Функции теломеразного белка дрожжей Saccharomyces cerevisiae Est3 тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

005015271

На правах рукописи

Логвина Наталия Александровна

Функции теломеразного белка дрожжей Б а ссії а го тусез сегеуІБІае ЕьіЗ

02.00.10 - биоорганическая химия

1 2 м*Р2СМ2

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2012

005015271

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители доктор химических наук, профессор,

член-корр. РАН Донцова Ольга Анатольевна кандидат химических наук, Зверева Мэрия Эмильевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор,

член-корр. РАН Кочетков Сергей Николаевич кандидат химических наук, Головин Андрей Викторович

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии

имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, г.Москва

Защита состоится 20 марта 2012 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.40, МГУ, Лабораторный корпус «А», аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан 17 февраля 2012г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры - теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Недорепликация концов хромосом при каждом клеточном делении приводит к укорочению теломер, в результате которого клетка перестаёт делиться, входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, например в раковых, стволовых и эмбриональных клетках млекопитающих, а также в одноклеточных эукариотических организмах существует механизм поддержания стабильности длины теломер с помощью достраивания теломерных повторов ферментом теломеразой. Изучение работы и регуляции теломеразного комплекса вызывает большой интерес во всем мире, так как открывает возможности для лечения онкологических заболеваний путём восстановления контроля числа клеточных делений в раковых клетках. Работы по созданию противоопухолевых препаратов, ингибирующих теломеразную активность, в частности, за счёт стабилизации квадруплексов на теломерных повторах, ведутся уже много лет. Очевидно, что для дальнейшего развития этого направления необходимо детальное понимание механизма работы теломеразного комплекса in vivo.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, являясь одноклеточными эукариотами и одновременно одним из наиболее изученных организмов, в геном которого легко вносить необходимые изменения, представляют собой удобную модельную систему для изучения теломеразного комплекса. В теломеразный комплекс дрожжей входят 4 незаменимых in vivo компонента: теломеразная обратная транскриптаза Est2, теломеразная РНК tlcl и два регуляторных белка - Est3 и Estl. Est3 является наименее изученным компонентом теломеразного комплекса, его структура и функция остаются неизвестными. Только в последние несколько лет стали известны некоторые его биохимические свойства, в частности, взаимодействие Est3 с теломерными олигонуклеотидами, однако основная функция белка Est3 до сих пор не ясна. Основой для данной работы стала гипотеза о взаимодействии белка Est3 с ДНК-квадруплексами на концах теломер и необходимости этого взаимодействия для регуляции теломеразной активности в дрожжах.

На сегодняшний день известно несколько белков, входящих в теломеразный комплекс других организмов, и взаимодействующих с квадруплексами. Например, структурный гомолог Est3 - TEBPbeta простейших - в паре с TEBPalfa способствует их формированию in vivo. В то же время, другой структурный гомолог Est3 - ТРР1 человека - образует димер Potl/TPPl, который расплетает ДНК-квадруплексы и является фактором процессивности для теломеразы человека. Последние данные свидетельствуют, что для привлечения Est3 на теломеры необходимо взаимодействие с другим незаменимым in vivo белком теломеразного комплекса -Estl. Кроме того, недавно было показано, белок Estl способен формировать ДНК-

квадруплексы. Подтверждение предполагаемого взаимодействия Est3 с ДНК квадруплексами будет означать, что регуляция теломеразной активности за счёт формирования квадруплексов является консервативным механизмом.

Целью работы являлась проверка гипотезы о взаимодействии Est3 с ДНК-квадруплексами, поиск возможной роли этого взаимодействия в функционировании теломеразного комплекса дрожжей S. cerevisiae, и определение связи с ГТФазной активностью и димеризацией белка Est3 5. cerevisiae.

Научная новизна и практическая значимость работы. В данной работе впервые показано, что белок Est3 способен взаимодействовать с ДНК- и РНК-квадруплексами, образованными теломерными повторами. Получены и охарактеризованы белки Est3 S.cerevisiae с заменами аминокислотных остатков, подтверждающими важность взаимодействия белка Est3 с ДНК-квадруплексами для работы теломеразного комплекса in vivo. Показана специфичность взаимодействия с межмолекулярными квадруплексами, определены константы диссоциации с различными типами квадруплексов. Обнаружено, что в узнавании и связывании ДНК-квадруплексов белком Est3 важную роль играет не только структура квадруплекса, но и нуклеотидная последовательность между гуаниновыми трактами, образующими G-квартеты. Также определена связь между взаимодействием Est3 с ДНК-квадруплексами, ГТФазной активностью белка Est3 и его способностью димеризоваться.

Результаты данной работы в комплексе с анализом литературных данных указывают на то, что в дрожжах S.cerevisiae система Est3-Estl аналогична системе TEBPalfa-TEBP-beta О.nova. Таким образом, полученные в ходе работы результаты указывают на существование консервативного механизма регуляции теломеразной активности с помощью формирования ДНК-квадруплексов и проясняют некоторые аспекты работы теломеразного комплекса.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: 21st IUBMB and 12th FAOBMB International congress of Biochemistry and Molecular Biology (Шанхай, Китай, 2009), XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, 2009), Международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения» (Сыктывкар, Республика Коми, 2010), Первый симпозиум по химии высокомолекулярных соединений для наук о жизни и материаловедения (Новосибирск, Россия, 2010).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 73 рисунками и 12 таблицами. Библиографический указатель включает 297 процитированных работ.

Краткое содержание работы 1. Взаимодействие белка Est3 с ДНК.

Ранее нами были получены данные, свидетельствующие, что взаимодействие Est3 с теломерными рибо- и дезоксирибо-олигонуклеотидами улучшается в присутствии ионов К+ и сделано предположение, что основным субстратом является особая структура, образующаяся в этих условиях - G-квадруплекс. В клетке квадруплексы могут быть образованы, в частности, одноцепочечными выступающими З'-концами теломерной ДНК. Можно предположить, что в таком случае белок Est3, как незаменимый компонент теломеразного комплекса in vivo, будет взаимодействовать именно с ДНК-квадруплексами, образованными теломерными повторами. Однако предположение о взаимодействии Est3 с теломерной ДНК in vivo нуждается в проверке, что и стало первым этапом данной работы.

Наличие взаимодйствия Est3 с д г ^ g % ^ ^

теломерной ДНК in vivo было подтверждено ^ ^ ^

иммунопреципитацией хроматина с помощью поликлональных антител к белку

\ Л* ¿Я Б

t.....| | д

У'"'*1?

из

........

шт тит 500

т ~ 400

300

тт

■ ■

т»

Est3. Наличие выделенной ДНК теломер в

¡м д 400 400

иммунопреципитате проверяли ПЦР с ЗОО — 300

праймерами к теломерному повтору и к

участку гена Yal069, расположенному на api

хромосоме I и отстоящему на 350 рисунок 1. Теломерная ДНК выделяется

нуклеотидов от конца хромосомы. Для вместе с белком Est3 при

контроля чистоты эксперимента иммунопреципитации хроматина. А -

„ ПЦР теломер и контрольного гена BDH2 использовался ген BDH2, находящийся в _

" ^ до иммунопреципитации; Б - после

субтеломерной области той же хромосомы, хроматин- иммунопреципитации с Результат эксперимента представлен на помощью поликлональных антител к рисунке 1. Исходная ДНК до очистки за Est3 белку Est3.

содержит как ген BDH2, так и теломерную ДНК. После иммунопреципитации остаётся только сигнал теломерной ДНК, которая специфично выделяется за счёт взаимодействия с Est3. Таким образом, было подтверждено взаимодействие белка Est3 с теломерной ДНК in vivo. Однако остаётся вопрос, приводит ли нарушение взаимодействия Est3 с ДНК к нарушению работы теломеразного комплекса in vivo? Для ответа на этот вопрос необходимо выяснить, приводит ли нарушение этого взаимодействия к укорочению теломер и сенессенсу. Для этого был проведён анализ литературных данных и отобраны известные белки Est3 с заменами аминокислотных остатков, которые потенциально приводят к нарушению взаимодействия с теломерной ДНК. Подтверждение отсутствия взаимодействия этих белков с теломерной ДНК и одновременно нарушение механизма поддержания длины теломер в клетке является косвенным доказательством важности этой функции Est3 in vivo. Для отбора кандидатов использовались следующие критерии:

Сенессенс фенотип (примерно через 70 поколений после нарушения работы теломеразы клетки престают делиться и гибнут, этот фенотип вызывается, в частности, делецией гена est3).

