Взаимодействие ионов и наночастиц биофильных 3d-металлов с протеиназами Candida albicans тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.01 ВАК РФ

На правах рукописи

МУХАМЕТЗЯНОВА АЛСУ РИНАТОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ И НАНОЧАСТИЦ БИОФИЛЬНЫХ 3</-МЕТАЛЛОВ С ИРОТЕИНАЗАМИ СапШа аІЬісат

02.00.01 — неорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

2 9 №Г

Казань - 2013

005532287

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент

Кутырева Марианна Петровна

Официальные оппоненты: Михайлов Олег Васильевич,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», профессор кафедры аналитической химии, сертификации и менеджмента качества

Первова Инна Геннадьевна, доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Уральский государственный лесотехнический университет», заведующая кафедрой физико-химической технологии защиты биосферы

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный

университет инженерных технологий»

Защита состоится 24 сентября 2013 г. в 14.00 ч на заседании диссертационного совета Д 212.080.03 на базе ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет» по адресу: 420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68 (зал заседаний Ученого совета, А-330).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского национального исследовательского технологического университета.

Автореферат разослан « ^Н »

Учёный секретарь диссертационного совета

АЛ. Третьякова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Роль ионов биофильных З^-металлов непосредственно связана с регуляцией ферментативных процессов. При этом основу протекающих взаимодействий составляют процессы комплексообразования ионов металлов с ферментами как макромолекулярными биолнгандами. Часто исследование в модельных системах на основе аминокислот или олигонуклеотидов не позволяет получить реальную информацию о процессах комплексообразования ионов биогенных металлов с биомолекулами, в частности с ферментами. Поэтому разработка и совершенствование методов и подходов к изучению комплексообразования ферментов с ионами металлов имеет высокое теоретическое значение и позволяет обеспечить эффективное практическое применение биологически функциональных металлокомплексов.

Одним из факторов, определяющих патогенность наиболее распространенных и опасных грибковых культур, является активность их протеолитических ферментов. Наибольший интерес в плане корреляции протеиназной активности и патогенности представляет культура Candida albicans (C.alb.). Среди протеиназ C.alb. доминирующими являются индуцируемая протеиназа (SAP2'), проявляющая антигенные свойства, и конститутивная протеиназа (SAP4'), обладающая преимущественно сорбционными функциями. При этом в литературе описано действие на протеиназы C.alb. только природных ингибиторов пепстатина А и ацетилпепстатина и их синтетических аналогов. Влияние ионов и наночастиц металлов, традиционно использующихся для управления ферментативной активностью, практически не представлено.

Целенаправленный поиск и синтез нетоксичных неорганических соединений на основе биофильных металлов - эффекторов протеолитических ферментов грибковых культур, исследование сложных взаимодействий ферментов с эффекторами, анализ и обобщение полученной информации, поиск закономерностей и особенностей для координационной и неорганической химии представляют значительный интерес.

Целью работы является выявление закономерностей взаимодействия ионов и наночастиц 3rf-металлов (кобальта, меди и цинка) с протеиназами Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов, а также разработка подходов к управлению ферментативной активностью протеиназ Candida и патогенностью грибковых культур.

Научная новизна:

На основании данных УФ-спектрофотометрии с использованием метода математического моделирования впервые определены параметры комплексообразования и ассоциации в системах [М(П)-&1Р2] и [М(П)-5И/Ч1, где М = Со(П), Си(П), Zn(ll), SAP 2 - индуцируемая, SAP4 - конститутивная протеиназы Candida albicans. Выявлены закономерности влияния природы иона металла и типа протеиназы Candida albicans на состав комплексных форм, константы образования комплексных форм, кажущиеся константы ассоциации.

Впервые для секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans SAP2 и SAP4 предложен подход к оценке процессов комплексообразования в системах М(П) - иммобилизованный фермент. Определены константы твердофазного комплексообразования Г„, состав образующихся твердофазных металлокомплексов. Выявлена корреляция параметров твердофазного комплексообразования с закономерностями комплексообразования SAP2 C.alb. с ионами металлов в растворах.

Разработаны методики синтеза и синтезированы новые гибридные наночастицы на платформе коллоидного диоксида кремния, модифицированного органическими

фрагментами Cu/(Si02)R„, Co/(Si02)Rn, Zn/(Si02)Rm где R= 3-аминопропилтриметоксисилан, (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)-пропан-2-илфосфонат, 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевина. Методами рентгенофазового анализа, УФ-спектрофотометрии, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии определены состав, морфология и размер синтезированных наночастиц.

Практическая зпачимость:

Показана принципиальная возможность использования ионов металлов Со(П), Cu(II), Zn(II) и гибридных наночастиц Cu/CSiOÄ, Co/(Si02)R„ Zn/(Si02)R„, где R = 3-аминопропилтриметоксисилан, (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)-пропиламино)пропан-2-илфосфонат, 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)проішл)мочевйна в управлении каталитической активностью индуцируемой и конститутивной аспарагиновых протеиназ Candida albicans, определяющих уровень патогенносте и адгезионной активности штаммов Candida. Максимальный эффект ингибирования наблюдается при использовании ионов Со(11) и наночастиц Co/(Si02)(CH2CH2CH2NHC(0)NHPh)n.

Впервые оценена фунгицидная активность гибридных наночастиц Cu/(Si02)Rn, Co/(Si02)Rn, Zn/(Si02)R„, где R = 3-аминопропилтриметоксисилан, (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)пропан-2-ил-фосфонат, 1-фенил-3-(3-(триметокси-силил)пропил)мочевина к культурам Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, плесневым грибам Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Rhodotorula mucilaginosa (rubra), Pénicillium fiiniculosum, Pénicillium chrysogenum. Pénicillium ochro-chloron, Pénicillium variotii, Trichoderma viride. Установлено, что активность наночастиц Co/(Si02)Rn к плесневым грибам зависит от природы модифицирующего фрагмента ядра Si02 и возрастает в ряду (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)пропан-2-илфосфонат < 3-аминопропилтриметоксисилан < 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевина.

На защиту выносятся:

• спектральные характеристики, результаты определения логарифмов условных констант образования, максимальной доли накопления и состава комплексных форм в системах [М(И)-£4Я2] и [M(ll)-SAP4], где M = Co(II), Си(П), Zn(II), SAP2 -индуцируемая, SAP4 - конститутивная протеиназы Candida albicans в растворе;

• параметры твердофазного комплексообразования иммобилизованных протеиназ Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов с ионами Со(11).;

• параметры ассоциации (кажущиеся константы ассоциации, количество участков связывания, количество идентичных центров связывания) ионов Со(П), Си(П), Zn(II) с протеиназами Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов в растворе и в иммобилизованном состоянии;

• параметры комплексообразования и ассоциации ионов Со(П), Си(П), Zn(II) с протеиназами Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов, выделенных из штаммов с различной резистентностью к препарату «Дифлюкан» в растворе и в иммобилизованном состоянии;

• методики синтеза гибридных наночастиц Cu/(Si02)R„, Co/(Si02)Rn, Zn/(Si02)Ra, где R=3-aMHHonponnriTpHMeTOKCHCHnaH, (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропил-амино)пропан-2-илфосфонат, 1 -фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевина, данные рентгенофазового анализа, спектральные характеристики, термическая устойчивость, морфология поверхности и размер частиц;

• количественные характеристики биохимической активности ионов Co(II), Cu(II), Zn(II) и наночастиц Cu/(Si02)Rn, Co/(Si02)R„, Zn/(Si02)R„ по отношению к индуцируемой и конститутивной аспарагиновым протеиназам Candida albicans в растворе и иммобилизованном состоянии;

• параметры фунгицидной активности наночастиц Cu/(Si02)Rn, Co/(Si02)R„, Zn/(Si02)R„ к дрожжеподобным грибам Candida albicans, Candida tropicalis, Candida parapsilosis, Candida krusei, плесневым грибам Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Rhodoiorula mucilaginosa (rubra), Pénicillium funiculosum, Pénicillium chrysogenum, Pénicillium ochro-chloron. Pénicillium variotii, Trichoderma viride.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (г.Томск, 2006); VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (г. Москва, 2007); П Международном форуме «Аналитика и аналитики» (г. Воронеж, 2008); XIX Российской молодежной научной конференции «Проблемы теоретической и экспериментальной химии» (г. Екатеринбург, 2009); XXIV Международной Чутаевской конференции по координационной химии (г. С.Петербург, 2009); IX Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2009); XVII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (г. Йошкар-Ола, 2010); XXV Международной Чугаевской конференции по координационной химии (г. Суздаль, 2011); X Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2011); XVIII Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (г. Йошкар-Ола, 2011); Всероссийском конкурсе научно-исследовательских работ студентов, аспирантов и молодых ученых по нескольким междисциплинарным направлениям «Эврика 2011» (г. Новочеркасск, 2011); XI Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» (г. Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 18 работ. Из них 6 статей (в изданиях из перечня ВАК) и 12 тезисов докладов на всероссийских и международных конференциях.

