Теломераза в клетках опухолей шейки матки тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

СКВОРЦОВ ДМИТРИИ АЛЕКСАНДРОВИЧ

Теломераза в клетках опухолей шейки матки: отдельные этапы регуляции

02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2009 2 С """

003465035

Работа выполнена на кафедре Химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имеии М.В. Ломоносова.

Защита состоится 31 марта 2009 г. в 17.00 на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 199992, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 28 февраля 2009 г.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН Донцова Ольга Анатольевна, кандидат химических наук, Рубцова Мария Петровна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор член-корр. РАН, Кочетков Сергей Николаевич, доктор биологических наук Лихтенштейн Анатолий Владимирович'

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 1961 году Хайфлик и Мурхиад показали, что культура соматических клеток имеет ограниченный период жизни. В 1973 году Оловников предположил, что укорочение концов хромосом - теломер - определяет возможное число делений клетки. Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и в регуляции транскрипции генов прителомерной области. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), должен существовать механизм, компенсирующий укорочение теломер. В 1985 году Блекберн и Грейберг открыли фермент, удлиняющий теломеры - теломеразу. Основными компонентами теломеразы являются обратная транекриптаза и матричная РНК.

Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Показано ее наличие в некоторых клетках крови, в тканях репродуктивных органов и некоторых быстро обновляющихся тканях, например, в кишечном эпителии и базалыюм слое клеток кожи. Активация теломеразы в раковых клетках наблюдается в 80 - 90% случаев. Активность теломеразы в соматических клетках ниже, чем в опухолевых. Недавние исследования показали, что в клеточных культурах, полученных из эпителия бронхов курильщиков, теломеразная активность повышена. Наличие теломеразной активности характерно именно для злокачественных опухолей, в то время как в доброкачественных опухолях активность этого фермента либо не выявляется вовсе, либо частота ее обнаружения низка. Активность теломеразы может появляться па разных стадиях перерождения в зависимое™ ог типа рака.

Механизмы, регулирующие работу теломеразы, могут быть важными мишенями при онкогенезе и, соответственно, противоопухолевой терапии. У человека б белков (TRF1, TRF2, hRapl, TIN2, ТРР1 и РОТ1) формируют так называемый шелтериновый комплекс, который является постоянным компонентом человеческих теломер. Белки TRF1 и TRF2 связываются с двуцепочечным участком теломерных повторов в виде гетеродимера, а РОТ1 связывается с одноцепочечным З'-концом теломер. Белок RPA тоже может связываться с одноцепочечиыми участками теломер и расплетать теломерпые G-квадруплекеы, но неизвестно как это влияет на работу теломеразы.

В данной работе с помощью системы in vitro, полученной на основе экстрактов клеток человека, содержащих и не содержащих RPA, исследовали влияние репликативного белка A (RPA) в широком диапазоне концентраций на работу теломеразы человека. Кроме того, в работе исследовали, на каком этапе опухолевого поражения шейки матки происходит активация теломеразы.

Цель работы.

1. Изучить влияние белка RPA на активность теломеразы in vitro.

2. Определить на каком этапе опухолевого поражения шейки матки происходит активация теломеразы.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В ходе данной работы при помощи TRAP-теста п системы in vitro, полученной на основе экстрактов клеток человека, содержащих и не содержащих RPA, показана возможность регуляции активности теломеразы белком RPA на этапе связывания с теломерой. Обнаружено, что недостаток белка RPA негативно сказывается на способности теломеразы человека удлинять ДНК-праймер в экстрактах клеток HeLa. Добавление небольшого количества RPA восстанавливает способность теломеразы удлинять праймер в процессивпой манере. Увеличение концентрации RPA приводит к ингибироватпо теломеразы.

При раке шейки матки кроме транскрипционной регуляции hTERT существуют и другие заметные этапы регуляции теломеразы, поскольку теломераза активна не во всех случаях обнаружения мРНК hTERT. При этом частота встречаемости теломеразной активности и экспрессии полноразмерной формы мРНК hTERT возрастает при переходе от нормы и ранних предраковых поражений к раку шейки матки. В частности регуляция может происходить на этапах связывания с теломерами и сплайсинга мРНК hTERT.

Полноразмерная форма мРНК гена hTERT кодирует функционально полноценную теломеразнуга обратную транскриптазу. Полноразмерная форма мРНК гена hTERT найдена в 55% случаев условно-нормальной ткани (гистологически нормальной ткани, прилегающей к опухоли) и присутствует во всех опухолевых образцах. Экспрессия а-формы мРНК hTERT наблюдается в 100% условно-нормальной ткани, и частота встречаемости этой формы уменьшается при переходе от нормы к раку, в то время как частота обнаружения теломеразной активности возрастает при переходе от нормы к раку. Можно предположить участие a-формы в отрицательной регуляции теломеразной активности. В то же время отсутствует специфичность экспрессии ß-формы и a+ß-формы мРНК hTERT на разных стадиях цервикальных интраэпителиальных неоплазий (CIN). Наличие или отсутствие ß- и a+ß-форм мРНК hTERT не влияет на активность теломеразы при раке шейки матки.

В работе показана возможность использования теломеразной активности для диагностики рака уже на ранних стадиях заболевания, поскольку теломеразная активность присутствует в опухолевых тканях независимо от стадии и появляется во время предраковых заболеваний (CIN). Активность теломеразы и экспрессия гена hTERT могут быть и в условно-нормальной ткани. Возможно, данные о наличии теломеразной активности в условно-нормальной ткани могут учитываться при назначении последующего лечения.

Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены фундаментальные результаты, позволяющие уточнить функции белка RPA и описать его влияние на теломеразу человека in vitro. Также получены данные, что активация теломеразы происходит на стадии предопухолевых поражений шейки матки.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: 8th International Engelhardt Conference On Molecular Biology "RNA-protein interactions", 19-24 August 2006, Sergiev Posad, Russia; международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов -2008», 9-10 апреля 2008, Москва, Россия; «Фундаментальная онкология - Петровские чтения)) 18 апреля 2008, г. Санкт-Петербург, Россия; "Выставка инновационных проектов" 20 ноября 2008, Москва, Россия; Eurogin Congress, April 23rd to 26th 2006, Paris, France, "Telomeres&Telomerase", May 2-6, Cold Spring Harbor, 2007, New York, USA.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 96 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы и выводы. Материал иллюстрирован 23 рисунками и 5 таблицами. Библиографический указатель включает 235 цитированных работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Опухоли шейки матки отличаются от других онкозаболеваний тем, что они индуцируются вирусами папилломы человека (ВПЧ). В то же время, одним из наиболее универсальных отличий раковых клеток от нормальных является наличие теломеразной активности. Известно, что белок Еб онкогенных ВПЧ активирует транскрипцию гена hTERT. Регуляция транскрипции гена hTERT считается основным этапом регуляции теломеразы. В связи с этим возникает вопрос, достаточно ли для появления теломеразной активности только инфицирования клеток ВПЧ высокой группы риска? Или происходит активация теломеразы ири прогрессии опухоли? Какие механизмы в этой регуляции задействованы?

Охватить в рамках одной работы всю систему регуляции теломеразы нереально. Вначале было решено рассмотреть один из наименее изученных этапов регуляции теломеразы - связывание с теломерой. В рамках этой задачи исследовали влияние на теломеразную активность связывающего одноцепочечную ДНК (оцДНК) человеческого белка RPA и его аналога из E.coli - SSB. Исследование проводили на модельной системе рака шейки матки - ВПЧ-содержащей клеточной линии HeLa.

При большом количестве информации по многим аспектам регуляции теломеразы заметной проблемой является наличие данных только по модельным системам и отсутствие их проверки и подтверждения на опухолях. С целью уточнения данных на опухолях шейки матки была выбрана регуляция теломеразной активности с помощью альтернативного сплайсинга.

1. Активность теломеразы в раках шейки матки

Активация теломеразы в опухолях - явление повсеместное, выявляемое в большинстве опухолевых клеток. Теломеразная активность не проявляется в нормальных клетках, но обнаружена в иммортальных клетках, культивируемых in vitro, а также в стволовых и половых клетках. В силу этого активация теломеразы может служить потенциальным маркером в диагностике рака. С другой стороны известно, что опухолевые клетки некоторых типов могут использовать альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации. Теломераза может активироваться как на ранних, так и на поздних стадиях рака. В связи с этим, для решения вопросов использования теломеразной активности в качестве диагностического маркера и времени ее активации необходимо предварительное изучение активиости этого фермента в большом наборе опухолей, находящихся на разных стадиях профессии.

Рак шейки матки принадлежит к числу наиболее распространенных онкологических заболеваний у женщин. Это заболевание связано с инфекцией вирусами из группы папиллом. Белок Е6 ВПЧ высокого онкогенного риска способен активировать транскрипцию гена теломеразной обратной транскриптазы, так что в случае этого рака теломеразная активность может появляться уже на ранних стадиях прогрессии.

Задачей данной части работы являлось определение теломеразной активности в образцах злокачественных опухолей различных стадий, содержащих геномы ВПЧ. Кроме того, оценивали потенциальную пригодность теломеразного теста в ранней диагностике рака шейки матки, вызываемого ВПЧ, Предпосылками для этой работы были сообщения о наличии теломеразной активности, с одной стороны, в опухолях шейки матки, а с другой стороны, в клеточных линиях, полученных из клеток, зараженных ВПЧ.

1.1 Проверка TRAP-системы на клеточных линиях

Для получения модельной системы, а также отработки и контроля метода нами были выбраны клеточные линии Silla и HeLa, полученные из материалов рака шейки

матки. Эти линии по литературным данным содержат активную теломеразу и ВПЧ. Клеточная линия 81На содержит интегрированный геном ВПЧ-16, а НеЬа содержит ВПЧ-

При очистке теломеразы с помощью улътрацентрифугирования (получение в 100 экстракта и затем очистка в глицериновом градиенте) оказалось, что активность и процессивность очищенного фермента возрастает. Есть несколько объяснений подобного эффекта. Во-первых, в концентрированном экстракте может быть слишком много ДНК-связывающих белков. Эти белки могут мешать работе теломеразы, блокируя связывание теломеразы с субстратом, а при разведении субстрат деблокируется. Во-вторых, большие концентрации теломеразы теоретически могут приводить, например, к конкуренции за субстрат. Но подобное объяснение маловероятно, так как количество теломеразы в клетках и соответственно экстракте очень невелико (порядка 100 молекул на клетку, менее чем 5* 10"13 М в экстракте). В-третьих, в клетках возможно присутствие веществ, ингибирующих активность уже готового фермента. В каждой контрольной дорожке с ЭЗО экстрактом (рис.1, дорожки 18,19) мы использовали то же количество экстракта, что и суммарно в остальных дорожках (рис. 1, дорожки 1-17). При этом в литературе не описаны присутствующие в клетке вещества обладающие ингибирующим эффектом. Схожая картина (хотя и не такая яркая) наблюдается при разведении как экстрактов из

123 456789 10 11 1213 1415 1617 1810 20

Рис. 1. Теломеразная активность в глицериновом градиенте экстракта клеточной линии НеЬа. Дорожки 911 - активность теломеразы в фракциях глицеринового градиента, обогащенных ферментом, 1-8 и 12-17 активность теломеразы в остальных фракциях глицеринового градиента, 18,19- активность теломеразы в ЭЗО экстракте, 20 контроль без экстракта.

1.2 Теломеразная активность в опухолевых образцах

Рак шейки матки является стадийным заболеванием и ранняя диагностика является одним из важнейших элементов в профилактике и лечении этого заболевания.

Нас интересовала зависимость теломеразной активности от стадии опухолевого процесса. Всего нами было отобрано 28 опухолей, которые представляли собой плоскоклеточные карциномы различных стадий по классификации ВОЗ и FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics - Международная федерация акушеров и гинекологов). Характеристика использованных образцов представлена в

18.

клеточных линий, так и полученных из операционных материалов. При увеличении концентрации экстракта сначала теломеразная активность появляется и возрастает, а при дальнейшем увеличении концентрации процессивность уменьшается.

таблице 1 (в данном случае обозначение Т означает размер опухоли, N - наличие метастазов в регионарные лимфоузлы и М - наличие метастазов в отдаленные лимфоузлы). Среди проанализированных нами 28 опухолей большая часть относилась к ранним стадиям Т1 и Т2 (25 образцов). У 7 больных обнаружены метастазы в регионарные лимфоузлы. Такая выборка больных объясняется прежде всего тем обстоятельством, что именно верификация ранних форм заболевания представляет наибольший интерес для клиницистов, а с другой стороны нас интересовал вопрос о возможности отличия метастатических форм от неметастатических.

Во всех опухолях ранее нашими коллегами из лаборатории молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина был идентифицирован ВГ1Ч-16, который является превалирующим среди популяции больных раком шейки матки в России.

Данные по тестированию теломеразной активности представлены в таблице 1, а пример результатов на рисунке 2А. Для всех опухолевых образцов после амплификации сигнала с помощью Г1ЦР были получены характерные спектры полос на электрофореграмме, отражающие синтез теломерных повторов, катализируемый теломеразой (рис. 2А, дорожки 2-10). Не выявлено различий между опухолями шейки матки от больных с метастазами и без них. В качестве положительного контроля использовали клетки НеЬа, в которых присутствует активная теломераза (рис. 2А, дорожка 1). При этом теломеразная активность отсутствует в контрольных препаратах, полученных обработкой клеточных лизатов РНКазой А, которая разрушает РНК, входящую в состав теломеразы, тем самым инактивируя фермент (рис. 2Б, дорожки 2, 4). В качестве альтернативного негативного контроля представлено тестирование теломеразной активности в образце доброкачественного поражения шейки матки (по морфологическому заключению), Теломеразная активность в этом образце отсутствует (рис. 2А, дорожка 10).

123456789 10

А

12 3 4

Б

Рис. 2. Анализ теломеразной активности методом TRAP. Номера соответствуют номерам в коллекции образцов в ГУ РОНЦ им. H.H.Блохина.

А. Теломеразная активность в образцах опухолевых тканей. Дорожка 1 - теломеразная активность в клеточной линия IleLa, дорожки 2-9 ~ в образцах раковых тканей из коллекции образцов ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина, дорожка 10 - в образце доброкачественного поражения шейки матки.