Стабильность (белок не деградирует в дрожжах in vivo; не образует трудно разрушимых комплексов с шаперонами при экспрессии в E.coli, если есть соответствующие данные)

Укорочение теломер in vivo, не связанное с нарушением взаимодействия с теломеразным комплексом

Консервативность (не критичный, но учитываемый параметр)

Кроме того, были учтена нежелательность внесения замен в остатки L92-V93-E94 и предыдущие 9, так как соответствующие нуклеотидные последовательности содержат сайт сдвига рамки считывания и активатор экспрессии белка Est3. По результатам анализа 39 известных аминокислотных замен в белке Est3 S.cerevisiae и С.albicans были выбраны замены ArgllO на глутамин и Aspl64 на аланин. Кроме того, ранее нами была создана система для экспрессии в E.coli белка Est3 с заменой Asp86 на аланин (Рис.2).

Были созданы штаммы с заменой гена est3 дикого типа в геноме штамма W303a S.cerevisiae на гены est3, несущие соответствующие мутации. Промоторный участок гена Est3 был оставлен без изменений, однако перед ним был встроен селективный маркер His3MX6. Внесение необходимых и отсутствие нежелательных случайных мутаций было подтверждено сиквенированием всего соответствующего участка генома. Таким образом, были получены следующие штаммы: Est3:E3N3wt, в котором исходный участок генома был заменен на ген est3 дикого типа вместе с маркером H¡s3MX6; Est3:E3N3-R110E -Est3:E3N3wt, но в ген est3 внесена мутация R110E; Est3:E3N3-D164A - Est3:E3N3wt, но в ген est3 внесена замена D164A. Экспрессия белка Est3 дикого типа (Est3wt) и белков Est3R110E и Est3D164A в полученных штаммах подтверждена методом Вестерн-блоттинга.

Для подтверждения летальности внесённых мутаций проводилась проверка сенессенс фенотипа полученных штаммов дрожжей. Известно, что белок Est3 необходим для нормальной работы теломеразы in vivo и потеря его функции приводит к сенессенсу, который наступает примерно через 50 поколений после потери гена белка дикого типа. Мы проанализировали рост клеток в ряду поколений для следующих штаммов Est3:E3N3wt, Est3:E3N3-R110E, Est3:E3N3-D164A и в штамме дикого типа. На рис.ЗА показана чашка Петри с клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течение 30 поколений, т.е. до наступления сенессенса. Колонии клеток в последовательных разведениях выглядят одинаково для всех штаммов. На рис. ЗБ показана чашка Петри с

Рисунок 2. Модель белка Ез13. Показаны аминокислотные

остатки, выбранные для замены.

клетками, которые предварительно растили в жидкой среде в течение 70 поколений с того же момента, т.е. после наступления сенессенса. Видно, что колонии контрольного штамма Est3:E3N3wt, содержащего искусственно введённый ген Est3 дикого типа и маркер H¡s3MX6 похожи на колонии клеток штамма дикого типа, в отличие от колоний штаммов Est3:E3N3-R110E и Est3:E3N3-D164A, у которых наступает сенессенс. Это подтверждает, что изменение фенотипа связано с заменой аминокислотных остатков в белке, а не с возможным нарушением его окружения в геноме. Дальнейшее выращивание клеток штаммов Est3:E3N3-R110E и Est3:E3N3-D164A приводило к преодолению сенессенса и перерождению за счёт включения альтернативных механизмов поддержания длины теломер.

W303a

W303a Est3:E3N3wt W303a Est3:E3N3-R110E W303ct Est3:E3N3-D164A

Рисунок 3. Фенотип полученных штаммов, экспрессирующих Est3D164A и Est3R110E. Серия разбавлений равного количества клеток разных штаммов была высеяна на чашки Петри со средой YPD. А-до наступления сенессенса; Б - после наступления сенессенса.

Таким образом, дрожжи, в которых белок дикого типа заменён на белок Est3R110E или Est3D164A проявляют сенессенс фенотип, что подтверждает важность этих аминокислот для нормальной работы теломеразы in vivo.

2. Выделение и анализ биохимических свойств белков Est3 дикого типа, Est3R110E и Est3D164A

2.1. Экспрессия Est3wt, Est3R110E и Est3D164A в E.coli.

Следующим этапом данной работы являлось изучение взаимодействия белков Est3wt, и Est3R110E и Est3D164A с теломерной ДНК in vitro и подтверждение того, что именно ДНК-квадруплекс является субстратом белка Est3. Белки Est3 дикого типа, R110E и D164A были экспрессированы в клетках E.coli. Для Est3 использовали плазмиду pET30a-Tev_6His-S-EST3, в которой ген белка Est3 встроен в экспрессионный вектор рЕТЗОа (Novagen) так, чтобы на N-конце экспрессируемого белка находились два афинных тага: б-His таг и S-таг, отделённые от белка сайтом TEV-протеазы. Кроме того, с помощью внесения нуклеотидных замен были созданы две конструкции для экспрессии в E.coli белков Est3R110E и Est3D164A. Надо отметить, что в клетке существуют две формы белка Est3 - укороченная и полноразмерная. Последняя необходима для нормальной работы теломеразы in vivo и синтезируется с помощью запрограммированного сдвига рамки считывания.

М/ЗОЗос

W303a Est3:E3N3wt W303a Est3:E3N3-R110E W303a Est3:E3N3-D164A 30 поколений 70 поколений

Сайт сдвига рамки считывания в плазллиде pET30a-Tev_6H¡s-S-EST3 и полученных из неё pET30a-Tev_6His-S-EST3R110E и pET30a-Tev_6His-S-EST3D164A был изменён так, чтобы синтезировался только полноразмерный белок. Дополнительная очистка была проведена гель-фильтрацией (FPLC) на колонке Pharmacia Superdex 200 26/60 (см. рис.4). Выход очищенных белков составил 1,5 мг/л исходной клеточной культуры.

На протяжении уже многих лет в литературе обсуждается возможность работы теломеразы как димера или даже олигомера. Ранее для белка Est3 была показана способность димеризоваться in vitro и высказано предположение о важности этой способности для нормальной работы белка, а значит, и теломеразного комплекса в целом, in vivo. Кроме того, нами были показаны способность Est3 гидролизовать ГТФ и увеличение скорости гидролиза ГТФ в 2 раза в присутствии ионов Mg2+.

Таблица 1. Константы димеризации Est3 Для изучения возможной связи

между димеризацей белка Est3 и его ГТФазной активностью были определены константы

димеризации в присутствии и отсутствии ГТФ, ГДФ и Mg2+. В работе использован разработанный нами ранее метод детекции димеризации белка Est3 in vitro.

Из приведённых в табл.1 данных следует, что присутствие ГТФ и ГДФ не влияет на димеризацию белка, тогда как увеличение концентрации ионов магния от 0 до 5 мМ приводит к увеличению константы димеризации белка Est3 на два порядка. Это указывает на существование белка в этих условиях преимущественно в димерной форме. Отметим, что 5мМ - это близкая к существующей в клетке концентрация ионов магния, локальное изменение которой может быть стимулировано другими компонентами теломеразного комплекса, что будет приводить к конформационному изменению теломеразного комплекса за счет димеризации белка Est3. Дополнительное подтверждение влияния ионов магния на димеризацию Est3 было получено при анализе профилей гель-фильтрации белка Est3 в присутствии и отсутствие Mg2+ (рис.5). Присутствие ионов магния приводило к появлению дополнительного пика, соответствующего димеру Est3. Аналогичная картина была получена для белка Est3R110E, однако Est3D164A, подобно изученному ранее белку Est3D86A, практически не обладал способностью образовывать димеры не зависимо от присутствия магния.

Рисунок 4. Профиль гель-фильтрации белка Est3wt.

2.2. Димеризация белка Est3

Параметр Кофактор

- ГДФ ГТФ Mg2+

6,1±0,4 б,1±0,3 5,7+0,4 8,3±0,2

В то же время литературные данные о сохранении белком Est3D164A взаимодействия с теломеразным комплексом ¡n vivo позволяют считать, что хотя

О 4 8 12 16 0 4 8 12 16 0 4 8 12 16

Рисунок 5. Анализ димеризации белков Est3wt, Est3R110E и Est3D164A методом гель-фильтрации в отсутствие (вверху) и в присутствии (внизу) ионов магния.

данная замена нарушает его способность димеризоваться, белок все же остаётся стабильным и правильно свёрнутым.

2.3. ГТФазная активность белков Est3 дикого типа, R110E и D164A.

