное неконкурентное ингибирование: 1С = 1 + К ¡Сп, I

1 4- К С0

- частичное неконкурентное ингибиронание: ¡с = ;

1+рк,сЧ

где с", и С" ■ концентрации ингибитора и субстрата, а к^ и - константы ассоциации комплексов тромбин-ингибитор и тромбин-фибриноген.

2. Верификация турбидиметрического метода

Для верификации турбидиметрического метода определены типы и константы ингибирования для известных ингибиторов тромбина, проведено сравнение с данными литературы.

В табл. 1 полученные результаты сравниваются с данными литературы для ингибиторов активного сайта, экзосайта I, экзосайта II, активного сайта и экзосайта I, активного сайта и экзосайта II тромбина, а также ингибитора ассоциации фибрина: новый метод позволяет охарактеризовать все классы ингибиторов. Определенные константы ингибирования согласуются с данными других методов^ константами связывания и константами ингибирования гидролиза низкомолекулярных субстратов тромбина. Данные о типах ингибирования существенно углубляют понимание механизмов ингибировании гидролиза для низко- и высокомолекулярных субстратов. Так, низкомолекулярные ингибиторы РРАСК, аргатробан и бивалирудин являются конкурентными ингибиторами в амидолитических тестах и не конкурируют с фибриногеном. Напротив, белковые ингибиторы — гирудин и антитромбин III — конкурируют с фибриногеном. Эти результаты можно объяснить тем что фибриноген-связывающий сайт удален от активного центра. Поскольку площадь контакта тромбина с фибриногеном велика, то предотвратить связывание могут только ингибиторы со сравнимой площадью контакта.

3. Изучение турбидиметрическим методом аптамеров

Кинетика ингибирования тромбина ДНК- и РНК-аптамерами не была изучена ранее, показано только их ингибирующее действие на свертывание крови. Причина этому — аптамеры не ингибируют гидролиз низкомолекулярных субстратов. В данной работе турбидиметрическим методом впервые изучено ингибирование тромбина аптамерами, структуры которых изображены на рис. 2. в-квадруплексные ДНК-аптамеры отличаются от РНК-аптамера ToggIe-25t по типу ингибирования: полное и неполное,

Таблица 1

Константы и типы ингибирования, определенные турбидиметрическим

методом, и их сравнение с данными литературы

Сайт связывания Ингибитор Кажущаяся константа ингибирования Тип ингибирования Кажущиеся константы из данных литературы

Активный сайт тромбина Арга-тробан К, =6,4±0,5 нМ полное неконкурентное К^=5,0 ±0,3 нМ (внутренняя флуоресценция тромбина) К,= 19±2 нМ (амидолитическая активность)

РРАСК К?ф= 20,8 ±1,4 нМ полное неконкурентное ЛГ, =24-45 нМ кса1=0,25±0,12-е"1 (амидолитическая активность)

Экзосайт I тромбина Гируген К, =1,50 ±0,06 мкМ полное неконкурентное К, =0,10-3,2 мкМ (внутренняя флуоресценция тромбина) К, = 0,76 ±0,06 мкМ (амидолитическая активность)

Сульфо-гируген К, =0,35 ±0,08 мкМ Р=0,22±0,07 неполное неконкурентное К, =0,025-0,038 мкМ (внутренняя флуоресценция тромбина) К,= 0,54-0,64 мкМ (гидролиз фибриногена)

Экзосайт I и активный сайт тромбина Бивали-рудин К, =1,75 ±0,04 нМ полное неконкурентное К, =0,3-6 нМ ^„,=0,3-0,7 мин"1 (амидолитическая активность)

Гирудин рекомби-нантный К, =0,9 ±0,7 пМ полное конкурентное а:, =0,18-0,45 пМ (амидолитическая активность, в 0,14 ИаС1)

Экзосайт II тромбина Гепарин К, =2,65±0,14 мкМ Р=0,7±0,2 неполное неконкурентное Ка =1,4-3,9 мкМ (аффинность)

К, =4,80±0,10 мМ полное неконкурентное Нет данных

Экзосайт II и активный сайт тромбина Антитромбин III и гепарин /С50 =1,40±0,10 нМ к =1-10' КГ'мин' cal полное конкурентное кса =0,66±1,68-10' АГ'лшн"' (амидолитическая активность)

Ингибитор ассоциации фибрина GPRP- пептид /С50 =27±2 МКМ «полное конкурентное» =18-20 мкМ (аффинность)

Toggle-25t

A U

К A

G31

С1 ТЗО

А2 G29

СЗ А28

Т4 С27

G5 С26

G6 Т7 G25 G 24

А8 , 39 ' ЛШ

Qt8

T21 T20 T19* - "G18 . . '

TÏf -T12 T9- 'НО

31-TBA NU 172 RA-36

Рис. 2. Структуры РНК-аптамера Toggle-25t и ДНК-аптамера 15-ТВА, а также предполагаемые структуры ДНК-аптамеров 31-TBA, NU172 и RA-36.

соответственно (табл. 2). Тип ингибирования коррелирует с природой сайта связывания (по данным РСА): РНК-аптамер Toggle_25t связывается с экзосайтом II тромбина, а ДНК-аптамер 15-ТВА - с экзосайтом I (фибриноген-связывающим сайтом). Toggle-25t аллостерически изменяет взаимодействие тромбина с фибриногеном, приводя к неполному ингибированию, а 15-ТВА ингибирует реакцию полностью.

