Механическая активация ферментативного гидролиза полимеров биомассы дрожжей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.21 ВАК РФ

На правах рукописи

БЫЧКОВ Алексей Леонидович

Механическая активация ферментативного гидролиза полимеров биомассы дрожжей

02.00.21 - химия твердого тела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

- о СЕН 2010

Новосибирск-2010

004608032

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии Сибирского отделения РАН

Научный руководитель доктор химических наук, профессор

Ломовский Олег Иванович

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

Аввакумов Евгений Григорьевич

Защита состоится 29.09.2010 г. в 10-00 на заседании диссертационного совета Д 003.044.01 в Учреждении Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН по адресу: 630128, Новосибирск, ул. Кутателадзе, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Институте химии твердого тела и механохимии СО РАН.

Автореферат разослан « » августа 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Загребельный Станислав Николаевич

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

кандидат химических наук

Шахтшнейдер Т.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Относительная простота механохимических экспериментов и распространённость в производстве операций, связанных с механической обработкой, постоянно привлекали внимание учёных и технологов к механохимпи как потенциальному методу решения прикладных задач. Большинство достижений в прикладной механохимии были сделаны на пересечении со смежными областями знаний [1], например, с материаловедением, биотехнологией, химией лекарственных веществ [2, 3], экологией [4] и т.д.

Однако, несмотря на постепенный рост интереса к механохимии. промышленные применения лабораторных разработок немногочисленны. Одним из факторов, сдерживающих промышленное применение лабораторных механохимических разработок, является недостаток фундаментальных знаний о протекании процессов при механическом воздействии.

В 50-70-х годах в нашей стране проведены исследования по изучению процессов механической обработки синтетических полимеров и индивидуальных органических веществ. Было установлено, что при механической обработке полимеров происходит разрыв ковалентных связей с образованием свободных радикалов, установлены многие эмпирические закономерности механокрекинга полимеров [5]. Работы по изучению процессов, происходящих при механической обработке биополимеров и биогенного сырья, являющегося комплексом биополимеров, в основном, направлены на достижение технологических эффектов и не раскрывают механизмов превращений.

Биогенные полимеры п их комплексы широко распространены и обладают огромным промышленным потенциалом. В ряде программ, поддерживаемых правительствами развитых стран, ставится задача расширения использования биовозобновляемого сырья. Например, доля такого сырья в химической промышленности США должна вырасти с 3-5 % в настоящее время до 25 % к 2025 году. Изучение процессов, происходящих при механической обработке биополимеров, а также химических реакций, сопряжённых с механической обработкой, является приоритетной задачей не только с точки зрения фундаментальной науки, но и с точки зрения рационального использования природных ресурсов в химической технологии.

Дрожжевая биомасса БассЬаготусеь сегегшае представляет собой суп-рамолекулярный комплекс полимеров, большинство из которых имеет важное практическое значение [6-8]. Процессы, происходящие при механохими-ческой обработке данного объекта, практически не изучены. В связи с этим изучение механохимических превращений биополимеров дрожжевой клеточной стенки является актуальной задачей.

Цель работы

Экспериментальное изучение физико-химических процессов, протекающих при механически активированном ферментативном гидролизе полимеров биомассы дрожжей, выявление возможности использования этих процессов в химической технологии для получения биологически активных препаратов.

В работе поставлены следующие задачи:

■ исследование реакционной способности биополимеров клеточной стенки по отношению к гидролизу различными агентами;

❖ выявление физико-химических процессов, происходящих при механической и химической обработке дрожжевой биомассы;

■ изучение изменений супрамолекулярной структуры полимеров клеточной стснки при механической обработке и при гидролизе целлюлозолитиче-скими ферментами и другими реагентами;

■ определение оптимальных условий проведения механоферментативного процесса, установление стабильности реагентов и получаемых продуктов;

■ определение эффективности применения данного подхода в качестве основы промышленного метода получения биологически активных добавок.

Научная новизна:

❖ впервые изучено влияние механической обработки на супрамолекуляр-ную структуру биополимеров клеточной стенки дрожжей;

изучено влияние разупорядочения супрамолекулярной структуры полимеров клеточной стенки на их реакционную способность в реакциях ферментативного гидролиза;

❖ впервые определены условия совместной механической обработки цел-люлозолитических ферментов и целлюлозного субстрата, обеспечивающие устойчивость ферментов и приводящие к образованию реакционносиособных композитов;

❖ впервые осуществлён механоферментативный гидролиз глюкана клеточных стенок, протекающий в присутствии ограниченного количества воды;

❖ получен продукт, представляющий собой маннанолигосахариды, прикреплённые к частично гидролизованной клеточной стенке дрожжей, которые являются экологически чистым заменителем антибиотиков для животноводства. По содержанию активного компонента продукт превосходит известные аналоги.

Практическая значимость работы.

На основании проведённых исследований получен продукт, представляющий маннанолигосахариды, прикреплённые к частично гидролизованной клеточной стенке дрожжей. Биологические испытания на животных показали, что данный продукт можно использовать в качестве экологически чистого за-

менителя кормовых антибиотиков в птицеводстве. Предложенный способ получения маннанолигосахаридных препаратов защищен патентом РФ (№ заявки 2009122130/15(03090), положительное решение о выдаче патента на изобретение 23.06.2010) «Профилактический антибактериальный препарат и способ его получения».

На защиту выносятся:

■ механизм ферментативного гидролиза биополимеров клеточной стенки, приводящий к деполимеризации р-глюкана и повышению доступности ман-нанолигосахаридов;

■ процессы, протекающие при механохимической обработке дрожжевой биомассы со щелочными, кислотными и абразивными добавками;

■ особенности механизма активированного ферментативного гидролиза полимеров клеточной стенки, приводящего к увеличению доступности ман-нанолигосахаридов;

■ изменения дефектности структуры полимеров клеточной стенки, протекающие при механически активированном ферментативном гидролизе дрожжевой биомассы;

■ оптимальные условия проведения механически активированного ферментативного гидролиза, стабильность реагентов и продуктов реакции;

■ антибактериальная эффективность препарата, полученного по предложенной мехаиоферментативной схеме обработки дрожжевой биомассы.

Апробация работы. Результаты, изложенные в диссертационной работе, докладывались и обсуждались на научных семинарах ИХТТМ СО РАН, а также на различных всероссийских и международных форумах, таких как: XLV Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2007), Научно-практическая конференция с международным участием «Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины» (Новосибирск, Россия. 2007), Международная конференция «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, Россия, 2008), V съезд Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 2008), XLVI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск. Россия, 2008), Международная конференция «Mcclianochemistry and Mechanical Alloying» (Джамшетпур, Индия, 2008), 111 международная конференция «Fundamental Bases of Mechanochemical Technologies» (Новосибирск, Россия, 2009), IV Всероссийская конференция «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, Россия, 2009), Международная конференция «Создание новых материалов для эксплуатации в экстремальных условиях» (Якутск. Россия, 2009), II Российско-Корейская конференция «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology» (Новосибирск,

Россия, 2010), Международная конференция «Catalysis for Renewable Sources» (Санкт-Петербург, Россия 2010).

Личный вклад соискателя. Соискатель лично принимал участие в проведении анализа научно-технической литературы, планировании экспериментов, постановке новых и адаптации, применительно к изучаемым объектам, уже известных методов анализа, приготовлении и исследовании образцов, приготовлении укрупнённой партии образцов для биологических испытаний, обработке и интерпретации полученных экспериментальных данных. Электронно-микроскопическое исследование образцов проводилось совместно с Е.И. Рябчиковой (ИХБФМ СО РАН). Анализы ВЭЖХ проводились совместно с К.Г. Королёвым (ИХТТМ СО РАН). Биологические испытания проводились совместно с Карпачёвой В.В. (СибНИПТИЖ СО РАСХН). Рентгенофа-зовый анализ проведен Т.А. Чуприковой и Г.С. Гавриловой (ИХТТМ СО РАН). Оптическая микроскопия проводилась Е.В. Киселёвой (ИЦИГ СО РАН). Обсуждение полученных результатов и написание научных статей проводилось совместно с научным руководителем и соавторами работ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ: 9 статей, 6 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях, 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Материал изложен на 129 страницах, включает 44 рисунка, 9 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 197 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении показана актуальность экспериментального изучения физико-химических процессов, протекающих при механической активированном ферментативном гидролизе полимеров клеточной стенки дрожжей. Сформулированы цели исследования и основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен анализ литературных данных. Обзор литературы состоит из 6-ти разделов. Проанализированы литературные данные как о физико-химических свойствах индивидуальных биополимеров клеточной стенки дрожжей, так и об их супрамолекулярных взаимодействиях, приводящих к образованию сложной структуры - клеточной стенки. Представлены данные о различных типах химических превращений, в которые могут вступать биополимеры клеточной стенки. Рассмотрены возможные пути увеличения их реакционной способности.

Во второй главе описано приготовление исследуемых образцов исходной (произодство ЗАО «Новосибирский дрожжевой завод»), механически и химически обработанной дрожжевой биомассы, описаны методы, используемые для их изучения.

Механическая обработка дрожжевой биомассы и её смесей с различными химическими реагентами проводилась в активаторе АГО-2 и РМС-10 Для обработки в активаторе АГО-2 были выбраны следующие условия: стальные реакторы со стальными сферическими мелющими телами (0 5 мм, общим весом 190 г), ускорение 20 $>, реакторы термостатировали проточной водой 10-15 °С. Для обработки в мельнице РМС-10 были выбраны следующие условия: частота вращення 30 Гц, скорость подачи сырья 10 кг/ч, температура внутри реактора 40 "С.

Ферметатвный пиролиз в жидкой фазе проводили в следующих условиях: к навеске гидролизуемого образца добавляли раствор ферментного препарата «Целлолюкс 2000» и выдерживали при температуре 50 °С в термо-статируемом шейкере.

Оля осуществления механически активированного ферментативного гидролиза смесь дрожжевой биомассы с ферментным комплексом «Целлолюкс 2000» механически обрабатывали в активаторе АГО-2. Полученный полупродукт запрессовывали в таблетку и прогревали при 50 °С в течение 2030 часов.

Моносахаридный состав продуктов определяли при помощи ВЭЖХ. Для этого проводили экстракцию углеводов из полученных продуктов и их кислотный гидролиз. Затем получали производные моносахаридов с этиловым эфиром л-аминобензойной кислоты. Разделение производных проводилось на приборе «Милихром А-02» (ЗАО «ЭкоНова», Россия), оснащенном обращен-но-фазовой колонкой «Нуклеос»л-С18» (2.0x75 мм, размер частиц 5.0 мкм) и спектрофотометрическим детектором.

Определение содержания глюкозы в образцах проводили с использованием набора реактивов «Новоглюк-К,М-1000» (ЗАО «Вектор Бест», Россия, Новосибирск). Принцип метода основан на селективном ферментативном окисленин глюкозы до глюконовой кислоты с выделением перекиси водорода, определяемой спектроскопически (510 нм) по количественной реакции с фенолом и 4-аминоантипирином.

Определение содержания белков в образцах проводили спектроскопически с использованием набора реактивов «Белок-ПГК-Ново» (ЗАО «Вектор Бест», Россия, Новосибирск). Принцип метода основан на взаимодействии аминогрупп белков с сульфогруппами пирогаллолового красного и образовании окрашенного комплекса с поглощением при 598 нм.

Для определения содержания глюкозы и маннозы использовали спектроскопический метод, основанный на получении окрашенных соединений, об-

разующихся при реакции углеводов с карбазолом в концентрированной серной кислоте. УФ-Спектр окрашенных соединений глюкозы имеет один пик (540 им), а спектр соединений маннозы два пика (440 нм и 540 нм). Концентрация углеводов в реальных образцах рассчитывалась с использованием коэффициентов экстинции, определённых из калибровочных смесей.

Определение молекулярной массы белков проводилось в вертикальной электрофоретической ячейке «Helicon VE-20». Разделяющий гель содержал 20 % акриламида, 3 % бисакриламида. Начальные условия разделения: сила тока 20 мА, падение напряжения 109 В, мощность 2,2 Вт, температура геля 25 °С.

Определение количества разрушенных клеток. Метод основан на определении падения концентрации метиленового голубого, наблюдаемого из-за сорбции молекул красителя клеточными стенками дрожжевой биомассы. Исходные и разрушенные клетки имеют разные коэффициенты сорбции. Суспензии с известным содержанием разрушенных клеток использованы для построения калибровочных кривых и для исследований экспериментальных образцов биомассы.

