Эффекты комплексообразования ионов металлов в процессах ингибирования активности некоторых протеолитических ферментов гуминовыми кислотами тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.01 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КЫРГЫЗСТАН ИНСТИТУТ НЕОРГАНИЧЕСКОЙ И ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи

КВДРАЖЕВА КАЖЛЯ АСЫЛВЙКОВНА

УДК 541. 49+641.132+547. 592

ЭФФЕКТЫ К0МГИЕКС00БРА30ВАНЙЯ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В ПРОЦЕССАХ ЙНГЙЕИРОВАНИЯ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ ГУМйНОЕЫШ КМСЛОТАШ

02. 00.01 - неорганическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Бишкек - 1992

Работа выполнена на кафедре физической и коллоидной химии Кыргызского государственного университета

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Ш.Ж.Жоробекова

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А.Д.Помогайло

кандидат химических наук, с.н.с. В.Ф.Назаров

Ведущее предприятие - Институт физической химии АН Украины

Защита состоится "_£_" МО^Гй. 1992 г. в 4к. 00 час. на заседании специализированного совета К 009. 05. 01 в Инстит неорганической и физической химии АН республики Кыргызстан по адресу: 720071, Бишкек, Ленинский пр., 267.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной б лиотеке АН республики Кыргызстан (г.Бишкек, Ленинский пр., 266

Автореферат разослан " 3 « $>4 ¿гии.Л- 1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

кандидат химических наук

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из актуальных' задач биокоординационной _ химии является исследование механизмов взаимодействия ионов металлов с биологически активными лигандами.------------------------------

Известно,что гуминовые кислоты, являясь природными макромс-лекулярными лигандами, способны проявлять биологическую активность, в частности, усиливать окислительно-восстановительные процессы, влиять на механизмы пролиферации клеток, ингибировать активность протеолитических ферментов. В этой связи отметим.что в любых биологических и экологических системах возмолшо присутствие ионов металлов. С этой точки грения особое внимание вызывает вопросы, связанные с возможностью изменения ингибирующей способности гуминовых кислот под воздействием различных ионов металлов.

Однако, до настоящего времени эти вопросы остаются малоизученными, что связано с отсутствием подходов к исследованию биологической активности гуминовых кислот на молекулярном уровне, а также с необходимостью использования теории множественных равновесий при рассмотрении процессов комплексообразования ионов металлов с указанными макромолекулярными лигандами.

В связи с этим исследование влияния ионов металлов, на процессы взаимодействия рассматриваемых макромолекулярных лигандов с ферментами являются весьма актуальными.

Цель работы. Исследование взаимодействия гуминовых кислот с рядом протеолитических ферментов в присутствии биометаллов и выяснение форм воздействия ионов металлов на активность как фермента, так и ингибиторов - гуминовых кислот в реакциях гидролиза сложных эфиров М-ацил-Ь-аминокислот.

Научная новизна работы состоит в следующем:

-установлено, что комплексы ионов металлов (Ш (II), гп (II), Со (II), Мч (II)) о гуминовыми кислотами являются неспецифичными ингибитора™ активности протеолитических ферментов животного и микробного происхождения (¡¿-химотрипеин, субтилизин);

- показана зависимость константы диссоциации фермент-ингиби-торных комплексов как от природы, так и от содержания ионов металлов в реакционной системе;

- впервые в качестве моделей белково-гуматных комплексов изучены разнолигандные комплексы металлов с гуминовыми кислотами и аминокислотами (метионин, аланин) при разных условиях среды.

Рассчитаны соответствующие константы устойчивости раанолигандных комплексов.

Практическая значимость работы состоит в следующем:

- на основе результатов исследования разнолигандных комплексов ионов металлов, формирующихся с участием гуминовых кислот, разработан новый метод определения содержания гуминовых кислот в природных водах, подтвержденный авторским свидетельством;

- представленные в работе данные по ингибированию протеоли-тических ферментов металлокомплексами гуминовых кислот, а также рассчитанные константы диссоциации рассмотренных фермент-ингиби-торных комплексов могут Сыть рекомендованы для использования их биохимиками, занимающимися экологическими и медицинскими проблемами;

- исследованные в работе взаимодействия металлокомплексов гуминовых кислот с протеолитическими ферментами и аминокислотами являются моделями сложных биохимических процессов в почвах и организме;

- синтезированные в работе разнолигандные комплексы металлов с гуминовыми кислотами и аминокислотами следует рассматривать как новые физиологически активные вещества, имеющие большое значение для нужд медицины и биотехнологии.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на XVI, XVIII выездной сессии секции бионеорганической химии Научного Совета по неорганической химии АН СССР (Ивано-Оранковек, 1989 г., Бишкек, 1991 г.), Международном симпозиуме по органической химии (Белград, 1989 г.), Всесоюзной конференции "Гуминовые вещества в биосфере: экологическая роль и народнохозяйственное значение" (Москва, 1990 г.), конференции молодых ученых ИНФХ и ИОХ АН республики Кыргызстан (Бишкек, 1990 г.).

