Химическая природа и биологическая активность гуминовых препаратов, выделенных из продуктов микробиологической трансформации органических субстратов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.03 ВАК РФ

71 11-2/63

МЕЖВЕДОМСТВЕННЫЙ ДИССЕРТАЦИОННЫМ СОВЕТ Д.02.04.234

ИНСТИТУТ ХИМИИ И ХИМИЧЕСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ HAH KP

(f Р <h ""/<2 " На правах рукописи

I <

/сц^м:

КЫДРАЛИЕВА КАМИЛЯ АСЫЛБЕКОВНА

УДК 547.992.2:577.15.062/066; 54.576.851.513

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ПРОДУКТОВ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ СУБСТРАТОВ

Диссертация

на соискание ученой степени доктора химических наук 02.00.03 - органическая химия, 02.00.04 - физическая химия

Научный консультант: доктор химических наук,

профессор, академик HAH KP Жоробекова Ш.Ж.

Бишкек 2004

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5

ВВЕДЕНИЕ 7

ГЛАВА 1. Современные представления о гуминовых веществах как 13 объекте физико-химических и органических исследований (Литературный обзор)

1.1. Биотехнологические способы получения 15 высокоэффективных экологичных биопрепаратов

1.1.1. Преимущества биологической конверсии 15

1.1.2. Регуляция процессов ферментации 18

1.2. Характеристика физиологически активных соединений 23

1.2.1. Ростовые вещества 23

1.2.2. Физиологическая активность гумусовых кислот 25

1.3. Взаимное влияние микроорганизмов и гуминовых 31 кислот

1.3.1. Роль микроорганизмов в синтезе гуминовых 31 веществ почвы

1.3.2. Влияние микробоценоза почв на разложение 37 гумуса

1.3.3. Антибактериальные свойства гуминовых кислот 49

1.4. Природа взаимодействия ферментов с гуминовыми 51 кислотами

1.4.1. Участие ферментов в деградации гуминовых 51 кислот

1.4.2. Влияние гуминовых кислот на ферментативные 55 процессы

1.4.3. Функции ионов металлов в ферментативных 63 системах

ГЛАВА 2. Оптимизация процессов биоконверсии органического сырья 68

2.1. Идентификация видового состава микроорганизмов 68 культуральной жидкости

2.2. Определение и идентификация доминирующей 76

микрофлоры

ГЛАВА 3. Определение фракционного состава основных биоактивных 82 растворов и разработка технологии изоляции биологически активных соединений

3.1. Характеристика образцов биологически активных 82 препаратов

3.2. Определение биологической активности препаратов 88

3.3. Физико-химическая характеристика гуминовых веществ, 96 содержащихся в ПАФ

3.4. Физиологические функции гуминовых веществ 119 3.4.1. Исследование физиологической активности 126 отдельных фракций гуминовых кислот

3.5. Разработка технологии изоляции биологически 131 активных соединений

3.5.1. Применение процесса микрофильтрации к 132 образцам продуктов анаэробной ферментации

3.5.2. Применение процесса ультрафильтрации к 134 образцам продуктов анаэробной ферментации

ГЛАВА 4. Взаимное влияние гумусовых веществ и микроорганизмов 140

4.1. Трансформация гумусовых веществ под воздействием 140 микроорганизмов

4.1.1. Сравнительное исследование устойчивости 140 гуминовых кислот к воздействию консорциума микроорганизмов из различных источников

4.1.2. Исследование устойчивости гуминовых кислот к 156 воздействию разных культур грибов

4.1.3. Изменение функционального состава фракций 164 гуминовых кислот под действием чистых культур грибов

4.2. Влияние гумусовых веществ на микроорганизмы 170 ГЛАВА 5. Формы воздействия гумусовых веществ на ферменты 174

5.1. Влияние гуминовых кислот на активность протеиназ 174

5.2. Ингибирование активности протеолитических 185 ферментов гуминовыми кислотами в присутствии ионов металлов

5.2.1. Ингибирование активности протеиназ ионами 185 металлов

5.2.2. Участие ионов металлов в образовании фермент- 196 ингибиторных комплексов

5.2.3. Образование, устойчивость и свойства комплексов 202 ионов металлов с гуминовыми кислотами