Б. Теломеразная активность в образцах раковых тканей до (дорожки 1 и 3) и после (дорожки 2 и 4) обработки РНКазой А. Стрелкой указана полоса неспецифического сигнала.

Обращает на себя внимание тот факт, что количество и размер амплифицнрованных продуктов теломеразы (так называемая "лесенка") варьирует в разных опухолевых образцах. Это может быть связано как с различной регуляцией теломеразы в опухолях, так и с разным соотношением числа опухолевых клеток к общему числу стромальных и других неопухолевых клеток в образце, который использовали для анализа. При разделении продуктов, полученных с помощью ТЯАР-теста, в иолиакриламидном геле мы наблюдаем сигнал, по положению соответствующий первому теломерному повтору (рис. 2Б, отмечен стрелкой), даже в образцах с инактивированной теломеразой (рис. 2Б, дорожки 2 и 4). В литературе широко распространены методы, основанные на тестировании теломеразной активности на основе ТЯАР-теста без разделения продуктов амплификации гель-электрофорезом. Наличие сильного неспецифического сигнала, обнаруженного в данной работе свидетельствует о том, что определение теломеразной активности с помощью ТИАР-теста без разделения гель-электрофорезом может приводить к обнаружению ложно-положительных сигналов при исследовании опухолевых образцов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в 100% исследованных в этой работе опухолевых образцах присутствует теломеразная активность, выявляемая Т1ЗДР-тестом (табл. 1). Мы предполагаем, что при данной форме рака длина теломер поддерживается именно за счет активации теломеразы (в 2 образцах активность теломеразы слабая). Не выявлено различий между метастазирующими и

неметастазирующими опухолями. Важно, что активность теломеразы обнаруживается и в тех опухолях, которые находятся на ранних стадиях развития. Это делает возможным использование теломеразной активности в качестве маркера опухолевой трансформации на ее ранних этапах.

Табл. 1. Характеристика плоскоклеточных карцином шейки матки, содержащих геном ВПЧ-16.

Номер опухоли Клиническая и гшоморфологическая характеристика Теломеразная активность

654 Т161Ч0М0 да

648 таомо да

699 ТШОМО да

652 ПбШМО да

659 Т1бЛ0М0 Да

734 ТШ1М0 Да

647 Т2Ш1М0 да

650 Т2ШМ0 да

738 •ПбШМО да

739 Т2ШМ0 да

736 ТШ1М0 да

665 Т261Ч0М0 да

656 ТШОМО да

657 Т2ШМ0 да

712 Т16Ш1М0 да

716 Т!62ШМ0 да

483 ПбШМО да

579 ПаЫхМО да

592 ПбШМО да

583 Т26ШМ0 да

588 Т162ШМ0 да

735 ПбШОМО да

682 ТЗМ1М0 да

630 ТЗ>11М0 да

650 тзшмо да

723 ншмо да

719 Т1ШМ0 да

1.3 Теломеразная активность в образцах условно-нормальных тканей

При хирургических

Д операциях врачи удаляют не

только видимую ими опухоль, но и слой морфологически нормальной ткани вокруг опухоли толщиной несколько

миллиметров (условно-

нормальная ткань). Была протестирована серия из 14 образцов таких тканей, гистологически верифицированных как

нормальные в паре с раковыми образцами. В ряде условно-нормальных образцов была обнаружена заметная

теломеразная активность (рис. 3). Возможно несколько причин появления в этих тканях некоей фракции клеток содержащих активную теломеразу. Это могут быть клетки крови, или микропроросты опухоли в нормальную ткань, или морфологически еще нормальные клетки, зараженные ВЛЧ в Это подтверждает эмпирическое

740 654 648 n t nt nt

699 n t

652 659 734 647 ntntntnt

Рис. 3. Анализ теломеразной активности методом TRAP в образцах опухолей и парных им условно-нормальных тканей. Номера соответствуют номерам в коллекции образцов ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина. п — теломеразная активность в образцах условно-нормальной ткани. I — теломеразная активность в соответствующих образцах раковой ткани.

которых инициировался процесс трансформации, правило по удалению опухоли "с запасом". Возможно, данные о наличии теломеразной активности в условно-нормальной ткани могут учитываться при назначении последующего лечения, однако это требует серьезных дальнейших исследований.

2. Активация теломеразы в предраковых поражениях шейки матки

Поражения шейки матки, в той или иной степени связанные с развитием опухолевого процесса можно условно разделить на 2 группы - предопухолевые (CIN разных стадий) и непосредственно опухоли. (Материалы для исследования CIN были любезно предоставлены к.м.н. Л.И.Короленковой (поликлиника ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина) после предварительно кольпоскопичкского контроля больных).

Существует несколько стадий CTN, которые характеризуются рядом морфологических изменений, которые достаточно четко определяются при гистологическом и цитологическом исследовании.

Отличительной особенностью предопухолевых поражений является их способность к возможной регрессии. Для CIN I регрессия достигает гораздо большей степени, чем для CIN II и CIN III. До настоящего времени не существует четких диагностических критериев, позволяющих определять CIN, способные к регрессии, и CIN, прогрессирующие к злокачественному фенотипу.

Поскольку в опухолях теломераза уже активна, но не активна в нормальных тканях, теломеразная активность должна появляться на стадии предракового поражения. Теломераза представляет собой комплекс, содержащий белок и РНК-матрицу. Основным

этапом регуляции теломеразы и литературе считается активация экспрессии мРНК hTERT, которая и клетках может быть представлена несколькими спланированными формами. Основными среди них являются полноразмерная, а-форма, ß-форма и a+ß форма. Схема представлена на рисунке 4. В совместной работе с лабораторией молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им H.H. Блохипа было проведено сравнение различных типов сплайсированных форм мРНК hTERT и теломеразной активности на ранних стадиях канцерогенеза.

11 НИ» IS

Полноразмерная мРНК

ТТы.Ц.М.|.Ци1"НиМ И 1

а-делеция |3-делеция

а+Р-делеция

Рис. 4. Схема мРНК, кодирующей каталитическую субъединицу теломеразы, и сс другие формы, получающиеся во время сплайсинга.

ТТТТТЦЛ |.H»|hH»R

2.1 Теломеразная активность и экспрессия мРНК hTERT в образцах предраковых поражений

В большинстве опухолей появление теломеразной активности коррелирует с появлением мРНК hTERT. Эта корреляция не 100% (есть случаи когда есть мРНК, но нет активности теломеразы), а па модельных системах показана возможность регуляции теломеразной активности на этапах сплайсинга мРНК hTERT, посттрансляционных модификаций теломеразы, доступа на теломеры. В связи с этим, желательно не только контролировать появление мРНК, но и детектировать теломеразную активность. Основной сложностью применения метода TRAP к анализу клинических образцов является приготовление клеточных экстрактов, поскольку, в отличие от клеточных линий, которые содержат только определенный тип клеток, в клинических образцах представлены и другие типы тканей. На операционных образцах опухолей была стандартизована методика их разрушения с целью приготовления экстрактов, содержащих активную теломеразу. В случае предраковых поражений основная сложность заключалась в том, что для анализа доступны лишь очень небольшие фрагменты тканей, разрушение которых в условиях, разработанных для образцов опухолей, доступных в больших количествах, приводит к получению разбавленных растворов, в которых детекция теломеразной активности затруднена. В связи с этим мы разработали специальный подход для приготовления концентрированных экстрактов из образцов весом 10-100 мг. Разработку данного подхода проводили на модели опухолевых препаратов, в которых ранее была обнаружена теломеразная активность. Первоначально метод был отработан на образцах опухолей 10-! 00 мг. В результате нам удалось добиться стабильно воспроизводимых результатов детекции активности теломеразы. На следующем этапе была проанализирована серия образцов CIN. Оказалось, что действительно, в ряде образцов была обнаружена теломеразная активность, а в ряде образцов она отсу тствует. Примеры полученных данных приведены на рисунках 5, 6.

Как наличие, так и отсутствие теломеразной активности на стадии СШ говорит об активации теломеразы в начале опухолевого процесса. Можно предположить, что активация теломеразы в тканях происходит, в основном, при поражении ВПЧ группы

высокого онкогенного риска (как это было показано на модельных клеточных линиях), поскольку частота встречаемости как ВПЧ группы высокого риска, так и активной теломеразы на ранних стадиях СГЫ составляет 30-40%.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 S R

Рис. 5. Определение теломеразной активности в образцах предраковых поражений. Дорожки I, 4, 7 теломеразная активность в образцах CIN П. Дорожки 2, 3, 13 - теломеразная активность в образцах CIN II, 111. Дорожка 5, 6, 12 - теломеразная активность в образцах CIN III. Дорожка 8, 9 ~ теломеразная активность в образцах миомы. Дорожка 10 — теломеразная активность в образцах нормального эпителия. Дорожка 11 — теломеразная активность в образцах рака in situ. Дорожка S - теломеразная активность в экстракте клеточной линии SiHa. Дорожка R теломеразная активность в экстракте SiHa, предварительно обработанном РНКазой А.

В первых экспериментах были использованы здоровая ткань и доброкачественные поражения шейки матки (миомы) для сравнения с CIN различных стадий и проверки, что нет неспецифического сигнала от пролиферирующих клеток крови (рис. 5). Нет теломеразной активности при нераковых поражениях и высокую активность теломеразы в большинстве поздних стадий CIN (III), хотя встречались и CIN III стадии без теломеразной активности (рис.5, дорожка 6). Для определения теломеразной активности полуколичественно и более эффективного сравнения образцов в работе использовали разные количества экстракта, изменяя количество суммарного белка, добавляемого в реакцию от 0,1 до 5 мкг (рис.6). В качестве положительного контроля на рис. б представлено определение теломеразной активности в препарате опухолевых клеток аналогичного размера.

S П кбш57 кбш51 кбш49 к6ш42 кйш41 кбшЗб кйш37 к6ш40 кбш32 кбш50 кбш52 кбш55 кбш56 кбш58 849с П S

. ... щ *iw -

— ц ~ щ ^tovr ff""

*> W ■> is ^ в

»«#84

Кол-во -

0,10,S2 50,10,5 2 50,10,52 50,10^250,10,52 5 5 2 0,50,15 2 0£J,15 2031,1 5 2 0,50,15 2 0£0,1520i0f1520£0,l 5 20,5«,1520,50,1520,50,1

белка,

МКГ

Рис. 6. Определение теломеразной активности: КБ11! - в ойразцах СТН с раститровкой по количеству экстракта, 849с- образец раковой ткани, II - без образца, в - в клетках линии БИа.

При этом наблюдается высокая активность и процессивпость (количество синтезированных повторов) теломеразы (рис. 6, образец 849С). В качестве отрицательного контроля использовали ту же реакцию без добавления клеточного экстракта. При анализе образцов С1М оказалось, что теломеразная активность наблюдается только в 19 из 31 проанализированных образцов (таблица 2).

Таблица 2. Теломеразная активность в образцах предраковых поражений. CIN, -и карцинома in situ - CIS.

Образцы Теломеразная активность

Условно-нормальная ткань 8/14 (60%)

CIN I 4/10(40%)

CIN II 7/10 (70%)

С FN III - CIS 8/11 (73%)

В совместной работе с лабораторией молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина проводили анализ мРНК hTERT в той же серии образцов.

В результате работы были выделены РНК из 36 образцов биопсий шейки матки. Из них 11 образцов представляют собой условно-нормальную ткань, 18 образцов - CIN разных стадий и б образцов - плоскоклеточные карциномы. Качество полученного препарата РНК проверяли по рибосомной РНК. Соотношения количества 28S и 18S рибосомных РНК составляло 3 к 1, что говорит о хорошем качестве полученного препарата.

После проведения обратной транскрипции, качество полученной кДНК проверяли с помощью амплификации renoR «домашнего хозяйства» GAPDH иНРЯП,

Использование праймеров, комплементарных как последовательностям РНК, удаляемым при сплайсинге, так и последовательностям, образуемым после сплайсинга, позволяет амплифицировагь цолноразмерную, а, ß и а+р формы мРНК hTERT независимо.

Все исследованные образцы биопсий шейки матки были разделены натри группы в зависимости от стадии поражения шейки матки. В первую группу вошли условно-нормальные ткани. Во вторую группу были объединены CIN легкой степени тяжести (CIN I и CIN II). А в третью группу - CIN тяжелой степени тяжести (CIN HI) и карциномы шейки матки. Полученные данные о наличии исследуемых сплайсированных форм мРНК hTERT в трех группах образцов биопсий шейки матки представлены в таблице 3.

Таблица 3. Анализ форм мРНК гена hTERT в образцах биопсий шейки матки CIN, CIS, гшоскоклеточной карцнномы - SSC.

Образцы Полноразмерная форма мРНК hTERT ß-форма мРНК hTERT a-форма мРНК hTERT a+ß-форма мРНК hTERT

Условно-нормальная ткаиь 6/11 (55%.) 8/11 (73%) U/11 (100%) 11/11 (100%)

CIN MI 10/12(83%) 12/12(100%) 3/12 (25%) 12/12(100%)

CIN III-CIS- see 12/12(100%) 12/12(100%) 4/12 (33%) 11/12(92%)

Полноразмерная форма мРНК гена hTERT кодирует функционально полноценную теломеразную обратную транскриптазу, наличие которой способствует иммортализации клеток. Она выявляется в 55% случаев условно-нормальной ткани, и далее частота ее обнаружения возрастает при переходе к CIN (83%) и далее к карциномам шейки матки (100%). Выявление полноразмерной формы в условно-нормальных клетках шейки матки позволяет сделать предварительный вывод об инициации процесса трансформации, что подтверждается повышением частоты обнаружения данной формы мРНК гена hTERT в ЦИНах и карциномах шейки матки.

p-форма мРНК гена hTERT содержит делению части шестого экзоиа, что приводит к функциональному нарушению каталитического центра тсломеразной обратной транскриптазы. Она выявляется в 73% случаев условно-нормальной ткани и в 100% случаев. предраковых поражений и на ранних стадий канцерогенеза шейки матки. В почках зародыша теломеразная активность исчезает на 15-й неделе развития, а а транскрипты hTERT обнаруживаются на 21-й неделе. Возможно, при онкогенезе шейки матки аналогичная ситуация, когда в небольшом проценте условно-нормальных тканей и предраковых поражений происходит активация транскрипции гена hTERT, однако образование полноценного фермента блокируется неправильным сплайсингом мРНК hTERT.