Работа выполнена на кафедре неорганической химии Химического института им. А.М. Бутлерова ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» при поддержке грантов программы «Молодежный инновационный проект» проект «Антисептические составы на основе наноразмерных полимеров для бетона, кирпича и штукатурки» (ГК № 9423р/14180); ЕЗН тема 021100038 «Новые типы гибридных органо-неорганических функциональных материалов на основе наноразмерных гиперразветвленных структур»; ЕЗН тема 021000014 «Физико-химические аспекты процессов катализа, сорбции, комплексообразования и межмолекулярных взаимодействий»; ФЦКП «Развитие центром коллективного пользования научным оборудованием комплексных исследований в области физико-химических наноматериалов и молекулярных систем, включая биологические» Министерства образования и науки РФ ГК№ 16.552.11.7008.

Структура н объем работы. Работа изложена на 193 страницах, содержит 25 таблиц, 84 рисунка, 183 библиографические ссылки. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы и приложения (3 таблиц, 6 рисунков).

Автор выражает благодарность научному руководителю кандидату химических наук, доценту Кутыревой МП. за помощь в работе и доктору химических наук, профессору Улаховичу H.A., принимавшему участие в обсуждении результатов работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В главе 1 (Литературный обзор) содержатся сведения' о строении и физико-химических свойствах протеиназ семейства Candida, описаны их биохимические свойства и факторы патогенности. Отдельное внимание уделено роли ионов 3 d-металлов в ферментативном катализе. Представлены общие методы синтеза и подходы к исследованию наночастиц металлов, способы стабилизации наноразмерных частиц 3d-металллов полимерными структурами.

В главе 2 представлены объекты исследования, условия эксперимента, методики приготовления растворов, синтеза гибридных наночастиц Cu/(Si02)Rn, Co/(Si02)Rn, Zn/(Si02)R„ В данном разделе приведены характеристики используемой в работе аппаратуры и методов исследования: рН-метрического титрования, УФ-Вид и ИК-спектроскопии, ЭПР, вольтамперометрии, рентгенофазового анализа, просвечивающей и сканирующий электронной микроскопии, совмещенной термогравиметрии и дифференциальной сканирующей калориметрии.

Глава 3 содержит экспериментальные данные и обсуждение полученных результатов. Исследовано взаимодействие в системах [М(И)-5МР2] и [М(П)-5/1Р4], где М = Co(II), Cu(II), Zn(II), SAP2 - индуцируемая, SAP4 - конститутивная протеиназы Candida albicans в растворе и в иммобилизованном состоянии.

Взаимодействие ионов биофильных металлов с протеиназалш Candida albicans в растворе. В данном разделе представлены результаты исследований реакций образования и закономерности в изменениях устойчивости комплексов ионов 3d-металлов Со(П), Cu(II) и Zn(II) с аспарагиновыми протеиназами Candida albicans SAP2 и SAP4 в растворе.

О формировании металлокомплексов в системах [Со(11)-&4Р2], [Cu(II)-iS'/i/>2], [Zn(II)-SAP2], [Zn{ll)-SAP4\ судили по изменению в электронных спектрах поглощения. Устойчивость и мольный состав комплексов ионов металлов с протеиназами Candida albicans установлены методом насыщения в сочетании с математической обработкой кривых с помощью программы CPESSP. Анализ равновесий и параметров комплексообразования ионов Co(II), Cu(II), Zn(II) с SAP C.alb. выявил наличие одной комплексной формы M2L+ в системах [Со(П)-ХЛР2] и [Cu(irbS/f/>2]. В системе [Zn(II)-SAP2] обнаружены дополнительные формы ZnH2L+ с долей накопления 78% и Zn2HL2+ с долей накопления 42%. Устойчивость идентичных комплексных форм зависит от природы иона-комплексообразователя и увеличивается в ряду Zn(II) < Cu(II) < Со(П) для формы M2L+. Переход к конститутивному ферменту SAP4 приводит при комплексообразовании с Zn(II) к реализации только одной комплексной формы состава Zn2HL2+(табл.1).

Изучено комплексообразование протеиназ, продуцируемых штаммами Candida albicans с различной резистентностью к наиболее востребованному препарату азольного ряда «Дифлюкан». Исследование проведено на примере SAP4 C.alb.: штамма по ГОСТ 9.049-91 - SAP 4, чувствительного к «Дифлюкану» SAP4m, резистентного к «Дифлюкану» SAP4(X). В качестве комплексообразователя выбран ион Zn(II). Устанвлено, что система \Za(\l)-SAP4<2>] характеризуется образованием только комплексной формы Zn3L+.

Таблица. 1. Логарифмы условных констант образования (/g/Q и максимальные доли накопления значимых комплексных форм Co(II), Cu(II) и Zn(II) с SAP C.alb. (сsAf2= 3.7Х10'7 моль/л, cwr 1.19><10"'2 моль/л, са>да= 4*10"8- 3.7*10"7 моль/л, рН=4.3, Т=25°С,

Система Равновесие fe/C' a, %

[Co(II)-£4P2] 2Co2++H3L Co2L++3H+ 14.2±0.4 99.9

[Cu(II)-&4P2] 2Cu2++H3L --5 Cu2L++3H+ 12.8±0.4 98.7

Zn2++H3L --5 ZnH2L++H+ 3.2±0.3 78

[Zn(II )-SAP2\ 2Zn2'+H3L -<-- Zn2HL2t+2H* 6.3±0.2 42

2Zn2'+H3L -5 Zn2L++3H+ 11.3±0.3 99.9

[Zn(II )-SAP4] 2Zn2++H3L --- Zn2HL2++2H+ 5.7±0.4 100

Спектральные исследования комплексообразования ионов биофильных металлов с SAP Candida albicans. Конформационные изменения макромолекулы SAP2 при взаимодействии с ионами металлов подтверждены методом ИК-Фурье спектроскопии.

При взаимодействии с ионом Zn(II) практически исчезают полосы амида II, что свидетельствует о неодинаковом расположении во вторичной структуре фермента а-спиралей и (3-слоев. При взаимодействии с ионами Со(И) и Cu(Il) происходят изменения в конформации неструктурированных участков (полоса при 1643 см" исчезает) и изменяется форма спектра в области полос р-слоев (1622-1643 см ). Комплексообразование с ионами металлов приводит к смещению полос С=0 (СОО) фрагментов в области 1700-1800 см 1 и появлению полосы симметричных колебаний СОО' фрагмента при 1403-1413 см"1.

Взаимодействие ионов биофильных металлов с иммобилизованными протеиназами Candida albicans. Предложен способ ковалентной иммобилизации SAP2 и SAP4 на нитратцеллюлозной мембране (НЦМ). Для того чтобы оценить возможность специфического связывания модифицированные ферментами НЦМ исследованы на предмет сорбционного извлечения из водных растворов ионов Со(И). Максимальная сорбциониая емкость НЦМ с иммобилизованной SAP2 по отношению к ионам Со(11) составляет 16.5 мкмоль/см2, для SAP4 - 27.7 мкмоль/см2 (рис. 1).

18 18 14 4,12

•3« | 8 х 6

Vl" А. О н

2

04-i 0,0

Рис.1. Изотерма

адсорбции Со(Щ на НЦМ

с иммобилизованной SAP2 (а) и SAP4 (б) C.alb. (Cw>2S=3.4xl(ri маш/см2, см>/=3.1х10'12 мсшь/см2, рН=4.043).