Нами было показано, что белок Est3 дикого типа является ГТФазой, а белок Est3 с заменой D86A не способен гидролизовать ГГФ (рис.б). Анализ ГТФазной активности белков Est3 R110E и D164A необходим, так как во-первых, наличие этой активности доказывает, что экспрессированные в E.coli белки с аминокислотными заменами правильно свёрнуты, а во-вторых, возможное отсутствие ГТФазной активности может являться причиной нарушения функции Est3 in vivo, которое, возможно, не имеет отношения к взаимодействию Est3 с ДНК. В данной работе была определена константа гидролиза ГГФ белком Est3R110E. К сожалению, определение константы для Est3D164A оказалось невозможным, так как в присутствии ГТФ белок быстро агрегировал и выпадал в осадок. Тем не менее, протекание гидролиза ГТФ с при концентрациях субстрата менее 50 мкМ (v0=0,07 мкМ/мин при с(ГТФ)=50мкМ) позволяет считать, что исходно Est3D164A обладает ГТФазной активностью, аналогичной белку дикого типа и указывает на то, что до агрегации белок находится в активном состоянии и данная аминокислотная замена не нарушает его структуру. Белок Est3R110E также гидролизует ГТФ, однако, его активность меньше, чем у белка дикого типа (рис.бА). Зависимость начальной скорости гидролиза от концентрации ГТФ как в случае белка дикого типа, так и в случае белков Est3R110E, Est3D86A является сигмоидальной и описывается уравнением Хилла.

О 4 8 12 16

О 4 8 12 16 0 4 8 12 16

Рисунок 6. Гидролиз ГТФ. А - Зависимость начальной скорости гидролиза от концентрации субстрата для Ез13086А и ИНОЕ. Б - линеаризация в кординатах Хилла зависимости скорости гидролиза ГТФ белком Ез13Я110Е от концентрации ГТФ.

Линеаризацией в координатах Хилла (рис.бБ) были определены кинетические параметры гидролиза ГТФ для Ез131Ш0Е (табл.2). Полученная константа гидролиза ГТФ белком Е513РШ.0Е в 4 раза больше таковой для Еб13 дикого типа и сравнима с константой гидролиза Ез13\дЛ: в отсутствие Мё2*.

Для Ез13 дикого типа независимо от присутствия ионов магния коэффициент Хилла указывает на возможную кооперативное^

связывания ГТФ с белком, в то время как для Е513Р110Е кооперативное^ мала либо отсутствует. Белок Е$13086А, который существует в растворе только в виде мономера, не обладает ГТФазной активностью. Таким образом, снижение ГТФазной активности для белков Ез131Ш0Е и Е$13086А коррелирует с уменьшением кооперативное™ гидролиза ГТФ этими белками. Это позволяет предположить, что димеризация белка важна для гидролиза ГТФ. Выше было показано, что присутствие ионов магния способствует димеризации белка Е513, однако из полученных данных следует, что роль магния этим не ограничивается, поскольку для белка дикого типа константа гидролиза в присутствии магния возрастает в четыре раза по сравнению с константой в отсутствие магния без изменения кооперативное™. Это согласуется с тем, что для многих известных ГТФаз ионы М§2+ входят в активный центр, координируют ГТФ и осуществляют стабилизацию переходного состояния.

Анализ последовательности белка Еб13 не выявил в нём всех консервативных мотивов, характерных для классических ГТФаз. Таким образом, Еб13 представляет собой ГТФазу нового класса. Недавно была обнаружена бактериальная

Таблица 2. Константы гидролиза ГТФ белками Е513иЛ и Е513(Ш0Е

Белок Коэффициент Хилла, И Утах, мкмоль/мин к, мкМ

1,8±0,5 0,09 28

ЕЯЗУЛ В отсутствие ме2+ 1,8+0,3 0,04 113

ЕБгЗКНОЕ 1Д±0Д 0,08 124

неклассическая ГТФаза Тогй. Как и в в этом белке отсутствуют классические ГТФазные мотивы (в частности, СХХХСКБ/Т отсутствует в обоих белках, ОХХб отсутствует в ТогО, однако можно предположить его наличие в Еб13 - О^СМВ^о). В случае Тогй ГТФазная активность проявляется только димерной формой белка. Вероятно, несимметричная димеризация позволяет создать новые связывающие центры на поверхности этого белка. Такую же важную роль для ГТФазной активности Еб13 может играть его способность к димеризации. Действительно, присутствие М§2+, значительно влияющего на димеризацию, не только четыре раза уменьшает константу гидролиза ГТФ для белка дикого типа, но и в два раза повышает \/та1<, что соответствует увеличению количества молекул белка в активной конформации. Это позволяет предположить, что не только координация ионов магния, но и димеризация может приводить к росту ГТФазной активности белка. Тот факт, что замена Аг§110 на глутаминовую кислоту снижает ГТФазную активность белка и уменьшает кооперативность связывания ГТФ по сравнению с белком дикого типа, также подтверждает наличие связи между димеризацией Ез13 и гидролизом ГТФ. То, что в отсутствие ГТФ Е513Я110Е способен образовывать димеры так же, как белок дикого типа, позволяет предположить, что эта замена влияет на связывание ГТФ с белком. В частности, замена положительно заряженного основания на отрицательно заряженную глутаминовую кислоту может приводить к электростатическому отталкиванию ГТФ. То, что данная замена вызывает укорочение теломер и сенессенс, подчёркивает важность ГТФазной активности белка ЕБгЗ для работы теломеразного комплекса.

3. Формирование ДНК-квадруплексов

Одним из предположений, являвшихся основой данной работы, являлась гипотеза о взаимодействии белка Еб13 с неканоническими ДНК и РНК-структурами, в частности, й-квадруплексами. В клетке ДНК-квадруплексы могут быть

образованы выступающими З'-теломерными концами хромосом и, соответственно, участвовать в регуляции теломеразной активности. В то же время, биологическая роль РНК-квадруплексов, образованных теломерными повторами, не ясна. V Поэтому в качестве объекта исследования были

Рисунок 7. б-квартет ° выбраны теломерные ДНК-квадруплексы.

Основными структурными элементами

квадруплексов являются С-квартеты, образованные четырьмя остатками гуанина за счёт неканонических водородных связей (рис.7). За счёт стэкинг-взаимодействия 0-квартеты в составе квадруплекса выстраиваются друг над другом, образуя «колонну» из четырёх спирально закрученных цепей НК. В качестве стабилизаторов структуры квадруплекса могут выступать ионы одно- и двухвалентных металлов, располагающиеся обычно между плоскостями б-квартетов. Наиболее распространёнными и изученными являются квадруплексы, образующиеся в присутствии и К+.

Ранее было показано, что взаимодействует с ДНК-олигонуклеотидом Д4 (aatctc(gggtgtgt)4) в присутствии 100 тМ К+, то есть в условиях вероятного образования ДНК-квадруплексов. Этот теломероподобный олигонуклеотид содержит 4 ввв участка и теоретически способен образовывать различные как меж- так и внутри-молекулярные квадруплексы. Поскольку было неизвестно, с каким именно из возможных ДНК-квадруплексов взаимодействует белок Б.сегеУ151ае, был проведён подбор условий для формирования различных структур ДНК. Для обозначения квадруплексов каждому квадруплексу присваивали число, соответствующее наиболее близкой по подвижности в нативном ПААГ полосе маркера. Таким образом, Д4-кв100 означает квадруплекс, образованный олигонуклеотидом Д4 и по подвижности наиболее близкий к 100 п.о. В дальнейшем в работе были использованы квадруплексы, образованные

олигонуклеотидами, содержащими один, четыре или шесть теломерных повторов (Рис.8). Несмотря на значительные отличия в составе полученных образцов, видно, что присутствие калия способствует формированию кв25, в то время как ионы 1\1Н4+ способствуют образованию смесей межмолекулярных квадруплексов. К сожалению, попытки выделить отдельные компоненты этой смеси элюированием из ПААГ не увенчались успехом из-за изменения равновесных условий и образования смесей, аналогичных исходным. Исключение составляли две относительно стабильные формы квадруплексов - квЮО и кв25. Нужно отметить, что при хранении при 25°С в воде или инкубации с ионами К+, квЮО переходил в кв25, который, исходя из полученных данных, является наиболее термодинамически выгодной формой для данного оли гону клеотида. По-видимому, в растворе существует неустойчивое равновесие промежуточных форм квадруплексов с низкой подвижностью в геле, предположительно межмолекулярных. Длительная инкубация приводит к устойчивому равновесию с образованием кв25. Спектрами кругового дихроизма (КД) подтверждено, что ДНК-структуры квЮО и кв25 являются параллельными ДНК-квадруплексами, причем квЮО предположительно является межмолекулярным, а кв25 внутримолекулярным.

Важной характеристикой в-квадруплексов является наличие характерных пиков в спектре КД.

NH4 К * М NH, К* К* NH, М М NHa К

Рисунок 8. ДНК-квадруплексы, образованные олигонуклеотидами Д1, Дб, Д4, (один, шесть и четыре теломерных повтора соответственно) и Р4 (рибо-олигонуклеотид с четырьмя теломерными повторами), и использованные в дальнейшей работе. Образцы получены различными способами: NH4 -упариванием досуха в 200 мМ ацетате аммония, К+ - упариванем досуха в 200 мМ хлориде калия.

На рис.9 приведены спектры КД для кв25 и квЮО. В обоих случаях присутствуют сильный максимум при 264 нм и минимум при 240 нм, характерные для параллельных квадруплексов.