а-форма мРНК гена hTERT, кодирует функционально неактивный фермент, так как содержит делецию 7 и 8 экзонов, также составляющих часть каталитического центра фермента. Эта мРНК кодирует доминантно-негативную форму теломеразы, которая ингибирует полноценный активный фермент и таким образом может служить регулятором теломеразной активности в клетке. В предраковых поражениях и на ранних стадиях канцерогенеза шейки матки происходит резкое падение частоты встречаемости а-формы мРНК hTERT со 100% случаев в группе условно-нормальных эпителиев шейки матки до 25% и 33% в группе дисплазий легкой степени тяжести и группе тяжелых дисплазий и карцином шейки матки, соответственно. Такое распределение встречаемости а-формы мРНК гена hTERT в группах биопсий шейки матки может свидетельствовать о ее возможной роли в подавлении теломеразной активности в клетках эпителия шейки матки.

a+ß-форма мРНК гена hTERT присутствует практически во всех образцах исследованных биопсий шейки матки за исключением одного случая карциномы шейки матки.

Для ряда образцов CIN одновременно проведен анализ сплайс-форм мРНК hTERT и детекция теломеразной активности. При этом не всегда наблюдается теломеразная активность при наличии правильно сплайсированной РНК (рис. 7).

ш

-■x.y.

iß • f>

,... &

. ■'' р-

Мё- Ш Ш fcfe >--::

■ Щ* •• . . " -у!

ш щ

10 17n 17t 12n 12t 18n 18t 24t 25t

Стадия ЦИН (I) (H) (III) цитоз(11-1И)

1 É ¡ü

мРНК hTERT SI S;

ШШ djeÜi BÖ

Рис. 7. Анализ теломеразной активности и полноразмерной мРНК hTERT в образцах CIN. Верхняя панель - теломеразная активность в образцах CrN. Нижняя панель - мРНК hTERT приведена фотография агарозного геля продуктов ОТ-ПЦР образцов CIN. t — образцы CIN, n — образцы соседней нормальной ткани тех же пациентов, П - без образца, Р - рак, КЛ - клеточная линия.

Теломеразная активность обнаруживается в опухолевых клетках, более того, теломераза активируется на ранних стадиях неопластической трансформации. Появление теломеразной активности служит универсальным маркером опухолевой трансформации.

Экспрессия а-формы hTERT наблюдается в 100% условно-нормальной ткани, и частота встречаемости этой формы уменьшается при переходе от нормы к опухоли, обратно появлению теломеразной активности, что может свидетельствовать о возможной роли а-формы в подавлении теломеразной активности в клетках эпителия шейки матки. Отсутствует специфичность экспрессии ß-формы и o+ß-формы мРНК hTERT на разных стадиях CIN. Наличие или отсутствие этих форм в присутствии полноразмерной мРНК hTERT не влияет на активность теломеразы при раке шейки матки, хотя возможно, иногда ß-форма сплайсируется вместо нолноразмерпой.

Кроме транскрипционной регуляции hTERT существуют и другие заметные этапы регуляции теломеразы, поскольку теломеразная активность присутствует не во всех случаях обнаружения полноразмерной мРНК hTERT. Частота встречаемости теломеразной активности и экспрессии полноразмерной формы мРНК hTERT возрастает при переходе от нормы и ранних предраковых поражений к раку шейки матки.

3. Влияние белка RPA на активность теломеразы

Репликативный белок А представляет собой стабильный комплекс грех субъединиц - RPA70, RPA32 и RPA14. Его первичная структура консервативна у всех эукариот. RPA образует стабильный комплекс с оцДНК и участвует в процессах репликации, рекомбинации, репарации, в ответе клеток на повреждение и др. В составе субъединиц RPA обнаруживаются б доменов, имеющих структуру типа «OB fold», характерную для всех связывающих оцЦНК белков. Для полярного связывания одной молекулы RPA человека с оцДНК необходим фрагмент в 30 иуклеотидных остатков. Образующиеся при

этом комплексы характеризуются высоким сродством (до 0,1нМ), а сам гетеротример формирует вытянутую конформацию. Обнаружен также тип связывания RPA в глобулярной информации при длине связываемого участка оцДПК 8-10 нуклеотидов, а также "промежуточный" тип связывания RPA с оцДНК при длине участка ДНК (13-22 нуклеотидов). Связывание RPA с ДНК в глобулярной форме характеризуется некоторой, хотя и низкой кооперативностыо. Следует также отметить, что для этого белка характерно предпочтение богатых пиримидииовыми основаниями последовательностей ДНК, а также способность эффективно взаимодействовать с такими неканоническими структурами, как G-квадруплексы, формирующиеся фрагментами теломерной последовательности. С RPA способно связываться большое количество белков, участвующих в тех же процессах метаболизма ДНК, что и RPA.

Ряд данных свидетельствует о возможном участии RPA в процессе удлинения теломерной ДНК теломеразой в разных эукариотических организмах. Известно, что в дрожжах S. cerevisiae RPA может взаимодействовать с белками, ассоциированными с теломеразным комплексом, и способствовать посадке теломеразы на теломеру, в дрожжах S. pombe он участвует в процессах поддержания стабильности теломер. Как уже отмечено, RPA способен связывать теломерную ДНК человека in vitro, более того, он может разрушать G-квартетные структуры, по крайней мере, в экспериментах in vitro.

Данные об участии RPA в регуляции активности теломеразы человека практически отсутствуют. Задачей данной части работы было исследование влияния RPA в широком диапазоне концентраций на работу теломеразы человека. Для этого была определена активность теломеразы в экстрактах человеческих клеточных линий с пониженным содержанием RPA и при добавлении экзогенного RPA.

3.1 Приготовление клеточных экстрактов с пониженным содержанием RPA

д Для приготовления экстракта с пониженным

-¡2 3 содержанием RPA использовали метод иммунопреципитации. S100 экстракт клеток HeLa обрабатывали поликлональными антителами против § gC qC RPA. Образовавшиеся комплексы целевого белка и щ [С К антител удаляли из экстракта с помощью Protein Gg сефарозы. В результате был получен экстракт, в котором J- содержание RPA существенно снижено по сравнению с исходным. Данные Всстерн-блот-анализа представлены g на рисунке 8. В исходном экстракте RPA хорошо -j 2 3 Детектируется, тогда как после процедуры иммунопреципитации соответствующая полоса исчезает •w (Рис.8А, дорожки 1, 2). В то же время, количество других „ ^ -¡_ белков в экстракте осталось неизменным, на что, в CL рЕ частности, указывают приведенные на рисунке 8Б СО ^г результаты Вестерп-блот-анализа с использованием О антител против актина (дорожки 1, 2). СО

Рис. 8. Анализ экстракта из клеток HeLa после иммунопреципитации RPA.

Панель А. Вестери-блот-анализ наличия RPA в экстрактах. Дорожка 1 - экстракт до иммунопреципитации, дорожка 2 -- после иммунопреципитации, дорожка 3 - выделенный RPA.

Панель Б. Вестерн-блог-анализ содержания актина в экстрактах. Дорожка 1 - экстракт до иммунопреципитации, дорожка 2 ~ после иммунопреципитации. дорожка 3 - выделенный актин.

3.2 Теломеразная активность в экстрактах с пониженным содержанием 13РА

Для детекции тсломеразной активности использовали стандартный подход - ТВАР-тест, суть которого состоит в первоначальном удлинении праймера теломеразой (присутствующей в экстрактах клеток), с последующим усилением сигнала с помощью ПЦР-амплификации. Для изучения влияния КРА варьировали количество содержащего теломеразу экстракта, используя разбавления исходных препаратов Я100 и 8100 с пониженным содержанием ЯРА. Количество экстракта в конкретном эксперименте выражали в условном значении «количество клеток» (из которого был бы приготовлен экстракт с такой концентрацией компонентов) - от 5 до 1000 клеток. Как видно из рисунка 9, в экстракте, обработанном антителами против 11РА, теломеразная активность в экстрактах из 100 и менее клеток не детектируется, тогда как в исходном, экстракте активность видна даже в 5 клетках.

§100-КРА В100

{ Л Г \

1 2 3 4 5 $ ? 8 310111213141516171819

Число клеток

Рис. 9. Анализ теломеразной активности в экстрактах с помощью TRAP-теста.

Дорожки 1-8 -теломеразная активность в экстракте после иммунопреципитации, приготовленном из 1000, 500, 200, 100, 50, 10, 5 клеток, соответственно. Дорожки 11-19 - то же для экстракта без иммуиопретшпитации. Дорожки 9,20 - теломеразная активность в экстрактах после и без иммунопрецигштации, предварительно обработанных РНКазой А (контроль на специфичность TRAP-теста). Дорожка 10 - реакция без добавления экстракта.

g S100-RPA S100 1 '2 3 4 5 6 7 8~~9

Для проверки возможной связи этого эффекта со снижением количества ЯРА в экстракте, и доказательства, что этот эффект не связан с инактивацией теломеразы или другими нарушениями, которые могут возникнуть в процессе иммунопреципитации, например, инактивации или удаления важных для работы теломеразы белков за счет ко-иммунопреципитации с ЯРА, мы добавляли к такому экстракту очищенный препарат рекомбинантного ИРА человека. До концентрации 0,1мМ появления теломеразной активности в обедненном ЯРА экстракте из 20 клеток не наблюдали. Появление теломеразной активности оказалось возможно детектировать при концентрациях КРА более 0,2мМ, На рисунке 10 представлены данные такого эксперимента для экстракта из 20 клеток, который обладал высокой теломеразной активностью до иммунопреципитации (Рис.10, дорожка 1) и потерял ее после иммунопреципитации (Рис.10, дорожка 2). При добавлении увеличивающихся количеств ИРА (0,1-0,5мМ) теломеразпая активность восстанавливается (Рис.10, дорожки 3-6). При этом в определенном диапазоне концентраций 0,1-0,ЗмМ (Рис.10, дорожки 3, 4) ЯРА стимулирует процессивьый синтез теломерных повторов теломеразой, что приводит к появлению в основном длинных ДНК-

фрагментов. Дальнейшее т увеличение избытка КРА в

смеси вызывает увеличение количества более коротких (50-60 нуклеотидов)

продуктов удлинения (Рис.10, дорожки 5,6). Добавление КРА к исходному экстракту также вначале стимулирует, а при больших количествах

ингибирует процессивный синтез теломерной ДНК (Рис.10, дорожки 7-9). При большом избытке белка (Рис.10, дорожка 9) происходит ослабление

теломеразной активности и преимущественный синтез коротких продуктов (по сравнению с дорожками 5,6). При этом наблюдается существенное увеличение количества неспецифического ПЦР-продукта, который

детектируется и при инактивации теломеразы РНКазой А (Рис.10, дорожка 2).

О 0 0.1 0.2 0.3 6,5 0,1 0,2 0,5 мМ, RFA

20 клеток

Рис. 10. Анализ теломеразной активности в экстракта после добавления RPA.

Дорожка 1 — теломеразная активность в экстракте из 20 клеток без иммунопреципитации. Дорожка 2 — теломеразная активность в экстракте из 20 клеток после иммунопреципитации. Дорожки 3-6 - теломеразная активность в экстракте после иммунопреципитации и добавления RPA до концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 мМ, соответственно. Дорожки 7-9 — теломеразная активность в экстракте без иммунопреципитации, после добавления RPA до концентрации 0,1, 0,2, 0,5мМ, соответственно.

S100

3.3 Влияние белка SSB на активность теломеразы

Для сравнения эффекта воздействия RPA на теломеразу с действием других белков, которые связываются неспецифически с оцДНК, в систему в тех же количествах был добавлен бактериальный белок SSB E.col'i, который, как известно, взаимодействует с оцДНК и участвует в процессах репликации, репарации и др. подобно RPA. В отличие от RPA добавление SSB к экстрактам из 20 клеток полностью подавляет теломеразную активность. Добавление SSB к полному экстракту из 50 клеток существенно меняет спектр удлиняемых продуктов при небольшом количестве белка, как и в случае больших

избытков RPA, а избыток SSB полностью блокирует работу теломеразы (Рис. 11). Недостаток белка RPA негативно сказывается на способности теломеразы человека удлинять ДНК-праймер в экстрактах клеток HeLa. Добавление небольшого количества RPA восстанавливает способность теломеразы удлинять нраймер в процессивной манере, а увеличение концентрации RPA приводит к ингибированию реакции. При этом прокариотический белок SSB не оказывает стимулирующего эффекта, подобного RPA, но подавляет теломеразную активность.

В клетках человека, как и в большинстве эукариотических клеток, З'-выступающий конец теломеры связан с рядом белков, среди которых ключевым для поддержания длины теломер in vivo является белок РОТ1. Данный белок взаимодействует с выступающим концом теломеры, защищая его от деградации и возможности вступать в процессы рекомбинации. Белок РОТ1 по разным данным может как способствовать, так и препятствовать посадке теломеразы на теломеру. Кроме того, в разных эукариотических организмах обнаружен еще ряд белков, необходимых для посадки теломеразы на теломеру и ее активации. Известно, что повторяющиеся G-богатые последовательности, такие как теломеры человека, могут образовывать стабильные G-квартетные структуры. Более того, для некоторых эукариотических организмов их существование на теломерах доказано с помощью флуоресцентной микроскопии с антителами против G-квартетов. Известно также большое число белков, которые могут взаимодействовать с такими G-квартетными структурами, в том числе и на теломерах. Таким образом, процессы, обеспечивающие правильность и своевременность посадки теломеразы на теломеру, могут быть достаточно сложными и протекать с участием множества белков. Предполагается, что теломеры удлиняются в самом конце S-фазы, на границе с С2-фазой, т.е. тогда, когда процесс репликации ДНК уже практически завершен. Синтез же RPA в это время продолжается, а

0 0,10,2(1,3 0,5 мМ, ЗЭВ

50 клеток

Рис. 11. Теломеразная активность в экстракте из 50 клеток без им му но преципитации после добаления ЗББ.

Дорожка 1 - теломеразная активность в экстракте из 50 клеток без иммунопреципитации. Дорожки 2-5 — теломеразная активность в экстракте без иммунопреципитации, после добавления ЗЭВ до концентрации 0,1, 0,2, 0,3, 0,5 мМ БЭВ, соответственно.