Публикации. Ш теме диссертации опубликованы восемь научных работ. Получено одно авторское свидетельство.

Объем работы. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 33 рисунка, состоит из введения, литературной (1 глава) и экспериментальной (2-4 главы) частей, выводов и списка литературы, Еключающего 187 наименований.

Краткое содержание работы

Глава I. Современные представления о комплексообразовании ионов металлов с гуминовыми кислотами

В первой главе обобщены литературные данные по характеристике гуминовых кислот (ГК) как природных макромолекулярных лиган-дов. Рассмотрены полифункциональные, полиэлектролитные свойства гуминовых кислот, приведены данные по размерам и формам этих соединений, конформационной изменчивости макромолекул.

Подробно изложены сведения, освещающие современное состояние исследований в области взаимодействия ионов металлов с гуминовыми кислотами. Рассмотрены возможные формы связи между ионами металлов и гуминовыми кислотами; факторы, влияющие на устойчивость образующихся металлокомплексов гуминовых кислот, обсуждены подходы и методы исследования, наиболее пригодные для изучения процессов комплексообразования в системах Ме-ГК, рассмотрены уравнения, адекватно описывающие комплексообразование с учетом макромолеку-лярной природы гуминовых кислот, их агрегативной неустойчивости.

Показана экологическая роль гуминовых кислот как комплексо-обрааугадих агентов, заключающаяся в аккумуляции и миграции целого ряда биогенных элементов, тяжелых металлов, токсикантов и радиоактивных нуклидов.

Рассмотрена возможность участия комплексов ионов металлов с гуминовыми кислотами в реакциях лигандного замещения, вследствие чего могут образовываться разнолигандные комплексы.

В настоящей работе сформулированы конкретные задачи, направленные на исследование механизмов влияния ионов металлов на биологическую активность гуминовых кислот с целью выяснения реакционной способности образующихся металлокомплексов последних.

Глава II. Комплексообразование ионов биометаллов с гуминовыми кислотами

Во второй главе диссертационной работы представлена физико-химическая характеристика гуминовых кислот, выделенных их торфа, как макромолекулярных лигандов (табл. 1). Необходимость представления такой характеристики вызвана нетривиальностью гуминовых кислот, как объектов исследования, зависимостью состава и свойств этих соединений от условий их формирования.

Ш результатам метода Бэт, который основан на титровании функциональных групп основаниями различной силы выявляются два

Таблица 1

Физико-химическая характеристика гуминовых кислот

!-1-!-1-1

|Обра-| ¡элементный состав [содержание кислотных групп |золь-| зец i | весовые % | • мг-экв/г |ность|

ГК |-,-,-,-1-,-,-1 % i

|кДа | С | Н | О | N |общ. | карбоксильные |фенол| i |||¡ || |общ. |сильн|слаб. | | )

-1-Ь—I-!-i-1-1-1-1-1-1-1

ГК-1 | 2,5166,212,74128,3112,715,6013,3010,60 |2,70 |2,30 | 3,4 | ГК-2 | 18 |61,6|3,76)31,95|3,1|5,28|3,00|0,56 |2,44 |2,28 | 4,2 j ГК-3 |124 |45,8|4,87¡44,44|4,8|3,97|1,95|0,84 |1,11 |1,99 | 4,6 |

типа карбоксильных групп: сильно- и слабокислотные (табл.1).

Кривые титрования гуминовых кислот имеют плавный характер, что является следствием широкой полифункциональности макромолекул гуминовых кислот. Результаты исследования природы и содержания кислотных групп подтверждает данные, ранее полученные при изучении функциональных групп гуминовых кислот, выделенных из различных источников.

Интерпретация экспериментальных данных по диссоциации функциональных групп гуминовых кислот и комплекеообразованию последних с ионами металлов проводилась с использованием теории сложных равновесий.

Ионизация функциональных групп гуминовых кислот способствует превращению макромолекул гуминовых кислот в макроанион, которые вследствие проявления электростатических эффектов подвергаются конфсрмационным превращениям. Об этом свидетельствуют результаты виокозиметрических исследований растворов гуминовых кислот.

