Биологически активные вещества из животной ткани и микроорганизмов. Методы получения и структурно-функциональные взаимосвязи тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

Для служебного пользования Экз. N

]и с и л з

На правах рукописи

ИВАНКИН АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА ИЗ ЖИВОТНОЙ ТКАНИ И МИКРООРГАНИЗМОВ . МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ВЗАИМОСВЯЗИ

Специальность 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных вешеств

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 1998

Работа выполнена на кафедре химии и биотехнологии Московского государственного университета леса, во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности и в Государственном научном центре по антибиотикам

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Неклюдов А. Д.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Катруха Г.С. доктор химических наук, профессор Розанцев Э.Г. доктор химических наук, профессор Ямсков И. А.

Ведущая организация: Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева

Защита диссертации состоится г. в /Учяс

на заседании Диссертационного совета Д 084.68.01 в Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА) по адресу: 113105, Москва, ул. Нагатинская За

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦА Автореферат разослан 1998 года.

Ученый секретарь Диссертационного Л /" о совета Д 084.68.01, "С М-л''

кандидат медицинских наук САа. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Одной из основных задач социально-экономического развития страны является обеспечение населения высококачественными веществами лекарственного и пищевого назначения.

Учитывая тенденцию роста численности населения , увеличения потребления лекарственных препаратов и необходимость расширения сырьевых источников для производства пищевых добавок, а также реальную ограниченность имеющихся природных ресурсов, задача разработки усовершенствованных методов получения сложных биологически активных веществ пищевого и медицинского назначения является актуальной.

В настоящее время в промышленном и опытно-промышленном масштабе выпускаются многие вещества, выделяемые из природного сырья животного происхождения, однако достижения биотехнологии последнего десятилетия, связанные прежде всего с созданием высокоэффективных процессов получения веществ сложного химического строения на базе селективных хроматографических методов и их сочетания с возможностями мембранной технологии, а также использование достижений генной инженерии, позволяют исследователям разрабатывать технологические процессы получения высо-коочищенных веществ пищевого , медицинского и микробиологического назначения с достаточно высоким выходом из мало используемых видов сырья.

Учитывая тот факт, что увеличивающаяся потребность в биотехнологической продукции определяет постоянно возрастающие объемы производства и , следовательно, растет количество образующихся отходов, возникает настоятельная потребность в разработке не только эффективных способов получения необходимых веществ, но и в обеспечении использования образующихся отходов, то есть комплексное решение организации производства по максимально замкнутому циклу.

Выбор объектов исследований определялся важностью получения сложных белковых и полисахаридных веществ природного происхождения для практических нужд. Так, гепарин является важнейшим антикоагулянтом крови, производство которого традиционно осуществлялось в нашей стране только из животного сырья пищевого назначения (легких крупного рогатого скота). Использование электрохимических свойств гепарина в условиях ионного обмена на синтетических ионитах

предопределяет возможность разработки высокоэффективной ионообменной технологии получения гепарина и других ценных мукополиса-харидов. Способность генетически модифицированных клеток интенсивно продуцировать некоторые вещества обуславливает выбор в качестве источника получения БАВ генно-инженерных клеточных продуцентов. Использование промышленного штамма-продуцента ре-комбинантного белка, включающего аминокислотную последовательность инсулина человека, предопределило возможность разработки процесса получения важнейшего антидиабетического препарата - инсулина человека, который необходим для сохранения жизни значительной доли населения, страдающей от заболевания диабетом. Изучение современных биотехнологических процессов с точки зрения уменьшения опасности для окружающей среды требует решения экологических проблем, в том числе утилизации образующихся белковых отходов. В качестве объектов для изучения процессов гидролитической деградации выбраны мало используемые отходы, в том числе боенская кровь, а также остатки животной и микробной клеточной биомассы, остающихся после осуществления процессов выделения целевых БАВ.

Цель и задачи работы. Основной целью данной работы было исследование факторов, определяющих взаимосвязь физико-химических и биохимических свойств белков, полисахаридов и продуктов их трансформации, разработка способов их получения из природного и генетически модифицированного сырья для получения БАВ медицинского , микробиологического и пищевого назначения.

В соответствии с целью было необходимо решить следующие задачи:

- изучить основные физико-химические процессы, обеспечивающие выделение БАВ белковой и полисахаридной природы из животной ткани и микробиологического сырья,

- исследовать зависимость основных показателей качества получаемых продуктов от операционных условий технологического процесса,

- изучить и обосновать оптимальные операционные параметры получения веществ с заданными физико-химическими свойствами,

- разработать технологические схемы получения БАВ медицинского, микробиологического и пищевого назначения.

- разработать способы переработки белковых отходов животной ткани и клеточной биомассы.

Экспериментальные исследования проводились на кафедре химии и

биотехнологии Московского государственного университета леса, во Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков и во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности, отдельные разделы работы выполнялись в сотрудничестве с лабораторией технологии органопрепаратов ВНИИТКГП и кафедрой технологии полимеров МХТИ им. Д.И. Менделеева. Работы по теме диссертации проводились в соответствии с комплексной научно-технической программой Минвуза РФ "Продовольствие" (198690 гг.), комплексными планами ГКНТ СССР и Российской научно-технической программой 02.06 "Комплексные безотходные технологии переработки мяса. п. 05 "Разработать безотходные технологии переработки вторичных нетрадиционных продуктов" на 1992-1999 гг.

Научная новизна. Проведены исследования физико-химических и биохимических свойств белковых и полисахаридных продуктов и показана взаимосвязь операционных технологических параметров получения и структурно-функциональных свойств БАВ.

Разработаны новые технологические процессы получения гепарина (А.с. СССР NN 1108629, 1202106), рекомбинантного белка с фрагментом проинсулина человека (А.с. СССР N 1828133), а также гидролиза-тов пищевого и микробиологического назначения (Положительное решение о выдаче патентов по заявкам NN 97115280 , 971152793).

Предложен способ иммобилизации панкреатина на карбоксиметил-целлюлозе, сохраняющий протеазную и эстеразную активности фермента. Совместной иммобилизацией в полиакриламидный гель трипсина и карбоксипептидазы В получен иммобилизованный катализатор для гидролитического расщепления проинсулина человека.

Из микробной биомассы выделен укороченный 150-звенный ре-комбинантный белок и определены условия его дальнейшей химико-ферментативной трансформации в инсулин.

Для осуществления очистки рекомбинантного белка синтезированы высокоустойчивые фторалкиловые ионитовые мембраны и определены условия эффективного обессоливания белка при длительном сохранении работоспособности мембран в электродиализаторе (А.с. СССР NN 689238, 770114, 909959, 969013).

Разработаны методики аналитического контроля процессов получения БАВ сложного химического строения из животного и микробного сырья.

Изучен процесс гидролиза белков крови комплексным химико-энзиматическим методом. Получены белковые гидролизаты, перспективные для пищевых и микробиологических целей ( Положительное решение о выдаче патента по заявке N 97110591).

Основные положения, выносимые на защиту:

-способы получения гепарина из животного сырья различных видов ионообменным методом,

-способ получения рекомбинантного белка и его трансформация в генно-инженерный инсулин человека,

-результаты изучения химико-ферментативной трансформации полипептидной структуры гибридного белка, включающего аминокислотную последовательность проинсулина человека.

-результаты изучения свойств полученных полисахаридов и полипептидов,

-способы иммобилизации протеаз и пептидаз на органических носителях методом ковалентного связывания,

- результаты исследований гидролиза белков крови комплексным химико-энзиматическим методом и способы получения обогащенных аминокислотами гидролизатов крови.

Практическая значимость работы. На основе проведенных исследований разработан технологический процесс получения гепарина , создана и испытана технология получения генно-инженерного инсулина человека, разработана технология получения белковых гидролизатов, которая может служить основой переработки отходов мясной, пищевой и микробиологической промышленности.

Разработаны методики аналитического контроля процессов выделения и очистки из ткани убойных животных и микробной биомассы, сложных веществ белковой и полисахаридной природы. Апробированные методики использованы в практических пособиях для обучения студентов.

Реализация результатов исследований. Разработаны и предложены для практического использования технологические схемы и технологии производства ряда важных биотехнологических продуктов. Разработанная технология производства гепарина внедрена на Московском, Каунасском, Минском заводах эндокринных препаратов. Проведена опытно-промышленная проверка процессов получения рекомбинантного белка и сухих гидролизатов крови.

