Ингибирование теломеразы человека тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Химический факультет

На правах рукописи

Ажибек Дулат Мейирбекович

ИНГИБИРОВАНИЕ ТЕЛОМЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

п т 2015

Москва -2015

005557946

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения

высшего образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова».

Научный руководитель:

Донцова Ольга Анатольевна, доктор химических наук, член-корр. Российской академии наук, профессор кафедры химии природных соединений химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Зверева Мария Эмильевна, кандидат химических наук, доцент кафедры химии природных соединений химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.ВЛомоносова»

Официальные оппоненты:

Киселев Федор Львович, доктор биологических наук, профессор, член-корр. Российской академии наук, заведующий лабораторией лаборатории молекулярной биологии вирусов, отдела трансформирующих генов опухолей, НИИ канцерогенеза Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Российский онкологический научный центр им. Н. Н. Блохина".

Смирнов Иван Витальевич, кандидат химических наук, научный сотрудник лаборатории биокатализа отдела пептидно-белковых технологий Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» Российской академии наук.

Защита состоится 24 февраля 2015 года в 16.00 на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова и на сайте химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» (по адресу http://www.chem.msu.ru/rus/theses/2014/2014-12-11 -azhibek/.

Автореферат разослан /£/$шваря 2015 г. -

Учёный секретарь У^Тл S^-r?

диссертационного совета, / //

кандидат химических наук, /Ь'

доцент /У (у Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современный подход к борьбе с онкологическими заболеваниями - это разработка целевой или таргетной терапии. Механизм целевой терапии заключается в ингибировании, блокировании или деградации молекул (ферменты/белки, РНК), необходимых для развития и/или жизнедеятельности опухолевых клеток. Такие молекулы называются мишенями. Спектр возможных мишеней и разрабатываемых к ним направленных препаратов достаточно широк и зависит от типа опухолевых клеток. Однако из-за гетерогенности опухоли в ней могут присутствовать опухолевые клетки, содержащие разные мишени, поэтому наибольший интерес представляет поиск мишеней, встречающихся в различных типах опухолевых клеток. Чем универсальнее мишень, тем больше типов опухолевых клеток будет подвергаться терапии. Одной из таких мишеней является теломераза. Теломераза - комплексный фермент, состоящий из РНК и белка. Этот фермент необходим для неограниченного числа делений клетки и активируется в 80-90% типов опухолевых клеток.

Концы хромосом млекопитающих состоят из повторяющихся последовательностей ТТАСОС, взаимодействующих со специфическими белками. Такие концевые ДНК-белковые структуры называются теломерами. При делении клетки длина теломер сокращается за счет недорепликации концов хромосом. Сокращение длины теломер до критического уровня приводит к активации программируемой гибели клетки. Основная функция теломеразы заключается в удлинении/поддержании длины теломер за счет синтеза повторяющейся последовательности ДНК на концах хромосом.

Выключение работы теломеразы приводит к сокращению количества теломерных повторов на концах хромосом с каждым делением опухолевой клетки, что приводит к последующей гибели клетки.

Целью данной работы был дизайн новых химерных ингибиторов теломеразы олигонуклеотидной природы, изучение влияния их структуры на ингибирующую способность и определение стадии биогенеза или работы теломеразы, подвергающейся ингибированию. Для достижения поставленных целей необходимо было разработать адекватную систему для детекции ингибирования теломеразы.

Научная новизна и практическая значимость работы. В ходе работы был оптимизирован количественный метод измерения теломеразной активности для поиска потенциальных ипгибиторов теломеразы различной природы. Решена проблема влияния исследуемых веществ на полимеразную цепную реакцию, которая используется для усиления сигнала при измерении теломеразной активности. Разработанный метод был

использован для оценки ингибирующей способности различных низкомолекулярных соединений и олигонуклеотидов. При тестировании олигонуклеотидов лучшую способностью ингибировать теломеразу в клетке проявили химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух последовательностей, комплементарных теломеразной РНК, и соединенных не-нуклеотидным линкером. Показано, что химерные олигонуклеотиды влияют на работу теломеразы в системе in vitro и эффективно блокируют сборку активного теломеразного комплекса в клетке. Таким образом, экспериментально продемонстрирована эффективность подхода к ингибированию теломеразы за счет блокирования сборки активного комплекса. Такие олигонуклеотиды могут стать основой для разработки новых более эффективных противоопухолевых препаратов. Так, способность ингибировать теломеразу в клетке наиболее эффективного химерного олигонуклеотида превышает такую способность для олигонуклеотида с последовательностью препарата Иметелстата, находящегося во второй фазе клинических испытаний, почти в 30 раз.

При анализе ингибирующей способности химерных олигонуклеотидов in vitro еще раз было подтверждено, что теломераза является димером. Так, димеризация способствует ингибированию теломеразы химерным олигонуклеотидом (М*сЗМ), предназначенным для взаимодействия с двумя молекулами теломеразной РНК. Это фундаментальное свойство теломеразы человека в дальнейшем также может быть использовано для разработки более эффективных и селективных ингибиторов теломеразы.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждали на семинарах лаборатории химии рибонуклеопротеидов кафедры химии природных соединений химического факультета МГУ им. Ломоносова; докладывали на конференциях: XVI Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» МГУ имени М.В.Ломоносова. Москва, Россия, апрель 11-14, 2009; XVII Международная Научная Конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2010» МГУ имени М.ВЛомоносова. Москва, Россия, апрель 8-12, 2010; 38-ая Международная конференция европейского биохимического общества FEBS. Санкт-Петербург, Россия, июль 6-11,2013.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы, список литературы и приложение. Материал иллюстрирован 40 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает 173 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Известно, что теломераза является сложным РНК-белковым комплексом, и для ее активации необходим процесс сборки этого комплекса в клетке. Основной целью данной работы была разработка нового подхода для ингибирования теломеразы, основанного на блокировании сборки теломеразного комплекса. Для скрининга ингибирующей способности вешеств необходим надежный метод тестирования. Из-за низкой концентрации теломеразы в клетке (100 молекул на 1 клетку) определение компонентов теломеразы и ее активности становится сложным процессом.