Поскольку ДНК-аптамеры 31-TBA, NU172 и RA-36 представляют собой G-квадруплекс с дополнительными элементами вторичной структуры, предполагается, что их сайт связывания идентичен сайту связывания 15-ТВА (экзосайт I). В табл. 2 приведены константы и типы ингибирования аптамеров. Дополнительные элементы вторичной структуры приводят к уменьшению константы и изменению типа ингибирования. Уменьшение константы можно объяснить взаимодействиями между дополнительными элементами вторичной структуры и ферментом или изменением структуры G-квадруплекса.

Таблица 2

Константы и типы ингибирования тромбина РНК- и ДНК-аптамерами, определенные турбидиметрическим методом

Аптамер Тип ингибирования Кажущаяся константа ингибирования, нМ

Toggle-25t неполное неконкурентное Р=0,33±0,08 10±3

15-ТВА полное неконкурентное 14,7±1,0

31-ТВА полное конкурентное 0,34±0,10

NUI 72 полное конкурентное 0,29±0,06

RA-36 полное неконкурентное 7,3±0,2

Изменение типа ингибирования обусловлено природой дополнительных элементов вторичной структуры: дуплекс и внутренняя петля 31-ТВА и NU172 дают конкурентное ингибирование, а G-квадруплекс RA-36 - неконкурентное. Решетниковым и Головиным методами молекулярной динамики получены модели RA-36 и 31-ТВА. Их совмещение с 15-ТВА в комплексе с тромбином, а также совмещение тромбинов в комплексах с 15-ТВА и фибриногеном представлено на рис. 3. В гипотетическом тройном комплексе аптамер-тромбин-фибриноген в случае 31-ТВА наблюдается перекрывание дуплекса аптамера с альфа-спиралями фибриногена, в то время как G-квадруплекс RA-36 направлен в другую сторону.

4. Поиск элементов структуры 31-ТВА и NU172, определяющих их ингибирующий потенциал

Для выяснения роли дополнительных элементов вторичной структуры в высокой активности аптамеров 31-ТВА и NU172, а также возможности комбинирования элементов структуры при конструировании ДНК-ингибиторов структура этих аптамеров (рис. 2) условно разбита на три части:

31-ТВА C1-G6; C26-G31 Т7; А8; G24; G25 G9-G23

дуплекс петля квадруплекс

NUI72 С1-С4; G23-G26 Т5;А6;Т22 G7-G21

Рис. 3. Совмещение моделей аптамеров 31-ТВА (розовым) и 11А-36 (синим) со структурами комплексов 15-ТВА-тромбин (рс!Ь 1(1 1НАО) и тромбин-фибриноген (рс!Ь id 2А45). Тромбин — зеленым, фрагмент фибриногена - желтым.

8 вариантов аптамеров, содержащих все возможные комбинации этих элементов, получены и исследованы турбидиметрическим методом и в коагуляционных тестах (табл. 3, рис. 4).

Таблица 3

Результаты анализа комбинированных аптамеров турбидиметрическим

методом и коагуляционными тестами

Шифр Тип ингибирования Кажущаяся константа ингибирования, нМ Удвоение тромбинового времени, мкМ Удвоение протром-бинового времени, мкМ

Ш конкурентный 0,34±0,10 0,25 2,1

¡аа неконкурентный 1,34±0,05 0,8 1,5

.¡.¡а конкурентный 1,2±0,3 0,5 2,2

а.М неконкурентный 48,6±0,2 2,2 >5

ая\ неконкурентный 13,4±1,8 0,6 5

а ¡а неконкурентный 13,2±1,6 1,0 >5

неконкурентный 14,2±0,7 0,5 4

ааа конкурентный 0,29±0,06 0,8 1,3

Шифр аптамера - запись дуплекса-петли-квадруплекса: ] - 31-ТВА, а — N11172.

80

5

Ф

о.

О 60 0) о ш

0

1

ю 5 О а к о о.

с

40

20

- ф »

X ■

1 ♦

1 2 3

Аптамер, мкМ

*

£

<з ▼

■ 31-ТВА

• ¡аа

А На

Г Щ

О аа]

< а]а

► т

▲ Ми 172

Рис. 4.

Активность комбинированных аптамеров в ко агуляционном тесте

протромбинового времени.

Только 2 из 6 комбинированных аптамеров сохранили высокую активность: N11172 с заменой дуплекса (¡аа) и 31-ТВА с заменой фармакофора (па). Конкурентный тип ингибирования, характерный для 31-ТВА и N11172, сохраняется в аптамере ]аа, но не в ^а. Активность фармакофора действительно модулируется дополнительными элементами вторичной структуры. Высокая ингибирующая активность фармакофора сохраняется при добавлении петли и дуплекса от 31-ТВА или в сочетании петли и фармакофора N11172. Несмотря на близость констант ингибирования ферментативной реакции, 31-ТВА и N11172 значительно различаются по ингибированию свертывания плазмы крови. Это различие также определятся не фармакофором, а сочетанием петель с дуплексом или фармакофором: активность аптамеров падает в ряду хаа > ^х > остальные (рис. 4).