Материалы работы использованы в учебных пособиях для вузов, справочных пособиях и научных статьях , посвященных физико-химическим и технологическим аспектам производства биотехнологических продуктов.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на научно-техничеких конференциях: II Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органопрепаратов"(Москва, 1982), Всесоюзной конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии" (Махачкала, 1990), Международной научно-технической конференции "Пища. Экология. Человек" (Москва,1995), Международной конференции "Лечебно-профилактическое и детское питание" (С.-Петербург, 1996 ), 2-й Всероссийской конференции "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и переработки с/х продуктов повышенной пищевой и биологической ценности" (Углич, 1996).

Результаты работы опубликованы в трудах Международных конгрессов: 17th Int. Symposium on column liquid chromatography. (Hamburg, 1993), 44-th Simposium "Achievements and development of meat hygiene and technology"( Beograd, 1995), The 41-th Annual Int. Congress of meat science and tecnology (San Antonio, 1995), "Meat for the consumer" 42 JCMS&T (Norvegian, 1996), The 43-nd Congress ICOMST (New Zeland, 1997).

Публикации. Основное содержание диссертационной работы опубликовано в 51 публикации, в том числе получено 7 авторских свидетельств и 3 положительных решения о выдаче патента на изобретете.

В диссертации обобщены результаты, выполненные как самим автором, так и при его непосредственном участии и руководстве.

Структура работы. Диссертация написана на 383 стр. машинописного текста и состоит из введения 7 стр., обзора литературы 20 стр., экспериментальной части 297 стр., выводов 2 стр., списка литературы 40 стр. и приложения 10 стр. Библиография включает 462 литературных источников, из них 211 на русском языке. Работа содержит 68 рисунков и 60 таблиц.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Анализ литературных данных показывает, что получение биологически активных веществ белковой и полисахаридной природы из клеток животной ткани или микроорганизмов может быть принципиально основано на предварительном выделении достаточно крупных молекул с последующим разделением компонентов. Выход целевого вещества, в силу затруднений с высвобождением из клеток моле-

кул сложного химического строения, каковыми являются белки и полисахариды, оказывается, как правило, низким.

Эта схема, применимая к достаточно широкому кругу феногене-тически различного сырья может предусматривать химический или энзиматический гидролиз биополимеров клетки с последующим разделением продуктов гидролиза.

Использование современных селективных технологий на полупроницаемых материалах или специфических сорбентах позволяет существенно сократить заключительные стадии таких процессов. Учитывая высокие требования к чистоте, предъявляемые к веществам, особенно в медицине и пищевой отрасли, на заключительных стадиях получения таких веществ предусматривается наличие специальной очистки.

При изучении процессов получения биологически активных веществ (БАВ) из тканей сельско-хозяйственных животных в настоящем исследовании были выявлены общие закономерности, позволяющие целенаправленно получать БАВ с применением специальных генно-инженерных продуцентов, для которых характерно наиболее рациональное использование на практике достижений современной биотехнологии с точки зрения возможности максимальной реализации биосинтетических способностей живых клеток-продуцентов для получения химически сложных и дорогостоящих БАВ по приемлемым схемам организации технологических процессов.

Экологические аспекты реализации биотехнических производств требуют обязательного решения проблем возникающих отходов за счет их использования в качестве вторичного сырья.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

В качестве объектов исследования использовали: легкие и трахеи крупного рогатого скота, оболочку слизистую тонкого отдела кишечника свиней, стандартные образцы гепарина-натрия, инсулина человека, проинсулина и С-пептида, анионит АМ-п, цельную кровь крупного рогатого скота, препарат растворимой карбоксиметилцеллю-лозы, белковые отходы, полученные после экстракции гепарина из легких крупного рогатого скота и отходы разрушенной клеточной биомассы после извлечения рекомбинантного белка, панкреатин очищенный, 1000-2000 ед/мг, остаточные пивные дрожжи после 8-10 генерации, а также другие реактивы высокой степени очистки.

Экстракцию мукополисахаридов из животного сырья проводили

при температуре 20-100 °С в присутствии 1-5 %-ного раствора хлорида натрия с pH 8,0-8,5. Анализ содержания гепарина в растворах осуществляли спектрофотометрированием при длине волны 442 нм в присутствии акридинового желтого. Антикоагулянтнуго активность гепарина определяли фармакопейным методом. Прямое изучение активности гепарина осуществляли на коагулометре ВМС-600 фирмы "BioDinamic" (США). Для очистки гетерополисахаридов использовали ионообменный метод на гранульных сорбентах с последующим фракционированием этанолом, окислительной обработкой и мембранной фильтрацией.

Для получения рекомбинантного белка применяли биомассу продуцента Е. coli 1854 . Анализ содержания рекомбинантного белка , проинсулина и инсулина выполняли методом SDS и нативного электрофореза, а также спектрофотометрированием при 215 и 225 нм. Выделение и очистку рекомбинантного белка, проинсулина и инсулина проводили методом ионообменной и гель-проникающей хроматографии на селективных сорбентах и электродиализом. Мембраны для электродиализа получали химической и радиациошю-химической прививкой перфтормономеров к фторопластам. Химическую обработку рекомбинантного белка для высвобождения проинсулина осуществляли в присутствии бромциана. Ферментативную обработку проинсулина для высвобождения инсулина осуществляли в присутствии нативных и иммобилизованных трипсина и карбоксипептидазы В. Иммобилизацию трипсина и карбоксипептидазы В проводили включением в поли-акриламидный гель при температуре 5-10 °С с последующей обработкой глутаровым альдегидом.

Ферментативный гидролиз крови и ее компонентов проводили на-тивным и иммобилизованным панкреатином и ферментами дрожжей. Получение иммобилизованного панкреатина осуществляли на карбок-симетилцеллюлозе в присутствии 1-этил-З (3-метиламинопрогтил) кар-бодиимида при pH 4,0 и температуре 40 °С, в течение 18 часов. Оптимизацию процесса ферментативного гидролиза крови проводили в присутствии этанола и моноцитрата натрия. Для осуществления исчерпывающего гидролиза белков, остатки белков крови и оболочки дрожжевых или бактериальных клеток подвергали гидролизу серной или соляной кислотой при повышенной температуре.

Общие методы исследования: Определение ионного состава растворов проводили на портативном ионном хроматографе IC-2001 фирмы "Eppendorf-Biotronic" (ФРГ) с кондуктометрическим детектором и колонками для определения ионов. Оценку молекулярно-массового распределение олигопептидов в гидролизатах проводили электрофорезом в 18% ПААГ с додецилсульфатом натрия или при помощи жидко-

стной хроматографии высокого давления на хроматографе ВТ 9260 ЬС фирмы "ЕррепйогГ-ВюЬ-отс" (ФРГ). Общий азот определяли по методу Къельдаля , аминный азот методом модифицировашюго фор-мольного титрования или спектрофотометрическим методом, основанным на реакции взаимодействия аминогрупп с тринитробензолсульфо-кислотой (ТНБС). Содержание белка в растворе определяли по методу Лоури . Содержание Сахаров и свободных витаминов в гидролизатах определяли на аналитическом хроматографе НР 5890 фирмы Хьюлетг-Паккард (Швейцария). Для идентификации полученных пиков проводили дополнительный хромато-масс-спектрометрический анализ на хроматомасспектрометре НР 5890. Изучение аминокислотного состава белковых гидролизатов выполняли на аминокислотном анализаторе ЬС 3000 фирмы "Ерреп(1огГ-ВюШ)шс" (ФРГ). Использованный метод позволял определять наличие в растворе 17 аминокислот с минимальным уровнем содержания 0,500 ± 0,006 мкМоль/мл. Триптофан определяли колориметрически после щелочного гидролиза образцов. Микрокалориметрический анализ белков производили с использованием микрокалориметра ДСМ-За (изготовитель ИБП РАН г. Пущино) в интервале температур 20-120 °С при скорости нагревания 2-4 К/мин и избыточном давлении 0,25 МПа.

1. Изучение процесса выделения очищенного гепарина из животного сырья (легких крупного рогатого скота и мукозы свиней)

В качестве сырья для выделения гепарина использовали легкие крупного рогатого скота и слизистую оболочку тонкого кишечника свиней.

Выделение гепарина из животного сырья построено на различных физико-химических эффектах, одним из которых является возможность ионообменной сорбции на синтетических ионитах. Исследования показали, что наилучшие результаты на стадии извлечения наблюдаются при ионообменном выделении гепарина на высокоосновных анионитах с группами четвертичных аммониевых оснований, что позволяет выделять наиболее активные фракции гепарина.

В качестве сорбентов для гепарина были изучены промышленные марки анионитов, а также специально синтезированные сорбенты с бифункциональными сшивающими агентами. В таблице 1 представлены результаты испытаний различных марок пористых анионитов по их способности сорбировать гепарин.