количество мест посадки на ДНК существенно снижается, что может приводить к накоплению в ядре свободного RPA. Это, в свою очередь, может приводить к его активному участию в процессе репликации теломер как на стадии работы самой теломеразы, так и в процессе синтеза комплементарной цепи ДНК. Известно, что RPA in vitro может связывать ДНК с теломерпой последовательностью и способствовать разворачиванию G-квартетов. Предполагается, что для этого необходимо кооперативное связывание нескольких молекул RPA. Обнаруженное в нашей работе свойство RPA, способствовать процессивному синтезу теломерной ДНК теломеразой, возможно, связано с тем, что он может вытеснять теломер-связывающие белки из теломеры и способствовать разрушению неканонических структур на теломерной ДНК. В то же время, при больших избытках RPA в экстрактах этот белок прочно связывается с ДНК, и, подобно SSB, по-видимому, вытесняет теломеразу из комплекса с ДНК. В наших экспериментах это проявляется в накоплении фрагментов ДНК определенной длины, размер которых определяется SSB-подобным характером связывания RPA с оцДНК. Таким образом, конкуренция между RPA, РОТ1, G-квартет-связывающими и др. белками может быть ключевой для регуляции длины оцДНК, синтезируемой теломеразой, а значит и для регуляции длины вновь синтезированной теломеры.

4. Адаптация TRAP-теста для поиска ингибиторов теломеразы

Тсломсраза является хорошей мишенью для химиотерапии, потому что она активируется в большинстве типов раковых опухолей и неактивна в большинстве нормальных клеток. Ингибиторы теломеразы могут лечь в основу препаратов для химиопрофилактики и лечения рака.

При использовании TRAP-теста для проверки возможных ингибиторов теломеразы существует несколько технических проблем. Некоторые препараты могут ингибировать не теломеразу, но и использующуюся в TRAP-тесте Taq-полимеразу, что может приводить к ложным эффектам ингибирования. Для избежания этой проблемы ставится контроль с внесением тестируемых препаратов после реакции удлинения субстрата теломеразой, но перед ПЦР. В связи с тем, что TRAP полуколичественный метод, возникает вопрос определения эффективности ингибиторов. Эта проблема решается использованием раститровок по концентрации ингибиторов.

Многие препараты, могущие представлять интерес как ингибиторы теломеразы, плохо растворимы в воде. В этом случае решением является растворение препаратов в органических растворителях и далее проведение TRAP в водио-органичсской среде. На используемый органический растворитель накладывается при этом сразу несколько ограничений. Он должен смешиваться с водой и обеспечивать в смеси с водой растворимость тестируемых препаратов. Растворитель не должен сам ингибировать теломеразу. Ингибиторы - потенциальные лекарства, поэтому растворитель не должен быть сильно токсичен. В качестве оптимального варианта был подобран ДМСО, который хорошо смешивается с водой и используется в качестве носителя для некоторых противоопухолевых препаратов. В концентрации до 5 % v/v он не сильно ипгибирует теломеразу и обеспечивает приемлемую растворимость ряда исследуемых препаратов. Работа системы тестирования была проверена на ингибиторе теломеразы AZT..

ВЫВОДЫ

1. Теломеразная активность присутствует в опухолях шейки матки независимо от

стадии, появляется в процессе опухолевой прогрессии во время предраковых поражений (CIN) и может быть использована в диагностике опухолей шейки матки

2. Теломсразпая активность отсутствует в доброкачественных опухолях матки и ее

количество существенно варьирует в предопухолевых поражениях.

3. Белок RPA, связывающий оцДНК, влияет на активность теломеразы в экстракте

клеток HeLa. Теломеразная активность снижается в экстрактах, обедненных RPA и восстанавливается при добавлении экзогенного RPA. При слишком высоких концентрациях RPA теломеразная активность ингибируется.

4. Частота экспрессии полноразмерной формы мРНК hTERT возрастает в тканях

опухолей шейки матки по сравнению с нормальными тканями и ранними предраковыми поражениями.

5.а-форма мРНК hTERT обнаружена в 100% условно-нормальной ткани. Частота встречаемости этой формы уменьшается в опухолевых тканях по сравнению с условно-нормальными. Специфичность экспрессии ß- и a+ß-форм мРНК hTERT на разных стадиях CIN отсутствует и активность теломеразы от них не зависит.

6. Теломеразная активность и мРНК hTERT детектируются в некоторых образцах

условно-нормальной ткани. ч

7. Отработан метод без использования радиоактивной метки для серийного анализа

CIN и поиска ингибиторов теломеразы среди плохо растворимых в воде препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Скворцов Д.Л, Гаспарьян Н.М., Рубцова М.П., Зверева М.Э., Федорова М.Д., Павлова JI.C., Богданов А.А., Донцова О.А., Киселев Ф.Л. Теломераза как потенциальный маркер для ранней диагностики рака шейки матки. (2006). ДАН. Т 408, N 4. с. 556-559.

2. М.П. Рубцова, Д.А. Скворцов, И.О. Петруссва, О.И. Лаврик, П.В. Спирин, B.C. Прасолов, Ф.Л. Киселев, О.А. Донцова. Репликатнвный белок А модулирует работу теломеразы человека in vitro. (2009). Биохимия. Т 74, вып. 1. с. 117122.

3. Skvortsov D.A., Gasparian N.M., RubtsovaМ.Р., Zvereva M.E., Fedorova M.D., Pavlova L.S., Bogdanov A.A., Dontsova O.A., Kisseljov F.L, Telomerase As a Potential Marker for Early Diagnosis of Cervical Carcinoma. (2006) 8th International Engclhardt Conference On Molecular Biology "RNA-protein interactions", 19-24 August, Sergiev Posad, Russia, abstract book, p. 47.

4. Zvereva M.I., Rubtsova M.P., Sharanov Y.S., Skvortsov D.A., Kisseljov F.L., Dontsova O.A., New properties of components of telomerase. (2007), "Telomeres&Telomerase", May 2-6, Cold Spring Harbor, New York, USA, abstact book, p. 192.

5. Zvereva M.I., Rubtsova M.P., Sharanov Y.S., Skvortsov D.A., Kisseljov F.L., Dontsova O.A., Novel properties of telomerase and telomerase subunits. (2007). The first meeting of the international workgroup on "Human events in human pathologies". 24-25 October, Moscow, Russia, abstract book, p. 14.

6. Скворцов Д.А., Рубцова М.П., Зверева М.Э., Киселев Ф.Л., Теломераза как потенциальный маркер для ранней диагностики рака шейки матки. Международная конференция студентов и аспирантов «Ломоносов-2008», 9-10 апреля, Москва, Россия, сборник абстрактов, с 299.

7. Kisseljov F., KisseljovaN., Katargin A., Volgareva G., Golovina D., Skvortsov D., Rubtsova M., Zvereva M. Epigenetic changes in cervical tumors. (2006) Eurogin Congress, April 23rd to 26th, Paris, France, abstract book, p. 149.

8. Скворцов Д.А., Гаспарьяи H.M., Рубцова M.IL, Зверева М.Э., Федорова М.Д., Павлова Л.С., Богданов А.А., Донцова О.А., Киселев Ф.Л. Теломераза как потенциальный маркер для ранней диагностики рака шейки матки. (2008). «Фундаментальная онкология - -Петровские чтения» 18 апреля, г. Санкт-Петербург. Вопросы онкологии Т 54, приложение, с 24.

Отпечатано в копицентрс « СТ ПРИНТ » Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: globus9393338@vandex.ru тел.: 939-33-38 Тираж 100 экз. Подписано в печать 24.02.2009 г.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Регуляция теломеразы при онкогенезе.

1.1 Активность теломеразы в различных опухолях.

1.2 Амплификация генов hTR и hTERT.

1.3 Регуляция транскрипции TERT.

1.3.1 Структура промотора обратной транскриптазы теломеразы.

1.3.2 Метилирование промотора hTERT.

1.3.3 Метилирование гистонов промотора hTERT.

1.3.4 Ацетилирование и деацетилирование.

1.3.5 Каскад МАРК.

1.3.6 Онкоген Мус и его антипод Mad.18'

1.3.7 Транскрипционные факторы Spl и Sp3.

1.3.8 Ядерный фактор NF-kappaB.

1.3.9 Транскрипционные факторы API и АР2.

1.3.10 Онкосупрессор р53.

1.3.11 Белки pRB, E2Fnpl6.

1.3.12 Вс12.

1.3.13 Онкосупрессор WT1.

1.3.14 Миелоидный клеточно-специфичный белок MZF-2.

1.3.15 Транскрипционные факторы ETS.

1.3.16 Стероидные гормоны.л.

1.3.17 Вирусная регуляция экспрессии hTERT.

1.3.18 Влияние гипоксии на экспрессию hTERT.

1.4 Посттранскрипционная регуляция hTERT.

1.4.1 Регуляция сплайсинга гена hTERT.

1.4.2 Клеточная локализация.

1.4.3 Фосфорилирование и дефосфорилирование hTERT.

1.5 Регуляция экспрессии теломеразной РНК.

1.5.1 Регуляция транскрипции теломеразной РНК.

1.5.2 Посттранскрипционная регуляция теломеразной РНК.

1.6 Контроль доступа теломеразы на теломеры.

1.7 Регуляция в ходе ответа на ионизирующие излучения.

В 1961 году Хайфлик и Мурхиад показали, что культура соматических клеток имеет ограниченный период жизни [1]. В 1973 году Оловников предположил, что укорочение концов хромосом - теломер - определяет возможное число делений клетки [2]. Теломеры защищают геном клетки от деградации, участвуют в мейотическом спаривании хромосом и регуляции транскрипции генов прителомерной области [3, 4]. В клетках, способных размножаться бесконечно (бессмертных), должен существовать механизм, компенсирующий укорочение теломер. В 1985 году Блекберн и Грейберг открыли фермент, удлиняющий теломеры — теломеразу [5].

Теломераза — рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из молекулы РНК — TR (Telomerase RNA), белка теломеразной обратной транскриптазы — TERT (Telomerase reverse transcriptase) [6] и ряда ассоциированных белков. TR является матрицей для TERT при удлинении (достраивании, поддержании) теломер с помощью теломеразы. Теломераза в клетках человека существует в виде димера и содержит две субъединицы обратной транскриптазы и две молекулы РНК [7]. В теломеразе человека с TERT связанььр23/р90 -шаперон, отвечающий за сборку/конформацию комплекса; 14-3-3, обеспечивающий ядерную локализацию, ТР1 с неизвестной функцией. С TR связываются белки hGARl, Dyskerin/NAP57, hNHP2, С1/С2, отвечающие за стабильность, созревание и локализацию РНК; La, hStau, вероятно, отвечающие за присоединение к теломерам; L22, участвующий г в процессинге, ядерной локализации; hNOPIO, A1/UP1, ТР1 с неизвестными функциями [8]. Ферментативная активность теломеразы человека в лизате ретикулоцитов кролика детектируется при добавлении hTR и hTERT [9, 10]. При введении hTERT в клетки, экспрессирующие hTR, в них появляется теломеразная активность [И, 12]. Заметим, что выполнение теломеразой своих функций in vivo не всегда совпадает с наличием теломеразной активности, измеренной in vitro с помощью основного используемого в настоящее время метода ее определения - протокола амплификации теломерных повторов (telomerase repeat amplification protocol [13] — TRAP). Например, добавление гемагглютининового эпитопа на С-конец hTERT при сохранении теломеразной активности препятствует удлинению теломер [14], [15].

Активная теломераза нужна, когда клетки активно делятся. Известно, что суперэкспрессия каждого из белков р53, E2F, р16, р21 и р15 останавливает клеточный цикл, что сопровождается угнетением теломеразной активности в плоскоклеточных карциномах и клеточных линиях глиомы человека [16, 17]. Ингибирование теломеразы может происходить как вследствие остановки клеточного цикла, так и независимо от его регуляции в результате действия этих белков. Например, р53 подавляет активность теломеразы за счет снижения уровня экспрессии hTERT до остановки клеточного цикла [8]. В этом случае угнетение активности теломеразы является не следствием остановки клеточного цикла, а независимым процессом.

Лейкоциты человека обладают слабой теломеразной активностью. Эксперименты с остановленными в GO-фазе лейкоцитами и последующим их стимулированием фитогемагглютинином показали, что через 2 дня более 30 % лейкоцитов переходят из G0-фазы в S-фазу. При этом, если в экстрактах необработанных лейкоцитов в GO-фазе теломеразная активность не детектируется, то на первый день обработки фитогемагглютинином появляется слабая теломеразная активность, а на второй день она возрастает более чем десятикратно по сравнению с первым. При этом оказалось, что добавление ингибитора клеточного цикла на стадии перехода в S-фазу не ингибирует теломеразную активность. Следовательно, детектируемая теломеразная активность появляется в лейкоцитах в Gl-фазе (рис. 1) [18]. Является ли активация теломеразы следствием входа клеток в клеточный цикл или независимым процессом точно не известно.

С другой стороны in vivo теломеры реплицируются во время S-фазы (рис.1) [19, 20]. В течение большей части клеточного цикла hTR накапливается в тельцах Кахаля, в S-фазе совмещаясь с теломерами в клетках. hTERT большую часть клеточного цикла находится в очагах, не связанных с нуклеолями, тельцами Кахаля или теломерами. В S-фазе клеточного цикла hTERT перемещается в нуклеоли, затем в тельца Кахаля и затем на теломеры [21,22].

Рис. 1. Схема клеточного цикла. Появление активности теломеразы in vitro происходит в GI -фазе, а работает она в S-фазе.

Активность теломеразы в зависимости от числа делений хорошо описывается двухшаговой гипотезой клеточного старения и обретения бессмертия (иммортализации) -теорией М1/М2 (рис. 2). В клеточных линиях эпителия теломераза активна и длина теломер поддерживается на постоянном уровне, В стволовых клетках активность теломеразы ниже и позволяет лишь частично компенсировать укорочение теломер. В соматических клетках активность теломеразы отсутствует. Укорочение теломер приводит в момент Ml -- достижение предела Хайфлика (точка А на рис. 2) -- к переходу клеток в состояние сенессенса (старения), которое может быть преодолено инактивацией (удалением) pRB/pl6 или р53. Клетки, преодолевшие Ml, продолжают делиться и входят в состояние кризиса М2 (точка Б на рис. 2), сопровождающееся массовой клеточной смертью. Уцелевшие клетки перерождаются в опухолевые. Раковые клетки способны к неограниченному делению и поддержанию длины теломер (как правило с помощью теломеразы). Если экспрессирующие hTR не достигшие момента М2 соматические клетки трансфецировать геном hTERT (точка В на рис.2) в них, как и в опухолях, происходит удлинение и стабилизация теломер [8].

