Идентификация и изучение функциональных особенностей новой теломеразы дрожжей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

005012658

СМЕКАЛОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ НОВОЙ ТЕЛОМЕРАЗЫ ДРОЖЖЕЙ

02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат

диссертации па соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2012

005012658

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: доктор химических наук, профессор,

член-корр. РАН Донцова Ольга Анатольевна;

кандидат химических наук, Зверева Мария Эмильевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН

Кочетков Сергей Николаевич;

кандидат биологических наук, Агафонов Михаил Олегович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт химической биологии и фундаментальной медиципы СО РАН, г.Новосибирск

Защита состоится 13 марта 2012 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 40, МГУ Лабораторный корпус «А»), аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 10 февраля 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Теломеры - это специализированные ДНК-белковые структуры, локализованные на концах хромосом эукариотических организмов; их основная функция состоит в поддержании стабильности генома. Классический механизм репликации не в состоянии обеспечить синтез конца хромосомы, это приводит к укорочению теломер при каждом раунде деления клетки, дестабилизации генома и сенессенсу. Для предотвращения этих процессов клетка использует различные механизмы, важнейшим из которых является активация теломеразы. Данный фермент представляет сложный РНК-белковый комплекс. Основные компоненты теломеразы - теломеразная каталитическая субъединица (теломеразная обратная транскриптаза, TERT) и теломеразная РНК (TR), в составе которой присутствует небольшой матричный участок, по которому и осуществляется синтез теломерного повтора.

Исследования в области биогенеза теломер позволяют предположить, что отсутствие или низкая активность теломеразы в соматических клетках - одна из причин старения организма. Мутации в теломеразной РНК вызывают дискератоз, а также ассоциированы с некоторыми случаями апластичной анемии, миелодисплазией и диффузным интерстициальным пневмофиброзом. Понимание механизма работы теломеразы и закономерностей регуляции фермента позволит найти новые подходы для лечения этих болезней. Было показано, что теломераза активна в 85% опухолей, а активация теломеразы является одним из первых шагов на пути трансформации клетки в злокачественную, поэтому теломеразный комплекс также является заманчивой мишенью для создания препаратов в области противоопухолевой терапии.

Отсутствие структурных данных для функционального теломеразного комплекса представляет главную проблему на пути изучения фермента и создания эффекторов, влияющих на его активность. Одна из причин - низкая стабильность каталитической субъединицы теломеразы, что не позволяет получить белок в форме, пригодной для структурных и функциональных исследований. Другая проблема - вариабельность теломеразной РНК. Различия в размере (от 150 нуклеотидов в реснитчатых до 2000 нуклеотидов в дрожжах) и нуклеотидном составе зачастую не позволяют выявить струиурные элементы, необходимые для работы и регуляции комплекса и затрудняют идентификацию РНК субъединиц теломеразы из новых организмов. Использование термофильных организмов часто более перспективно для структурно-функционального изучения ферментов, так как биологические компоненты - и белки, и нуклеиновые кислоты, имеют более компактную пространственную организацию, что способствует их

стабилизации в растворе. Данная работа посвящена идентификации и изучению особенностей тсломеразы в термотолерантных дрожжах Hansenula polymorpha. Цели работы:

1. Идентификация основных компонентов теломеразы дрожжей Н. polymorpha

2. Разработка метода выделения каталитической субъединицы теломеразы, пригодной для структурно-функционального изучения комплекса

3. Изучение особенностей функционирования новой теломеразы дрожжей Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе были идентифицированы основные компоненты теломеразы дрожжей Н. polymorpha -теломеразная каталитическая субъединица (hpTERT) и теломеразная РНК (hpTER). Высокая стабильность каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha позволила разработать метод выделения рекомбинантного белка, пригодного для структурных и функциональных исследований. Он включает экспрессию каталитической субъединицы теломеразы с 6His и S-тагами на N-конце белка в E.coli, очистку методами аффинной и ионообменной хроматографии. Впервые было показано, что в системе in vitro рекомбинантная каталитическая субъединица теломеразы обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.

Идентифицированная в работе теломеразная РНК Н. polymorpha представляет собой одну из самых компактных теломеразных РНК дрожжей, ее длина составляет 824 нуклеотида. Анализ матричного участка теломеразной РНК методами мутагенеза, детекция теломеразной активности Н. polymorpha in vitro и анализ теломер выявили существенное различие в работе теломеразы in vitro и in vivo. Теломераза, выделенная in vitro, использует дополнительный нуклеотид с 5' конца матричного участка (А170) в реакции обратной транскрипции. Синтезируемый таким образом тимин отсутствует в аннотированной последовательности теломер. Анализ последовательности концов хромосом показал, что нет ни одного случая присутствия тимина в этой позиции in vivo. На основе полученных данных предложена модель регуляции теломеразы на конце хромосомы.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", 25-30 июня, г. Турин, Италия, 2011; международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения», 12-15 апреля, г. Сыктывкар, 2010; CSHL Meetings "Telomeres&Telomerase", 28 апреля-2 мая, Нью-Йорк, США, 2009; Spetsai Summer School "Proteins and their Networks - from specific to global analysis", 7-17 сентября, г. Спеце, Греция, 2009.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 32 рисунками и 1 таблицей. Библиографический указатель включает 137 цитированных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В данной работе мы впервые обратились к термотолерантным дрожжам НатепиЬ ро1утогрка в качестве модели для исследования теломеразы. Этот организм способен выживать при температурах до 50 "С, что позволяет надеяться на большую стабильность выделенной каталитической субъединицы теломеразы Я. ро1утогрка по сравнению с аналогами из других организмов. На настоящий момент единственным примером полноразмерной теломеразной обратной транскриптазы, для которой удалось получить кристаллическую структуру, является ТЕЯТ из организма ТпЬоНит саиапеит. Отличительной особенностью этого белка является отсутствие № концевого домена, характерного для всех других известных теломеразных обратных транскриптаз. Для Т'НгаИутепа ЛегторкИа получены данные о структуре И-концсвого домена теломеразной каталитической субъединицы и о структуре ее РНК-связывающего домена.

Я. ро1утогрИа принадлежит к метилотрофным дрожжам, таксономический анализ относит ее к семейству ЗасскаготусеШсеае, род РкШа. Анализ митохондриального генома Я. ро1утогр1га позволяет сомневаться в принадлежности Я. ро!утогрка к роду ПсУиа и предполагает создание отдельного рода для данного организма.

Известно, что теломеры Я. ро1утогрка состоят из 18-23 повторов последовательности 5'-gggtggcg-3'. Они характеризуются высоким процентным содержанием в-С пар (87%), а также гомогенностью, необычной для большинства дрожжей. Тот факт, что Я. ро1утогрка стоит на пересечении между разными видами дрожжей делает особенно интересной идентификацию теломеразной РНК из этого организма.

1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЫДЕЛЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ ТЕЛОМЕРАЗЫ, ПРИГОДНОЙ ДЛЯ СТРУКТУРНЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В сотрудничестве с лабораторией генетической инженерии центра «Биоинженерии» РАН мы отсеквенировали геном И. polymorpha, штамм DL1. Собранные контиги находятся в свободном доступе в базе данных Pubmed, Genbank (AEOIO1000001.1 - АЕ0101000013.1).

Последовательность каталитической субъединицы теломеразы S. cerevisiae (Est2) сравнили с геномом Н. polymorpha. Анализ программой BLAST выявил 44% гомологии по аминокислотам с участком HPODL контига 07 318035-315746. Искомый ген белка (далее hpTERT) содержит обратнотранскриптазный домен, который характерен для всех обратных транскриптаз, включая обратные транскриптазы ретровирусов, ретротранспозонов, интронов П-й группы. Также в аминокислотной последовательности hpTERT можно выделить N- и С- концевые домены, характерные для теломеразных обратных транскриптаз. Ген кодирует белок размером 92 кДа - это одна из самых маленьких теломеразных обратных транскриптаз, за исключением TERT из Т. castaneum.