Самым надежным и информативным для исследования теломеразы является прямой метод детекции теломеразной активности (ПТА). Этот метод основан на удлинении теломер-подобного олигонуклеотида теломеразой в клеточном экстракте в присутствии радиоактивно меченого нуклеотида, который включается в теломерный повтор. Результат удлинения олигонуклеотида теломеразой называют «продукт удлинения». Далее «продукт удлинения» анализируют электрофорезом. У метода ПТА очень низкая чувствительность, что требует большого количества теломеразы и радиоактивного материала и делает невозможным его использование в обычных исследовательских лабораториях. Самым доступным и простым методом для определения ингибирования теломеразы является метод амплификации теломерных повторов (ТРАП), включающий в себя дополнительный шаг — амплификацию «продукта удлинения» с помощью ПЦР. Этот дополнительный шаг вводит ограничения на использование этого метода при тестировании потенциальных ингибиторов теломеразы. 1. Разработка метода детекции теломеразной активности

Так как основной целью работы было исследование новых химерных ингибиторов теломеразы олигонуклеотидной природы, стабильность которых зависит от компонентов клеточного экстракта, на первом этапе был разработан способ дополнительной очистки клеточного экстракта и концентрирования в нем теломеразы. Для оптимизации метода измерения теломеразной активности за основу был взят метод ТРАП. Необходимо было решить проблему ингибирования соединениями шага амплификации сигнала.

При поиске ингибиторов теломеразы методом ТРАП очистка «продукта удлинения» перед проведением ПЦР абсолютно необходима, так как ингибиторы теломеразы обычно ингибируют и ПЦР, что искажает полученные результаты. Мы планировали исследование ингибирования теломеразы олигонуклеотидами, которые по своей природе одинаковы с «продуктом удлинения». Соответственно очистка «продукта удлинения» от олигонуклеотида невозможна. Чтобы решить эту проблему, мы добавили этап разбавления «продукта удлинения» перед ПЦР. При разбавлении можно снизить

концентрацию ингибиторов до предела, когда они перестают влиять на ПЦР. При этом в ПЦР «продукты удлинения» амплифицируются, что позволяет измерить ингибирование теломеразы (рис.1 А).

Для сравнения способности веществ ингибировать теломеразу необходимо определить IC50. IC50 - это концентрация ингибитора, при которой активность теломеразы составляет 50% от исходной. Для его расчетов необходим количественный метод. В связи с этим был использован ТРАП с количественным ПЦР на шаге амплификации сигнала, а именно ПЦР в реальном времени (RQ-ТРАП). IC50 рассчитывали по логарифмической кривой ингибирования теломеразы. Для этого измеряли и строили зависимость относительной теломеразной активности от разной концентрации ингибитора (рис.1 А, сплошная линия). Логарифмическая кривая ингибирования состоит из трех частей: нижнее плато, верхнее плато и экспоненциальная часть. Для расчета ICso ингибирования теломеразы выявляли верхнее и нижнее плато. Чтобы ингибирование ПЦР (рис.1 А, прерывистая линия) не влияло на результат ингибирования теломеразы, верхнее плато кривой ингибирования ПЦР должно пересекаться с экспоненциальной частью и верхним платом ингибирования теломеразы.

При проверке ингибирования ПЦР тестируемое вещество было добавлено после теломеразной реакции перед разбавлением и до проведения ПЦР (рис.1 А, прерывистая линия, до разбавления). После разбавления «продукта удлинения» кривая ингибирования смещается (рис.1 А, прерывистая линия, после разбавления). Если сигнал будет таким же, как и в отсутствие ингибитора, то это означает, что ингибитор не влияет на ПЦР. Для оценки ингибирования ПЦР олигонуклеотидами в качестве модельных олигонуклеотидов мы решили использовать РНК олигонуклеотиды HuG2R (5'-UUAGGGUUAGGG-NH2-3') и HuG4R (5'-(UUAGGG)4-NH2-3'), имеющие теломерные последовательности и максимально схожие с теломерным продуктом. Из литературных данных известно, что такие олигонуклеотиды ингибируют теломеразу, т.к. являются аналогами TERRA -природного ингибитора теломераз. Использование разбавления «продукта удлинения» в 40 раз оказалось достаточным для элиминирования ингибирования ПЦР для РНК олигонуклеотидов (рис. 1Б). В случае HuG4R видно, что при увеличении концентрации олигонуклеотид начинает ингибировать ПЦР уже в отсутствие теломеразного продукта (рис.1 Б).

Таким образом, измерить ингибирование теломеразы олигонуклеотидами, влияющим на ПЦР, без выделения «продукта удлинения» можно с помощью введения дополнительного шага разбавления до ПЦР.

