Изучение биохимических свойств белка Est3p, компонента теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи

ШАРАПОВ Юрий Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙС ТВ БЕЛКА Ев<3р, КОМПОНЕНТА ГЕЛОМЕРАЗНОГО КОМПЛЕКСА ДРОЖЖЕЙ 8ассНаготусез сегемяае.

02.00.10—биооргяническая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2007

003066961

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова и в Лаборатории Молекулярной Биологии Медицинекого Исследовательского Центра, Кембридж,

Научные руководители

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Зверева Мария Эмильевна, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Донцова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник Туницкая Вера Леонидовна, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Тер-Аванесян Михаил Давидович

Ведущая организация Институт Химической Биологии и

Фундаментальной Медицины Сибирского отделения РАН, г Новосибирск

Защита состоится 23 октября 2007 г в 17 00 на заседании диссертационного совета Д ' 501 001 41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан 21 сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На оравах рукописи

ШАРАПОВ Юрий Сергеевич

ИЗУЧЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БЕЛКА Ев<3р, КОМПОНЕНТА ТЕЛОМЕРАЗНОГО КОМПЛЕКСА ДРОЖЖЕЙ ЗассНагощсе* сегег'тае.

02.06.10—биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

Работа выполнена на кафедре Химии Природных Соединений Химического факультета Московского Государственного Университета им МВ Ломоносова и в Лаборатории Молекулярной Биологии Медицинского Исследовательского Центра, Кембридж, Великобритания

Научные руководители

кандидат химических наук, старший научный сотрудник Зверева Мария Эмильевна, доктор химических наук, профессор, член-корреспондент РАН Донцова Ольга Анатольевна

Официальные оппоненты доктор химических наук,

ведущий научный сотрудник Туницкая Вера Леонидовна, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Тер-Аванесян Михаил Давидович

Ведущая организация Институт Химической Биологии и

Фундаментальной Медицины Сибирского отделения РАН, г Новосибирск

Защита состоится 23 октября 2007 г в 1700 на заседании диссертационного совета Д 501 001 41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете им MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские горы, д 1, стр 40, МГУ Лабораторный корпус "А", аудитория 501

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им М В Ломоносова

Автореферат разослан 21 сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

Смирнова И.Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. На концах линейных хромосом эукариотических организмов находятся особые ДНК-белковые структуры, называемые теломерами Теломерная ДНК состоит из повторяющихся нуклеотидных последовательностей и заканчивается 3'-высгупающим одноцепочечным участком При каждом клеточном делении в результате недорепликации происходит укорочение теломер При достижении теломерами некоторой критичной длины клетка вовсе перестает делиться, входит в состояние сенессенса и погибает Однако, во многих клетках, для которых природой предусмотрен неограниченный потенциал деления, например в одноклеточных организмах или в половых и раковых клетках существует механизм поддержания стабильности длины теломер, в основу которого положен синтез теломерной ДНК с помощью специального фермента теломеразы Теломераза - сложный РБК-белковый комплекс, который состоит из молекулы РНК, обратной транскриптазы и ряда других белковых компонентов Неослабевающий интерес к изучению теломеразного комплекса связан, в первую очередь, с перспективой лечения онкологических заболеваний путем ингибирования теломеразной активности и восстановления механизма контроля числа клеточных делений у раковых клеток.

Дрожжи Saccharomyces cerevtsiae, являющиеся одноклеточными эукариотами, представляют собой очень удобную модельную систему для изучения теломеразы Теломеразный комплекс этих дрожжей состоит из РНК TLC1, включающую в себя матричный участок для синтеза теломерных повторов, и, по крайне мере, трех важных белковых компонентов - Estlp, Est2p и Est3p Обратная транскршггаза Est2p в комплексе с TLC1 способна удлинять теломероподобный ДНК-олигонуклеотид (праймер) т vitro Белок Estlp считается ответственным за прикрепление теломеразы к теломере и активацию фермента в S-фазе клеточного цикла. Про ЕйЗр можно с уверенностью утверждать, что он является компонентом теломеразного комплекса Saccharomyces cerevtsiae и необходим для жизнедеятельности клетки, так как делеция его гена приводит к летальному фенотипу прогрессирующего укорочения теломер Однако до настоящего времени структура и конкретная функции Est3p остаются неизвестными, в связи с чем, этот компонент дрожжевого теломеразного комплекса вызывает огромный интерес у исследователей

Цель работы Разработка эффективного метода выделения белка ЕйЗр и функциональное изучение его биохимических свойств

Научная новизна и практическая значимость работы Впервые разработан эффективный метод выделения активного т vitro компонента теяомеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae белка Est3p Показана способность этого белка образовывать гомодимер in vitro Впервые обнаружены и исследованы новые свойства белка Est3p ©ГРазная и АТРазная активности, способность взаимодействовать с рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидами, уникальная способность специфически узнавать и раскручивать РНК/ДНК гибридные дуплексы

Таким образом, в рамках данной диссертационной работы получены важные результаты, позволяющие сделать выводы о функционировании белка Est3p в составе теяомеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Апробация работы Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях Международной конференции им В А. Энгельгардта по Молекулярной Биологии, Московская область, Россия, 2006 г, Международной конференции "Теломеры и Теломераза", Нью-Йорк, США, 2007 г, Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2007", Москва, Россия, 2007, Международной конференции "Биокатализ-2007", Москва, Санкт-Петербург, Россия, 2007

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 121 странице машинописного текста и содержит следующие разделы введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, материалы и методы, выводы Материал иллюстрирован 25 рисунками и 4 таблицами Библиографический указатель включает 222 цитированные работы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение белка Est3p с аффинным эпитопом GST

В клетке присутствуют две формы белка Est3p укороченная и полноразмерная Последняя синтезируется с помощью интересного механизма запрограммированного сдвига рамки считывания Известно, что только один из двух белков необходим для нормальной работы теломеразы т vivo Это полноразмерный белок Из опыта работ прошлых лет известно, что очень часто дрожжевые белки оказываются плохо растворимы при экспрессии их генов в Е coU Известно также, что увеличить эту растворимость можно, продуцируя химерный белок, содержащий на N-конце объемный аффинный

эпитоп, такой, например, как фрагмент глутатион-З-трансферазы (GST). В связи с этим изначально бьию решено про клонировать ген EST3 в экспрессной ный вектор pGEX-4f-l, в котором содержится последовательность, кодирующая GST

Фрагмент ДНК, соответствующий участку гена EST3, кодирующему белок, с мутированным сайтом сдвига рамки считывания, так, чтобы синтезировался только полноразмерный Est3p. был получен с помощью двух полимеразных цепных реакций (ГГЦР1- Клонирование было проведено таким образом, что ген EST3 оказался слитым в одной рамке считывания с последовательностью, кодирующей фрагмент глутятион-S-трансферазы и участок узнавания специфической протеазы Тромбина В результате

экспрессии полученной конструкции, названной pGEX EST3, образовывался химерный белок Est3p, содержавший на своем N-конце эпитоп GST (GST-Esi3p). Этот белок выделялся из клеточного лизата с помощью аффинной хроматографии на смоле глутатион-сефароэе Было обнаружено, что добавление при выделении АТР или OTP увеличивало растворимость белка. Это могло происходить благодаря

взаимодействию молекул этих

нуклеозидтр и фосфатов с молекулами белка н стабилизации таким образом их структуры. Для того »ггобы снизить количество примеси прокариотических бел ков-ша перо нов, совыделявшихся с GST-Est3p, в процессе выделения смола дополнительно промывалась при 37°С буфером, содержащим ионы Mg2- и АТР, а затем буферам с высокой концентрацией соли. После проведения аффинной хроматография обработка рекомбинаеткого бейка протеааой Тромбином позволяла получить белок ЕмЗр, не содержащий зпитопа GST. Белок, модифицированный GST, действительно, был хорошо растворим и легко выделялся с помощью глутатнон-сефарозы, однако при отрезании аффинного эпитопа значительная часть Est3p терялась (рис I, дорожки 3, 4), Попытки отделить от ЕйЗр отрезанный GST с помощью вторичной аффинной хроматографии приводили к еще большим потерям целевого белка, снижая его количество до исчезающего. Й связи с этим при проведении различных функциональных

OST-Est3p *

к* Ш

OST 1 г «

EstJP--—

*

/ / / 4

Да

Рисунок 1. Выделение белка Esl3p. Анализ в 15%-ном ПААГ-ДСН. Дорожка 1 - суммарная белковая фракция кз клеток Rcoli, трансформированных плазм идой pGEX_EST3 и росших в отсутствии индуктора экспрессии ИПТТ Дорожка 2 - то же самое после индукции экспрессии И1111 Дорожка 3-эл«>ат с глутатнон-сефарозы белка GST-EsOp. Дорожка 4 - препарат белка Est3p после отрезания аффинного эпитопа GST. Дорожка 5 - маркеры молеку лярного веса белков. Положение в геле белков GST-Esi3p, GST и Es(3p показано стрелками.

тестов в данной работе использовался либо препарат белка, содержавший в растворе одновременно и Est3p, и GST (рис. I, дорожка 4), либо белок с не отрезанным аффинным эпитопом (рис. 1, дорожка 3). В качестве контроля во всех случаях использовался белок GST, который синтезировался при экспрессии плазм иды pGEX-4T-l и выделялся точно так же, как белок GST-Est3p, с помощью аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе.

2. Взаимодействие Kst3p с рибо- и дезоксирнбоолигонуклеотидамн.

Препарат, содержавший Est3p с отрезанным GST (рис 1, дорожка 4), полученный, как описано выше, в избытке добавлялся к радиоактивно меченным ДНК

D1 Di On R1 R! Rn

a тшш&м? 5 ^шшшш

OTP GDP GIPGDP OTP GDP GTPGQP GTPGDP GTPG'JP

r ШШ?

1 7 J 4 5 6 i 2 a 4 s 6

Рисунок 2. Взаимодействие Est3p с рибо- и дезоксирибоолиговуклеотидами в присутствии GTT it GDP, Показаны радиоавтографы олигонуклеогндов и их комплексов и белком, разделенных 8% неденатурирующем ПААГ. Дорожки соответствуют: D1, Ш, Dn, Rl, R2, Rn - взаимодействие белков с олигону клеогндамн Di. D2, Diu Rl, R2 и rh, соответственно: GTP, GDP, ATP. ADP - взаимодействие белков С алигоыуклеопкдамн в присутствии GTT. GDP. ATP и ADP, соответственно; +GST, +Est3p - взаимодействие о олигону клеогндамн белка GST и белка Esfc3p, соотвстсвенно. Во всех случаях положение олигону клеотндов и их комплексов с Esl3p в геле обозначены стрелками. f32P|-радноактнвно меченные одиговуклеотиды обозначены звездочкой * возле названия.

(название начинается с буквы D) или РНК (название начинается с буквы R) о ли го ну кл еотндам, имитировавшим участников теломеразной реакции или выступавшими в качестве контроля: DI дезоксирибоолигонуклеотнд с последовательностью С-богатой цепи геломерной ДНК, D2 - дезоксирибоопигонукяеоггид с последовательностью G-богатой цепи теломерной ДНК, Dn - дезоксирибсюлигонуклеотид с Hffгеломерной последовательностью, R1 - рибоолитокуклеотид с последовательностью матричной области TLCI, R2 - рибоолигонуклеотид с последовательностью, комплиментарной матричной области TLCI, Rn - р и всю л иго нукдеот ид с нетелом ерной последовательностью. Было решено протестировать взаимодействие белка с о литомумеоткдами в присутсвии АТ5\ ,У)Р, OTP и GDP.