5.3. Характеристика образования комплексов в системах 216 гуминовые кислоты - фермент, гуминовые кислоты -

ионы металла - фермент ВЫВОДЫ 228

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 232

ПРИЛОЖЕНИЕ 256

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГВ - гумусовые вещества

ГК - гуминовые кислоты

ФК - фульвокислоты

ИУК - индолилуксусная кислота

ГБК - гибберелловая кислота

МО - микроорганизмы

КПМ - консорциум почвенных микроорганизмов

КБМ - консорциум микроорганизмов биогумуса

КДМ - консорциум дереворазрушающих микроорганизмов

ПАФ - продукты анаэробной ферментации

ПАФ-20 - ПАФ со временем инкубации в реакторе 20 дней

ДТГ - детритогумин

Mw - средневесовая молекулярная масса

ММР - молекулярно-массовое распределение

Срв - концентрация редуцирующих веществ

Cn3mhh ~ концентрация аминного азота

V[ - объем элюата

ТСХ - тонкослойная хроматография п - количество повторностей X, - результат одного измерения X - среднее

S(x¡) - среднее квадратичное отклонение или ошибка единичного измерения S (х) - ошибка среднего значения

D450 - оптическая плотность раствора при длине волны \=450 нм Ala - аланин Arg - аргинин

Asp - аспарагиновая кислота Су s - цистеин Gly - глицин

Glu - глютаминовая кислота His - гистидин

Leu - лейцин Lys - лизин Met - метионин Phe - фенилаланин Pro - пролин Ser - серии Thr - триптофан Туг - тирозин Val - в алии

со- степень восстановленности Т- трипсин XT - химотрипсин

АТЕЕ - этиловый эфир N - ацетил - L -тир оз ина BLME - метиловый эфир N-бензоил-Е-лейцина S — субстрат Е - фермент

ES ~ фермент-субстратный комплекс Км- константа Михаэлиса

Кат - каталитическая константа скорости распада фермент-ингибиторного комплекса

ВВЕДЕНИЕ

Отходы органических веществ, таких как окисленные бурые угли, растительные и животные остатки, отходы сельскохозяйственных и пищевых предприятий могут быть использованы в качестве дешевого источника получения широкого ряда продуктов сельскохозяйственного, медицинского и биотехнологического назначения. В этом аспекте очень важно развитие новых экологически чистых, основанных на моделировании природных каталитических процессов, технологий их переработки. Стратегия переработки отходов в настоящее время включает аэробное компостирование смешанных или однородных отходов или анаэробную реакторную ферментацию. Каждый подход разработан и/или разрабатывается с учетом определенного вида отходов. Целью переработки отходов является разработка технологии, которая с одной стороны являлась бы экологически безопасной, а с другой стороны, была бы близка к процессам, происходящим в природе.

Направленное вмешательство в процессы переработки сырья позволяет интенсифицировать процесс, при этом на фоне ускорения минерализации исходного субстрата в биореакторах активизируются биосинтетические процессы, способствующие получению конечных продуктов с желаемыми свойствами. Регуляция способов переработки достигается физическими, химическими и биологическими воздействиями, которые способны активизировать определенные группы микроорганизмов в составе консорциума, тем самым направленно регулировать синтез определенных ферментов и ряда биологически активных метаболитов. При этом достигается ускорение процессов деградации исходного органического сырья и как следствие увеличение спектра продуктов микробного синтеза.

В литературе обычно в качестве основного критерия эффективности биореакторов в настоящее время используется выход биогаза с единицы реакторного объема, характеристике жидкой фракции практически не уделяется внимания. Однако, на основании имеющихся данных по внедрению процесса метаногенеза сельскохозяйственную практику можно заключить, что в иерархии вклада этого метода первое место занимает его экологический аспект, затем

следует эффект от получения высококачественных удобрений, и только третье место занимает энергетическая составляющая процесса.