Таким образом, гуминовые кислоты рассматривают как макромо-лекулярные полидентатные лиганды, обладающие свойствами полиэлектролитов и конформационяой изменчивостью.

Исследование комплексообразования гуминовых кислот с различными средневесовыми молекулярными массами (Мг) с ионами биомэтал-лов (N1 (И), Со (II), гл (II), Мп (II)) проводилось методом гель -фильтрации на сефадексе (3-100 на колонке 1,3*30 см.

Экспериментальные данные, представленные в координатах Скэт-чарда (рис.1) показывают, что образование комплексов в рассмат-оизчеыой системе протекает как связывш-.ие ионов металла по мко-

жеству центров на макромолекуле гуминовых киолот с формированием отдельных координационных узлов. Взаимодействие ионов металлов с гуминовыми кислотаму реализуется с участием двух типов функциональных групп - сильно- и слабокислотных.

(у/СМгМСГ

V-! О

0,05 0,1 1,5 2,0

Рис. 1. График Скэтчарда для связывания гуминовых кислот (ГК-1) с ионами Со2*

Врезки к рис.: графики Хилла для образования координационных центров типа А и В.

Условия опыта: I -25°С; рН 8,0; I -0,1 (МаС104).

Для каждого типа активных центров (А, В) наш рассчитаны

константы связывания (Кд , Кц ) и максимальные числа центров связывания ионов металлов на макромолекуле гуминовых кислот Мц)

(табл. 2). При низких исходных концентрациях ионов металлов в

рассматриваемой системе происходит образование координационных узлов с участием наиболее сильных донорных центров макролиганда, которым соответствуют высокие значения Кд и К^ . С увеличением

концентрации ионов металлов и вовлечением в процесс комплексооб-разования менее сильных донорных центров, рассчитанные величины констант связывания понижается.

Таблица 2

Характеристика процесса комплексооб разовая ия ионов металлов с гуминовыми кислотами

** — ........г--- К^СГК) 1 КА, УГ1 1--------- МА | V кв .Ы1 «В ХВ

124000 18000 2600 2,52-10® 3,52*10® 5,06*10® 61,4 55,0 6,5 1,73 1,20 1,19 2,0Г.105 2,86-10® 3,60-Ю5 95,6 74,3 8,9 3,50 3,15 2,73

Со2+ 124000 18000 2600 4,00-10® 2,30-Ю7 4,60-Ю7 58,8 67,4 6,8 2,15 1,20 0,95 2.80-105 3,30-10® 4,10-10® 90,0 84,0 12,2 2,62 1,60 1,50

2Л2+ 124000 18000 2500 2,50-Ю7 4,30-Ю7 9,80-Ю7 32.6 30.7 6,7 1,28 1,18 1,10 8,10-10® 2,80-10® 3,70-10® 68,9 46,4 7,8 3,75 3,64 3,50

Ш2+ 124000 18000 2500 3.16-107 5,90-Ю7 1.00-108 71,4 43,0 24,0 1,80 1,45 1,18 6,00-10® 5,80-10® 6,60-10® 125,0 61,6 36,0 2,33 2,30 2,14

Условия опыта: Ь-25°С; рН 8; I- 0,1 (ЫаСЮ^)

Следует отметить, что зависимость величины каяузцейся константы связывания от концентрации ионов металлов, по существу, обусловлена вовлечением лигандных групп с различными злектродо-норными свойствами. В связи с этим никакого противоречия закону действия масс вдесь нет. Это лишь проявление одной из особенностей комплексообразования с ыакромолекулярными лигандами, имеющими множество неоднородных центров. В координационной химии макроли-гандов экспериментальная константа связывания, как правило, является среднестатистической величиной, т. е.,

к к К - £ 1Л-К1/ и (1) .

1-1 1-1

ее рассматривают как функцию равновесия, устанавливающегося в процессе связывания лигандных групп определенного типа (1-1).

С увеличением молекулярной массы гуминовых кислот наблюдается понижение устойчивости образующихся металлокомплексов, что мо-;жт быть связано с проявлением стерических затруднений при удлинении полимерной цепи макролиганда.

Обработка данных—в координатах И-у) позволила

рассчитать коэффициенты Хилла (Хд, Хд) (табл. 2).

Повышение значений коэффициентов Хилла с увеличением числа координационных центров свидетельствует об усилении при этом кооперативное™ процессов комплексообраэования ионов металлов с Тумановыми кислотами.