Для доказательства того, что выделенная ДНК-структура

действительно является квадруплексом, был проведен ДМС-пробинг входящих в неё остатков гуанина. Можно видеть (рис.15, дорожки 1, 2), что в Рисунок 9. Спектры кругового дихроизма Денатурированном олигонуклеотиде Д4 квадруплексов Д4-кв100 и Д4-кв25. все остатки гуанина доступны для

метилирования. Однако в составе исследуемого квадруплекса гуанины, входящие в состав 63-трактов защищены, в то время как гуанины, входящие в TGTGT линкеры, остаются доступными для модификации. Это подтверждает образование G-квартетов из гуанинов, входящих в GGG-тракты, а также соответствует возможной структуре внутримолекулярного квадруплекса, в котором гуанины G3 участков входят в состав трёх G-квартетов, расположенных друг над другом, а TGTGT-линкеры образуют петли.

4. Взаимодействие белка Est3 с ДНК-квадруплексами in vitro.

4.1. Белок Est3 специфично узнает ДНК-квадруплексы.

В предшествующих исследованиях было показано, что Est3 связывает теломерные рибо- и дезоксирибо-олигонуклеотиды, содержащие теломерные повторы, а также разрушает ДНК/РНК гетеродуплексы. Было предположено, что субстратом является не одноцепочечная ДНК, а отличающаяся меньшей подвижностью в нативном акриламидном геле неизвестная ДНК-структура, появление которой связано с инкубацией олигонуклеотида с ионами калия. На основании этих данных была выдвинута гипотеза о взаимодействии белка Est3 с ДНК-квадруплексами. Для подтверждения этой гипотезы ранее были выделены ДНК квадруплексы квЮО, образованные олигонуклеотидами Д4 (четыре теломерных повтора) и Д6 (шесть повторов). Формирование квадруплексов было подтверждено спектрами кругового дихроизма. Выделенные квадруплексы были инкубированы с возрастающими количествами Est3 в присутствии 100 мМ KCI, образование комплекса было проанализировано неденатурирующим ПААГ. В случае обоих олигонуклеотидов наблюдалось появление дополнительных зон с меньшей подвижностью в геле, что предполагает связывание одной, двух и более молекул белка с квадруплексом (рис.10). То, что появление новых зон в «нативном» геле связано с образованием ДНК-белкового комплекса, а не формированием новых ДНК-структур, подтверждено обработкой SDS и протеиназой К (рис.ЮБ): в обоих случаях наблюдается исчезновение зон, появившихся при инкубации с Est3.

Таким образом, все эти зоны соответствуют ДНК-белковым комплексам с различным количеством молекул белка. Связывание нескольких молекул белка

Рисунок 10. Взаимодействие Ез13 с теломерными ДНК-квадруплексами. А. Взаимодействие выделенного ДНК-квадруплекса Д4 с возрастающими концентрациями Ез13. Б. Взаимодействие Ез13 с выделенным квадруплексом Дб. 1 - чистый квадруплекс, 2, 4, 5, с добавлением Ев13, 3-е добавлением ЕъХЮЯЬА, 4 с последующей обработкой 505, 5-е обработкой протеиназой К. Стрелками отмечены зоны, сответствующие ДНК-белковому комплексу.

может объясняться либо наличием в квадруплексе нескольких сайтов взаимодействия, либо связыванием Е513 в форме димера. Полученный ранее в нашей лаборатории белок Езг3086А не способен образовывать димеры. При его взаимодействии с квадруплексами образуется только один комплекс квадруплекс-белок (рис. 10Б), что позволяет предположить кооперативное

Анизотропия 0,12

0,09

0,06 0,03 0,00

10 12 С, мкМ

связывание ЕбТЗ в противоположность независимому связыванию нескольких молекул белка с несколькими возможными сайтами в структуре квадруплекса. Одновременно это означает, что димеризация белка не является необходимым условием взаимодействия. В то же время, при сравнении взаимодействия Д4 и Д6 (рис. 10) видно, что с увеличением

Рисунок 11. Специфичность взаимодействия числа повторов увеличивается Е^З с квадруплексом. Детекция методом количество комплексов с белком, т.е.,

анизотропии флуоресцинции. Доля квадруплекса, связанного с белком, определялась возрастанием анизотропии, которое соответствует возрастанию количества комплекса в растворе. Расчёт образование нескольких комплексов

вероятно, увеличивается количество сайтов взаимодействия. Таким образом, для квадруплекса Д6-кв100

констант диссоциации проводился аппроксимацией уравнением Хилла для кооперативного связывания. 1 - Д4

связано как с наличием нескольких сайтов взаимодействия с белком, так и с кооперативностью взаимодействия

квадруплекс, 2 - одноцепочечный Д4, з - ^ с квадруплексом. Специфичность нетеломерныи олигонуклеотид НС.

взаимодеиствия белка ЕвТЗ с квадруплексом по отношению к одноцепочечной ДНК была также проанализирована титрованием меченого флуоресцеином ДНК-квадруплекса квД4 с детекцией доли связанного с белком квадруплекса методом анизотропии флуоресценции (рис.11). Это позволило оценить константы диссоциации для Д4-квадруплекса (1,2+0,2 мкМ),

0.06-

0.04-

0.02-

0.00

одноцепоченчного Д4 (25+10 мкМ), и неспецифического одноцепочечного олигонуклеотида НС (>30 мкМ). Коэффициент Хилла (Ь) для квД4 равен 1,3, что подтверждает кооперативность связывания Еб13.

Полученные константы диссоциации являются кажущимися, так как реальная доля активного белка неизвестна. Тем не менее, значения этих констант позволяют сравнивать способность Еб13 взаимодействовать с различными субстратами. Все эксперименты по связыванию были воспроизведены с несколькими независимо выделенными образцами белка, и различие констант диссоциации в одних и тех же условиях для одинаковых образцов составляло не более 0,4 мкМ.

К сожалению, выделение чистого квадруплекса Д4-кв100 затруднено, т.к. в процессе элюции из геля образуется либо кв25, либо смесь ДНК-структур, 0 08 аналогичная исходной. Сильное

ви-ш* Кс1=1,2 И=1,з вшах=о,об отличие в составе смеси Д4кв в бь-к+ №6,9 11=1,1 Вшах=о,оз ацетате аммония и в хлориде калия

ч—г----* (рис.9) позволило сравнить

взаимодействие Еб13 с кв25 и с межмолекулярными квадруплексами —* (рис.12).

Из приведённых на рис.12 данных видно, что константы 20 диссоциации комплексов с Д4кв и Д4-с(Еэ13) дМ кв25 отличаются приблизительно в 6

Рисунок 12. Взаимодействие Ез13 с меж- и раз, а Втах - в три раза, что согласуется внутри- молекулярными квадруплексами. с отсутствием наблюдаемого Приведены кривые титрования квД4 и квД4-25 взаим0действия Е513 с кв25 при

белком £513 дикого типа. п л * ■- ■>

анализе в нативном ПААГ. Кроме того,

из-за сильного отличия в константах и особенностей метода измерения (аддитивность анизотропии флуоресценции), примесь этого квадруплекса не оказывает значительного влияния на измеряемую константу для Д4кв-1ЧН4+. Поэтому все эксперименты по определению кажущихся констант диссоциации были проведены со смесью ДНК структур, для краткости обозначаемой как квД4. Несмотря на неоднородность субстрата, полученные константы позволяют сравнивать стабильность различных комплексов.

Таким образом, Ез13 может специфично связывать в-квадруплексы. При этом образуются различные по составу комплексы, в том числе содержащие мономерную и димерную форму Ез13, на что указывает образование только одного комплекса не способным димеризоваться белком Ез13086А. В то же время увеличение длины квадруплекса приводит к увеличению количества комплексов (сравнение Д6 и Д4), что предполагает появление новых участков взаимодействия при увеличении числа в-трактов.

Для выяснения, приводит ли отсутствие взаимодействия с ДНК-

квадруплексом к нарушению работы теломеразы, а также подтверждения того, что

наблюдаемая активность не является результатом наличия в препарате белка микропримесей, были выбраны белки Est3 с заменами аминокислотных остатков R110E и D164A. Как уже было показано, эти замены затрагивают неизвестную жизненно-важную функцию белка Est3, возможно, взаимодействие с ДНК-квадруплексами.

Далее было изучено взаимодействие Est3R110E и D164A с ДНК-квадруплексами. На рис.13А приведены кривые титрования квД4 белком Est3 дикого типа, а также R110E и D164A, на рисДЗБ - линеаризация полученных кривых в координатах Хилла. Видно, что константы взаимодействия квД4 с белком относятся как 1:2:5 для Est3 wt:R110E:D164A. Одновременно изменяется кооперативность связывания белка с квадруплексом: значения коэффициента Хилла для Est3 и Est3R110E (равные 1,3 и 2, соответственно) предполагают связывание димеров Est3 с квадруплексом. В случае D164A связывается только мономер (h=0,9), что согласуется с неспособностью белка Est3D164A образовывать димеры.