Структура другого аптамера, ИА-Зб, может иметь два й-квадруплекса, соединенных тимидином (рис. 2). Теоретически, оба квадруплекса могут быть фармакофорами. Для выяснения свойств фармакофоров ИА-36 были изучены укороченные варианты ИА-36: фрагмент (2-31) - без и фрагмент (1-30) - без С31, для которых невозможна сборка одного из й-квадруплексов. Турбидиметрическим методом показано, что эти фрагменты ЫА-Зб ингибируют тромбин, но с меньшей эффективностью (табл. 4). При этом фрагмент (1"30) активнее фрагмента (2-31). Коагуляционными тестами были изучены более

Таблица 4

Результаты анализа ИА-Зб и его фрагментов турбидиметрическим и

коагуляционными тестами

Аптамер Тип ингибирования Кажущаяся константа ингибирования, нМ Концентрация удвоения тромбинового времени, мкМ Концентрация удвоения протромбинового времени, мкМ

ЯА-36 неконкурентный 7,3±0,2 0,4 3,0

фрагмент (2-31) неконкурентный 16,7±0,2 0,6 >4

фрагмент (1-30) неконкурентный 11,6±0,4 0,4 3,8

короткие фрагменты: (2-30), (3-31), (4-31), (1-29) и (1-28) (рис. 5). Фрагмент без первого и последнего гуанинов не обладал активностью. Остальные фрагменты менее активны, чем ИА-Зб, причем З'-делеции активнее 5'-делеций, как и в ферментативных тестах. По-видимому, ИА-Зб содержит два функционально неравнозначных в-квадруплексных фармакофора.

5. Активность ДНК-аптамеров в присутствии разных стабилизирующих

катионов

Известно, что О-квадруплексы в растворе стабилизируются одно- и двухвалентными катионами. Для правильной сборки ДНК-аптамеры подвергают преформированию: кратковременно нагревают до 95°С для разрушения структуры, затем охлаждают в присутствии соли для сборки

30 -|

о

| 25-ф

о. о ш

0

§ 20-

1

ю

2 О

е-15-

о о. с

ю4-о

1 О %

★

< I

КА-36

• • (2-31) КА-36

▲ (3-31) КА-36

▼ (4-31) КА-36

О (1-30) КА-36

* < (1-29) КА-36

> (1-28) КА-36

* (2-30) КА-36

Рис. 5.

Эффективность серии фрагментов КА-36 в

коагуляционном тесте

протромбинового времени.

Аптамер,

мкМ

правильной структуры. В ряде работ, например Cho et al. (2008) и Rache et al. (2012), получен следующий ряд стабильности G-квадруплексных структур с разными катионами: Na+<K+<Ba2+.

В данной работе проведен подбор условий для преформирования аптамеров 15-ТВА, 31-ТВА и RA-36 (данные для 15-ТВА на рис. 6). 15-ТВА без преформирования медленно увеличивает свою ингибирующую активность при 37°С в буфере 20 мМ Трис-НС1, 140 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 1 СаСЬ. Преформирование в растворах NaCl или KCl также значительно увеличивает ингибирующую активность, в то время как катионы бария приводят к ухудшению и полной потере ингибирующей активности аптамера. Таким образом, ряд ингибирующей активности противоположен ряду стабильности: Na+>K+>Ba2+.

Хотя 15-ТВА, 31-ТВА и RA-36 имеют единый фармакофор, оптимальные условия их сборки несколько различаются за счет влияния дополнительных элементов вторичной структуры. Так для 31-ТВА и RA-36 оптимально преформирование в KCl. В отличие от 15-ТВА, аптамеры 31-ТВА и RA-36 значительно менее эффективны при преформировании в 1-100 мМ растворах NaCl. Катионы бария ухудшают ингибирующую активность всех трех аптамеров.

Таким образом, в работе впервые показано, что только ограниченная стабилизация G-квадруплекса приводит к увеличению ингибирующей активности аптамеров: катион бария, сильнее всего стабилизирующий G-квадруплексы, снижает активность аптамеров.

б. Конкуренция аптамеров с гиругеном за связывание с тромбином

Как следует из табл. 1, ближайшим функциональным аналогом G-квадруплексных аптамеров является гируген — пептид, связывающийся с экзосайтом I тромбина. В данной работе впервые показана неаддитивность ингибирования тромбина смесью гиругена и 15-ТВА, что указывает на конкуренцию за связывание с тромбином между ними (рис. 7). Аналогичные данные получены для аптамера RA-36, в то время как с 31-ТВА конкуренция не наблюдалась.

о

16 14 12 10 8 6 4 2

ОН

15-

12

О

9-

6-

3-

■ Вода

1 час в буфере, 37°С

I

1

0 20

■ ОмМК*

♦ 1 мМ К*

< 10 мМ К*

100 мМК*

60

80

15-ТВА, нМ

I

I ♦

[

т <

I

о

100 120

♦

!

14 12 10 8 64 2 0

ш 0 мМ N8*

А 0,01 мМ N8*

• 0,1 мМ N8*

♦ 1 мМ Ыа*

10 мМ N3*

► 100 мМ Ыа*

12-

10

8-

О 6

41

II

20

40 60 80 15-ТВА, нМ

■ 0 мМ Ва2*

▲ 0,01 мМ Ва2*

• 0,1 мМ Ва2*

♦ 1 мМ Ва2*

-4 10 мМ Ва2*

> 100 мМ Ва2*

-4

20

40

100

120

20

100 120

40 60 80 15-ТВА, нМ

■4

100

120

60 80 15-ТВА, НМ

Рис. 6. Ингибирующая активность 15-ТВА после преформирования с разными катионами.

.1!

й §

а

* I

10

й $

I

I

5

20

30

40

15-ТВА, нМ

■ 0 мкМ О 1,4 мкМ ▲ 2,5 мкМ Т 4 мкМ

50

60

Рис. 7.

Неаддитивность ингибирования тромбина смесью 15-ТВА и гиругена (концентрация гиругена приведена в подписи к рисунку). Данные нормированы на образец с гиругеном, но без 15-ТВА.