0,2 0.4 0,6 0.6 с°Со<11)- ммать/л

0,0000 0,0002 0,0004 0,0006

: Со(Н)-

ммспь/л

Для оценки параметров комплексообразования Co(II) с SAP, иммобилизованной на поверхности НЦМ, использована модель фиксированных полидентатных центров (рис.2).

120000

Рис. 2. Зависимость 1/с5соа» от 1/сУсо(Н) по данным сорбции Со(И) из буферного раствора НЦМ с иммобилизованной &4Р2"(1) (с.^-/ = 2.64x10"' моль/см2, 5Нц =6см2, время контакта мембраны с раствором - 30 мин, рН=4.2, Т=(25±0,02)°С), с иммобилизованной ЯАР4' (2) (с^/=3.11х10"12 моль/см2, рН=4.0).

3000 6000 9000 12000 15000 16000

!А;7Со([1)-л/моль

Рассчитаны величины констант твердофазного комплексообразования Г„ и число координированных с одним ионом металла молекул фермента п (табл.2).

Таблица 2. Характеристики комплексообразования Со(Н) с иммобилизованной на НЦМ І'АР С.аІЬ. (с2.64« 10"7 моль/см2 и с5и>/=ЗЛ1><10'12 моль/см2, 8Нцм = 6 см2, У=15 мл, время

SAPCalb. п lgr„ Равновесие

SAP? 0.75±0.0І 3.45±0.04 Co(II) + HmL — [CoHm-iL]+ + Н+, где HraL - SAP C.alb.

SAP-f 0.32±0.01 2.81±0.02

Согласно полученным данным молекула иммобилизованной SAP2 взаимодействует с одним ионом Со(П) с /1=0.75. Это может быть обусловлено связыванием одной молекулы протеиназы с несколькими ионами модулятора одновременно. Кроме того, в связывании более подвижных «вертикально» закрепленных молекул конститутивной протеиназы с ионами Со(Н) может участвовать большее количество участков макромолекулы.

Оценка параметров ассоциации солей биофильных металлов с аспарагиновыми протеиназами Candida albicans. Методом Скэтчарда определены кажущиеся константы ассоциации солей биофильных металлов Со(Н), Cu(II), Zn(II) с SAP2 и SAP4 в растворе. Полученные зависимости в координатах Скэтчарда являются линейными, что говорит о взаимодействии макромолекул SAP2 и SAP4 с ионами металлов по одному участку связывания (рис.3).

Рис.3. График Скэтчарда для связывания Со(Н) с SAP2 (R=0.9917) (а), связывания Zn(Ii) с SAP2 (R=0.99918) (б).

0,6 0,8 1,0 1,2

0,0 0,7 1.4 2,1 28 ї5 42

Для связывания солей Со(П), Си(Н) и гп(П) протеиназой БАР2 наблюдается увеличение кажущихся констант ассоциации в ряду ионов 7п(П) < Си(П) < Со(П) при

наличии двух идентичных центров связывания в специфическом участке молекулы фермента (табл. 3). Для Си(Н) в биомолекуле присутствуют два независимых участка связывания с незначительно различающимися величинами каждый из которых

содержит по одному центру связывания.

Таблица 3. Параметры ассоциации в системах [Co(II)-£4/>], [Cu(I[)-S/iP] и [Zn(II)- SAP] в растворе (п=3, р=0.95).__

Фермент кл(кажЬ Л/МОЛЬ т

Со(11) Cu(II) Zn(II) Co(II) Cu(Il) Zn(II)

SAP2 (8.0±0.5)х10° (7.2±0.4)xl0ö (3.1±0.3)*10Ö 1.9 1.1 1.8

(9.2±0.5)*106 1.1

SAP4 (3.6±0.3)х10'> (3.2±0.3)*106 (l.l±0.1)xI06 1.0 0.9 1.0

Переход к протеиназе SAP4 характеризуется понижением кажущихся констант ассоциации и количества идентичных центров связывания. Вероятно, ион металла координируется только с центром связывания для ионов металла - Asp57.

Оценка параметров ассоциации солей биофильных металлов с иммобилизованными протеиназами Candida albicans.

Для иммобилизованных SAPТ и SAP4' снижаются на 1 порядок. При этом

происходят значительные изменения в характере связывания эффектора. Для SAP2* наблюдаются два независимых участка связывания с количеством идентичных центров 1 и 9 соответственно.

Для SAP41 сохраняется 1 участок связывания, но количество идентичных центров в нем увеличивается до 2.

Переход от индуцируемого (SAP?) к конститутивному (SAP4') ферменту так же, как и в растворе, сопровождается понижением кА (|саж).

Таблица 4. Параметры ассоциации в системе

[Co(H)-S/4f 1 (п=3, р=0.95).

Фермент кл (каж), л/моль m

SAPT (1.7±0.1)х105 (2.7±0.3)х103 1.0 9.4

SAP41 (0.4±0.1)*105 2.3

Синтез и свойства гибридных наночастиц кобальта, меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV). Для синтеза наночастиц меди, кобальта и цинка в качестве матрицы использовали сферические наночастицы ЗЮ2 (ЫЮОХ ТМ40), модифицированные по поверхности органическими молекулами: 3-аминопропилтриметоксисиланом (1), (0,0диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)-пропиламино)пропан-2-илфосфонатом (2), 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)-

мочевиной (3):

(1) (2) (3)

Синтез гибридных наноразмерных частиц (НРЧ) Си/СЗЮг)!*.,,, Со/(5Ю2)Яп, 7п/(5102)Я„ осуществлен методом химического восстановления кристаллогидратов

Си804*5Н20, СоС12*6Н20, 2п804'7Н20 гидразин гидратом в среде стабилизатора

На рентгенограммах образцов 1-За (рис. 4) наблюдаются четкие

интенсивные сигналы при углах в, равных 43.55°, 50.65° и 74.40°, соответствующие

металлической меди с параметрами гранецентрированной кубической решетки (938), (342) и (240). Кроме того, в образцах 1-2а присутствуют рефлексы частиц Си20 при углах 0=36.65° и 42.65°. Широкий пик при #=23.15° указывает на аморфную структуру 8Ю2. Размер частиц Си(0), определенный по интегральной ширине дифракционной линии с использованием формулы Дебая-Шеррера, составляет 6.09-13.24 нм, а наночастиц Си20 - 5.82-8.25 нм.

Для гибридных наночастиц кобальта 1-36 (рис. 5) на рентгенограммах наблюдаются четкие интенсивные сигналы при углах 0, равных 34.75°, 39.30°, 42.85°, 45.55°, 54.20°, 58.15°, 59.90°, 62.83°, 75.65°, 77.65° и 79.30°, которые соответствуют металлическому кобальту в образце 16 и его оксидной фазе во всех образцах. Размер частиц металлического кобальта составляет 8.45 нм, оксида СоО - 2.71-8.50 нм, смешанного оксида Со304- 1.52-5.82 нм.

Рентгенограммы гибридных наночастиц цинка 1в содержат четкие интенсивные сигналы при углах 9, равных 32.23°, 34.87°, 57.33°, которые соответствуют оксидной фазе ZnO с размером частиц 3.95 нм.

Установлено, что средний диаметр наночастиц металлической меди и оксидов кобальта в составе оболочки гибридной НРЧ зависит от природы органического фрагмента на поверхности БЮ2 и уменьшается в ряду -8!(ОСНз)2(СН2)3Ш2 > -8;(0СНз)2(СН2)зКНС(СНз)2Р(0)(0С2Н5)2>-8К0СН3)2(СН2)3КНС(0)ЫНР11.

........* .......3 * * 29,фад 29,град

Рис. 4. Рентгенограмма образца За. Рис. 5. Рентгенограмма образца 36.

Оптические спектры гидрозолей синтезированных наночастиц характеризуются наличием максимумов поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Все образцы Си/(5Ю2)КП имеют в составе наночастицы металлической меди размером более 4 нм, на что указывает максимум ППР при 510 нм. Образцы 1-2а имеют дополнительную полосу ППР при 410 нм, соответствующую наличию Си20.