•Эмбриональные клеточные линии Трансформированный^

Сенессенс Кризис Число 1шето.чнь1х:делении'

Рис. 2. Зависимость длины тсломер от числа делений в различных типах клеток: эмбриональных клеточных линиях, соматических клетках и трансфецированных hTERT клетках. А — достижение клетками лимита Хайфлика, Б - кризис, сопровождающийся гибелью клеток и перерождением уцелевших в: опухолевые, В — трансфекция клеток геном hTERT. '

Следует отметить, что не всегда наблюдается корреляция активности теломеразы и длины теломер. Например, при лейкемии; зависимость между длиной- теломер и? активностью теломеразы отсутствует [23].

Активность теломеразы не проявляется в соматических клетках и тканях человека за редким исключением. Она есть в некоторых клетках крови; в репродуктивных тканях и некоторых быстро обновляющихся тканях, например, в кишечном эпителии и базальном слое клеток кожи [24]: Так, стволовые клетки способны, многократно преодолеть предел Хайфлика. ш поделиться больше 1000 раз [25]. Активация теломеразы в опухолевых клетках наблюдается в 80 - 90 % случаев. В соматических клетках с активной теломеразой уровень активности ниже, чем в опухолевых- [26]; Недавние исследования показали; что в клеточных культурах, полученных: из эпителия; бронхов; курильщиков, теломеразная активность повышена [27]; Наличие теломеразной: активности характерно-именно для злокачественных опухолей' в то время • как. в доброкачественных опухолях, активность этого фермента либо не выявляется;вовсе, либо частота ее обнаружения низка [2, 13- 28].

Белки, регулирующие работу теломеразы; могут быть важными мишенями при онкогенезе и, соответственно, противоопухолевой терапии; На активность теломеразы влияют белки, имеющие множество функций в клетке, а значит, воздействующих отнюдь не специфично. Также встречаются случаи, когда регуляторы теломеразы действуют совместно, либо несколько регуляторов объединены в каскад. В последнем случае вещества, приводящие к изменениям теломеразной активности, могут не являться непосредственными и специфическими регуляторами теломеразы. Практическое применение подобных веществ требует тщательного изучения механизма их действия и тщательного контроля побочных эффектов, поскольку кроме теломеразы они могут влиять на другие важные компоненты клетки.

Активация теломеразы ~ это потенциальный маркер для раннего обнаружения рака. Она может появляться на разных стадиях перерождения в зависимости от типа рака. Для использования активности теломеразы в диагностике необходимо предварительно изучение механизмов активации теломеразы на разных стадиях развития заболевания.

Выводы

1. Теломеразная активность присутствует в опухолях шейки матки независимо от стадии, появляется в процессе опухолевой прогрессии во время предраковых поражений (CIN) и может быть использована в диагностике опухолей шейки матки

2. Теломеразная активность отсутствует в доброкачественных опухолях матки и ее количество существенно варьирует в предопухолевых поражениях.

3. Белок RPA, связывающий оцДНК, влияет на активность теломеразы в экстракте клеток HeLa. Теломеразная активность снижается в экстрактах, обедненных RPA и восстанавливается при добавлении экзогенного RPA. При слишком высоких концентрациях RPA теломеразная активность ингибируется.

4. Частота экспрессии полноразмерной формы мРНК hTERT возрастает в тканях опухолей шейки матки по сравнению с нормальными тканями и ранними предраковыми поражениями.

5.а-форма мРНК hTERT обнаружена в 100% условно-нормальной ткани. Частота встречаемости этой формы уменьшается в опухолевых тканях по сравнению с условно-нормальными. Специфичность экспрессии Р- и a+p-форм мРНК hTERT на разных стадиях CIN отсутствует и активность теломеразы от них не зависит.

6. Теломеразная активность и мРНК hTERT детектируются в некоторых образцах условно-нормальной ткани.

7. Отработан метод без использования радиоактивной метки для серийного анализа

CIN и поиска ингибиторов теломеразы среди плохо растворимых в воде препаратов.

Благодарности

Киселеву Федору Львовичу за консультации по онкологии, Ларисе Петровне Короленковой за предоставление образцов ЦИН, Ларисе Сергеевне Павловой за предоставление опухолевых образцов, Петренко Анатолию Анатольевичу за наш совместный проект по ЦИН, Ирине Олеговне Петрусевой за наш совместный проект с белком RPA, Коллективам лабораторий химии нуклеопротеидов химфака МГУ и молекулярной биологии вирусов.

1.8 Заключение

Теломеразная активность является маркером рака, причем одним из наиболее универсальных. В зависимости от типа опухоли теломераза подвергается действию различных систем регуляции и, соответственно, активируется на разных стадиях заболевания.

Знания о системе регуляции теломеразы позволят более эффективно разрабатывать методики и препараты для подавления теломеразной активности в опухолевых клетках. К сожалению, многие механизмы регуляции теломеразы тканеспецифичны. Выявление взаимосвязи системы регуляции теломеразы с другими онкогенами может помочь в разработке комплексной диагностики рака, позволящей выявлять заболевание и определять тактику борьбы с ним на наименее агрессивной стадии.

Глава 2. Результаты и их обсуждение

Опухоли шейки матки отличаются от других онкозаболеваний тем, что они индуцируются ВПЧ. В то же время, одним из наиболее универсальных отличий раковых клеток от нормальных является наличие теломеразной активности. Известно, что белок Е6 онкогенных ВПЧ активирует транскрипцию гена hTERT. Регуляция транскрипции гена hTERT считается основным этапом регуляции теломеразы. В связи с этим возникает вопрос, достаточно ли для появления теломеразной активности только инфицирования клеток ВПЧ высокой группы риска? Или происходит активация теломеразы при прогрессии опухоли? Какие механизмы в этой регуляции, задействованы?

Охватить в рамках одной работы всю систему регуляции теломеразы нереально. Вначале было решено рассмотреть один из наименее изученных этапов регуляции теломеразы — связывание с теломерой. В рамках этой задачи исследовали влияние на теломеразную активность оцДНК-связывающего человеческого белка RPA и его аналога из E.coli — SSB. Исследование проводили на модельной системе рака шейки матки — ВПЧ-содержащей клеточной линии HeLa.

При большом количестве информацииf по многим аспектам регуляции теломеразы заметной проблемой является наличие данных только по модельным системам, при отсутствии их проверки и подтверждения на опухолях. С целью уточнения данных на опухолях шейки матки была выбрана регуляция теломеразной активности с помощью альтернативного сплайсинга.

2.1 Активность теломеразы в раках шейки матки

Активация теломеразы в опухолях - явление повсеместное, выявляемое в большинстве опухолевых клеток [26]. Теломеразная активность не проявляется в нормальных клетках, но обнаружена в бессмертных клетках, культивируемых in vitro, а также в стволовых и половых клетках [219]. В'силу этого активация.теломеразы может служить потенциальным маркером в i диагностике рака. С другой стороны известно, что опухолевые клетки некоторых' типов- могут использовать альтернативный механизм поддержания длины теломер, основанный на рекомбинации [31]. Теломераза может активироваться как на ранних, .так и на поздних стадиях рака. В связи с этим для решения вопросов использования теломеразной активности в качестве диагностического маркера и времени ее активации необходимо предварительное изучение активации этого фермента в большом наборе опухолей, находящихся на разных стадиях прогрессии.

Опухоли шейки матки принадлежат к числу наиболее распространенных онкологических заболеваний у женщин. Это заболевание связано с инфекцией вирусами из группы папиллом. Белок Е6 ВПЧ высокого онкогенного риска способен активировать транскрипцию гена теломеразной обратной транскриптазы, так что в случае этого рака теломеразная активность может появляться уже на ранних стадиях прогрессии.

Задачей данной части работы являлось определение теломеразной активности в образцах злокачественных опухолей различных стадий, содержащих геномы ВПЧ. Кроме того, оценивали потенциальную пригодность теломеразного теста в ранней диагностике рака шейки матки, вызываемого ВПЧ. Предпосылками для этой работы были сообщения о наличии теломеразной активности, с одной стороны, в опухолях шейки матки [234, 235], а с другой стороны, в линиях, полученных из клеток, зараженных ВПЧ [220].

2.1.1 Проверка работы TRAP-теста на клеточных линиях

Для получения модельной системы, а также для отработки и контроля метода нами были выбраны клеточные линии SiHa и HeLa, полученные из материалов рака шейки матки. Эти линии по литературным данным содержат активную теломеразу (рис. 8) и ВПЧ. Клеточная линия SiHa содержит интегрированный геном ВПЧ-16, a HeLa содержит геном ВПЧ-18. со л: л: <2.

И W

Я ^в Ц

Рис. 8. Теломеразная активность в клеточных линиях SiHa и HeLa.

Была проанализирована серия образцов с различными количествами клеточного экстракта (Рис. 9, дорожки 1-4). Активность теломеразы детектируется с количества экстракта, эквивалентного 10 клеткам. Интересно, что при слишком больших концентрациях клеточного экстракта, взятого в пробу, качество анализа также ухудшается (Рнс 9, дорожка 1).

12 3 4 5 6 7

Рис. 9. TRAP с разными количествами клеточного экстракта. 1. 10000 клеток HeLa, 2. 1000 клеток HeLa, 3. 100 клеток HeLa, 4. 10 клеток HeLa, 5. клеточный экстракт, преобработанный РНазой А, 6. образец без TS-олигонуклеотида в реакции удлинения праймера теломеразой, 7. радиоактивно-меченный TS-олигонуклеотид.

Поскольку в клеточном экстракте присутствует множество различных ферментов, чтобы подтвердить, что TS-праймер удлиняется именно теломеразой была поставлена реакция с экстрактом, предварительно обработанным РНазой А. Теломераза -рибонуклеиновый комплекс, поэтому обработка образцов РНазой А, расщепляющей РНК, должна приводить к потере теломеразной активности. Так, в образце, обработанном РНазой А (Рис. 9, дорожка 5), наблюдается исчезновение полос по сравнению с необработанными образцами (Рис.9, дорожки 1 -4), что говорит о специфичности метода.

При очистке теломеразы с помощью ультрацентрифугироваиия (получение S100 экстракта и затем очистка в глицериновом градиенте) оказалось, что активность и процессивность очищенного фермента возрастает. Есть несколько объяснений подобного эффекта. Во-первых, в концентрированном экстракте может быть слишком много ДНК-связывающих белков. Эти белки могут мешать работе теломеразы, блокируя связывание теломеразы с субстратом, а при разведении субстрат деблокируется. Во-вторых, большие концентрации теломеразы теоретически могут приводить, например, к конкуренции за субстрат. Но подобное объяснение маловероятно, так как количество теломеразы в клетках и, соответственно, экстракте очень невелико (порядка 100 молекул на клетку, менее чем 5*10"13 М в экстракте). В-третьих, в клетках возможно присутствие веществ, ингибирующих активность уже готового фермента. В каждой контрольной дорожке с S30 экстрактом (рис.10, дорожки 18, 19) использовали то же количество экстракта, что и суммарно в остальных дорожках (рис. 10, дорожки 1-17). При этом в литературе не описаны присутствующие в клетке вещества, обладающие ингибирующим эффектом. Схожая картина (хотя и не такая яркая) наблюдается при разведении экстрактов как клеточных линий, так и полученных из операционных материалов. При увеличении концентрации экстракта теломеразная активность сначала появляется и возрастает, а при дальнейшем увеличении концентрации процессивность фермента уменьшается.

123 456789 1011 12131415 16171819 20

Рис. 10. Теломеразная активность в глицериновом градиенте экстракта клеточной линии HeLa. Дорожки 9-11 - активность теломеразы в фракциях глицеринового градиента, обогащенных ферментом. Дорожки 1-8 и 12-17 — активность теломеразы в остальных фракциях глицеринового градиента. Дорожки 18,19 - активность теломеразы в S30 экстракт. Дорожка 20 — контроль без экстракта.

2.1.2 Активность теломеразы в опухолевых образцах

Рак шейки матки является стадийным заболеванием и ранняя диагностика является одним из важнейших элементов в профилактике и лечении этого заболевания. Нас интересовала зависимость теломеразной активности от стадии опухолевого процесса. Всего нами было отобрано 28 опухолей, которые представляли собой плоско клеточные карциномы различных стадий по классификации ВОЗ и FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics - Международная федерация акушеров и гинекологов), характеристика использованных образцов представлена в табл. 2 (в данном случае Т означает размер опухоли, N - наличие метастазов в регионарные лимфоузлы и М -наличие метастазов в отдаленные лимфоузлы). Среди проанализированных нами 28 опухолей большая часть относилась к ранним стадиям Т1 и Т2 (25 образцов). У 7 больных были обнаружены метастазы в регионарных лимфоузлах. Такая выборка больных объясняется прежде всего тем обстоятельством, что именно верификация ранних форм заболевания представляет наибольший интерес для клиницистов, а с другой стороны нас интересовал вопрос о возможном отличии метастатических форм от неметастатических.

Во всех опухолях ранее нашими коллегами из лаборатории молекулярной биологии вирусов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина был идентифицирован ВПЧ тип 16, который является превалирующим среди популяции больных раком шейки матки в России [221].

Данные по тестированию теломеразной активности представлены в табл. 2. Пример результатов тестирования теломеразной активности представлен на рис. 11 А. Для всех опухолевых образцов после амплификации сигнала с помощью ПЦР были получены характерные спектры полос на электрофореграмме, отражающие синтез теломерных повторов, катализируемый теломеразой (рис. 11 А, дорожки 2-10). Не было выявлено различий между опухолями шейки матки от больных с метастазами и без них. В качестве положительного контроля использовали клетки HeLa, в которых присутствует активная теломераза (рис. 11 А, дорожка 1). При этом теломеразная активность отсутствует в контрольных препаратах, полученных обработкой клеточных лизатов РНКазой А, которая разрушает РНК, входящую в состав теломеразы, тем самым инактивируя фермент (рис. 11Б, дорожки 2, 4). В качестве альтернативного негативного контроля представлено тестирование теломеразной активности в образце доброкачественного поражения шейки матки (по морфологическому заключению). Теломеразная активность в этом образце отсутствует (рис. 11А, дорожка 10).