Число координационных узлов в макромолекулярном комплексе гуминовых кислот возрастает по »ере усиления комплоксообразуш^й способности металлов в следующем ряду: N1 > 2п > Со > Мп.

Результаты исследования электронных спектров поглощения соединений кобальта и никеля с гуминовыми кислотами представлены в табл.3. Замещение молекул воды в координационной сфере ионов металла функциональными группами гуминовых кислот приводит к смещению указанных переходов в поля с большей энергией СОч повышается). Возрастание величины указывает на увеличение прочности связи металл-лиганд.

Стерические затруднения, вызванные высокомолекулярной природой лиганда, обусловливают частичное замещение молекул воды в координационной сфере и формирование координационных узлов с низкой симметрией. Это объясняется тем, что в спектрах имеются также полосы, не отвечающие указанным в таблице переходам.

На основании анализа КК-спектра а металлокомплексов гуминовых кислот можно предположить координацию металлов с карбоксильными группами ГК при рН < 9, поскольку характеристическая полоса колебаний карбо.нила СООН-групп (1700 ем-1) ослабляется вследствие замещения ионов водорода в карбоксильных группах гуминовых кислот ионами металла. Вместе с этим в спектрах появляются полосы, соот-

ветствушие симметричным 400-1390 см ) и асснштричным

(Уаз-1590- 1660 см'Ь колебаниям карбоксилат-иона. Кроме того,

выявляются полосы при 800-720 см~* и 640-520 см-1, которые могут быть отнесены к валентным колебаниям карбоксилов в комплексах (рис.2). Координация металл-ионов в этих условиях может происходить и с азотом имидазольного кольца гистидина.

О 3300 3000 1800 1600 1400 800 Рис. 2. Инфракрасные спектры системы: ионы кобальта- ГК - аланин;

600

V, см"

Со : ГК : А1а- 1- 0:1:0; 2- 1:2:0; 3- 1:2:2.

[10-10? М

Рис. 3. Влияние ионов металлов на приведенную вязкость гуминовых кислот (ГК-2).

Условия опыта: Ь - 25°С; рН 8; 1-0,1 (НаС104); ГГК-23- 0,312-10"2,Г/ДЛ.

Таблица 3

Значения электронных переходов и некоторые параметры кристаллического поля комплексов металлов с и гуминовыми кислотами

Комплекс максим, пс Л ,нм )ГЛ0ШЭНИЯ },см-1 электронные переходы оа Д .см1 геометрическое строение

ЫКНдО)!* 1350 800 394 7350 12500 25380 —3Т1е(Р) —^ВСР) 735 правильный октаэдр

ш-гк 1265 751 888 7900 13315 25770 790 искаженный октаэдр

Со(Е>0)§+ 1100 510 455 9008 19608 22000 1300 мало искаженный октаэдр

Со-ГК 1094 504 448 9140 19840 22340 4т1е —4т1г(р) 1320 искаженный октаэдр

Результаты виекозиметрических исследований указывают на возможность конформационных изменений гуминовых кислот при комплск-сообразовании с ионами метаилов (рис.3). Е частности, при повышении концентрации ионов металлов в растворе в определенный момент приведенная вяакость понижается, что связано со сжатием полимерного клубка вследствие координации ионов металлов несколькими до-норными группами одной макромолекулы. При этом реализуется внутримолекулярный механизм.

Таким образом, на основании исследования взаимодействия ионов металлов с гуминовыми кислотами показано, что макромолекулярная природа последних обусловливает проявление при комплексообразова-нии их с ионами металлов концентрационных, кооперативных и конформационных эффектов. 0

Глава III. Эффекты комплексообрааования ионов металлов в процессах ингибирования активности некоторых протеолитических ферментов гуминовыыи кислотами В настоящей работе в качестве-теста на биологическую активность гуминовых кислот выбрана их ингибирущая способность по отношению к протеолитическим ферментам.

Нами проведено исследование влияния ионов металлов (Со (II), N1 (II), Ш (II), 2п (II)) на ингибирование активности субтилизи-на штамм 72 и ¿-химотрипсина в реакциях гидролиза субстратов гуминовыыи кислотами (ГК-2). В качестве субстратов использованы этиловый эфир Н-ацетил-Ь-тирозина (АТЕЕ) и метиловый эфир И-бен-'эоил-Ь-лейцина (ВЬМЕ).

Нами предварительно были исследованы природа влияния гуминовых кислот и ионов металлов на реакцию гидролиза субстратов, катализируемого указанными ферментами.