Таблица 1

Зависимость обменной емкости СОЕ промышленных анионитов по гепарину от пористости сорбентов

Марка Содержание Удельный Удельная Средний Стати-анионита сшивающего объем пор, поверх- эквивален- ческая

агента ДВБ, Ууд., ностъ, тный ра- обменная % см3/г 3Уд., диус пор емкость

м2/г гср., СОЕ по

км гепарину, мг/мл

АРА-М 40/100 40 1,31 110 23,7 80

АН-511 8/100 8 1,04 65 32,0 90

АВ-171 30/100 30 0,72 79 18,3 52

АВ-171 15/100 15 0,38 68 10,5 45

АМС - 0,03 - - 38

АМ-п 10 0,04 - - 40

Из представленных данных видно, что емкость синтетических анионитов по гепарину существенно возрастает с увеличением удельного объема и среднего эквивалентного радиуса пор. Изучено влияние пористости и зернения ионита, количества и типа сшивающего агента, температуры, рН, концентрации реагентов на величину емкости сорбентов по гепарину и показано, что окончательно выбор ионообменного сорбента для выделения гепарина из солевых растворов осуществляется также с учетом физико-механической прочности сорбентов и условий их длительной эксплуатации в реальных ионообменных установках.

Изучение сорбционных свойств ионитов различных партий показало, что изменение параметров сорбции для ионитов различных марок в зависимости от партий может различаться в 2 - 3 раза. Из отечественных анионитов наиболее стабильными показателями обладал макропорист!,¡й анионит АМ-п, который и был использован для разработки технологического процесса выделения гепарина из животного сырья.

Для интенсификации процесса выделения гепарина изучены характер и условия выделения гепарина на полупроницаемых материалах методом ультрафильтрации. На рис. 1 представлены параметры ультрафильтрации гепарина-Иа из мукозы на мембранах типа МВ с оптимальным для гепарина размером пор. Оптимизацию параметров ультрафильтрации гепарина проводили с учетом необходимости получения максимально сконцентрированных по гепарину растворов в условиях минимальных потерь активных фракций вещества молекулярной массы 12000-18000. В результате прямого ультрафильтрационного концентрирования растворов до содержания гепарина 5000 ЕД/мл получали растворы с концентрацией примесного хлорида натрия практически равной исходной (2,1 моль/л). Дальнейшее снижение содержания соли осуществляли в режиме диафильтрации последовательным разбавлением раствора. В этих условиях изменение содержания гепарина в растворе в зависимости от количества ступеней диафильтрации п незначительно и для значения п < 6 не превышало 10 %. Концентрация хлорида натрия при п = 6 уменьшается в 8 - 12 раз.

Для обеспечения получения апирогекной субстанции гепарина и освобождения продукта от пигментирующих веществ осуществляли окислительную обработку растворов гепарина в присутствии перман-ганата калия или натрия с последующей обработкой апирогекным углем и стерилизующей фильтрацией. Найденные условия обработки: 10 мин при 95 °С в присутствии до 0,5 % масс, окислителя и мембранной фильтрацией через фильтр 0,22 мкм позволили получать продукт, соответствующий фармакопейным требованиям.

Масштабирование условий ионообменного выделения гепарина из животного сырья дало возможность получать гепарин из различных видов сырья: из легких крупного рогатого скота с выходом 20000 ЕД/кг, мукозы заморожешюй с выходом 40000 ЕД/кг, мукозы консервированной метабисульфитом натрия с выходом 20000 ЕД/кг, мукозы высушенной с выходом 150000 ЕД /кг.

Найденные оптимальные условия сорбции для колонн 1000x200 мм вместимостью 35 л, 25 л сорбента АМ-п составили: поток - 160 л/ч, температура жидкости - 60 °С, содержание ЫаС1 в экстракте - 1 моль/л, плотность экстракта (из мукозы) - 1,045 г/см3. рН 8,3 - 8,5 коэффициент псевдоожижения смолы 1,3.

Оптимальные условия промывки сорбента со связанным гепарином составили: колонна 1000x200 мм вместимостью 35 л, 25 л сорбента АМ-п, поток - 160 - 400 л/ч, температура жидкости - 20-60 °С, содержание ЫаС1 в промывном растворе - 1 моль/л, количество промывного раствора - 3 объема колонны (100 л). В этих условиях величина сорбции гепарина с активностью >120 ЕД/мг превышала 90 %.

Актив- Содер- Объем

ность, жание раство-

ЕД/мл гепарина, ра, л мг/мл

Время процесса, ч

Рис. 1. Зависимость содержания гегтарина-К'а из мукозы в фильтрате ( 1 ) и концентрате ( 2), активности фильтрата ( 3 ) и концентрата ( 4 ), объема фильтрата ( 5 ) и концентрата ( 6 ) от времени концентрирования (фильтр ФМ-02, 0,25 МПа, мембрана МВ с площадью фильтрации 0,08 м2. Раствор гепарина-Ыа в 2,5 М N301).

Оптимальные условия десорбции гепарина составили: колонна 1000x200 мм вместимостью 35 л, 25 л сорбента АМ-п, поток -15 л/ч, температура жидкости - 20 °С, содержание NaCl в элюирующем растворе - 2,5 моль/л, pH 7,5 - 8,0.

Проведенные исследования позволили остановиться на определенной технологической схеме получения гспарина(рис. 7\. Данная технологическая схема была апробирована в заводских условиях и в дальнейшем была использована для организации реального производства на эндокринных заводах (Московский эндокринный, Каунасский эндокринный завод, Литва, Объединение «Белмедпрепараты», Республика Беларусь).

легкие к.р.с. или мукоза свиней

V

водно-солевая экстракция

V

отделение жмыха от

экстракта ------> отходы жмыха

V

сорбция гепарина на отработанный

ионообменной смоле ------> экстракт

V

десорбция гепарина со смолы

осаждение гепарина-полупродукта спиртом

V

химическая очистка гепарина сырца

V

фильтрация раствора гепарина

V

осаждение гепарина спиртом и сушка

V

гепарин

Рис. 2 . Блок-схема технологического процесса получения гепарина ионообменным методом

Проведенные исследования позволили получить гепарин высокой чистоты и изучить его физико-химические и биологические свойства. Субстанция гепарина характеризуется основными показателями, представленными в таблице 2 .

Таблица 2 Свойства гепарина-порошка

Наименование

Гепарин из мукозы Обр.1 Обр. 2 Обр.З

Гепарин из легких Обр.1 Обр.2 Обр.З

Описание Аморфный порошок белого цвета с желтоватым

оттенком, без запаха, гигроскопичен

Растворимость

вводе 1:10 1:10 1:10

в изотоническом 1:10 1:10 1:10 растворе ЫаС1

Подлинность препарата соотв. соотв. соотв. биологическим методом

1:10 1:10

1:10 1:10

1:10 1:10

соотв. соотв. соотв.

Прозрачность (5 % р-р) соотв. соотв. соотв. соотв. соотв. соотв.

Цветность (5 % р-р) 4а 4а За 2а 1а 2а

рН 1 %-ного раствора 7,2 7,4 6,1 6,2 6,6 7,5

Специфические примеси, отс. отс. отс. отс. отс. отс.

(белок)

Потеря в массе при 7,2 7,4 8,0 8Д 8,2 9,8

высушивании, %

Общая зола, % 35,2 36,2 40,0 33,5 37,8 39,6

Пирогенностъ (2000 ЕД апирог.апирог.апирог.апирог. апирог.апирог. на 1 кг массы кролика)

Гистаминоподобные вещества

Антикоагулянтная активность, ЕД/мг Хранение

норма норма норма норма норма норма

151

145 150

125

141 135

в сухом защищенном от света месте при температуре +4 градуса. Срок годности 4 года.

Таким образом, можно констатировать, что содержащиеся в клетках животной ткани полисахариды могут быть получены водно-солевой экстракцией с последующим ионообменным хроматографиро-ванием, а комбинирование условий химической обработки с сорбци-онными и мембранными процессами, позволяет с высокой эффективностью осуществлять очистку полисахаридов в сравнительно мягких условиях и получать продукт с минимальным содержанием других биологически активных примесей.

2. Исследование процесса получения и выделения рскомбинант-ного белка с целью дальнейшей трансформации в генно-инженерный инсулин человека через про инсулин

Для получения рекомбинантного белка (РБ) молекулярной массы 17500, 151-звенная аминокислотная последовательность которого включает 86 аминокислотных остатков проинсулина человека (рис.3), была использована биомасса продуцента РБ Е. coli 1854.