В целом, изменение кажущейся константы взаимодействия для Est3D164A является довольно заметным и может приводить к нарушению функции Est3 ¡n vivo и проявлению сенессенс фенотипа. Наблюдаемое для Est3R110E увеличение константы гидролиза ГТФ в 4 раза по сравнению с белком дикого типа, вероятно, вызвано суммарным эффектом нарушения ГТФазной активности и ухудшения взаимодействия с теломерными квадруплексами. Это показывает важность обеих функций белка Est3 для работы теломеразного комплекса ¡n vivo.

Рисунок 13. А Нормированные кривые взаимодействия Est3 (круги), R110 (квадраты) и D164 (треугольники). За 1 принято значение Втах для каждой кривой. Б Линеаризация полученных кривых по Хиллу Для Est3 h=l,3, Kd=l,2; для est3R110E h=l,5, Kd=2,4; для Est3D164A h=l, Kd=5,8.

Тот факт, что константы взаимодействия для одноцепочечной ДНК и ДНК-квадруплекса отличаются более, чем на порядок, позволяет утверждать, что EstB взаимодействует именно с образованными теломерами квадруплексами. Последние данные свидетельствуют, что для привлечения Est3 на теломеры необходимо взаимодействие с другим незаменимым in vivo белком теломеразного

О 5 10 15 20 25 c(Est3), цМ

■ Est3R110E ' Est3D164A

1.5 lg c(Est3)

-1.5J

комплекса - Estl. Недавно было показано, что белок Estl способен формировать ДНК-квадруплексы. Полученные в этой работе результаты позволяют предполагать, что Est3 связывает и стабилизирует ДНК-квадруплексы, сформированные белком Estl. Таким образом, система Est3-Estl напоминает систему TEBPalfa-TEBP-beta Oxytríchia Nova, в которой для нормального формирования квадруплексов на концах теломер необходимы оба белка. Этот факт, как и наличие гомологов Est3, Estl и ТЕВР в других организмах, свидетельствует в пользу существования консервативного механизма регуляции теломеразной активности за счёт формирования ДНК-квадруплексов.

4.2. Узнавание ДНК-квадруплекса белком Est3 основано на взаимодействии с петлями в структуре квадруплекса.

Известно, что G-квадруплекс может взаимодействовать с белком как за счёт узнавания самого G-квартета, так и за счёт взаимодействия с петлями в структуре квадруплекса

c(Est3), цМ

Вшах 0.06003 h 1.308 Kd 1.217

10 15

c(Est3), цМ

0.00-}-1-1-1-!-1

0 5 10 15 20 25

С^З), цМ

Рисунок 14. Взаимодействие квадруплексов квД4, квД1 и квДб с Ез13 .

Например, в комплексах (ТЕВРа)2-ТЕВРр-квадруплекс, для которых структура была установлена методом РСА, ТЕВРа взаимодействует с квадруплексом тремя различными способами - в первом случае связывая дезоксирибозу гуанинов, входящих в б-квартеты, в двух других - взаимодействуя с петлёй ТТТТ. Причём в одном из последних необходимо взаимодействие с этой же петлёй белка ТЕВРр.Полученные нами данные позволяют предположить, что EstЗ так же может

взаимодействовать с петлёй в составе й-квадруплекса. Образование петель затруднено для квадруплексов, сформированных из олигонуклеотида с одним теломерным повтором - Д1 (ААТТСТ-ббСТОТОТ). Были измерены константы взаимодействия с квадруплексами, образованными различными по длине олигонуклеотидами Д1, Д4 и Дб, содержащими 1, 4 и 6 теломерных повторов соответственно (рис.9). Поскольку реальная кооперативность не может быть меньше,чем коэффициент Хилла, можно предположить, что с Д1 связывается только мономер Е513, в то время как с Д4 взаимодействуют и мономерная и

димерная формы белка. Олигонуклеотид Д6 образует аналогичный набор ДНК-квадруплексов, однако они отличаются меньшей подвижностью в нативном геле. Вероятно, в этом случае увеличение кооперативное™ связано с увеличением числа участков взаимодействия за счёт большей длины олигонуклеотида. Однако в случае квД1 подвижность квадруплексов полностью совпадает с подвижностью квадруплексов, образованных

олигонуклеотидом Д4. Отличие

кооперативности для Д1 и Д4 может быть объяснено, если предположить, что Е513 взаимодействует как с в-квартетами, так и с ТСТОТ-петлёй. В таком случае, в отсутствие хорошо сформированных петель в квД1 взаимодействие будет происходить только с й-квартетом, и, соответственно, будет образовываться только комплекс с мономером

Для подтверждения того, что Е513 взаимодействует именно с квадруплексом, был проведён ДМС-пробинг выделенного Д4-кв100 и его комплекса с Еб13 (рис.15). Появление защит у остатков гуанина в вСС-трактах (сравнение дорожек 1 и 2, выделено пунктирными стрелками) подтверждает, что исследуемый объект является

Ж-

5'-ААТСТС-(еССТСТЙТ)4-3'

Рисунок 15. Остатки тимина в петле 6-квадруплекса участвуют во

взаимодействии с белком Е^З. Радиоавтограф ДМС-пробинга

выделенного денатурированного Д4 (дорожка 1), Д4-кв100 (2) и комплекса квЮО с белкоми Е513 (3). Слева пунктирными стрелками показаны защищённые из-за образования 6-квартета гуанины, справа сплошными -появляющиеся в присутствии ЕзгЗ модификации тиминов. Ниже приведена последовательность

олигонуклеотида с выделенными нуклеотидами, доступность которых для модификации изменяется при

образовании комплекса. _<-

квадруплексом. Образование комплекса с

Е$13 приводит к неожиданному эффекту - появлению дополнительных сигналов, соответствующих тиминам в ТвТСТ-петле ДНК квадруплекса. ДМС в условиях данного эксперимента не должен взаимодействовать с остатками тимина. Однако при щелочных значениях рН атом N3 тимина может быть модифицирован ДМС. Появление такого сильного сигнала свидетельствует, что взаимодействие с Еб13

изменяет локальное окружение остатков тимина, стимулируя либо их модификацию диметилсульфатом, либо разрыв цепи при последующей обработке пиперидином, вызванный возникновением сильного напряжения в этом месте ДНК-цепи.

Остаток гуанина, расположенный между реакционноспособными тиминами, также участвует во взаимодействии с Est3 - в этом случае наблюдается защита от модификации. В петле TGTGT два гуанина, из которых доступность первого (в направлении от 5' к 3') для модификации практически не изменяется при образовании комплекса с Est3. Отношение интенсивностей сигналов второго гуанина к первому изменяется от 1:1 до 0,5:1 при образовании комплекса с Est3, т.е. реакционная доступность второго гуанина уменьшается в два раза за счёт взаимодействия с белком.

Таким образом, как и в случае TEBPbeta, узнавание белком квадруплекса, образованного теломерными повторами, происходит не только за счёт взаимодействия с G-квартетом, но и за счёт изменения структуры петли квадруплекса.

4.3. Влияние ГТФазной активности на взаимодействие Est3 с ДНК-квадруплексами.

Важным аспектом регуляции взаимодействия Est3 с ДНК-квадруплексами является возможная зависимость этого взаимодействия от гидролиза ГТФ. Действительно, так как Est3 обладает ГТФазной активностью и, более того, присутствие ГТФ стимулирует расплетание ДНК/РНК-гетеродуплексов, логично предположить, что ГТФазная активность влияет и на взаимодействие с квадруплексами. В частности, гидролиз ГТФ может быть необходим для регуляции связывания Est3 с теломерным концом, и, следовательно, работы теломеразного комплекса in vivo.

с(ЕєІЗ), цМ

Рисунок 16. Влияние ГТФазной активности на взаимодействие ЕзІЗ с ДНК-квадруплексами. А - «нативный» ПААГ комплексов Д4 квЮО - белок в присутствии ГТФ (2), ГДФ (3) и негидролизуемого аналога ГТФ (4), чистый квД4 - дорожкаї, + и - наличие или отвутствие обработки протеиназой К. Б - Кривые связывания ЕбіЗ с Д4-квадруплексом в присутствии ГДФ и негидролизуемого аналога ГТФ.

Анализ комплексов белка с квадруплексом в неденатурирующем ПААГ подтверждает это предположение. На рис. 16А видно, что количество образовавшегося комплекса отличается в присутствии ГТФ и его негидролизуемого аналога и в присутствии ГДФ.