Результаты исследований по влиянию эффекторов на активности изучаемых ферментов указывают на ингибирование гуминовыми кислотами и ионами Со (II), N1(11), № (II) по смешанному типу (рис.4). Ионы цинка (II) в исследуемом интервале концентраций не оказывают заметного влияния на активность ферментов.

г?

(i/V)-10"\ If^O

• 0,8 • • - . л о/Л А/л

/ЛСз

2

0,6 •

0,4 •

1 1 1

-0,4

0,2

0,4. . 0,6

tsrto-^M"1

Pec. 4. ииетнное ингибирование активности субтилиэина

гуминовыми кислотами (ГК-2) в реакции гидролиза АТЕЕ. Условия опыта; t -25°С; рН 7,8; I -0,1 (NaC104).

СЕ30- 1,63-10"? М; СГКМ05,& 1-0; 2-1,10;

3- 1,64; 4- 2,74; Б- 3,83;6- 4,24

10

Для описания ферментативного процеооа, протекающего о учао-тием ингибитора (I), выбрана следующая кинетичесгсая схема:

к.

Е + Б —^

¡Ш

1! КБ £1 + 5

ЕЗ

Е + Р

(2)

¿к2

» Е1Б -»- Е1 + Р

где Е- фермент, Б -субстрат, ЕЗ- фермент-субстратный комплекс (комплекс Михаэлиса), Е1- фермент-иягибиторный комплекс, Кз-константа диссоциации комплекса Михаэлиса ЕБ, к2- константа скорости распада комплекса Еказлюа, ?Л- ютстанта диссоциации фэр-мент-ингибиторкого комплекса (константа ингибирования). Определены значения < р , К1 для каждого из рассматриваемых ингибиторов (табл. 4).

Таблица 4

Параметры ингибирования активности протеиназ в реакциях гидролиза сложных эфиров Н-ацил-Ь-ам1шокислот

гумяковкмя и ионами металлов

Фермент

Субстрат

Эффектор

К1 ,М

о£

•¿-хиыо-трипсин

субтили-

эин

АТЕЕ АТЕЕ АТЕЕ АТЕЕ АТЕЕ ВШЕ АТЕЕ Н.МЕ ЩЕ АТЕЕ

ГК

N2 2г;

со;

ГК

ГК

2+ 2+ 2+ 2+

N

2л'

2+ .2+

со;

,2+

2+

(1,87+0,14)-10~б (7,70+0,05)-Ю-6

(8,50+0,30)-Ю"4 (2,75+0,10)-Ю-4 (6,60+0,23)-10"®

(8,16+0,18) -10' (9,80+0,45)-10"

-в

(8,40±0,20)-10"6 (1,75+0,08)-10"^

0,76 1,0

0,77 1,98 0,78 0,90 0,89

0,65 2,69'

0,70 0,88

0,63 1,0 ■ 0,14

0,17 0,21

0,16

0,16

Рассчитанные значения констант ингибирования гушшовыми кислотами (табл. 4) свидетельствует о высокой устойчивости Фермент-ингибиторных комплексов. Комплекс гушновых кислот с белко-выы катализатором шлет быть отнесен к группе полиэлектролитных

комплексов, высокая устойчивость которых объясняется кооперативным (многоточечным) связыванием.

Необходимо отметить, что близость констант ингибирования активности субтилиэина гуминовыми кислотами в реакциях гидролиза АТЕЕ и BLM2, соответственно, указывает на достаточную инертность гуминовых кислот по отношению к выбранным субстратам.

Экспериментальные значения констант ингибирования ионов металлов показывают, что по способности к комплексообразованию с указанными ферментами' ионы металлов располагаются в ряд Ирвинга -Вильямса.

С целью выяснения возможности участия в процессе ингибирования металлокомплексов гуминовых кислот образующихся в реакционной системе ГК - Ш - Е исследовано влияние ионов металлов на процесс ингибирования активности протеинаэ гуминовыми кислотами. При этом выявлена нелинейная зависимость скорости ферментативного гидролиза субстратов от концентрации ингибиторов в системе (рис.5).

Теоретические величины скоростей ферментативной реакции, полученные с использованием кинетических уравнений, описывающих классическое двухкомпонентное ингибирование как по взаимозависимому, так и взаимонезависимому типу не. соответствует экспериментальным данным. Этот факт, очевидно, указывает на существенное влияние комплекеообразования ионов металлов с гуминовыми кислотами на ингибирование активности протеолитических ферментов в таких многокомпонентных системах, а именно на участие в ферментативном процессе металлокомплексов гуминовых кислот.