Рисунок Сравнение прочности свя зывания si' с рибо- и

дезоксирнбоолнгонуклоотндами. Покажиы радиоавтографы олнгсшуклеогидов и их коьтпексов с белком, разделенных неденатурнрующем 11ААГ. Л - взаимодействие олнгонуклеотндов D2 к R2 с Т:sт~j; в разных кошдопроцига Дорожки 1-5 - связывание 02 с ЕяЗр в присугсвнн GTP, молярное соотношения EKF.sGp - 1:1, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, соответственно. Дорожки й-10 - связывание R2 с EstJp в присутснии OTP, молярные соотношения K2:EsLJp - 1:1, 1:10, I 20, 1:10, 1:1(11), соответственно. Б -Вытеснение олигокуклееггнда D2 аз комплекса Est3p олигонуклеотидом R3, Дорожка 1 -связывание Est3p с [ Р]-радннктин'^г. леченным D2 в присутсвии GTP. Дорожка 2 -стюыванив Esi.ip с [~'*Р)'радилрлш>но моченным D2 в прнсулсвин СГРн двухкратного по отношению к D2 избытка немеченого R2 Дорожка 3 - снязынанис Esi3p с |,:Р|-раднакгнвио меченным R2 в прнсулсвин GTP Дорожка 4 - связывание Est3p с ['"Р]-р;щнактнвно мечеаным R2 в ттрисутсвин GTP и двухкратного по отношению к D2 <пыI ка немеченого D2. Во всех случаях положение олнгонунпсспидов и ид комплексов о Est3p в геле обозначены стрелками. i^PJ-paarcoajTrHftHO меченные одигопуклееггнды обозначены звездочкой * возле названия.

Оказалось, что Hsl3p способен связываться с дезокенрибоолигонуклеотидом D2 (рис,2 А, В). В присутствии GTP или АТР эта способность проявлялась лучше (рис.2 А, дорожка 10, рнс2 В. дорожка 4) а вот GDP или A DP напротив сильно ослабляли взаимодействие белка с ол игону клеоти дом (рис 2 А. дорожка 12. рис.2 В, дорожка 6). Похожие эффекты наблюдались и в случае дезоксирибоолигонукдеотидов DI и Dn,

однако нужно отметить, что они связывались с Ев13р гораздо слабее, чем 02 (рис 2 А).

s

Рибоолигонуклеотиды также взаимодействовали с Est3p в похожей манере Связывание белка с R2 было намного сильнее, чем с R1 и Rn (рис 2 Б) Эффекты, оказываемые ATP, ADP, GTP и GDP на взаимодействие белка с РНК, были схожие, однако выражены слабее, чем в случае с ДНК Так, например, если добавление <ШР и ADP приводило к практически полному подавлению связывания Est3p с ДНК (рис 2 А, дорожка 12, рис 2 В, дорожка 6), то взаимодействие с РНК лишь ослаблялось, но все же детектировалось (рис 2 Б, дорожка 12, рис 2 Г, дорожка 6)

Белок GST, использовавшийся в данных тестах в качестве контроля, не связывался ни с ДНК, ни с РНК (рис 2)

Если сравнивать между собой рибо- и дезоксирибоолигонуклеотнды по способности взаимодействовать с Est3p, то можно сделать вывод, что для этого белка РНК является более предпочтительным субстратом Комплекс Est3p-D2 можно детектировать в неденатурирующем геле при 50-ти кратном избытке белка, в то время как образование Est3p-R2 наблюдается уже при 10-ти кратном белковом избытке (рис 3 А) Кроме этого 2-х кратный избыток немеченого радиоактивно R2 вытесняет D2 из комплекса с белком, в то время как такой же избыток немеченого D2 не вызывает разрушения комплекса ЕйЗр-R2 (рис 3 Б) Эти данные свидетельствуют о том, что Est3p связывается с РНК-олигонуклеотидами гораздо эффективнее, чем ДНК-олигонуклеотидами с той же последовательностью

Интересным фактом является наличие у РЖ-олигонуклеотада R2 по меньшей мере трех различных конформаций, детектируемых в неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ), некоторые из которых полностью исчезают при добавлении избытка белка Est3p (рис 3 А, дорожки б, 10) Это свидетельствует о предпочтении белком определенных конформеров R2

3. Способность Est3p разворачивать дуплексы.

Для того чтобы протестировать влияние белка Est3p на стабильность двухцепочечных нуклеиновых кислот были сформированы следующие дуплексы D1/D2 -ДНК-дуплекс с тупыми концами, D1/D2L - ДНК-дуплекс с выступающим одноцепочечным участком, РНК-дуплекс R1/R2 и три разных гегеродуплекса D1/R2, R1/D2 и Dn/Rn Во всех случаях один из олигонуклеотидов был [-у-32Р]-меченный на 5'-конце Est3p добавлялся к дуплексам в присутствии различных кофакторов ATP, GTP,

GDP и негвдролшуемого аналога GTP - GMPPNP. Продукты реакции анализировались с помощью разделении в неденатурирующем ГГААГ

//// //// » ff//// « ff/ff/

Dl'ifö » ДОр

•fît

1 a э 4 »

//

m

>|H

Рисунок 4. Исследование разворачивающей активности £st3p. Показаны радиоавтографы дуплексов и олнгонуклеотндов, разделенных 8% неденатурирующем ПААГ, А влияние белка Est3p на стабильность ДНК/ДНК дуплекса D1/D2. Дорожка 1 - дезоксирибоолигонуклеотнд D1. Дорожка 2 -D1/D2 дуплекс в присутствии белка GST. Дорожки 3-7 - DI/D2 дуплекс в присутствии белка Est3p без кофактора, с GTP, GDP, АТР и ADP, соотвстсвснно. Б - влияние белка Est3p на стабильность РНК/РНК дуплекса R1/R2. Дорожка I -рибоолкгонуклеотид RI, Дорожка 2 - RI/R2 дуплекс в присутствии белка GST. Дорожки 3-7 - R1/R2 дуплекс в присутствии белка Esl3p без кофактора, с GTP, GDP, АТР и ADP, соогветсвенно. В - разворачивание ДНК/РНК гегеродуплскса D1/R2 белком Est3p в присутствии АТР, Дорожка 1 - дсзокстфибоолкгонуклсотид D1, Дорожки 2-5 - D1/R2 гегеродуплекс с белком Est3p после О, 5, 10 и 15 минут инкубирования, еоитветсвсшю. Г разворачивание ДНК/РНК гетер оду п л с к са D2fRl белком Est3p в присутствии АТР. Дорожка I - дезоксирнбооянгонуклеотнд D2. Дорожки 2-5 - D2/RI гегеродуплекс с белком Esl3p после 0, 5, 10 и 15 минут инкубирования, еоответсвенио, Д - влияние белка EsÜp на стабильность ДНК/РНК гетеродуплекса D1/R2. Дорожка 1 - дезоксирибоолш онуклеотид D1. Дорожка 2 — D1/R2 гегеродуплекс в присутствии белка GST. Дорожки 3-6 - D1/R2 гетеродуплеке в присутствии белка Est3p без кофактора, с GTP, GDP и негидролизуеыым аналогом GTP - GMPPNP, соответственной Е - влияние белка Est3p на стабильность ДНК/РНК гетерещушюкса Dii/Ru Дорожка 1 -де:юкеирибоолигонуклеотид Da. Дорожка 2 - Dii/Rn гегеродуплекс в присутствии белка GST. Дорожки 3-4 - Dn/Rn гетеродуллекс в присутствии белка Esl3p, с G TP и без кофактора, соответственно.. Во всех случаях положение олитонуклеотидов и дуплексов в геле обозначены стрелками, [32Р|-радиакгивно меченные о лотонуклсотиды в составе дуплексов обозначены звездочкой *,

И в присутствии, и в отсутствии кофакторов ЕйЗр не вызывал разворачивания ни ДНК/ДНК, ни РНК/РНК дуплексов (рис 4 А, Б) В случае последних в присутсвие АТР или GTP он даже немного стимулировал образование двухцепочечной РНК (рис 4 Б, дорожки 2,3)

В присутствии АТР и GTP Est3p стимулировал разворачивание всех ДНК/РНК гетеродуплексов (рис 4 В, Г, Д, Е), о чем свидетельствовало появление полосы более легкого меченного олигонуклеотида (в работе использовались дуплексы как с радиоактивно меченым ДНК, так и с РНК олигонуклеотвдом) Добавление, GDP или негидролизуемого аналога GTP - GMPPNP вызывало небольшое снижение разворачивающей активности Est3p (рис 4 Д)

Белок GST, использовавшийся в данных тестах в качестве контроля, в присутствии различных кофакторов не оказывал на тестируемые дуплексы никакого влияния (рис 4 А, Б, Д, Е, дорожка 2)

Нужно отметить, что способность дискриминировать субстрат и специфически раскручивать ДНК/РНК дуплексы является довольно уникальным свойством белка Est3p, поскольку большинство известных ферментов, обладающих ДНК/РНК разворачивающей активностью, способны действовать и на другие варианты дуплексов

Способность ЕяЗр разворачивать ДНК/РНК гегеродуплексы может быть использована в процессе удлинения теломер теломеразным комплексом и влиять на процессивносгь этого комплекса После синтеза теломеразой одного повтора образуется длинный комплементарный дуплекс теломерной ДНК с матричным участком теломеразной РНК, который должен быть хотя бы частично расплетен для того, чтобы синтез мог продолжаться Известно, что теломераза дрожжей Saccharomyces cerevisiae способна синтезировать довольно протяженную теломерную ДНК т vivo, однако т vitro реконструированный фермент, состоящий только из TLC1 и Est2p добавляет к теломер-подобному праймеру всего один повтор В большинстве случаев дролокевой теломеразный комплекс выделенный из клеточного экстракта с помощью ион-обменной или аффинной хроматографии также способен синтезировать только один теломерный повтор Возможно, во всех этих случаях какие-то белковые компоненты, необходимые теломеразному комплексу, в том числе и Est3p. просто теряются во время его выделения

Ранее было показано, что N-концевой домен обратно-транскриптазной субъединицы теломеразного комплекса Tetrahymem Tnermophila способен связываться с ДНК и РНК, а похожий домен человеческой теломеразной обратной транскриптазы необходим для процессивной работы теломеразного комплекса Возможно, что белок

Est3p с его способностью взаимодействовать с ДНК и РНК и раскручивать ДНК/РНК гетеродуплексы выполняет ту же функцию, что и N-концевые домены каталитической субъеденицы в других теломеразах

4. Влияние мутаций Е104А и 104RE на свойства Est3p.

Известно, что очень часто заряженные аминокислоты играют важную роль во взаимодействии белков с нуклеиновыми кислотами С помощью внесения нуклеотидных замен в плазмиду pGEX_EST3 были создали две формы белка Est3p В первой форме остаток Giul04 был заменен на остаток аланина (Е104А) Во второй - остатки Giul04 и Argl05 были поменяны местами (104RE), для того чтобы, с одной стороны, возможно, изменить способность белка связываться с нуклеиновыми кислотами за счет локального изменения конформации и заряда, а, с другой стороны, сохранить общий заряд белка, влияющий, например, на такие свойства как растворимость Оба белка с внесенными мутациями были выделены точно так же как белок Est3p дикого типа с аффинным эпитопом GST Нужно отметить, что в случае белка с заменой Е104А количество совыделявшегося белка-шаперона из Ecoli, массой около 60 кДа, предположительно, GroEL, было больше, чем в случае белка с мутацией 104RE и белка дикого типа (рис 5 А) и снизить уровень примеси не помогали даже дополнительные промывки смолы Выделенные белки с аминокислотными заменами были протестированы на способность связываться с рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидами и разворачивать ДНК/РНК гетеродуплексы Было выяснено, что белки с мутациями Е104А и 104RE связываются с ДНК и РНК с меньшей эффективностью, чем наивный Est3p (рис 5 Б) Эффективность разворачивания гетеродуплексов внесенные мутации снижали незначительно (рис 5 В)

Способность Est3p взаимодействовать с одноцепочечной ДНК или РНК может быть важна для процесса разворачивания геггеродуплексов Связывая одноцепочечный субстрат, белок может смещать равновесие в сторону диссоциации ДНК/РНК дуплекса на его отдельные составляющие Однако, тот факт, что способность белков с мутациями Е104А и 104RE раскручивать гетеродуплексы снижается незначительно, может подразумевать наличие альтернативного механизма Также можно предположить, что связывание с одноцепочечной нуклеиновой кислотой важно, но даже при сделанных аминокислотных заменах не является лимитирующей стадией при разворачивании белком двухцепочечных субстратов, поэтому при детектировании в нативном геле трудно увидеть

разницу в разворачивающей активности у Est3p дикого типа и полученных белков с мутациями.