1 2 3 4 5 6 7 8 9

-

^-->. . ®

Ф"

Рисунок 17. Остатки тимина в петле в-квадруплекса участвуют во взаимодействии с белком Е513. ДМС-пробинг выделенного Д4-кв100 (дорожки 1 и 5), комплексов квЮО с белками Еб13 (2-4) и Еб13086А (6-8), и денатурированного Д4 (9). Сплошными стрелками показаны появляющиеся в присутствии Ез13 модификации тиминов, прерывистыми - защита атома гуанина при образовании комплекса. В дорожках 3 и 7 в качестве кофактора выступал ГТФ, в дорожках 4 и 8 - ГДФ.

ДМС-пробинг комплексов квадруплекс-Е$13 с негидролизуемым аналогом ГТФ (6МР-РЫР) и ГДФ выявил отличие во взаимодействии ЕэгЗ с петлёй квадруплекса в присутствии ГДФ и негидролизуемого аналога. Паттерн модификации комплекса Е513-квЮ0-ГТФ такой же, как и в случае Ез13-кв100, в то время как для Ез13-кв100-ГДФ отсутствуют характерные сигналы модификации тиминов, что свидетельствует об изменении локального окружения этих остатков в комплексе в результате гидролиза ГТФ. При этом защита гуанина, расположенного между этими тиминами, сохраняется, и паттерн модификации в присутствии ГДФ не является идентичным паттерну чистого квадруплекса и косвенно подтверждает образование комплекса в этих условиях. Нужно подчеркнуть, что паттерн модификации комплекса квЮО с белком Е$13086А не зависит от присутствия ГТФ либо ГДФ. Напомним, что замена 086А приводит к практически полной потере ГТФазной активности белком Можно предполагать, что конформационная

перестройка в белке, необходимая для гидролиза ГТФ не может произойти в случае замены аспарагина 86 на аланин и, следовательно, не изменяется взаимодействие белка с тиминами в петле ТСТбТ. Также возможно, что белок Е513086А не связывает ГДФ, и комплекс кв100-Е$13086А-ГДФ не образуется, а наблюдаемый паттерн соответствует наличию комплекса кв100-Е513086А.

Стабильность комплексов в «нативном» геле может отличаться от стабильности в равновесных условиях, поэтому константы связывания Еб13 с Д4-квадруплексом (рис.16 Б) были определены титрованием в присутствии ГДФ и негидролизуемого аналога ГТФ, взятого вместо ГТФ, так как гидролиз ПГФ белком в процессе эксперимента мог серьёзно повлиять на измеряемое значение константы.

Как оказалось, гидролиз ГГФ слабо влияет на образование комплекса Ез13-квадруплекс, так как константы диссоциации в присутствии ГДФ и негидролизуемого аналога ГТФ в качестве кофакторов отличались менее чем в 2 раза. Коэффициент Хилла при переходе от аналога ГТФ к ГДФ изменялся от 1,16+0,06 до 1,5+0,07, что может отражать преимущественное связывание димера Еб13 в присутствии ГДФ. Это предположение подтверждается изменением соотношения интенсивностей полос, соответствующих комплексу квадруплекс-мономер и комплексу квадруплекс-мультимер на рис. 16Б (Ез13+ГТФ и Е513+ГДФ, верхняя и нижняя стрелки). Однако такое изменение кооперативное™ может быть связано с влиянием димеризации Еб13 на ГТФазную активность и не иметь отношения к взаимодействию белка с ДНК-квадруплексом.

Эффективность связывания квадруплексов с белком можно оценить по интегральному показателю Е, количественно характеризующему величину связывания лиганда при его концентрации, равной Кс1.

Е = Втах/2Кс)

Для количественной оценки влияния ГТФ на основные параметры взаимодействия белка с квадруплексом (Ка или Втах) были рассчитаны их константы ингибирования и активации (табл.З). Показатели 1С5о(К<)) и 1С5о(Втах) соответствуют концентрации вещества, снижающей активность (повышение Кй) или количество активных центров (понижение Втах) в 2 раза. Величина )С50(КС], Втах) показывает теоретическую концентрацию кофактора, снижающую связывание квадруплекса в 2 раза при его концентрации, равной К^

Таблица 3. Влияние ГДФ и негидролизуемого аналога ГТФ на связывание квадруплексов

белком Е$13.

К^, мкМ . Н Втах Е 1С50(Ка), мМ 1С50(Вт„), мМ 1С50(К„ Втах), мМ

Е$43 1,2±0Д 1,3+0,05 0,10±0,02 0,046 - - -

Е513+ГДФ 0,9±0,1 1,5+0,07 0,07±0,01 0,039 - 11,7 11,7

ЕяЗ+анэлог ГТФ 1,5±0,1 1Д6±0,04 0,10+0,02 0,033 13,7 - 13,7

Из представленных данных видно, что ГДФ и негидролизуемый аналог ГТФ незначительно влияют на эффективность связывания Еб13 с белком, причём эффект от ГДФ обусловлен в первую очередь снижением количества активных центров, а эффект негидролизуемого аналога ГТФ - изменением константы взаимодействия. Исходя из данных ДМС-пробинга, негидролизуемый аналог ГТФ способствует переходу Ез13 в более напряжённую конформацию, тем самым снижая стабильность комплекса с квадруплексом. Эти выводы согласуются со снижением в

2 раза скорости гидролиза ГТФ Д4-квадруплексом и уменьшением количества образующегося комплекса в присутствии ГДФ, зафиксированном в неденатурирующем ПААГ. В целом, очевидно, что гидролиз ГТФ не участвует в регуляции взаимодействия Еб13 с ДНК-квадруплексами и, вероятно, выполняет другую регуляторную функцию в клетке. Такой функцией может быть, например, изменение конформации белка, необходимое для его взаимодействия с другими компонентами теломеразного комплекса.

4.4. Взаимодействие белка EstЗ с РНК-квадруплексом.

Рисунок 18. Взаимодействие белков Est3 и Est3D164A с Р4-квадруплексом.

В начале данной работы мы предположили, что взаимодействие Est3 с теломероподобными ДНК-олигонуклеотидами более важно, чем взаимодействие с аналогичными РНК-олигонуклеотидами, так как его предполагаемая роль в клетке очевидна - привлечение теломеразы к теломерам и подготовка одноцепочечных G-богатых концов для удлинения. Однако недавно, сначала в клетках человека, а затем и в дрожжах, была обнаружена Терра - РНК, состоящая из теломерных повторов, ассоциированная с теломерами и выполняющая неизвестную пока функцию в регуляции удлинения теломер теломеразой.

Нами был получен квадруплекс, образованный Р4 олигонуклеотидом. Установлено, что константы диссоциации для комплекса этого квадруплекса с белком Est3 и Est3D164 отличаются в 10 раз (рис.19). Константы взаимодействия ДНК-квадруплекса с этими белками отличаются не более, чем в шесть раз, что позволяет предположить, что именно взаимодействие с РНК является основным для Est3 и является причиной est фенотипа. Более того, способность Est3 димеризоваться и взаимодействовать и с ДНК и с РНК квадруплексами, а также ассоциированность Терры с теломерами позволяет выдвинуть гипотезу, что in vivo Est3 взаимодействует одновременно с Террой и теломерами, образующими квадруплексы. Однако для проверки этой гипотезы требуется проведение отдельных исследований.

Выводы

1. Белок Est3 специфично взаимодействует с ДНК- и РНК-квадруплексами in vitro.

2. Узнавание различных квадруплексов белком Est3 основано на взаимодействии с петлёй в составе ДНК-квадруплекса.

3. ДНК-квадруплекс ингибирует гидролиз ГТФ белком Est3.

4. ГТФазная активность белка Est3 коррелирует с димеризацией молекул белка.

5. Димеризация белка Est3 стимулируется присутствием ионов магния.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Малявко, А. Н., Логвина, Н. А., Зверева, М. Э., and Донцова, О. А. (2010) Димеризация in vitro теломеразного белка Est3p стимулируется ионами магния, Доклады Академии Наук 433,1-3.

2. Shubernetskaya, О., Logvina, N., Sharanov, Y., and Zvereva, M. (2011) Yeast telomerase protein Est3 is a novel type of GTPase, Biochimie 93, 202-206.

3. Logvina, N. A., Zvereva, M. I., Shubernetskaya, O. S., Sharanov, Y. S., Rhodes, D., and Dontsova, O. A. (2009) Yeast telomerase protein Est3 recognizes G-quadruplexes in GTP-dependent manner, 21st IUBMB and 12th FAOBMB International congress of Biochemistry and Molecular Biology, p 121, Shanghai, China.

4. Логвина, H. A. (2009) Изучение взаимодействия теломеразного компонента дрожжей Saccharomyces cerevisiae белка Est3 с G-квадруплексами, XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "ЛОМОНОСОВ-2009", Макс Пресс, Москва, Российская Федерация.