Ген белка hpTERT был клонирован под Т7 промотор в 3 различные экспрессионные системы для последующего выделения из Е. coli: 1) pCDF с 6His тагом на N-конце белка 2) рЕТЗЗЬ+ с 6His тагом на С-конце белка 3) pET30aTEV с 6His и S- тагами с N- конца белка. Постановка тагов с различных сторон белка обусловлена вероятностью сворачивания концов аминокислотной цепи внутрь белковой глобулы, с чем может быть связано снижение эффективности аффинной хроматографии. S-таг представляет собой небольшую пептидную последовательность размером 4 кДа, которая может использоваться для стабилизации белков в растворе. Экспрессия белков индуцировалась изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозидом, очистка проводилась с помощью металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA (никель-нитрилтриуксусная кислота) агарозе в нативных условиях. hpTERT детектируется во всех образцах элюции с аффинного сорбента. Это говорит об успехе тактики выбора термотолерантных дрожжей в качестве источника каталитической субъединицы теломеразы. Однако при использовании векторов pCDF и рЕТЗЗЬ+, как в случае расположения тага с N-, так и с С- конца вместе с целевым белком на смоле происходит совыделение значительного количества примесей. Нужно отметить, что соотношение целевой белок/примеси лучше в случае использования конструкции рЕТЗЗЬ+ с 6His тагом на С-конце белка, что, скорее всего, отражает закрытую ориентацию N-конца белковой цепи hpTERT. Выделение белка с использованием S тага (конструкция рЕТЗОаТЕУ) дает принципиально лучший результат. Очевидно, что хорошо структурированный, небольшой S-таг с N- конца белка значительно повышает его

стабильность в растворимой форме. Белок был выделен и дополнительно очищен с помощью гель-фильтрации и ионообменной хроматографии на БР-сефарозе, результат очистки представлен на рисунке 1А.

А

Б

В

субстрат РНК/ ДНК/

ДНК ДНК ДНК

hpTERT +

+ - + - + -

70 •

РНК

35 16

40 -

55

5

3

Днк

5'

к.

Рис.1. Проверка функциональной активности hpTERT, выделенной из клеток Е. coli, трансформированных вектором pET30aTEV_hpTERT. А - Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантной hpTERT, полученной из клеток Е. coli, трансформированных вектором pET30aTEV_hpTERT. Дорожки 1 и 2 - белки суммарных клеточных лизатов Е. coli до и после индукции ИПТГ. Образец в дорожке «hpTERT» соответствует белковому препарату, полученному с помощью дополнительной очистки посредством аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе и ионообменной хроматограф™ на SP-сефарозе. Б - Схема РНК-ДНК-дуплекса, используемого в качестве субстрата для hpTERT в реакции обратной транскрипции. В - продукты реакции с участием hpTERT (добавление белка в реакционную смесь обозначено «+», те же компоненты без добавления белка обозначены «-» над рисунком) и различных субстратов (тип субстрата указан над рисунком) проанализированы методом электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях. Для визуализации продуктов удлинения ДНК-олигонуклеотида в реакционной смеси присутствует [<х-3"P]dGTP. Зона, соответствующая по подвижности исходному ДНК-олигонуклеотиду, отмечена стрелкой. Отсутствие явных продуктов удлинения ДНК-олигонуклеотида во всех дорожках, кроме первой, свидетельствует о получении активной hpTERT в растворимой форме.

На основании данных о составе теломер можно предположить последовательность матричного участка теломеразной РНК и смоделировать ДНК олигонуклеотид, имитирующий теломеру. Таким образом, система содержала очищенную рекомбинантную каталитическую субъединицу теломеразы; субстрат, представляющий собой гибридный РНК-ДНК дуплекс со свободным 31 концом (Рис. 1Б); смесь нуклеотидов, где dGTP содержит 32й изотоп фосфора в альфа положении (для визуализации удлинения олигонуклеотида). В качестве контролен использовались аналогичный ДНК-ДНК дуплекс,

либо одноцепочечная теломерная ДНК. Поскольку каталитическая субъединица теломеразы является обратной транскриптазой, такие субстраты не могут использоваться hpTERT для удлинения. Кроме того, каждая реакция проводилась в присутствии и в отсутствии hpTERT (Рис. 1В). В дорожке №1 рисунка 1В можно наблюдать специфичный сигнал, соответствующий присоединению dGTP к ДНК олигонуклеотиду в РНК-ДНК дуплексе. Эта зона отсутствует в системах с субстратами ДНК-ДНК, либо одноцепочечной ДНК и в отсутствии белка, что исключает участие клеточных полимераз Е. coli в данной реакции. ДНК/РНК дуплекс, используемый для реакции, спланирован таким образом, что теоретически в данной системе возможно присоединение трех нуклеотидов. Сигналы, соответствующие присоединению второго и третьего нуклеотидов, можно также детектировать в дорожке под номером 1, однако их интенсивность намного ниже. Скорее всего, это связано с отсутствием в системе полноразмерной теломеразной РНК, необходимой для реконструкции теломеразной активности in vitro. Тем не менее, присоединение даже одного нуклеотида говорит о наличии у белка специфичной обратнотранскриптазной активности и о сохранении им корректной структуры каталитического центра.

Таким образом, конструкция рЕТЗОаТЕУ с hpTERT, где 6His- и S-аффинные таги расположены с N-конца белка, может быть использована для получения рекомбинантной функциональной каталитической субъединицы теломеразы Н. polymorpha. Это открывает новые возможности для определения структуры теломеразной обратной транскриптазы и изучения механизма ее работы.

2. ДИМЕРИЗАЦИЯ N-КОНЦЕВОГО ДОМЕНА hpTERT И БЕЛКА EST3 S. CEREVISIAE

Кроме обратно-транскриптазного домена, ответственного за катализ, теломеразная обратная транскриптаза содержит С- и N-концевые домены, необходимые для ее функционирования. Было показано, что N-концевой домен участвует в ассоциации теломеразной РНК и TERT, взаимодействует с теломерой, способствует функциональной мультимеризации теломеразного комплекса. Учитывая исключительную роль N-концевого домена в фунционировании теломеразы, а также тот факт, что это единственный фрагмент теломеразной обратной транскриптазы (за исключением Т. castaneum TERT), для которого удалось получить кристаллическую структуру, мы экспрессировали N-концевой домен TERT Н. polymorpha в системе, отработанной на полноразмерном белке.

Как и в случае полноразмерного белка hpTERT, N-концевой домен, слитый с б-His и S-тагом, был растворим при выделении из клеток Е. coli, трансформированных плазмидой

pET30aTEV_Ndom. После очистки с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе образец белка был подвергнут гель фильтрации на Superdex S200 колонке, предварительно откалиброванной стандартными белковыми маркерами. При анализе хроматограммы мы детектировали основной пик, соответствующий N-концевому домену, в области 46 кДа, что соответствует димерной форме белка. Интересно, что при очистке полноразмерного белка методом гель фильтрации мы не обнаружили димеризации, пик hpTERT соответствует массе белка, которая составляет 96 кДа. Предыдущие эксперименты с использованием аффинных тагов с N- и С- конца hpTERT позволили предположить, что N-домен имеет закрытую ориентацию по отношению к белковой глобуле. Это гипотеза также объясняет отсутствие способности N-домена к димеризации в составе полноразмерного белка hpTERT.

Ранее мы исследовали димеризацию дрожжевого белка Est3, являющегося компонентом теломеразного комплекса S. cerevisiae. В позвоночных организмах не обнаружено гомологов Est3 белка, однако, его способность связывать РНК и теломер-подобные ДНК олигонуклеотиды, а также взаимодействие с теломерой in vivo позволили предположить, что он выполняет сходные функции с N-концевым доменом каталитической субъединицы теломеразы. В эксперименте по исследованию димеризации Est3 белка мы использовали его производные с различными аффинными тагами - Gst-EsÜ (Est3 слит с аффинным эпитопом глутатион S трансферазы) и 6His-Est3 (гексагистидиновое производное). Мы смешивали два белковых препарата Est3-6His и GST-Est3p и затем выделяли из полученной смеси белок с гистидиновым аффинным эпитопом с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе. При анализе полученной таким образом белковой фракции с помощью ПААГ-ДСН мы детектировали оба производных Est3p, что указывало на взаимодействие между этими двумя белками. В качестве контроля на специфичность взаимодействия мы использовали чистый белок GST, который не совыделялся с гексагистидиновым производным. При переходе от молярного соотношения Est3p-6His:GST-Est3p 1:1 к молярному соотношению 1:10 количество совыделявшегося GST-Est3p не увеличивалось и не превышало количество Est3p-6His. Это наблюдение позволяет предположить, что происходит насыщение белка GST-Est3p по отношению к Est3p-6Hís, следовательно, олигомерная форма, скорее всего, является димером. Способность Est3 к образованию димера коррелирует с димеризацией N-концевого домена полноразмерной каталитичекой теломеразы Н. polymorpha. Этот факт не доказывает, но поддерживает гипотезу о схожей функции этих белков в работе теломеразного комплекса.