д / У ;/ </ Г /

Шапсрон — — ее кДл

GST4=3l3p — - - —L_ 4$кДа

ЗвкДа

gst—— ^ —* "** - 2s№*

Es,3p----~ - 1>ф

14,<кДа

12 3 4 5 6 7

iJ//

f / / /

w

Рисунок 5. Свойства нртяапшх форм !'Л1лр А - Выделение белка Hst3p н его мутантных форы. Авалнз в 15%-ном ПААГ-ДСН. Дорожки 1-3 - элюэгпн с гдугатноя-сефарозы тагяроваяных аффинным эпигоном GST белков ЕяЗр. Е104А и 104RE. соответственно. Дорожки 4-6 - препараты белков HsOp HI(.14А н 104RE, соответственно, после отрезания ¡аффинного мг,:!0::.ч GST, Дорожка 7 - маркеры молекулярного веса белков. О - взяНИР Esl3p и его нутавгных форм с де:юкснри6оолигонуклеотндои Ш в присутсвии GTF. Дорожки 1-4 - дсзоксирнбоолнгонуклеопщ D2 в присутствии белков GST, Eat3p, Е1ША и ID4RE, соответственно. В - влияние белка Hsi3p и его млтантных форм на стабильность Д1-ГК/РНК гегеродуплекса D1/R2 в присутствия GTP. Дорожка I - дезоксирвбоолиговуклеотнд Ш. Дорожки 2-5 - DliKl гетеролуплекс в присутствии белков GST, Esl Jp EI04A н 104RFT соответственно. Во всех случаях положение белков, олигонуклеотрдов, дуплексов и komhickcob в геле показано стрелками.

Тот факг, что Нй13р с наибольшей эффективностью связывается с О-богатыми олигоиуклеотидами, позволяет высказать предположение, что в клетке этот компонент теломеразвого комплекса может связываться с З'-кошго.м теломер. В «можно, с помощью этого связывания ЕзгЗр освобождает О-богатый од ноцепочеч н ы й участок от кэпирующих его белков и помогает теломеразе получить доступ к самому концу тело меры

Известно, что в штамме Saccharomyces cerevisiae, содержащем белок с мутацией Е104А вместо обычного Est3p, теломеры по сравнению со штаммом дикого короче, что свидетельствует о некотором нарушении правильной работы теломеразного комплекса Тот факт, что замена Glu 104 на аланин в Est3p вызывает нарушение связывания с ДНК m vitro и укорочение теломер m vivo, позволяет предполагать, что свойство Est3p взаимодействовать с ДНК важно для процесса удлинения теломер

Est3p с довольно высокой эффективностью связывается с рибоолигонуклеотидом R2 Этот олигонуклеотид является наиболее предпочтительным субстратом из всех протестированных одноцепочечных РНК и ДНК В последовательности R2 содержится участок UGUGU, который присутствует и в последовательности теломеразной РНК TLC1 (1082-1086) Этот участок присутствует во всех известных дрожжевых теломеразных РНК и находится в частично не спаренном структурном элементе Исходя из всего этого, можно сделать предположение, что Est3p способен взаимодействовать с теломеразной РНК напрямую Тот факт, что Est3p скорее вызывает формирование РНК/РНК дуплексов, чем их диссоциацию, позволяет предположить, что, возможно, этот белок неким образом участвует в процессе правильного сворачивания теломеразной РНК во время сборки теломеразного комплекса

5. Димеризации Estóp.

Ранее было показано, что теломераза дрожжей содержит как минимум два активных сайта и, возможно, работает как димер или мулътимер Более того, в случае теломеразы человека такая мультямеризация осуществляется за счет РНК-РНК и РНК-белкового взаимодействия и функционально необходима Недавно было выдвинуто предположение о том, что в димеризации теломеразы дрожжей, возможно, участвует Est3p Одной из задач настоящей работы являлась разработка метода выделения активного белка Est3p и проверка его способности к димеризации in vttro

5.1. Белок Est3p с различными аффинными эпвтопами на N- и С-концах.

Для проверки возможной димеризации Est3p необходимо было получить производные этого белка, различающиеся аффинными зпитопами или их отсутствием на N- и С-концах Выделение с помощью аффинной хроматографии из смеси двух белков только одного из них служило бы доказательством существования белка в виде мономера. Было решено, в качестве первого компонента использовать упомянутый ранее белок GST-

Est3p с неудаленным аффинным эпитопом глутатион-8-трансферазы на N-конце белка (рис 1, дорожка 3) В качестве второго компонента решено было использовать гексагисгидиновое (6His) производное Est3p Для получения такого производного использовали плазмидные векторы pQE32 и рЕТЗЗЬ+, позволяющие регулировать уровень экспрессии рекомбинантного белка в клетках Е coli, что могло быть важным для получения растворимого белка. В качестве источника гена EST3 с участком сдвига рамки считывания измененным таким образом, чтобы в результате экспрессии синтезировался только полноразмерный белок Est3p, использовалась, созданная ранее, гшазмида pGEX_EST3 С помощью ПЦР были получены фрагменты ДНК, соответствующие участку гена EST3, кодирующему белок Est3p и содержавшие сайты узнавания различных эндонуклеаз рестрикции на концах Эти фрагменты были встроены соответственно в векторы pQE32 и рЕТЗЗЬ+ Полученные конструкции были названы pQE32_EST3 и pET33b+_6His-EST3 В клетках Е coli, трансформированных плазмвдой pQE32_EST3 или pET33b+_6His-EST3, продуцируемый белок Est3p содержал шесть гистидиновых остатков на N-конце Уровень экспресси в случае pET33b+_6His-EST3, как и ожидалось, был выше, чем в случае pQE32_EST3, однако в обоих, случаях большая часть продуцируемого целевого белка оказывалась в "тельцах включения", и после выделения 6His-Est3p детектировался только в следовых количествах (рис б А, В) Эти трудности не удалось преодолеть ни с помощью варьирования концентраций индуктора экспрессии (ИГПТ), ни с помощью синтеза рекомбинантного белка при температуре 16°С Поэтому было решено создать новую конструкцию pET33b+_EST3-6H3s, которая позволяла бы получить Est3p с шестью гистидиновыми остатками не на N-, а на С-конце Для этого с помощью ПЦР был получен фрагмент ДНК, кодировавший белок ЕяЗр с 6His эпитопом на С-конце Этот фрагмент был клонирован в экспрессионный вектор рЕТЗЗЬ+ Уровень экспрессии гена EST3 на плазмиде pET33b+_EST3-6His в клетках Е coli был довольно высок (рис 6 В), при этом и количество белка Est3p в растворимой фракции и после выделения с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе было гораздо выше, чем в случае использования плазмид pQE32_EST3p и ET33b+_6His-EST3 (рис 6 А, Б) Вероятно, перемещение 6His с N- на С-конец белка неким образом улучшило процесс правильного сворачивания Est3p в Е Coli, что и привело к повышению его растворимости

На биохимических свойствах белка расположение шести гистидиновых остатков на С-конце не отразилось, что было доказано с помощью функциональных тестов in vitro Est3p-6His так же, как и белок без каких либо аффинных эпюгопов, связывал ДНК- и РНК-олигонуклеотиды и стимулировал раскручивание ДНК/РНК гетеродуплексов

Таким образом, впервые удалось разработать метод быстрого и удобного выделения в достаточно высокой концентрации активного белка ЕЯЗр, содержащего шесть гиетядинов на С-конце.

Рисунок 6. Выделение г{ксагмстидкковых прошвооных белка Es(3p В 15%-ном TIAAJ . содержавшем 0,1% ДСН, анализировали суммарную белковую фрзкшио нз клеток Е. coli, трансформированных анимидами pQE32_ES'l'J (A),pET3?b+_6Hii-EST3 (Б) н pET13b+_EST3-6His (В) к росших а отсутствие ИПТТ (А-В. дорожки 2) или в присутствии ИПТГ (А-В, дорожки 4 - Элюаты с Ni-SiA;u..fX";K 1 - маркеры молекулярных масс белков.

5.2. Образование го иод и мера Est3p in vitro.

Для проверки способности Est3p образовывать димеры и олигомеры, в первую очередь, был проанализирован препарат Est3-6His с помощью метода электрофореза в неденатурирующем поли акридам идиом геле, содержащем всего 001% додецилсульфата ширин. Такая низкая кониетрация детергента в геле и буферах для электрофореза не вызывала диссоциации комплексов белка на субъединицы и в тоже время позволяла за счет небольшого сдвига заряда белковых молекул значительно уменьшить время проведения электрофореза и улучшить качество изображения, после окрашивания геля Coomassie brilliant blue R250 В препарате EST3-6His, нанесенном на такой неяенатурирующнй ПААГ (рис.7 А, дорожка ]), кроме основной полосы.

соответствующей мономеру Ек13р, детектировалось также присутствие бел кг с большей массой. При этом такая полоса исчезала, если образец перед нанесен нем на тс ль прогревали в буфере с 8 М мочевиной (рис.7 А, дорожка 2), Это явно указывало на то, что белок Ей!3р способен к олигомеризаиии. Зона, соответствующая олигомеру, по своей интенсивности сопоставима с зоной, соответствующей мономернон форме белка, т.е в данном препарате белка -50% молекул образуют олигомер.

1 г 1 г J t s

Рисунок 7. Димсриззцн* IsT'p in vitm. л - Анализ и 12%-ном ПААГ, содержавшей 0,01% ДСП, препарата белка fist3p-6Hi5 (J) и того же прсплрйзта, предварительно прогретого на 95° в буфере с К М мочекнчон (2). Б - Анализ в 15%-ном ПААГ, содержавшем 0,1% ДСП, белковых фракций полученных при аффинном выделения на Ni-NTA-агарозс ю смеем белков Ksi3p-6His н GST-ЕяЗр 1 г О, I (2), Estfp-Wlis и GST-Esi3p i : i (3>, esop-6hls и GST-EsOp 1 : 10 (4) и ЕяЗр-ftHis и gst 1 : 10 (.vi, I -Аффинное выделение на Ni-NTA-агарозс Esl3p-6His без добавления других белков.

Для альтернативной проверки олигомеризации были смешаны два белковых препарата EST3-6His и GST-Est3p и затем выделили из полученной смеси белок с гистидиновым аффинным зпитопом с помощью смолы Ni-NTA-агарозы При анализе полученной таким образом белковой фракции с помощью ПААГ-ДСН (рис.7 Б) было установлено, что кроме EST3-6His в ней детектировался и GSl'-EstJp, Это указывало на взаимодействие между этими двумя белками Добавленный вместо GST-Kst3p в качестве контроля белок GST не со выделялся с EST3-6His при аффинной хроматографии (рис 7 Б, дорожка 5). Тот факт, что при переходе от молярного соотношения Est3p-6His : GST-Est3p 1 I к молярному соотношению 1 . 10 количество соаыдйдавшетося GST-ЕкЗр особо не увеличивалось и не превышало количество ЕЯЗр-бН1$ (рис.7 Б, дорожки 3 и 4), позволяет сделать вывод, что ол я го мерная форма, скорее всего, является димером. Гегеродимер BST3-6His и GST-Est3p в неденатурнрующем ПААГ детектировать не удалось Это, по-

видимому, свидетельствует о том, что взаимодействие между молекулами GST-Est3p и Est3-6His намного слабее, чем между двумя молекулами EST3-6His, из-за наличия у GST-Est3p довольно объемного аффинного эпитопа, GST

Таким образом, разработан эффективный метод одностадийного выделения активного компонента теломеразного комплекса дрожжей S cerevisme белка Est3p и подтверждена способность этого белка образовывать гомодимер in vitro

6. СТРазная и АТРазная активности белка Est3p.