123456789 10 1234

А Б aioichovaioioi^ia

Ь (X) VO KJ ю О Ла. Т7

738 736 1 + ■ +

Э ^ р n> to

Рис. 11. Анализ теломеразной активности методом TRAP, Номера соответствуют номерам в коллекции образцов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

А. Тел оме разная активность в образцах раковых тканей. Дорожка 1 - теломеразная активность в клеточной линии HeLa, дорожки 2-9 — в образцах раковых тканей из коллекции образцов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, дорожка 10 ("н.р.") - в образце доброкачественного поражения шейки матки.

Б. Теломеразная активность в образцах раковых тканей до (дорожки 1 и 3) и после (дорожки 2 и 4) обработки РНКазой А. Стрелкой указана полоса неспецифического сигнала.

Обращает на себя внимание тот факт, что количество и размер амплифицированных теломерных повторов (так называемая "лесенка") варьирует для разных опухолевых образцов. Это может быть связано как с различной регуляцией теломеразы в опухолях, так и с разным соотношением числа опухолевых клеток к общему числу стромальных и других неопухолевых клеток в образце, который использовали для анализа. При разделении продуктов, полученных с помощью TRAP-теста, в полиакриламидном геле мы наблюдаем сигнал, по положению соответствующий первому теломерному повтору (рис. 11 Б, отмечен стрелкой), даже в образцах с инактивированной теломеразой (рис. 11 Б, дорожки 2 и 4). Основная масса исследований поводится в настоящее время методами тестирования теломеразной активности на основе TRAP-теста без разделения продуктов амплификации с помощью гель-электрофореза. Наличие сильного неспецифического сигнала, обнаруженного в данной работе свидетельствует о том, что определение теломеразной активности с помощью TRAP-теста без разделения с помощью гель-электрофореза может приводить к обнаружению ложно-положительных сигналов при исследовании опухолевых образцов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в 100% исследованных в этой работе опухолевых образцах присутствует теломеразная активность, выявляемая TRAP-тестом (табл. 2), что свидетельствует о том, что при данной форме рака длина теломер поддерживается именно за счет активации теломеразы (в 2 образцах активность теломеразы была слабая). Не выявлено различий между метастазирующими и неметастазирующими опухолями. Важно, что активность теломеразы обнаруживается и в тех опухолях, которые находятся на ранних стадиях развития. Это делает возможным использование теломеразной активности в качестве маркера опухолевой трансформации на ее ранних этапах.

Номер опухоли Клиническая и патоморфологическая характеристика Теломеразная активность

654 T16N0M0 Да

648 T2N0M0 Да

699 T16N0M0 Да

652 T16N1M0 Да

659 T16N0M0 Да

734 T16N1M0 Да

647 T26N1M0 Да

650 T2N0M0 Да

738 T16N0M0 Да

739 T2N0M0 Да

736 T1N1M0 Да

665 T26N0M0 Да

656 T16N0M0 Да

657 T2N0M0 Да

712 T161N1M0 Да

716 T162N0M0 Да

483 T16NxM0 Да

579 TlaNxMO Да

592 T16N0M0 Да

583 T26N0M0 Да

588 T162N0M0 Да

735 T161N0M0 Да

682 T3N1M0 Да

630 T3N1M0 Да

650 T3N0M0 Да

723 T1N0M0 Да

719 T1N0M0 Да

1. Hayflick, L. P.S. Moorhead (1961) Exp Cell Res. 25: p. 585-621.

2. Olovnikov, A.M. (1973) J Theor Biol. 41(1): p. 181-190.

3. Blackburn, E.H. (2001) Cell. 106(6): p. 661-673.

4. Pandita, Т.К., C.R. Hunt, G.G. Sharma, Q. Yang (2007) Cell Mol Life Sci. 64(2): p. 131138.

5. Greider, C.W. E.H. Blackburn (1985) Cell. 43(2 Pt 1): p. 405-413.

6. Harrington, L., T. McPhail, V. Mar, W. Zhou, R. Oulton, M.B. Bass, I. Arruda, M.O. Robinson (1997) Science. 275(5302): p. 973-977.

7. Beattie, T.L., W. Zhou, M.O. Robinson, L. Harrington (2001) Mol Cell Biol. 21(18): p. 6151-6160.

8. Cong, Y.S., W.E. Wright, J.W. Shay (2002) Microbiol Mol Biol Rev. 66(3): p. 407-425, table of contents.

9. Beattie, T.L., W. Zhou, M.O. Robinson, L. Harrington (1998) Curr Biol. 8(3): p. 177180.

10. Weinrich, S.L., R. Pruzan, L. Ma, M. Ouellette, V.M. Tesmer, S.E. Holt, A.G. Bodnar, S. Lichtsteiner, N.W. Kim, J.B. Trager, R.D. Taylor, R. Carlos, W.H. Andrews, W.E. Wright, J.W. Shay, C.B. Harley, G.B. Morin (1997) Nat Genet. 17(4): p. 498-502.

11. Wen, J., Y.S. Cong, S. Bacchetti (1998) Hum Mol Genet. 7(7): p. 1137-1141.

12. Vaziri, H. S. Benchimol (1998) Curr Biol. 8(5): p. 279-282.

13. Kim, N.W., M.A. Piatyszek, K.R. Prowse, C.B. Harley, M.D. West, P.L. Ho, G.M. Coviello, W.E. Wright, S.L. Weinrich, J.W. Shay (1994) Science. 266(5193): p. 20112015.

14. Counter, C.M., W.C. Hahn, W. Wei, S.D. Caddie, R.L. Beijersbergen, P.M. Lansdorp, J.M. Sedivy, R.A. Weinberg (1998) Proc Natl Acad Sci USA. 95(25): p. 14723-14728.

15. Ouellette, M.M., D.L. Aisner, I. Savre-Train, W.E. Wright, J.W. Shay (1999) Biochem Biophys Res Commun. 254(3): p. 795-803.

16. Henderson, Y.C., R.L. Breau, T.J. Liu, G.L. dayman (2000) Head Neck. 22(4): p. 347354.

17. Fuxe, J., G. Akusjarvi, H.M. Goike, G. Roos, V.P. Collins, R.F. Pettersson (2000) Cell Growth Differ. 11(7): p. 373-384.

18. Buchkovich, K.J. C.W. Greider (1996) Mol Biol Cell. 7(9): p. 1443-1454.

19. Ten Hagen, K.G., D.M. Gilbert, H.F. Willard, S.N. Cohen (1990) Mol Cell Biol. 10(12): p. 6348-6355.

20. Wright, W.E., V.M. Tesmer, M.L. Liao, J.W. Shay (1999) Exp Cell Res. 251(2): p. 492499.

21. Tomlinson, R.L., T.D. Ziegler, T. Supakorndej, R.M. Terns, M.P. Terns (2006) Mol Biol Cell. 17(2): p. 955-965.

22. Jady, B.E., P. Richard, E. Bertrand, T. Kiss (2006) Mol Biol Cell. 17(2): p. 944-954.

23. Januszkiewicz, D., J. Wysoki, K. Lewandowski, M. Pernak, K. Nowicka, J. Rembowska, J. Nowak (2003) Int J Mol Med. 12(6): p. 935-938.

24. Harle-Bachor, C. P. Boukamp (1996) Proc Natl Acad Sci USA. 93(13): p. 6476-6481.

25. Rubin, H. (2002) Nat Biotechnol. 20(7): p. 675-681.

26. Заридзе, Д.Г., ed. Канцерогенез 2004, Медицина: Москва. 179-191.

27. Yim, H.W., R.J. Slebos, S.H. Randell, D.M. Umbach, A.M. Parsons, M.P. Rivera, F.C. Detterbeck, J.A. Taylor (2007) Cancer Lett. 246(1-2): p. 24-33.

28. Counter, C.M., A.A. Avilion, C.E. LeFeuvre, N.G. Stewart, C.W. Greider, C.B. Harley, S. Bacchetti (1992) EMBO J. 11(5): p. 1921-1929.

29. Healy, K.C. (1995) Oncol Res. 7(3-4): p. 121-130.

30. Shay, J.W. S. Bacchetti (1997) Eur J Cancer. 33(5): p. 787-791.

31. Henson, J.D., A.A. Neumann, T.R. Yeager, R.R. Reddel (2002) Oncogene. 21 (4): p. 598610.

32. Perrem, K., L.M. Colgin, A.A. Neumann, T.R. Yeager, R.R. Reddel (2001) Mol Cell Biol. 21(12): p. 3862-3875.

33. Norrback, K.F. G. Roos (1997) Eur J Cancer. 33(5): p. 774-780.

34. Резван В.В., Б.И.Н. (2001) Российские медицинские вести. N2 р. с. 4-7.

35. Скворцов Д.А., Г.Н.М., Рубцова М.П., Зверева М.Э., Федорова М.Д., Павлова JI.C., Богданов А.А., Донцова О.А., Киселев Ф.Л. (2006) ДАН. t.408(N4): р. с 556-559.

36. Bechter, О.Е., W. Eisterer, М. Dlaska, Т. Kuhr, J. Thaler (2002) Exp Hematol. 30(1): p. 26-33.

37. Pasrija, Т., R. Srinivasan, D. Behera, S. Majumdar (2007) Eur J Cancer. 43(9): p. 14761482.

38. Chen, K.Y., L.N. Lee, C.J. Yu, Y.C. Lee, S.H. Kuo, P.C. Yang (2006) Cancer Lett. 240(1): p. 148-156.

39. Park, Y.M., J.Y. Choi, B.H. Byun, C.H. Cho, H.S. Kim, B.S. Kim (1998) Exp Mol Med. 30(1): p. 35-40.

40. Murillo-Ortiz, В., H. Astudillo-De la Vega, S. Castillo-Medina, J.M. Malacara, L. Benitez-Bribiesca (2006) BMC Cancer. 6: p. 206.

41. Soder, A.I., J.J. Going, SB: Kaye, W.N. Keith (1998) Oncogene. 16(8): p. 979-983.

42. Hiraga, S., T. Ohnishi, S. Izumoto, E. Miyahara, Y. Kanemura, H. Matsumura, N. Arita1998) Cancer Res. 58(10): p. 2117-2125.

43. Carroll, Т., E. Maltby, I. Brock, J. Royds, W. Timperley, D. Jellinek (1999) J Pathol. 188(4): p. 395-399.

44. Chong, E.Y., P.Y. Lam, W.S. Poon, H.K. Ng (1998) Hum Pathol. 29(6): p. 599-603.

45. Harada, К., K. Kurisu, K. Arita, T. Sadatomo, H. Tahara, E. Tahara, T. Ide, T. Uozumi1999) Cancer. 86(6): p. 1050-1055.

46. Hiyama, E., K. Hiyama, T. Yokoyama, Y. Matsuura, M.A. Piatyszek, J.W. Shay (1995) Nat Med. 1(3): p. 249-255.

47. Yao, D.F., W. Wu, M. Yao, L.W. Qiu, X.H. Wu, X.Q. Su, L. Zou, D.B. Yao, X.Y. Meng (2006) World J Gastroenterol. 12(31): p. 4966-4972.

48. Cairney, C.J. W.N. Keith (2008) Biochimie. 90(1): p. 13-23.

49. Anedchenko, E., N. Oparina, A. Dmitriev, G. Krasnov, L. Pavlova, N. Alexandrova, F. Kisseljov, V. Senchenko (2008) Oncol Rep. 20(2): p. 469-474.

50. Takakura, M., S. Kyo, Т. Kanaya, H. Hirano, J. Takeda, M. Yutsudo, M. Inoue (1999) Cancer Res. 59(3): p. 551-557.

51. Meyerson, M., C.M. Counter, E.N. Eaton, L.W. Ellisen, P. Steiner, S.D. Caddie, L. Ziaugra, R.L. Beijersbergen, M.J. Davidoff, Q. Liu, S. Bacchetti, D.A. Haber, R.A. Weinberg (1997) Cell. 90(4): p. 785-795.

52. Horikawa, I., P.L. Cable, C. Afshari, J.C. Barrett (1999) Cancer Res. 59(4): p. 826-830.

53. Pericuesta, E., M.A. Ramirez, A. Villa-Diaz, A. Relano-Gines, J.M. Torres, M. Nieto, B. Pintado, A. Gutierrez-Adan (2006) Reprod Biol Endocrinol. 4: p. 5.

54. Wick, M., D. Zubov, G. Hagen (1999) Gene. 232(1): p. 97-106.

55. Cong, Y.S., J. Wen, S. Bacchetti (1999) Hum Mol Genet. 8(1): p. 137-142.

56. Zinn, R.L., K. Pruitt, S. Eguchi, S.B. Baylin, J.G. Herman (2007) Cancer Res. 67(1): p. 194-201.

57. Fuji warn-Akita, H., C. Maesawa, T. Honda, S. Kobayashi, T. Masuda(2005) Int J Oncol. 26(4): p. 1009-1016.

58. Nomoto, К., M. Maekawa, K. Sugano, M. Ushiama, N. Fukayama, S. Fujita, T. Kakizoe (2002) Jpn J Clin Oncol. 32(1): p. 3-8.

59. Guilleret, I., P. Yan, F. Grange, R. Braunschweig, F.T. Bosman, J. Benhattar (2002) Int J Cancer. 101(4): p. 335-341.

60. Guilleret, I. J. Benhattar (2003) Exp Cell Res. 289(2): p. 326-334.

61. Shin, K.H., M.K. Kang, E. Dicterow, N.H. Park (2003) Br J Cancer. 89(8): p. 1473-1478.

62. Widschwendter, A., H.M. Muller, M.M. Hubalek, A. Wiedemair, H. Fiegl, G. Goebel, E. Mueller-Holzner, C. Marth, M. Widschwendter (2004) Gynecol Oncol. 93(2): p. 407416.

63. Liu, С., X. Fang, Z. Ge, M. Jalink, S. Kyo, M. Bjorkholm, A. Gruber, J. Sjoberg, D. Xu (2007) Cancer Res. 67(6): p. 2626-2631.

64. Patel, J.H., Y. Du, P.G. Ard, C. Phillips, B. Carella, C.J. Chen, C. Rakowski, C. Chatteijee, P.M. Lieberman, W.S. Lane, G.A. Blobel, S.B. McMahon (2004) Mol Cell Biol. 24(24): p. 10826-10834.