Используя уравнение для скорости ферментативной реакции, описывающее кинетическую схему с участием трех ингибиторов , были рассчитаны кажущиеся константы Ш3для металлокомплексов гуминовых кислот.

Анализ зависимости Kig от концентрации ионов металлов (рис.6) позволяет сделать некоторые предположения о состоянии макромолекулы гуминовых кислот в присутствии ионов металлов различной концентрации. При ниаких концентрациях ионов металлов образуется незначительное число координационных узлов, вследствие этого имеет место стабилизация развернутой ' конформации макромолекулы гуминовых кислот, которая оказывает благоприятное воздействие на прочность образующихся фермент-ингибиторных комплексов. При этом не нарушается комплементарность поверхностей макромолекул белко-

V 107, M-o"1

0,2 0,6 1,0 1,4 1,6

.2+

еш2+З-Ю4,М

Рис. б. Влияние ингибиторов (Ш , Гй -2) на активность oí-химотрипсина в реакции гидролиза АТЕВ. Условия опыта: t-25°C; 1-0,1 (NaC104); рН 7,8;

IS3 - 2,03'10*4М; ГЕЗ- Í.OO-IO"8!!; СГКЗ-106: I- 0; 2- 1,10; 3- 2,74; 4- 4,38.

-7,0 -6,0 -6,0 -4,0 -3,0

IgCMJ

Рис.6.. Зависимость К13 от содержания ионов металлов

в системе ГК- ионы металлов химотрипсин. Субстрат- АТЕЕ. Условия опыта: 1«25°С; рН 7,8; 1-0,1 (МаС104); ГЯ-3,83-10"4,М; СГЮ- 1,1-10

[ЕЮ- 1,0-10"8,М.

вого катализатора и гуминовых кислот, оохранягооя вое типы взаимодействия, имевшие место вне участия ионов металлов (гидрофобные, электростатические, посредством водородных связей). Кроме того, по местам локализации ионов металлов в макродкгандах происходит образование разнолигандных координационных узлов с участием как гуминовых кислот,, так и фермента. Образующиеся при этом фермент-ингибиторные комплексы характеризуются более высокой устойчивостью и подавление активности протеиназ усиливается (рис. 6).

При последующем увеличении содержания ионов металлов в растворе образование разнолигандных координадионноых уалов затруднено вследствие пространственных затруднений, вызвангчх конформацион-ными изменениями. Следствием этого является также ослабление всех видов взаимодействия между ингибитором и белком. Ингибирование в этих условиях в определенной степени снимается.

В зависимости от концентраций, необходимых для максимального усиления ингибируюцей способности гуминовых кислот по отношению к о^-химотрипсину и субтилизину, ионы металлов можно соответственно расположить в ряд Ш< 2п < Со < Ш, который противоположен ряду устойчивости Ирвинга- Вильямса. При больших концентрациях по эффективности воздействия на ингибируюшую способность гуминовых кислот ионы металлов располагаются соответственно ряду устойчивости Ирвинга-Вильямса. Эти данные можно объяснить тем, что более склонные к образованию комплексы ионы металлов связываются с гу-миновыми кислотами прочнее и вызывают соответствующие изменения конформации его макромолекул. Вследствие этого возрастает эффективность воздействия их на. ингибируюшую способность гуминовых кислот.

Таким образом, ыеталлокомплексы гуминовых кислот являются сильными неспецифичными ингибиторами протеолитических ферментов, активность которых может меняться в зависимости как от природы, так и от содержания ионов металлов в реакционной системе.

Глава IV. Разнолигандные комплексы ионов металлов с гуминовыми кислотами и аминокислотами

Известно, что комплексы металлов с макромолекулярными лиган-дами характеризуются ненасыщенностью координационной сферы металла. Вследствие этого такие соединения проявляют высокую активность в так называемых реакциях "тганд-обиеиа" или "лиганд-сорб-цин", в результате которых образуются разнолигандные комплек-

оы. Нами исследована возможность и специфика образования разнолигандных комплексов ионов металлов (Со (II), N¡-(11)) с участием гуминовых кислот и аминокислот (ыетионин, аланин), которые могут быть рассмотрены в качестве моделей вышеуказанных фермент- инги-биторных комплексов. Исследование проводилось в гомогенных и гетерогенных условиях.

Ш экспериментальным результатам, полученным при исследовании лиганд-сорбции аминокислот (1.) на ыеталлокомплексах гуминовых кислот при рН 3 были построены кривые образования разнолигандных комплексов (рис.7).