до разбавления

после разбавления

«¡¡ь

80 - Г\

60 •

40 - 1

20 ■ N \ О4 __

С 3 4 5

1вй; Л_ __ _

VI N

80 ■ 1 \

60 - \ - -

40 - \ \

\ \

20 - 1 \ \

2 3 4 5

ингнц. " теломеразной активности

ингиб. гаи*

1о§[Сикткб., нМ]

1оа|СннгкЕ., нМ]

1ов|С(ол|]г.). нМ|

1ой[С(олнт.). нМ1

Рис.1. Исключение влияния ингибирования ПЦР теломеразными ингибиторами в методе ТРАП измерения теломеразной активности за счет разбавления продукта удлинения теломеразы. А -схематическое представление графика ингибирования теломеразы до и после разбавления теломеразного продукта перед ПЦР. Б — графики ингибирования теломеразы олигонуклеотидами НиС2Я и Ни04Я, полученные на основе данных методом ¡КЗ-ТРАП с разбавлением. Ингибирование теломеразы отмечено как (•), ингибирование ПЦР как (о).

Недостаток использования разбавления «продукта удлинения» для исключения

ингибирования ПЦР в методе ТРАП исследуемыми веществами заключается в том, что при сильном разведении концентрация теломеразного продукта становится меньше предела чувствительности ПЦР. Для снятия такого ограничения необходимо было повысить концентрацию теломеразного продукта. Для этого необходимо было повысить концентрацию теломеразы в теломеразной экстракте. Это возможно за счет увеличения экспрессии теломеразы исходно в клетке перед получением теломеразного экстракта. На данный момент в мире для увеличения экспрессии теломеразы в основном используется генно-инженерная конструкция, созданная в лаборатории профессора Лингнера. В этой конструкции два компонента теломеразы, ЬТЯ и ЬТЕЯТ, синтезируются с двух разных плазмид и временно экспрессируются в клетках НЕК293Т. Основная проблема при временной экспрессии - уменьшение транскрипции трансфецированных плазмид в клетке во времени. Один из способов борьбы с уменьшением транскрипции генов на плазмидах, внесенных в клетку, является эписомальная репликация плазмиды.

Известно, что ДНК-содержащие вирусы умеют реплицироваться в клетке. Такие вирусы кодирует белок, который специфически связывается с ориджином репликации вируса и привлекает репликативную машину клетки. Для экспрессии теломеразы мы решили использовать клетки НЕК293Е, содержащие антиген вируса EBV (Ebstein Baar virus) под названием EBNA-1. Ориджин репликации этого вируса работает синхронно с делением клетки, поэтому репликация плазмиды не конкурирует с его транскрипцией. Размер ориджина EBV большой (-2000 п.о.), он содержит два основных элемента FR и DS. Есть данные о том, что элемент DS (200 п.о.) достаточен для репликации плазмиды. Мы поместили элемент DS в плазмиды pBSK-Ul-hTR-U2/U5 и р-SFFV-hTERT, которые транзитарно экспрессируют компоненты теломеразы. Полученные конструкции, умеющие эписомально реплицироваться, названы pBSK-DS-Ul-hTR и p-DS-SFFV-hTERT. В результате экспрессии этих конструкций в клетках НЕК293Е активность теломеразы увеличилась в 3-4 раза (рис.2). В качестве контроля плазмиды трансфецировали в другую сублинию клеток 293Т, не имеющих EBNA-1 белка. Видно, что элемент DS не работает в этих клетках.

Адекватность метода RQ-ТРАП с разбавлением по отношению к литературным данным проверили, используя соединения с известным ICso. Для этого выбрали известное низкомолекулярное соединение BIBR1532, которое часто используется в качестве контрольного ингибитора теломеразы. Полученная для этого соединения величина ICso составила 0,21 ±0,04 мкМ. Эта величина IC50 при сравнении с литературными данными соответствует результатам измерения методом ПТА (1С50~0,1мкМ). Однако, BIBR1532 не ингибирует ПЦР. Следующим этапом стала проверка подхода на соединениях, ингибирующих ПЦР.

«Продукт удлинения» теломеразой содержит теломерные последовательности, которые могут образовывать С4-квадруплексы. Известно, что низкомолекулярные вещества, взаимодействующие с и стабилизирующие С4-квадруплексы и называющиеся 04-лигандами, ингибируют ПЦР и являются ингибиторами теломеразы. Нами были

0 1000

S л 800

1 §

5 I 600

2 6

3 = 400

□ 293Е ■ 293T

ГЪ

НС трансф

р-Ов-вГТУ-ЬТЕКТ р^ГГУ-ЬТКИТ рВвК-Ю-Ш-ЬТК рввк-ш-ьта-ш/ш Рис.2. Экспрессия теломеразы в сублиниях клеток НЕК293: НЕК293Е - отмечены пустыми столбцами, НЕК293Т - отмечены темными столбцами. По оси абцисс приведены названия плазмид, трансфецированных в клетки. Относительная теломеразная активность приведена по отношению к не трансфецированным клеткам.

2HCI NH;

Рис.3. Структурные

формулы LCTA-1120 и LCTA-1581.

проверены известные соединения LCTA-1120 и LCTA-1581, являющиеся антрахиноновыми производными, которые ингибируют теломеразу (рис.3). IC50 для них: 0,69±0,24 и 0,92±0,45, соответственно. Это соответствует литературными данным.