Ala-Asp-Asp-Lys-Phe-Asn-Lys-Gln-Gln-Gln-Asn-Ala--Phe-Tyr-Gln-Ile-Leu-His-Leu-Pro-Asn-Leu-Asn-Glu-Glu-Gln-Arg--Asn-Gly-Phe-Ile-Gln-Ser-Leu-Lys-Asp-Asp-Pro-Ser-Gln-Ser-Ala--Asn-Leu-Leu-Ala-Glu-AJa-Lys-Lys-Leu-Asn-Asp-Ala-Gin-Ala-Pro--Lys-Ala-Asp-Asn-Lys-Glu-Ser-Met-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-

B1 B2 ВЗ В4 В5 В6 В7 -Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-В8 В9 В10В11 В12В13В14В15В16В17В18В19В20 В21 В22 -Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-В23 В24 В25 В26 В27 В28 В29 ВЗО ВС 1 ВС2 CI С2 СЗ С4 С5 -Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Glu-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-С6 С7 С8 С9 С10С11С12С13С14С15С16С17С18С19С20 -Leu-GIn-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys-Arg-Gly - Ile-С21 С22 С23 С24 С25 С26 С27 С28 С29 С30 С31 CAI СА2 А1А2 -Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Tlir-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr- Gin - Leu-Glu-АЗ A4 A5 A6 Al A8 A9 AlO All A12 A13 A14 A15 A16 A17 -Asn-Tyr-Cys-Asn(COOH) A18 A19 A20 A21

Рис.3. Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка из Е. coli 1854. Cys - аминокислотные остатки, соединенные дисульфидными -S-S- связями: А20-В19, А6-А11 и А7-В7, на участках аминокислотной последовательности инсулина человека

Изучение исходной биомассы клеток показало, что содержание РБ по данным денситометрирования белковых зон при 570 нм после электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS достигало 35-40 % от суммарного клеточного белка.

Высокий уровень содержания РБ в биомассе клеток продуцента позволил проводить выделение синтезированного в клетках РБ в соответствии с приведенной схемой (табл. 3, рис. 5).

Биомасса

V

1. Разрушите клеток

V

2. Отделение осадка РБ-сырца центрифугированием

V

РБ (лидерная последователыюсть-Ме^проинсулин)

V

1. Экстракция с растворением РБ

V

2. Хроматографическая очистка РБ

V

3. Ультрафильтрация и получение РБ лиофилизацией

V

4. Обработка бромцианом

V

Проинсулин (с нерегулярными -Б-З-связями)

V

Окислительный сульфитолиз

V

Проинсулин-Б-сульфонат

V

1. Хроматографическая очистка

V

2. Ренатурация с образованием -Б-Б- связей

V

Проинсулин

V

Ферментативная трансформация в инсулин

V

Инсулин человека

Рис. 5. Схема получения рекомбинантного белка и его трансформация в генно-инженерный инсулин человека

Таблица 3

Распределение содержания рекомбинантного белка в продуктах обработки клеточной биомассы

N Наименование Объем, л Суммарное В т.ч. реком-

пл. содержание бинантного

клеточного белка,

белка, г/л % от г/л

суммы

1 Суспензия клеток

Е. coli 1854

после биосинтеза

и концентрирования

сепарацией 4,0 60 35 21

2 Суспензия разрушенных

ультразвуком осколков

клеток (разбавление

водой 1:2,5) 10,0 25 35 8

3 Осадок тел включения,

полученных при сепари-

ровании суспензии разру-

шенных клеток

(содержащих рекомби-

нантный белок) 1,5 75 60 44

4 Надосадочная жидкость,

полученная при сепари-

ровании разрушегашх

клеток 7,5 18 нет нет

5 Отделенный сепарацией

влажный рекомбинантный

белок в виде промытых

водой тел включения 2,5 45 60 26

6 Суспензия белка в бу-

фере с мочевиной 9,5 12 60 15

7 Раствор рекомбинан-

тного белка в буфере

с мочевиной 8,5 11 65 7

8 Нерастворившийся осадок

остатков клеток 1,0 8 30 2

Извлечение РБ осуществляли из разрушенной массы индуцированных клеток. Исследования показали, что применение ультразвука при мощности до 200 Вт/л позволяет при температуре 20 °С обеспечить за 2 часа разрушение более 99 % клеток. Для экстракционного растворения РБ применяли денатурирующие буферные растворы в оптимальном составе включающие : 7,5 М мочевину, 0,2 М хлорид натрия, 20 мМ 2-меркаптоэтанол и 1-25 мМ комплексообразователей (этилендиаминтетраацетата и трисгидроксиметапаминометана) при рН 8,0.

На рис. 6 представлен процесс ионообменного выделения и очистки РБ . Применение градиентной хроматографии позволило получить РБ со степенью чистоты более 95%.

D280

3

Время, ч

Рис.6. Ионообменная хроматография рекомбинантного белка на ДЭАЭ-сефарозе FF. Колонка К50/30, вместимостью 0,5 л "Pharmacia" (Швеция), уравновешенная буфером 30 мМ трис рН 7,5, скорость потока 18 мл/мин .1 - сорбция 2 л раствора (10 г) белка в 7,5 М мочевиновом буфере и промывание 2 л 30 мМ трис рН 7,5, 2 -элюи-рование 30 мМ трис 0,25 М NaCl, 3- элюирование 30 мМ трис 1 М NaCl.

С целью осуществления процесса электродиализного обессолива-ния белковых растворов нами были специально синтезированы ионито-вые мембраны на основе перфторалкиловых сополимеров. Свойства мембран приведены в таблице 3.

Таблица 3

Характеристики мембран на основе химически привитых сополимеров

Наименование Степень Удельное состава * привив- объемное ки, % сопротивление, Ом;м

Стати- Разруша- Набуха-ческая ющее ние в обмен- напря- воде, ная жение, % емкость, МПа

Н*форма Ыа'фор.ча мэкв/г

МФАК, 10 10,2 6,1 0,56 1,31 19

ДВБ,ГФПФВ 25 1,5 0,7 1,44 1,05 31

45 0,9 0,4 1,88 0,92 44

МФАК, ТФС 10 8,6 3,5 0,96 1,21 21

ДВБ,ГФПФВ 26 1,2 0,6 1,17 0,88 38

34 0,6 0,2 1,92 0,77 49

ТФС,АК 21 1,4 1,1 1,41 1,09 37

ДВБ,ГФПФВ 44 0,8 0,5 1,62 0,96 48

62 0,5 0,1 1,83 0,32 56

* МФАК - метилфторакрилат, ДВБ - дивинилбензол, ГФПФВ - со полимер Ф-26 гексафторпропилена с винилиденфторидом, ТФС -альфа, бета, бета-трифторстирол

Получение мембран, работоспособных в течение достаточно длительного времени, осуществляли на основе химически стойких перфтори-рованных пленочных сополимеров гексафторпропилена с винилиденфторидом, к которым химическим путем в присутствии инициаторов

радикальной полимеризации или радиационно-химическим путем под воздействием источника гамма-облучения Со60 осуществляли прививочную сополимеризацию виниловых мономеров с ионогенными группами.

Показано, что электродиализ, так же, как гель-проникающая хроматография на сефадексах, является эффективным методом обессоли-вания РБ, особенно при получении больших количеств вещества.

Получение инсулина человека из РБ через проинсулин осуществляли химико-ферментативной трансформацией. В оптимальных условиях расщепление РБ для высвобождения проинсулина выполняли в присутствии бромциана, концентрация белка составляла 0,05 г/мл в 90%-ной муравьиной кислоте, содержащей 30 г/л бромциана, при температуре 30 °С, время процесса 7 ч, с последующей обработкой продуктов тетратионатом, гель-хроматографированием на сефадексе 0-50Р и элюцией 50 мМ раствором бикарбоната аммония для лиофильного высушивания продукта. Проинсулин 87 %-ной чистоты, полученный с выходом 85 % (в пересчете на исходный белок) в виде Б-сульфоната использовали для последующей энзиматической трансформации в инсулин.

Получение инсулина человека из проинсулина проводили биокаталитическим методом в присутствии нативных или иммобилизованных в полиакриламидный гель трипсина и карбоксипептидазы В. Изучение условий ферментативного гидролиза проинсулина в инсулин показывает, что при использовании высокоочшценных ферментов, гидролитическая трансформация заканчивается при температуре 37 °С и рН 7,5 в течение 0,5 ч. Анализ активности иммобилизованного катализатора показал, что при сохранении более 90 % нативной активности по трипсину и 80 % активности по карбоксипептидазе В иммобилизованные ферменты сохраняли способность обеспечивать образование целевого инсулина в пределах 3-4 ч. Полученный инсулин человека подвергали ионообменной очистке на Б-сефарозе и сефадексе 0-5080 с последующим лиофильным высушиванием из 1М раствора уксусной кислоты и получали высокоочищеный продукт с содержанием основного вещества более 98%.