В присутствии препарата, содержавшего белок Est3p и отрезанный с помощью Тромбина аффинный эпитоп GST (рис 5 А, дорожка 4), наблюдался гидролиз и АТР, и GTP с высвобождением монофосфата (рис 8) GST сам по себе не обладал ни АТРазной, ни вТРазной активностями (рис 8 А, Б, дорожка 1)

время 15

sst

время

Est3p после дополни Estsp до дополни тельной очистки

тельной очистки

Рисунок 8. Исследование АТРазной и СГРазной акпюносги белка Est3p Радиоавтографы пластин после тонкослойной хроматографии А - гидролиз АТР Дорожка 1 - гидролиз АТР в присутствии препарата белка GST, время инкубации 15 минут Дорожки 2-4 - гидролиз АТР в присутствии препарата белка Est3p полученного с использованием дополнительных этапов очисгаи во время аффинной хроматографии, время инкубации 5, 10 и 15 минут, соответственно Дорожки 5-7 -гидролиз АТР в присутствии препарата белка Est3p полученного 6et использования дополнительных этапов очистки во время аффинной хроматографии, время инкубации 5,10 и 15 минут, соответственно Б -все то же самое для GTP

Уровень гидролиза АТР в присутствии препарата белка Est3p был выше уровня гидролиза GTP Некоторый вклад в стимулирование гидролиза АТР могли вносить примесные прокариотические белки, например шапероны, какоторые известно, обладают АТРазной активностью и могут совыделятся с дрожжевыми белками, продуцируемыми в Ecoh Для снижения уровня совыделяющихся при очистке белка Est3p шаперонов в

процессе аффинной хроматографии смолу дополнительно промывали буфером, содержавшим ионы Mg2+ и АТР, и буфером с высокой концентрацией соли На рисунке 7 видно, что, если при выделении белка не предпринимать эти дополнительные промывки, уровень гидролиза АТР, катализируемого полученным белковым препаратом больше, уровень гидролиза GTP практически такой же Данный факт говорил о том, что при очистке Est3p с помощью аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе вместе с ним могли совыдеяяться белки, обладающие АТР-азной, но не GTP-азной актитвностью

Способность препаратов Est3p с мутациями Е104А и 104RE (рис 5 А, дорожки 5, 6), стимулировать гидролиз GTP сильно снижалась по сравнению с белком дикого типа (рис 9 А) В случае Е104А гидролиз исчезал практически полностью Препараты обоих выделенных белков с аминокислотными заменами обладали АТРазной активностью, однако уровень гидролиза АТР также был ниже, чем в присутствии Est3p без мутации (рис 9 Б)

GST Esl3p Е104А 104RE

время 15' 5' 10' 15' 5 10 15 5 10 15' Pi-

РисуНОК 9, Исследование АТРазной и СТРазной активности мутантных форм белка ЕяЗр Радиоавтографы пластин после тонкослойной хроматографии А - гидролиз GTP Дорожка 1 (контроль) - гидролиз GTP в присутствии препарата бежа GST, время инкубации 15 минут Дорожки 2-4 - гидролиз GTP в присутствии препарата белка Est3p, время инкубации 5, 10 н 15 минут, соответственно Дорожки 5-7 - гидролиз GTP в присутствии препарата мутангного белка Е104А, время инкубации 5,10 и 15 минут, соответственно Дорожки 8-10 - пиролиз GTP в присутствии препарата мутангного белка 104RE, время инкубации 5,10 и 15 минут, соответственно Б-все тоже самое для АТР

Для дополнительного доказательства взаимодействия Est3p с АТР и GTP были проведены эксперименты по фотосшиванию этих нуклеозидтрифосфатов, [а-32Р]-радиоактивно меченных, с белком Est3p с неотрезанным GST-эпитопом (рис 5 А, дорожки 1-3) В обоих случаях сшивки АТР и GTP с белком, содержавшим мутацию Е104А, детектировалась слабая радиоактивная полоса, соответствовавшая по подвижности белку GST-Est3p (рис 10, дорожки 3, 6) В остальных случаях такая полоса не детектировалась Возможно, замена остатка глутаминовой кислоты в положении 104 на аланин вызывает такие нарушения в каталитическом центре Est3p, что белок начинает хуже катализировать

гидролиз тринуклеозидфосфатов, но по-прежнему может связывать их Таким образом, АТР или GTP могут быть связаны с белком и не подвергаться гидролизу в случае Е104А более продолжительное время, чем в случае дикого типа, а это может приводить к увеличению вьсхода реакции фотосшивания. Кроме этого можно предположит!,, что мутация Е104А влияет на стадию диссоциации Cii>P или ADP от белка после гидролиза, и в этом случае количество детектируемого после сшивки комплекса также будет больше.

«Да

___ . îsiw!

1 г J 4 s ь

Рисунок 10. Анализ продуктов реакции фогосщивання |a-î!P|-радиоактивно меченных AIV али GIT с Esl3p и его мутактными фОрыаыи. Дорожки ï-З Сшивание |с- ;Р]ЛТР с ËSI3p, 104RE м Е104А, сошветевенно. Дорожки 4-6 - Сшивание ¡a-"P|GTP ç ЕйЗр, 104RE и В104А, акггветйвенно

Несмотря на то, что при выделении Est3p с помощью аффинной хроматографии предпринимались дополнительные шаги no очистке целевого белка от примесей, которые могли обладать АТРазной активностью, полностью исключать наличие таких примесей все же было нельзя Было решено получить еще один препарат белка Est3p, который был бы еще более тщательно очищен Для этого была получена конструкция рЕТЗОа-Теv_6His- S -EST3, при экспрессии которой синтезировался белок Est3p, содержавший на N-конце шесть гистидиновых остатков и небольшой 5 кДа S-таг, которые были отделены участком узнавания специфической протеазы Tcv

Экспрессия в клетках E.coli

J vir/

Аффиная хроматография №1 ^т^ на Ni-NTA-агарозе

Гель-фильтрация №1

ШГ

Отрезание аффинных эпитопоа с помощью Tev-лротеазы

Аффиная хроматография №2 на Ni-NTA-агарозе, концентрирование

1

Гель-фильтрация №2.

концентрирование

20 кДа

Рисунок 1L Получения очищенного препарата бедка ЕяЗр Панель А - схема очистки белка Est3p. Панель Б -анали-! в 15% ЛААГ ДСН лолу'¡сн нога препарата Est3p.

В результате выделения белка по схеме, представленной на рисунке 11 А, чистота ЕйЗр в получаемом препарате составляла более 95% (рис.11 Б). Аналогичным образом выделялся белок Est3p с заменой остатка аспарагиновой кислоты в положении 86 на аланин (D86A) Известно, что такая аминокислотная замена в дрожжах Saccharomyces cerevtsiae приводит к клеточной гибели в результате сенеесенса Оба препарата, и немутированны и Est3p, и D86A, были протестированы на способность стимулировать гидролиз АТР и GTP. Белок дикого типа, как и ожидалось, обладал и ОТРазной, и АТРазной активностями В случае же белка с мутацией гидролиза АТР и GTP практически не наблюдалось (рис.12), что свидетельствовало о том, что способность катализировать гидролиз АТР и GTP это свойство именно белка Est3p, а не примесей

I

21

ЕыЗр

1г5<56Т89 )a34S67S9

Рнгунпк 12. Исследование АТРазной и GTPaínOH активности белка Est3p н сю чуташной i|«~f \iu л86а А - дтр Дорожка 1 (контроль) - гидролиз АТР в отсутствии белка,

время инкубации 2" ''.нн\ i Доро>жки 2-5 -1 ндроли* АТР в присутствии препарата пелка ::s( ip время инкубации 5, 10, 15 н 25 минут, соответствен] ¡0. Дорожки (.-9 - гнлролнз АТР в присутствии препарата мутэигного бе.чкзг DJS6A. время инкубздпи 5, 10, 15 и 25 минут, соответственно. Б - то же самое для GTP.

Заряженные аминокислотные остатки практически всегда присутствуют в активных центрах известных СТРаз и AT Раз. Тот факт, что мутагенез некоторых таких заряженных консервативных остатков в Est3p снижает ОТРазную и АТРазную активность белка in vitro, r некоторых случаях убивая ее полностью, и вызывает нарушение процесса удлинения теломер in vivo, указывает на важность свойства ЕйЗр катализировать гидролиз нуклеоэидгрифосфатов для работы теломеразного комплекса.

ВЫВОДЫ

1 Компонент теломеразного комплекса дрожжей 5ассИаготусея сеп'у/хше белок

ЕзтЗр образует томодимер т \>Иго. 2. Белок ЕяЗр связывается с РНК- и ДНК-олигонукпеатцдами с тело мерной

последовательностью. 3 Белок Е$13р специфически узнает и раскручивает РНК/ДИК гибридные дуплексы.

4. Белок Ез13р обладает ОТ Разной и АТРазнон активностями

5, Летальная мутация ВЙ6А а белке ЕьгЗр приводит к потере С/ТРазной и АТРгож.й активности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЬК ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Sharanov Y S, Zvereva МI, Donlsova О А (2006) Saccharomyces cerevisiae telomerase subumt Est3p binds DNA and RNA and stimulates unwinding of RNA/DNA heteroduplexes FEBSLett, 580: 4683-4690

2 Шаранов Ю С , Смекалова E M, Зверева МЭ, Донцова О А_ (2007) Выделение активного теломеразного белка Est3p и изучение его димеризации in vitro Биохимия, 7: 866-871

3 Dontsova О А, Sharanov Yu S, Zvereva MI Properties of yeast telomerase protein Est3 The 8ft International Engelhardt Conference on Molecular Biology August 19-24, (2006), Buran Conference Center, Moscow Region, Russia, Abstract book, p 43

4 Zvereva MI, Rubtsova M P, Sharanov Y S, Skvortsov D A., Kisseljov F L, Dontsova О A New properties of components of telomerase Telomeres & Telomerase meeting May 2-6, (2007) Cold Spnng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. Abstract book, p 192

5 Смекалова EM, Шаранов ЮС, Зверева МЭ (2007) Исследование белковых компонентов (EST3 и EST2) теломеразного комплекса дрожжей Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2007" С 543

6 Zvereva M.I, Sharanov Y S, Dontsova О А. (2007) Functional properties of telomerase protein Saccharomyces cerevisiae Est3p International Conference Biocatalysis-2007 fundamentals and applications Abstract book, p 26-27

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stprint ru e-mail zakaz@stpnnt ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 18 09 2007 г

Отпечатано в копицентре «СТ ПРИНТ» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус www stprint ru e-mail zakaz@stprint ru тел 939-33-38 Тираж 100 экз Подписано в печать 18 09 2007 г

Содержание.

Список сокращений.

1. Введение.

2. Обзор литературы. Компоненты и регуляция длины теломер почкующихся дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2.1. Структура дрожжевых теломер.

2.1.1 Теломерная ДНК дрожжей.

2.1.2. Субтеломерные области дрожжевых хромосом.

2.1.3. G-богатый одноцепочечный участок на 3'-конце.

2.2. Гены, влияющие на функции теломер.

2.3. Белки, взаимодействующие с G-богатым одноцепочечным участком теломер.

2.3.1. Белок Cdcl3.

2.3.2. Теломеразный комплекс дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

2.3.2.1. Коровый фермент. Tlcl и Est2p.

2.3.2.2. Estlp и Est3p - in vivo регуляторные компоненты теломеразного комплекса.

2.3.3. Гетеродимер Ки.

2.3.4. MRX комплекс.

2.4. Белки, взаимодействующие с двухцепочечным участком теломер.

2.4.1. Белок Rapl и ассоциированные с ним факторы.

2.4.2. Гетеродимер Ки как компонент двухцепочечной области теломер.

2.5. Регуляция структуры теломерного конца.

2.6. Регуляция длины теломер.

2.6.1. Два состояния теломер.

2.6.2. Теломеразное удлиннение G-богатого одноцепочечного участка прочно связано с полимеразным синтезом комплементарной цепи.

2.6.3. Удлиннение теломер в течение клеточного цикла.

2.6.4. Ассоциация компонентов теломеразного комплекса с теломерным хроматином.

2.6.5. Контроль длины теломер с помощью рекомбинации.

2.6.6. Контроль длины теломер с помощью Tell киназы.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Получение белка Est3p с аффинным эпитопом GST.

3.2. Взаимодействие Est3p с рибо- и дезоксирибоолигонуклеотидами.

3.3. Способность Est3p разворачивать дуплексы.

3.4. Влияние мутаций Е104А и 104RE на свойства Est3p.

3.5. Димеризация Est3p.

3.5.1. Белок Est3p с различными аффинными эпитопами HaN- и С-концах.

3.5.2. Образование гомодимера Est3p in vitro.

3.6. СТРазная и АТРазная активности белка Est3p.