Другие производные этих соединений, которые были синтезированы в лаборатории Н.С.Ильинского с целью улучшения способности таких соединений взаимодействовать с С4-квадруплексами, также были проверены на способность ингибировать теломеразу. Большинство соединений ингибирует ПЦР в пределах концентрации 0,05-0,15 мкМ, тогда как теломеразу в 4-7 раза слабее. Оказалось, что модификация боковых групп не сильно влияет на способность ингибировать теломеразу.

Разработанный нами метод был дополнительно протестирован на металлорганическом соединении, моделирующем квадруплекс, параллельно с методом ПТА. Для изучения медных комплексов на кафедре органической химии химического факультета МГУ в лаборатории профессора Зыка Н.В. в группе Мажуги A.C. было синтезировано новое соединение 2-алкилтио-5-арилметилен-4Н-имидазолин-4-он (рис.4), которое образует комплекс с двумя атомами меди, имеющих две разных степени окисления (рис.4).

Этот комплекс (рис.4) ингибировал теломеразу с IC50 13±2 мкМ по нашему методу и с IC50 20мкМ по методу ПТА. В методах используются разные солевые условия в теломеразной реакции, что поставило вопрос о степени стабильности комплекса в разных солевых условиях. Для этого решено было проверить ингибирует ли теломеразу органическое соединение и/или двухвалентная медь по отдельности вне комплекса. Соединение без меди ингибирует теломеразу на том же уровне, что и комплекс (1С=12±6 мкМ). Двухвалентная медь также ингибирует теломеразу с IC50 равной 9±1 мкМ. Можно предположить, что расположение меди в комплексе критически не влияет на ингибирующую способность соединения. Кроме того, полученные данные говорят о необходимости подтверждения ингибирующей способности соединений, выбранных по результатам RQ-ТРАП, методом прямого измерения теломеразной активности.

Рис.4. Структурная формула 2-алкилтио-5-арилметилен-4Н-имидазолин-4-он в комплекса с медью.

2. Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы 2.1. Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидов

Основной целью нашей работы была разработка новых подходов к ингибированию теломеразы. Известно, что теломеразная РНК имеет два домена, необходимые для работы теломеразы: псевдоузел и CR4/CR5 (рис.5А). Эти два домена могут сближаться друг с другом в теломеразном комплексе. Кроме того известно, что в условиях in vitro теломераза является димером. В связи с этим мы решили использовать химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух олигонуклеотидных частей, соединенных ненуклеотидным линкером. Такой химерный олигонуклеотид связывался бы одновременно с двумя участками hTR внутримолекулярно и/или межмолекулярно, тем самым, возможно, нарушая структуру или динамику hTR (и/или теломеразного комплекса). Это привело бы к ингибированию теломеразы.

Химерные олигонуклеотиды были синтезированы Зацепиным Т.С. и состояли из следующих частей: олигонуклеотид М - комплементарен к матричной части (область 4665); J - комплементарен к области псевдоузла 152-168; N -комплементарен к CR4/CR5 домену hTR (рис.5). Также олигонуклеотид N имеет дополнительные 3 нуклеотида на 5'-конце, предоставляющие возможность отделять два соединенных комплементарных участка в таких олигонуклеотидах, как MN или JN. Во избежание деградации нуклеазами и элонгации полимеразами все олигонуклеотиды были 2'-ОМе модифицированы и защищены с 3'-конца 6-аминогексанолом (-R-NH2 в рис.5Б).

Химерные олигонуклеотиды были соединены 3'-5', или З'-З', или 5'-5* концами через 1,3-пропандиоловый линкер (сЗ) (Рис. 5Б). Если М, N, J олигонуклеотиды использовались индивидуально, то сЗ линкер был добавлен на 5'-конец, а в случае с М также и на 3'-конец (табл.1). Олигонуклеотид G (Рис. 5А) (hTR область 42-54), который имеет последовательность, идентичную с GRN163L и связывается с матричной частью hTR, несет модификации, описанные выше, был использован в качестве контроля для ингибирования теломеразы. GRN163L (Иметелстат) является модифицированным олигонуклеотидом, разработанным компанией Geron. GRN163L проходит II стадию клинических испытаний.

Для каждого олигонуклеотида была измерена теломеразная активность как in vitro, так и в условиях «in vivo».

Р!

о

« и

hTR(451 п.о.)

Под термином «in vivo» подразумевается культивирование клеток в присутствии олигонуклеотидов, их влияние на теломеразу и ее компоненты в клетке, последующее выделение теломеразного экстракта из таких клеток и проведение тестирования

теломеразной активности в nbs" - этом экстракте разработанным

А ~ st 5 методом RQ-ТРАП.

• I ; 'e-e/ ~ О

™ хл J] 2.2. Ингибирование

теломеразы химерными олигонуклеотидами in vitro

Для каждого

олигонуклеотида было

проведено параллельное тестирование влияния на ПЦР реакцию для определения степени необходимого

разбавления при измерении влияния на теломеразную активность in vitro. Олигонуклеотиды М и J по отдельности достаточно

хорошо ингибируют

теломеразу in vitro (IC50 составили 100 нМ и 19 нМ, соответственно). Как и предполагалось, олигонуклеотид G показал лучшее ингибирование, чем М (1Сso 11пМ) (табл. 1).