7. Аллостерическая активация тромбина гиругеном и 15-ТВА

Ранее было показано, что гируген активирует тромбин по отношению к некоторым низкомолекулярным субстратам. В данной работе впервые показано, что 15-ТВА в отсутствие катионов натрия активирует тромбин с кажущейся константой 210±50 нМ и степенью активации В=1,33±0,05. Для выяснения природы этого явления исследовали ингибирование разных форм тромбина: окисленной (5 мМ Н2О2) и частично восстановленной форм (5 мМ ДТТ), В-тромбина (расщепленного в экзосайте I) и у"тРомбина (расщепленного в экзосайте I и 148-ой петле). Часть результатов представлена на рис. 8. Впервые показано, что 15-ТВА сильнее активирует частично восстановленную форму а-тромбина. Т.е. именно конформационная подвижность а-тромбина позволяет ингибитору оптимально связаться с ферментом. В то время как конформация 6-и у"Ф°Рм тромбина может быть слишком лабильна, поэтому их активация незначительна.

140 мМ №С1 О мМ ЫаС!

3 4 5 15-ТВА, мкМ

140 мМ ЫаС1 О мМ №С1

*

10 15 20 15-ТВА, мкМ

25

30

15 20 15-ТВА, мкМ

Рис. 8. Аллостерическая активация аптамером 15-ТВА тромбина в гидролизе низкомолекулярного субстрата пептидомиметика 8-2238: А -а-тромбин, Б — тромбин в 5 мМ дитиотреитоле, В — тромбин в 5 мМ перекиси водорода.

8. Эффективность ингибирования тромбинов животных ДНК-аптамерами к тромбину человека

Высокая специфичность аптамеров к тромбину человека приводит к сложностям при выборе адекватной животной модели тромбоза для испытаний in vivo. В данной работе детально исследовано ингибирование тромбинов из разных источников аптамерами 15-ТВА, 31-ТВА и RA-36 (табл. 5). Показано, что дополнительные элементы вторичной структуры, способствующие ингибированию тромбина человека, могут ухудшить ингибирование тромбинов животных. С другой стороны, всего одна замена в экзосайте I тромбина может привести к смене типа ингибирования, если сравнить тромбин мыши с тромбином крысы. Наиболее ярко видоспецифичность проявляется для тромбина кролика: он плохо ингибируется аптамерами, что коррелирует с его существенной дивергенцией относительно тромбина человека. Ингибирующая активность аптамеров также исследована в коагуляционных тестах на плазмах крови человека и животных, где как и для турбидиметрического метода была показана видоспецифичность, концентрационные эффекты и влияние отдельных компонентов плазмы крови некоторых животных.

Таблица 5

Ингибирование тромбинов из разных источников ДНК-аптамерами

15-ТВА 31-ТВА RA-36

Тромбин человека 14,7 ± 1,0 0,34±0,10 7,3 ± 0,2

Тромбин быка 14,3 ± 0,8 13,9 ± 1,6 12,5 ± 1,1

Тромбин свиньи 17,2 ± 0,9 7,3 ±0,5 5,1 ± 0,3

Тромбин кролика 182 ± 16 3200 ± 300 480 ± 60

Тромбин крысы 16,7 ± 1,7 2,4 ± 0,4 2,3 ±0,3

Тромбин мыши 26 ±2 1,14 ± 0,18 4,4 ± 0,4

Кажущиеся константы ингибирования приведены в нМ, конкурентный тип ингибирования выделен серым фоном, неконкурентный — белым.

9. Определение аффинности аптамеров к протромбину

Для аптамера N11172 обнаружена нелинейная зависимость эффекта на плазме крови человека от концентрации аптамера (рис. 4). Поэтому

предположили, что этот эффект может быть обусловлен связыванием аптамера с проформой тромбина - протромбином, который присутствует в крови человека в высокой концентрации (2 цМ) и частично превращается в тромбин после инициации каскада свертывания крови. Известно, что минимальный фармакофор 15-ТВА связывается с протромбином в 2,6 раза хуже, чем с тромбином: Kd=86 нМ против 24 нМ по данным Kretz et al. (2006).

В данной работе показано, что турбидиметрическим методом можно оценить константы диссоциации комплексов протромбина с аптамерами. Добавление протромбина не влияет на скорость гидролиза фибриногена, но уменьшает эффективность ингибирования тромбина аптамерами 15-ТВА, 31-ТВА, NU172 и RA-36. Кажущиеся константы диссоциации комплексов протромбин-аптамер составляют: 6,0±1,0 нМ для NU172, 68±5 нМ для 15-ТВА, 52±4 нМ для 31-ТВА, 450 нМ для RA-36. Вероятно, именно высокая аффинность NU172 к протромбину определяет экспоненциальный характер кривых в коагуляционных тестах (рис. 4). Аптамер RA-36 обладает наименьшей кросс-специфичностью.

Одним из достоинств аптамеров является возможность использования антидота - комплементарного олигонуклеотида, разрушающего третичную структуру аптамера, формируя классический дуплекс, что инактивирует аптамер. В данной работе показано что аптамер ИА-Зб взаимодействует с антидотом достаточно быстро, в результате чего полностью теряет ингибируюшую активность. Стехиометрия комплекса близка к 1:1 (рис. 9).

10. Изучение действия антидота к RA-36

5 п

3 -

О

- 2 -

4

II

Рис. 9.

Инактивация аптамера RA-36

комплементарным

олигонуклеотидом:

1 Л

к

1

I

А - антидот, ■ - антидот

0

и 10 нМ RA-36.

О 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Стехиометрия антидот: RA-36

11. Исследование активности аптамеров in vivo

Активность аптамера RA-36 проверяли при внутривенном, подкожном и внутримышечном введении крысам. Аптамер активен in vivo при дозах 0,77-3,4 мг/кг и имеет большее время полувыведения при внутривенном введении (рис. 10) по сравнению с фармакофором, 15-ТВА: с 3 до 7 минут. Подкожное и внутримышечное введение аптамера требует больших доз (14-35 мг/кг), но обеспечивает более медленное выведение: время падения активности на 1/2 плато - около 100 минут. Рассчитанная биодоступность составила от 80 до 100% введенного аптамера.