Исследование структуры и дефектности клеточной стенки методами электронно-микроскопического анализа. Для исследования структуры клеточных стенок дрожжевой биомассы использовали химические реакции компонентов дрожжевых стенок со специальными реагентами. Такие реакции и соответствующие реагенты традиционно используются в препаративной микроскопии для решения аналитических задач [9]. В результате реакций белковых либо глюкановых компонентов с реагентами структура клетки «декорируется» выделяющимися частицами, которые хорошо различимы при электронно-микроскопическом исследовании. Поскольку эффект базируется на формировании контраста на различных участках электронно-микроскопического изображения, такие реагенты можно назвать «контрастирующими».

Для исследования дефектности белковых участков клеточных стенок использовали декорирование осмиевой кислотой. В результате взаимодействия осмиевой кислоты с аминокислотами белков образовываются электронноп-лотные комплексы сложного состава. Реакция восстановления комплексных аммиачных солен серебра и образование металлического серебра использована для выявления глюкановых участков клеточной стенки, содержащих концевые альдегидные группы, и, соответственно, оценки степени дефектности таких участков.

Рентгенографические исследования осуществлялись при комнатной температуре на порошках в кварцевой кювете с помошью дифрактометра ДРОН 4M (излучение Си Ка).

В третьей главе представлены экспериментальные данные по гидролизу полимеров меточной стенки различными реагентами. Также, детально рассмотрено влияние механической обработки на реакционную способность целлюлозолитиче-ских ферментов, дефектность структуры биополимеров и их реакционную способность в последующем ферментативном гидролизе.

Первый параграф третьей главы содержит результаты экспериментов но жидкофазному гидролизу различными реагентами исходной биомассы 5! ссгак/ас и антибактериального препарата, полученного по известной в литературе схеме. Из приведённых данных можно заключить, что действующим началом маннанолиго-сахарнцных препаратов является поверхность частично гидролизованной клеточной стенки 5'. се/отйюе, содержащая доступные маннанолигосахариды.

Для оценки доступности маннанолигосахаридов и, как следствие, эффективности механической, химической и любой другой обработки следует использовать данные о содержании щёлочераегворимых маннанолигосахаридов, а для достижения максимального выхода маннанолигосахаридов необходимо гидролизовать наиболее реакционноспособную часть структурообразующего р-глкжана, который связывает и организует остальные компоненты клеточной стенки.

Были проведены эксперименты по гидролизу дрожжевой биомассы ферментным препаратом «Целлолюкс 2000». Процессы, происходящие при протекании

Рнс. I. Накопление глюкчпы в результате ферментативного

пшролта дрожжевой биомассы: я -нм\ол мономерноп формы [./тки!}.>_ Ь - вы.хол I лнжоолшосахарндов.

В ходе гидролиза наблюдаются два параллельных процесса: гидролиз [З-глкжана клеточной стенки с образованием олигомерных форм глюкосахаридов и гидролиз глюкоолигосахарпдов с накоплением мономерной формы глюкозы.

Показано, что при ферментативном гидролизе дрожжевой биомассы в жидкой фазе наиболее эффективно процесс протекает на протяжении первых пяти часов. За пять часов концентрация мономерной формы глюкозы увеличивается до 15,4 %, а концентрация олигомерных форм падает с 5,7 % до 1,4 %. Дальнейшее проведение ферментативного гидролиза позволяет более полно гидролизовать (3-глюкан, но не эффективно из экономических соображений.

гидролиза, проиллюстрированы на рис. 1.

» 1а

* _ »

* л _ - — А — -

8 12 - А

I А

^ а

Ъ - - •- Ь

& 6 Н».

*

А • 9 -- время, ч

о • •

О 5 10 15 20

Во втором параграфе третьей главы рассмотрено влияние механической обработки на дефектность структуры клеточной стенки и выход щёлочерастворимых маннанолигосахаридов.

Методом, основанным на сорбции красителя дрожжевыми клеточными стенками, определена степень разрушения клеток биомассы при механической обработке. За 2 минуты механической обработки разрушаются около 30-40 % дрожжевых клеток (рис. 2). Для разрушения всех клеток биомассы необходимо проводить обработку около 15 минут, что может приводить к перегреву образца и денатурации целевых компонентов и ферментов.

Анализ содержания белка в экстракте механически обработанной биомассы показал, что в результате механической обработки дрожжевой биомассы выход маннопротеинов в раствор значительно увеличивается (рис. 3 ).

Рис. 2. Зависимость количества раз* рушенных клеток в зависимости от 80 | времени механической обработки: й ' | - экспериментальные данные, б -60 , а - ♦ а теоретическое описание эксноненци-

^ б альным законом.

о »♦

0

N.

КГ Г

4. I I

ПЛ

!\А/ЛГ

Н1 /

! I

У

п ¡учУУ'л

Рис. 3. Профнлограмма распределении но молекулярной массе белков зкетракта механически обработанной дрожжевой биомассы.

При проведении механической обработки дрожжевой биомассы выход растворимых продуктов зависит от физико-химической природы добавки. Обработка с гидроксидом натрия приводит к образованию композита с повышенной реакционной способностью. Добавление воды к такому композиту приводит к повышенному выходу маннанолигосахаридов, что связано с локальными повышениями концентрации щёлочи при диффузии воды в композит.

Рис. 4. Морфология дрожжевых клеток до механической обработки. Ультратонкие сречы препаратов, фиксированных осмиевой кислотой, и - исходные дрожжевые клетки, о - увеличенный фрагмент микрофотографии клеточных стенок.

Рис. 5. Мирф» ни нн дрожжевых клеток после механической обработки. Ультра гонкие сре-)ы препаратов, фиксированных осмиевой кислотой, п - дрожжевые клетки после механической обработки, б - увеличенный фрагмент микрофотографии клеточных стенок.

Электронномикроскопические исследования клеточном стенки показали, что при механической обработке нарушается сплошность дрожжевых клеток, а также изменяется супрамолекулярная структура полимеров клеточной стенки. Для определения дефектности маннопротеиновых компонентов было использовано «декорирование» осмиевой кислотой (рис. 4-5). По сравнению с клетками исходного препарата структура клеточной стенки разупорядоче-на. стенка выглядит гомогенной. Чётко разделявшиеся в исходных клеточных стенках слои маннопротеинов и |3-глкжана (рис. 4) становятся размытыми и частично проникают друг в друга (рис. 5). Эти данные свидетельствуют о нарушении супрамолекулярной структуры полимеров и позволяют нрогнози-

ровать у механически обработанной биомассы повышенную реакционную способность при последующем ферментативном гидролизе.

Для декорирования дефектов углеводных компонентов была использована реакция с аммиачными комплексами нитрата серебра. Показано, что стенка исходных, а также механически обработанных клеток, не взаимодействует с комплексами серебра ввиду низкой концентрации восстанавливающих альдегидных групп (рис. 6). Таким образом, видно, что механическая обработка в отсутствие реагентов не приводит к существенному повышению реакционной способности глюкана клеточной стенки.

Рис. 6. Декорирование дефектов углеводных компонентов: а - ультратонкнн срез исходной клетки. 11 - ультратонкнн ере» механически обработанных клеток.

Для подтверждения данных электронной микроскопии об устойчивости компонентов клеточных стенок при механической обработке без реагентов, проведен эксперимент, в котором компоненты клеточной стенки (таб. I) были выделены, очищены, охарактеризованы методами физико-химического анализа и подвергнуты механической обработке в активаторе АГО-2. Измерены активности целлюлозолитического препарата «Целлолкжс 2000» по отношению к исходным и механически обработанным компонентам клеточной стенки.

Все глюкановые полимеры клеточной стенки способны гидролизоваться ферментами препарата «Целлолкжс 2000». Однако реакционная способность супрамолекулярных комплексов, состоящих из этих полимеров, гораздо ниже реакционной способности индивидуальных компонентов. Например, комплекс щёлоченерастворимого (З-глюкана ферментами практически не гидро-лизуется, несмотря на довольно высокую реакционную способность входящих в его состав кислоторастворимого р-1,6-глюкана и кислотонераствори-мого |3-1,3-глюкана.

Активность комплекса щёлоченерастворимого глюкана может быть увеличена при помощи механического разупорядочения его супрамолекулярной структуры. Из данных, приведённых в таб. 1, видно, что механическая обра-

ботка на протяжении 5 минут (активатор АГО-2, при 20 g) приводит к увеличению реакционной способности щёлоченерастворимого р-глюкана.

Таб. 1. Активность ферментативного комплекса "Цсллолюкс 2000" по отношению к глю-кановым полимерам._

Полимер Активность «Целлалкжс-а 2000». ед./г

ЩблочерааиорнмыП Р-1,3-глюкан 250

Щйлочснсрас гворимый Р-глкжан 14

- кпслоторастворпмый (Ы.б-пнокан 220

- кислотонерастворнмий Р-1,3-глюкан 114

ЩСлоченерастворпмый р-глюкан после 5 мннуг механической обработки 26

Сравнение результатов экспериментов по взаимодействию с аммиачными комплексами серебра и экспериментов по определению активностей растворов ферментов показывает, что наблюдаемая в данном случае степень разупорядочения слабо отражается на электронно-микроскопичсских снимках, но заметна при проведении кинетических исследований.

Представленные данные позволяют сделать вывод, что механическая обработка дрожжевой биомассы приводит к разрушению части клеток, разупо-рядочению супрамолекулярной структуры клеточной стенки, а в ряде случаев и к образованию реакционноспособных механокомпозитов. Полученная информация необходима для дальнейшего планирования и проведения механо-ферментативного гидролиза дрожжевой биомассы.

В третьем параграфе приведены результаты экспериментов, иллюстрирующих влияние механической обработки на реакционную способность целлю-лозолитических ферментов. Изучено влияние механических свойств субстрата на целлюлозолитическую активность ферментов. Для проведения экспериментов использовали лабораторный активатор АГО-2, а в качестве субстрата использовали микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ). Механические свойства МКЦ варьирован! путём предварительной механической обработки.

Результаты измерения активности механически обработанного ферментного комплекса «Целлолюкс 2000» представлены на рис. 7-а. Исходя из представленных данных, можно предположить, что во время механического воздействия могут протекать следующие процессы: недиффузионное распределение ферментов по микрокристаллической целлюлозе, увеличение реакционной способности МКЦ за счёт снижения степени кристалличности и снижение цсллюлозолитической активности ферментативного препарата вследствие денатурации составляющих его белков.

Для установления вклада процесса аморфизации субстрата проведён эксперимент, в котором механически аморфизованную МКЦ гидролизовали при помощи необработанного ферментативного препарата (рис. 7-6, кривая

2). Показано, что в результате механической обработки реакционная способность целлюлозы по отношению к ферментативному гидролизу увеличивается более чем в 2 раза. Увеличением реакционной способности МКЦ, по-видимому, можно объяснить более высокие значения активности и более медленное падение активности (рис. 7-а кривая 2) по сравнению с кривой 1 (рис. 7-а).

I 1.= о I2-5 -

0 о

1 1.0 В п О 2 | 2 „ о о- -О -о О о □ О 1 £ о

(0 0,8 5

i 0,6 о

I 0.4

О. "1.5-

.... 5

о о I

а г

о 1

а

о.2 а) о - о 05 б) ос о--------------

50 100 0 50 100

время мех обработки, сек время мех обработки, сек

Рис. 7. Изменение активности ферментативного препарата «Целлолюкс 2000» при механической обработке:

I - обработка препарата без субстрата, 2 - I - совместная обработка фермента и совместная обработка препарата и МКЦ, предварительно аморфнтованнон МКЦ.

2 - ферментативный гндролш предвари 1С.1ЫШ аморфщованнон МКЦ.

Показано, что инактивация ферментов происходит при всех значениях начальной кристалличности целлюлозы. МКЦ частично аморфизовали обработкой в АГО-2 в течение 4 минут (20 g). К частично аморфизованной МКЦ добавляли навеску препарата и проводили дальнейшую обработку в тех же условиях. По кривой 1 (рис. 7-6) видно, что при малых временах обработки (порядка 40 секунд) активность ферментов превышает активность модельной системы, по-видимому, благодаря тому, что в качестве субстрата используется уже аморфизованная реакционноспособная МКЦ. При дальнейшей механической обработке активность резко падает вследствие денатурации ферментов.

Таким образом, определены условия совместной механической обработки целлюлозолитических ферментов и целлюлозного субстрата, обеспечивающие устойчивость ферментов и приводящие к образованию реакцион-носпособных композитов. Применение данных условий при переработке дрожжевой биомассы позволяет более эффективно осуществлять предложенный механоферментативный гидролиз полимеров.

В четвёртом параграфе обсуждается влияние механической обработки клеточной стенки на эффективность ферментативного гидролиза составляющих её полимеров.

На основании полученных результатов для повышения эффективности ферментативного гидролиза (3-глюкана была предложена следующая схема, названная механоферментативной обработкой, в которой стадии ферментативного гидролиза предшествует стадия механической обработки смеси субстрата и фермента.