Псевдоузел J

" EH

ЦССССССЦССССООЫ^-Д»»

'tc-o*

м

М: 5'^:CCUUCÜCAGUUAGGGUUAG-2' J: 5'-UUGCUCUAGAAUGAACG-3' N:5'^5UUGCCCCGGGCCGACCGCG-3'

ос н,-сн,-сн,-о-го,-о-;

_ o-CH.-CH -CHvO po, о-:

-О-СИ ,-CH;-CH;-OfQ;-C-

Рис. 5. А. Положение олигонуклеотидных частей химер на вторичной структуре ЬТЯ. Олигонуклеотиды М, ], в и N окрашены в серый цвет. Б. Схематическое представление химер. Я-ЫН2 - 6-амшюгексанольная группа.

Табл.1. Количественные характеристики ингибирования теломеразы олигонуклеотндами._

олигонуклеотид\ название 1С5о,нМ

кд-тРАП ПТА

¡11 \ntro Ы У/уо

сЗЫ не ингиб. 41.1±7.4 н.о.

сЗМ 100±20 5.2±0.9 н.о.

сз: 19±16 43±21 6.8±0,8

сЗО 11.6±5.6 67±33 5.5±0,6

МсЗ 75±57 175±137 77.4±10

МсЗК 35±18 2.2±0.8 118±20

МЫсЗ не ингиб. 18.4±5.6 н.о.

сЗМЫ не ингиб. 1.2±0.4 н.о.

М*сЗИ 15.7±8.2 0.51±0.11 72±8

МсЗЫ* 13.5±3.4 7±1 н.о.

сЗМсЗК 184±58 0.7±0.5 н.о.

ЫсЗМ 76±21 1.3±0.9 27±3

N03: не ингиб. 1.5±0.7 н.о.

N»031 не ингиб. 1.3±0.6 н.о.

.ГсЗЫ 229±72 3.9±1.7 н.о.

№ш5сЗ.Г не ингиб. 8.5±3.5 н.о.

Мс3.1гги5 не ингиб. 11.2±0.8 н.о.

№тзс3.1гш5 не ингиб. 18.4±3.2 н.о.

сотрМсЗ.! не ингиб. не ингиб. н.о.

МсЗМ 221±10 1.4±0.3 н.о.

М*сЗМ 11.9±0.3 0.3±0.1 19.3±2.5

ММсЗ 42±1 4.5±0.9 26.7±3

сЗМсЗМ 44±12 0.31 ±0.04 н.о.

не ингиб. - 1С50 больше, чем 500нМ.

При сравнении ингибирующей способности МсЗМ и М*сЗМ видно усиление ингибирования в 10-20 раз при инверсии олигонуклеотида М. Этот эффект можно объяснить существованием преимущественной ориентацией для взаимодействия двух конъюгированных олигонуклеотидов М с димерной формой теломеразы (рис.6). В случае олигонуклеотида М расположение модификации сЗ как на 5'- (сЗМ), так и на З'-концах (МсЗ) не влияет на ингибирование теломеразы (табл. 1), т.к. такая модификация возможно пространственно не мешает взаимодействию олигонуклеотида М и теломеразы (рис.6, рисунки возле сЗМ и МсЗ). Дополнительным доказательством может служить разница в ингибировании МсЗМ и сЗМ (или МсЗ). Олигонуклеотиды сЗМ и МсЗ могут взаимодействовать по отдельности с двумя субьединицами димерной теломеразы, тогда как в олигонуклеотиде МсЗМ 5'-конец МсЗ части пространственно будет мешать

связыванию 3'-конца сЗМ части с одной из субьединиц теломеразы. Из-за этого МсЗМ ингибирует теломеразу хуже (1С50=220нМ), чем МсЗ в отдельности (1С50~75нМ), а М*сЗМ ингибирует лучше (1С50~10нМ) (рис. 6).

Олигонуклеотид N в системе in

сЗМ -

vitro не ингибирует теломеразу (табл. 2). Однако при -мсз конъюгировании его с М ингибирующая способность

химерных олигонуклеотидов становится больше, чем олигонуклеотида М в отдельности. Например, химера Mc3N в два раза лучше ингибирует теломеразу, чем сЗМ, тогда как

(А

с г+А

нет взаимодействия

ZDE

Л/у

Теломерата в лнмерноп форме

М олнгонуклеотм

Рис. 6. Схематическое представление, показывающее разницу в ингибировании теломеразы

олигонуклеотипами сЗМ. МсЗ. МсЗМ и М*сЗМ.

М*сЗИ и МсЗЫ* ингибируют в 5 раз лучше. Такой эффект увеличения ингибирующей способности можно объяснить за счет внутримолекулярного взаимодействия. Известно, что внутримолекулярные взаимодействия сильнее чем межмолекулярные на несколько порядков. Олигонуклеотид N предназначен для взаимодействовия с СЯ4/СЯ5 доменом ЬТИ (рис.5А). В активном теломеразном комплексе этот домен связан с белком ИТЕЮ", и это взаимодействие возможно сильнее, чем взаимодействие СК.4/СЯ5 домена с олигонуклеотидом N. В химере, объединяющей М и N. с теломеразой сначала взаимодействует олигонуклеотид М. В связи, с чем взаимодействие олигонуклеотида N с доменом СЯ4/СЯ5 ЬТЯ становится внутримолекулярным и может преодолеть взаимодействие ИТЕЯТ белка с доменом СЯ4/СК5. По сравнению с химерой М и М, в химере М с N нет корреляции положения и ориентации олигонуклеотида N с ингибирующей способностью теломеразы. Возможные причины - это умение взаимодействовать олигонуклеотида N с обоими доменами СК4/СЯ5 ЬТИ в димерной форме теломеразы и/или высокая конформационная подвижность домена СЛ4/СЯ5 ИТИ. в активном теломеразном комплексе.