На концах линейных хромосом эукариотических организмов находятся особые ДНК-белковые структуры, называемые теломерами. Они поддерживают стабильность хромосом, защищая их от деградации и слияния, участвуют в процессе клеточного старения (сенессенса), играют важную роль в формировании архитектуры ядра, участвуют в регуляции транскрипции прилежащих к ним генов [1]. Но, пожалуй, самой интересной функцией теломер является их работа в качестве своеобразных часов, отсчитывающих количество клеточных делений. Эту гипотезу в 1971 году выдвинул русский ученый A.M. Оловников [2], отметивший, что при каждом акте репликации после удаления с 5'-конца отстающей цепи РНК-затравки должно происходить укорочение теломер. При достижении теломерами некоторой критичной длины клетка входит в состояние сенессенса и погибает. Однако, во многих клетках, для которых природой предусмотрен неограниченный потенциал деления, например, в половых, стволовых клетках, одноклеточных организмах существует механизм поддержания стабильности длины теломер, в основу которого положен синтез теломерной ДНК с помощью специального фермента теломеразы [3]. Теломераза - сложный РНК-белковый комплекс, который состоит из молекулы РНК, обратно-транскриптазной субъединицы и ряда других белковых компонентов [4].

Теломеразная активность характерна для половых, стволовых, зародышевых, а также для раковых клеток [5-7]. Неослабевающий интерес к изучению теломеразного комплекса связан, в первую очередь, с перспективой лечения онкологических заболеваний путем ингибирования теломеразной активности и восстановления механизма контроля числа клеточных делений у раковых клеток. Известно, что такое ингибирование может быть осуществлено как путем воздействия непосредственно на каталитическую субъединицу (ингибиторы - аналоги субстратов) или на теломеразную РНК (антисенс технологии), так и воздействием на регуляторный аппарат теломеразы, который включает в себя ряд сложных и зачастую еще совсем неизученных компонентов.

В случае теломеразы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, таким регуляторным компонентом, о котором очень мало что известно, является белок Est3p. Низшие одноклеточные эукариоты, почкующиеся дрожжи, представляют собой очень удобную для изучения модельную систему, помогающую прояснить многие непонятные моменты в работе теломеразы человека. С уверенностью можно утверждать, что ЕБ13р является компонентом теломеразного комплекса БассИаготусея сегеш1ае [8] и необходим для жизнедеятельности клетки, так как делеция его гена приводит к летальному фенотипу прогрессирующего укорочения теломер [9]. Однако до настоящего времени структура и конкретная функции белка ЕБ13р остаются неизвестными, в связи с чем, этот компонент теломеразного комплекса дрожжей БассИаготусея сегеу1я1ае вызывает огромный интерес у исследователей. Данная работа посвящена разработке метода выделения белка Еэ13р и изучению его биохимических свойств.

5. Выводы.

1. Компонент теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae белок Est3p образует гомодимер in vitro.

2. Белок Est3p связывается с РНК- и ДНК-олигонуклеотидами с теломерной последовательностью.

3. Белок Est3p специфически узнает и раскручивает РНК/ДНК гибридные дуплексы.

4. Белок Est3p обладает СТРазной и АТРазной активностями.

5. Летальная мутация D86A в белке Est3p приводит к потере СТРазной и АТРазной активности.

3.7. Заключение.

Схема работы теломеразного комплекса включает в себя несколько этапов: а) связывание теломеразного комплекса с теломерным концом, б) элонгацию, в) транслокацию и г) диссоциацию (рис.25). Исходя из полученных в настоящей работе данных о новых свойствах белка Est3p, можно выдвинуть ряд предположений о возможной функции этого компонента теломеразного комплекса на той или иной стадии работы фермента.

Рисунок 25. Схема удлинения тедомерной ДНК тсломеразой.

Тот факт, что Е^13р с наибольшей эффективностью связываегся с О-богатыми олигонуклеотидами, позволяет высказать предположение, что в клетке этот компонент теломеразного комплекса может связываться с 3'-концом теломер. Возможно, с помощью этого связывания Ей13р освобождает О-богатый одноцепочечный участок от кзппруюших его белков и помогает теломеразе получить доступ к самому концу тело меры.

ЕэгЗр с довольно высокой эффективностью связывается с рнбоолигонуклеотидом К2. Этот олигонуклеотид является наиболее предпочтительным субстратом из всех протестированных одноцепочечных РНК и ДНК В последовательности К2 содержится участок 1ГС1Юи. который присутствует и в последовательности теломеразной РНК ТЬС1 (1082-1086). Этот участок* присутствует во всех известных дрожжевых теломеразяых Р1ГК и находится в частично не спаренном структурном элементе [111]. Исходя из всего этого, можно сделать предположение, что ЕьгЗр способен взаимодействовать с теломеразной РНК напрямую Тот факт, что скорее вызывает формирование РНК/РНК дуплексов, чем их диссоциацию, позволяет предположить, что, возможно, этот белок неким образом участвует в процессе правильного сворачивания теломеразной РНК во время сборки теломеразного комплекса.

Способность Est3p разворачивать ДНК/РНК гетеродуплексы может быть использована в процессе удлинения теломер теломеразным комплексом на стадии транслокации и влиять на процессивность этого комплекса. После синтеза теломеразой одного повтора образуется длинный комплементарный дуплекс теломерной ДНК с матричным участком теломеразной РНК, который должен быть хотя бы частично расплетен для того, чтобы синтез мог продолжаться. Известно, что теломераза дрожжей Saccharomyces cerevisiae способна синтезировать довольно протяженную теломерную ДНК in vivo [37], однако in vitro реконструированный фермент, состоящий только из TLC1 и Est2p добавляет к теломер-подобному праймеру всего один повтор [217]. В большинстве случаев дрожжевой теломеразный комплекс выделенный из клеточного экстракта с помощью ион-обменной [132] или аффинной [217, 218] хроматографии также способен синтезировать только один теломерный повтор. Возможно, во всех этих случаях какие-то белковые компоненты, необходимые теломеразному комплексу, в том числе и Est3p, просто теряются во время его выделения.

Ранее было показано, что N-концевой домен обратно-транскриптазной субъединицы теломеразного комплекса Tetrahymena Thermophila способен связываться с ДНК и РНК [219, 220], а похожий домен человеческой теломеразной обратной транскриптазы [203] необходим для процессивной работы теломеразного комплекса [218]. Возможно, что белок Est3p с его способностью взаимодействовать с ДНК и РНК и раскручивать ДНК/РНК гетеродуплексы выполняет ту же функцию, что и N-концевые домены каталитической субъеденицы в других теломеразах.

Способность раскручивать ДНК/РНК гетеродуплексы не исключает также возможности участия белка Est3p в завершающей стадии синтеза теломерной ДНК -диссоциации теломеразного комплекса.

На какой именно стадии работы теломеразы и как используется взаимодействие Est3p с ДНК и РНК, раскручивание этим белком ДНК/РНК гетеродуплексов, гидролиз GTP и АТР. Как точно устроен активный центр Est3p и каковы детали его функционирования, на все эти, а также на многие другие вопросы, касающиеся этого интересного компонента теломеразного комплекса дрожжей, еще предстоит ответить в ходе дальнейших исследований.

4. Материалы и методы.

4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы.

В работе были использованы следующие реактивы и препараты:

- NaCl, NaOAc, Na2HP04, КН2Р04, KCl, КОАс, MgCl2, Mg(OAc)2, CaCl2, MnCl2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, H3BO3, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, имидазол, глицерин фирмы Merk, Германия;

- ДСН, акриламид, МД^'-метиленбисакриамид, ТЕМЕД, Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия;

- уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, фирмы Химмед, Россия;

- водонасьиценный фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германия;

- этанол фирмы Ферейн, Россия;

- LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ИПТГ, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол фирмы Sigma, Германия;

- полиэтиленгликоль 6000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия;

- бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, мочевина фирмы Difco, США;

- амициллин, канамицин, хлорамфеникол фирмы Invitrogen, США;

- легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies, Шотландия;

- [a-32P]dGTP, [у-32Р]АТР, [y-32P]GTP [a-32P]ATP, [a-32P]GTP фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, США;

- T4 ДНК-лигаза, Т4 ДНК-полимераза, Taq-полимераза, эндонуклеазы рестрикции ЕсоШ, Smal, Sphl, Nhel, Hindill, Ncol, Eagl фирмы MBI Fermentas, Литва; экзонуклеаза Exolll фирмы New England Biolabs, Великобритания;

- олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол, Россия и фирмой Sigma, Великобритания;

- Ni-NTA агароза, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Qiagen, Германия;

- суммарная тРНК, мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, Amersham-Pharmacia Biotech, США;

- набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Германия;

- секвеназа 2.0 фирмы USB Corporation, США;

- первичные антитела мыши против шести гистидинов, первичные антитела мыши против, вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (HRP-anti-mouse) фирмы Promega, США.

- фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta, Германия;

- паластинки для тонкослойной хроматографии с PEI-целлюлозным покрытием фирмы Macherey-Nagel, Германия;

- плазмида рЕЗ была любезно предоставлена Петровым A.B.

1. Blackburn, Е.Н. (1991) Structure and Function of Telomeres. Nature 350: 569-572.

2. Оловников, A.M. (1971) Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. АН СССР 201:1496-1499.

3. Greider, C.W., and Blackburn, Е.Н. (1985) Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 43:405-413.

4. Collins, K. (2000) Mammalian Telomeres and Telomerase. Curr. Op. Cell Biol. 12: 378-383.

5. Harley, C.B., Futcher, A.B., and Greider, C.W. (1990) Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. Nature 345:458-460.

6. Vaziri, H., Dragowska, W., Allsopp, R.C., Thomas, Т.Е., Harley, C.B., and Landsdorp, P.M. (1994) Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9857-9860.

7. Hughes, T.R., Evans, S.R., Weilbaecher, R.G., and Lundbland, V. (2000) The Est3 protein is subunit of yeast telomerase. Curr. Biol. 10: 809-812.

8. Lingner, J., Cech, T.R., Hughes, T.R., and Lundbland, V. (1997) Three Ever Shorter Telomere (EST) genes are dispensable for in vitro yeast telomerase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11190-11195.

9. Szostak, J.W., and Blackburn, E.H. (1982) Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell 29:245-255.

10. Dunn, В., Szauter, P., Pardue, M.L., and Szostak, J.W. (1984) Transfer of yeast telomeres to linear plasmids by recombination. Cell 39:191-201.

11. Horowitz, H., and Haber, J.E. (1985) Identification of autonomously replicating circular subtelomeric Y' elements in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 5: 2369-2380.

12. Pluta, A.F., Dani, G.M., Spear, B.B., and Zakian, V.A. (1984) Elaboration of telomeres in yeast: recognition and modification of termini from Oxytricha macronuclear DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1475-1479.

13. Carson, M.J., and Hartwell, L. (1985) CDC 17: an essential gene that prevents telomere elongation in yeast. Cell 42:249-57.

14. Lustig, A.J., and Petes, T.D. (1986) Identification of yeast mutants with altered telomere structure. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:1398-1402.

15. Meyne, J., Ratliff, R.L., and Moyzis, R.K. (1989) Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:7049-7053.

16. Higashiyama, T., Maki, S., and Yamada, T. (1995) Molecular organization of Chlorella vulgaris chromosome I: presence of telomeric repeats that are conserved in higher plants. Mol. Gen. Genet. 246:29-36.

17. Richards, E.J., and Ausubel, F.M. (1988) Isolation of a higher eukaryotic telomere from Arabidopsis thaliana. Cell 53:127-136.

18. Shakirov, E.V., and Shippen, D.E. (2004) Length regulation and dynamics of individual telomere tracts in wild-type Arabidopsis. Plant Cell 16:1959-1967.

19. Fajkus, J., Kovarik, A., Kralovics, R., and Bezdek, M. (1995) Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant Nicotiana tabacum. Mol. Gen. Genet. 247:633-638.

20. Blackburn, E.H., and Gall, J.G. (1978) A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J. Mol. Biol. 120:33-53.

21. Shampay, J., Szostak, J.W., and Blackburn, E.H. (1984) DNA sequences of telomeres maintained in yeast. Nature 310:154-157.

22. Wang, S.S., and Zakian, V.A. (1990) Sequencing of Saccharomyces telomeres cloned using T4 DNA polymerase reveals two domains. Mol. Cell Biol. 10:4415-4419.