С целью увеличить реакционную способность, изменить свойства образца на первой стадии дрожжевая биомасса & сеге\ч$'те подвергается механической обработке совместно с ферментативным препаратом «Целлолкжс 2000». В ходе этой стадии осуществляется распределение ферментов но объёму образца, механическое разрушение некоторой части клеток, а также ра-зупорядочение супрамолекулярной структуры полимеров клеточной стенки, приводящее к повышению их реакционной способности.

Вторая стадия включает в себя компактирование полученного порошка. Это позволяет повысить объёмную концентрацию фермента, а также предотвратить потерю воды, которая необходима для гидролиза.

Третья стадия - прогрев компакта при оптимальной температуре действия ферментов (50 °С) необходима для протекания гидролиза (З-глюкана. Образовавшиеся на первой стадии разрушенные клетки служат центрами локализации последующего гидролиза. Вода из состава биомассы (влажность дрожжей около 5 %) растворяет фермент. Ферменты сорбируются на субстрате и катализируют реакцию гидролиза.

На рис. 8 приведена микрофотография компакта клеток после механической обработки с ферментом. Часть разрушенных клеток играют роль центров локализации реакции гидролиза при прогреве компакта.

т^шцршш

Ш^ттшшШ*

С

Щ

л т # -^С Ф

к

с

• • А .••• • »

л-^х.'

■ К * •

'11

т. -Г

(о)

KML4I.1I

Рис. 8. Микрофотография дрожжевой биомассы после механической обработки: а обработанной биомассы, о - увеличенный фрагмент «я» с центром локализации реакции на месте разрушенных клеток.

Протекание ферментативного гидролиза иллюстрируется рис. 9. Видно, что реакция протекает в объёме автолокализованно, то есть путём образо-

вапия и постепенного продвижения зоны превращения. На микрофотографии отчётливо виден фронт реакции, центральная зона погибших клеток с вытекшим содержимым, а также периферическая зона клеток, до которых реакционный фронт ещё не дошёл. Центральная часть представляет собой клетки, которые подверглись гидролизу (рис. 9-а). Клеточное содержимое находится вне клеток, которые потеряли форму. Клетки, которые не участвовали в реакции (рис. 9-6), не отличаются от исходных.

Химический анализ щелочного экстракта продукта механофермента-тивного гидролиза показал, что выход глюкана равен 22 %, а выход маннано-лигосахаридов - 3,8 % (1,1 % в виде маннанолигосахаридов и 2,7 % в виде маннопротеинов) от массы исходной биомассы 5. сегехчз'юе (рис. 10). Выход маннанолигосахаридов выше, чем при одностадийной механической обработке с ферментами (2,1 %) и выше, чем при двухстадийной жидкофазной обработке «фермент - щелочная экстракция» (2,0 %).

е? малнолротеины ■ мананолигосахариды

0,2 К''"Я ¡Ш ¥

вив

Иркроные дрохжи

Дрожжк п^пе обработки

Дрожвгм поше мг'р и ферментативного гидролиза

Рис. 9. Микрофотография автолокалн-шваннон реакционной юны гидролиза (З-гдюкана 8. сегеччйае: а - гидролюо-панпмс клетки, 6 - исходные клетки

Рис. 10. Выход манилнолигосяхлридов и маннопро1еннов в результате механической и механоферментативнон обработки.

Для исследования изменений еунрамолекулярной структуры компонентов клеточной стенки использован способ декорирования дефектов белков и Р-глюкана клеточной стенки с помощью реакций с осмиевой кислотой и солями серебра, соответственно.

Рис. 11. Морфология дрожжевых клеток после механической н ферментативной обработки.

На рис. 11 приведена микрофотография ультратонкого среза дрожжевой биомассы, подвергнутой механоферментативной обработке (ср. с рис. 5). Клеточные стенки повреждены, цитоплазма и органеллы разрушены и образуют электроноплотную массу, локализо-

ванную между клеточными стенками. В клеточных стенках обнаружены зернистые структуры размером 12-25 нм, которые, предположительно, являются комплексами гликопротеинов с 0з04 [101.

Таким образом, ферментативный гидролиз глюкана приводит к снятию диффузионных ограничений, в результате чего появляется возможность образования осмиофильных зернистых структур.

Обработка образцов комплексами серебра показала (рис. 12-6), что внутри и на поверхности клеточных стенок отмечается накопление наноча-стиц серебра, очевидно, обусловленное наличием центров зародышеобразо-вания, а также благодаря накоплению в системе достаточного для роста заро-

Рнс. 12. Препарат дрожжевой биомассы, подвергнутой механоферментатпвной обработке, и - клеточные стенки после механической обработки, й - фрагменты мембраноподобных структур после механической обработки и ферментативного гидролига.

Приведённые данные свидетельствуют в пользу того, что в ходе ферментативного гидролиза происходит деполимеризация р-глюкана. приводящая к разупорядочению супрамолекулярной структуры полимеров клеточной стенки. В результате наблюдаемого разупорядочения клеточная стенка практически не теряет своей сплошности, но происходит уменьшение её плотности. Следствием этого является увеличение коэффициентов диффузии для реагентов или экстрагентов.

В результате реакции образуются олигосахариды, которые переходят в водную фазу. Эти обстоятельства позволяют создать на основе предложенной механоферментативной обработки технологические схемы получения из -V. сеге\'шае антибактериальных препаратов, сорбентов с развитой поверхностью, продуктов, содержащих компоненты макромолекул её клеточной стенки.

Сопоставление данных электронной микроскопии и данных химического анализа говорит о том, что предложенная механоферментативная обработка дрожжевой биомассы позволяет достичь основной цели - разупорядочения структуры полимеров клеточной стенки, а также увеличения доступно-

сти манианолигосахаридов. Наличие в полученном препарате водорастворимых маннанолигосахаридов и манианолигосахаридов, связанных с поверхностью клеточной стенки, позволяет использовать его как гетерогенный сорбент патогенных микроорганизмов, а также как источник растворимых маннанолигосахаридов. При этом уровень извлечения маннанолигосахаридов превосходит их уровень извлечения из препаратов, полученных по классической жидкофазной технологии.

Исходя из представленных данных, можно сформулировать основные положения физико-химической модели, описывающей процесс механофер-ментативной обработки:

• На стадии механической обработки происходит разрушение клеток и увеличение реакционной способности полимеров клеточной стенки, связанное с разупорядочением их супрамолекулярной структуры.

• На стадии компактирования происходит уплотнение образца, что позволяет повысить концентрацию фермента в зоне реакции, обеспечивает постоянный тесный контакт между реагентами и способствует быстрому продвижению реакционного фронта.

• На стадии прогрева происходит ферментативный гидролиз клеточной стснки 5. сегеу'шае, причём реакция протекает в режиме автолокализации. Разрушенные при механической обработке клетки служат центрами автолокализации гидролиза.

• В результате протекания механически активированного ферментативного гидролиза образуется продукт, представляющий собой частично гидролизованные клеточные стенки, содержащие доступные маннанолигоса-хариды.

В пятом параграфе третьей главы приведена технологическая схема меха-ноферментативного способа получения препаратов с повышенным содержанием маннанолигосахаридов и результаты их биологических испытаний.

Предложенный в данной работе способ механоферментативного гидролиза дрожжевой биомассы может быть положен в основу новой механохи-мической технологии получения маннанолигосахаридных препаратов. Схема

логических участках производительности до 100 кг/час, а отсутствие в технологической цепочке жидкофазных стадий и экстракции органическими растворителями позволяет говорить об экологической безопасности технологии и об её экономической эффективности. К тому же технология обладает рядом других достоинств, таких как: простота в эксплуатации и обслуживании производства, применение в технологическом процессе только экологически чистых и биовозобновляемых компонентов, доступность и ннзкая цена используемого сырья (биомасса дрожжей - отход спиртовой промышленности), возможность использования оборудования в составе технологических линий в кормопроизводстве.

Эффективность препаратов, полученных по предложенной технологии, проверена экспериментально. Испытания, проведённые на гусях мясного направления продуктивности в период их откорма, показали, что применение маннанолигосахаридных препаратов наиболее эффективно в качестве профилактического средства. Результаты испытаний представлены в таб. 2.

Таб. 2. Динамика среднесуточного прироста живой массы, падежа и сохранности подолыт-пых гусей.____

Показатель Группа

Контрольная | опытная

В начале эксперимента (возраст гусей - 2 мес.)

Средняя живая масса, кг 1.17 1,04

Через 30 Аней

Средняя живая масса, кг 2.18 2.16

Среднесрочный прирост, г 33,5 37,6

11ад5ж. гол. 1 -

Сохранность, % 98,0 100

Через 55 дней

Средняя живая масса, кг 2,58 2,64

Среднесуточный прирост, г 16,0 19,1

Падеж, гол. - 1

Сохранность, °о 98,0 98,0

Садовой прирост, кг 1.41 1.61

Потреблено корма на 1 голову, кг 11.36 10,94

Затраты корма на 1 г прироста, г 8.07 6,82

Отобранные средние пробы образцов печени и мышечной массы не показали существенных изменений в химическом составе печени и мышечной массы. Однако в печени контрольных животных больше содерж&чось практически всех изучаемых микроэлементов. Это объясняется тем, что питательные вещества, поступившие с кормом, хуже усваивались в кишечнике и током крови транспортировались в печень.

Полученные данные свидетельствуют о положительном влиянии изучаемых добавок. Они обладают антибактериальными свойствами, стимулируют обмен веществ и улучшают использование питательных веществ корма.

Оценена прибыль, получаемая предприятием при применении в рационе гусей маннанолигосахаридной кормовой добавки в количестве 1 %. Оценка показала, что внедрение добавки позволит дополнительно получить около 26 рублей прибыли на каждую голову.

Основные результаты работы и выводы

1. Обработка клеточной стенки $асс1юготус&; сегег'шае ферментами, обладающими целлюлазной активностью, в жидкой фазе приводит к нарушению целостности структурообразующего элемента клеточной стенки - р-глюкана и, как следствие, увеличению выхода ковалентно связанных с ним маннанолигосахаридов примерно в 6 раз.

2. Механическая обработка клеточной стенки в течение 2 минут (активатор АГО-2. ускорение 20 g) увеличивает эффективность щелочной экстракции маннанолигосахаридов в 1,7 раза вследствие нарушения структуры Р-глюкана.

3. На основе полученных данных по ферментативному гидролизу и механической обработке впервые предложена механоферментативная схема получения препаратов с повышенным содержанием биологически доступных маннанолигосахаридов. Схема включает механическую обработку дрожжевой биомассы в присутствии ферментов, компактирование полученного композита и прогрев компакта (ферментативный гидролиз).

4. Механическая обработка клеток & сегеушае в смеси с ферментами обеспечивает образование реакционноспособного композита, в котором фермент недиффузионным образом распределяется среди клеточных стенок. Показано увеличение реакционной способности полимеров клеточных стенок в процессе механической обработки. При механической обработке часть клеток разрушается и в ходе последующего прогрева служит центрами локализации ферментативного гидролиза. Компактирование композита обеспечивает тесный контакт между клетками и протекание реакции гидролиза р-глюкана клеточных стенок в режиме автолокализации.

5. В процессе ферментативного гидролиза глюкосахариды отщепляются от глюкановых полимеров и глюкопротеинов. В результате возрастает выход маннанолигосахридов, а также уменьшается степень полимеризации глюкановых полимеров и доля глюкосахаридов, связанных с белками.

6. Благодаря проведению механоферментативного гидролиза выход при экстракции суммы доступных маннанолигосахаридов увеличивается в 2,9 раза с 1,3 % до 3,8 %.

Список цитируемой литературы

1. Болдырев, В.В. Механохимия и механическая активация твёрдых веществ // Успехи химии. - 2006. - Т. 75, № 3. - С. 203-216.

2. Дубинская, A.M. Механохимия лекарственных веществ // Хим. фарм. журнал. - 1989. -№. 23. - С. 754-764.

3. Сухие технологические процессы, базирующиеся на химических реакциях в твердой фазе. 1. Получение быстрорастворимых дисперсных форм лекарственных веществ методом механической активации / В.В. Болдырев, Т.П. Шахтшнейдер, Л.П. Бурлева, М.А. Васильченко, В.А. Севсрцсв // Химия в интересах устойчивого развития. - 1994. -№ 2. - С. 455-459.

4. Ломовский О.И., Болдырев В.В. Механохимия в решении экологических проблем. - Новосибирск: ГПНПБ СО РАН, 2006. - 221 с.

5. Барамбойм, Н.К. Механохимия высокомолекулярных соединений. -М.: Химия, 1971.-364 с.