5. Зверева, М. Э., Логвина, Н. А., Шубернецкая, О. С., Смекалова, Е. М., Скворцов, Д. А., Рубцова, М. П., and Донцова, О. А. (2010) Особенности функционирования теломеразного комплекса, Международная конференция «Генетика продолжительности жизни и старения», р 8, Сыктывкар, Республика Коми.

6. Зверева, М. Э., Щербакова, Д. М., Логвина, Н. А., Смекалова, Е. М., Шубернецкая, О. А., Аджибек, Д. М., Скворцов, Д. А., Рубцова, М. П., and Донцова, О. А. (2010) Регуляция активности теломеразы, Первый симпозиум по химии высокомолекулярных соединений для наук о жизни и материаловедения, р 16, Новосибирск, Россия.

Заказ № 74-а /02/2012 Подписано в печать 15.02.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-mail:zak@cfr.ru

61 12-2/281

Московский Государственный Университет имени М. В. Ломоносова

Химический факультет

Логвина Наталия Александровна

Функции теломеразного белка дрожжей БасскаготусеБ сегеу1$1ае Е513

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

02.00.10 - Биоорганическая химия

Научные руководители:

д. х. н, профессор, член-корр. РАН. Донцова O.A.

к. х. н. доцент Зверева М.Э.

Москва-2012

Содержание

Список сокращений...........................................................................................................4

1. Введение.........................................................................................................................5

2. Обзор Литературы. Взаимодействие белков с в-квадруплексами...........................7

2.1. в-квадруплексы......................................................................................................7

2.2. Белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами.......................................10

2.3. Теломерные и теломер-ассоциированные белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами..................................................................................................15

2.3.1. Белки ТЕВР и их структурные гомологи.......................................................15

2.3.2. Репликативный белок А ^РА).......................................................................37

2.3.3. Белки, взаимодействующие с двухцепочечной теломерной ДНК - Иар1 и ТКР2............................................................................................................................41

2.3.4. Белки комплекса М1*Х...................................................................................45

2.3.5. Хеликазы.........................................................................................................46

2.3.6. Белок ЕбП.......................................................................................................55

2.4. Заключение...........................................................................................................57

3. Результаты и обсуждение...........................................................................................61

3.1. Получение и характеристика белков Еб13 и дикого типа и несущих замены аминокслотных остатков............................................................................................63

3.1.1. Выбор и получение генов белков Еб13 с заменами аминокислотных остатков, потенциально приводящими к нарушению взаимодействия с теломерной ДНК.......................................................................................................63

3.1.2. Выделение и анализ биохимических свойств белков Еб13 дикого типа, Ез131Ш0Е и Еб130164А.............................................................................................69

3.2. Формирование ДНК-квадруплексов...................................................................76

3.3. Взаимодействие белка Еб13 с ДНК-квадруплексами........................................82

3.3.1. Белок Ез13 специфично узнает ДНК-квадруплексы....................................82

3.3.2. Узнавание ДНК-квадруплекса белком EstЗ основано на взаимодействии

с петлями в структуре квадруплекса.......................................................................85

3.3.3. Влияние ГТФазной активности на взаимодействие Ез13 с ДНК-квадруплексами........................................................................................................88

3.4. Взаимодействие белка Еб13 с теломерной ДНК................................................91

3.5. Взаимодействие белка Еб13 с РНК-квадруплексом..................................94

3.6. Заключение...........................................................................................................94

4. Материалы и методы..................................................................................................96

4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы,................................................96

4.2. Методики, использованные в работе................................................................99

4.2.1. Клонирование................................................................................................99

4.2.3. Выделение белка Ез13.................................................................................103

4.2.3. Измерение ГТФазной активности белков Еб13 дикого типа и Еб13 с заменами РШОЕ и 0164А.......................................................................................106

4.2.4. Измерение констант димеризации белка Еб13.........................................107

4.2.5. Методы работы с ДНК-квадруплексами....................................................108

4.2.6. Методы изучения взаимодействия Еб13 с квадруплексами....................110

4.2.7. Создание штаммов Е513:ЕЗЫЗ\л/1, Ез13:ЕЗЫЗ-т0Е, Ез13:ЕЗЫЗ-0164А ....113

4.2.8. Иммунопреципитация хроматина..............................................................115

5. Выводы........................................................................................................................117

6. Список использованной литературы........................................................................118

Список сокращений

DBD - DNA-binding domain (ДНК-связывающий домен) FRET - флоуресцентный резонансный перенос энергии GMPPNP - гуанозин-5'-(3, у-имидо)трифосфат O.nova (S.nova) - Oxytricha nova (Sterkiella nova) P¡ - фосфат-ион

S.cerevisiae - Saccharomyces cerevisiae

S.lemnae - Stylonychia lemnae

SDS - додецилсульфат натрия

ТЕВР - telomere end-binding rotein

TERRA-telomerase repeat RNA, hTERRA=(UAAGGG)n

Tris - трис(гидроксиметил)аминометан

БСА - бычий сывороточный альбумин

ГДФ - гуанозиндифосфат

ГМФ - гуанозинмонофосфат

ГТФ - гуанозинтрифосфат

Да, кДа -дальтон, килодальтон

ДМС - диметилсульфат

ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - 1,4-дитио-01_-треитол

ИПТГ - изопропил-1-тио-3-0-галактопиранозид

н.о. - нуклеотидных остатков

п.н. - пары нуклеотидов

п.о. - пар оснований

п.о. - пары оснований

ПААГ-полиакриламидный гель

ПААГ-полиакриламидный гель

ПМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

ТЕМЕД - 1\1,М,1\1',1М'-тетраметилэтилендиамид

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат натрия

ЭМ - электронная микроскопия

1. Введение

На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры - теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Недорепликация концов хромосом при каждом клеточном делении приводит к укорочению теломер, в результате которого клетка перестаёт делиться, входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, например в раковых, стволовых и эмбриональных клетках млекопитающих, а также в одноклеточных эукариотических организмах существует механизм поддержания стабильности длины теломер с помощью достраивания теломерных повторов ферментом теломеразой. Изучение работы и регуляции теломеразного комплекса вызывает большой интерес во всем мире, так как открывает возможности для лечения онкологических заболеваний путём восстановления контроля числа клеточных делений в раковых клетках. Работы по созданию противоопухолевых препаратов, ингибирующих теломеразную активность, в частности, за счёт стабилизации квадруплексов на теломерных повторах, ведутся уже много лет. Очевидно, что для дальнейшего развития этого направления необходимо детальное понимание не только механизма работы теломеразного комплекса, но и особенностей взаимодействия теломерных квадруплексов с теломеразой как in vivo, так и in vitro.

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, являясь одноклеточными эукариотами и одновременно одним из наиболее изученных организмов, в геном которого легко вносить необходимые изменения, представляют собой удобную модельную систему для изучения теломеразного комплекса. В теломеразный комплекс дрожжей входят 4 незаменимых in vivo компонента: теломеразная обратная транскриптаза Est2, теломеразная РНК tlcl и два регуляторных белка - Est3 и Estl. Est3 является наименее изученным компонентом теломеразного комплекса, его структура и функция остаются неизвестными. Только в последние несколько лет стали известны некоторые его биохимические свойства, в частности, ГТФазная активность и способность к димеризации, взаимодействие Est3 с теломерными олигонуклеотидами, однако основная функция белка Est3 до сих пор не ясна.

Основой для данной работы стала гипотеза о взаимодействии белка Est3 с ДНК-квадруплексами на концах теломер и необходимости этого взаимодействия для

регуляции теломеразной активности в дрожжах. На сегодняшний день известно несколько белков, входящих в теломеразный комплекс других организмов, и взаимодействующих с квадруплексами. Например, структурный гомолог Est3 - ТЕВР(3 простейших - в паре с ТЕВРа способствует формированию G-квадруплексов in vivo. В то же время, другой структурный гомолог Est3 - ТРР1 человека - образует димер Potl/TPPl, который расплетает ДНК-квадруплексы и является фактором процессивности для теломеразы человека. Последние данные свидетельствуют, что для привлечения Est3 на теломеры необходимо взаимодействие с другим незаменимым /л vivo белком теломеразного комплекса - Estl. Кроме того, недавно было показано, белок Estl способен формировать ДНК-квадруплексы. Подтверждение предполагаемого взаимодействия Est3 с ДНК квадруплексами будет означать, что регуляция теломеразной активности за счёт формирования квадруплексов является консервативным механизмом.

Целью работы являлась проверка гипотезы о взаимодействии Est3 с ДНК-квадруплексами, поиск возможной роли этого взаимодействия в функционировании теломеразного комплекса дрожжей 5. cerevisiae, и определение связи с ГТФазной активностью и димеризацией белка Est3 S.cerevisiae.

2. Обзор Литературы. Взаимодействие белков с G-квадруплексами

2,1. G-квадруплексы.