(табл. 5).

Таблица. 5. Образцы наночастиц М/(5Ю2)В.„

И м № соединения

осн, —¿1— СН2-СН2-СН2-1ЧН2 осн. Си Со Хп 1а 16 1 в

ОСНз ^Нз ос2н5 —¿¡—СЦгСНг-СНз-КН-С— Р=0 ОСНз СНз ОС2Н5 Си Со 2а 26

осн, .-. —Б!—СНг-СН2-СНг-КН-С-НН—/(^)\ ¿СН3 О Си Со За 36

В электронном спектре поглощения образца наночастиц кобальта 16 наблюдаются максимумы ППР металлического Со(0) - 420 нм и его оксидов СоО - полоса с максимумом при 210 нм и плечом при 350 нм и Со304 - 620 нм. В образцах 2-36 присутствуют только максимумы ППР оксидов кобальта.

Для наночастиц цинка 1в в электронном спектре наблюдается полоса ППР 7.пО в области 355 нм.

Методом совмещенной ТГ-ДСК совмещенного с масс-спектрометрией оценена термическая устойчивость наночастиц (рис. 6, 7).

105 -----т.-

50 Ш Те^Л? ^ 300

Рис. 6. ТГ-ДСК термограммы соединения За. Рис. 7. ТГ-ДСК термограммы соединения 26.

Разложение структуры типа ядро-оболочка в диапазоне температур 25-300°С происходит в несколько стадий. Для наночастиц 1а эндотермические переходы обусловлены фазовыми переходами молекул Н20 и термолизом органических растворителей (диэтиловый эфир), адсорбировавшихся на поверхности гибридной наночастицы при синтезе. Термолиз органического фрагмента протекает выше 300°С. Термическое поведение наночастиц 2а в диапазоне температур от 50°С до 300°С имеет аналогичный характер. Наночастицы За термически устойчивы, что может указывать на то, что модификация фрагментами фенилмочевины способствует наилучшему закреплению ионов меди на поверхности с их последующим восстановлением до металлической меди в виде плотного слоя (оболочки). Следует отметить, что оксидная фаза в данном образце отсутствует.

Термическое поведение наночастиц кобальта в образцах 16 и 26 обусловлено характерными окислительными процессами в оксидной фазе в диапазоне температур 200-270°С (рис.7). Для гибридных наночастиц 36 на ядре, модифицированном фенилмочевиной, окислительные процессы отсутствуют и наблюдается лишь эндотермический процесс при 270.4°С, связанный с термолизом органического фрагмента ядра.

Таким образом, термическая устойчивость наночастиц меди выше, чем наночастиц кобальта. Максимальной термической устойчивостью обладают гибридные наночастицы меди на платформе 8Ю2, модифицированного 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевиной.

Морфология поверхности гибридных наночастиц изучена методом просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. Исходные наночастицы (5Ю2Ж„ имеют сферическую форму и размер 22±0.5 нм. В случае образца гибридных наночастиц меди на поверхности аминомодифицированого диоксида кремния 1а. наночастицы стабилизатора (1) агрегированы в большей степени, чем прекурсор. Они имеют сферическую форму и размер 22 нм (рис. 8а). При смешивании их с Си504х5Н20 на микрофотографии отчетливо видны однородные сферические частицы диаметром 22 нм (рис.8б). Гибридные наночастицы меди в данном случае представлены

индивидуальными сферическими частицами с диаметром 27 нм (рис. 8в) и сферическими агрегатами от 55 до 90 нм (рис. 8г).

Рис. 8. Изображение частиц (ЗЮ2)Кп (Я= -51(ОСНз)2(СН2)зШ2)

(а), смеси частиц (8Ю2)Я„ И Си804*5Н20

(б), гибридных НРЧ Си/(8102)Я„ (в, г) полученные методом

пэм

Гибридные наночастицы кобальта 16, полученные на основе того же прекурсора, имеют вид сфер размером 32 нм и шестигранников порядка 64-90 нм (рис. 9).

Гибридные наночастицы цинка 1в на платформе того же стабилизатора имеют сферическую форму с диаметром 24 нм (рис. 10). При этом на микрофотографиях отчетливо видно, что оксид цинка находится в составе оболочки на поверхности стабилизатора.

Рис. 9. Изображение смеси частиц (8Ю2)К„

(К= -51(ОСН3)2(СН2)э>Ш2) и СоС12*6Н20 (а), гибридных НРЧ Со/(8Ю2)Я„ (б, в) полученные методом ПЭМ.

Рис. 10. Изображение гибридных НРЧ 2п/(8ЮгЖг1 (К=-5і(ОСНз)2(СН2)зМН2) 1в, полученное методом ПЭМ.

яИр і ЩВ На микрофотографиях наночастиц меди 2а, закрепленных на

_ ^Щ,". поверхности (8і02)К„, где я= ^¡(ОСНзМСНгЬЫНаСНзЖОХОСгНзЬ, ШЗШШШЩИ»! видно, что гибридные наночастицы 2а имеют сферическую форму с Т® і, 1 1 диаметром 28 нм (рис. 11).

При переходе к наночастицам кобальта 26 на поверхности того же стабилизатора образовавшиеся сферические гибридные наночастицы имеют диаметр 30 нм, а оксидная фаза имеет форму шестигранников с диаметром 80-145 нм (рис. 12).

Рис. 11. Изображение гибридных наночастиц 2а адж^ пе Я= ^ОСНзКСЩНЩСНзЖО) (ОС^Щ полученное методом СЭМ.

Рис. 12. Изображение гибридных наночастиц 26 СЭДЗОД?,, тте Я= ^ОСНзКСЩЫВДСНзЖО) (ООДМ, полученное методом СЭМ.

При замене модифицирующего агента на 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевину (стабилизатор (3)) общая тенденция не меняется. Гибридные наночастицы Си За имеют сферическую форму с диаметром 27 нм (рис. 13). Гибридные наночастицы Со 36 с диаметром 34 нм имеют форму многогранника (0=80-125 нм), окруженного стабилизатором (рис. 14).

Рис. 13. Изображение гибридных ЦНМНК! Рис- 14 Изображение гибридных наночастиц За Си/(5Юг)Я„, где ^НЕ^Нь * наночастиц 36 Со/(ЖуК„ от

Я=-5<ОСН,МСН2),ННаО)ЫН№) ^ШИЕ? Я=-5*(ОСНз)2(СН2),МНС(О^НРЬ

ШШвё

СТСТДШИ

В главе 4 обобщены результаты систематических исследований по биохимической активности ионов и наночастиц кобальта, меди и цинка по отношению к аспарагиновым протеиназам С.alb.

В растворе величина усредненного значения эффекта ингибирования возрастает в ряду Cu(0%) < Zn(54%) < Со(100%). Для индуцируемой протеиназы SAP2 наибольшим ингибирующим эффектом обладают ионы Со(П). Активация каталитической активности в присутствии Со(11) имеет точечный характер и не превышает 45%, а в присутствии ионов Zn(II) - 36%. Ионы Cu(II) можно характеризовать как активатор ферментативной активности во всем диапазоне рабочих концентраций.

Оценка влияния Co(ll) на каталитическую активность иммобилизованных SAP обоих типов показывает, что SAP2s подвергается инактивации модулятором в среднем на 82%, а эффект активации несет точечный характер. На SAP4' модулятор влияет в меньшей степени. Эффект ингибирования в этом случае ослабляется до 80%.

Влияние гибридных наночастиц кобальта, меди и цинка на каталитическую активность секреторных аспарагиноеых протеиназ Candida albicans.

Для наночастиц Cu/(Si02)((0CH3)2(CH2)3NH2)„ (la) наблюдается скачкообразная активация, причем при концентрации Cu/(Si02)((0CH3)2(CH2)3NH2)n 1мг/мл происходит увеличение активационного эффекта в 3 раза, тогда как ингибирование носит диапазональный характер и имеет значение 100% при концентрации 1а 0.05 мг/мл (табл. 6). При замене модифицирующего агента на (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)-пропан-2-илфосфонат влияние медьсодержащих гибридных наночастиц (2а) приводит к проявлению только активирующего эффекта. Активация каталитической активности SAP2 наблюдается во всем диапазоне концентраций модулятора и достигает максимума при концентрации 0.01 мг/мл (усиление активационного эффекта в 6 раз). При смене модифицирующего4ра™ента на

1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевину для медьсодержащих НРЧ (За)

тенденция к активации сохраняется.