6. Бабаян, Т.Л. Выделение физиологически активного маннана и других полисахаридов из автолизатов пекарских дрожжей / Т.Л. Бабаян, В.К. Латов // Биотехнология. - 1992. - № 2. - С. 23-26.

7. Product based о polysaccharides from baker's yeast and its use as a technological coadjuvant for bakery products : pat. 6.060.089 USA : CI2N 1/06, CI2N 1/18/ Lazzari F.-appl. 1998; publ.09.05.2000.

8. Liu, X.Y. A new method of p-D-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae / X.Y. Liu, Q. Wang, S.W. Cui, H.Z. Liu // Food Hydrocolloids. - 2008.

- № 22. - P. 239-247.

9. Барыкина, Р.П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы метода.

- М.: Изд-во МГУ, 2004.-312 с.

10. Nielson, A. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins / A. Nielson, W. Griffith // The Journal of Histochemistry and Cytochemistry.

- 1979. - V. 27, № 5. - P. 997-999.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах: Статьи в журналах

1. Бычков, А.Л. Изменение супрамолекулярной структуры клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae при механоферментативной обработке / А.Л. Бычков. Е.И. Рябчикова, К.Г. Королев. О.И. Ломовский // Химия в интересах устойчивого развития. - 2009. - № 5. - С. 479-486.

2. Бычков, AJ1. Изменения клеточной стенки при механической активации растительной и дрожжевой биомассы / А.Л. Бычков, К.Г. Королев, Е.И. Рябчикова, О.И. Ломовский // Химия растительного сырья. - 2010. -№ 1. - С. 49-56.

3. Бычков, A.J1. Влияние механической обработки на активность целлю-лозолитического препарата / A.J1. Бычков, О.И. Ломовский // Журнал прикладной химии. - 2010. - Т. 83, № 6. - С. 1051-1053.

4. Bychkov, A.L. Obtaining mannanoligosaccharide preparations by means of the mechanoenzymatic hydrolysis of yeast biomass / A.L. Bychkov, K.G. Korolev, O.I. Lomovsky // Applied Biochemistry and Biotechnology. Принята к печати 18.04.2010. Полный текст доступен с 29.04.2010 по электронному адресу www.springerlink.coni/conlent/k094xq7rl 1572p25/?p=a30a78eb83724f3b833776 5d91c6f321&p¡=62

Статьи в сборниках трудов конференций

5. Бычков, А.Л. Получение наночастиц серебра восстановлением гетеро-фазными продуктами ферментативного гидролиза клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae / А.Л. Бычков, К.Г. Королёв, Е.И. Рябчикова, О.И. Ломовский II Науч.-практич. конф. с международ, участием «Нанотехнологии и наномате-риалы для биологии и медицины» (Новосибирск, 11-12 окт. 2007 г.): сб. материалов. - Новосибирск, 2007. - Т. 1. - С. 41 -48.

6. Королёв, К.Г. Изменение морфологии клеточной стенки в ходе меха-нохимической обработки / К.Г. Королёв, А.Л. Бычков, Е.И. Рябчикова, О.И. Ломовский // Междунар. конф. «Техническая химия. От теории к практике» (Пермь, 8-12 сент. 2008 г.) : сб. материалов. - Пермь, 2008. - Т.1. - С. 244248.

7. Бычков, А.Л. Активация ферментативного гидролиза полисахаридов клеточной стенки S. cerevisiae с целью получения антибактериальных препаратов /7 V Съезд Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва. 2-4 дек. 2008 г.): сб. материалов. - М.: ИАЦ, 2008. - С. 314-319.

8. Бычков А.Л. Изменение морфологии клеточной стенкн при механической активации дрожжевых и растительных клеток / А.Л. Бычков, К.Г. Королёв, Е.И. Рябчикова, О.И. Ломовский // IV Всерос. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 21-23 апр. 2009 г.): сборник материалов. - Барнаул, 2009. - С. 63-65.

9. Бычков А.Л. Получение композитного препарата, содержащего стабилизированные наночастицы серебра // Междунар. конф. «Создание новых материалов для эксплуатации в экстремальных условиях» (Якутск, 16-19 ноября 2009 г.): сб. материалов.-Якутск,2009.-С. 183-185.

Тезисы в сборниках трудов конференций

10. Бычков, А.Л. Механохимическое получение манноолигосахаридных препаратов из клеточной стенки дрожжей // XLV Междунар. науч. студенч. конф. «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 10-12 апр. 2007): тез. докл. - Новосибирск, 2007. - С. 6.

11. Бычков, А.Л., Королёв, К.Г Наночастицы металлов в контрастировании механических нарушений надмолекулярных структур клеточных стенок Saccharomvces cerevisiae / A.J1. Бычков, К.Г Королёв // XLVI Междунар. науч. студенч. конф. «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2630 апр. 2008 г.): - Новосибирск, 2008. - С. 12.

12. Koroliov, K.G. Cell wall transformation during mechanical activation / K.G. Koroliov, A.L. Bychkov, E.I. Ryabchikova, O.I. Lomovsky // International conf. "Mechanochemistry and Mechanical Alloying" (Jamshedpur, India, Dec. 1-4, 2008): book abstr. - Jamshedpur. 2008. - P. 22.

13. Bychkov, A.L. The changes of yeast cell under action mechanoenzymati-cal treatment / A.L. Bychkov, E.I. Ryabchikova, K.G. Korolcv, O.I. Lomovsky // III International Conf. "Fundamental Bases of Mcchanochemical Technologies" (Novosibirsk. Russia, May 27-30, 2009) : book abstr. - Novosibirsk, 2009. - P. 194.

14. Bychkov, A.L. Obtaining mannanoligosaccharide additive by means of the mechanoenzymatic hydrolysis of yeast biomass / A.L. Bychkov, E.I. Ryabchikova, K.G. Korolev, O.I. Lomovsky // 2nd Annual Russian-Korean Conf. "Current Issues of Natural Products. Chemistry and Biotechnology" (Novosibirsk, Russia, March 15-18, 2010): book abstr. - Novosibirsk, 2009. - P. 57.

15. Bychkov A.L. The practical application of mechanically activated enzymatic hydrolysis / Bychkov A.L., Lomovsky O.I. // International Conf. "Catalysis for Renewable Sources: Fuel, Energy, Chemicals" (Tsars Village (St. Petersburg), Russia, June 28 - July 2.2010): book abstr. - St. Petersburg, 2010. - P. 83.

Патенты

16. Профилактический антибактериальный препарат и способ его получения :пат. РФ : МКП6 A6IК 36/064, А61Р 1/00 / О.И. Ломовский, К.Г. Королёв, А .Л. Бычков, С.Г. Колдыбаев. - № заявки 2009122130/15(030590); заявл. 09.06.2009; положит, решение. 23.06.2010.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю д.х.н., О.И. Ломовскому за руководство и неоценимую помощь в обсуждении полученных результатов, к.х.н. К.Г. Королёву, д.х.н. Е.И. Рябчиковой, к.х.н. Политову, к.х.н. М.А. Михайленко за помощь в проведении экспериментальных работ.

Автор признателен веем сотрудникам Лаборатории химии твёрдого тела ИХТТМ СО РАН за помощь и поддержку.

Изд. Лип. ИД № 04060 от 20.02.2001

Подписано к печати и в свет 10.08.2010 Формат 60x84/16. Бумага № I. Гарнитура "Times New Roman".

Печать оперативная. Печ. л. 1,5. Уч.-изл. л. 1,2. Тираж 100. Заказ X« 105. Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. A.B. Николаева СО РАН Просп. Акад. Лаврентьева, 3, Новосибирск. 630090

Сокращения и условные обозначения

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Биополимеры клеточном стенки дрожжей Ю

1.1.1. Химический состав и строение клеточной стенки дрожжей

1.1.2. Супрамолекулярная структура белков

1.1.3. Супрамолекулярная структура полисахаридов клеточной стенки

1.1.4. Пространственная организация биополимеров клеточной стенки дрожжей: полисахаридов и глико протеинов

1.2. Роль полисахаридов в структурной организации клегочной стенки. Основные компоненты клеточной стенки

1.2.1. р-1,3-Глюкан и р-1,6-глюкан- компоненты, определяющие механическую прочность клеточной стенки

1.2.2. Маннопротеины - источник биологически активных маннанолигосахаридов

1.3. Фнзнко-хпмичсские особенности полимерного состояния вещества

1.3.1. Химические особенности полимерного состояния вещества

1.3.2. Физические особенности полимерного состояния вещества

1.4. Механическая обработка биополимеров и её химико-технологическое применение

1.5. Химическая и механическая обработка клеточной стенки н сё технологическое применение

1.6. Маинанолигосахарпды - экологически чистые заменители антибиотиков в животноводстве ;

1.7. Цель и задачи исследования

2. Экспернмешпалънап часть

2.1. Характеристика реагентов, материалов и мегодов физико-химического анализа

2.2. Методика проведения механической обработки и химических реакции

2.2.1. Механическая обработка

2.2.2. Проведение ферментативного гидролиза

2.2.3. Получение укрупнённой партии маннанолигосахаридных препаратов

2.3. Исследование исходной биомассы, продуктов механической и химической обработки физико-химическими методами

2.3.1. Физико-химические методы исследования

2.3.2. Исследование структуры и дефектности клеточной стенки методами электронно-микроскопического анализа

3. Результаты и обсуждение

3.1. Гидролиз полимеров клеточной стенки S. cerevisiae

3.1.1. Гидролиз полимеров исходной биомассы

3.1.2. Гидролиз продуктов, полученных по классической технологии

3.2. Влияние механической обработки на дефектность структуры клеточной стенки и эффективность щелочного гидролиза

3.2.1. Изменение выхода растворимых маннанолигосахаридов

3.2.2. Влияние химических реагентов и нейтральной абразивной добавки на эффективность процесса.

3.2.3. Изменение структуры и дефектности полимеров клеточной стенки

3.3. Влияние механической обработки целлюлозолитпческнх ферментов на их реакционную способность

3.3.1. Устойчивость ферментов в условиях ме.чашгческон обработки без субстрата

3.3.2. Устойчивость ферментов в условиях механической обработки в присутствии субстрата

3.4. Влияние механической обработки на структуру клеточной стенки и эффективность ферментативного гидролиза составляющих её полимеров

3.4.1. Изменение структуры и дефектности полимеров клеточной стенки, а также выхода маннанолигосахаридов при обработке ферментами целлюлазного типа

3.4.2. Основные превращения в биополимерах клеточной стенки дрожжей в результате механоферментативного гидролиза

3.5. Технологическая схема механоферментативного способа получения препаратов с повышенным содержанием маннанолигосахаридов и результаты их испытания

Согласно современным представлениям, под термином «механохимия» понимают науку, изучающую превращения вещества при механических воздействиях [1].

Становление механохимии как науки в России началось с работ Флавиана Михайловича Флавицкого. Изучение реакций между твердыми телами привело Флавицкого к постановке новых методов химического анализа твёрдых тел, и к изобретению в 1901 г. "Карманной лаборатории для изучения химии твердых веществ в применении к анализу" [2].

Дальнейшее развитие механохимия в России получила после Великой Отечественной войны в связи с исследованиями взрывчатых веществ [3, 4]. Практически одновременно с этим, благодаря работам Бутягина П.Ю. [5], Барамбойма Н.К. [6], Берлина А.А. [7] и др., начала бурно развиваться механохимия полимерных материалов; постепенно оформившаяся в самостоятельную ветвь механохимии.

Относительная простота экспериментов, и распространённость в производстве операций, связанных с механической обработкой, постоянно привлекало внимание учёных и технологов к механохимии как потенциальному методу решения прикладных задач. Большинство достижений в прикладной механохимии были сделаны на пересечении со смежными областями знаний, например, с физико-химической механикой, созданием новых материалов [8], биотехнологией [9], химией лекарственных веществ [10-12], экологией [13] и т.д.

Хотя исторически механохимию связывают сугубо с материаловедческими задачами, её возможности на настоящее время гораздо шире. Получение быстрорастворимых лекарственных препаратов \ [14], механосинтез органических и неорганических соединений [15], получение тугоплавких и абразивных материалов [16], интенсификация процессов переработки техногенных отходов и биогенного сырья [17-19] — это лишь неполный список задач, иллюстрирующий современные возможности механохимии.

Однако, несмотря на постепенный рост интереса к механохимии, промышленные применения лабораторных разработок немногочисленны. Отчасти это связано с тем, что большинство приложений требует оборудования большой энергонапряжённости и производительности. Оборудование, отвечающее обоим этим критериям одновременно, пока является редкостью. Большинство энергонапряжённых активаторов обладают низкой производительностью, а широко распространённое в промышленности мельничное оборудование не обеспечивает должной энергонапряжённости [20-21]. В связи с этим, на данный момент реализованы лишь разработки, позволяющие получать дорогостоящие продукты (например, обработка золотосодержащего сырья), или разработки, в которых высокие энергонапряжённости не требуются или даже противопоказаны (например, переработка биогенного сырья [22-23], получение лекарственных средств [14].