65. Coutts, A.S. N.B. La Thangue (2005) Biochem Biophys Res Commun. 331(3): p. 778785:

66. Faiola, F., X. Liu, S. Lo, S. Pan, K. Zhang, E. Lymar, A. Farina, E. Martinez (2005) Mol Cell Biol. 25(23): p. 10220-10234.

67. Cong, Y.S. S. Bacchetti (2000) J Biol Chem. 275(46): p. 35665-35668.

68. Hou, M., X. Wang, N. Popov, A. Zhang, X. Zhao, R. Zhou, A. Zetterberg, M. Bjorkholm, ' M. Henriksson, A. Gruber, D. Xu (2002) Exp Cell Res. 274(1): p. 25-34.

69. Mukhopadhyay, N.K., G.J. Gordon,' G. Maulik, G. Doerre, B.C. Liu, R. Bueno, D.J. Sugarbaker, M.T. Jaklitsch (2005) J Cell Mol Med. 9(3): p. 662-669.

70. Kondoh, K., N. Tsuji, K. Asanuma, D. Kobayashi, N. Watanabe (2007) Exp Cell Res. 313(16): p. 3486-3496.

71. Wu, K.J., C. Grandori, M; Amacker, N. Simon-Vermot, A. Polack, J. Lingner, R. Dalla-Favera (1999) Nat Genet. 21(2): p. 220-224.

72. Greenberg, R.A., R.C. O'Hagan, H. Deng, Q. Xiao, S.R. Hann, R.R. Adams, S. Lichtsteiner, L. Chin, G.B. Morin, R.A. DePinho (1999) Oncogene. 18(5): p. 1219-1226.75: ' Fujimoto, К. M. Takahashi (1997) Biochem Biophys Res Commun. 241(3): p. 775-781.

73. Wang, J., L.Y. Xie, S.- Allan, D. Beach, G.J. Hannon (1998) Genes Dev. 12(12): p. 17691774.

74. Oh, S., Y.H. Song, U.J. Kim, J." Yim, Т.К. Kim (1999) Biochem Biophys Res Commun. 263(2): p. 361-365.

75. Kyo, S., M. Takakura, T. Taira,.T. Kanaya, H. Itoh, M. Yutsudo, H. Ariga, M. Inoue (2000) Nucleic Acids Res. 28(3): p. 669-677.

76. Mac, S.M., C.A. D'Cunha, P.J. Farnham (2000) Mol Carcinog. 29(2): p. 76-86.

77. Oh, S.T., S. Kyo, L.A. Laimins (2001) J Virol. 75(12): p. 5559-5566:

78. Boisclair, Y.R., A.L. Brown, S. Casola, M.M. Rechler (1993) J Biol Chem. 268(33): p. 24892-24901.

79. Hagen, G., S. Muller, M. Beato, G. Suske (1994) EMBO J. 13(16): p. 3843-3851.

80. Wooten, L.G. B. Ogretmen (2005) J Biol Chem. 280(32): p. 28867-28876.

81. Won, J., J. Yim, Т.К. Kim (2002) J Biol Chem.' 277(41): p. 38230-38238.

82. Pacifico, F. A. Leonardi (2006) Biochem Pharmacol. 72(9): p. 1142-1152.

83. Duyao, M.P., D.J. Kessler, D.B. Spicer, C. Bartholomew, J.L. Cleveland, M. Siekevitz, G.E. Sonenshein (1992) J Biol Chem. 267(23): p. 16288-16291.

84. Sinha-Datta, U., I. Horikawa, E. Michishita, A. Datta, J.C. Sigler-Nicot, M. Brown, M. Kazanji, J.C. Barrett, C. Nicot (2004) Blood. 104(8): p. 2523-2531.

85. Simickova, M., M. Nekulova, L. Pecen, M. Cernoch, M. Vagundova, Z. Pacovsky (2001) Neoplasma. 48(4): p. 267-273.

86. Yin, L., A.K. Hubbard, C. Giardina (2000) J Biol Chem. 275(47): p. 36671-36675.

87. Ashburner, B.P., S.D. Westerheide, A'.S. Baldwin, Jr. (2001) Mol Cell Biol. 21(20): p. 7065-7077.

88. Takakura, M„ S. Kyo, M. Inoue, W.E. Wright, J.W. Shay (2005) Mol Cell Biol. 25(18): p. 8037-8043.

89. Zhong, M., J.D. Liu, J. Wang, J. Liu, L. Li, L. Hou, B. Zhang (2006) Shanghai Kou Qiang Yi Xue. 15(5): p. 461-465.

90. Ma, H., V. Urquidi, J. Wong, J. Kleeman, S. Goodison (2003) Mol Cancer Res. 1(10): p. 739-746.

91. Ко, L.J. C. Prives (1996) Genes Dev. 10(9): p. 1054-1072.95. el-Deiry, W.S. (1998) Semin Cancer Biol. 8(5): p. 345-357.

92. Sax, J.K. W.S. El-Deiry (2003) Cell Death Differ. 10(4): p. 413-417.

93. Asker, C., K.G. Wiman, G. Selivanova (1999) Biochem Biophys Res Commun. 265(1): p. 1-6.

94. Kusumoto, M., T. Ogawa, K. Mizumoto, H. Ueno, H. Niiyama, N. Sato, M. Nakamura, M. Tanaka (1999) Clin Cancer Res. 5(8): p. 2140-2147.

95. Kanaya, Т., S. Kyo, K. Hamada, M. Takakura, Y. Kitagawa, H. Harada, M. Inoue (2000) Clin Cancer Res. 6(4): p. 1239-1247.

96. Roos, G., P. Nilsson, S. Cajander, N.H. Nielsen, C. Amerlov, G. Landberg (1998) Int J Cancer. 79(4): p. 343-348.

97. Xu, D., Q. Wang, A. Gruber, M. Bjorkholm, Z. Chen, A. Zaid, G. Selivanova, C. Peterson, K.G. Wiman, P. Pisa (2000) Oncogene. 19(45): p. 5123-5133.

98. Shats, I., M. Milyavsky, X. Tang, P. Stambolsky, N. Erez, R. Brosh, I. Kogan, I. Braunstein, M. Tzukerman, D. Ginsberg, V. Rotter (2004) J Biol Chem. 279(49): p. 50976-50985.

99. Bartek, J. J. Lukas (2001) FEBS Lett. 490(3): p. 117-122.

100. Ge, Z., C. Liu, M. Bjorkholm, A. Gruber, D. Xu (2006) Mol Cell Biol. 26(1): p. 230-237.

101. Won, J., J. Yim, Т.К. Kim (2002) FASEB J. 16(14): p. 1943-1945.

102. Crowe, D.L., D.C. Nguyen, K.J. Tsang, S. Kyo (2001) Nucleic Acids Res. 29(13): p. 2789-2794.

103. Crowe, D.L. D.C. Nguyen (2001) Biochim Biophys Acta. 1518(1-2): p. 1-6.

104. Alonso, M.M., J. Fueyo, J.W. Shay, K.D. Aldape, H. Jiang, O.H. Lee, D.G. Johnson, J. Xu, Y. Kondo, T. Kanzawa, S. Kyo, B.N. Bekele, X. Zhou, J. Nigro, J.M. McDonald, W.K. Yung, C. Gomez-Manzano (2005) J Natl Cancer Inst. 97(21): p. 1589-1600.

105. Nguyen, D.C. D.L. Crowe (1999) Biochim Biophys Acta. 1445(2): p. 207-215.

106. Xu, H.J., Y. Zhou, W. Ji, G.S. Perng, R. Kruzelock, C.T. Kong, R.C. Bast, G.B. Mills, J. Li, S.X. Hu (1997) Oncogene. 15(21): p. 2589-2596.

107. Saito, M., K. Nakagawa, K. Hamada, S. Hirose, H. Harada, S. Kohno, S. Nagato, T. Ohnishi (2004) Int J Oncol. 24(5): p. 1213-1220.

108. Zinkel, S., A. Gross, E. Yang (2006) Cell Death Differ. 13(8): p. 1351-1359.

109. Mandal, M. R. Kumar (1997) J Biol Chem. 272(22): p. 14183-14187.

110. Elkak, A.E., K. Kirkpatrick, L. Mears, C. Wells, M. Ghilchik, R. Newbold, K. Mokbel (2002) Eur J Surg Oncol. 28(1): p. 14-18.

111. Jiang, J.F., W.J. Liu, J. Ding (2000) Acta Pharmacol Sin. 21 (8): p. 759-764.

112. Kanauchi, H., N. Wada, O.H. Clark, Q.Y. Duh (2002) Surgery. 132(6): p. 1021-1026; discussion 1026-1027.

113. Oh, S., Y. Song, J. Yim, Т.К. Kim (1999) J Biol Chem. 274(52): p. 37473-37478.

114. Englert, C. (1998) Trends Biochem Sci. 23(10): p. 389-393.

115. Fujimoto, K., S. Kyo, M. Takakura, T. Kanaya, Y. Kitagawa, H. Itoh, M. Takahashi, M. Inoue (2000) Nucleic Acids Res. 28(13): p. 2557-2562.

116. Maida, Y., S. Kyo, T. Kanaya, Z. Wang, N. Yatabe, M. Tanaka, M. Nakamura, M. Ohmichi, N. Gotoh, S. Murakami, M. Inoue (2002) Oncogene. 21(26): p. 4071-4079.

117. Xiao, X., S.K. Phogat, I.A. Sidorov, J. Yang, I. Horikawa, D. Prieto, J. Adelesberger, R. Lempicki, J.C. Barrett, D.S. Dimitrov (2002) Leukemia. 16(9): p. 1877-1880.

118. Xiao, X., M. Athanasiou, I.A. Sidorov, I. Horikawa, G. Cremona, D. Blair, J.C. Barret, D.S. Dimitrov (2003) Exp Mol Pathol. 75(3): p. 238-247.

119. Goueli, B.S. R. Janknecht (2004) Mol Cell Biol. 24(1): p. 25-35.

120. Kyo, S., M. Takakura, T. Kanaya, W. Zhuo, K. Fujimoto, Y. Nishio, A. Orimo, M. Inoue (1999) Cancer Res. 59(23): p. 5917-5921.

121. Misiti, S., S. Nanni, G. Fontemaggi, Y.S. Cong, J. Wen, H.W. Hirte, G. Piaggio, A. Sacchi, A. Pontecorvi, S. Bacchetti, A. Farsetti (2000) Mol Cell Biol. 20(11): p. 37643771.

122. Tanaka, M., S. Kyo, M. Takakura, T. Kanaya, T. Sagawa, K. Yamashita, Y. Okada, E. Hiyama, M. Inoue (1998) Am J Pathol. 153(6): p. 1985-1991.

123. Poole, J.C., L.G. Andrews, Т.О. Tollefsbol (2001) Gene. 269(1-2): p. 1-12.

124. Bouchal, J., Z. Kolar, J. Mad'arova, A. Hlobilkova, E. von Angerer (2002) Biochem Pharmacol. 63(6): p. 1177-1181.

125. Kimura, A., M. Ohmichi, J. Kawagoe, S. Kyo, S. Mabuchi, T. Takahashi, C. Ohshima, E. Arimoto-Ishida, Y. Nishio, M. Inoue, H. Kurachi, K.Tasaka, Y. Murata (2004) Oncogene. 23(26): p. 4505-4515.

126. Meeker, A.K., HJ. Sommerfeld, D.S. Coffey (1996) Endocrinology. 137(12): p: 57435746.

127. Meeker, A.K. (2006) Urol Oncol. 24(2): p. 122-130.

128. Iczkowski, K.A., W. Huang, R. Mazzucchelli, C.G. Pantazis, G.R. Stevens, R. Montironi (2004) Cancer. 100(2): p. 294-299.

129. Mokbel, К., M. Ghilchik, G. Williams, N. Akbar,.C. Parris, R. Newbold (2000) Int J Surg Investig. 1(6): p. 509-516.

130. Wang, Z., S. Kyo, M. Takakura, M. Tanaka, N. Yatabe, Y. Maida, M. Fujiwara, J. Hayakawa, M. Ohmichi, K. Koike, M. Inoue (2000) Cancer Res. 60(19): p. 5376-5381. •

131. Zhang, J., Y. Tu, S. Smith-Schneider (2005) Cancer Cell Int. 5(1): p. 6.

132. Soda, H., E. Raymond, S. Sharma, R. Lawrence, K. Davidson, M. Oka, S. Kohno, E. Izbicka, D.D. Von Hoff (2000) Prostate. 43(3): p. 161-168.

133. Guo, C., B.N. Armbruster, D.T. Price, C.M. Counter (2003) J Urol. 170(2 Pt 1): p. 615618.

134. Kelley, M.L., K.E. Keiger, C.J. Lee, J.M. Huibregtse (2005) J Virol. 79(6): p. 3737-3747.

135. Gewin, L. D:A. Galloway (2001) J Virol. 75(15): p. 7198-7201.

136. Veldman, Т., I. Horikawa, J.C. Barrett, R. Schlegel (2001) J Virol. 75(9): p. 4467-4472.

137. Garbe, J., M. Wong, D. Wigington, P. Yaswen, M.R. Stampfer (1999) Oncogene. 18(13): p. 2169-2180.

138. Klingelhutz, A .J., S.A. Foster, J.K. McDougall (1996) Nature. 380(6569): p. 79-82.

139. Veldman, Т., X. Liu, H. Yuan, R. Schlegel (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100(14): p. 8211-8216.

140. Lee, D., H.Z. Kim, K.W. Jeong, Y.S. Shim, I. Horikawa, J.C. Barrett, J. Choe (2002) J Biol Chem. 277(31): p. 27748-27756.

141. Gastroenterol. 11(36): p. 5627-5632.

142. Zhang, X., N. Dong; H. Zhang, J. You, H: Wang, L. Ye (2005) J Lab Clin Med. 145(2): p. 98-104.

143. Liu, Y.C., C.J. Chen, H.S. Wu, D.C. Chan, J.C. Yu, A.H. Yang, Y.L. Cheng, S:C. Lee, H.J. Harn (2004) Eur J Surg Oncol. 30(4): p. 384-390.149.' Kojima, H., K.D. Kaita, Z. Xu, J.H. Ou, Y. Gong, M. Zhang, G.Y. Minuk (2003) J Hepatol. 39(2): p. 262-268.