Были синтезированы химерные олигонуклеотиды, состоящие из олигонуклеотидов .1 и N. Такие химерные олигонуклеотиды интересны тем, что не содержат частей, комплементарных к матричной части ИТЯ, и не имеют теломерной последовательности. Олигонуклеотид } в отдельности сильно ингибирует теломеразу, почти на уровне олигонуклеотида в. Однако при конъюгировании с N ингибирующая способность сильно уменьшается или полностью теряется (табл. 1). Единственным объяснением может быть

пространственное затруднение взаимодействия олигонуклеотида J с теломеразным комплексом в J и N химерах. Для проверки правильности данных, полученных методом RQ-ТРАП, для некоторых олигонуклеотидов был дополнительно сделан анализ методом ПТА (табл.1). Полученные двумя разными методами данные согласуются друг с другом. 2.3. Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами в клеточных линиях НЕК293

Мы изучили влияние олигонуклеотидов на теломеразную активность в клетках клеточной линии НЕК293. Для этого клетки были трансфецированы этими олигонуклеотидами и культивированы в течение двух дней. Из клеток выделили клеточный экстракт. Затем теломеразная активность полученных клеточных экстрактов была измерена методом RQ-ТРАП. Полученные данные приведены в табл. 1 (столбец in vivó).

В условиях in vivo получены отличные от in vitro данные ингибирования теломеразы

выбранными олигонуклеотидами.

Эффективность химерных олигонуклеотидов как ингибиторов теломеразы выше по сравнению с данными, полученными in vitro. Причиной является влияние ингибиторов на биогенез теломеразы в условиях in vivo. В системе in vivo ингибирование теломеразы зависит от стабильности олигонуклеотидов и

ингибирования биогенеза, которые рассмотрены далее.

На данный момент не существует корректных универсальных методов

определения стабильности олигонуклеотидов в клетке. В основном о стабильности олигонуклеотидов судят по функциональному анализу. Известно, что олигонуклеотиды могут деградировать как внутри, так и с 3'- и 5'-конца. С З'-конца мы защитили олигонуклеотиды аминолинкером и исследовали стабильность, связанную с 5'-концом. Олигонуклеотиды Mc3N* и M*c3N ингибируют теломеразу одинаково в условиях in vitro. В первом олигонуклеотиде оба 5'-конца не защищены, во втором защищены полностью. В условиях in vivo их ингибирующие активности различаются в 10 раз. Существует корреляция между защитой 5'-конца и ингибирующей

0 1 2

количество 5' не зашпшен. концов Рис. 7. Корреляция числа незащищенных 5'-концов и ингибирования теломеразы. Для представления были использованы химерные олигонуклеотиды,

составленные из М и N частей: МсЗИ* (количество 5'-

незащищенных концов - 2), МсЗК и ЫсЗМ (количество 5'-незащищенных концов - 1), M*cЗN и сЗМсЗЫ (количество 5'-незащищенных

концов - 0).

способностью в условиях in vivo (рис. 7). Тот же эффект проявляется для олигонуклеотида МсЗМ (табл. 1).

Наиболее сильный эффект при защите 5'-конца проявляется для олигонуклеотида М. В условиях in vitro разницы в ингибировании между сЗМ и МсЗ не было. Однако в условиях in vivo IC50 для 5'-защищенного сЗМ составляет 5,2 нМ, тогда как для 5'-незащищенного МсЗ - 175 нМ, что дает различие больше, чем в 30 раз. Для химерных олигонуклеотидов это отличие составляет всего 3-4 раза. Возможная причина заключается в том, что химерные олигонуклеотиды состоят из 2-х частей и 5'-защита во втором олигонуклеотиде сильно замедляет деградацию. Однако для

25 20

1 15

2 lo

5 0

-Г

Рис.8. Влияние длины линкера и позиции в химерных олигонуклеотидах на ингибирование

теломеразы in vivo.

олигонуклеотидов Nc3J и N*c3J ингибирующие эффекты были одинаковы. Это может

быть объяснено худшей

ингибирующей способностью N*c3J по сравнению с Nc3J.

Для исследования влияния длины линкера на ингибирующую способность кроме химеры Mc3N, были синтезированы

олигонуклеотиды, соединенные через триэтилен- и гексаэтилен-гликоль. MNc3 был использован как контроль с нулевой длиной линкера. Во всех олигонуклеотидах 5'-конец не защищен. Результаты представлены на рис. 8. Полученные данные показывают, что длина линкера между олигонуклеотидами не влияет на их ингибирующую способность.

Подозрение в специфичности вызвали химерные олигонуклеотиды, состоящие из N и J частей, так как в условиях in vitro эти олигонуклеотиды не ингибируют теломеразу, тогда как в системе in vivo сравнимы с остальными химерными олигонуклеотидами.

Для проверки специфичности ингибирования в условиях in vivo за счет комплементарности олигонуклеотида были введены нуклеотидные замены в каждую часть химеры Nc3J (Nmisc3J, Nc3Jmis, Nmisc3Jmis) (табл. 1), нарушающие такое

0 5 10

число введенных нуклеотидов некомплементарных IiTR

Рис.9. Корреляция зависимости ингибирующей способности химерных нуклеотидов в условиях in vivo от числа введенных замен нуклеотидов, некомплементарных hTR.