Другим фактором, сдерживающим промышленное применение лабораторных механохимических разработок, является недостаток фундаментальных знаний о протекании процессов при механическом воздействии. Долгое время большинство исследований было направлено на то, как максимально увеличить поверхность вещества при минимальных затратах энергии.

В своём обзоре [24] академик Болдырев В. В. отметил, что механохимия, как наука, находится на рубеже, когда массив первичных экспериментальных данных уже накоплен, но интерпретация эффектов механохимических процессов часто сводится к выводам типа: «в ходе проведения механической активации происходит накопление в кристаллах дефектов и, как следствие этого, реакционная способность увеличивается». Автор настаивает, что основной целью учёных, занятых проблемами механохимии и смежных областей, является осмысление уже накопленных данных с целью установления механизмов протекания процессов при механической обработке.

Если в механохимии неорганических материалов изучение механизмов началось раньше и протекает более интенсивно, то интерес к механизмам механических превращений органических и биогенных соединений, молекулярных кристаллов только начинает развиваться. Несмотря на ежегодное увеличение числа опубликованных работ по данной теме, недостаток фундаментальных знаний ощущается сильно.

В 50-60-х годах проведены исследования по изучению процессов механической обработки синтетических полимеров и индивидуальных органических веществ [5, 25-26]. Именно тогда было установлено, что при механической обработке полимеров происходит разрыв ковалентных связей с образованием свободных радикалов, установлены многие эмпирические закономерности механокрекинга полимеров [6]. Работы же по изучению процессов, происходящих при механической обработке биополимеров, биогенного сырья (являющегося комплексом биополимеров), в основном, направлены на достижение технологических эффектов и не раскрывают механизмов превращений.

Биогенные полимеры и их комплексы — биогенное сырьё - широко распространены и обладают огромным промышленным потенциалом. Поэтому изучение процессов, происходящих при их механической обработке, а также химических реакций, сопряжённых с механической обработкой, является приоритетной задачей не только с точки зрения фундаментальной науки, но и с точки зрения рационального использования природных ресурсов в химической технологии.

Дрожжевая биомасса, а именно клеточная стенка дрожжей Saccharomyces cerevisiae представляет собой супрамолекулярный комплекс полимеров, большинство из которых имеет важное практическое значение [27-31]. Процессы, происходящие при механохимической обработке данного объекта, практически не изучены. В связи с этим изучение механохимических превращений биополимеров дрожжевой клеточной стенки является актуальной задачей.

Целью данной работы является экспериментальное изучение физико-химических процессов, протекающих при механически активированном ферментативном гидролизе полимеров клеточной стенки дрожжей, выявление возможности использования этих процессов в химической технологии для получения биологически активных препаратов.

В работе поставлены следующие задачи: исследование реакционной способности биополимеров клеточной стенки по отношению к гидролизу различными агентами; выявление физико-химических процессов, происходящих при механической и химической обработке дрожжевой биомассы; изучение изменений супрамолекулярной структуры полимеров клеточной стенки при механической обработке и при гидролизе целлюлозолитическими ферментами и другими реагентами; определение оптимальных условий проведения механоферментативного процесса, установление стабильности реагентов и получаемых продуктов; определение эффективности применения данного подхода в качестве промышленного метода получения биологически активных добавок.

На защиту выносятся: механизм ферментативного гидролиза биополимеров клеточной стенки, приводящий к деполимеризации р-глюкана и повышению доступности маннанолигосахаридов; процессы, протекающие при механохимической обработке дрожжевой биомассы со щелочными, кислотными и абразивными добавками; особенности механизма механически активированного ферментативного гидролиза полимеров клеточной стенки, приводящего к увеличению количества доступных маннанолигосахаридов; изменения дефектности структуры полимеров клеточной стенки, протекающие при механически активированном ферментативном гидролизе дрожжевой биомассы; оптимальные условия проведения механически активированного ферментативного гидролиза, стабильность реагентов и продуктов реакции; антибактериальная эффективность препарата, полученного по предложенной механоферментативной схеме обработки дрожжевой биомассы.

1. Обзор литературы

5. Выводы

1. Обработка клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae ферментами, обладающими эндо-деполимеразной активностью по отношению к полисахаридам, в жидкой фазе приводит к нарушению целостности структурообразующего элемента клеточной стенки — (3-глюкана и, как следствие, увеличению выхода ковалентно связанных с ним маннанолигосахаридов примерно в 6 раз.

2. Механическая обработка клеточной стенки в течение 2 минут (активатор АГО-2, ускорение 20 g) увеличивает эффективность щелочной экстракции маннанолигосахаридов в 1,7 раза вследствие нарушения структуры Р-глюкана.

3. На основе полученных данных по ферментативному гидролизу и механической обработке впервые предложена механоферментативная схема получения препаратов с повышенным содержанием биологически доступных маннанолигосахаридов. Схема включает механическую обработку дрожжевой биомассы в присутствии ферментов, компактирование полученного композита и прогрев компакта (ферментативный гидролиз).

4. Механическая обработка клеток S. cerevisiae в смеси с ферментами обеспечивает образование реакционноспособного композита, в котором фермент недиффузионным образом распределяется среди клеточных стенок. Показано увеличение реакционной способности полимеров клеточных стенок в процессе механической обработки. При механической обработке часть клеток разрушается и в ходе последующего прогрева служит центрами локализации ферментативного гидролиза. Компактирование композита обеспечивает тесный контакт между клетками и протекание реакции гидролиза Р-глюкана клеточных стенок в режиме автолокализации.

5. В процессе ферментативного гидролиза глюкосахариды отщепляются от глюкановых полимеров и глюкопротеинов. В результате возрастает выход маннанолигосахридов, а также уменьшается степень полимеризации глюкановых полимеров и доля глюкосахаридов, связанных с белками.

6. Благодаря проведению механоферментативного гидролиза выход при экстракции суммы доступных маннанолигосахаридов увеличивается в 2,9 раза с 1,3 % до 3,8%.

7. Публикации по теме диссертации

Тезисы в сборниках трудов конференций

1. Бычков, А.Л. Механохимическое получение манноолигосахаридных препаратов из клеточной стенки дрожжей // Студент и научно-технический прогресс: Тез. докл. XLV Международной научной студенческой конф. 10 -12 апреля 2007 г. - Новосибирск, 2007. С. 6.

2. Бычков, А.Л., Королёв, К.Г Наночастицы металлов в контрастировании механических нарушений надмолекулярных структур клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae II Студент и научно-технический прогресс: Тез. докл. XLVI Международной научной студенческой конф. 26 - 30 апреля 2008 г., С. 12.

3. Koroliov, K.G., Bychkov, A.L., Ryabchikova, E.I., Lomovsky, O.I. Cell wall transformation during mechanical activation // Mechanochemistry and Mechanical Alloying: International Conf. December 1-4, 2008, Jamshedpur, India. - P. 22.

4. Bychkov, A.L., Ryabchikova, E.I., Korolev, K.G., Lomovsky, O.I. The changes of yeast cell under action mechanoenzymatical treatment // Fundamental bases of mechanochemical technologies: III International conference, May 27-30, 2009, Novosibirsk, Russia. - P. 194.

5. Bychkov, A.L., Ryabchikova, E.I., Korolev, K.G., Lomovsky, O.I. Obtaining mannanoligosaccharide additive by means of the mechanoenzymatic hydrolysis of yeast biomass // Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology: 2nd Annual Russian-Korean Conference, March 15-18, 2010, Novosibirsk, Russia. - P. 57.

6. Bychkov A.L., Lomovsky O.I. The practical application of mechanically activated enzymatic hydrolysis // Catalysis for Renewable Sources: Fuel, Energy, Chemicals: International Conference, June 28 - July 2, 2010, Tsars Village (St. Petersburg), Russia. - P 83.

Статьи в сборниках трудов конференций

7. Бычков, А.Л., Королёв, К.Г., Рябчикова, Е.И., Ломовский, О.И. Получение наночастиц серебра восстановлением гетерофазными продуктами ферментативного гидролиза клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae II Нанотехнологии и наноматериалы для биологии и медицины: Сб. материалов науч.-практич. конф. с международ, участием, 11-12 октября 2007 г. - Новосибирск, 2007. - Т. 1. - С. 41-48.

8. Королёв, К.Г. Бычков, A.JI., , Рябчикова, Е.И., Ломовский Изменение морфологии клеточной стенки в ходе механохимической обработки // Техническая химия. От теории к практике: Сборник докладов Международной конф. 8-12 сентября, 2008 г. - Пермь, 2008. - Т.1. - С. 244-248.

9. Бычков, А.Л: Активация ферментативного гидролиза полисахаридов клеточной стенки S. cerevisiae с целью получения антибактериальных препаратов // Материалы Пятого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. 2-4 декабря 2008 г. -М.: ИАЦ, 2008. - С. 314-319.

10. Бычков А .Л., Королёв К.Г., Рябчикова Е.И, Ломовский О.И., Изменение морфологии клеточной стенки при механической активации дрожжевых и растительных клеток // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: Сборник докладов IV Всероссийской конференции. 21-23 апреля 2009 г. - Барнаул, 2009. - С. 63-65.

11. Бычков А.Л., Получение композитного препарата, содержащего стабилизированные наночастицы серебра // Создание новых материалов для эксплуатации в экстремальных условиях: Сборник докладов международной конф. 16-19 ноября 2009 г. - Якутск, 2009. - С. 183-185.

Статьи в журналах

12. Бычков, А.Л., Рябчикова, Е.И., Королев, К.Г., Ломовский, О.И.

Изменение супрамолекулярной структуры клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae при механоферментативной обработке // Химия в интересах устойчивого развития. - 2009. - № 5. - С. 479-486.

13. Бычков, А.Л., Королев, К.Г., Рябчикова, Е.И., Ломовский; О.И. Изменения клеточной стенки при механической активации растительной и дрожжевой биомассы // Химия растительного сырья. - 2010. - № 1. - С. 4956.

14. Бычков, А.Л., Ломовский, О.И. Влияние механической обработки на активность целлюлозолитического препарата // Журнал прикладной химии. -2010.-Т. 83.-№6.-С. 1051-1053.

15. Bychkov, A.L., Korolev, K.G., Lomovsky, O.I. Obtaining mannanoligosaccharide preparations by means of the mechanoenzymatic hydrolysis of yeast biomass // Applied Biochemistry and Biotechnology. Принята к печати 18.04.2010. С 29.04.2010 доступна по электронному адресу www.springerlink.com/content/k094xq7rl 1572p25/?p=a30a78eb83724f3b83377 65d91c6f321&pi=62

Патенты

16. Ломовский О.И., Королёв К.Г., Бычков А. Л., Колдыбаев С.Г. Профилактический антибактериальный препарат и способ его получения // Пат. РФ. № заявки 2009122130/15(030590). - Положительное решение о выдаче патента от 23.06.2010.

4. Заключение

Изучены процессы, происходящие при механической обработке и последующем ферментативном гидролизе дрожжевой биомассы. Данные процессы интересны в плане получения профилактических антибактериальных препаратов для животноводства. Разработаны и оптимизированы способы увеличения доступности действующих веществ - маннанолигосахаридов.

Процессы, протекающие при механической обработке дрожжевой биомассы, такие как разрушение клеток, разупорядочение супрамолекулярной структуры клеточной стенки, распределение фермента по объёму субстрата, приводят к повышению реакционной способности структурообразующего компонента клеточной стенки - р-глюкана.

Определены оптимальные условия механической обработки субстрата. Соблюдение данных условий позволяет проводить механическую активацию ферментативного гидролиза полимеров клеточной стенки без заметного разложения ферментов и целевых компонентов - маннанолигосахаридов и маннопротеинов.

Проведение последующего ферментативного гидролиза, протекающего в присутствии малого количестве воды по автолокализационному механизму, позволяет частично гидролизовать (3-глюкан дрожжевых клеточных стенок и повысить доступность маннанолигосахаридов.

Предварительная механическая обработка дрожжевой биомассы и целлюлозолитических ферментов позволяет осуществлять ферментативный гидролиз более эффективно и за меньшее время.

По сравнению с известными на настоящий момент методами получения подобных препаратов, основанными на ферментативном или кислотном гидролизе дрожжевой биомассы в жидкой фазе, применение механохимических процессов позволяет избегать жидкофазных стадий и использования органических реагентов.

Проведены предварительные испытания полученных препаратов. Результаты испытаний демонстрируют эффективность применения предложенного препарата в качестве профилактического антибактериального средства.