Ш*

1 - Ni- ГК-Met; 2 - Nl-ГК- Ala; 3 - Со-ГК- Met; 4 - Со - ГК-Ala.

Из этих данных следует, что в результате рассматриваемой реакции лигандного замещения образуются разнолигандные комплексы,

где в координационной сфере металлов аминокислоты занимает одно или два места.

В ИК-спектрах разнолигандных комплексов наблюдается коротковолновый сдвиг колебаний Vas (NHg), Vas и Ys (СОО~), тогда как для Vs (NHg) происходит длинноволновый сдвиг относительно колебаний аналогичных групп в ыеталлокомплексах гуминовых кислот. Наблюдаемые изменения в колебательных спектрах, очевидно, вызваны координацией аминокислот посредством карбоксилат-анионов к иетал-локомплексам гуминовых кислот (рис.2). Ва основании анализа ИК-спектров ыолет быть предложено следуйте строение координационных узлов в синтезированных продуктах (рН 3):

Лиганд-сорбция аминокислот на металлокомплексах гуминовых кислот может быть представлена как связывание аминокислот на множестве металлсодержащих центров полимерной основы, в качестве последней слухат макромолекулы гуминовых кислот. Для описания равновесия в подобной системе были использованы подходы, разработанные при исследовании биополимеров с низкомолекулярными соединениями. В таком случае константа равновесия в системе металло-комплексы гуминовых кислот -аминокислоты может быть описана уравнением:

ш*

К--(3)

([№3 - Ш*)-НЛр где Е1Л*- концентрация аминокислоты, связанной с ионами металла;

СМРЗ-концентрация металлсодержащих центров гуминовых кислот;

[ЬЗр-равновесная концентрация аминокислоты.

Если ввести величину v, равную отношению количества связанных аминокислот к массе металлокомплекса гуминовых кислот, то после соответствующих преобразований подучим следующее выражение:

у/С и р- КСМРЗ - Кч - К'(СМРЗ -_у), (4) которое дает возможность определить К с помощью графиков Скэтчар-да ( у/Шр ; у). Следует отметить, что установленная при таком подходе константа (табл.5) является среднестатистической величиной, характеризующей связывание аминокислот по множеству координационных узлов, находящихся на макромолекуле металлокомплексов гуминовых кислот.

Экспериментальные зависимости в координатах Скэтчарда соответствуют многоцентровой модели связывания аминокислот с металлокомплексами гуминовых кислот. Также, как и в процессе взаимодействия ионов металлов с гуминовыми кислотами , выявляется два типа координационных узлов, формирующихся с участием аминокислот.

Таблица 5

Характеристика процесса комплексообразования металлокомплексов гуминовых кислот с аминокислотами

Комплекс | Кд ю- 1м-11 Нд ТХд квТо'4 - м"11 Мв 1 хв - |

ГК-М1-Ме1 11,0 7,0 1,54 1,00 5,7

ГК-Со-Мэ1 7,10 5,6 1,43 0,75 3,7

ГК-Ш-АЬа 15,0 3,0 0,40 0,95 2,8

ГК-Со-АЬа 3,30 2,5 2,30 0,80 1.6

Условия опыта: Ъ-25°С; рН 3,0; 1-0,1 (ЫаС104).

Кооперативные эффекты, наблюдаемые в исследуемых процессах комплексообразования металлокомплексов гуминовых кислот с аминокислотами, проявляются только при образовании координационных узлов с участием сильных донорных центров макролиганда.

Образование разнолигандных комплексов при взаимодействии аминокислот с металлокомплексами гуминовых кислот в растворе изучалось с использованием потенциометрического метода. Расчет констант устойчивости образовавшихся разнолигандных комплексов производился по методу Шварценбаха на основе анализа кривых титрования При этом для рассмотренных комплексов (ГК-Ш-М^, ГК-Со-Ме^ ГК-ЬИ-АЬа, ГК-Со-АЬа) константы устойчивости соответственно равны 6,84; 6,07; 6,56; 5,90.

Сопоставление констант устойчивости разнолигандных комплексов, образующихся при различных рН показывает, что устойчивость исследованных соединений выше в слабощелочной среде. В слабощелочных растворах макромолекула металлокомплексов гуминовых кислот находится в состоянии гибкой конформации, что снимает в некоторой мере стерические препятствия для доступа аминокислот к металлсо-деряапим центрам.