При переходе к кобальтсодержащим НРЧ картина меняется. Co/(Si02)((OCH3)2(CH2)3NH2)„ (16) оказывает преимущественно ингибирующее действие на SAP2 которое достигает значения 100% при концентрации 0.01мг/мл. При переходе к C0/(Si02)((0CH3)2(CH2)3NHC(CH3)2P(0)(0C2H5)2)n (26) наблюдается диапазональное чередование активационного эффекта с ингибирующим при увеличении концентрации C0/(Si02)((0CH3)2(CH2)3NHC(CH3)2P(0)(0C2H5)2)„, а в случае

C0/(Si02)((0CH3)2(CH2)3NHC(0)NHPh)n (36) сохраняется ингибирующее действие и

появляется скачкообразный эффект активации при понижении концентрации C0/(Si02)((0CH3)2(CH2)3NHC(0)NHPh)n.

Проведен эксперимент по оценке каталитической активности протеиназы Candida albicans в присутствии наночастиц Zn (1в). Устойчивый эффект ингибирования наблюдается только в области концентраций модулятора 0.01-0.1 мг/мл.

Таблица 6. Каталитическая активность SAP2 в присутствии гибридных наночастиц M/(Si02)Rn, где М= Си, Со, Zn (п=5, р=0.95)._,_

CM/<Si02)Rn, Asapi■ C.alb., мг/мл*мин

мг/мл la 16 1в 2а 26 За 36

0 1.20±0.07

0.01 1.30±0.08 0.010±0.006 0 7.70±0.4 3.50*0.2 10.7*0.5 2.0*0.1

0.05 0 0.10±0.01 0 2.50±0.1 1.9±0.1 4.4±0.3 0.10*0.01

0.10 0.30*0.02 0.20±0.01 0.30*0.02 4.70*0.3 0.30*0.02 1.7*0.1 0

0.50 0.90±0.06 0.40*0.01 3.50*0.17 3.30*0.2 0.30*0.02 2.5*0.2 0

1.00 3.6±0.2 - 3.50±0.17 3.90*0.3 1.7±0.1 2.2±0.1 0

Суммируя полученные результаты, можно выявить следующие общие тенденции:

- В ряду модифицирующих фрагментов ядра Si02: 3-аминопропилтриметоксисилан — (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)пропан-2-илфосфонат — 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевина наблюдается уменьшение активационного эффекта и усиление ингибирующего действии модулятора.

- Ингибирующий эффект усиливается в ряду металлов Си - Zn - Со, находящихся в оболочке гибридных наночастиц.

- Для наночастиц Си и Zn характерно проявление скачкообразного эффекта активации в высоких концентрациях модулятора, тогда как наночастицы Со обладает эффектом полного ингибирования.

Адсорбция протеиназ и адгезия бластоспор Candida albicans на нитратцеллюлозной мембране. Определение адсорбционных свойств фермента SAP4 является важной характеристикой его принадлежности к типу конститутивных протеиназ. Продукты метаболизма конститутивных протеиназ формируют благоприятную среду для последующей секреции и инвазии индуцируемых протеиназ C.alb., обладающих антигенными свойствами (SAP2). Проведенные исследования позволят наиболее полно представить механизм инвазии секреторных аспарагиновых протеиназ C.alb.

Изучена физическая адсорбция секреторной аспарагиновой протеиназы SAP4 на нитратцеллюлозной (НЦ) мембране и специфическая адсорбция фермента на мембране с иммобилизованным субстратом гемоглобином (НЬ) (табл.7). Оценена адсорбция фермента SAP4 в присутствии ионов Zn(II) в концентрациях, при которых наблюдаются максимальные эффекты активации или ингибирования (табл.7).

Таблица 7. Протеолитическая активность (А) и величина предельной сорбции (а„) SAP4 в

czn(h)> моль/л А, мг/мл х мин а^, моль/м2

НЦ | нц+нь

SAP4

0 0.029±0.002 2.5±0.1 12.1±0.3

1x10" 0.014±0.002 0 0

lxlO"5 0.008±0.001 0 0

Для SAP4 в присутствии Zn(II) в концентрации (5x10'8 моль/л), при которой эффект ингибирования составил 84%, сорбция фермента практически не наблюдается.

Сопоставлены результаты изменения ферментативной активности протеиназы C.alb. SAP4 с данными по адгезии бластоспор C.alb. на НЦ мембрану с иммобилизованным гемоглобином. Выявлено, что обработка клеток C.alb. раствором, содержащим ионы Zn(II) в концентрации, соответствующей ингибированию протеиназы SAP4, приводит к уменьшению величины адгезии по сравнению с необработанными модулятором бластопорами C.alb.

Разработанная модель адсорбции протеиназ SAP4 и адгезии клеток C.alb. на НЦ пленку с иммобилизованным гемоглобином позволяет оценить патогенные свойства клинических штаммов гриба и получить практически значимую для медицинских и фармакологических целей информацию. Результаты исследования могут послужить одним из критериев диагностики кандидаинфекции и прогнозирования микотических осложнений.

Оценка фунгицидной активности гибридных наночастиц на основе диоксида кремния, покрытых оболочкой переходных металлов (Со, Си, Zn), по отношению к дрожжевым грибам семейства Candida и к плесневым грибам Aspergillus, Penicillium, Rhodotorula и Trichoderma проведена дискодиффузионным методом. Фунгицидная активность оценена по диаметру зоны лизиса, образующейся вокруг диска, пропитанного контрольным соединением. В холостом опыте использовали диски без препаратов, обработанные растворителем. В качестве стандарта использовали диски с противогрибковым препаратом «Нистатин».

Доказана фунгицидная активность наночастиц Cu/(Si02)R„ (1а-3а) и Co/(Si02)Rn (16 -36) по отношению к ряду плесневых грибов. Активность наночастиц Co/(Si02)Rn к плесневым грибам зависит от природы модифицирующего фрагмента ядра Si02 и возрастает в ряду (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)пропан-2-илфосфонат < 3 -аминопропилтриметоксисилан < 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)-пропил)мочевина.

Гибридные наночастицы Co/(Si02)((C>CH3)2(CH2)3NHC(0)NHPh)n могут ^ быть использованы для разработки инновационных антисептических композиций для обработки поверхностей.

выводы

1. Оценены параметры координационных взаимодействий секреторных аспарагиновых протеиназ Cartdida albicans индуцируемого (SAP2) и конститутивного (SAP4) типов с ионами Со(П), Си(П) и Zn(II) в водном растворе. Максимальные доли накопления характерны для комплексных форм состава MH2L+, M2L+. Устойчивость идентичных комплексных форм увеличивается в ряду Zn(II) < Cu(II) < Со(Н) для формы M2L . Возрастание резистентности штамма Candida albicans для конститутивной протеиназы SAP4 приводит к образованию комплексной формы состава Zn3L .

2. При твердофазном комплексообразовании в системах [Со(П) - иммобилизованная SAP Candida albicans] с одним ионом металла координируется одна молекула иммобилизованного фермента; логарифмы констант комплексообразования для иммобилизованной SAP2 3.45±0.04 и для иммобилизованной SAP4 2.81±0.02.

3. Связывание ионов Co(II), Cu(II) и Zn(II) протеиназой SAP2 характеризуется увеличением кажущихся констант ассоциации (кд (Ш)) в ряду ионов Zn(II) < Cu(II) < Со(П). В случае протеиназы SAP4 кажущиеся константы ассоциации уменьшаются в том же ряду.