3. ВЫДЕЛЕНИЕ ТЕЛОМЕРАЗЫ И АНАЛИЗ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ В ДРОЖЖАХ Я. POLYMORPHA

Теломераза была выделена из клеток Я. polymorpha дикого типа. Дрожжевой S100 экстракт был очищен на DEAE сефарозе с помощью ионообменной хроматографии. Для визуализации теломеразной активности использовался классический «прямой метод детекции». В экстракт, предположительно обогащенный теломеразой, добавляли субстрат (олигонуклеотид, содержащий теломерную последовательность), радиоактивно меченный (a-32P)-dGTP (dGTP*), другие нуклеотиды. Продукты реакции анализировали в полиакриламидном геле, визуализация осуществлялась с помощью системы Phosphorlmager.

В DEAE фракциях, содержащих 400-500 мМ NaOAc, была детектирована РНК-зависимая полимеризующая активность в области, соответствующей более тяжелому, чем исходный праймер, продукту (рис. 2А). Дальнейшие эксперименты показали, что продукты удлинения не детектируются в отсутствие праймера или с неспецифическим праймером, т.е. в данном случае специфически детектируется именно теломеразная активность. Для того чтобы проверить последовательность нуклеотидов, добавляемую ферментом, мы провели серию реакций, в которых один из нуклеотидов (dA, dT, dC) был заменен своим дидезоксианалогом. Для этого эксперимента использовался праймер HD5 5'-tggcggggtggcg-3'. В обычных условиях в результате работы фермента он удлинялся на 9 нуклеотидов. Удлинение HD5 праймера в присутствии ddT приводило к преждевременному стопу на четвертом нуклеотиде (Рис. 2Б, дорожка 4), тогда как в присутствии ddC HD5 удлинялся на 7 нуклеотидов (Рис. 2Б, дорожка 5). Как и ожидалось, включение ddA в реакционную смесь не изменило паттерн продуктов реакции (Рис. 2Б, дорожка 3). Эти результаты позволили нам предположить, что последовательность, синтезируемая ферментом в данных условиях, соответствует теломерной.

Дрожжевая теломераза, выделенная in vitro, не обладает высокой процессивностью. В большинстве случаев она непроцессивна. Это справедливо как для делящихся дрожжей S. pombe, так и для почкующихся дрожжей, например, К. ¡actis, С. albicans, S. cerevisiae (хотя известно, что при определенных условиях теломераза S. cerevisiae может синтезировать больше одного повтора). Теломераза 5. castelii производит более 8 теломерных повторов без диссоциации от субстрата, но это, скорее, исключение из правил. В наших экспериментах теломераза Я. polymorpha была непроцессивной в подавляющем большинстве случаев. При концентрировании DEAE фракции, обогащенной теломеразой, мы детектировали РНК-зависимую ДНК полимеризующую активность в зоне, соответствующей по подвижности второму и третьему повторам. Это согласуется с гипотезой о том, что процессивность является количественной, а не качественной характеристикой теломеразы.

А

Б

ЫаОАс

50тМ

ЮООтМ

<Г /

РНКаза номер фракции

-Ч--4--+-4--+- +

4 6 8 10 12 14

+1 —

• . .. ' 1 2 3 4 5

ёИ05

4

в

Рис. 2. Теломеразная активность Я. ро1утогрИа. А - Детекция РНК-зависимой ДНК

полимеризующей активности во фракциях, полученных в результате хроматографии 8100 экстракта Я. ро1утогрИа на ОЕАЕ сефарозе Б - Анализ ферментом. Дидезоксианалог нуклеотида, используемый в реакции, указан над рисунком. В - Анализ активности теломеразы в широком температурном диапазоне. Буквой «К» обозначен контроль нанесения - радиоактивно меченный олигонуклеотид, добавляемый к продуктам теломеразной реакции перед переосаждением.

Поскольку одной из особенностей дрожжей Я. ро1угпогрка является способность выживать при температурах до 50°С, мы провели анализ теломеразной активности в широком температурном диапазоне от +4 до +70 °С (Рис. 2В). Реакционная смесь и экстракт, обогащенный теломеразой, предварительно инкубировались при соответствующей температуре в течение 2 минут, после чего смешивались и инкубировались еще 15 минут. Оптимальная температура жизнедеятельности Н. ро1утогрИа составляет 37 "С, именно это значение использовалось в предыдущих экспериментах.

£

£ 4 15 25 35 40 45 50 60 70 Т,*С

+1 — в4->-

К

• ---

нуклеотиднои последовательности, синтезируемой

Несмотря на то, что клетки Я. ро1утогрка способны выживать при температуре 50 °С, теломеразная активность не детектируется при температурах выше, чем оптимальное значение. Наоборот, даже при 4 "С можно детектировать синтез ДНК, при этом наиболее эффективно добавляются первые четыре нуклеотида. Логично было бы предположить, что изменение температурных условий реакции равномерно повлияет на «процессивность первого типа», то есть, способность теломеразы добавлять каждый следующий нуклеотид в рамках одного повтора. Тот факт, что при 4 °С синтез первых пяти нуклеотидов происходит с той же эффективностью, что и при 37 °С, в то время, как эффективность обратной транскрипции следующих четырех нуклеотидов значительно снижается, говорит о возможном существовании дополнительного термодинамического барьера в реакции. В процессе синтеза теломерной последовательности теломеразная РНК должна репозиционировать матричный участок и синтезируемую ДНК в каталитическом сайте, действуя, как пружина. Можно предположить, что репозиционирование гетеродуплекса после синтеза пятого нуклеотида сопряжено со структурными изменениями в архитектуре теломеразной РНК и этот переход облегчается в условиях более высоких температур.

4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ РНК Я. РОЬУМОЯРНА

Стратегия поиска

Для того чтобы идентифицировать теломеразную РНК Н. ро1утогрка мы применили сочетание подходов биоинформатического анализа генома и метода биохимического поиска. Последовательность теломеразной РНК должна была содержать матричный участок, комплементарный теломерному повтору, кроме того, ген теломеразной РНК должен отстоять на значительном расстоянии от генов консервативных белков. Мы провели выборку последовательностей Я. ро1утогрИа, содержащих последовательность 5'-gggtggcg-3' и исключили кандидаты, где предполагаемый матричный участок входил в состав открытой рамки считывания. Стратегия идентификации теломеразной РНК и использованием биохимического подхода заключается в амплификации необходимой молекулы, причём селективность достигается за счёт знания последовательности предполагаемого матричного участка. Теломеразная РНК присутствует в клетке в очень небольших количествах, поэтому для увеличения эффективности метода необходимо было сконцентрировать и очистить теломеразу. Первым этапом на этом пути стало получение поликлональных антител против каталитической субъединицы теломеразы из Я. ро!утогрИа (ИрТЕИТЛ На втором этапе теломеразный экстракт, полученный после очистки на ОЕАЕ сефарозе, был подвергнут иммунопреципитации за очищенные поликлональные антитела против каталитической субъединицы теломеразы. Мы детектировали теломеразную

активность в иммунопреципитате, что доказывает надежность используемого подхода (Рис. ЗА). Из полученной фракции были извлечены рибонуклеиновые кислоты, после чего образец был подвергнут обратной транскрипции и амплификации. Последняя стадия анализа включала клонирование, секвенирование и анализ полученных последовательностей (Рис. ЗБ).