144. Hayashi, Y., W. Wang, T. Ninomiya, H. Nagano, K. Ohta, H. Itoh (1999) Mol Pathol. 52(1): p. 19-24.

145. Sugimoto, M., H. Tahara, T. Ide, Y. Furuichi (2004) Cancer Res. 64(10): p. 3361-3364.

146. Liu, J.P;, L. Cassar, A. Pinto, H. Li (2006) Cell Res. 16(10): p. 809-817.

147. Ding, L., L.L. Li, J. Yang, Y.G. Tao, M. Ye, Y. Shi, M. Tang, W. Yi, X.L. Li, J.P. Gong, Y. Cao (2005), Int J Biochem Cell Biol. 37(9): p. 1881-1889.

148. Yang, J., X.-Deng, L. Deng, H. Gu, W. Fan, Y. Cao (2004) J Exp Clin Cancer Res. 23(3): p. 495-506.

149. Chen, F., C. Liu, C. Lindvall, D. Xu, I. Ernberg (2005) Int J Cancer. 113(2): p; 284-289. .156. Verma, S:C., S; Borah, E.S: Robertson (2004) J Virol. 78(19): p. 10348-10359.

150. Re, M.C., P. Monari; D: Gibellini, P: Ciancianaini, P.P. Dall'Aglio, M. Vignoli, G. Furlini, E. Ramazzotti; U. Bertazzoni, C. Casoli (2000) J Hematother Stem Cell Res.9(4): p. 481-487.

151. Bellon,M. C. Nicot (2008) J Natl Cancer Inst. 100(2): p. 98-108.

152. Uchida, N., T. Otsuka,.F. Arimaj H. Shigematsu, T. Fukuyama, M. Maeda, Y. Sugio, Y. Itoh, Y. Niho (1999) Leuk Res, 23(3): p. 311-316.

153. Gabet, A.S:, F. Mortreux, P. Charneau, P. Riou, M. Duc-Dodon^ Y. Wu, K.T. Jeang, E: . Wattel (2003) Oncogene. 22(24): p. 3734-3741.

154. Glasspool, R.M., S:- Burns, S.F. Hoare, C. Svensson, N.W. Keith (2005) Neoplasia. 7(6): p. 614-622. ■ :

155. Shah, K.V. (2007) Int J Cancer. 120(2): p. 215-223.163; Moreno, C.S., S. Ramachandran, DiG. Ashby, N. Laycock, C.A. Plattner, W. Chen, W.C. Halm, D.C. Pallas (2004) Cancer Res. 64(19): p. 6978-6988.

156. Yatabe, N., S. Kyo, Y. Maida, H. Nishi, M: Nakamura, Т. Kanaya, M. Tanaka, K. Isaka, S: Ogawa, M. Inoue (2004) Oncogene. 23(20): p. 3708-3715.

157. Nishi, H., T. Nakada, s'. Kyo, M. Inoue, J.W. Shay, K. Isaka (2004) Mol Cell Biol. 24(13): p. 6076-6083.166; Anderson, C.J., S.F. Hoare, M. Ashcroft, A.E. Bilsland, W.N. Keith (2006) Oncogene. 25(1): p. 61-69.

158. Kilian, A., D.D; Bowtell, H.E. Abud,,G.R. Hime, D;J. Venter, P;K. Keese, E.L. Duncan,

159. R.R. Reddel, R.A. Jefferson (1997) Hum Mol Genet. 6(12): p. 2011-2019: 168; Saeboe-Larssen, S., E. Fossberg, G. Gaudernack (2006) BMC Mol Biol. 7: p. 26.

160. Hisatomi, H., K. Ohyashiki, J.H. Ohyashiki, K. Nagao, T. Kanamaru, H. Hirata, N. Hibi, Y. Tsukada (2003) Neoplasia. 5(3): p. 193-197.

161. Colgin, L.M., C. Wilkinson, A. Englezou, A. Kilian, M.O. Robinson, R.R. Reddel (2000) . Neoplasia. 2(5): p. 426-432.

162. Yi, X., D.M. White, D.L. Aisner, J.A. Baur, W.E. Wright, J.W. Shay (2000) Neoplasia. 2(5): p. 433-440. 1

163. Cerezo, A., H; Kalthoff, M. Schuermann, B; Schafer, P. Boukamp (2002) J Cell Sci. 115(Pt 6): p. 1305-1312.

164. Barclay, J.Y., A.G. Morris, C.U.Nwokolo (2005) Dig Dis Sci. 50(7): p. 1299-1303.

165. Ulaner, G.A., J.F. Hu, Т.Н. Vu, L.C. Giudice, A.R. Hoffinan (1998) Cancer Res. 58(18): . p. 4168-4172.175: Song, M.S. S:W. Lee (2006) FEBS Lett. 580(21): p. 5033-5043.

166. Brambilla, С., M; Folini, Pi Gandellini, L. Daprai, M.G. Daidone, N. Zaffaroni (2004) Cell Mol Life Sci. 61(14): p. 1764-1774.

167. Morin, G.B. (1989) Cell. 59(3): p. 521-529.

168. Akiyama, M., T. Hideshima, T. Hayashi, Y.T. Tai, C.S. Mitsiades, N. Mitsiades, D; Chauhan, P:.Richardson, N.C.'Munshi, K.C. Anderson (2003) Cancer Res. 63(1): p: 1821.

169. Seimiya, H., H. Sawada, Y. Muramatsu, M. Shimizu, K. Ohko, K. Yamane, T. Tsuruo (2000) EMBO J. 19(11): p. 2652-2661.

170. Li, H., L. Zhao, Z. Yang, J.W. Funder, J.P. Liu (1998) J Biol Chem. 273(50): p. 3343633442.

171. Yeh, Y.M., Y.T. Pan, T.C. Wang (2005) Cancer Lett. 218(2): p. 207-213.

172. Li, H., L.L. Zhao, J.W. Funder, J.P. Liu (1997) J Biol Chem. 272(27): p. 16729-16732.

173. Kang, S.S., T. Kwon, D.Y. Kwon, S.I. Do (1999) J Biol Chem. 274(19): p. 13085-13090.

174. Breitschopf, K., A.M. Zeiher, S. Dimmeler (2001) FEBS Lett. 493(1): p. 21-25.

175. Kharbanda, S., V. Kumar, S. Dhar, P. Pandey, C. Chen, P. Majumder, Z.M. Yuan, Y. Whang, W. Strauss, Т.К. Pandita, D. Weaver, D. Kufe (2000) Curr Biol. 10(10): p. 568575.

176. Yashima, K., A. Maitra, B.B. Rogers, C.F. Timmons, A. Rathi, H. Pinar, W.E. Wright, J.W. Shay, A.F. Gazdar (1998) Cell Growth Differ. 9(9): p. 805-813.

177. Feng, J., W.D. Funk, S.S. Wang, S.L. Weinrich, A.A. Avilion, C.P. Chiu, R.R. Adams, E. Chang, R.C. Allsopp, J. Yu, et al. (1995) Science. 269(5228): p. 1236-1241.

178. Guilleret, I., P. Yan, L. Guillou, R. Braunschweig, J.M. Coindre, J. Benhattar (2002) Carcinogenesis. 23(12): p. 2025-2030.

179. Morales, C.P., E.L. Lee, J.W. Shay (1998) Cancer. 83(4): p. 652-659.

180. Nishio, Y., K. Nakanishi, Y. Ozeki, S.X. Jiang, T. Kameya, A. Hebisawa, M. Mukai, W.D. Travis, T.J. Franks, T. Kawai (2007) Jpn J Clin Oncol. 37(1): p. 16-22.

181. Maitra, A., K. Yashima, A. Rathi, C.F. Timmons, B.B. Rogers, J.W. Shay, A.F. Gazdar (1999) Cancer. 85(3): p. 741-749.

182. Dome, J.S., C.A. Bockhold, S.M. Li, S.D. Baker, D.M. Green, E.J. Perlman, D.A. Hill, N.E. Breslow (2005) J Clin Oncol. 23(36): p. 9138-9145.

183. Kedde, M., C. le Sage, A. Duursma, E. Zlotorynski, B. van Leeuwen, W. Nijkamp, R. Beijersbergen, R. Agami (2006) J Biol Chem. 281(52): p. 40503-40514.

184. Zhao, J.Q., S.F. Hoare, R. McFarlane, S. Muir, E.K. Parkinson, D.M. Black, W.N. Keith1998) Oncogene. 16(10): p. 1345-1350.

185. Zhao, J.Q., R.M. Glasspool, S.F. Hoare, A. Bilsland, I. Szatmari, W.N. Keith (2000) Neoplasia. 2(6): p. 531-539.

186. Zhao, J., A. Bilsland, S.F. Hoare, W.N. Keith (2003) FEBS Lett. 536(1-3): p. 111-119.

187. Zhao, J., A. Bilsland, K. Jackson, W.N. Keith (2005) BMC Cancer. 5: p. 6.

188. Bilsland, A.E., K. Stevenson, S. Atkinson, W. Kolch, W.N. Keith (2006) Cancer Res. 66(3): p. 1363-1370.

189. Levav-Cohen, Y., S. Haupt, Y. Haupt (2005) Growth Factors. 23(3): p. 183-192.

190. Zhu, Y., R.L. Tomlinson, A.A. Lukowiak, R.M. Terns, M.P. Terns (2004) Mol Biol Cell. 15(1): p. 81-90.

191. Tomlinson, R.L., E.B. Abreu, T. Ziegler, H. Ly, C.M. Counter, R.M. Terns, M.P. Terns (2008) Mol Biol Cell. 19(9): p. 3793-3800.

192. Theimer, C.A., B.E. Jady, N. Chim, P. Richard, K.E. Breece, T. Kiss, J. Feigon (2007) Mol Cell. 27(6): p. 869-881.

193. Yi, X., V.M. Tesmer, I. Savre-Train, J.W. Shay, W.E. Wright (1999) Mol Cell Biol. 19(6): p. 3989-3997.

194. Griffith, J.D., L. Comeau, S. Rosenfield, R.M. Stansel, A. Bianchi, H. Moss, T. de Lange1999) Cell. 97(4): p. 503-514.

195. Paeschke, K., S. Juranek, T. Simonsson, A. Hempel, D. Rhodes, H.J. Lipps (2008) Nat Struct Mol Biol. 15(6): p. 598-604.

196. Tang, J., Z.Y. Kan, Y. Yao, Q. Wang, Y.H. Hao, Z. Tan (2008) Nucleic Acids Res. 36(4): p. 1200-1208.

197. Hug, N. J. Lingner (2006) Chromosoma. 115(6): p. 413-425.

198. Wang, F., E.R. Podell, A.J. Zaug, Y. Yang, P. Baciu, T.R. Cech, M. Lei (2007) Nature. 445(7127): p. 506-510.

199. Ye, J.Z., D. Hockemeyer, A.N. Krutchinsky, D. Loayza, S.M. Hooper, B.T. Chait, T. de Lange (2004) Genes Dev. 18(14): p. 1649-1654.

200. Armbruster, B:N., C.M. Linardic, T. Veldman, N.P. Bansal, D.L. Downie, G.M. Counter (2004) Mol Cell Biol. 24(8): p. 3552-3561.211. van Brabant, A.J., R. Stan, N.A. Ellis (2000) Annu Rev Genomics Hum Genet. 1: p. 409459. ,

201. Kondo, Т., N. Que, K. Yoshida,. Y. Mitani, K. Naka, H. Nakayama, W. Yasui (2004) Cancer Res. 64(2): p. 523-529:

202. Salas, T.R., I. Petruseva, O. Lavrik, A. Bourdoncle, J;L. Mergny, A. Favre, C. Saintome (2006) Nucleic Acids Res. 34(17): p. 4857-4865.214: Cohen, S;, E. Jacob, H. Manor (2004) Biochim Biophys.Acta. 1679(2): p. 129-140.

203. Satra, M., I. Tsougos, V. Papanikolaou, K. Theodorou, C. Kappas, A. Tsezou (2006) Int J Radiat Biol. 82(6): p. 401-409:

204. Perez Mdel, R., D. Dubner, S. Michelin, F. Leteurtre, E.D: Carosella, P.A. Gisone (2002) Int J Radiat Biol. 78(12): p. 1175-1183.

205. XivL., G. Chen, J: Zhou, G. Xu, S. Wang, P. Wu, T. Zhu, A. Zhang, W. Yang, Q. Xu, Y. Lu, D. Ma (2006) Apoptosis. 11(5): p. 789-798Г

206. Colitz, G.M., C.A. Barden, P: Lu, H:L. Chandler(2006) Vet.Ophthalmol: 9(5): p: 379385.

207. Broccoli, D:, J.W. Young, T. de Lange (1995) Proc Natl Acad Sci U S A. 92(20): p. 9082-9086:

208. Snijders, Pvan Duin, J.M. Walboomers, RID: Steenbergen, E.K. Risse, T.J. Helmerhorst; R.II. Verheijen, C.J. Meijer (1998) Cancer Res. 58(17): p. 3812-3818.

209. Samoylova, E.V., G.O; Shaikhaiev, S,V. Petrov, N.P. Kisseljova; F.L. Kisseljov (1995) Int J Cancer. 61(3): p. 337-341.

210. Zhang,.R.G., X.W. Wang, J.H. Yuan, L.X. Guo, II. Xie (2000) Cell Res. 10(1): p. 71-77.

211. Iftode, C., Y. Daniely, J.A. Borowiec (1999) Crit Rev Biochem Mol Biol. 34(3): p. 141180: "

212. Fanning» E., V. Klimovich, A.R: Nager (2006) Nucleic Acids Res. 34(15): p. 4126-4137. 225: Schramke, V., P: Luciano, V. Brevet, S. Guillot- Y. Corda, M.P. Longhese, E. Gilson,.V.

213. Geli (2004) Nat Genet. 36(1): p. 46-54.

214. Kibe, Т., Y. Ono, K. Sato, M. Ueno (2007) Mol Biol Cell. 18(6): p. 2378-2387.

215. Meyer, R.R. P.S. Laine (1990) MicrobioLRev. 54(4): p. 342-380.

216. Smogorzewska, A. T. de Lange (2004) Annu Rev Biochemr 73: p: 177-208.

217. Loayza, D. T. De Lange (2003) Nature: 423(6943): p. 1013-1018: .