4. Синтезированы новые гибридные наночастицы Cu/(Si02)R„, Co/(Si02)R„, Zn/(Si02)Rn на платформе коллоидного диоксида кремния, модифицированного 3-аминопропил-триметоксисиланом, (0,0-диэтил)-2-(3-(три-метоксисилил)пропиламино)пропан-2-илфосфонатом, 1-фенил-3-(3-(три-метоксисилил)пропил)мочевиной. Наночастицы Си(0) стабилизируются на ядре (Si02)R„, где R = -Si(0CH3)2(CH2)3NHC(0)NHPh. Все остальные типы гибридных наночастиц содержат оксидную фазу.

5. Выявлены возможности ионов и наночастиц кобальта, меди и цинка в управлении ферментативной активностью протеиназ Candida albicans. Максимальной антипротеиназной активностью обладают ионы Со(1Г) и наночастицы Co/(Si02)Rn, где R = -Si(0CH3)2(CH2)3NHC(0)NHPh.

6. Максимальной фунгицидной активностью к культурам семейств Candida, Aspergillus, Rhodotorula, Pénicillium и Trichoderma viride обладают наночастицы Co/(Si02)R„. Активность наночастиц Co/(Si02)Rn к плесневым грибам зависит от природы модифицирующего фрагмента ядра Si02 и возрастает в ряду (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)пропан-2-илфосфонат < 3-аминопропил-триметоксисилан < 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевина. Гибридные наночастицы Co/(Si02)R„, где R = 1-фенил-3-(3-(триметоксисилил)пропил)мочевина могут быть использованы для разработки антисептических композиций для обработки поверхностей.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Кутырева М.П. Адсорбция конститутивной аспарагиновой протеиназы Candida albicans на нитроцеллюлозной мембране [Текст] / М.П. Кутырева, А.Р. Мухаметзянова, H.A. Улахович, A.A. Иванова, Н.И. Глушко // Ученые записки Казанского государственного университета. Серия Естественные науки. - 2011. - Т. 153, кн. 1. - с.111-119.

2. Мухаметзянова А.Р. Композиция на основе наночастиц диоксида кремния и Zn(II) как модулятор активности протеиназ [Текст] / А.Р. Мухаметзянова, М.П. Кутырева, О.И. Медведева, Вл.В. Горбачук, JI.C. Якимова, И.И. Стойкое, Н.АУлахович // Ученые записки Казанского государственного университета Серия Естественные науки. - 2011. -Т. 153, кн. 3.-С. 70-84.

3. Кутырева М.П. Подавление патогенной активности Candida albicans с использованием хлорида кобальта [Текст] / М.П. Кутырева, А.Р. Мухаметзянова, H.A. Улахович // Биомедицинская химия.-2012.- Т.59, №4,- С. 411-417.

4. Кутырева М.П. Комплексообразование Со(Н) с иммобилизованными протеиназами Candida albicans [Текст] / М.П. Кутырева, А.Р. Мухаметзянова, Н.А Улахович // Журнал неорганической химии.-2012.-Т. 57, №10.- С. 1420-1425.

5. Кутырева М.П. Гетеронаночестицы меди на платформе модифицированного диоксида кремния [Текст] / М.П. Кутырева, А.Р. Мухаметзянова, H.A. Улахович, Вл.В. Горбачук, JI.C. Якимова, И.И. Стоиков, О.И. Медведева, Г.А. Кутырев II Вестник Казанского технологического университета -2012. - Т. 15, №5. - С. 12-14.

6. Кутырева М.П. Силикатные наночастацы модифицированные аминными группами и цинком как прекурсоры антикандидозных препаратов [Текст] / М.П. Кутырева, AJ». Мухаметзянова, Н.АУлахович, Вл.В. Горбачук, JI.C. Якимова, И.И. Стойкое // Бутлеровские сообщения. - 2012. - Т.31, №7. - С. 65-72.

7. Улахович Н.А Сорбционное концентрирование катионов N¡(11), Co(II), Zn(II), Cd(II) на модифицированных нитроцеллюлозных мембранах [Текст] / H.A. Улахович, М.П. Кутырева, М.С. Старикова, А.Р. Мухаметзянова // Международная научная конференция «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелегий»:-Томск, Россия, 2006. - Томск, 2006. - С. 134.

8. Кутырева М.П. Неорганические соли и координационные соединения d-металлов как модуляторы каталитической активности аспарагиновых протеиназ Candida albicans [Текст] / М.П. Кутырева, H.A. Улахович, P.P. Галимзанова, А.Р. Мухаметзянова, Н.И. Глушко // VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». - Москва, Россия, 23-25 апреля 2007 - Москва, 2007. - С.124.

9. Кутырева М.П. Характеристики мультилигандных платформ для извлечения катионов металлов [Текст] / М.П. Кутырева, H.A. Улахович, М.С. Старикова, А.Р. Мухаметзянова, Г.Ш. Усманова, Г.А. Кутырев, JI.K. Вилкова, Э.П. Медянцева // II Международный форум «Аналитика и аналитики». - Воронеж, Россия, 22-26 сентября 2008. - Воронеж, 2008. - С. 240.

10. Мухаметзянова А.Р. Взаимодействие индуцируемой Секреторной аспарагиновой протеиназы Candida albicans с хлоридом кобальта(11): комплексообразование и биологическая активность [Текст] / А.Р. Мухаметзянова, М.П. Кутырева // XIX Российская молодежная научная конференция «Проблемы теоретической и экспериментальной химии». - Екатеринбург, Россия, 27-29 апреля. - Екатеринбург, 2009. -С.357.

11. Кутырева М.П. Комплексообразование кобальта (И) с секреторной аспарагиновой протеиназой Candida albicans в гомо- и гетерогенных системах [Текст] / М.П. Кутырева, H.A. Улахович, А.Р. Мухаметзянова, Н.И. Глушко, E.B. Халдеева // XXIV Международная Чугаевская конференция по координационной химии,- С. Петербург, Россия,-15-19 июня 2009,- С. Петербург, 2009 -С. 585.

12. Мухаметзянова А.Р. Супрамолекулярные координационные системы на основе каскада протеиназ Candida albicans [Текст] / А.Р. Мухаметзянова // IX Научная конференция

молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века» .- Казань, Россия.- 78 декабря.- Казань, 2009.- С. 63.

13. Кутырева М.П. Синтез и биологическая активность силикатных наночастиц модифицированных аминогруппами [Текст] / М.П. Кутырева, И.И. Стойков, А.Р. Мухаметзянова, Вл.В. Горбачук, Л.С. Якимова // XVII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем».- Йошкар-Ола, Марий Эл, 28 июня-2 июля

2010,- Йошкар-Ола, 2010. - С.119.

14. Мухаметзянова А.Р. Взаимодействие кобальта (II) с протеиназами Candida albicans в гомо- и гетерогенных средах [Текст] / А.Р. Мухаметзянова, М.П. Кутырева, Н.А Улахович // XXV Международная Чугаевская конференция по координационной химии. - Суздаль, Россия, 6-11 июня 2011. - Москва, 2011. - С.470.

15. Мухаметзянова А.Р. Комплексообразование катиона кобальта(И) с иммобилизованными протеиназами Candida albicans [Текст] / А.Р. Мухаметзянова, М.П. Кутырева, Н.А Улахович // X Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века».- Казань, Россия, 28-29 марта 2011.- Казань, 2011. - С. 71.

16. Мухаметзянова А.Р. Получение, структура и свойства гетеронаночастиц Si02Rn/Cu, SiOjRt/Co [Текст] / А.Р. Мухаметзянова, М.П. Кутырева, H.A. Улахович, Г.Э. Хафаева, И.И. Стойков, Вл.В. Горбачук, В.В. Сальников // XVIII Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем» - Йошкар-Ола, Марий Эл.- 28 июня-2 июля 2011,- Йошкар-Ола, 2011. - С.98.

17. Мухаметзянова А.Р. Металлосодержащие гетеронаночастицы, обладающие антимикотической активностью [Текст] / АР. Мухаметзянова // Всероссийский конкурс научно-исследовательских работ студентов, аспирантов и молодых ученых по нескольким междисциплинарным направлениям «Эврика 2011». - Новочеркасск, Россия, 8-11ноября

2011,- Новочеркасск, 2011. - С.74.