1. Болдырев, В.В. Механохимия // Химическая энциклопедия. — М., «Большая российская энциклопедия», 1992. - Т. 3. - С. 77.

2. Flavitsky, F. Pocket-laboratory // Pat. USA. № 719.776. - 3.02.1903.

3. Горст, А.Г. Пороха и взрывчатые вещества. М., Оборонгиз, 1949. -224 с.

4. Юлий Борисович Харитон (к 75-летию со дня рождения) / Н.Н. Семенов, В.Н. Кондратьев, М.А. Садовский, Я.Б. Зельдович, А.Н. Дремин // Физика горения и взрыва. 1979. - № 6. - С. 163-165.

5. Бутягин, П.Ю. Спектры ЭПР, конформация и химические свойства свободных радикалов в твердых полимерах / П.Ю. Бутягин, A.M. Дубинская, В.А. Радциг// Успехи химию 1969. - Т. 38, № 4. - С. 593-623.

6. Барамбойм, Н.К. Механохимия высокомолекулярных соединений. — М.: Химия, 1971.-364 с.

7. Берлин, А.А. О некоторых биологических проблемах механохимии природных полимеров // Биофизика. 1963. - Т. 8 - С. 28-33.

8. Душкин, А.В. Возможности механохимической технологии органического синтеза и получения новых материалов // Химия в интересах устойчивого развития. 2004. - Т. 12. - № 3. - С. 251-274.

9. Дубинская, A.M. Механохимия лекарственных веществ // Хим. фарм. журнал. 1989. -№. 23. - С. 754-764.

10. Северцев // Химия в интересах устойчивого развития. — 1994. — № 2. С. 455-459.

11. Shakhtshneider, Т.Р., Boldyrev, V.V. In «Reactivity of Molecular Solids» / Ed. E. Boldyreva, V. Boldyrev. 1999, John Wiley & Sons, Ltd., P. 271-311.

12. Ломовский, О.И. Механохимические методы в решении экологических задач // Химия в интересах устойчивого развития. — 1994. — № 2. С. 473-482.

13. Душкин, А.В., Тимофеева, Н.В. Способ получения быстрорастворимой таблетированной формы, содержащей ацетилсалициловую кислоту // Пат. РФ № 2170582. 20.07.2001.

14. Tanaka, К. Solvent-free organic synthesis / К. Tanaka, F. Toda // Chem. Rev.-2000.-№ 100.-P. 1025-1074.

15. Болдырев, B.B. Механохимия твёрдых неорганических веществ / В.В. Болдырев, Е.Г. Аввакумов // Успехи химии. 1971. - №. 10. - С. 1835-1856.

16. Горохова, В.Г. Импульсная механохимическая обработка полимеров растительного происхождения / В.Г. Горохова, JI.H. Петрушенко, А.А. Шишко, В.Г.Чернова // Доклады академии наук. 1995. - №. 343. - С. 6264.

17. Ефанов, М.В. Нитрование механохимически активированной лузги подсолнечника / М.В. Ефанов, А.В. Забелина // Хим. природ, соед. — 2002. № 6. -С. 482-483.

18. Королёв, К.Г. Механохимия карбоксил- и гидроксилзамещенных органических соединений и ее технологическое применение: Дис. канд. хим. наук: 02.00.21 / К.Г. Королёв. ИХТТМ СО РАН. Новосибирск, 2005. -147 с.

19. Болдырев, В.В. Механохимия и механическая активация твёрдых веществ // Успехи химии. 2006. - Т. 75. — № 3. — С. 203-216'.

20. Каргин В.А., Слонимский Г.Л. Краткие очерки по физикохимии полимеров. Химия. Москва, 1967, с. 129.

21. Капустян, В.М. Полимеризация мономеров в твердой фазе в условиях высокого давления и напряжений сдвига / В.М. Капустян, А.А. Жаров, Н.С. Ениколопян // ДАН СССР. 1968. -№ 179. - С. 627-628.

22. Белоусова, Н.И. Получение смесей аминокислот на основе автолизатов дрожжей Saccharomyces, выращенных на этаноле или сахарах / Н.И. Белоусова, С.В. Гордиенко, В.К. Ерошин, В.Я. Ильченко // Биотехнология. 1990. - № 3: - С. 6-9.

23. Комплексная переработка дрожжевой биомассы / В.К. Латов, Т.Л. Бабаян, С.В. Гордиенко, А.С. Коган, В.А. Цыряпкин, В.М. Беликов // Биотехнология. 1990. - № 3. - С. 14-17.

24. Бабаян, Т.Л. Выделение физиологически активного маннана и других полисахаридов из автолизатов пекарских дрожжей / Т.Л. Бабаян, В.К. Латов // Биотехнология. 1992. - № 2. - С. 23-26.

25. Lazzari, F. Product based о polysaccharides from baker's yeast ad its use as a technological coadjuvant for bakery products // Pat. USA. № 6.060.089. -9.05.2000.

26. Liu, X.Y. A new method of p-D-glucans from spent yeast Saccharomyces cerevisiae / X.Y. Liu, Q. Wang, S.W. Cui, H.Z. Liu // Food Hydrocolloids. -2008. № 22. - P. 239-247.

27. Бирюзова, В.И. Ультраструктурная организация дрожжевой клетки. -М.: Наука, 1993.-224 с.

28. Jackson, P. The analysis of fluorophore-labeled glycans by high-resolution polyacrylamide gel electrophoresis // Analytical Biochemistry. 1994 - V. 216 -P. 243-252.

29. Strahl-Bolsinger, S. Protein O-mannosylation / S. Strahl-Bolsinger, M. Gentzsch, W. Tanner // Biochimica et Biophysica Acta. 1999 - V. 1426 - P. 297-307.

30. Klis, F.M. Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae / F.M. Klis, P: Mol, K. Hellingwerf // FEMS Microbiology Reviews. 2002 - V. 26 - P. 239-256.

31. Smith, A.E. Wall material properties of yeast cell: Part 1. Cell measurements and compression experiments / A.E. Smith, Z. Zhang, C.R. Thomas // Chemical Engineering Science. 2000 - V. 55 - P. 2031-2041.

32. Smith, A.E. Wall material properties of yeast cell. Part II. Analysis / A.E. Smith, K.E. Moxham, A.P.J. Middelberg II Chemical Engineering Science. -2000 V. 55 - P. 2043-2053.

33. The mechanical properties of Saccharomyces cerevisiae / A.E. Smith, Z. Zhang, C.R. Thomas, K.E. Moxham, A.P.J. Middelberg // PNAS. 2000. - V. 97.-№ 18.-P. 9871-9874.

34. Калебина, Т.С. Роль белков в формировании молекулярной структуры клеточной стенки дрожжей / Т.С. Калебина, И.С. Кулаев // Успехи^ биологической химии. 2001. - Т. 41. - С. 105-130.

35. Manners, D.J. The structure of a (3-(l-3)-D-glucan from yeast cell walls / D.J. Manners, A.J. Masson, J.C. Patterson // Biochem. J. 1973 - V. 135 - P. 1930.

36. Manners, D.J. The structure of a (3-(l-6)-D-glucan from yeast cell walls / D.J. Manners, A.J. Masson, J.C. Patterson // Biochem. J. 1973 - V. 135 - P. 3136.

37. Muller, A. The application of various protic acids in the extraction of (1-3)-P-D-glucan from Saccharomyces cerevisiae / A. Muller, H. Ensley, H. Pretus // Carbohydrate Research. 1997 - V. 299 - P. 203-208.

38. Zlatkovic, D. A glucan from active dry baker's yeast {Saccharomyces cerevisiae): A chemical and' enzymatic investigation of the structure / D. Zlatkovic, D. Jacovljevic, D. Zekovic, M.M. Vrvic // J. Serb. Chem. Soc. 2003. -V. 68,№ 11.-p. 805-809.

39. Frevert, J. Saccharomyces cerevisiae structural cell wall mannoprotein / J. Frevert, C.E. Ballou // Biochemistry. 1985. - № 24. - P. 753-759.

40. Страйер Л. Биохимия. В 3 томах. М.: Мир, 1984.

41. Ленинджер А. Основы биохимии. В 3 томах. М.: Мир, 1985.

42. Щербаков, В.Г., Лобанов, В.Г., Прудникова; Т.Н., Минакова, А.Д. Биохимия. СПб.: ГИОРД, 2003. - 440 с.

43. Anfmsen С. Principles that govern the folding of protein chains // Science. 1973. -№ 181. - P. 223-229.

44. Impact of natural variation, in bacterial F17G adhesins on crystallization behaviour / L. Buts, A. Wellens, I. Molle, L. Wyns, R. Loris, M. Lahmann, S. Oscarson // Acta Ciystallogr. D Biol. Ciystallogr. 2005. - № 61. - P. 1149-59.

45. The X-ray crystal structure of the Trichoderma reesei family 12 endoglucanase 3, Cell2A, at 1.9 A resolution / M. Sandgren, A. Shaw, Т.Н.

46. Ropp, S. Wu, R. Bott, A.D. Cameron, J. Stahlberg, C. Mitchinson, T.A. Jones // J. Mol. Biol. 2001. - V. 308, № 2. - P. 295-310.

47. Кантор, Ч., Шиммел, П. Биофизическая химия. М.: Мир. 1985 в 3-х тт.

48. Chunga, H.J. Impact of molecular structure of amylopectin and amylose on amylose chain association during cooling / H.J. Chunga, Q. Liu // Carbohydrate Polymers. 2009. - V. 77, № 4. - P. 807-815.

49. Caia, L. Structure and digestibility of crystalline short-chain amylose from debranched waxy wheat, waxy maize, and waxy potato starches / L. Caia, Y.C. Shi // Carbohydrate Polymers. 2010. - V. 79, № 4. - P. 1117-1123.

50. The agarose double helix and its function in agarose gel structure / A. Struther, A. Fulmer, W. E. Scott, С. M. Dea, R. Moorhouse, D. A. Rees // Journal of Molecular Biology. 1974. - V. 90, № 2. - P. 269-272.

51. Manners, D.J. The fine structure of amylopectin / D.J. Manners, N.K. Matheson // Carbohydrate Research. 1981. - V. 90, № 1. - P. 99-110.

52. Mazeau, K. Conformational analysis of xylan chains / K. Mazeau, C. Moine, P. Kraus, V. Gloaguen // Carbohydrate Research. 2005. - V. 340, № 18. - P. 2752-2760.

53. Atalla, R.H. Native cellulose: a composite of two distinct crystalline forms / R.H. Atalla, D.L. VanderHart //Science. 1984. - V. 223. - P. 283-285.

54. Современные представления о строении целлюлоз / JI.A. Алешина, С.В. Глазкова, J1.A. Луговская, М.В. Подойникова, А.Д. Фофанов // Химия растительного сырья. 2001. - №. 1. - С. 5-36.

55. Manners, D.J. Enzymic Synthesis and Degradation of Starch and Glycogen // Advances in Carbohydrate Chemistry. 1963. - V. 17. - P. 371-430.

56. Синицын А.П., Гусаков A.B., Черноглазов B.M. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. М.: МГУ, 1995. 224 с.

57. Schreuder, M.P. Targeting of a heterologous protein to the cell wall of Saccharomyces cerevisiae / M.P. Schreuder, S. Brekelmans, H. Ende, F.M. Klis // Yeast. 1994. - V. 9, № 4. - P. 399-409.

58. Рабинович, M.JI. Хвостатые ферменты / М.Л. Рабинович, М.С. Мельник// Природа. -2003. -№ 5. С. 24-31.

59. Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология. Изд.: Академия, 2005. - 480 с.

60. Hunter, J.B. Kinetics of enzymatic lysis and disruption of yeast cell: I. Evaluation of two lytic systems with different properties / J.B. Hunter, J.A. Asenjo // Biotechnology and Bioengineering. 1987. - V. 30. - P. 471-480.

61. Hunter, J.B. Kinetics of enzymatic lysis and disruption of yeast cell: II. A simple model of lysis kietics / J.B. Hunter, J.A. Asenjo // Biotechnology and Bioengineering. 1987. - V. 30. - P. 481-490.

62. Liu, L.C. Optimization of enzymatic lysis of yeast / L.C. Liu, G.J. Prokopakis, J.A. Asenjo // Biotechnology ands Bioengineering. 1988. - V. 32. -P. 1113-1127.

63. Morris, G.J. Effect on osmotic stress on the ultrastructure and viability of die yeast Saccharomyces cerevisiae / G.J. Morris, L. Winters, G.E. Coulson, K.J. Clarke // J. Gen. Microbiol. 1986. - № 129. - P. 2023-2034.

64. Harthmann, C. Numerical simulation of the mechanics of a yeast cell under high hydrostatic pressure / C. Harthmann, A. Delgado // Journal of Biomechanics. 2004. - V. 37. - P. 977-987.