Найденное содержание аминокислот, а также анализ С-конце-вых аминокислот подтверждает, что полученный из РБ проинсулин может быть трансформирован в полипептид, соответствующий инсулину человека (табл. 4 ).

Проведенные исследования позволили выявить оптимальный комплекс физико-химических и биологических свойств генно-нженерного инсулина человека для приготовления высококачественных лекарственных форм инсулина. Полученный инсулин характеризуется основными показателями, представленными в табл. 5.

Изучение специфической активности и медико-биологические испытания полученного генно-инженерного инсулина человека подтвердили его полную идентичность известным высококачественным зарубежным препаратам.

Таблица 4

Аминокислотный состав полученных полипептидов

Оста-

РБ

Проинсулин

Инсулин

ток Коли- Содержание ами- Коли- Содержание ами- Содержание

ами- чество нокислот, но- остат- г/100 г белка кис- ков в _

чество нокислот, остат- г/100 г белка ков в

аминокислот, г/100 г белка

ло- белке, Теоре- Полу-ты моль"1 тичес- чено кое

белке, Теоре- Полу-моль"1 тичес- чено кое

Теоре- Полу-тачес- чено кое

Аэр 11 7,22 12,0(18) 3 3,74 7,0(4) 5.34 6.4( 3)

Абп 7 4,60 1 1,25

ТЬг 3 1,76 1,6(3) 3 3,57 3,6( 3) 4.67 4.8(3)

Бег 9 4,67 4,8( 9) 5 4,92 5,4(5) 4.04 5.1(3)

аи 13 9,44 20,7(28) 9 12,4122,2(16) 13.89 17.5(7)

ап 15 10,89 7 9,65

Рго 6 3,41 3,6( 6) 3 3,24 3,6(3) 1.53 2.1( 1)

ау И 4,08 3,7(11) 10 7,03 6,8(10) 3.52 4.3(4)

А1а 12 5,27 5,4(12) 4 3,34 3,2(4) 1,09 1,2( 1)

Сув 6 7,11 7,5(6) 6 13,51 12,0(6) 20.49 17,5(6)

Уа1 6 3,47 3,6( 6) 6 6,58 6,6( 6) 6.09 6,6(4)

МЛ 1 0,74 1Д 1) 0 0 0 (0) 0 0(0)

Не 4 2,59 3,2(4) 12 2,46 2,4(12) 3,48 3,7(2)

Ьеи 19 12,30 12,5(19) 4 4,91 5,5(4) 10,44 12,2( 6)

Тут 5 4,47 4,1(5) 4 6,79 6,9( 4) 10,03 12,1(4)

РЬе 6 4,89 5,0(6) 3 4,64 5,4( 3) 6,78 8,3(3)

Ш 3 2,29 2,3( 3) 2 2,91 3,4( 2) 4,21 5,3(3)

ЬуБ 9 6,48 6,8(9) 2 2,74 2,6( 2) 1,98 2,4( 1)

5 4,31 4,0(5) 4 6,53 6,7( 4) 2,42 3,4( 1)

ИТОГО 151 100,00 102,0(151) 86 100,00 103,3(86) 100,00 112,9(51)

Таблица 5

Основные характеристики генно-инженерного инсулина человека

Наименование показателей Обр. 1 Обр. 2 Обр. 3

Изоэлектрическая точка 5,1±0,1

Описание Белый или почти белый порошок

Растворимость Практически нерастворим в воде,

спирте, хлороформе, эфире

растворим в 0,01 н. НС1 1:10 1:10 1:10

мало растворим в 0,01 н. №ОН 1:100 1:100 1:100

Потеря в массе при сушке,% 7,7 7,2 8,0

Сульфатная зола, % 0,9 0,8 0,9

Содержание азота, % 15,0 14,7 16,3

Прозрачность раствора (эталон N1) соотв. соотв. соотв.

Цветность раствора (эталон N5) соотв. соотв. соотв.

Оптическая плотность раствора 0,49 0,52 0,53

0,05 % раствора препарата в 0,01 н.

растворе НС1 при длине волны 276 нм

Содержание дезамидоинсулина 0,7 0,6 1,2

и других родственных пептидов

Микробиологическая чистота соотв. соотв. соотв.

(в норме - не более 300 бактерий/г)

Биологическая активность, ЕД/мг 26,5 25,9 27,0

Содержание основного вещества, % 99,2 99,3 97,8

Проведенные исследования показали, что сложные биологически активные вещества, используемые человеком в качестве медицинских препаратов, пищевых или стимулирующих добавок, не могут быть получены химическим синтезом и их приходится выделять путем высвобождения из клеток животного или микробного происхождения, решая проблемы экстракции этих веществ и очистки от сопутствующих примесей, а использование генно-инженерных продуцентов, в которых генетической модификацией специально задается возможность получения совершенно не свойственных обычным клеткам веществ, присущих организму человека, открывает возможность полного удовлетворения потребности человека в столь необходимых БАВ.

3. Исследование процессов разделения и химико-ферментативной трансформации вторичного белкового сырья животного и микробного происхождения для утилизации отходов биотехнической промышленности с целью получения питательного белка для пищевого, кормового и микробиологического применения

В результате выделения БАВ из тканей животных или получения их с помощью генетической инженерии наряду с целевыми продуктами остается значительное количество отходов, которые после специальных технологических процедур также могут быть превращены в смеси активных веществ, способные найти применение в различных отраслях народного хозяйства.

К таким отходам, представляющим серьезную экологическую опасность относятся переработанные мелкодисперсные белковые взвеси, образующиеся после экстракции легких, мукозы, других животных органов при получении мукополисахаридов, белковые растворы со стадий селективного разделения, твердые и полужидкие отходы биомассы микробных клеток, образующиеся, например, после выделения реком-бинантных белков из клеточных продуцентов. Проведенные исследования показывают, что целесообразно использование методов утилизации, позволяющих получать полезные белковые продукты из бросовых отходов с различной степенью деградации. К таким способам следует отнести метод гидролитического расщепления. В качестве удобного объекта изучения закономерностей протекания процессов гидролитического расщепления белкового сырья использовалась бо-енская кровь.

Микрокалориметрическое изучение поведения крови и ее компонентов при нагревании показывает, что термограмма денатурации цельной крови содержит один основной пик денатурации и несколько минорных пиков, соответствующих основным составляющим компонентам крови, при рН 7,6 температура денатурации основного компо-не!гга составляет 70 °С, а температура конца денатурации располагается в области 90 -100 °С, что подтверждает необходимость осуществления высокотемпературной обработки белковых смесей при их химико-ферментативной трансформации.

Для отработки типичных условий гидролиза проведено изучение кинетики процесса модельного гидролиза альбумина боенской крови. Глубину гидролиза и степень конверсии белка оценивали по соотношению количества освобождающихся концевых аминогрупп в ферментативном гидролизате ( Ыач ), определяемое формольным титрованием, соотнесенное к величине содержания концевых аминогрупп Ыам(НС1), полученной при исчерпывающем тотальном кислотном гидролизе. В

качестве ферментных препаратов использовали ферменты животного происхождения (панкреатин в нативной и иммобилизованной на карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ) форме), а также остаточные пивные дрожжи и другие ферменты (табл. 6).

Таблица 6

Степень конверсии альбумина при его гидролизе различными ферментными препаратами

Ферменты, взятые для гидролиза Степень конверсии, %

1. Протосубтилин Г-10х 27.3

2. Протосубтилин Г-20х 38.1

3. Каназа 39.6

4. Ферментный препарат "С" 63.1

5. Протелин 42.2

6. Панкреатин 68.8

7. Трипсин 5.8

8. Папаин 10.2

9. Проназа Е 71.3

При анализе кинетических данных использовали выражение скорости V, = Утах - [Р],гаах ^2, где: [Р], - концентрация продуктов гидролиза в момент времени I в молях или мкМ/мл, определенная по накоплению аминогрупп, образованных в процессе гидролиза; I - время, Утах - максимальная скорость гидролиза. На рис. 7-8 представлены результаты обработки экспериментальных данных с использованием приведенного уравнения. Можно определить максимальную скорость гидролиза белка в каждом конкретном случае, экстраполяцией полученной зависимости на ось ординат, а также максимальный выход продуктов гидролиза за время, когда зависимость скорости гидролиза от времени имеет прямолинейный характер.

Характер полученных зависимостей скорости гидролиза от времени процесса существенно менялся в случае использования сложного белкового субстрата, каковым является боенская кровь. На рис.9 представлены кинетические зависимости скорости гидролиза крови от концентрации панкреатина. Характер процесса носиг сложную 8-образную форму и может быть описан с учетом ингибирования гидролиза продуктами реакции , а также состоянием белкового субстрата в граничных условиях.