18. Мухаметзянова А.Р. Параметры ассоциации секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans с ионами биофильных металлов [Текст] / А.Р. Мухаметзянова, E.H. Чумышева, И.С. Берендеева, М.П. Кутырева, H.A. Улахович II XI Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета «Материалы и технологии XXI века». -Казань, Россия, 17 мая 2012 - Казань, 2012. - С. 48.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 564-77-41, 564-77-51. Лицензия ПД№7-0215от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 11.07.2013 г. Печ.л. 1,0 Заказ М К-7279. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Федеральное государственное автономное образовательное учереждение высшего профессионального образования

«КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201361370 Мухаметзянова Алсу Ринатовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ИОНОВ И НАНОЧАСТИЦ БИОФИЛЬНЫХ 3¿/-МЕТАЛЛОВ С ПРОТЕИНАЗАМИ Candida albicans

02.00.01 - неорганическая химия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата

химических наук

Научный руководитель: кандидат химических наук, доцент Кутырева М.П.

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений................................................................................................................................5

Введение..............................................................................................................................................................6

Глава 1. Литературный обзор 18

1.1. Протеиназы семейства Candida. 18

1.2. Роль ионов 3¿/-металлов в ферментативном катализе 26

1.3. Ингибиторы протеиназ Candida albicans 33

1.4. Биологическая активность наночастиц ¿/-металлов 36

1.4.1. Общие подходы к синтезу и исследованию 36 наночастиц металлов

1.4.2. Стабилизация наноразмерных частиц 3d- 40 металллов полимерными структурами

1.4.3. Биологическая активность наночастиц d- 46 металлов

1.5. Заключение 48 Глава 2. Аппаратура, объекты исследования и условия 50

эксперимента

2.1. Объекты исследования и приготовление растворов 50

2.2. Методики синтеза наночастиц кобальта, меди и 54

цинка на платформе модифицированных частиц

диоксида кремния

2.3. Аппаратура и условия эксперимента 58

2.4. Обработка результатов эксперимента 61

2.4.1 Расчет констант устойчивости и состава 61

комплексных форм в растворе (метод насыщения или сдвига равновесия)

2.4.2. Математическое моделирование и расчет 63 условных констант образования комплексных форм (IgK') по программе CPESSP

2.4.3. Определение кажущихся констант 63 ассоциации методом Скэтчарда

2.4.4. Построение изотерм сорбции Co(II) на 65 нитратцеллюлозную мембрану с закрепленной SAP Candida albicans

2.4.5. Определение протеолитической активности 66 протеиназы Candida albicans

2.4.6. Определение фунгицидной активности 67

2.4.7. Определение микотической активности в 68 присутствии «Дифлюкана»

Глава 3. Комплексообразование ионов и наночастиц кобальта, 70

меди и цинка с аспарагиновыми протеиназами Candida

albicans в гомо- и гетерогенных средах

3.1. Взаимодействие ионов биофильных металлов с 71 протеиназами Candida albicans в растворе

3.1.1. Взаимодействие ионов биофильных металлов 80 с протеиназами штамма Candida albicans с различной резистентностью к препарату «Дифлюкан» в растворе

3.1.2. Спектральные исследования 83 комплексообразования ионов биофильных металлов с SAP Candida albicans

3.2. Взаимодействие ионов биофильных металлов с 90 иммобилизованными протеиназами Candida albicans

3.2.1. Оценка параметров комплексообразования 94 Со(П) с иммобилизованными SAP2 и SAP4

3.2.2. Комплексообразование Co(II) с 99 иммобилизованными SAP С.alb. с различной резистентностью к препаратам азольного ряда

3.3. Оценка параметров ассоциации солей биофильных 101 металлов с аспарагиновыми протеиназами Candida albicans

3.3.1. Определение кажущихся констант 104 ассоциации солей биофильных металлов с SAP2 и SAP4 в растворе

3.3.2. Оценка параметров ассоциации солей 111 биофильных металлов с иммобилизованными протеиназами С. alb.

3.4. Синтез и свойства гибридных наночастиц кобальта, 115 меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV)

3.4.1. Синтез гибридных наночастиц кобальта, 118 меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV)

3.4.2. Оптические свойства гибридных наночастиц 123 кобальта, меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV)

3.4.3. Термическая устойчивость гибридных 127 наночастиц кобальта, меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV)

3.4.4. Исследование растворов гибридных 131 наночастиц кобальта, меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV) методом динамического светорассеяния

3.4.5. Морфология поверхности гибридных 132 наночастиц кобальта, меди и цинка, стабилизированных коллоидным оксидом кремния (IV)

Глава 4. Биологическая активность ионов и наночастиц 139 кобальта, меди и цинка по отношению к аспарагиновым протеиназам Candida albicans

4.1. Влияние ионов Co(II), Cu(II) и Zn(II) на 140 каталитическую активность индуцируемых секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans

4.1.1. Влияние иона Co(II) на каталитическую 143 активность иммобилизованных SAP3 С. alb.

4.2. Влияние гибридных наночастиц кобальта, меди и 144 цинка на каталитическую активность секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans

4.3. Кинетические параметры ферментативного 147 протеолиза гемоглобина в присутствии ионов металлов и наночастиц

4.4. Влияние ионов id-металлов на параметры 151 адсорбции протеиназ и бластоспор Candida albicans

на нитратцеллюлозной мембране

4.4.1. Адгезия клеток Candida albicans на 155 нитратцеллюлозной мембране

4.5. Оценка фунгицидной активности гибридных 158 наночастиц на основе диоксида кремния, покрытых оболочкой переходных металлов (Со, Си, Zn) по отношению к дрожжевым грибам семейства Candida

и к плесневым грибам Aspergillus, Pénicillium, Rhodotorula и Trichoderma

Выводы................................................................................ 162

Список литературы................................................................. 164

Приложение.......................................................................... 188

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Гп - константа твердофазного комплексообразования М - модулятор

НРЧ - наноразмерные частицы

НЦ - нитрат целлюлозы

НЦМ - нитратцеллюлозная мембрана

111 LP - поверхностный плазмонный резонанс

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

РФА - рентгенофазовый анализ

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ЭСП - электронные спектры поглощения

Asap с.aib. - активность секреторной аспарагиновой протеиназы Candida albicans

а - доля накопления комплексной формы С. alb. — Candida albicans Hb - гемоглобин

kA - кажущаяся константа ассоциации

IgK' - логарифм условной константы образования комплексной формы т - количество идентичных центров связывания

п - число координированных с одним ионом металла молекул фермента SAP С.alb. - секреторная аспарагиновая протеиназа Candida albicans SAP 2 С. alb. - секреторная аспарагиновая протеинза Candida albicans индуцируемого типа

SAP4 С. alb. - секреторная аспарагиновая протеинза Candida albicans конститутивного типа

SAP4(1) - секреторная аспарагиновая протеиназа конститутивного типа штамма, чувствительного к антимикотическому препарату «Дифлюкан» SAP4(2) - секреторная аспарагиновая протеиназа конститутивного типа штамма, резистентного к антимикотическому препарату «Дифлюкан» SAP2S - иммобилизованная секреторная аспарагиновая протеиназа Candida albicans индуцируемого типа

SAP4S - иммобилизованная секреторная аспарагиновая протеиназа Candida albicans конститутивного типа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Роль ионов биофильных Зб/-металлов непосредственно связана с регуляцией ферментативных процессов. При этом основу протекающих взаимодействий составляют процессы комплексообразования ионов металлов с ферментами как макромолекулярными биолигандами. Одним из возможных донорных центров в макромолекулярном биолиганде является пептидная связь. Однако, ее плоская геометрия, транс-ориентация фрагментов и делокализация заряда снижают ее комплексообразующую активность. В этом случае повышается роль боковых радикалов аминокислотных остатков. При этом следует учесть, что третичная структура биомолекул способствует сближению в пространстве ряда функциональных групп с последующим формированием потенциальных донорных областей. Поскольку комплексообразование происходит в полости макромолекулы, где условия значительно отличаются от водной среды, то исследование в модельных системах не позволяет получить реальную информацию о процессах комплексообразования ионов биогенных металлов с биомолекулами, в частности с ферментами. Разработка и совершенствование методов и подходов к исследованию комплексообразования ферментов с ионами металлов имеет высокое теоретическое значение и позволяет обеспечить эффективное практическое применение биологически функциональных металлокомплексов.