взаимодействие. Количество нуклеотидных замен составило 5-6 на каждую часть. Корреляция количества замен и ингибирующей способности оказалось линейной (рис.9). Замена N и J частей в Nc3J химере на комплементарные (compNc3compJ) (табл. 1) привела к полной потере ингибирующей способности в условиях т vivo. Это говорит о присутствии ингибирующего эффекта за счет комплементарных взаимодействий олигонуклеотидных частей химер и hTR.

Для подтверждения специфичности действия химерных олигонуклеотидов только на теломеразу была проверена токсичность наиболее активных химерных олигонуклеотидов на клетки НЕК293Е методом определения жизнеспособности клеток (МТТ) (рис. 10), так как ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivo может быть обусловлено их цитотоксическим действием. Только в случае M*c3N и N*c3J (рис. 10, Д и Е) виден слабый спад выживаемости. Он начинается с концентрации 10 нМ и не доходит до 50%. Однако эти олигонуклеотиды снижают теломеразную активность наполовину при концентрации менее 1нМ.

10 IOIKI

< ('чш), нМ

('(". lili). нМ

Рис. 10. МТТ анализ цитотоксичности химерных олигонуклеотидов при разной концентрации на клетках НЕК293Е. А - М*сЗМ, Б - сЗМ1Ч, В- Мс31Ч, Г - N¿31, Д - М*сЗЫ, Е - М*с31

Из полученных данных следует, что влиянием токсичности олигонуклеотидов при оценке ингибирования теломеразы in vivo можно пренебречь.

Один из возможных путей, приводящих к снижению теломеразной активности это -деградация hTR. В связи с этим мы решили проверить стабильность hTR в клетках в присутствии химерных олигонуклеотидов.

Количество hTR в клетках НЕК293Е, культивируемых в присутствии различных концентраций химерных олигонуклеотидов, было измерено методом ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (RQ-ПЦР) с использованием мРНК фермента

глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (вАРОН) как внутреннего контроля, так как уровень мРНК этого фермента постоянен в клетке. Относительное количество полученной ЬТЯ нормировалось на количество вАРОН.

Для олигонуклеотидов Ыс31, №и$с31пш, МсЗ-Тпив, сЗМЫ, МсЗЫ и М*сЗМ при увеличении их концентрации при трансфекции уровень ЬТЯ в клетке значимо не менялся (рис. 11) и не коррелировал с изменением теломеразной активности. Следовательно, химерные олигонуклеотиды не влияют на стабильность ИТЯ.

„ . Хт^СЗЛик

12(1

£100

£ N11 <•<>

| 4(1

£.20

120

100

н 80

60

X 40

о 20

>< 0

0.01 0Л 1 10 100 1000 10000 С(олиг). нМ

О -II)

а,

>' 20

. 160 Й 140 ¡3 120 "л ico as su

w. 140 g 120 ■ 3 íoo

С(олиг), н.М

МсЗХ

0.01 1 100 С(олиг), нМ МсЗМ

Н--+-Ч

1 100 10000 С(олиг). нМ

ЦОЛИГ). .11 С(олиг). нМ

Рис. 11. Стабильность теломеразной РНК в условиях «ги vivo» в присутствии разной концентрации химерных олигонуклеотидов. Представлены зависимости уровня hTR в % от концентрации используемых олигонуклеотидов в культуральной среде. За 100% принят уровень hTR в клетках, не обработанных олигонуклеотидами.

Из предыдущих данных видно, что химерные олигонуклеотиды не ингибируют теломеразу за счет деградации hTR и не имеют цитотоксического действия на клетки. Если эти олигонуклеотды запускают какие-то сигнальные пути, то могут ингибировать теломеразу за счет подавления экспрессии или пост-трансляционной модификации hTERT. Однако наиболее вероятный и простой механизм ингибирования теломеразы в клетке — возможное нарушение сборки теломеразного комплекса за счет блокирования взаимодействия hTERT и hTR.

Для проверки возможного влияния химер на сборку теломеразы было проведено центрифугирование в сахарозном градиенте клеточных экстрактов, полученных после трансфекциий клеток олигонуклеотидами, концентрация которых была больше, чем Ю50. Фракции после разделения были собраны, начиная с более тяжелых. В каждой фракции было измерено количество ЬТЯ и теломеразная активность. Данные показаны на рис. 12.

5Í 5>

С, 50-

140

120 в. ^ 100 -

0 t 80

tt г.

Él"60 5 £

j S 40

1 P

c 20

0

5 10

номер фракции

-»- HEK293+M*c3M -в- HEK293

5 10 15

номер фракции

В

rh

тип

!4*c3J M*c3N M*c3M c3MN

трансф.

Рис.12. Оценка сборки теломеразы. А. Распределение hTR и теломеразной активности по фракциям градиента, полученного после центрифугирования клеточного экстракта НЕК293 в градиенте сахарозы. Б. Распределение hTR после градиентного центрифугирования экстрактов полученных из клеток НЕК293 и НЕК293, трансфецированных М*сЗМ химерным олигонуклеотидом. В. Количество собранной теломеразы, оставшейся после трансфекции химерными олигонуклеотидами in vivo.