Аз40

0.4 0.3 0.2 0.1 О

4 8 12 16 t 4 8 12 16 t

Рис.7. Зависимость накопления продуктов гидролиза альбумина под действием панкреатина от времени проведения реакции (рН реакционной среды 8,0, Т=37 °С):

а - концентрация субстрата 0.5%, концентрация фермента,

мг/мл: 1-0.15; 2-0.30; 3-0.45; 4-0.75. б - концентрация фермента - 0.15 мг/мл; концентрация субстрата, %: 1-0.06; 2-0.10; 3-0.12; 4-0.20.

РЬ'1 хЮ"2, мг Ш2/мл-мин

0.3

0.2

0.1

0 40 80 120 160 t, мин

Рис.8 . Результаты проверок выполнимости кинетического уравнения V, = Vmax - [P]tmax t/2. Концентрация фермента - 0.5 мг/мл; концентрация субстрата, % : 1 - 0.2; 2 - 1.0.

б

Аздо

0.15

Рис. 9 . Зависимость накопления продуктов гидролиза крови от концентрации фермента панкреатина: 1 - 2.0 мг/мл; 2 - 4.0 мг/мл; 3 - 6.0 мг/мл; 4 - 8.0 мг/мл.

Учитывая удобство использования не нативных, а иммобилизованных ферментов , был получен иммобилизованный на КМЦ панкреатин. Для сравнительной оценки гидролизующей способности на-тивного и иммобилизованного панкреатина лизированная разбавлением водой (1:2) кровь гидролизовалась в течение 24 часов при 40 °С. Как показали исследования, иммобилизованный панкреатин обладал большей термостабильностыо и за одно и то же время гидролиза давал по-луторакратный прирост количества концевых аминогрупп по сравнению с нативным ферментом.

Поскольку наилучшие результаты по гидролизу удается получать при использовании комплексных ферментных препаратов с широкой субстратной специфичностью, проводились исследования возможности использования дрожжевых протеаз для получения ферментативных гидролизатов крови.

Изучено влияние измельчения дрожжей перед автолизом, предварительное разбавление дрожжевой суспензии и крови, влияние лизи-рующих и стабилизирующих добавок на выход ферментативного гид-ролизата. Исходя из полученных данных, можно рекомендовать следующие условия гидролиза белков крови полиферментной дрожжевой системой: соотношение кровь: вода 1:1, концентрация моноцитрата натрия 3-5%, концентрация этанола 3-5%, время гидролиза при 50 °С Зч с последующем повышением температуры до 60 °С и прогревом еще в течение 1-1,5 ч, количество добавляемых активированных дрожжей до 6 % масс. Степень конверсии белков крови при данных условиях составляла 10-15 %. Оптимизацию условий гидролиза крови крупного рогатого скота дрожжевой биомассой проводили исходя из максимума достигаемой степени конверсии белков крови в результате гидролиза и наилучшего соотношения незаменимых аминокислот к заменимым в получаемых гидролизатах. В качестве критерия оптимизации использовался один показатель - выход ферментативного гидролизата, оцениваемый по увеличению содержания свободных аминогрупп, а в качестве переменных факторов - шесть управляемых количественных параметров процесса, имеющих непрерывный характер изменения в заданных пределах (количество крови, дрожжей, цитрата натрия, этанола в смеси, продолжительность процесса и температура).

В результате оптимизации установлено, что процесс гидролиза боенской крови ферментами биомассы автолизованных остаточных пивных дрожжей рода БассЬаготусез СагЬЬегз целесообразно проводить при температуре 58 °С в течение 4,2 ч в присутствии 4,2 % об. плазмолизирующего агента этанола, стабилизирующего реагента цитрата натрия - 5,6 % об., при содержании крови в смеси 30 % об., суспензии дрожжей - 40 % об. Выход ферментативного гидролизата крови при этом увеличивался против первоначального уровня до 3035 %. Дальнейшее увеличение степени гидролиза и выхода ферментного гидролизата достигалось за счет применения дополнительных ферментов. На рис. 10 представлены результаты изучения совместного гидролиза крови дрожжами и панкреатином, позволяющее отметить наличие двух отличающихся друг от друга реакционных систем: гидролиза полностью растворимых компонентов крови панкреатином в гомогенной среде и дисперсионной фазы, к которой можно отнести все плохо растворимые или нерастворимые соединения. Реализация данного подхода, заключающаяся в обеспечении максимального лизиса компонентов крови и дрожжевых клеток приводила к увеличению выхода ферментативного гидролизата в два-три раза.

P.xlO"2,

мг NHz/мл 10

О

90

180 Время,мин

Рис. 10. Зависимость накопления продуктов оптимизированного гидролиза (температура 58 °С) белков цельной крови крупного рогатого скота ферментами дрожжей рода Saccharomyces Carlsberg и иммобилизованного панкреатина.

1 - дробное добавление панкреатина,

2 - гидролиз в присутствии иммобилизованного панкреатина.

Изучение условий протекания ферментативного гидролиза боен-ской крови в присутствии дрожжевых протеаз позволило получить ферментативные гидролизаты крови (рис. 11), которые были использованы в рецептурах кормов для выращивания лабораторных животных, а также в составе питательных сред при культивировании бактериальных штаммов, в частности рода Listeria.

Возникновение в биотехнических процессах твердых, частично обработанных в ходе технологических операций отходов измельченной животной или микробной биомассы представляет значительную проблему, которая в ряде случаев осложнена нерастворимостью отходов и трудностью с их последующей деградацией.

Метод кислотного гидролиза позволяет успешно решить проблему таких отходов путем их кислотного расщепления с последующей нейтрализацией полученной смеси и сушкой продукта. Проведенные

нами исследования показывают, что 15-25 %-ные растворы серной кислоты позволяют получать гидролизаты белков достаточно глубокой степени деградации до аминокислот при следующих условиях гидролиза: концентрация кислоты 25 %, время 6 ч, температура 120 °С.

Автолизат пивных дрожжей

V

Ферментативный гидролизат крови

V

Фильтрация реакционной смеси

V

Сушка ферментативного Кислотный гидролиз гидролизата КГК-Ф V

Нейтрализация V

Сушка кислотного гидролизата КГК-К V V

Фасовка и упаковка продукта

Рис. 11. Технологическая схема производства гидролизатов крови.

Повышение температуры с 100 до 120 сС позволяло во многих случаях повысить степень конверсии белка с 40 до 80 %. Результаты кислотной обработки некоторых отходов представлены в таблице 7. Типичный аминокислотный состав кислотного гидролизата белковых остатков крови ( г/100 г белка) : Асп -5.54, Тре -3.81, Сер 11.45, Глу-8.75, Про-13.59, Гли-6.72, Ала -3.95, Цис -4.52, Вал-3.78, Мет-0.28, Иле-2.74, Лей-5.68, Тир-2.12, Фен-4.15, Гис-4.18, Лиз-0.91, Арг-4.65 ( ИТОГО 86.90).

Таблица 7

Условия обработки белковых отходов

Наименование Концентрация отхода белка

Остатки

белков

крови

Отходы животной ткани после выделения гепарина из легких и мукозы

Отходы

после

извлечения

рекомбинан

тного

белка из

клеточной

биомассы Е

соН

Условия обработки Выход гидролиз ата

75-80%

80-90%

концентрация к-ты - 25% 85-95% температура - 120 °С время -7ч

10-30% концентрация к-ты - 10 % температура -120°С время -4ч

не раство- концентрация к-ты - 25%

римы температура - 100 °С

(5-10%масс, время - 5ч

в смеси с

раствором

кислоты)

не растворимы

(5-10% масс, в смеси с раствором кислоты)

В результате кислотного гидролиза получены кислотные гидролиза-ты белка, имеющие следующие характеристики (рис. 11): NaM, мг% 250 - 250, No6ul„ мг % 450 - 550, сухой остаток 10 - 20 %, pH 5,0-6,5.

Изучение физико-химических свойств гидролизатов показало, что в зависимости от условий получения гидролизатов ферментативным или химическим путем наблюдается более сбалансированный состав по свободным аминокислотам в случае ферментативных гидролизатов , а также большее количество фракций непрогидролизованных пептидов

с молекулярной массой 1-15 кД. Определение ионного состава примесных неорганических ионов в гидролизатах подтверждает заметное влияние предистории происхождения образца вещества на его ионный состав. Полученные в присутствии дрожжей гидролизаты содержали остаточные количества витаминов группы В и моносахаридов типа глюкозы и галактозы, что потенциально расширяет спектр их применения. Так, добавление до 10 % смеси кислотно-ферментативного гид-ролизата в неполноценные животные корма увеличивало скорость наращивания массы крыс, что подтверждает эффективность использования сбалансированных по аминокислотному составу гидролизатов в рационах питания животных.