При рН-3 маловероятна сколько-нибудь значительная деформация полимерной цепи и изменение геометрического расположения её функциональных групп. Последние не всегда могут находиться в конфор-

нации, оптимальной для образования комплексов. Кроме того, с позиций электростатических представлений, в кислой среде может проявляться электростатическое отталкивание между протонированными аминогруппами аминокислот, входящих в координационную сферу центрального иона В связи с этим взаимодействие центрального иона с лигандами ослабляется.

Таким образом, представленные в данной главе результаты являются подтверждением возможности образования раэнолигандных координационных узлов, формирующихся с участием лигандных групп как гуминовых кислот, так и белка, структурными единицами которого являются аминокислоты.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что гуминовые кислоты, как природные макро-молекулярные лиганды, проявляют особенности при комплексообраэо-вании с ионами металлов, обусловленные неоднородностью лигандных центров, полиэлектролитными свойствами, конформационной изменчивостью полимера

2. Установлено влияние комплексообразования с ионами металлов на активность ингибитора, обусловленное образованием раэнолигандных координационных узлов, формирующихся с участием.гуминовых кислот и белка Рассчитаны константы нестойкости фермент-ингиби-торных комплексов, образующихся с участием металлокомплексов гуминовых кислот. Предложено рассматривать подобные фермент-ингиби-торные комплексы как белково -гуматные комплексы ионов металлов.

3. Выявлена зависимость.прочности фермент-ингибиторных комплексов от природы ионов металлов. Установлено, что эффективность воздействия ионов металлов на ингибирующую способность гуминовых кислот возрастает в ряду Ирвинга-Вильямса

4. Показана возможность регуляции ингибируюшрй способности гуминовых кислот с помощью изменения обвдэй концентрации ионов металлов в реакционной системе. Изменение ингибирующей способности металлокомплексов гуминовых кислот, формирующихся при разных значениях общей концентрации ионов металлов в реакционной системе, проходит через оптимум. В зависимости от величины концентрации, необходимой для максимального усиления ингибирующей способности металлокомплексов гуминовых кислот по отношению к протеолктичес-ким ферментам, ионы металлов располагаются в ряд, обратный ряду Ирвинга-Вильямса

Б. Впервые в качестве моделей белково-гуматных комплексов металлов изучены разнолигандные комплексы- металлов с гуминовыми

кислотами и аминокислотами, образующиеся, в гомогенных и гетерогенных системах. Рассчитаны константы устойчивости соответствующих комплексов. Показано, что устойчивость разнолиганднъЁГкБм^"" лексов выше в гомогеннных системах.

Основные результаты диссертации изложены з работах:

1. Норобекова Ш. Ж. , Кыдралиева H.A., Власова Т.Е. Способ определения гуминовых кислот в природной воде. Авторское свидет. No 1427298 от 01.06.1988 г.

2. ЗЬробекова ÜL2., КараСазв С. 0., Кыдрздиева К. А. Влияние ионов некоторых переходных металлов на ингибирование активности протеиназ гуминовыми кислотами. //В кн. : Координационные соединения металлов с биолигандами.-Фрунзе: Илим, 1986.- С. 118 -128.

3. Ghorobekova Sh. , Kidralieva К. The influence of metal1-ions on the inhibition of proteolytic enzymes with humic acids. //Proc. of sixth European Sympos. on Organic Chem., Belgrade, Yugoslavia, 1989.

4. Кыдралиева К. A. , Жоробекова Ш. S. Лиганд-сорбция аминокислот на металлокомплексах гуминовых кислот. //Тез. докл. XVIII выездной сессии секции бионеорг. химии Научного Совета по неорг. химии АН СССР. - Бишкек, 1991.- С. 33.

5. Кыдралиева К. А. , Норобекова III Ж. Реакции лигандного замещения металлокомплексов гуминовых кислот аминокислотами в растворе // Там т. - С. 34.

6. Кыдралиева К. А., Норобекова Ш. Ж. Реакционная способность гуматных комлексов ионов металлов (Со , Hi } в реакциях ингибиро-вания активности некоторых протеиназ. // Там же. - С. 72.

7. Норобекова Ш. Ж. , Зарипова А. А., Кыдралиева К. А. Прикладные аспекты химии металлокомплексов гуминовых кислот. // Там ив. -С. 95.

S. Норобекова 11 Ж. , Мальцева Г. М. , Кыдралиева К. А. Особенности комплексообразования ионов металлов с гуминовыыи кислотами. //Биологические науки, 1991,- No 10.- С. 71-75.

ô. Жоробекова Ш. К. , Кыдралиева К. А. Ингибирование активности протеиназ гуминовыми кислотами. //Там же.-С. 151-154.