Для клеток НЕК293 пик количества hTR совпадает с пиком теломеразной активности (рис.12А). Это означает, что этот пик принадлежит собранной теломеразе. Для сравнения, распределение hTR для клеток НЕК293 клеток, инкубированных в присутствии М*сЗМ химеры (наиболее сильный теломеразный ингибитор в системе in vivo), показано на рис. 12Б.

Видно, что количество hTR сильно уменьшается (до 22%) в пике с собранной теломеразой. Данные для c3J и других эффективных химер Nc3J, M*c3N, c3MN

суммированы на рис. 12В. Все наиболее активные химеры ощутимо влияют на сборку теломеразы. Самый сильный эффект показала химера Nc3J, для которой почти не детектировался собранный теломеразный комплекс. Необходимо отметить, что c3G почти не влиял на сборку теломеразы (рис. 12В).

В ходе разработки новых подходов ингибирования теломеразы были созданы химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух модифицированных олигонуклеотидов, соединенных ненуклеотидным линкером и комплементарных к разным участкам hTR. Было показано, что эти олигонуклеотиды не цитотоксичны и не вызывают деградацию мишени hTR в клетке. Был определен механизм действия таких химер, заключающийся в ингибировании сборки теломеразы. Также было показано, что усиление ингибирования теломеразы в клетке химерными олигонуклеотидами обеспечивается увеличением их стабильности за счет защиты на 5'-конце.

При анализе ингибирующих способностей химер in vitro оказалось, что химеры, состоящие только из разнонаправленных частей М, ингибируют теломеразу в 7 раз лучше, чем индивидуальный М. Это дополнительно подтверждает, что в условиях in vitro теломераза является димером. Разница для таких химер и отдельного М при анализе in vivo составила несколько порядков, что свидетельствует в пользу утверждения о димеризаций hTR в процессе сборки теломеразного комплекса.

В условиях in vitro химерные олигонуклеотиды, состоящие из М и N частей, ингибировали теломеразу, тогда как слитый MN не ингибировал. Отсюда следует, что разработанные химерные олигонуклеотиды, состоящие из М и N, М и М частей, уменьшают активность теломеразы в клетке за счет ее прямого ингибирования и за счет блокирования сборки теломеразы одновременно. В ходе работы также была проверена специфичность действия химерных олигонуклеотидов в клетке. Эффективность химер JN при тестировании иигибироваиия теломеразной активности в клетке выше, чем у олигонуклеотида с последовательностью Иметелстата, почти в 30 раз. Доказанный механизм действия химер, а именно, блокирование сборки теломеразы, является несомненным плюсом для последующей разработки препаратов на их основе.

выводы

1. Новая система экспрессии основных компонентов теломеразного комплекса человека позволяет повысить уровень теломеразы в клетках НЕК293Е по сравнению с описанными ранее.

2. Разработанный метод количественного определения теломеразной активности позволяет измерять ингибирование теломеразы веществами, влияющими на ПЦР и стабилизирующими в-квадруплексы.

3. Производные антра[2,3-Ь]тиофен-5,10-дион, 2-алкилтио-5-арилметилен-4Н-имидазолин-4-он и его медь содержащий комплекс являются ингибиторами теломеразы.

4. Химерные олигонуклеотиды, состоящие из двух частей, комплементарных разным районам ЬТ11 и соединенных ненуклеотидным линкером, ингибируют сборку теломеразы.

5. Димеризация теломеразы человека подтверждена с помощью серии химерных олигонуклеотидов, ингибирующих активность теломеразы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Vasilkova D.V., Azhibek D.M., Zatsepin T.S., Naraikina Y.V., Prassolov V.S., Proko M.M., Zvereva M.M., Rubtsova M.P. Dynamics of human telomerase RNA structure revealed by antisense oligonucleotide technique. // Biochimie. -2013,- V. 95.- P. 2423-2428.

2. Majouga A.G., Zvereva M.I., Rubtsova M.P., Skvortsov D.A., Mironov A.V., Azhibek D.M., etc. Mixed Valence Copper(I,II) Binuclear Complexes with Unexpected Structure: Synthesis, Biological Properties and Anticancer Activity. II J Med Chem.- 2014,- V. 57.- P. 6252-6258.

3. Azhibek D., Zvereva M., Zatsepin Т., Rubtsova M., Dontsova O. Chimeric bifunctional oligonucleotides as a novel tool to invade telomerase assembly. // Nucleic Acids Res.- 2014.-V. 42.-P. 9531-9542.

4. Ilyinsky N.S., Shchyolkina A.K., Borisova O.F., Mamaeva O.K., Zvereva M.I., Azhibek D.M., etc. Novel multi-targeting anthra[2,3-b]thiophene-5,10-diones with guanidine-containing side chains: Interaction with telomeric G-quadruplex, inhibition of telomerase and topoisomerase I and cytotoxic properties. // Eur J Med Chem. -2014,- V. 85. -P. 605614.

5. D. Azhibek, T. Zatsepin, M. Zvereva and O. Dontsova. Determination of kinetic parameters of telomerase inhibition by telomerase RNA template antagonist. // FEBS Journal.- 2013.-Issue Supplement si. -V. 280. -P. 303.

6. M. Rubtsova, D. Vasilkova, A. Malyavko, D. Skvortsov, D.Azhibek and O. Dontsova. Endonuclease cleavage is the first event of human telomerase RNA З'-end processing. // FEBS Journal.- 2013,- Issue Supplement si. -V. 280. -P. 47.

Подписано в печать 23.12.2014 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ № 7466-12-14 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39