Полученные данные по характеру и скорости роста культур на средах с кислотными и ферментативными гидролизатами подтверждают целесообразность применения гидролизатов крови в качестве полноценного питательного компонента микробиологических сред.

Проведенные исследования процесса гидролитической деградации белковых отходов показывают, что многие отходы пищевой и микробиологической промышленности являются ценным резервным источником белка, который после соответствующей биохимической трансформации может бьггь превращен в аминокислотно-пептидную смесь, имеющую питательную ценность. Использование деградированных белковых отходов в качестве добавок к питательным рационам животных и микроорганизмов расширяет сырьевую базу и позволяет получать обогащенные питательными веществами смеси для культивирования микроорганизмов и выращивания животных.

ВЫВОДЫ

1. Изучен процесс селективного выделения гепарина из легких с активностью 130 ±5 и мукозы 150 ± 5 ЕД/мг водно-солевой экстракцией в сочетании с ионообменной, ультрафилырациошгой очисткой и химической обработкой. Выявлен оптимальный комплекс физико-химических и биологических свойств препарата.

2. Разработана промышленная технология производства антикоагулянта крови гепарина ионообменным методом, позволяющая получать гепарин с выходом 20000 ЕД/кг из легких крупного рогатого скота и 40000 ЕД/кг из мукозы свиней.

3. Определены оптимальные условия выделения и очистки реком-бинантного белка на анионите и установлено, что получешшй белок с содержанием основного вещества 85±10 % может быть использован для дальнейшей химико-ферментативной трансформации в инсулин человека.

4. Химической и радиационно-химической прививкой виниловых мономеров к фторопластам синтезированы высокоустойчивые ионито-вые мембраны и показано, что полученные материалы позволяют эффективно осуществлять обессоливание белков электродиализом в условиях сохранения длительной работоспособности мембран.

5. Иммобилизацией включением в полиакриламидный гель трипсина и карбоксипептидазы В получен катализатор для гидролитического расщепления проинсулина человека. Выполнены исследования по химико-ферментативной трансформации рекомбинантного белка и определены оптимальные условия для его целенаправленной трансформации в инсулин через проинсулин.

6. Получен генно-инженерный инсулин человека, который по физико-химическим и биологическим свойствам полностью соответствует свойствам природного инсулина человека и качеству лекарственных препаратов инсулина человека, выпускаемых за рубежом.

7. Разработан метод получения гидролизатов из крови комплексным химико-энзиматическим методом путем осуществления гидролиза в присутствии остаточных пивных дрожжей, позволяющий получить ряд ценных питательных продуктов для медицинской, микробиологической и пищевой отраслей.

8. Предложен способ иммобилизации панкреатина на карбоксиме-тилцеллюлозе. Определены оптимальные условия проведения реакции, которые позволяют получить конъюгат фермента с полимером, сохраняющий 85 % протеазной и 92 % эстеразной активности. Определены термодинамические константы гидролиза белков крови натив-ным и иммобилизованным панкреатином.

9. На основании данных по оптимизации процесса ферментативного гидролиза белков крови остаточными пивными дрожжами наработаны опытные и опытно-промышленные партии гидролизатов крови и изучены основные физико-химические свойства полученных продуктов. Показана перспективность кислотного гидролиза белковых отходов для утилизации переработанных остатков животной ткани и клеточной биомассы.

10. Результаты , полученные в диссертации , использованы в технологических схемах получения гепарина, рекомбинантного белка и гидролизатов крови и вошли в соответствующие разделы опьггао-промышленных и промышленных регламентов , а также НТД на конечные продукты.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тевлина A.C., Фрейдаин Ю.Г., Курдаева JI.C., Лебедева Е.Ю., Иванкин А.Н. Получение и свойства катионитовых мембран с ком-плексообразующими фуппами.//Пластмассы.-1976.-Ш.-С. 49-50.

2. Тевлина A.C., Акулова Т.П., Иванкин А.Н. Синтез и свойства гомогенных анионитовых мембран// Пластмассы,- 1978.-N9.-С. 31-32.

3. Тевлина A.C., Акулова Т.П., Иванкин А.Н. Электрохимические и диффузионные характеристики ионитовых мембран//Ж. Труды МХТИим.Д.И.Менделеева.-1978.-Ы 102.-С. 45-47.

4. Иванкин А.Н., Тевлина A.C. Получение гомогенных катионитовых мембран и исследование их свойств. -В сб.: Тезисы докладов Всесоюзного совещания "Современные аспекты синтеза и производства ионообменных материалов",- НИИТЭХИМ, Черкассы: 1979.- С. 33-34.

5. Ситникова В.В., Николаев Н.И., Чувилева Г.Г., Тевлина A.C., Акулова Т.П., Иванкин А.Н. Подвижность коионов в ионитовых мембранах//Журнал физ. химии.-1979.-Т.53.-Ш.-С. 1295-1296.

6. Степанукене Э., Иванкин А.Н., Васюков С.Е., Демин В.П., Вайченонене Н., Лашас Л.В. Изучение процесса выделения Са-соли гепарина на анионообменных смолах.// Тезисы докладов II Всесоюзн. конференции "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органопрепаратов".-М.

1982.-С. 141.

7. Иванкин А.Н., Васюков С.Е., Лукина И.В., Ваченене Э. Некоторые особенности ультрафильтрации солей гепарина.//Там же, с. 150.

8. Демин A.C., Иванкин А.Н., Васюков С.Е., Тевлина A.C. Кам-нев Ю.В. Изучение сорбции гепарина на силыюосновных анионитах.//Там же, с. 149.

9. Животова Г.П., Васюков С.Е., Иванкин А.Н., Шульгина A.A., Аксенова Л.Н., Фиалкова М.А., Шер А.И., Иванова Г.И. Разработка методов апирогснной очистки сырцов гепарина.//Там же, с. 140.

10. Васюков С.Е., Требоганов А.Д., Бушин А.П., Животова Г.П. Иванкин А.Н., Савин B.C., Чернова Л.М., Видяпина Л.Я., Костикова Г.И., Асланов В.Г. Разработка ионообменной технологии производства гепарина.//Там же. -С. 139.

11. Тевлина A.C., Иванкин А.Н., Акулова Т.П., Демин В.П. Исследование процесса прививки виниловых мономеров на фторсо-держащие СПЛ с целью получения ионитовых мембран// Пластмассы.-

1983.-N2.-C. 22-24.

12. Иванкин А.Н., Тевлина A.C., Загорец П.А. О механизме ра-

дотационной прививки метилальфа-фторакрилата и альфа,бета,бе-та-трифторстирола на перфторированный сополимер // Высокомолекулярные соединения.-1983.-А25.-Ы4.-С. 812-817.

13. Иванкин А.Н., Васюков С.Е., Панов В.П. Получение, свойства и применение хондроитинсульфатов Химико-фармацевтический журнал.-1985.-ЫЗ.-С. 192-202.

14. Навашин С.М., Яроцкий С.В., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Инсулин человека: физико-химические свойства и получение. - Антибиотики и химиотерапия//1988.-Т.ЗЗ.-N9.-C. 701-708.

15. Ярокий С.В., Иванкин А.Н., Устюжанина С.В., Орешина М.Г. Самойлова J1.H. Питательные среды для культивирования продуцента рекомбинантного белка. -В сб.: Тезисы докладов Всесоюзн. конференции "Разработка и производство препаратов медицинской биотехнологии", Махачкала, 1990, ч.И.-С. 111.

16. Газиумарова Л.Д. Яскелевечене В. Яроцкий С.В. Иванкин А.Н. Питательные среды для культивирования штаммов-продуцентов БАВ.-В сб.: Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендованный для внедрения. -М.:ВНИИСЭНТИ, 1991.-N3.-C. 5-7.

17. Ivanldn A.N., Kandaryk V.V. Chromtography of the substances in the preparation of genetic insulin of human. -B сб.: "The 17th Int. Symposium on column liquid chromatography. Hamburg, May 9-14, 1993,-P. 51.

18. Nekludov A.D., Lissitsyn A.B., Fiodorova N.B., Ivankin A.N., Yevstafieva E. Hydrolysis of the slaughter cattle blood by yeast proteases.- В сб.: Proc. The 41-th Annual Int. Congress of meat scicnce and tecnology. San Antonio , Texas, USA. Aug. 20-25,1995.-P. 260.