160

of 20

S

<в

CL

CÜ

Z 80

о ш

0

1 40

о о.

♦ 0,77 мг/кг

■ 1,7 мг/кг

1 3.4 иг/кг

-Контроль

5 10 15 20

Время после введения, мин

25

Рис. 10.

Ингибирование свертывания плазмы крови крыс при внутривенном введении разных доз аптамера ИА-Зб.

ВЫВОДЫ

1. Предложен новый метод определения констант и типа ингибирования тромбина, основанный на измерении светорассеяния ассоциатов фибрина. Этим методом охарактеризованы все классы ингибиторов тромбина: не только ингибиторы активного сайта, но и ингибиторы связывания белковых субстратов — гируген и аптамерные олигонуклеотиды.

2. Впервые получены кинетические характеристики ингибирования тромбина различными аптамерами, содержащими фармакофор и дополнительные структурные элементы. Тип ингибирования определяется как сайтом связывания аптамера, так и дополнительными элементами вторичной структуры ингибиторов.

3. Согласно данным экспериментов in vitro и in vivo высокая видоспецифичность ДНК-аптамеров к тромбину человека обусловлена

комбинацией G-квадруплексного фармакофора и дополнительных элементов структуры аптамеров.

4. Эффективность ингибирования и активации тромбина аптамерами определяется конформационной подвижностью как аптамера, так и тромбина.

5. Несмотря на различную химическую природу, гируген и ДНК-аптамер 15-ТВА конкурируют за связывание с тромбином по экзосайту I, ингибируют гидролиз фибриногена по одному типу и одинаково активируют гидролиз низкомолекулярного субстрата тромбина.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Golovin А.V., Kopylov A.M., Reshetnikov R.V., Zawalova E.G.. Pavlova G.V., Babiy V.E. Antithrombin aptamers and a method of their structure stabilization. Patent PCT WO 2011/075004 Al, December 13, 2010.

2. Zawalova E.. Golovin A., Reshetnikov R., Mudrik N., Panteleyev D., Pavlova G., Kopylov A. Novel modular DNA aptamer for human thrombin with high anticoagulant activity. // Curr. Med. Chem., 2011, V. 18, No. 22, P. 3343-3350.

3. Zawalova E.. Golovin A., Timoshenko T., Babiy A., Pavlova G., Kopylov A. DNA aptamers for human thrombin with high anticoagulant activity demonstrate target-and species-specificity. // Curr. Med. Chem., 2012, V. 19, No. 30, P. 5232-5237.

4. Завьялова Е.Г. Новый взгляд на кинетическую схему расщепления фибриногена тромбином. // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Химия живых систем, нанобиоматериалы и нанобиотехнологии, 2010, Москва, Россия, С. 1.

5. Завьялова Е.Г.. Сушко А.Д., Копылов A.M., Яминский И.В. Изучение структуры ассоциатов фибрина. // Сборник тезисов 4ой Международной конференции Современные достижения бионаноскопии, 2010, Москва, Россия, С. 26.

6. Завьялова Е.Г.. Решетников Р.В., Головин А.В., Пантелеев Д.Ю., Мудрик Н.Н., Павлова Г.В., Копылов A.M. Исследование антикоагулянтной активности ДНК-аптамеров in vitro и in vivo. // Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Биофизика, биоинженерия и нанобиотехнологии, 2011, Москва, Россия, С. 35-36.

7. Завьялова Е.Г.. Решетников Р.В., Головин А.В., Пантелеев Д.Ю., Павлова Г.В., Копылов A.M. Модульный ДНК-аптамер к тромбину человека обладает высокой антикоагуляционной активностью. // Материалы V Всероссийской конференции по

клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии, 2011, Москва, Россия, С. 193.

8. Завьялова Е.Г.. Решетников Р.В., Головин А.В., Копылов A.M. Механизм ингибирования протеолиза фибриногена тромбином аптамерными ДНК. // Сборник материалов XVIII Всероссийского национального конгресса «Человек и Лекарство»,

2011, Москва, Россия, С. 598.

9. Zawalova E.G.. Reshetnikov R.V., Golovin A.V., Mudrik N.N., Panteleev D.Yu., Pavlova G.V., Kopylov A.M. Modular thrombin binding DNA aptamer exhibits high anticoagulant activity. // Abstract book of 60-th International Congress of the European Society for Cardiovascular and Endovascular Surgery, 2011, Moscow, Russia, P. 167.

10. Zawalova E.. Reshetnikov R., Golovin A., Mudrik N., Panteleev D., Pavlova G., Kopylov A. Novel thrombin binding DNA aptamer exhibits high inhibitory potential for blood coagulation. // Abstract book of XXIII Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis and 57th Annual SSC meeting, 2011, Kyoto, Japan, P. P-MO-162.

11. Kopylov A., Golovin A., Reshetnikov R., Zawalova E.. Panteleyev D., Pavlova G., Mudrik N. Modular design of DNA aptamer for human thrombin with high anticoagulant activity. // Abstract book of 36th FEBS Congress. Biochemistry for Tomorrow's Medicine, 2011, Torino, Italy, P. 158.

12. Завьялова Е.Г.. Копылов A.M. Моделирование протеолиза фибриногена тромбином. // V Российский симпозиум «Белки и пептиды», 2011, Петрозаводск, Россия, С. 243.