65. Direct observation of cell wall glucans in whole cells of Saccharomyces13 ♦cerevisiae by magic-angle spinning С -NMR / E. Krainer, R.E. Stark, F. Naider, K. Alagramam, J.M. Becker // Biopolymers. 1994. - № 34. - P. 1627-1635.

66. Architecture of the yeast cell wall. p(l-6)Glucan interconnects mannoprotein, p-(l-3)glucan, and chitin / R. Kollar, B.B. Reinhold, E. Petrakova, H.J. Yeh, G. Ashwell, J.C. Kapteyn // J. Biol. Chem. 1997. - № 272. - P. 17762-17775.

67. Kokorevics, A. Cellulose depolimerization to glucose and other water soluble polysaccharides by shear deformation and high pressure trearment / A. Kokorevics, J. Gravitis // Glycoconjugate Journal. 1997 - V. 14 - P. 669-676.

68. Голязимова, O.B. Механическая активация ферментативного гидролиза лигноцеллюлозы / O.B. Голязимова, А.А. Политов, О.И. Ломовский // Химия растительного сырья. 2009. -№ 2. - С. 59-63.

69. Голязимова, О.В. Увеличение эффективности измельчения лигноцеллюлозного растительного сырья с помощью химической обработки / О.В. Голязимова, А.А. Политов, О.И. Ломовский // Химия растительного сырья. 2009. — С. 53-57.

70. Firon, N. Interaction of mannose-containing oligosaccharides with the fimbrial lectin of Escherichia coli / N. Firon, I. Ofek, N. Sharon // Biochemical and biophysical research communications. 1982. - V. 105, № 4. - P. 14261432.

71. Speights, R.M., Downing, S.L. Method for inhibiting the growth of Salmonella И Pat. USA. -№ 5.032.579. 16.07.1991.

72. Binding of mannan-binding protein to various bacterial pathogens of meningitis / L.C.V. Emmerik, E.J. Kuijper, C.A. Fijen, J. Dankert, S. Thiel // Chin. Exp. Immunol. 1994. - № 97. - P. 411-416.

73. Gadjeva, M. Mannan-binding lectin a soluble pattern recognition molecule / M. Gadjeva, K. Takahashi, S. Thiel // Molecular immunology. - 2004. - V. 41, №2. - P. 113-121.

74. Howes, A.D., Newman, K.E. Compositions and methods for removal of mycotoxins from animal feed // Pat. USA. № 6.045.834. - 4.04.2000.

75. Oda, Y. Interactions of cadmium with yeast mannans / Y. Oda, S. Ichida, S. Aonuma, T. Shibahara // Chem. Pharm. Bull. 1988. - V. 36. - № 7. - P. 2695-2698.

76. Alloush, H.M. 3-Phosphoglycerate kinase: a glycolytic enzyme protein present in the cell wall of Candida albicans / H.M. Alloush, J.L. Lopez-Ribot, B.J. Masten, W.L. Chaffin // Microbiology. 1997. - V. 143. - P. 321—330.

77. Готтшалк А. Гликопротеины. Tl. M.: Мир, 1969. - 304 с.

78. Jentoft, N. Why are proteins O-glycosylated? // Trends Biochem. Sci. -1990.-V. 15.-P. 291—294.

79. Nakajima, T. Structure of the linkage region between the polysaccharide and protein parts of Saccharomyces cerevisiae mannan / T. Nakajima, C.E. Ballou // J. Biol. Chem. 1974. - V. 249. - P. 7685-7694.

80. Rosenfeld, L. Acetolysis of disaccharides: comparative kinetics and mechanism / L. Rosenfeld, C.E. Ballou // Carbohydr. Res. 1974. - V. 32. - P. 287-298.

81. Structure and properties of the extracellular inulinase of Kluyveromyces marxianus CBS 6556 / R.J. Rouwenhorst, M. Hensing, J. Verbakel, W.A. Scheffers, J.P. Van Dijken II Appl. Env. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 33373345.

82. Conzelmann, A. A major 125-kd membrane glycoprotein of Saccharomyces cerevisiae is attached to the lipid bilayer through an inositol-containing phospholipid / A. Conzelmann, H. Reizman, C. Desponds, C. Bron // EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 2233-2240.

83. Семчиков, Ю.Д. Высокомолекулярные соединения. — M.: Академия, 2003.-368 с.

84. Acidic hydrolysis of polyaciylonitrile: effect of neighboring groups / L.B. Krentsel, Y.V. Kudiyavtsev, A.I. Rebrov, A.D. Litmanovich, N.A. Plate // Macromolecules. 2001. - V. 34, № 16. - P. 5607-5610.

85. Cho, I. Hydrophobic and ionic interactionsin the ester hydrolysis by imidazole-containing polymers / I. Cho, J.S. Shin // Bulletin of Korean Chemical Society. 1982. -V. 3, № 1. - P. 34-36.

86. Kudryavtsev, Y.V. On the kinetics of polyaciylamide alkaline hydrolysis / Y.V. Kudryavtsev, A.D. Litmanovich, N.A. Plate // Macromolecules. 1998. -V. 31, № 14. - P. 4642-4644.

87. Polowinski, S. Kinetics of hydrolysis of side groups in polyphenylmethaciylate / S. Polowinski, B. Bortnowska-Barela // Journal of Polymer Science: Polymer Chemistry Edition. 2003. - V. 19, № 1. - P. 51-55.

88. Nagase, K. Alkaline hydrolysis of polyaciylamide / K. Nagase, K. Sakaguchi // Journal of Polymer Science Part A: General Papers. 2003. - V. 3, №7.-P. 2475-2482.

89. Bevington, J.C. The alkaline hydrolysis of methyl methaciylate/isoprene copolymers. 3. Direct detection of the hydrolysed units / J.C. Bevington, J.R. Ebdon // Die Makromolekulare Chemie. 2003. - V. 153, № 1. p. 181 - 188 2003.

90. Malkin, A.Y. The high elasticity of polybutadienes with different micro-structure / A.Y. Malkin, V.G. Kulichikhin, M.P. Zabugina, G.V. Vinogradov // Polymer Science U.S.S.R. 1970. - V. 12, № 1. - p. 138-148.

91. Bartenev, G.M. Relaxation nature and regularities of breakdown of crosslinked and non-crosslinked polymers in the high-elastic state / G.M.

92. Bartenev, Y.A. Sinichkina // Polymer Science U.S.S.R. 1981. - V. 23, № 6. -P. 1554-1561.

93. Trapeznikov, A.A. High elasticity and strength of the structure of butyl rubber vulcanizates at different temperatures / A.A. Trapeznikov, L.P. Tolstogan // Polymer Science U.S.S.R. 1988. - V. 30, № 8. - P. 1680-1686.

94. Motomura, K. Viscoelasticity of linear polymer monolayers / K. Motomura, R. Matuura // Journal of Colloid Science. 1963. - V. 18, № 4. - P. 295-306.

95. Thurston, G.B. Shear rate dependence of the viscoelasticity of polymer solutions. I. Theoretical model // Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. — 1987. V. 9, № 1-2. - P. 57-68.

96. Thurston, G.B. Shear rate dependence of the viscoelasticity of polymer solutions. : II. xanthan gum // Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. -1987. V. 9, № 1-2. - P. 69-78.

97. Richardson, R.K. Non-linear viscoelasticity of polysaccharide solutions. 1: Guar galactomannan solutions / R.K. Richardson, S.B. Ross-Murphy // International Journal of Biological Macromolecules. 1987. - V. 9, № 5. - P. 250-256.

98. Richardson, R.K. Non-linear viscoelasticity of polysaccharide solutions. 2: Xanthan polysaccharide solutions / R.K. Richardson, S.B. Ross-Murphy // International Journal of Biological Macromolecules. 1987. - V. 9, № 5. - P. 257-264.

99. Yu, W. Linear viscoelasticity of polymer blends with co-continuous morphology / W. Yu, W. Zhou, C. Zhou // Polymer. 2010. - V. 51, № 9. - P. 2091-2098.

100. Дубинская, A.M. Превращения органических веществ под действием механических напряжений // Успехи химии. 1999. - Т.68, № 8. — С. 708723.

101. Tako, М. Gelation mechanism of agarose / M. Tako, S. Nakamura // Carbohydrate Research. 1988. - V. 180, № 2. - P. 277-284.

102. Labropoulos, K.C. Dynamic rheology of agar gels: theory and experiments. Part I. Development of a rheological model / K.C. Labropoulos, D.E. Niesz, S.C. Danforth, P.G. Kevrekidis // Carbohydrate Polymers. 2002. - V. 50, № 4. - P. 393-406.

103. Джимбо, Г. Аппараты для тонкого измельчения как реакторы // Известия Сибирского отделения Академии наук СССР. 1987. -№ 17, вып. 5. - С. 14-22.

104. Ушанова, В.М. Влияние степени измельчения сырья на процесс экстракции / В.М. Ушанова, С.В. Ушанов, С.М. Репях// Изв. ВУЗов. Лесной журнал. 1998. -№ 1. - С. 101-105.

105. Бандюкова, В.А. Изучение кинетики экстракции флавоноидов из растительного сырья. I. Извлечение рутина из Sida Hermaphrodita / В.А. Бандюкова, Л.В. Лигай // Хим. природ, соед. 1987. - № 5. - С. 655-657.

106. Алтунина, Л.К. Исследование структуры целлюлозосодержащих материалов в процессе механической активации / Л.К. Алтунина, Л.П. Госсен, Л.Д. Тихонова, Е.Г. Ярмухаметова // Журнал прикладной химии. -2002. Т. 75, № 1. С. 166-167.

107. Ефанов, М.В. О превращениях древесины осины и ее основных компонентов в реакции О-ацилирования // Хим. природ, соед. — 2001. № 5. -С. 410-412.

108. Рязанова, Т.В. Об интенсификации процесса экстракции коры лиственницы сибирской в дезинтеграторе / Т.В. Рязанова, Н.А. Чупрова, Н.Ю. Ким // Химия растительного сырья. 2000. -№ 1. - С. 95-100.

109. Vedernikov, N. Mechanochemical destruction of plant raw materials-polysaccharides in presence of small amounts of concentrated sulfuric acid / N.

110. Vedernikov, V. Karlivans, Г. Roze; A. Rolle // Сибирский химический'журнал: 1991. - Вып. 5i - С. 67-72.

111. Kuzuya, М. Mechanolysis of glucose-based polysaccharides as studied by electron spin resonance / M. Kuzuya, Y. Yamauchi, S. Kondo // J. Phys. Chem. B. 1999. - № 103. - P. 8051-8059.

112. Lam, Т.Н. Removal of phenolics from plant extracts by grinding with anion exchange resin / Т.Н. Lam, M. Shaw // Biochem. Biophys. Res. Comm; -1970. V. 39, № 5. - P. 965-968;

113. Middelberg A.P.J. Process-scale disruption of microorganisms // Biotechnology advances. 1995. - V. 13, № 3. - P. 491-551.

114. Heim; A. The effect of microorganism concentration on yeast cell disruption in a bead1 mill / A. Heim, U. Kamionowska, M. Solecki // Journal of food engineering. 2007. - № 83. - P. 121-128:

115. Sucher, R.W., Robbins, E.A., Sidoti, D.R:, Schuldt E.H., Seeley, R.D: Yeast, glycan^ and > process of making same // Pat. USA. № 3:867.554. -18.02.1975.

116. ICim, K.S. Production of soluble p-glucan from the cell wall? of Saccharomyces cerevisiae / K.S. Kim, H.S. Yun // Enzyme and Microbial Technology. 2006. - V. 39, № 3. - P. 496-500.

117. Попова, B.A. Влияние предварительной обработки кормовых дрожжей на выход щелочной белковой фракции / В.А. Попова, О.И. Игнатьева, А.Н. Тюманок // Биотехнология. 1989. - Т. 5, № 2. - С. 194-198.

118. Feliu, J.X. An optimized ultrasonic protocol for bacterial cell'disruption and recovery of beta-galactosidase fusion^proteins / J.X. Feliu, A. Vilaverde // Biotechnol. Tech. 1994'. -№ 8. - P. 509-514.

119. Дамберг, Б.Э. О токсическом' действии цистеина, на клетки Saccharomyces cerevisiae, растущие на средах различного состава / Б.Э. Дамберг, Я.Э. Блумберг // Микробиология. 1983. - Вып.' 1, Т. 52! - С. 6872.

120. Nikaido, Н. Molecular basis of outer membrane permeability / Н.г Nikaido, M. Vaara // Microbiol: Rev. 1985. - № 49. - P. 1-32.