19. Nekludov A.D., Lisicin A.B., Ivankin A.N. , Hromova P.A., Mosina G.I., Petrakova A.N. Poboljsanje kvaliteta krai zaklanih zivitinja hidroliticnom metodom// Proc. 44th Simposium "Achievements and development of meat hygiene and technology", 14-16 juna 1995, Beograd.- Tehnology mesa, 1995, v. XXXVI, N2-3,-P. 50.

20. Неклюдов А.Д., Иванкин A.H., Евстафьева E.A., Мосина Г.И., Карпо Б.С. Переработка боенской крови сорбционным мето-дом//Мясная индустрия.-1996.-ЫЗ .-С. 11-12.

21. Lisicin А.В., Nekludov A.D., Ivankin A.N., Mosina G.I., Petrakova A.N., Carpo B.S. Investigations of amino acids composition of cattle muscules.- В сб.:" Meat for the consumer", 42-nd ICoMST, 1-6 September, 1996 // Eds K.I.Hildrum, E.G. Larsen.-Lillehammer: MATFORSK, 1996.-P. 334-335.

22. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Евстфьева Е.А., Лисицын А.Б. Изучение возможности использования белков крови в лечебном и профилактическом питании,- В сб.: Пища. Экология. Человек./ Тезисы докладов Международной научно-техн. конференции, 4-6 декабря 1995. -М.: МГАПБ, 1995.-С. 52.

23. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бабурина М.И. Иммобилизованный на карбоксиметилцеллюлозе панкреатин и его использование для получения пищевых гидролизатов. -Там же, с. 53.

24. Салаватулина P.M., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Митале-ва С.И. Экстракция белковых фракций при посоле мяса// Мясная промышленность.-1996.-N 6.-С. 25-26.

25. Иванкин А.Н., Осотов A.A. Анализ вредных веществ в окружающей среде и технико-экономический анализ химических процессов. -М.: МГУЛ, 1995.-28 с.

26. Иванкин А.Н., Герман А.Б., Осотов A.A., Тележкин В.В. Практикум по основам биотехнологии.-М.: МГУЛ, 1996.-102 с.

27. Иванкин А.Н. Свойства солей гепарина, полученных ионообменным методом// Мясная индустрия.-1996.-N1.-C.24-25.

28. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Евстафьева Е.А., Бабурина М.И. Изучение процесса сорбционной переработки боенской крови с целью получения добавок пищевого назначения. В сб.: Тезисы докладов Международной конференции "Лечебно-профилактическое и детское питание" 27 мая 1996 г., С.-Петербург, 1996.-С. 41.

29. Бердутина A.B. Неклюдов А.Д. Иванкин А.Н. Карпо Б.С. Осока A.B. Определение макрокинетических констант кислотного гидролиза кератинсодержащего сырья,- Там же, с. 83.

30. Бердутина A.B., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Карпо Б.С. Осока A.B. Изучение процесса кислотного гидролиза кератинсодержащего сырья,- В сб.: Тезисы докладов 2-й Всероссийской конференции "Прогрессивные экологически безопасные технологии хранения и переработки сельскохозяйственной продукции для создания продуктов питания повышенной пищевой и биологической ценности", 1-4 октября 1996 г.-Углич, 1996.-С.48.

31. Иванкин А.Н., Карпо Б.С., Неклюдов А.Д. Определение ионного состава гидролизатов методом иошюй хроматографии. -Там же, с. 206-207.

32. Карпо Б.С., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Мосина Г.И., Изучение аминокислотного состава мясных продуктов и гидролизатов боенской крови. - Там же, с. 226-227.

33. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д., Карпо Б.С. Определение свободных неорганических ионов в пищевых продуктах методом ионной хроматографии//Мясная индустрия,- 1997.-N 1.-С. 24-26.

34. Карпо Б.С., Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д. Методические

особенности изучения аминокислотного состава мясных и других бе-локсодержащих продуктов.- В сб. Трудов 1-й Международной конф. "Научные и практические аспекты совершенствования качества продуктов детского и геродиетического питания". -М: Пищепромиз-дат, 1997.-С.411.

35. Иванкин А.Н., Неклюдов А.Д., Суханова С.И. Экспресс анализ содержания примесных неорганических ионов в растворах методом ионной хроматографии.-В сб. Трудов 1-й Международной конф. "Научные и практические аспекты совершенствования качества продуктов детского и геродиетического питания". -М: Пшцепромиздат, 1997. -С. 410.

36. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Петракова А.Н., Мосина Г.И., Горошко Г.П., Калинова Ю.Е. Оптимизация процесса гидролиза белков крови дрожжевыми протеазами рода Saccharomyces carlsberg//C6. научных трудов ВНИИМП.-М.1997.-С. 57-63.

37. Berdutina A.V. Nekludov A.D. Ivankin A.N. Osoka A.V. Karpo B.S. Study of the process of acid hydrolysis of keratin-containing row materials as a method for manufacture of food additives.-Congr. proceedings 43rd ICOMST.1997 27 July-1 Aug 1997,- Auckland: New Zeland.- P. 482-483.

38. Ivankin A.N. Nekludov A.D. Mosina G.I. Utilization of meat wastes by hydrolytic method for production of biologically active substances for food, medical and microbiologocal purposes.-Там же, с. 500-501.

39. Ivankin A.N. Nekludov A.D. Karpo B.S. Study of the content of foreign inorganic ions in solutions of biologically active substances by method of ion chromatography. -Там же, с. 488-489.

40. Неклюдов А.Д. Иванкин A.H. Бабурина М.И. Получение и свойства панкреатина, иммобилизованного на карбоксиметалцеллюло-зе//Прикладная биохим. и микробиол.-1998.-Т.34. N 1,- С. 57-62.

41. Неклюдов А.Д. Иванкин А.Н., Мосина Г.И., Горошко Г.П. Оптимизация процесса гидролиза белковых субстратов дрожжевыми протеазами рода Sacch. Carlsberg. //Прикладная биохим. и микро-биол.-1998.-Т.34. N 4,- С. 394-397.

Изобретения по теме диссертации

1. Тевлина A.C., Иванкин А.Н., Коршак В.В., Баранова Н.П., Йемин В.П., Челноков В.Г. Способ получения гомогенных ионитовых мембран. Авт.свид.СССР N689238, 1978, Бюлл. Изобретений., 1979,

N 36.

2. Тевлина A.C., Загорец П.А., Иванкин А.Н., Демин В.П., То-ропцева Т.Н. Способ получения фторсодержащих катионитовых мембран. Авт.свид.СССР N 770114, 1979. Не публикуется .

3. Тевлина A.C., Загорец П.А., Иванкин А.Н., Способ получения гомогенных катионитовых мембран. Авт.свид.СССР N 909959,1981. Не публикуется.

4. Тевлина A.C., Загорец П. А., Иванкин А.Н., Способ получения катионитовых мембран. Авт.свид.СССР N 969013,1981. Не публикуется .

5. Васюков С.Е., Требоганов А.Д., Бушин А.П., Кочергин П.М., Демин A.C., Иванкин А.Н., Савин B.C. Способ получения солей гепа рина. Авт.свид. СССР, N 1202106, 1984. Не публикуется .

6. Иванкин А.Н. Васюков С.Е. Лукина И.В. Животова Г.П. Донецкий И.А. Способ очистки сырца гепарина. Авт.свид.СССР, N 1108629, 1984. Не публикуется .

7. Иванкин А.Н., Яроцкий C.B., Навашин С.М., ГТолстянов

А.Е., Миталева С.И. Способ выделения внутриклеточных рекомбинант-ных белков. Авт.свид.СССР, N 1828133. Бюлл. Изобретений., 1993, N26.

8. Баер H.A., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Дубина В.И., Бердутина A.B., Баканов H.A. Способ активации комплекса протеолитических ферментов поджелудочной железы убойных животных. Положительное решение о выдаче патента по заявке N 97115280/13(016480) от 18 дек. 1997 г.

9. Баер H.A., Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Дубина В.И., Бердутина A.B., Баканов H.A. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясо-костного сырья убойных животных. Положительное решение о выдаче патента по заявке N 971152793(016479 ) от 18 дек. 1997 г.

10. Костенко Ю.Г., Неклюдов А.Д., Шагова Т.С., Иванкин А.Н., Янковский КС. Микробиологическая среда для выращивания и диагностики бактерий рода Listeria. Положительное решение о выдаче патента по заявке N 97110591/13(010881) от 21.01.98.

Личный вклад автора состоял в выборе направлений исследований, литературном поиске, определении задач, разработке основных подходов и методов исследования, обсуждении, анализе и трактовке материала. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель участвовал на всех этапах исследований, от постановки задачи и эксперимента, до обсуждения и оформления результатов.