13. Kopylov А. М., Golovin A., Reshetnikov R., Turchaninov T., Yuminova A., Zawalova E.. Mudrik N., Panteleyev D., Pavlova G. Anticoagulant activity of thrombin-binding DNA aptamers. // BIT's 9th Annual Congress of International Drug Discovery Science and Technology, 2011, Shenzhen, China, P. 296.

14. Zawalova E.G.. Golovin A.V., Pavlova G.V., Kopylov A.M. RA-36, novel thrombin binding DNA aptamer exhibits high inhibitory potential and specificity for blood coagulation. // Abstract book of 17th Congress of the European Hematology Association,

2012, Amsterdam, Netherlands, P.680.

15. Kopylov A. M., Golovin A., Reshetnikov R., Lapsheva E., Turchaninov T., Yuminova A., Zawalova E. Modular construction of aptameric nanostructures: anti-thrombin aptamers. // 4th International Conference on Drug Discovery and Therapy, 2012, Dubai, UAE, P. 97.

Заказ № 24-а/05/2013 Подписано в печать 16.05.2013 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru

Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Химический факультет Кафедра химии природных соединений

04201357989

На правах рукописи

Завьялова Елена Геннадиевна

ИЗУЧЕНИЕ ИНГИБИРОВАНИЯ ТРОМБИНА АПТАМЕРНЫМИ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ

диссертация на соискание учёной степени кандидата химических наук

02.00.10 — биоорганическая химия

Научный руководитель: проф., д.х.н. А.М. Копылов

Москва - 2013

ч

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений...........................................................................7

Введение...........................................................................................8

Глава I. Обзор литературы................................................................10

§ 1.1 Образование и функции тромбина в крови................................10

Каскад свертывания крови.......................................................10

Методы изучения каскада свертывания крови in vitro.................12

Коагуляция.....................................................................12

Тест генерации тромбина.................................................14

§ 1.2 Ферментативная активность тромбина....................................15

Структура а-тромбина..............................................................16

Низкомолекулярные субстраты тромбина..................................20

Гидролиз фибриногена тромбином............................................20

§ 1.3 Ингибиторы ферментативной активности тромбина..................22

Классификация ингибиторов....................................................22

Ингибиторьгпептидомиметики.................................................24

Белковые ингибиторы тромбина................................................27

Антитромбин III..............................................................28

Кофактор II гепарина.......................................................28

Тромбомодулин...............................................................29

Гирудины........................................................................30

Ботроярацин...................................................................33

Гемадин..........................................................................33

Пептидные ингибиторы тромбина.............................................34

Гиругены........................................................................34

EGF-пентид.....................................................................36

Бивалентные пептидные ингибиторы тромбина.........................36

Гирулоги.........................................................................37

Модификация гирулогов...................................................38

Гирунормы......................................................................39

Другие ингибиторы активного сайта, соединенные с

гиругеном.......................................................................40

Вариегин........................................................................40

Ингибиторы по экзосайту II тромбина.......................................41

Гепарин..........................................................................42

у'-пептид.........................................................................42

Синтетический ингибитор к экзосайту II............................42

§ 1.4 Аптамерные олигонуклеотиды - новая парадигма

ингибиторов тромбина..............................................................43

15-ТВА - минимальный G-квадруплекс-фармакофор..................43

Дуплексные элементы структуры в комбинации с

G-квадруплексным фармакофором............................................45

Соединение нескольких G-квадруплексных фармакофоров.........46

G-квадруплекс содержащий ДНК-аптамер к экзосайту II

тромбина.................................................................................46

Бифункциональные ДНК-аптамеры к тромбину.........................48

РНК-аптамеры к тромбину........................................................49

Глава II. Экспериментальная часть.....................................................51

§ 2.1 Материалы.............................................................................51

§ 2.2 Методы исследования..............................................................53

Разделение фибринопептидов....................................................53

Идентификация фибринопептидов.............................................53

Получение и очистка Е-домена фибриногена...............................57

Поверхностный плазмонный резонанс: связывание тромбина

и Е-домена фибриногена............................................................57

Определение радиусов гирации фибриногена и

ассоциатов фибрина...................................................................58

АСМ ассоциатов фибрина...........................................................59

ПЭМ ассоциатов фибрина...........................................................59

Определение мутности раствора турбидиметрическим методом.....60

Изучение ингибиторов тромбина турбидиметрическим методом....60

3

Преформирование аптамеров.....................................................60

Проведение экспериментов с конкурирующими лигандами..........61

Изучение ингибирования аптамерами тромбинов животных........62

Изучение влияния гиругена и аптамеров на гидролиз

низкомолекулярного субстрата разными формами тромбина........62

Получение плазмы крови животных...........................................63

Проведение коагуляционных тестов............................................63

Нормирование результатов коагуляционных тестов

для разных препаратов тромбинов..............................................63

Эксперименты in vivo.................................................................64

Построение и моделирование кривых..........................................64

Глава Ш. Результаты и их обсуждение................................................65

§ 3.1 Теоретическое моделирование гидролиза фибриногена

тромбином.................................................................................65

Схема реакции..........................................................................65

Выбор приближения для описания кинетики

гидролиза фибриногена.............................................................68

Описание кинетики гидролиза фибриногена в

квазиравновесном приближении................................................69

Моделирование образования протофибрилл и

последующего отщепления фибринопептида В.............................71

§ 3.2 Описание экспериментальных данных разработанной моделью...75 Определение констант ассоциации и диссоциации

комплекса тромбин-фибриноген..................................................75

Моделирование отщепления фибринопептидов и

образования промежуточных форм фибрина................................76

Определение степени ассоциации фибрина по

динамическому светорассеянию..................................................82

§ 3.3 Моделирование турбидиметрической кривой..............................84

Светорассеяние..........................................................................84