23. Singer, M.S., and Gottschling, D.E. (1994) TLC1: template RNA component of Saccharomyces cerevisiae telomerase. Science 266:404-409.

24. Prescott, J., and Blackburn, E.H. (1997) Functionally interacting telomerase RNAs in the yeast telomerase complex. Genes Dev. 11:2790-2800.

25. Prescott, J., and Blackburn, E.H. (1997) Telomerase RNA mutations in Saccharomyces cerevisiae alter telomerase action and reveal nonprocessivity in vivo and in vitro. Genes Dev. 11:528-540.

26. Forstemann, K., Hoss, M., and Lingner, J. (2000) Telomerase-dependent repeatdivergence at the 31 ends of yeast telomeres. Nucleic Acids Res. 28:2690-2694.

27. Forstemann, K., and Lingner, J. (2001) Molecular basis for telomere repeat divergence in budding yeast. Mol. Cell Biol. 21: 7277-7286.

28. Forstemann, K., and Lingner, J. (2005) Telomerase limits the extent of base pairing between template RNA and telomeric DNA. EMBO Rep. 6: 361-366.

29. Cohn, M., McEachern, M.J., and Blackburn, E.H. (1998) Telomeric sequence diversity within the genus Saccharomyces. Curr. Genet. 33: 83-91.

30. McEachern, M.J., and Hicks, J.B. (1993) Unusually large telomeric repeats in the yeast Candida albicans. Mol. Cell Biol. 13: 551-560.

31. McEachern, M.J., and Blackburn, E.H. (1994) A conserved sequence motif within the exceptionally diverse telomeric sequences of budding yeasts. Proc. Natl Acad. Sci. USA 91: 3453-3457.

32. Sugawara, N. 1998 DNA sequences at the telomeres of fission yeast S.pombe. Ph.D. thesis, Harvard University, Cambridge, Massachusetts.

33. Mitton-Fry, R.M., Anderson, E.M., Theobald, D.L., Glustrom, L.W., and Wuttke, D.S. (2004) Structural basis for telomeric single-stranded DNA recognition by yeast Cdcl3. J. Mol. Biol. 338:241-255.

34. Konig, P., and Rhodes, D. (1997) Recognition of telomeric DNA. Trends Biochem. Sci. 22:43-47.

35. Teixeira, M.T., Arneric, M., Sperisen, P., and Lingner, J. (2004) Telomere length homeostasis is achieved via a switch between telomerase- extendible and -nonextendible states. Cell 117:323-335.

36. Horowitz, H., Thorburn, P., and Haber, J.E. (1984) Rearrangements of highly polymorphic regions near telomeres of Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 4: 2509-2517.

37. Walmsley, R.W., Chan, C.S., Tye, B.K., and Petes, T.D. (1984) Unusual DNA sequences associated with the ends of yeast chromosomes. Nature 310:157-160.

38. Shampay, J., and Blackburn, E.H. (1988) Generation of telomere-length heterogeneity in Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 534-538.

39. Craven, R.J., and Petes, T.D. (1999) Dependence of the regulation of telomere length on the type of subtelomeric repeat in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics 152:1531-1541.

40. Chan, C.S., and Tye, B.K. (1983) A family of Saccharomyces cerevisiae repetitive autonomously replicating sequences that have very similar genomic environments. J.1. Mol. Biol. 168:505-523.

41. Chan, C.S., and Tye, B.K. (1983) Organization of DNA sequences and replication origins at yeast telomeres. Cell 33: 563-573.

42. Louis, E.J. (1995) The chromosome ends of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 11: 1553-1573.

43. Murray, A.W., and Szostak, J.W. (1983) Construction of artificial chromosomes in yeast. Nature 305:189-193.

44. Pryde, F.E., and Louis, E.J. (1999) Limitations of silencing at native yeast telomeres. EMBOJ. 18:2538-2550.

45. Pryde, F.E., and Louis, E.J. (1997) Saccharomyces cerevisiae telomeres. A review. Biochemistry 62:1232-1241.

46. Lundblad, V., and Blackburn, E.H. (1993) An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues estl- senescence. Cell 73:347-360.

47. Makarov, V.L., Hirose, Y., and Langmore, J.P. (1997) Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. Cell 88: 657-666.

48. Wellinger, R.J., Wolf, A. J., and Zakian, V.A. (1993) Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase. Cell 72:51-60.

49. Larrivee, M., LeBel, C., and Wellinger, RJ. (2004) The generation of proper constitutive G-tails on yeast telomeres is dependent on the MRX complex. Genes Dev. 18:1391-1396.

50. Griffith, J.D., Comeau, L., Rosenfield, S., Stansel, R.M., Bianchi, A., Moss, H., and de Lange, T. (1999) Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97:503-514.

51. Tomaska, L., Willcox, S., Slezakova, J., Nosek, J., and Griffith, J.D. (2004) Tazl binding to a fission yeast model telomere: formation of telomeric loops and higher order structures. J. Biol. Chem. 279: 50764-50772.

52. Shore, D., and Nasmyth, K. (1987) Purification and cloning of a DNA binding protein from yeast that binds to both silencer and activator elements. Cell 51: 721-732.

53. Lustig, A.J., Kurtz, S., and Shore, D. (1990) Involvement of the silencer and UAS binding protein RAP1 in regulation of telomere length. Science 250:549-553.

54. Nugent, C.I., Hughes, T.R., Lue, N.F., and Lundblad, V. (1996) Cdcl3p: a singlestrand telomeric DNA-binding protein with a dual role in yeast telomere maintenance. Science 274:249-252.

55. Runge, K.W., and Zakian, V.A. (1996) TEL2, an essential gene required for telomere length regulation and telomere position effect in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol 16: 3094-3105.

56. Grandin, N., Reed, S.I., and Charbonneau, M. (1997) Stnl, a new Saccharomyces cerevisiae protein, is implicated in telomere size regulation in association with Cdcl3. Genes Dev. 11:512-527.

57. Grossi, S., Puglisi, A., Dmitriev, P.V., Lopes, M., and Shore, D. (2004) Pol 12, the B subunit of DNA polymerase alpha, functions in both telomere capping and length regulation. Genes Dev. 18: 992-1006.

58. Garvik, B., Carson, M., and Hartwell, L. (1995) Single-stranded DNA arising at telomeres in cdcl3 mutants may constitute a specific signal for the RAD9 checkpoint. Mol. Cell. Biol. 15:6128-6138.

59. Booth, C., Griffith, E., Brady, G., and Lydall, D. (2001) Quantitative amplification of single-stranded DNA (QAOS) demonstrates that cdcl3-l mutants generate ssDNA in a telomere to centromere direction. Nucleic Acids Res. 29:4414-4422.

60. Hackett, J.A., Feldser, D.M., and Greider, C.W. (2001) Telomere dysfunction increases mutation rate and genomic instability. Cell 106:275-286.

61. Craven, R.J., Greenwell, P.W., Dominska, M., and Petes, T.D. (2002) Regulation of genome stability by TEL1 and MEC1, yeast homologs of the mammalian ATM and ATR genes. Genetics 161:493-507.

62. Chan, S.W., and Blackburn, E.H. (2003) Telomerase and ATM/Tellp protect telomeres from nonhomologous end joining. Mol. Cell 11:1379-1387.

63. Hackett, J.A., and Greider, C.W. (2003) End resection initiates genomic instability in the absence of telomerase. Mol. Cell Biol. 23: 8450-8461.

64. Mieczkowski, P.A., Mieczkowska, J.O., Dominska, M., and Petes, T.D. (2003) Genetic regulation of telomere-telomere fusions in the yeast Saccharomyces cerevisae.

65. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10854-10859.

66. Hartwell, L.H., Mortimer, R.K., Culotti, J., and Culotti, M. (1973) Genetic Control of the Cell Division Cycle in Yeast: V. Genetic Analysis of cdc Mutants. Genetics 74: 267-286.

67. Weinert, T.A., and Hartwell, L.H. (1993) Cell cycle arrest of cdc mutants and specificity of the RAD9 checkpoint. Genetics 134:63-80.

68. Lydall, D., and Weinert, T. (1995) Yeast checkpoint genes in DNA damage processing: implications for repair and arrest. Science 270:1488-1491.

69. Grandin, N., Damon, C., and Charbonneau, M. (2001) Tenl functions in telomere end protection and length regulation in association with Stnl and Cdcl3. EMBO J. 20: 1173-1183.

70. Pennock, E., Buckley, K., and Lundblad, V. (2001) Cdcl3 delivers separate complexes to the telomere for end protection and replication. Cell 104: 387-396.

71. Evans, S.K., and Lundblad, V. (2000) Positive and negative regulation of telomerase access to the telomere. J. Cell Sci. 19:3357-3364.

72. Lendvay, T.S., Morris, D.K., Sah, J., Balasubramanian, B., and Lundblad, V. (1996) Senescence mutants of Saccharomyces cerevisiae with a defect in telomere replication identify three additional EST genes. Genetics 144:1399-1412.

73. Evans, S.K., and Lundblad, V. (1999) Estl and Cdcl3 as comediators of telomerase access. Science 286:117-120.

74. Bianchi, A., Negrini, S., and Shore, D. (2004) Delivery of yeast telomerase to a DNA break depends on the recruitment functions of Cdcl3 and Estl. Mol. Cell 16:139-146.

75. Chandra, A., Hughes, T.R., Nugent, C.I., and Lundblad, V. (2001) Cdcl3 both positively and negatively regulates telomere replication. Genes Dev. 15:404-414.

76. Qi, H., and Zakian, V.A. (2000) The Saccharomyces Telomere-Binding Protein Cdcl3p Interacts With Both the Catalytic Subunit of DNA Polymerase a and the Telomerase-Associated Estl Protein Genes Dev. 14:1777-1788.

77. Mitton-Fry, R.M., Anderson, E.M., Hughes, T.R., Lundblad, V., and Wuttke, D.S. (2002) Conserved structure for single-stranded telomeric DNA recognition. Science 296:145-147.

78. Murzin, A.G. (1993) OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J. 12: 861867.

79. Horvath, M.P., Schweiker, V.L., Bevilacqua, J.M., Ruggles, J.A., and Schultz, S.C.1998) Crystal structure of the Oxytricha nova telomere end binding protein complexed with single strand DNA. Cell 95:963-974.

80. Lei, M., Podell, E.R., Baumann, P., and Cech, T.R. (2003) DNA self-recognition in the structure of Potl bound to telomeric single-stranded DNA. Nature 426:198-203.

81. Theobald, D.L., Cervantes, R.B., Lundblad, V., and Wuttke, D.S. (2003) Homology among telomeric end-protection proteins. Structure 11:1049-1050.

82. Theobald, D.L., and Wuttke, D.S. (2004) Prediction of multiple tandem OB-fold domains in telomere end-binding proteins Potl and Cdcl3. Structure 12:1877-1879.

83. Taggart, A.K., Teng, S.C., and Zakian, V.A. (2002) Estlp as a cell cycle-regulated activator of telomere-bound telomerase. Science 297:1023-1026.

84. Schramke, V., Luciano, P., Brevet, V., Guillot, S., Corda, Y., Longhese, M.P., Gilson, E., and Geli, V. (2004) RPA regulates telomerase action by providing Estlp access to chromosome ends. Nat. Genet. 36:46-54.

85. Fisher, T.S., Taggart, A.K., and Zakian, V.A. (2004) Cell cycle-dependent regulation of yeast telomerase by Ku. Nat. Struct. Mol. Biol. 11:1198-1205.

86. Baumann, P., and Cech, T.R. (2001) Potl, the putative telomere end-binding protein in fission yeast and humans. Science 292:1171-1175.

87. Greider, C.W., and Blackburn, E.H. (1989) A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature 337:331-337.

88. Lingner, J., and Cech, T.R. (1996) Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10712-10717.

89. Witkin, K.L., and Collins, K. (2004) Holoenzyme proteins required for the physiological assembly and activity of telomerase. Genes Dev. 18:1107-1118.

90. Lundblad, V., and Szostak, J.W. (1989) A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell 57: 633-643.

91. Singer, M.S., Kahana, A., Wolf, A.J., Meisinger, L.L., Peterson, S.E., Goggin, C., Mahowald, M., and Gottschling, D.E. (1998) Identification of high-copy disruptors of telomeric silencing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 150: 613-632.