Канонической формой ДНК считается В-форма, открытая Дж. Уотсоном и Ф. Криком в 1953 году и являющаяся основной формой ДНК in vivo [1]. За прошедшее время собрано множество доказательств существования как in vitro, так и in vivo других форм ДНК, например двухспиральных А- и Z- форм, трёхспиральной триплексной ДНК и ДНК-квадруплексов, образованных сразу четырьмя цепями нуклеиновых кислот. Такое разнообразие вторичных структур ДНК может существенно влиять на ключевые для клетки процессы репликации, транскрипции и рекомбинации [2].

Ещё в 1960 году было обнаружено, что ГМФ может при условиях, близких к физиологическим, образовывать in vitro агрегаты, содержащие G-квартеты {Рисунок 1 А, Б}. Это открытие было по-настоящему оценено только в 80-х годах, когда появились свидетельства того, что гуанин-богатые фрагменты ДНК могут образовывать G-квадруплексы. Это четырёх-цепочечные ДНК-спирали, в которых перпендикулярно оси спирали располагаются плоскости G-квартетов, стабилизированные стэкинг-взаимодействиями и расположенными между плоскостями ионами одновалентных металлов (Рисунок 1В).

А н в Б В

ОСЬ G К9ЙДруПЛ:6КСП

Рисунок 1. А и Б - 6-квартет, В - кристаллическая структура олигонуклеотида с)(А660(ТТД6С6)3) [3].

Одним из любопытных примеров образования 6-квартетов является существование таких структур в клетках гуаноцитах, найденных у некоторых пауков. Эти клетки наполнены кристаллическими пластинами гуанина (Рисунок 2}. Если такого паука потревожить, он может практически мгновенно изменить свой цвет, убрав гуаноциты с поверхности тела.

Также, некоторые глубоководные рыбы используют кристаллы гуанина как фоторецепторы [3].

Рисунок 2. Образцы кристаллов гуанина паука Tetragnatha polychromata; размер пластин приблизительно 4x2 piVS. А - вид сверху, Б-вид сбоку [3, 4].

Имеются свидетельства существования квадруплексов in vivo и в менее экзотических ситуациях. Распределение квадруплекс-формирующих последовательностей ДНК в геноме неравномерно, наибольшая плотность наблюдается в таких биологически важных участках геномов как теломеры, промоторы различных генов и участки, подверженные частой рекомбинации. Кроме того, на сегодняшний день уже известно множество белков, взаимодействующих с ДНК-квадруплексами, 8 том числе способных формировать квадруплексы, либо, наоборот, разрушать эту вторичную структуру. Более того, существуют нуклеазы, специфично разрезающие ДНК внутри или около квадруплексов. Такое разнообразие и количество белков, взаимодействующих с ДНК-квадруплексами, поддерживает предположение об их существовании и биологической роли in vivo. [3]

Есть свидетельства того, что G-квадруплексы участвуют в регуляции транскрипции генов c-myc, Insulin, Rb, KRAS, MCK, sMtCK, a7 integrin, VEGF, HIF-la, c-kit, Bcl-2, p globin [510]. Кроме того, квадруплексы могут способствовать рекомбинации, ассоциации гомологических хроматид в мейозе и экспансии G-богатых нуклеотидных локусов в геноме. В отсутствие хеликаз, расплетающих квадруплексы, такие локусы могут останавливать репликацию, блокируя ДНК-полимеразу, что приводит к возникновению таких заболеваний как Синдром бернера. Также G-квадруплексы участвуют в переключении образования различных классов антител с помощью рекомбинации, в упаковке вирусов, в частности, HIV-1, регуляции длины теломер и защите теломерами хромосом от деградации и слияния [2].

Теломеры представляют собой особые ДНК-белковые структуры на концах линейных хромосом в эукариотах. Теломерная ДНК содержит как двухцепочечный, так и З'-выступающий одноцепочечный участки, с которыми взаимодействуют различные компоненты теломеразного комплекса. Выступающий конец теломерной ДНК способен образовывать квадруплексы. Последовательности теломерных повторов во всех организмах, от простейших (TTTTGGGG в О.nova и S.lemnae) до человека (TAAGGG), и даже нерегулярные теломерные повторы дрожжей (G2-3T1-6 в S.cerevisiae) предрасположены к образованию in vitro шпилек и G-квадруплексов.

Известно, что образование ДНК-квадруплексов блокирует удлинение теломерных праймеров теломеразой [11]. Позднее было показано, что теломеразы из Tetrahymena и Euplotes не удлиняют внутримолекулярные квадруплексы, но могут использовать в качестве субстрата межмолекулярные параллельные теломерные G-квадрулпексы [12, 13]. Стабилизация теломерных квадруплексов человека низкомолекулярными соединениями приводит к ингибированию теломеразной активности in vitro и блокированию удлинения теломер в раковых клетках in vivo. Многие низкомолекулярные соединения, стабилизирующие квадруплексы, тестировались как антираковые препараты, и работы в этом направлении остаются актуальными и сегодня [2].

Всё вышеописанное указывает на потенциальную важность ДНК-квадруплексов для защиты теломер и регуляции их удлинения. Однако долгое время существование теломерных квадруплексов in vivo оставалось недоказанным. В 2001 году была опубликована статья Christiane Schaffitzel и др. [14], в которой было показано существование G-квадруплексов in vivo в макронуклеусе. Клетки реснитчатых инфузорий, таких как Oxytricha, Euplotes, и Stylonychia, имеют два различных по морфологии и функциям ядра. В диплоидном микронуклеусе ДНК организована также, как и в других эукариотах. При половом размножении из микронуклеуса образуется новый макронуклеус. При этом происходят серьезные перестройки ДНК, приводящие к образованию миллионов хромосом, размер которых варьируется от 500 п.н. до 20 000 п.н. Концы этих хромосом защищены короткими теломерами (T4G4)n, последние 16 из которых образуют выступающий З'-конец. Теломерные концы участвуют в агрегации хромосом макронуклеуса и образовании ими структур более высокого порядка. In vitro теломерный повтор реснитчатых инфузорий d(T4G4) может образовывать как антипараллельные, так и параллельные квадруплексы. Авторами работы были получены антитела (scFv) селективно связывающие параллельный квадруплекс, а также антитела

взаимодействующие с G-квадруплексами независимо от их конформации. Антитела, способные связывать антипараллельные квадруплексы, взаимодействовали с макронуклеусом Stylonychia lemnae. При этом ни микронуклеус, ни полоса репликации в макронуклеусе, содержащая большое количество теломерной ДНК, не окрашивались при иммунофлуоресцентном анализе. Обработка макронуклеуса нуклеазами, нарушающими агрегацию минихромосом, приводила к исчезновению окрашивания. Таким образом получило подтверждение не только существование антипараллельных квадруплексов в теломерных областях, но и их разрушение при репликации.

Позднее было подтверждено образование квадруплексов in vivo теломерами человека [15-17]. Cheng-Chung Chang и коллеги использовали для доказательства существования квадруплексов в человеческих теломерах особые свойства флуоресцентного красителя BVMC- 3,6-b¡s(l-methyl-4-v¡nylpyr¡din¡um)carbazoled¡iodide (дийодид 3,6-бис(1-метил-4-винилпиридин)карбазола)), (Рисунок 3).

Этот краситель предпочтительно

взаимодействует с квадруплексами, при этом

максимумы спектров испускания при

взаимодействии с ДНК-дуплексами и ДНК-

квадруплексами отличаются и составляют 545

„ и 575 нм соответственно. Сравнение спектров

Рисунок 3. Структура флуоресцентного r г

красителя BVMC, специфично флуоресценции на концах хромосом и в других

взаимодействующего с ДНК-квадруплексами.

Ниже приведено сравнение в спектров регионах показало наличие квадруплексов на

испускания BVMC при взаимодействии с концах метафазных хромосом. Анализ двухспиральной ДНК и G-квадруплексом.

Максимумы соответствуют 575 нм для ДНК- хромосом с помощью FLIM (Two photon-

квадруплекса и 545 нм для ДНК-дуплекса. .. .. /-,Г.!-\ П I • Г ..

excitation (2РЕ) fluorescence lifetime imaging

microscopy) подтвердил существование 64-структур в теломерах человека. [17]

2.2. Белки, взаимодействующие с ДНК-квадруплексами

Несмотря на недостаток прямых доказательств существования ДНК-квадруплексов in vivo, их биологическая роль на сегодняшний день практически не вызывает сомнений. Одним из косвенных подтверждений является большое количество известных белков из различных организмов, взаимодействующих с квадруплексами, а также негативный эффект, который оказывает нарушение функций этих белков на рост и развитие клеток и организма в целом. В в конце главы 2.2 (Таблица 1) приведён список белков,

взаимодействующих с квадруплексами, по данным базы Uniprot (www.uniprot.оrg). Дополнительный поиск литературы позволил найти ещё около 10 б