В связи с этим актуальным и важным представляется исследование и использование жидкой фракции переброженного шлама, основным компонентом которого являются вещества гумусовой природы, в целях получения продуктов с оптимальными, заранее заданными свойствами, изучение состава продуктов анаэробной ферментации, выделение гуминовых веществ и оценка биологической активности данных препаратов как фитостимуляторов и ингибиторов протеиназ.

Работа выполнялась в соответствии с госбюджетной темой лаборатории биофизической химии ИХХТ HAH KP «...», в рамках гранта МНТЦ KP-156.2 «Получение новых материалов на основе биоконверсии органического сырья».

Цель работы состояла в изоляции и идентификации видового состава микрофлоры культуральной жидкости биологически активных компонентов из продуктов анаэробной ферментации; выделении моноизолятов, обладающих высокой продуцирующей активностью по различным группам ферментов; определении фракционного состава продуктов анаэробной ферментации органических субстратов основных биоактивных растворов и оптимизации технологии выделения биологически активных компонентов; изучении эффектов взаимного влияния образующихся в процессе ферментации гуминовых веществ и микроорганизмов; установлении форм воздействия гуминовых веществ на ферменты, продуцируемые микроорганизмами.

Научная новизна. Впервые анализ динамики развития микробной популяции при ферментации проведен по ферментативной активности микроорганизмов: липазной, целлюлазной, протеолитической, уреазной. Предложены рекомендации по интенсификации анаэробной ферментации с использованием биостартера на основе смеси препаратов из выделенных пяти бактериальных культур.

Впервые представлены данные, позволяющие оценить процесс анаэробной ферментации с точки зрения характеристики жидких продуктов. На основе использования процессов мембранной фильтрации (микро- и ультрафильтрации) разработан биотехнологический подход для получения биологически активных фракций ПАФ. Показана возможность использования процесса микрофильтрации

для выделения биологически активных фракций ПАФ. Установлено ингибирующее влияние осмотических компонентов в составе образцов ПАФ на биологическую активность выделенных из них гуминовых препаратов.

Впервые экспериментально показана фитогормоноподобная активность гуминовых препаратов. Уровень стимуляции фракций ГК и их характер сходны с действием на семена индольных соединений типа ауксинов. Установлен эффект «взаимоисключения» специфической биологической активности отдельных составных органических компонентов ПАФ, находящихся в ассоциированном состоянии.

Изучено влияние консорциума микроорганизмов и чистых грибов, выделенных из почвы, биогумуса и гниющей древесины Ыти РатПа на количественный и качественный состав ГК бурых углей. Установлено, что все исследованные группы микроорганизмов способны разлагать ГК с образованием фракций с более низкими молекулярными массами, обогащенными кислородсодержащими функциональными группами, увеличивающими их растворимость в воде и усвояемость растениями. Эффективность трансформации ГК выше в случае использования консорциума микроорганизмов, вследствие проявления синергизма микроорганизмов.

Экспериментальными методами установлены условия образования и состав растворимых и нерастворимых в воде фермент-ингибиторных комплексов, включающих ионы токсичных металлов (Сс12+, РЬ2+).

Практическая ценность работы. Выявлены наиболее перспективные по своим физиолого-биохимическим показателям штаммы микроорганизмов, продуцирующие ферменты с высокой активностью (липазной, целлюлазной, протеолитической, уреазной). На основе этих культур предложен биостартер для интенсификации технологии анаэробной ферментации.

Установлено, что основными биологически активными компонентами продуктов анаэробной ферментации органических субстратов являются гумусовые вещества, представленные новообразованными трансформированными, а также металл-содержащими формами. Показано, что отдельные фракции продуктов анаэробной ферментации в определенных концентрациях проявляют специфическую фитогормоноподобную активность, которая возрастает с

увеличением молекулярной массы веществ, входящих в состав этих фракций. Установлен эффект «взаимоисключения» специфической биологической активности отдельных составных органических компонентов ПАФ, находящихся в ассоциированном состоянии.