В результате проведенного анализа было получено 20 последовательностей. Несмотря на несколько стадий очистки значительная часть (9 сиквенсов) представляла гены рибосомной РНК Н. ро1утогрИа. 3 последовательности соответствовали генам консервативных белков дрожжей - таким образом, маловероятно, чтобы они кодировали теломеразную РНК. Еще 4 соответствовали генам Е. сой, - чувствительность метода выявила даже следовые количества примесей. 4 последовательности совпадали друг с другом и с последовательностью кандидата, обнаруженного с помощью биоинформатического подхода на предыдущем этапе.

Транскрипция гена - кандидата на роль теломеразной РНК в клетке

Последовательность кандидата на роль гена теломеразной РНК располагается между аннотированными белками РОБ4 (в 187 нуклеотидах в 5' области от предполагаемого матричного участка) и геном Ароматической аминотрансферазы I (в 647 нуклеотидах в 3' области от предполагаемого матричного участка). Для того чтобы подтвердить транскрипцию исследуемого участка генома в клетке, был проведен Нозерн блот анализ с использованием зонда в 556 нуклеотидов на область, содержащую матричный участок и лежащую между генами консервативных белков (Рис. ЗВ). Были проанализированы образцы суммарной РНК; РНК, выделенной из Б100 экстракта; а также РНК, полученной после переосаждения ОЕАЕ фракции, обогащенной теломеразой. Анализ выявил присутствие нескольких форм транскрипта исследуемого гена. Основной сигнал соответствовал длине маркера приблизительно в 800 нуклеотидов и присутствовал во всех изученных образцах. Эта длина идеально соответствует размеру участка между аннотированными белковыми генами. Впоследствии мы будем обращаться к этой области генома как к гену ЬрТЕЯ. Клонирование дополнительных молекул ЬрТЕЯ позволило определить 5'- и 3'- концы транскрипта более точно. 5'- конец достаточно гомогенен и отстоит от матричного участка на 168 нуклеотидов. Анализ 3'- конца разделил последовательности РНК, соответствующие гену ЬрТЕЯ, на 3 класса: 1) четыре наиболее длинных клона содержали дополнительно полиадениловую последовательность (6-11А) с 3' конца. Этот результат согласуется с литературными данными о частичном полиаденилировании теломеразной РНК; 2) последовательности, заканчивающиеся в

позиции 672-680 нуклеотидов от начала транскрипта ЬрТЕЛ; 3) последовательности, заканчивающиеся в позиции 584-590 нуклеотидов от начала транскрипта ЬрТЕЛ. Три формы аналогичной длины детектируются Нозерн блот анализом. Этот результат отражает или направленный процессинг, или деградацию, что не может быть точно выявлено с помощью данного метода анализа. Логично предположить, что наиболее удаленные концы соответствуют исходному транскрипту, - таким образом, его длина составляет 824 нуклеотида. Нужно отметить, что это одна из наиболее коротких известных дрожжевых теломеразных РНК. Единственное исключение - это теломеразная РНК С. ИИегтопсЩ, длина которой составляет 779 нуклеотидов.

В

terSearch

! обратная транскрипция ¿v ^ О

J^ ^ Q» ^

,<f Ar

DEAE IP

{РНКазаН, TUT, dö 1000

800

leScarch

600

РНКаза

polyC ^ 400

ПЦР. юонироваииеб секаенироваиие 300

Рис. 3. Поиск кандидатов на роль теломеразной РНК с использованием биохимического подхода. А - Анализ присутствия теломеразы до (DEAE) и после (IP) коиммунопреципитации экстракта против антител к hpTERT. Б - Схема получения пула последовательностей-кандидатов на роль теломеразной РНК в дрожжах Н. polymorphe В - Нозерн блот анализ с использованием зонда в 556 нуклеотидов к гену hpTER. Анализировались образцы суммарной РНК; РНК, выделенной из S100 экстракта и из DEAE фракции, обогащенной теломеразой.

Нокаут гена hpTER приводит к фенотипу укорачивающихся теломер

Нокаут генов, необходимых для функционирования теломеразы, вызывает фенотип укорачивающихся теломер (Est фенотип). Он характеризуется потерей жизнеспобности клеток через определенное количество поколений ввиду укорочения теломер до критической длины. Мы нокаутировали ген hpTERT (как положительный контроль) и ген hpTER. Штамм DL1-I, используемый в данных исследованиях, дефективен в производстве лейцина; в нормальных условиях он гаплоиден. Мы заменили часть гена hpTER в 500 нуклеотидов, содержащую предполагаемый матричный участок теломеразной РНК, на

14

лейциновый маркер Н. polymorpha. В случае hpTERT ген был прерван вставкой лейцинового маркера по сайту Stul. Полученные конструкции были трансформированы в штамм DL1-1, делеции искомых генов были подтверждены ПЦР анализом, который дал продукты предсказанной длины. Мы наблюдали два независимых AhpTER трансформанта, AhpTERT трансформант и штамм дикого типа в течение нескольких поколений. Анализ жизнеспособности клеток проводился высеванием жидкой клеточной культуры на чашку (Рис. 4А). С первым же пересевом (около 20 поколений с момента трансформации) можно наблюдать потерю жизнеспособности нокаутных штаммов (Рис.4А, 1й пересев). Теломеры Я. polymorpha изначально короче теломер других дрожжей (140-190 нуклеотидов по сравнению с 300-500 нуклеотидами у S. cerevisiae, принадлежащей тому же роду). Вероятно, укорочение теломер после 20 поколений достаточно сильно для того, чтобы серьезно повлиять на способность клетки поддерживать архитектуру генома; поэтому данный результат не противоречит литературным данным о том, что обычно первые признаки фенотипа наблюдаются позже. Начиная со второго пересева, клетки из жидкой культуры были неспособны к формированию колоний. После нескольких пересевов для всех типов мутантов можно наблюдать возникновение жизнеспособных колоний, скорее всего, результат гомологической рекомбинации - альтернативного механизма удлинения теломер.

Статус теломер в исследуемых штаммах был проверен с помощью метода Соузерн блот анализа терминальных фрагментов рестрикции (Рис. 4Б). В области, соответствующей по подвижности 0.6 kb можно наблюдать зону, укорачивающуюся по мере жизни нокаутных штаммов. Она соответствует концу хромосомы и отражает судьбу теломер. В совокупности с данными по жизнеспособности клеток это подтверждает фенотип укорачивающихся теломер для AhpTERT и AhpTER штаммов.

Наблюдаемый эффект может обуславливаться не делецией hpTER, а побочным эффектом трансформации (мутации, либо встраивание фрагмента ДНК в нецелевую область генома). Для того чтобы исключить подобное событие, мы сконструировали шаттл вектор, в который ген hpTER встроен вместе со 150 нуклеотидами из 5' области, которые служили бы нативным промотором. Вектор был трансформирован в AhpTER клетки. Полученный штамм мы характеризовали следующим образом: во первых, жизнеспособность клеток восстанавливалась; во вторых, из них можно было выделить активную теломеразу, тогда как в штамме AhpTER теломеразная активность не детектировалась.

£ wt AhpTERT AhpTER

f--

12346 12346 пересев

Рис. 4. Клетки, нокаутные по гену hpTER демонстрируют фенотип укороченных теломер. А -жизнеспособность штаммов AhpTER, AhpTERT и штамма дикого типа оценивалась методом высевания жидкой культуры на чашку. Б - анализ изменения длины теломер в AhpTER и AhpTERT штаммах в течение поколений. Каждый пересев соответствует примерно 20 поколениям.

Мутационный анализ матричного участка теломеразной РНК Я. polymorpha

Известно, что одиночные мутации в матричном участке теломеразной РНК, используемом для синтеза, чаще всего не ¡шляются летальными. Такая мутантная теломеразная РНК используется клеткой для синтеза теломер с измененной последовательностью. Этот подход станет исчерпывающим доказательством функционирования hpTER гена в качестве теломеразной РНК в организме Я polymorpha.