В медицине, фармации, экологическом и аналитическом мониторинге в настоящее время широко применяются ферменты в иммобилизованном состоянии. Многочисленные металлоферменты, закрепленные на биополимерах, и их металлокомплексы, катализируют разнообразные биохимические реакции, обеспечивающие жизнедеятельность организмов. Кроме того, связывание с носителем часто повышает термическую устойчивость фермента. Протекающие на поверхности твердого тела или полимерной матрицы процессы носят более сложный характер, зависят от способа закрепления биолиганда на матрице, количества и пространственной

доступности донорных фрагментов. Их описание значительно отличается от интерпретации равновесий комплексообразования в гомогенной среде и требует разработки модели гетерогенного комплексообразования в каждом конкретном случае, так как общие подходы к исследованию координационных свойств иммобилизованных ферментов практически отсутствуют.

Одним из факторов, определяющих патогенность наиболее распространенных и опасных грибковых культур, является активность их протеолитических ферментов. Наибольший интерес в плане корреляции протеиназной активности и патогенности представляет культура Candida albicans {С.alb.), которая продуцирует систему из 10 изоферментов. Секреторные аспарагиновые протеиназы Candida albicans обладают широкой субстратной специфичностью и возможностью мутировать под влиянием внешних факторов, в том числе при действии большинства антимикотических препаратов. Микозы Candida являются ВИЧ ассоциированными. При этом вирус иммунодефицита человека обладает аналогичной системой из 10 аспарагиновых протеиназ. Поэтому протеиназы Candida albicans часто используются в качестве модельной системы при исследовании патогенной активности и испытании новых фармацевтических препаратов.

Среди протеиназ С.alb. наибольший интерес представляют два типа протеиназ Candida, взаимосвязанных друг с другом: индуцируемая протеиназа SAP2, проявляющая антигенные свойства, и конститутивная протеиназа SAP4, обладающая преимущественно сорбционными функциями и являющаяся необходимой для последующей секреции и функционирования протеиназ первой группы. Протеиназы SAP 2 и SAP4 являются одними из доминирующих в системе аспарагиновых протеиназ С.alb. и определяют локализацию и тяжесть кандидаинфекции. Выявление путей управления активностью протеиназ С.alb. является актуальной и значимой задачей, решение которой приведет к созданию высокоэффективных

антимикотических препаратов с новым механизмом действия. Эти исследования являются особенно перспективными в связи с возрастанием резистентности штаммов грибковых культур к современным антимикотическим препаратам, что на сегодняшний день представляет одну из важнейших проблем терапии микозов.

Особый интерес при исследовании ферментативных процессов представляет взаимодействие ферментов с их субстратами и молекулами-модуляторами, в результате которых изменяется ферментативная активность. Наряду с общими положениями, применимыми к любой равновесной системе, в биосистемах существует ряд особенностей, таких как взаимодействие связывающих центров и кооперативность, взаимоотношения между двумя различными модуляторами при связывании с одной макромолекулой. Оценка способов связывания модуляторов с макромолекулами позволит понять физиологические процессы и найти способы их регулирования.

При этом в литературе описано действие на протеиназы С.а1Ъ. только природных ингибиторов пепстатина А и ацетилпепстатина и их синтетических аналогов. Влияние ионов металлов, традиционно использующихся для управления ферментативной активностью, практически не рассматривалось.

В развитии современных эффективных способов терапии заболеваний и лекарственных препаратов нового поколения активно используются возможности нанотехнологий. В этом направлении явно обозначен значительный потенциал наночастиц металлов. Перспективы использования наночастиц в качестве лекарственных препаратов обусловлены их малыми размерами, благодаря которым они беспрепятственно проникают и перемещаются внутри живых организмов путем эндоцитоза, а также развитой поверхностью с возможностью образования нанокомпозита и способностью направленно концентрироваться в организме. Наряду с

высокой биосовместимостью, наночастицы металлов обычно менее токсичны по сравнению с ионами металлов.

При этом одной из важнейших проблем является синтез достаточно стабильных наночастиц заданного размера, в течение длительного времени сохраняющих высокую химическую или биологическую активность. Поэтому при разработке методов синтеза наночастиц большое внимание уделяется повышению их стабильности. Особый интерес представляют устойчивые гибридные материалы, полученные на основе наночастиц типа ядро-оболочка, состоящих из тонкой оболочки металла, закрепленного на поверхности коллоидных частиц неорганических оксидов. Получение гибридных наночастиц заданного размера, формы и структуры основано на управлении процессом образования наночастиц в синтезе. Значительную сложность также представляет обеспечение воспроизводимости процесса синтеза изолированных наночастиц и предотвращение реакций агломерации гибридных наночастиц в растворе.

Таким образом, целенаправленный поиск и синтез нетоксичных неорганических соединений на основе биофильных металлов - эффекторов протеолитических ферментов грибковых культур, исследование сложных взаимодействий ферментов с неорганическими ионами и наночастицами, анализ и обобщение полученной информации, установление закономерностей и выявление особенностей данных процессов являются актуальными задачами координационной и неорганической химии.

Целью работы является выявление закономерностей взаимодействия ионов и наночастиц 3 ¿/-металлов (кобальта, меди и цинка) с протеиназами Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов, а также разработка подходов к управлению ферментативной активностью протеиназ Candida и патогенностью грибковых культур.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: • исследовать взаимодействие секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов с катионами

Co(II), Cu(II) и Zn(II) в водном растворе методами ИК-, УФ - Вид. спектроскопии и вольтамперометрии с оценкой параметров комплексообразования (логарифмов условных констант образования, состава и долей накопления комплексных форм) и ассоциации (кажущихся констант ассоциации и количества участков и идентичных центров связывания) в системе [металл(И) - фермент]; оценить параметры твердофазного комплексообразования иммобилизованных аспарагиновых протеиназ Candida albicans индуцируемого и конститутивного типов с некоторыми катионами 3d-металлов;

разработать методы синтеза гибридных наночастиц кобальта, меди и цинка, стабилизированных на платформе коллоидного оксида кремния (IV), модифицированного органическими фрагментами, охарактеризовать их морфологию и термическую устойчивость;

оценить биохимическую активность ионов и гибридных наночастиц кобальта, меди и цинка по отношению к секреторным аспарагиновым протеиназам Candida albicans;

определить фунгицидную активность гибридных наночастиц кобальта, меди и цинка к культурам рода Candida и плесневым культурам Aspergillus, Pénicillium, Rhodotorula и Trichoderma.

Научная новизна. На основании данных УФ-спектрофотометрии с использованием метода математического моделирования впервые определены параметры комплексообразования и ассоциации в системах [М(П)-&4Р2] и [М(П)-&4Р4], где М = Co(II), Cu(II), Zn(II), SAP2 -индуцируемая, SAP 4 - конститутивная протеиназы Candida albicans. Выявлены закономерности влияния природы иона металла и типа протеиназы Candida albicans на состав комплексных форм, константы образования комплексных форм, кажущиеся константы ассоциации.

Впервые для секреторных аспарагиновых протеиназ Candida albicans SAP2 и SAP4 предложен подход к оценке процессов комплексообразования в системах М(П) - иммобилизованный фермент. Определены константы твердофазного комплексообразования Гп, состав образующихся твердофазных металлокомплексов. Выявлена корреляция параметров твердофазного комплексообразования с закономерностями

комплексообразования SAP2 С.alb. с ионами металлов в растворах.

Разработаны методики синтеза и синтезированы новые гибридные наночастицы на платформе стабилизирующего коллоидного диоксида кремния, модифицированного органическими фрагментами Cu/(Si02)Rn, Co/(Si02)Rn, Zn/(Si02)Rn, где R = 3-аминопропилтриметоксисилан, (0,0-диэтил)-2-(3-(триметоксисилил)пропиламино)пропан-2-илфосфонат, 1 -фенил-3 -(3 -(триметоксисилил)пропил)мочевина. Методами

рентгенофазового анализа, УФ-спектрофотометрии, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии определены состав, морфология и размер синтезированных наночастиц.