Выявлено ингибирующее влияние осмотических компонентов в составе образцов ПАФ на биологическую активность выделенных из них гуминовых препаратов. На основе использования процессов мембранной фильтрации (микро-и ультрафильтрация) разработан биотехнологический подход для получения биологически активных фракций ПАФ. Показана возможность использования процесса микрофильтрации для выделения фракций ПАФ, обладающих высокой биологической активностью. Предложено использовать метод ультрафильтрации с соответствующим порогом отсечения, позволяющий удалять осмотические компоненты для выделения наиболее активных фракций. Предложенный подход позволяет выделять биологически активные низкомолекулярные фракции гуминовых веществ и использовать для изучения их влияния на мембранный транспорт и метаболизм растительной клетки.

Разработаны практические рекомендации по использованию продуктов разделения ПАФ. Концентраты, полученные как при микро-, так и при ультрафильтрации рекомендованы для использования в качестве органического компонента, увеличивающего плодородие почвы при одноразовом внесении его в почву (например, один раз в три года), поскольку активные элементы находятся в депонированном состоянии и освобождаются из комплекса по мере утилизации растениями. Пермеаты могут быть использованы как внекорневая подкорхмка минеральными компонентами и физиологически активным веществом.

Рассчитаны константы ингибирования активности протеолитических ферментов комплексами гуминовых кислот с ионами токсичных металлов. Эти величины могут быть использованы для расчета форм существования комплексов гуминовые кислоты - ионы металлов - ферменты в природных средах и прогноза их свойств in vivo.

Экономическая значимость результатов. Использование биостартера -препарата на основе выделенных пяти бактериальных культур с высокой

и

ферментативной активностью позволит интенсифицировать технологический процесс получения продуктов целевого назначения. Использование процесса мембранной фильтрации (микро- и ультрафильтрации) позволит исключить ингибирующее влияние осмотических компонентов и получать продукты с высокой ростостимулирующей активностью. Рекомендовано проводить , сертификацию гуминовых веществ на содержание металлов для оценки биологической активности самих гуминовых веществ, содержащихся в препаратах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. Результаты анализа динамики развития микробной популяции при ферментации, проведенного по ферментативной активности микроорганизмов: липазной, целлюлазной, протеолитической, уреазной. Рекомендации по интенсификации анаэробной ферментации с использованием биостартера на основе смеси препаратов из выделенных пяти бактериальных культур.

Физико-химическая характеристика продуктов анаэробной ферментации органических субстратов с различным временем инкубирования. Ингибирующее влияние осмотических компонентов в составе образцов ПАФ на биологическую активность гуминовых препаратов, выделенных из образцов ПАФ. Биотехнологический метод на основе использования процессов мембранной фильтрации (микро- и ультрафильтрации) для получения биологически активных фракций ПАФ, в том числе и за счет исключения осмотических компонентов.

Фитогормоноподобная активность гуминовых препаратов, возрастающая с увеличением молекулярной массы веществ, входящих в состав этих фракций. Эффект «взаимоисключения» специфической биологической активности отдельных составных органических компонентов ПАФ, находящихся в ассоциированном состоянии.

Эффекты взаимного влияния гуминовых кислот и микроорганизмов.

Условия образования и состав растворимых и нерастворимых в воде фермент-ингибиторных комплексов, включающих ионы токсичных металлов (Сс12+, РЪ2+), константы ингибирования металлокомплексов ГК активности протеаз.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 6 Европейском Симпозиуме по органической химии (Белград, 1989), Всесоюзной

конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (Москва, 1990), XVIII Выездной сессии секции бионеорганической химии Научного совета по неорганической химии АН СССР (Бишкек, 1991), Межреспубликанской конференции «Химия радионуклидов и металл-ионов в природных объектах» (Минск, 1992), Международном Симпозиуме по ферментам в органическом синтезе (Нью-Дели, Индия, 1992), семинаре МНТЦ (Бишкек, 1998), Всероссийской ежегодной школе «Экология и почвы» (Пущино, Научный центр РАН, 1999, 2000), 9 Международном Симпозиуме по макромолекулярным металлокомплексам (Нью-Йорк, 2001), 2 Международной конференции «Биотехнология и бизнес» (Москва, 2002), Научно-Практическом семинаре НАТО «Использование гуматов для рекультивации природных сред: от теории к практике» (Звенигород, 2002), 2 Международной конференции «Гуминовые �