Выравнивание гена hpTER с теломерной последовательностью выявило область со 171-го по 187-й нуклеотид, которая может служить матрицей для синтеза теломер (Рис. 5). Логично предположить, что первая часть используется для связывания хромосомы, тогда как вторая вовлечена в синтез ДНК. Анализ паттерна нуклеотидов, добавляемого теломеразой к праймеру G4 5'-(gggtggcg)4-3', поставил интригующий вопрос. К субстрату добавляется 9 нуклеотидов; в соответствии с теломерной последовательностью Я. polymorpha это должна быть последовательность 5'-gggtggcgg-З'. Частично этот сиквенс был подтвержден опытом с дидезоксинуклеотидами (было показано, что 4-й и 7-й нуклеотиды являются тимином и цитозином соответственно). Если первый повтор матричного участка (до нуклеотида С179) используется для связывания субстрата, тогда вторая часть (С 178 - С171) служит для синтеза теломерного повтора. Здесь представлено только 8 нуклеотидов, комплементарных теломерному повтору, А170, расположенный с 5'

конца за матричным участком, не соответствует последовательности теломерного повтора. С другой стороны, олигонуклеотид 04 может начать удлиняться с нуклеотида С186 (в этом случае только два из трех нуклеотидов будут связаны уотсон-криковским взаимодействием для инициации полимеризации). Тогда последующая доступная часть матрицы идеально соответствует теломерному паттерну, однако вторая часть повтора останется незадействованной.

3'

185

180

175

•ugcuccccaccgc t.

с с с а с с g !

170

I ,

а с

1-й повтор 2-й повтор

Рис. 5. Схема матричного участка гена ЬрТЕВ1.

.5'

Для того чтобы разрешить это противоречие, мы мутировали нуклеотид С176 на аденин в шаттл векторе и трансформировали его в штамм, нокаутный по ЬрТЕЯ гену; теломераза из полученного штамма была выделена и проанализирована на предмет добавляемой последовательности в присутствии дидезоксинуклеотидов (Рис. 6А). В случае, когда в реакционной смеси присутствует сйТ, можно наблюдать преждевременную по отношению к дикому типу остановку синтеза на третьем нуклеотиде, в позиции мутации С176А. Этот результат однозначно подтверждает идентификацию теломеразной РНК Я. ро1утогрИа. Он также позволяет обозначить область, используемую для синтеза теломерного повтора как 178-171 нуклеотид. Тем не менее, остаётся неясным появление девятого нуклеотида в теломеразной реакции при использовании 04 олигонуклеотида.

Теломераза Я. polymorpha использует дополнительный (нетеломерный) нуклеотид А170 с 5' конца матричного участка в реакции обратной транскрипции in

vitro

Мы предположили, что синтез девятого нуклеотида является результатом преждевременной транслокации, так, как это происходит для теломеразы S. cerevisiae или S. pombe. Чтобы проверить, насколько эффективно используется конец матричного участка, мы сконструировали теломеразные РНК с мутациями C17IT и G172T. Обе мутангных теломеразы были проанализированы, в каждом случае видно эффективное включение тимина в теломеразньгй паттерн (Рис. 6Б). Этот результат исключает возможность преждевременной транслокации. Кроме того, наличие девятого нуклеотида в случае мутанта С171Т показывает, что синтез дополнительного нуклеотида не может быть результатом транслокации в позиции С174 или С179, так как альтернативный аденозин с 3'

конца вновь синтезированной ДНК не сможет обеспечить комплементарность вначале матричного участка.

wt С176А

F # IT £

+9— *»» 185 180 175 170

» V I | I ,|

wt ц 9 с ц с о с с а С- с g с|с с с а с с g с]а с

С176А ugcuce-ecaccgccca_accgcac

• I I I J г I i I

¡gqgtggcggg&tggcg

i i l I I i r l i I

♦1— \ —-gaqgtog - -

1 2 3 4 5 6

/ #£ # # ^ 6-

fao i' о' o"

^ л

180 175 17G

1 2 3

I |-J—J

с u с с с с а с с д с[с с с а с с д ф с

wt

С171Т ugcuccccaccg сссс г ucgiao

G172T ugcuccccaccgccccacct.cac

Рис. 6. Анализ матричного участка гена hpTER. А - Теломераза, выделенная из штамма с геном hpTER с мутацией С176А, добавляет к субстрату G4 альтернативную последовательность. Б -Мутации CI71T и G172T в гене hpTER показывают, что теломераза эффективно использует конец матричного участка и опровергают возможность преждевременной транслокации.

Мы предположили, что, несмотря на регулярный повтор 5'-(gggtggcg)n-3' на концах хромосом, теломераза, выделенная in vitro может потенциально использовать нуклеотид А170. Мы провели реакцию с теломеразой дикого типа и праймером HD1, который позиционируется в середину матричного участка. В реакциях использовался различный набор нуклеотидов, что позволяло проследить последовательность, добавляемую теломеразой (Рис. 7А). Праймер заканчивается последовательностью 5'-tggcggggtg-3', что на 5 нуклеотидов длиннее, чем G4 олигонуклотид, использовавшийся ранее. Таким образом, в соответствии с теломерной последовательностью Н. polymorpha теломераза должна синтезировать сиквенс 5'-gcgg-3'. Как и ожидалось, в присутствии радиоактивно меченного dGTP* без других нуклеотидов теломераза добавляла к субстрату HD1 только один

нуклеотид (Рис. 7 А, дорожка 1). Присутствие сЮТР* вместе с аСТР обеспечивало синтез трех нуклеотидов (не четырех, как можно было бы ожидать в соответствии с данными по теломерной последовательности). Включение четвертого нуклеотида можно наблюдать, только в присутствии сЛТР в реакции (Рис. 7А, дорожка 3). Скорее всего, этот результат отражает обратную транскрипцию аденина 170, который располагается непосредственно с 5' конца матричного участка. В дорожках 2-3 можно наблюдать сигнал меньшей интенсивности, он соответствует отжигу олигонуклеотида Н01 с последующим синтезом ДНК одним повтором ранее; эффективность такого процесса на порядок ниже (Рис. 7Б, «позиционирование 2»).

dT dC dC dG* dG* dG*

позиционирование 1

з:

180

175

170

- u g с u с с с с а с с с; c[c с с а с с g с|а с ggggtggcggggtggcgt

HD1

позиционирование 2

з:

180 I

175

170

.5'

12 3

"ugcuccccaccg с|с с с а с с о с|а с'

^^gggg'ggcggggtggcgt

Рис.7. Обратная транскрипция нуклеотида А170. А - Работа теломеразы дикого типа анализировалась в присутствии олигонуклеотида НЭ1 и различного набора нуклеотидов. Б - 2 варианта позиционирования олигонуклеотида №1 в матричный участок теломеразной РНК. Последовательность, добавляемая теломеразой, выделена черным цветом. «Позиционирование 2» соответствует сигналу низкой эффективности в левой части рисунка.

В соответствии с данным предположением в присутствии сЮТР* мы наблюдаем единственную зону (Рис. 7А, дорожка 1). Для эксперимента с участием а0ТР* и с!СТР реакция обратной транскрипции идет вплоть до позиции С176 - добавляется 6 нуклеотидов (Рис. 7А, дорожка 2). В присутствии ёвТР*, ёСТР и с!ТТР теломераза преодолевает барьер А175 (Рис. 7А, дорожка 3).

Удивительно, но проведённый эксперимент показал, что последний нуклеотид, добавляемый теломеразой к субстрату в реакции in vitro, не соответствует аннотированной последовательности теломер Я. polymorpha. Для того чтобы выяснить, встречается ли подобная ситуация in vivo, мы проанализировали 87 чтений, полученных в результате

секвенирования генома Я polymorphs которые содержали от 13 до 20 теломерных повторов. Среди 1400 проанализированных повторов не было ни одного случая присутствия тимипа после паттерна 5'-TGGCG-3>. Мы наблюдали гетерогенность после сиквенса 5'-TGGC-3', которая заключалась в различном количестве гуанинов - 6.7% и 4.5% теломерных повторов содержали 5 и 3 гуанина соответственно, в противоположность четырем, которые кодируются матричным участком теломеразной РНК Я. polymorphs В соответствии с литературными данными этот тип гетерогенности объясняется проскальзыванием фермента по матрице и наблюдается в случае, когда матрица содержит несколько одинаковых нуклеотидов подряд.