121. Marvin, H.J. Release of outer membrane fragments from wild type Esherichia coli and from several E. coli lipopolysaccharide mutants by EDTA and heat shock treatments / H.J. Marvin, M.B.A. Beest, B. Witholt // J. Bacteriol.- 1989. -№ 171. P. 5262-5267.

122. Ames, G.F.L. Simple, rapid; and quantitative release of periplasmic proteins by chloroform / G.F.L. Ames, C. Prody, S. Kustu // J. Bacteriol. 1984. -№ 160.-P. 1181-1183.

123. Laouar, L.L. Yeast permeabilization with surfactants / L.L. Laouar, B.J. Mulligan, K.C. Lowe// Biotechnol. Lett. 1992. -№ 14. - P. 719-720.

124. Methods for DNA extraction from Candida albicans / P.M. Glee, P.J. Russell, J.O. Welsch, J.C. Pratt, J.E. Cutler // Analytical Biochemistiy. 1987. -№ 164.-P. 207-213.

125. Hoffman, C. A ten-minute DNA preparation from yeast efficiently releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli / C. Hoffman, F. Winston // Gene. 1987. - № 57. - P. 267-272.

126. Данилевич, B.H. Новый подход для выделения геномной ДНК из дрожжей и грибов: получение ДНК-содержащих клеточных оболочек и их прямое использование в ПЦР / В.Н. Данилевич, Е.В. Гришин // Биоорганическая химия. 2002. - Т. 28, № 2. — С. 156-167.

127. Данилевич, В.Н. Быстрая и эффективная экстракция растворимых белков из грамотрицательных микроорганизмов без разрушения клеточных стенок / В.Н. Данилевич, JI.E. Петровская, Е.В. Гришин // Биоорганическая химия. 2006. - Т. 32, № 6. - С. 579-588.

128. Изменение тонкой структуры клеток микроорганизмов под воздействием солей-хаотропов / В.И. Дуда, В.Н. Данилевич, Н.Е. Сузина, А.П. Шорохова, В.В. Дмитриев, О.Н. Мохова, В.Н. Акимов // Микробиология. 2004. - Т. 73, № 3. - С. 406-415.

129. Люминесцентно-микроскопическое изучение микроорганизмов, обработанных хаотропными агентами / В.И. Дуда, В.Н. Данилевич, В.Н. Акимов, Н.Е. Сузина, В.В. Дмитриев, А.П. Шорохова // Микробиология. — 2005. Т. 74, № 4. - С. 505-510.

130. Божков, А.И. Удаление клеточных стенок Saccharomyces cerevisiae ферментным комплексом Chaetomium globossum / А.И. Божков, И.С. Леонова, В.И. Облак // Биотехнология. 2004. - № 6. - С. 46-53.

131. Truscheit, Е., Bierling, R., Shlumberger, H.D., Oettgen, H.F. Process for the preparation of immunopotentiating agents from components of yeast cell wall material // Pat. USA. -№ 4.138.479. 6.02.1979.

132. Kitamura, K., Matsuki, S., Tanabe, K. Physiologically active polysaccharides, production ad use thereof // Pat. USA. № 4.313.934. -2.02.1982.

133. Kanegae, Y., Sugiyama, Y., Minami, K. Method for producing yeast extract //Pat. USA. -№ 4.810.509. 8.03.1989.

134. Касаткина, H.C. Дезинтеграция микроорганизмов в вихревой мельнице / H.C. Касаткина, Г.М. Левагина // Обработка дисперсных материалов и сред. 1999 - Вып. 9 - С. 66-68.

135. Кудрявцев, А.А., Гуревич, Г.А., Фихте, Б.А. Механические свойства микробных оболочек. Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1988. - 152 с.

136. Аливердиева, Д.А. Выделение оболочек клеток дрожжей // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Материалы третьего московского международного конгресса. 14-18 марта 2005 г. Москва, 2005.-С. 269.

137. Тонеева-Давидов а, Е.Г. Способ получения бета-глюканов клеточной стенки дрожжей // Пат. РФ. № RU.2216595C1. - 18.11.2002.

138. Максимюк, Н.Н., Скопичев, В.Г. Физиология кормления животных: Теории питания, приём корма, особенности пищеварения. — СПб.: Изд. «Лань», 2004 256 с.

139. Иоффе, М.Л. Влияние низкомолекулярной белковой фракции в рационе лабораторных животных на их состояние / М.Л. Иоффе, Е.В. Конник, М.Г. Безруков, Н.В. Дмитриева // Биотехнология. 1989. — Т. 5, № 1.-С. 86-92.

140. Nakamura, Т. Effects of brewer's yeast cell wall on constipation and defecation in experimentally constipated rats / T. Nakamura, K. Agata, M. Mizutani, H. lino // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. - V. 65, № 4. - P. 774780.

141. Nakakuki, T. Present status and future prospects of functional oligosaccharide development in Japan // J. Appl. Glycosci. 2005. - № 52. - P. 267-271.

142. Warrand, J., Healthy polysaccharides. The next chapter in food products // Food technol. Biotechnol. 2006. - V. 44, № 3. p. 355-370.

143. Hirayama, M. Novel physiological functions of oligosaccharides // Pure Appl. Chem. 2002. - № 74. - P. 1271-1279.

144. Oyarzabal, O.A. Fructooligosaccharide utilization by Salmonella and potential direct-fed-microbial bacteria for poultry / O.A. Oyarzabal, D.E. Conner, W.T. Blevins // J. of Food Protection. 1995. - № 58. - P. 1192-1196.

145. Effects of hen age, Bio-Mos, and Flavomycin on poult susceptibility to oral Escherichia coli challenge / A.S. Fairchild, J.L. Grimes, F.T. Jones, M.J. Winel, F.W. Edens, A.E. Sefton // Poultry Sci. 2001. - V. 80, № 5. - P. 562-571.

146. Jacques, K.A. Effect of mannanoligosaccharide on performance of calves fed acidified and non-acidified milk replacers / K.A. Jacques, K.E. Newman // J. Anim. Sci: 1993. - № 71. - P. 271.

147. Firon, N. Carbohydrate specificity of the surface lectins of Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Salmonella typhnnurmm / N. Firon, I. Oftek, N. Sharon // Carbohydrate research. 1983. - № 120. - P. 235-249.

148. Smith, S., Elbein, A.D., Pan, Y.T. Inhibition of bacterial binding by high-mannose oligosaccharides // Pat. USA. № 5.939.279. - 17.08.1999.

149. Tzipori, S. The relative importance of enteric pathogen affecting neonates of domestic animals // Advances in veterinary science and comparative medicine. 1985. - № 29. - P. 103-206.

150. Dawson, K.A., Sefion, A.E. Methods and composition for control of coccidiosis // Pat. USA. № 7.048.937.B2. - 23.05.2006.

151. Kumao, T. Mannanoligosaccharides blended coffee beverage intake increases the fat level in feces / T. Kumao, S. Fujii // Journal of health science. -2006. V. 52, № 3. - P. 329-332.

152. Effects of mannooligosaccharides from coffee mannan on fat storage in mice fed a high fat diet / I. Takao, S. Fujii, A. Ishii, L.K. Han, T. Kumao, K. Ozaki, A. Asakawa // Journal of health science. 2006. - V. 52, № 3. - P. 333337.

153. Peppier, H.J. "Production of yeast and yeast products", Microbial technology, 2nd ed., Academic press, Inc., V. 1, P. 159-185, 1979.

154. Курбатова, E.A. Набор реагентов для ферментативного определения глюкозы «Новоглюк» / Е.А. Курбатова, В.И. Пулкова, В.К. Старостина // Новости "Векгор-Бест". 2002. - Т. 24, № 2. Режим доступа www vector-best ru/nvb/n24/st24 5 htm.

155. Максименко, О.А. Метод одновременного определения различных моносахаридов в биологических объектах / О.А. Максименко, JI.A. Зюкова,

156. Н.С. Андреев, P.M. Федорович // Журнал аналитической химии. 1971. - Т. 26,вып. 12.-С. 2467-2471.

157. McMurrough, I. Effect of growth rate and4 substrate limitation on- the composition and structure of the cell wall of Saccharomyces cerevisiae / I. McMurrough, A.H. Rose I I Biochem. J. 1967. -№ 105. - P. 189-203.

158. Borzani, W. Quantitative adsorption of methylene blue by dead yeast cells / W. Borzani; M.L. Vairo // J. Bacterid. 1958. - № 76, V. 3. - P. 251-255.

159. Borzani, W. Measurement of gram-positiveness // J. Bacterid. 1960. - № 79. - V. 4. - P. 461-463.

160. Adams, C.W.M. Osmium tetroside as a histichemicab and^ histological reagent / C.W.M. Adams, Y.H. Abdulla, O.B. Bayliss // Histochemie. 1967. -№9.-P. 68-77.

161. Adams, C.W.M. Osmium tetroxide and the Marchi method; reactions witlr polar and non-polar lipids, proteins and polysaccharide- // The Journal' of Histochemistry and Cytochemistry. 1960. - V. 8, № 4. - P. 262-267.

162. Lombardi, L. Electron staining with uranyl acetate. Possible role of free amino groups / L. Lombardi, G. Prenna, L. Okolicsanyi, A. Gautier // The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1971. - V. 19; № 3. - P. 161-168.

163. Franc, S. A routine method for contrasting elastin at the ultrastructural level / S. Franc, R. Garrone, A. Bosch, J.M. Franc // The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1984. - V. 32, № 2. - P. 251-258.

164. Guimaraes, E.V. An alternative technique to reveal polysaccharides in Toxoplasma gondii tissue cysts / E.V. Guimaraes, L. Carvalho, H.S. Barbosa // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2003. - V. 98, № 7. p. 915-917.

165. Repeated use of uranyl acetate solution in section staining in transmission electron microscopy / M. Yamaguchi, M. Shimizu, T. Yamaguchi, M. Ohkusu, S. Kawamoto // Plant morphol. 2005. 17. - P. 57-59.

166. Барыкина, Р.П. Справочник по ботанической: микротехнике. Основы метода. М.: Изд-во МГУ, 2004. - 312 с.

167. Стрижко, J1.C. Биосорбенты для извлечения благородных металлов из промышленных растворов // Цветные металлы. 2003. — № 2. — С. 40-44.

168. Klaus, Т. Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated / Т. Klaus, R. Joerger, E. Olsson, C.G. Granqvist // PNAS. 1999. - V. 96, № 24. -P. 13611-13614.

169. Shin, Y. Facile stabilization of gold-silver alloy nanoparticles on cellulose nanocrystal / Y. Shin, I.T. Bae, B.W. Arey, G.J. Exarhos // J. of Phys. Chem. -2008. V. 112, № 13. - P. 4844-4848.

170. Хлебцов, Н.Г. Золотые наноструктуры с плазмонным резонансом для биомедицинских исследований / Н.Г. Хлебцов, В.А. Богатырев, J1.A. Дыкман, Б.Н. Хлебцов // Российские нанотехнологии. 2007. - Т. 2, № 3-4. - С. 69-86.

171. Synthesis of gold nanotriangles and silver nanoparticles using Aloe vera plant extract / S.P. Chandran, M. Chaudhary, R. Pasricha, A. Ahmad, M. Sastry // Biotechnol. Prog. 2006. - № 22. - P. 577-583.

172. Rapid preparation process of silver nanoparticles by bioreduction and their characterization / F. Mouxing, L. Qingbiao, S. Daohua, L. Yinghua, H. Ning, D. Xu, W. Huixuan, H. Jiale // Chinese J. Chem. Eng. 2006. - V. 14, № 1. - P. 114-117.

173. Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and their antibacterial activity / A. Panacek, L. Kvitek, R. Prucek, M. Kolan, R. Vecerova, N. Pizurova // J. Phys. Chem. B. 2006. - № 110. - P. 16248-16253.

174. Huang. J. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles by novel sundried Cinnamomus camphora leaf / J. Huang, L. Qingbao, D. Sun, L. Yinghua // Nanotechnology. 2007. - № 18. - P. 1-11.

175. Якушева JI. Д. Инактивация ферментов при механических воздействиях / Л. Д. Якушева, А. М. Дубинская // Биофизика. 1984. - Т. 29,№2.-С. 190-193.

176. Якушева Л. Д. О возможных механизмах механической инактивации ферментов / Л. Д. Якушева, А. М. Дубинская // Биофизика. 1984. - Т. 29, № 3. - С. 365 - 367.

177. Дубинская А. М. Изменение структуры коллагена под влиянием механического диспергирования // Биофизика. 1980. - Т. 25, № 4. - С. 610 -616.

178. Березин И. В. Механохимия иммобилизованных ферментов новый подход к исследованию фундаментальных проблем биохимии / И. В. Березин, А. М. Клибанов, К. Мартинек // ЖФХ. - 1975. - № 49. - С. 2519 -2527.