92. Diede, S.J., and Gottschling, D.E. (1999) Telomerase-mediated telomere addition in vivo requires DNA primase and DNA polymerases alpha and delta. Cell 99: 723-733.

93. Friedman, K.L., Heit, J.J., Long, D.M., and Cech, T.R. (2003) N-terminal domain of yeast telomerase reverse transcriptase: recruitment of Est3p to the telomerase complex. Mol. Biol. Cell 14:1-13.

94. Marcand, S., Brevet, V., and Gilson, E. (1999) Progressive cis-inhibition of telomerase upon telomere elongation. EMBOJ. 18: 3509-3519.

95. Singh, S.M., Steinberg-Neifach, O., Mian, I.S., and Lue, N.F. (2002) Analysis of telomerase in Candida albicans: potential role in telomere end protection. Eukaryot Cell 1: 967-977.

96. Steinberg-Neifach, O., and Lue, N.F. (2006) Modulation of telomere terminal structure by telomerase components in Candida albicans. Nucleic. Acids Res. 34:2710-2722.

97. Bhattacharyya, A., and Blackburn, E.H. (1997) A functional telomerase RNA swap in vivo reveals the importance of nontemplate RNA domains. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:2823-2827.

98. Roy, J., Fulton, T.B., and Blackburn, E.H. (1998) Specific telomerase RNA residues distant from the template are essential for telomerase function. Genes Dev. 12: 3286-3300.

99. McCormick-Graham, M., and Romero, D.P. (1995) Ciliate telomerase RNA structural features. Nucleic Acids Res. 23:1091-1097.

100. McEachern, M.J., and Blackburn, E.H. (1995) Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. Nature 376:403-409.

101. Blasco, M.A., Funk, W., Villeponteau, B., and Greider, C.W. (1995) Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA. Science 269: 1267-1270.

102. Tsao, D.A., Wu, C.W., and Lin, Y.S. (1998) Molecular cloning of bovine telomerase RNA. Gene 221: 51-58.

103. Ares, M.Jr. (1986) U2 RNA from yeast is unexpectedly large and contains homology to vertebrate U4, U5, and U6 small nuclear RNAs. Cell 47:49-59.

104. Chen, J.L., and Greider, C.W.(2004) An emerging consensus for telomerase RNA structure. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101:14683-14684.

105. Lustig, A. J. (2004) Telomerase RNA: a flexible RNA scaffold for telomerase biosynthesis. Curr. Biol. 14: 565-567.

106. Ly, H., Blackburn, E.H., and Parslow, T.G. (2003) Comprehensive structure-function analysis of the core domain of human telomerase RNA. Mol. Cell Biol. 23:6849-6856.

107. Zappulla, D.C., and Cech, T.R. (2004) Yeast telomerase RNA: a flexible scaffold for protein subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 10024-10029.

108. Dandjinou, A.T., Levesque, N., Larose, S., Lucier, J.F., Abou Elela, S., and Wellinger, R. J. (2004) A phylogenetically based secondary structure for the yeast telomerase RNA. Curr. Biol. 14:1148-1158.

109. Livengood, A.J., Zaug, A.J., and Cech, T.R. (2002) Essential regions of Saccharomyces cerevisiae telomerase RNA: separate elements for Estlp and Est2p interaction. Mol. Cell Biol. 22: 2366-231A.

110. Seto, A.G., Livengood, A.J., Tzfati, Y., Blackburn, E.H., and Cech, T.R. (2002) A bulged stem tethers Estlp to telomerase RNA in budding yeast. Genes Dev. 16: 2800-2812.

111. Seto, A.G., Zaug, A.J., Sobel, S.G., Wolin, S.L., and Cech, T.R. (1999) Saccharomyces cerevisiae telomerase is an Sm small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature 401:177-180.

112. Peterson, S.E., Stellwagen, A.E., Diede, S.J., Singer, M.S., Haimberger, Z.W., Johnson, C.O., Tzoneva, M., and Gottschling, D.E. (2001) The function of a stem-loop in telomerase RNA is linked to the DNA repair protein Ku. Nat. Genet. 27: 64-67.

113. Stellwagen, A.E., Haimberger, Z.W., Veatch, J.R., and Gottschling, D.E. (2003) Ku interacts with telomerase RNA to promote telomere addition at native and broken chromosome ends. Genes Dev. 17:2384-2395.

114. Will, C.L., and Luhrmann, R. (2001) Spliceosomal UsnRNP biogenesis, structure and function. Curr. Opin. Cell Biol. 13:290-301.

115. Henning, K.A., Moskowitz, N., Ashlock, M.A., and Liu, P.P. (1998) Humanizing the yeast telomerase template. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 5667-5671.

116. Tzfati, Y., Fulton, T.B., Roy, J., and Blackburn, E.H. (2000) Template boundary in a yeast telomerase specified by RNA structure. Science 288: 863-867.

117. Tzfati, Y., Knight, Z., Roy, J., and Blackburn, E.H. (2003) A novel pseudoknot element is essential for the action of a yeast telomerase. Genes Dev. 17:1779-1788.

118. Chen, J.L., Blasco, M.A., and Greider, C.W. (2000) Secondary structure ofvertebrate telomerase RNA. Cell 100: 503-514.

119. Chapon, C., Cech, T.R. and Zaug, A.J. (1997) Polyadenylation of telomerase RNA in budding yeast. RNA 3:1337-1351.

120. Prowse, K.R., Avilion, A. A., and Greider, C.W. (1993) Identification of a nonprocessive telomerase activity from mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1493-1497.

121. Lingner, J., Hughes, T.R., Shevchenko, A., Mann, M., Lundblad, V., and Cech, T.R. (1997) Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science 276:561-567.

122. Kelleher, C., Teixeira, M.T., Forstemann, K., and Lingner, J. (2002) Telomerase: biochemical considerations for enzyme and substrate. Trends Biochem. Sci. 27: 572-579.

123. Friedman, K.L., and Cech, T.R. (1999) Essential functions of amino-terminal domains in the yeast telomerase catalytic subunit revealed by selection for viable mutants. Genes Dev. 13:2863-2874.

124. Peng, Y., Mian, I.S. and Lue, N.F. (2001) Analysis of telomerase processivity: mechanistic similarity to HIV-1 reverse transcriptase and role in telomere maintenance. Mol. Cell 7:1201-1211.

125. Lue, N.F., Lin, Y.C. and Mian, I.S. (2003) A conserved telomerase motif within the catalytic domain of telomerase reverse transcriptase is specifically required for repeat addition processivity. Mol. Cell Biol. 23: 8440-8449.

126. Teixeira, M.T., Forstemann, K., Gasser, S.M., and Lingner, J. (2002) Intracellular trafficking of yeast telomerase components. EMBO Rep. 3:652-659.

127. Cohn, M., and Blackburn, E.H. (1995) Telomerase in yeast. Science 269: 396400.

128. Virta-Pearlman, V., Morris, D.K., and Lundblad, V. (1996) Estl has the properties of a single-stranded telomere end-binding protein. Genes Dev. 10:30943104.

129. Zhou, J., Hidaka, K., and Futcher, B. (2000) The Estl subunit of yeast telomerase binds the Tlcl telomerase RNA. Mol. Cell Biol. 20:1947-1955.

130. Evans, S.K., and Lundblad, V. (2002) The Estl subunit of Saccharomyces cerevisiae telomerase makes multiple contributions to telomere length maintenance. Genetics 162:1101-1115.

131. Clissold, P.M., and Ponting, C.P. (2000) PIN domains in nonsense-mediatedmRNA decay and RNAi. Curr. Biol. 10: 888-890.

132. Beernink, H.T., Miller, K., Deshpande, A., Bucher, P., and Cooper, J.P. (2003) Telomere maintenance in fission yeast requires an Estl ortholog. Curr. Biol. 13: 575580.

133. Reichenbach, P., Hoss, M., Azzalin, C.M., Nabholz, M., Bucher, P., and Lingner, J. (2003) A human homolog of yeast Estl associates with telomerase and uncaps chromosome ends when overexpressed. Curr. Biol. 13: 568-574.

134. Snow, B.E., Erdmann, N., Cruickshank, J., Goldman, H., Gill, R.M., Robinson, M.O., and Harrington, L. (2003) Functional conservation of the telomerase protein Estlp in humans. Curr. Biol. 13:698-704.

135. D'Andrea, L.D., and Regan, L. (2003) TPR proteins: the versatile helix. Trends Biochem. Sci. 28: 655-662.

136. Singh, S,M„ and Lue, N.F. (2003) Ever shorter telomere 1 (ESTl)-dependent reverse transcription by Candida telomerase in vitro: evidence in support of an activating function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5718-5723.

137. Morris, D.K., and Lundblad, V. (1997) Programmed translational frameshifting in a gene required for yeast telomere replication. Curr. Biol. 7: 969-976.

138. Taliaferro, D., and Farabaugh, P.J. (2007) An mRNA sequence derived from the yeast EST3 gene stimulates programmed +1 translational frameshifting. RNA 13: 606-613.

139. Clare, J.J., Belcourt, M., and Farabugh, P.J. (1998) Efficient translation frameshifting occurs within a conserved sequence of overlap between the two genes of yeast Tyl transposon Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6816-6820.

140. Belcourt, M., and Farabugh, P.J. (1990) Ribosomal frameshifting in the yeast retrotransposon Ty: tRNAs induce slippage on 7 nucleotide minimal site Cell 62:339352.

141. Voytas, D.F., and Boeke, J.D. (1993) Yeast retrotransposon and tRNAs Trends Genet. 9:421-427.

142. Downs, J.A., and Jackson, S.P. (2004) A means to a DNA end: the many roles of Ku. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5:367-378.

143. Tuteja, R., and Tuteja, N. (2000) Ku autoantigen: a multifunctional DNA-binding protein. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 35:1-33.

144. Boulton, S.J., and Jackson, S.P. (1998) Components of the Ku-dependent nonhomologous end-joining pathway are involved in telomeric length maintenance andtelomeric silencing. EMBO J. 17: 1819-1828.

145. Laroche, T., Martin, S.G., Gotta, M., Gorham, H.C., Pryde, F.E., Louis, E.J., and Gasser, S.M. (1998) Mutation of yeast Ku genes disrupts the subnuclear organization of telomeres. Curr. Biol. 8:653-656.

146. Hediger, F., Neumann, F.R., Van Houwe, G., Dubrana, K., and Gasser, S.M. (2002) Live imaging of telomeres: yKu and Sir proteins define redundant telomere-anchoring pathways in yeast. Curr. Biol. 12:2076-2089.

147. Boulton, S.J., and Jackson, S.P. (1996) Identification of a Saccharomyces cerevisiae Ku80 homologue: roles in DNA double strand break rejoining and in telomeric maintenance. Nucleic Acids Res. 24:4639-4648.

148. Porter, S.E., Greenwell, P.W., Ritchie, K.B., and Petes, T.D. (1996) The DNA-binding protein Hdflp (a putative Ku homologue) is required for maintaining normal telomere length in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 24: 582-585.

149. Gravel, S., Larrivee, M., Labrecque, P., and Wellinger, R.J. (1998) Yeast Ku as a regulator of chromosomal DNA end structure. Science 280: 741-744.

150. Polotnianka, R.M., Li, J., and Lustig, A.J. (1998) The yeast Ku heterodimer is essential for protection of the telomere against nucleolytic and recombinational activities. Curr. Biol. 8: 831-834.

151. Walker, J.R., Corpina, R.A., and Goldberg, J. (2001) Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair. Nature 412:607-614.

152. Kramer, K.M., and Haber, J.E. (1993) New telomeres in yeast are initiated with a highly selected subset of TGI-3 repeats. Genes Dev. 7:2345-2356.

153. Kolodner, R.D., Putnam, C.D., and Myung, K. (2002) Maintenance of genome stability in Saccharomyces cerevisiae. Science 297:552-557.

154. Chen, C., and Kolodner, R.D. (1999) Gross chromosomal rearrangements in Saccharomyces cerevisiae replication and recombination defective mutants. Nat. Genet. 23: 81-85.