Геометрия фибрина и его ассоциатов...........................................85

4

Определение связи между оптической плотностью

раствора и геометрией ассоциатов фибрина.................................87

§ 3.4 Определение связи между кинетикой гидролиза

фибриногена и формой турбидиметрической кривой......................88

Исследование ассоциатов фибрина.............................................88

Параметризация турбидиметрической кривой.............................96

Определение констант и типа ингибирования............................100

§ 3.5 Изучение турбидиметрическим методом ингибиторов

тромбина, охарактеризованных другими методами.......................102

Ингибиторы активного сайта тромбина......................................102

Ингибиторы экзосайта I тромбина.............................................103

Ингибиторы активного сайта и экзосайта I тромбина..................104

Ингибиторы экзосайта II тромбина............................................106

Ингибиторы активного сайта и экзосайта II тромбина.................106

Ингибиторы ассоциации фибрина.............................................108

Сравнение результатов с данными, опубликованными ранее......108

§ 3.6 Изучение турбидиметрическим методом аптамерных

олигонуклеотидов к тромбину...................................................111

Аптамеры с известным сайтом связывания.................................111

Аптамеры с G-квадруплексом и дополнительными

элементами вторичной структуры..............................................112

Моделирование комплексов 31-ТВА и RA-36 с тромбином............115

Подбор условий преформирования G-квадруплекс

содержащих аптамеров.............................................................118

Изучение влияния дополнительных структурных элементов на ингибируюшую активность G-квадруплекс

содержащих аптамеров.............................................................124

Определение констант связывания ДНК-аптамеров

с протромбином........................................................................130

Изучение видоспецифичности G-квадруплекс

содержащих аптамеров турбидиметрическим методом................133

5

Выравнивание первичных структур тромбинов

человека и животных...............................................................137

§ 3.7 Изучение ДНК-аптамеров к тромбину в биологических

жидкостях in vitro и in vivo.......................................................141

Изучение видоспецифичности G-квадруплекс содержащих

аптамеров в коагуляционных тестах..........................................141

Изучение ингибирующей активности RA-36 in vivo.....................147

Изучение действия антидота к RA-36.........................................149

§ 3.8 Изучение влияния ДНК-аптамеров на гидролиз

тромбином низкомолекулярных субстратов................................150

Конкуренция ДНК-аптамеров с гиругеном в

ингибировании тромбина.........................................................150

Исследование влияния ДНК-аптамеров и гиру гена на

гидролиз низкомолекулярного субстрата тромбина.....................150

Конформация тромбина в комплексах с ингибиторами................159

Выводы...........................................................................................162

Благодарности.................................................................................163

Литература......................................................................................164

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ACM атомнсгсиловая микроскопия

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ дитиотреитол

КД круговой дихроизм

о.е. оптические единицы

осч особо чистый

ПЭМ просвечивающая электронная микроскопия

РНК рибонуклеиновая кислота

РСА рентгеноструктурный анализ

чда чистый для анализа

ЯМР ядерный магнитный резонанс

FpA и FpB фибринопептиды А и В G-квадруплекс гуаниновый квадруплекс IU international units (международные единицы

активности)

MALDI matrix-assisted laser desorption/ionization (матрично-

активированная лазерная десорбция/ионизация) HMDS гексаметилдисилазан

РРАСК ^-Р11е)РгоА^-хлорметилкетон

SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential

Enrichment (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) ТВА thrombin-binding aptamer (тромбин-связывающий

аптамер)

TOF time of flight (времяпролетный)

ВВЕДЕНИЕ

Тромбин - ключевая пептидаза каскада свертывания крови, катализирующая гидролиз фибриногена до фибрина. Фибрин ассоциирует в фибриновые нити - каркас тромба. Избыточное тромбообразование приводит к сердечно-сосудистым заболеваниям с высокой смертностью и инвалидизацией, что обуславливает неугасающий интерес к антитромботическим препаратам, в частности, к ингибиторам тромбина.

Для клинического применения одобрены ингибиторы тромбина разной природы: полисахариды (гепарины), белки (гирудин, антитромбин III, бивалирудин) и пептидомиметики (аргатробан, дабигатран). Они обладают рядом недостатков: гепарин вызывает геморрагические осложнения, а остальные не имеют «антидота», что осложняет корректировку неудачно подобранной дозы; белковые ингибиторы могут вызывать иммунный ответ.

Поиск безопасных антикоагулянтов привел к получению ингибитора тромбина на основе дезоксирибоолигонуклеотида — 15-ТВА (минимального фармакофора). Этот 15-мер образует G-квадруплексную структуру, которая связывается с фибриноген-связывающим сайтом (экзосайтом I) тромбина с кажущейся константой диссоциации 24 нМ и ингибирует свертывание крови in vitro и in vivo. Однако, клиническое применение 15-ТВА ограничено его малым временем выведения -5 минут»' повышение массы олигонуклеотидов увеличивает этот параметр. Поэтому дополнительные элементы вторичной структуры к 15-ТВА могут улучшить его свойства^ примеры более активных ингибиторов — аптамеры 31-ТВА и NU172. Низкая токсичность и иммуногенность, возможность масштабного химического синтеза и направленной модификации,

наличие «антидота» (комплементарной последовательности) - это преимущества нового поколения ингибиторов тромбина.