Таким образом, последовательность нуклеотидов, получаемая в результате работы теломеразы in vitro, выглядит как 5'-gggtggcgt-3\ в то время как in vivo за паттерном 5'-gggtggcg-3' всегда следует «g».

В теломеразе процесс обратной транскрипции ограничен с 5' конца РНК-шпилькой

(TBE, template boundary element - ограничивающий элемент). Мутации, нарушающие

структуру этого элемента, могут привести к обратной транскрипции негеломерной

последовательности за матричным участком теломеразной РНК, нарушениям в

использовании РНК матрицы и изменениям в процессивности теломеразы. Известно, что С-

домен теломеразной обратной транскриптазы стабилизирует матричный граничный

элемент, непосредственно взаимодействуя с РНК-шпилькой. Делеции в С-концевом домене

hTERT приводили к синтезу последовательности за пределами матричного участка. Эти

данные позволяют предположить, что включение нетеломерного нуклеотида теломеразой

Я. polymorpha in vitro может быть связано с положением, структурой граничного элемента,

либо с его способностью связывать hpTERT. Возможно, что в процессе выделен™

теломеразы эта структура нарушается, то есть, включение дополнительного нуклеотида

является артефактом выделения теломеразы. Однако высокая эффективность и 100%

воспроизводимость наблюдаемого процесса позволяют предположить, что подобное

событие может иметь место in vivo. Мы не зафиксировали ни одного случая присутствия

тимина после паттерна 5'-gggtggcg-3' в теломерах Я. polymorpha. Возможно, что это

является следствием нуклеазной активности, которая ассоциирована с теломеразой. В таком

случае, нуклеазная активность может обеспечивать корректирующую функцию и удалять

нетеломерный нуклсотид, ее эффективность может быть нарушена в процессе выделения теломеразы.

Другое возможное объяснение заключается в том, что включение тимина - это особенность именно непроцесеивной формы теломеразы Я. polymorpha. Находясь в процессивком состоянии, теломераза реплицирует теломерную ДНК без включения

нетеломерного нуклеотида. Но для того чтобы диссоциировать с теломеры, теломераза переключается в непроцессивное состояние, возможно, что этот процесс сопряжен со структурными изменениями комплекса. В таком случае обратная транскрипция аденина 170 будет происходить только на самом конце теломеры, а детекция этого события может быть затруднена вследствие клеточных процессов или в результате выделения геномной ДНК. В рамках этой гипотезы можно предположить, что добавление нетеломерного нуклеотида служит маркером теломеры, которая только что подверглась удлинению ферментом. В таком случае, теломераза не сможет использовать в качестве субстрата олигонуклеотид, заканчивающийся нетеломерной последовательностью 5'-gggtggcgt-3\

Для того, чтобы проверить это предположение мы провели эксперимент, в котором использовали теломерный олигонуклеотид G4 и олигонуклеотид G4t, соответствующий последовательности, продуцируемой теломеразой in vitro (Рис. 8А).

G4t G4 тип субстрата

180 175 170

-ugcuccccaeeg cjcc с а с с g с|1 С

G4 gggtggcg т

G4t !;^-ggggtggcgt f Яш <—+1

ШшШ к

Рис. 8. Эффективность теломеразной реакции в случае использования разных субстратов. А -Схематичное изображение используемых в реакции олигонуклеотидов Б - Реакция удлинения праймера теломеразой. Фермент не способен использовать G4t олигонуклеотид (имититирующий только что синтезированную теломеразой последовательность) в качестве субстрата для реакции полимеризации. Буквой «К» обозначен контроль нанесения - радиоактивно меченный олигонуклеотид, добавляемый к продуктам теломеразной реакции перед переосаждением

Отсутствие сигнала в дорожке «G4t» (Рис. 8Б) обозначает неспособность теломеразы использовать только что синтезированную последовательность нуклеотидов в реакции обратной транскрипции. Возможно, именно это обстоятельство обуславливает отсутствие процессивносги теломеразы Н. polymorphs in vitro.

выводы

1. Идентифицированы гены каталитической субъединицы теломеразы и теломеразной РНК в дрожжах Н. polymorphs

2. Разработан метод получения каталитической субъединицы теломеразы Я. polymorpha (hpTERT), пригодной для струйных и функциональных исследований. Показано, что в отсутствие полноразмерной теломеразной РНК белок обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью.

3. N-концевой домен каталитической субъединицы теломеразы Я. polymorpha и белок Est3 S. cerevisiae димеризуются in vitro.

4. Охарактеризована теломеразная активность Я polymorpha. Теломераза Я. polymorpha

использует дополнительный нуклеотид (А170) с 5' конца матричного участка в реакции

обратной транскрипции in vitro, тогда как in vivo результат обратной транскрипции Al70 не детектируется.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Смекалова Е.М., Петрова О.А., Зверева М.Э., Донцова О.А. Рекомбинантная форма TERT Н. polymorpha обладает ограниченной обратнотранскриптазной активностью (2012). Acta Naturae, 4 № 1 (12), с. 47-50.

Шарапов, Ю.С., Смекалова, Е.М., Зверева, М.Э., Донцова, О.А. (2007) Выделение активного теломеразного белка Est3p и изучение его димеризации in vitro. Биохимия, 7: 866-871.

Smekalova Е.М., Zvereva M.I., Dontsova O.A. Detection of the telomerase activity and identification of the telomerase components in thermotolerant yeast Hansenula polymorpha. (2011) 36th FEBS Congress "Biochemistry for tomorrow's medicine", 25-30 June, Turin, Italy, abstract book, p. 90.

Смекалова E.M., Зверева М.Э., Петрова O.A., Донцова О.А. Теломераза дрожжей Hansenula polymorpha. (2010) Международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения», 12-15 апреля, Сыктывкар, Россия, сборник тезисов, с. 17-18.

Smekalova Е.М., Zvereva M.I., Petrova О.А., Dontsova О.А. Telomerase in thermo-tolerant yeast Hansenula polymorpha - detection of the telomerase activity, cloning and characterization of its catalytic subunit. (2009) CSHL Meetings "Telomeres&Telomerase", 28 April - 2 May, New York, USA, abstract book, p. 161.

Smekalova E.M., Zvereva M.I., Petrova O.A., Dontsova O.A Telomerase in thermo-tolerant yeast Hansenula polymorpha (2009) Spetsai Summer School, 7-17 September, Spetsai, Greece, book «Proteins and their Networks - from specific to global analysis», p.57.

Подписано в печать 08.02.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1180 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

61 12-2/283

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ НОВОЙ ТЕЛОМЕРАЗЫ ДРОЖЖЕЙ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Специальность 02.00.10 - биоорганическая химия

Химический факультет Кафедра Химии Природных Соединений

СМЕКАЛОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА

V.

Научные руководители: кандидат химических наук,

с.н.с., доцент Зверева М.Э.,

профессор, член-корреспондент РАН Донцова О.А.

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений 6

Введение 7

1. Обзор литературы.

Теломеразная РНК: структура, функции и биогенез 8

1.1. Реакционный цикл теломеразы 8

1.2. Структура теломеразной РНК 10

1.2.1. Псевдоузел. 13

1.2.2. STE элемент. 18

1.2.3. Н/АСА scaRNA домен. 21

1.3. Биогенез теломеразной РНК. 22

1.3.1. Транскрипция и процессинг 22

1.3.1.1. в дрожжах 23

1.3.1.2. в реснитчатых простейших 26

1.3.1.3. в позвоночных (human) 27

1.3.2. Локализация и траспорт теломеразной РНК. 29

1.3.2.1. в дрожжах 29

1.3.2.2. в позвоночных 33

1.4. Взаимодействие теломеразной РНК с дополнительными белками 37

1.4.1. в дрожжах 37

1.4.2. в позвоночных 37

1.5. Регуляция экспрессии теломеразной РНК человека 39

1.5.1. Амплификация гена 40

1.5.2. Регуляция транскрипции 40

1.5.3. Регуляция с помощью сигнальных путей 42

1.5.4. Регуляция с помощью механизмов эпигенетики 44

1.6. Неканонические функции теломеразной РНК 46

1.7. Заключение 47

2. Результаты и обсуждение.