155. Myung, K., Datta, A., and Kolodner, R.D. (2001) Suppression of spontaneous chromosomal rearrangements by S phase checkpoint functions in Saccharomyces cerevisiae. Cell 104:397-408.

156. Bertuch, A.A., and Lundblad, V. (2004) EXOl contributes to telomere maintenance in both telomerase-proficient and telomerase-deficient Saccharomyces cerevisiae. Genetics 166:1651-1659.

157. Maringele, L., Lydall, D. (2002) EXO1 -dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Delta mutants. Genes Dev. 16:1919-1933.

158. Moreau, S., Morgan, E.A., and Symington, L.S. (2001) Overlapping functions of the Saccharomyces cerevisiae Mrel 1, Exol and Rad27 nucleases in DNA metabolism. Genetics 159:1423-1433.

159. Bertuch, A. A., and Lundblad, V. (2003) The Ku heterodimer performs separable activities at double-strand breaks and chromosome termini. Mol. Cell Biol. 23: 8202-8215.

160. Cosgrove, A.J., Nieduszynski, C.A., and Donaldson, A.D. (2002) Ku complex controls the replication time of DNA in telomere regions. Genes Dev. 16:2485-2490.

161. Dionne, I., and Wellinger, R.J. (1998) Processing of telomeric DNA ends requires the passage of a replication fork. Nucleic Acids Res. 26: 5365-5371.

162. Stracker, T.H., Theunissen, J.W., Morales, M„ and Petrini, J.H. (2004) The Mrel 1 complex and the metabolism of chromosome breaks: the importance of communicating and holding things together. DNA Repair. (Amst.) 3: 845-854.

163. Lichten, M. (2005) Rad50 connects by hook or by crook. Nat. Struct. Mol. Biol. 12:392-393.

164. Kironmai, K.M., and Muniyappa, K. (1997) Alteration of telomeric sequences and senescence caused by mutations in RAD50 of Saccharomyces cerevisiae. Genes Cells 2:443-455.

165. Nugent, C.I., Bosco, G., Ross, L.O., Evans, S.K., Salinger, A.P., Moore, J.K., Haber, J.E., and Lundblad, V. (1998) Telomere maintenance is dependent on activities required for end repair of double-strand breaks. Curr. Biol. 8: 657-660.

166. Ritchie, K.B., and Petes, T.D. (2000) The Mrel Ip/Rad50p/Xrs2p complex and the Tellp function in a single pathway for telomere maintenance in yeast. Genetics 155:475-479.

167. Diede, S.J., and Gottschling, D.E. (2001) Exonuclease activity is required for sequence addition and Cdcl3p loading at a de novo telomere. Curr. Biol. 11:13361340.

168. Tsukamoto, Y., Taggart, A.K., and Zakian, V.A. (2001) The role of the Mrel 1-Rad50-Xrs2 complex in telomerase- mediated lengthening of Saccharomyces cerevisiae telomeres. Curr. Biol. 11:1328-1335.

169. Lewis, L.K., Karthikeyan, G., Westmoreland, J. W„ and Resnick, M.A. (2002)

170. Differential suppression of DNA repair deficiencies of Yeast rad50, mrel 1 and xrs2 mutants by EXOl and TLC1 (the RNA component of telomerase). Genetics 160:4962.

171. Li, B., and Lustig, A.J. (1996) A novel mechanism for telomere size control in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10:1310-1326.

172. Bucholc, M., Park, Y., and Lustig, A.J. (2001) Intrachromatid excision of telomeric DNA as a mechanism for telomere size control in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 21:6559-6573.

173. Takata, H., Tanaka, Y., and Matsuura, A. (2005) Late S phase-specific recruitment of Mrel 1 complex triggers hierarchical assembly of telomere replication proteins in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell 17:573-583.

174. Konig, P., Giraldo, R., Chapman, L., and Rhodes, D. (1996) The crystal structure of the DNA-binding domain of yeast RAP1 in complex with telomeric DNA. Cell 85:125-136.

175. Conrad, M.N., Wright, J.H., Wolf, A.J., and Zakian, V.A. (1990) RAP 1 protein interacts with yeast telomeres in vivo: overproduction alters telomere structure and decreases chromosome stability. Cell 63:739-750.

176. Kyrion, G., Boakye, K.A., and Lustig, A.J. (1992) C-terminal truncation of RAP1 results in the deregulation of telomere size, stability, and function in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 12:5159-5173.

177. Marcand, S., Gilson, E., and Shore, D. (1997) A protein-counting mechanism for telomere length regulation in yeast. Science 275: 986-990.

178. Levy, D.L., and Blackburn, E.H. (2004) Counting of Rifl p and Rif2p on Saccharomyces cerevisiae telomeres regulates telomere length. Mol. Cell Biol. 24: 10857-10867.

179. Tsukamoto, Y., Kato, J., and Ikeda, H. (1997) Silencing factors participate in DNA repair and recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nature 388: 900-903.

180. Mishra, K., and Shore, D. (1999) Yeast Ku protein plays a direct role in telomeric silencing and counteracts inhibition by rif proteins. Curr. Biol. 9:1123-1126.

181. Roy, R., Meier, B., McAinsh, A.D., Feldmann, H.M., and Jackson, S.P. (2004)

182. Separation-of-function mutants of yeast Ku80 reveal a Yku80p-Sir4p interaction involved in telomeric silencing. J. Biol. Chem. 279: 86-94.

183. Wellinger, R.J., Ethier, K., Labrecque, P., and Zakian, V.A. (1996) Evidence for a new step in telomere maintenance. Cell 85:423-433.

184. Jia, X., Weinert, T., and Lydall, D. (2004) Mecl and Rad53 inhibit formation of single-stranded DNA at telomeres of Saccharomyces cerevisiae cdcl3-l mutants. Genetics 166:753-764.

185. Zubko, M.K., Guillard, S., and Lydall, D. (2004) Exo 1 and Rad24 differentially regulate generation of ssDNA at telomeres of Saccharomyces cerevisiae cdcl3-l mutants. Genetics 168:103-115.

186. Fan, X., and Price, C.M. (1997) Coordinate regulation of G- and C strand length during new telomere synthesis. Mol. Biol. Cell 8:2145-2155.

187. Adams, A.K., and Holm, C. (1996) Specific DNA replication mutations affect telomere length in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 16:4614-4620.

188. Adams Martin, A., Dionne, I., Wellinger, R.J., and Holm, C. (2000) The function of DNA polymerase alpha at telomeric G tails is important for telomere homeostasis. Mol. Cell Biol. 20:786-796.

189. Marcand, S., Brevet, V., Mann, C., and Gilson, E. (2000) Cell cycle restriction of telomere elongation. Curr. Biol. 10:487-490.

190. Bianchi, A., and Shore, D. (2007) Early Replication of Short Telomeres in Budding Yeast. Cell 128:1051-1062.

191. Smith, C.D., Smith, D.L., DeRisi, J.L., and Blackburn, E.H. (2003) Telomeric protein distributions and remodeling through the cell cycle in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Biol. Cell 14: 556-570.

192. Williams, B., Bhattacharyya, M.K., and Lustig, A.J. (2005) Mre 11 p nuclease activity is dispensable for telomeric rapid deletion. DNA Repair. (Amst.) 4:994-1005.

193. Garber, P.M., Vidanes, G.M., and Toczyski, D.P. (2005) Damage in transition. Trends Biochem. Sci. 30: 63-66.

194. Ritchie, K.B., Mallory, J.C., and Petes, T.D. (1999) Interactions of TLC1 (Which Encodes the RNA Subunit of Telomerase), TEL1, and MEC1 in Regulating Telomere Length in the Yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell Biol. 19:60656075.

195. Takata, H., Kanoh, Y., Gunge, N., Shirahige, K., and Matsuura, A. (2004) Reciprocal association of the budding yeast ATM-related proteins Tell and Mecl withtelomeres in vivo. Mol. Cell 14: 515-522.

196. Yang, C.P., Chen, Y.B., Meng, F.L., and Zhou, J.Q. (2006) Saccharomyces cerevisiae Est3p dimerizes in vitro and dimerization contributes to efficient telomere replication in vivo. Nucleic Acids Res. 34: 407-416.

197. Funaba, M., and Mathews, L.S. (2000) Recombinant expression and purification of smad proteins. Protein Expr. Pur if. 20: 507-513.

198. Lejeune, D., Delsaux, N., Charloteaux, B., Thomas, A., and Brasseur, R. (2005) Protein-nucleic acid recognition: statistical analysis of atomic interactions and influence of DNA structure. Proteins 61: 258-271.

199. Moriarty, T.J., Huard, S., Dupuis, S., and Autexier, C. (2002) Functional multimerization of human telomerase requires an RNA interaction domain in the N terminus of the catalytic subunit. Mol. Cell Biol. 22: 1253-1265.

200. Beattie, T.L., Zhou, W., Robinson, M.O., and Harrington, L. (2001) Functional multimerization of the human telomerase reverse transcriptase. Mol. Cell Biol. 21: 6151-6160.

201. Wenz, C., Enenkel, B., Amacker, M., Kelleher, C., Damm, K., and Lingner, J. (2001) Human telomerase contains two cooperating telomerase RNA molecules. EMBOJ. 20: 3526-3534.

202. Wang, L., Dean, S.R., and Shippen, D.E. (2002) Oligomerization of the telomerase reverse transcriptase ftom Euplotes crassus. Nucleic Acids Res. 30:40324039.

203. Hsiao, K. (1993) Exonuclease III induced ligase-free directional subcloning of PCR products. Nucleic Acids Res. 21:5528-5529.

204. Lobau, S., Weber, J., Wilke-Mounts, S., and Senior, A.E. (1997) Fl-ATPase, roles of three catalytic site residues. J. Biol. Chem. 272: 3648-3656.

205. Senior, A.E., Nadanaciva, S., and Weber, J. (2000) Rate acceleration of ATP hydrolysis by F(l)F(o)-ATP synthase. J. Exp. Biol. 203: 35-40.

206. Tombline, G., Bartholomew, L.A., Tyndall, G.A., Gimi, K., Urbatsch, I.L., and Senior, A.E. (2004) Properties of P-glycoprotein with mutations in the "catalytic carboxylate" glutamate residues. J. Biol. Chem. 279: 46518-46526.

207. Zanetti, L., Ristoratore, F., Bertoni, A., and Cariello, L. (2004) Characterization of sea urchin transglutaminase, a protein regulated by guanine/adenine nucleotides. J. Biol. Chem. 279:49289-49297.

208. Najafi, S.M., Harris, D.A., and Yudkin, M.D. (1996) The SpoIIAA protein of Bacillus subtilis has GTP-binding properties. J. Bacteriol. 178: 6632-6634.

209. Bergara, F., Ibarra, C., Iwamasa, J., Patarroyo, J.C., Aguilera, R., and Marquez-Magana, L.M. (2003) CodY is a nutritional repressor of flagellar gene expression in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 185: 3118-3126.

210. Levdikov, V.M., Blagova, E., Joseph, P., Sonenshein, A.L., and Wilkinson, A.J. (2006) The structure of CodY, a GTP- and isoleucine-responsive regulator of stationary phase and virulence in gram-positive bacteria. J. Biol. Chem. 281:1136611373.

211. Bourne, H.R., Sanders, D.A., and McCormick, F. (1991) The GTPase superfamily: conserved structure and molecular mechanism. Nature 349:117-127.

212. Niu, H., Xia, J., and Lue, N.F. (2000) Characterization of the interaction between the nuclease and reversetranscriptase activity of the yeast telomerase complex. Mol. Cell Biol. 20: 6806-6815.

213. Moriarty, T.J., Marie-Egyptienne, D.T., and Autexier, C. (2004) Functional organization of repeat addition processivity and DNA synthesis determinants in the human telomerase multimer. Mol. Cell Biol. 24: 3720-3733.

214. Collins, K., and Gandhi, L. (1998) The reverse transcriptase component of the Tetrahymena telomerase ribonucleoprotein complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8485-8490.

215. Bryan, T.M., Goodrich, K.J., and Cech, T.R. (2000) A mutant of Tetrahymena telomerase reverse transcriptase with increased processivity. J. Biol. Chem. 275: 24199-24207.

216. Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

217. Laemmli, U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.