Поскольку гидролиз низкомолекулярных субстратов не ингибируется лигандами к экзосайтам тромбина, кинетика ингибирования аптамерами не изучена. Потому представляется актуальной разработка метода, основанного на гидролизе фибриногена, для изучения эффективности и механизма действия аптамеров. Изучение кинетики ингибирования тромбина серией аптамеров позволит выяснить роль дополнительных элементов вторичной структуры, оптимальные условия для образования G-квадруплексного фармакофора, механизмы ингибирования и исследовать действие «антидота».

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цель - изучение кинетики ингибирования тромбина аптамерами в сравнении с известными ингибиторами, выявление механизма и детерминант ингибирующей активности.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи•

1. Разработать метод, основанный на гидролизе фибриногена тромбином, для изучения аптамеров к тромбину.

2. Верифицировать метод на хорошо изученных ингибиторах тромбина.

3. Сравнить ДНК- и РНК-аптамеры с известными ингибиторами.

4. Выявить влияние катионов и дополнительных элементов вторичной структуры на активность фармакофора.

5. Изучить особенности ингибирования тромбина аптамерами в биологических жидкостях in vitro и in vivo.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

§ 1.1 Образование и функции тромбина в крови

Тромбин - многофункциональная пептидаза плазмы крови, отвечающая за образование фибриновых ассоциатов, каркаса тромба. В норме представлен в виде профермента. При повреждении эндотелия сосудов или патологии запускается система свертывания (коагуляции) крови, состоящая из трипсиноподобных сериновых пептидаз, которые последовательно активируют друг друга, что приводит к образованию тромбина и, следовательно, тромба (1).

Каскад свертывания крови

Гипотеза каскадного механизма образования тромбина была выдвинута в 1964 г. в статьях R.G. Macfarlane, W. Davie и О. Ratnoff (1, 2). В работах этих авторов постулировано, что каждый белковый фактор свертывания присутствует в плазме крови в виде неактивного прекурсора, который при ограниченном протеолизе превращается в ферментативно активную форму (рис. 1). Гидролиз же конечного профактора цепи, фибриногена приводит к появлению фибрина, ассоциирующего с образованием трехмерного каркаса из длинных нитей, являющегося основой тромба. Образующийся тромбин выступает в роли вторичного сигнала и запускает следующую часть каскада, что дополнительно увеличивает количество а-тромбина и фибрина в плазме крови. Необходимыми кофакторами активации каскада выступают катионы кальция и фосфатидилсерин — компонент клеточной мембраны, высвобождаемый при нарушении её целостности (1, 3).

Каскадный механизм активации ферментов свертывания крови подобен фотохимической амплификации, т.е. каждый профермент подобен фотоумножителю, увеличивающему сигнал в 10 раз, что приводит к усилению первоначального сигнала до миллиона раз (2).

Повреждение сосуда

Первичный сигнал

і

Вторичный сигнал

Тромбин

поверхность

2+

Тканевой фактор

FXa Са2 FVII FV" Тканевой фактор

FVIla ?

Тканевой фактор

---------FIX

FX

FXlil

Протромбин

FV

Тромбоциты

ромби

2+

Фибриноген Фибрин) Сшитый фибрин Целевая реакция

Рис. 1. Каскад свертывания крови. Рисунок создан на основе работы Е. W. Davie (2).

Каскадный механизм не отражает полноту процесса свертывания крови, поскольку не учитывает роль тромбоцитов, ключевых клеток гемостаза (т.н. первичный гемостаз), а также роль антикоагулянтных механизмов системы свертывания крови, расщепляющих фибриновые ассоциаты и ингибирующих тромбин (4). Однако, каскад используется в качестве упрощенной модели свертывания крови для изучения ингибиторов пептидаз, отклонений в концентрации и активности факторов свертывания (1, 3).

Методы изучения каскада свертывания крови in vitro

Коагуляция

В клинических лабораториях для оценки состояния гемостаза пациентов используются коагуляционные тесты. Тест представляет собой измерение времени коагуляции (образования фибринового сгустка) в препарате фибриногена (раствор очищенного белка, плазма крови или кровь). Коагуляция сопровождается увеличением вязкости и мутности образца, что фиксируется как время свертывания образца. Свертывание иницируется добавлением непосредственно тромбина или реагентов, вызывающих его образование через каскад свертывания крови (4). По данным Mitrophanov и Reifman (5), а также Danforth et al. (6) для коагуляции плазмы крови достаточно 2-10 нМ тромбина. Тесты используемые для контроля действия ингибиторов каскада свертывания перечислены далее.

Тромбиновое время- для коагуляции добавляют тромбин, тест чувствителен к наличию прямых ингибиторов тромбина, ингибиторов ассоциации фибрина и концентрации фибриногена (4).

Протромбиновое время - время коагуляции после добавления тканевого фактора (первичный сигнал). Тест чувствителен к изменениям концентрации профакторов V, VII, X, протромбина и фибриногена, а также к ингибиторам соответствующих факторов (рис. 1). Удлинение этого

показателя указывает на <30% активности одного или нескольких факторов (4).

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) - время коагуляции после добавления каолиновых частиц (имитация вторичного сигнала). Тест чувствителен к изменениям концентрации профакторов V, VIII, IX, X, XI, протромбина и фибриногена, а также к ингибиторам соответствующих факторов (рис. 1). Удлинение этого показателя указывает на <30% активности одного или нескольких факторов (4).

Гепариновый тест (Heptest): для коагуляции добавляют экзогенный фактор Ха, фибриноген и кофакторы, необходимые для процессирования протромбина в тромбин (Va, Са2+, фосфолипиды) (7). Тест чувствителен к ингибиторам фактора Ха и, в меньшей степени, тромбина (8).

Экариновое (эхитоксовое) время- для коагуляции добавляют экарин -фермент, процессирующий протромбин только до