49

Введение 49

2.1. Каталитическая субъединица теломеразы Н. polymorpha 51

2.1.1. Идентификация каталитической субъединицы

теломеразы Н. polymorpha (hpTERT) 51

2.1.2. Разработка метода выделения белка hpTERT,

пригодного для структурных и функциональных исследований 51

2.1.3. Каталитическая субъединица теломеразы Н. polymorpha, экспрессированная в Е. coli, обладает ограниченной обратно-транскриптазной активностью в отсутствии теломеразной РНК 55

2.1.4. Димеризация N-концевого домена hpTERT и белка Est3

дрожжей S. cerevisiae 57

2.2. Теломераза Н. polymorpha 61

2.2.1. Детекция теломеразной активности в клетках Н polymorpha 61

2.2.2. Характеристики теломеразы Н. polymorpha 64

2.2.2.1. Способность использовать олигонуклеотиды разной длины 64

2.2.2.2. Процессивность 64

2.2.2.3. Влияние температуры на теломеразную активность 66

2.3. Теломеразная РНК Н. polymorpha 67

2.3.1. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК

биоинформатическими методами 67

2.3.2. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК

биохимическими методами 68

2.3.3. Транскрипция гена - кандидата на роль теломеразной РНК в клетке 70

2.3.4. Нокаут гена hp TER приводит к фенотипу укорачивающихся теломер 73

2.3.5. Предсказание вторичной структуры гена hp TER 76

2.3.6. Мутационный анализ матричного участка

теломеразной РНК Н. polymorpha 82

2.4. Теломераза Н. polymorpha использует дополнительный (нетеломерный) нуклеотид А170 с 5' конца матричного участка

в реакции обратной транскрипции in vitro 83

2.5. Заключение

90

3. Материалы и методы 94

3.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы 94

3.2. Методики, использованные в работе 97

3.2.1. Определение концентрации ДНК в растворе 97

3.2.2. Клонирование гена hpTERT в вектор pUC19 из генома Н. polymorpha 98

3.2.3. Клонирование гена hpTERT в различные экспрессионные системы 98

3.2.4. Выделение и очистка рекомбинантного hpTERT 99

3.2.5. Проверка функциональности очищенного hpTERT в системе in vitro 100

3.2.6. Клонирование N-домена hpTERT в вектор рЕТЗОаТЕУ 100

3.2.7. Получение поликлональных антител против белка hpTERT 100

3.2.7.1. Выработка иммунного ответа у кролика 100

3.2.7.2. Проверка специфичности и эффективности связывания

антител с целевым белком методом Вестери-блот 101

3.2.8. Выделение теломеразы из клеток Н. polymorpha 101

3.2.8.1. Наращивание клеток и получение S100 экстракта 101

3.2.8.2. Определение суммарной концентрации белка в экстракте

с помощью измерения оптической плотности при 235 и 280 нм 103

3.2.8.3. Хроматография 103

3.2.9. Детекция теломеразной активности в системе in vitro 103

3.2.10. Выделение геномной ДНК Н. polymorpha 104

3.2.11. Клонирование области генома Н. polymorpha,

содержащей ген hpTER в вектор pUC 19_hpTER 105

3.2.12. Клонирование гена hpTER в шаттл вектор рКАМ556 105

3.2.13. Мутагенез 106

3.2.14. Нозери-блот анализ 106

3.2.15. Трансформация дрожжей Н. polymorpha 107

3.2.16. Анализ фенотипа полученных штаммов методом разбавлений 108

3.2.17. Анализ фенотипа полученных штаммов методом Саузерн блот 109

3.2.17.1. Перенос ДНК на нитроцеллюлозную мембрану 109

3.2.17.2. Приготовление зондов 109

3.2.17.3. Гибридизация мембраны с радиоактивно меченным зондом 109 4. Выводы 111

Список литературы 112

Список сокращений

БСА бычий сывороточный альбумин

кДа Килодальтон

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ 1,4-дитио-0Ь-треитол

DEAE- диэтиламиноэтил-сефароза

сефароза

DEAE- теломераза, выделенная с помощью хроматографии на

фракция ДЭАЭ-сефарозе

н.о. нуклеотидных остатков

п.о. пар оснований

ПААГ Полиакриламидный гель

ПМСФ фенилметилсульфонилфторид

ПЦР полимеразная цепная реакция

ОТ-ПЦР обратная транскрипция с последующей ПЦР

РНК рибонуклеиновая кислота

мяРНК малая ядерная РНК

мяоРНК малая ядрышковая РНК

ТЕМЕД N,N,N' ,N! -тетраметилэтилендиамид

ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия

TER Теломеразная РНК

TERT Теломеразная обратная транскриптаза

Tris трис(гидроксиметил)аминометан

SDS додецилсульфат натрия

TMG триметилгуанозиновый кэп

Введение

Теломеры - это специализированные ДНК-белковые структуры, локализованные на концах хромосом эукариотических организмов; их основная функция состоит в поддержании стабильности генома [1]. ДНК теломер состоит из повторяющихся последовательностей (теломерных повторов). Классический механизм репликации не в состоянии обеспечить синтез конца хромосомы, это приводит к укорочению теломер при каждом раунде деления клетки, дестабилизации генома и сенессенсу. Для предотвращения этих процессов клетка использует различные механизмы, важнейшим из которых является активация теломеразы. Данный фермент представляет сложный РНК-белковый комплекс. Основные компоненты теломеразы - теломеразная каталитическая субъединица (теломеразная обратная транскриптаза, ТЕЯТ) и теломеразная РНК (ТЯ), в составе которой присутствует небольшой матричный участок, по которому и осуществляется синтез теломерного повтора на 3' конце хромосомы [2].

Исследования в области биогенеза теломер позволяют предположить, что отсутствие или низкая активность теломеразы в соматических клетках - одна из причин старения организма [3]. Мутации в теломеразной РНК вызывают дискератоз, а также ассоциированы с некоторыми случаями апластичной анемии, миелодисплазией и диффузным интерстициальным пневмофиброзом [4,5]. Было показано, что теломераза достоверно активна в 85% опухолей, а активация теломеразы является одним из первых шагов на пути трансформации клетки в злокачественную, поэтому теломеразный комплекс является заманчивой мишенью для создания препаратов в области противоопухолевой терапии [6]. Изучение работы теломеразы и закономерностей регуляции фермента позволит понять механизм развития многих болезней и разработать новые подходы для их лечения.

1. Обзор литературы. Теломеразная РНК: структура, функции и биогенез

1.1. Реакционный цикл теломеразы

Теломераза синтезирует длинные последовательности, состоящие из теломерных повторов, используя в качестве матрицы небольшой участок теломеразной РНК. Коровый фермент состоит из двух основных компонентов -теломеразной обратной транскриптазы и теломеразной РНК. Этих слагаемых достаточно для реконструкции теломеразной активности in vitro, тогда как in vivo требуется намного больше факторов для обеспечения работы фермента [7]. Теломераза представляет собой РНК-зависимую ДНК полимеразу, которая осуществляет реакцию обратной транскрипции по собственной РНК.

Каталитический цикл теломеразы включает две фазы: синтез единственного теломерного повтора с 3' конца теломеры и высвобождение матрицы из РНК-ДНК дуплекса для обеспечения возможности синтеза следующего повтора. Последовательный синтез множественных повторов по одной и той же матрице несвойственен обычным полимеразам и требует специализированного механизма для высвобождения матричного участка теломеразной РНК после каждого раунда репликации. Реакция инициируется связыванием 3' конца теломеры в 5' область матрицы с образованием гибридного короткого ДНК/РНК дуплекса, после чего происходит синтез одного теломерного повтора (Рис. 1.1). В случае теломеразы человека происходит обратная транскрипция шести нуклеотидов 5'-GGTTAG-3' [8]. По достижении конца матричного участка синтез нуклеотидов прекращается, а вновь синтезированная ДНК либо транслоцируется в начало матричного участка, либо диссоциирует от фермента. Транслокация представляет собой сложный мультистадийный процесс, точный механизм которого до сих пор неизвестен. Он включает несколько этапов: расплетение ДНК/РНК дуплекса, перемещение и отжиг ДНК в 5' область матрицы. Было показано, что транслокация матрицы происходит за пределами каталитического сайта теломеразы [9]. Присоединение нуклеотидов в рамках одного повтора происходит достаточно быстро, поэтому

скорость лимитирующим фактором является именно процесс транслокации [8Л0].

Теломера ХТмТГ 5' 3'-

тснт

сллисссллис1 ■ ш ■

СТТАЕ

тк

V6'

Синтез

* ♦ ♦ ♦ *

'СААиСССААис-111111

(ИГГЛВ^СТТАС

актнанын сайт

Транслокация

I

слдисс СААЦС 11111

СГТАС^ЙТТДК

I

Репозппио-ннрованне

матрицы

гааiiс с с аа1 *с ■

еТТ«ИбТТАВ

I

Разделение цепей

сла'.сссаат;с

щи

етТАОЗСГТА?

1

Рисунок 1,1. Модель реакционного цикла теломеразы человека [И]. После сборки активного теломеразнйго комплекса, который состоит из каталитически субъединицы теломеразы (ТЕКХ), -щломеразной РНК (ТЯ) и одноцепочечного 3" конца теломеры происходит добавление шести нуклеотидов по матричному участку теломеразной РПК. Освобождение матричного участка для нового акта синтеза происходит в несколько этапов и включает разделение ДНК/РНК гстсродуилекса. репозиционирование матрицы относительно вновь синтезированной ДНК и образование нового гетеродуллекса.

Способность синтезировать несколько повторов без диссоциации от матрицы называют процессивностью теломеразы. эффективность процесса обеспечивается многими факторами [12]. В составе каталитической субъединицы теломеразы содержится несколько Д11К - с вяз ы в а ю щ и х мотивов, которые обеспечивают удерживание теломеры вблизи фермента в процессе транслокации [13-15]. а также мотивы для связывания репозиционироваипого в процессе транслокации ДИК/РНК гибрида [16,17]. Мутации в этих мотивах влияют на процессивность теломеразы. Было показано, что в случае теломеразы

человека комплекс белков РОТ1/ТРР1 также является одним из факторов процессивности [18].

Функции теломеразной РНК не ограничиваются предоставлением матричного участка для синтеза теломерного повтора. Различные элементы сложной структуры молекулы участвуют в каталитической реакции присоединения нуклеотида, формируя каталитический центр фермента наравне с аминокислотами TERT и обуславливая тем самым эффективность добавления нуклеотидов в рамках одного повтора и возможность транслокации, обеспечивают ассоциацию различных белковых факторов и сборку комплекса, играют ключевую роль в процессах транспорта и регуляции теломеразы. Недавно появились факты, подтверждающие наличие у теломеразной РНК функций, не связанных с биогенезом теломеразного комплекса. Данный обзор литературы посвящен структуре и функциям теломеразной РНК, а также различным аспектам ее биогенеза.

1.2. Структура

Теломеразные РНК различных организмов очень сильно отличаются друг от друга по размеру, по нуклеотидной последовательности, по структуре. Так, длина теломеразных РНК реснитчатых простейших составляет от 147 до 205 нуклеотидов, в позвоночных - 312 - 559, в дрожжах - от 779 и достигает 2030 нуклеотидов [19,20]. Сравнительный и филогенетический анализ совместно со структурными исследованиями позволили представить модель вторичной структуры теломеразных РНК реснитчатых и позвоночных (Рис. 1.2 А, Б) [21,22]. Для дрожжевой теломеразной РНК задача оказалась более сложной ввиду большого размера молекулы и эволюционной подвижности теломеразной РНК дрожжей. В совокупности, исследования позволили выявить несколько элементов структуры высшего порядка, консервативных среди теломеразных РНК разных видов. Помимо матричного участка, по которому теломеразная каталитическая субъединица осуществляет синтез теломерной последовательности, все теломеразные РНК содержат элемент, ограничивающий матричный участок с 5' конца (5' template boundary element, или TBE). Также,

можно выделить протяженную петлю, которая включает матричный участок, предполагаемый псевдоузел и заканчивается спиралью [23]. В позвоночных эта структура составляет коровый домен и может быть комбинирована in trans с CR4/CR5 доменом и теломеразной обратной транскриптазой в системе реконструкции теломеразной активности. Считается, что шпилька IV реснитчатых и CR4/CR5 домен теломеразной РНК позвоночных несут одинаковую функцию. Образование псевдоузла и его важность для работы теломеразного комплекса была подтверждена структурными и функциональными исследованиями для теломеразной РНК позвоночных. В то же время, данные мутационного анализа по теломеразе реснитчатых указывают на то, что образование псевдоузла в теломеразной РНК необязательно для функционирования комплекса [24]. В модельной системе S. cerevisiae было показано, что участок, содержащий предполагаемый псевдоузел, связывает TERT. С другой стороны, для этого участка предложена альтернативная вторичная структура, которая включает 2 шпильки. Эти две модели не являются взаимно-исключающими и могут отражать молекулярное переключение структуры, необходимое для регуляции фермента [25]. Функционирование данного участка в качестве молекулярного переключателя между псевдоузлом и шпилькой было предположено и для теломеразной РНК человека на основании структурных исследований [26].

Теломеразная активность может быть реконструирована in vitro из транскрипта TER и рекомбинантной TERT для человека и Tetrahymena, однако до сих пор это не удалось для дрожжевой теломеразы, что значительно затрудняет анализ механизма комплекса и его структурно-функциональные исследования. Значительный шаг в области понимания архитектуры комплекса был сделан Томасом Чеком и сотрудниками, которые показали, что теломеразная активность может быть реконструирована в системе, содержащей Est2 (теломеразная каталитическая субъединица) и «минимальную теломеразную РНК» или мини-Т, которая содержит основные сайты взаимодействия с белками [27]. Создание мини-Т РНК основывалось на мутационном и делеционном анализе, который показал, что большая часть структуры теломеразной РНК дрожжей необязательна для функционирования

комплекса. Коровый домен TLC1 связывает Est2 и соединен спиралями с сайтами связывания Estl, Ku и Sm белков (Рис. 1.2 В). Длина наименьшей мини-Т, которая сохраняла функции теломеразной РНК, составляла 384 нуклеотида (исходная TLC1 содержит 1200 нуклеотидов). В отличие от теломеразы человека или простейших минимальная теломеразная РНК дрожжей, реконструированная in vitro с каталитической субъединицей, была непроцессивна. Нужно отметить, что подобное отсутствие процессивности наблюдается также в случае теломеразы S. cerevisiae дикого типа, выделенной из клеток.

На сегодняшний день не существует достоверной третичной структуры полноразмерной теломеразной РНК, а также теломеразной РНК или ее отдельных участков с белками теломеразного комплекса. Тем не менее, была решена структура ряда отдельных элементов теломеразной РНК, что позволило получить достаточно хорошее представление об архитектуре молекулы. Мы рассмотрим последовательно элементы структуры теломеразных РНК и современное представление об их функционировании. Неудивительно, что основной массив структурных данных относится к теломеразной РНК человека. Однако, данные исследований по филогенетическому сравнению теломеразных РНК, биохимические эксперименты и построение компьютерных моделей позволяют провести параллель со структурой теломеразных РНК других организмов, а также выявить новые закономерности в функционировании молекулы.

Рисунок 1.2. Общие элементы структуры высшего порядка для теломераэнъгх РНК различных организмов [22]. 11редсказания вторичной структуры представлены для теломеразных РНК а) реснитчатых б) позвоночных (Я sapiens) в) дрожжей (S. cerevisiae). Матричный участок. ТВН элемент и псевдоузел отмечены голубым, зеленым и синим цветом соответственно. Красным цветом отмечены мутации, вызывающие болезни. Элементы структуры, использованные при конструировании минм-Т РНК S. cerevisiae, обведены r серую рамку.

1.2.1. Псевдоузел

Псевдоузел, образованный элементами: Р2Ь-РЗ (Рис. 1.3 А), представляет самый консервативный элемент структуры теломеразных РНК. Было показано, что мутации двух нуклеотидов GC107/8 —> AG в шпильке РЗ, присутствующие у больных диске