Новые хромофорные субстраты аспартильных протеиназ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

ХРОМОГЕННЫЕ И ФЛУОРОГЕННЫЕ СУБСТРАТЫ АСНАРТИЛЬНЫХ ПРОТЕИНАЗ.

1.1. Методы определения активности аспартильных протеиназ с использованием спектров поглощения.

1.2. Методы определения активности аспартильных протеиназ с использованием спектров флуоресценции.

Аспартильные протеиназы образуют большую группу ферментов, активных, как правило, в кислой среде. Они имеют большое промышленное значение и традиционно используются в производстве сыра, сои и какао. В последние двадцать лет интерес к аспартильным протеиназам возрос вследствие появления новых направлений, в частности, в индустрии создания новых лекарственных препаратов для терапии гипертонии, сердечной недостаточности, рака, грибковых заболеваний, а также противовирусных препаратов, используемых в клинике для лечения СПИДа. В связи с этим возрос интерес и к методам, позволяющим быстро оценить активность ферментов этого класса.

В литературе описаны разнообразные методы контроля активности аспартильных протеиназ с использованием флуорогенных субстратов. Их важным достоинством является высокая чувствительность определения по сравнению со спектрофотометрическими методами. Однако, высокие требования спектрофлуорометрического метода к чистоте используемых реагентов, а также необходимость дорогостоящего оборудования ограничивают область его применения в решении ряда практических и исследовательских задач.

На сегодняшний день нет удобной методики, позволяющей быстро и объективно оценивать активность аспартильных протеиназ по расщеплению хромофорных субстратов. Даже наилучшие из субстратов, содержащие в качестве хромофора остаток п-нитрофенилаланина, не обеспечивают достаточной чувствительности метода из-за малого различия в спектрах поглощения субстрата и продуктов его расщепления.

Проблема отсутствия удобных субстратов особенно ощущается в производственных условиях. Например, протеолитическая активность химозина -аспартильной протеиназы, используемой в сыроделии - чаще всего оценивается по его молокоствораживающей способности. Недостатки данной оценки активности заключаются в том, что метод не прямой, и фактически оценивается не сам процесс расщепления, а последующие события - коагуляция образовавшихся пептидных фрагментов. Показатель зависит от процесса створаживания и варьируется в зависимости от качества субстрата, т.е. молока. Наблюдение за скоростью створаживания осуществляется визуально, и в настоящее время автоматизировать процесс контроля не представляется возможным.

Таким образом, возникает необходимость в создании новых удобных хромофорных субстратов, в разработке на основе их применения объективной методики определения активности химозина, пепсина и, возможно, других аспартильных протеиназ.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. ХРОМОГЕННЫЕ И ФЛУОРОГЕННЫЕ СУБСТРАТЫ АСПАРТИЛЬНЫХ ПРОТЕИНАЗ.

Хромогенные и флуорогенные субстраты в течение многих лет широко используются в биологических исследованиях для изучения гидролаз - ферментов, расщепляющих белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды, липиды и др. Большинство исследований, проведенных с применением хромогенных субстратов, было посвящено изучению именно протеолитических ферментов. Стимулом для бурного развития соответствующих исследований явились доступность хромогенных субстратов, высокая чувствительность методов с их использованием, а также возможность применения недорогого оборудования - обычных спектрофотометров и фотоэлектрокалориметров - для процесса контроля ферментативного гидролиза. Внедрение высокоселективных пептидных хромогенных субстратов позволило эффективно изучать отдельные ферменты в смесях с другими протеиназами, что привело к созданию эффективных методов диагностики различных заболеваний.

Так как наряду с рентгеносгрукггурным анализом субстратный анализ является мощным орудием изучения тонкого строения активных центров ферментов, хромогенные субстраты приобретают всё большее значение в энзимологии и других смежных областях биологии, где применяются ферменты. Они, в частности, используются для изучения природы субстратной специфичности ферментов и определения их активности, исследования механизмов катализа, выяснения деталей действия разнообразных ингибиторов и т.д.

Прежде чем перейти к рассмотрению синтетических субстратов аспартильных протеиназ кратко рассмотрим историю открытия и некоторые этапы изучения ферментов этого класса.

Изучение аспартильных протеиназ имеет интересную и разнообразную историю. Она начиналась с исследования желудочного сока у людей, где присутствие пепсина было отмечено ещё в начале 19 века. А в 1875 году аналогичную «желудочную» активность Дарвин неожиданно обнаружил в соке растения [1].

Гипотеза о гомологии двух ферментов, выдвинутая Дарвином, основывалась на сомнительных доказательствах, но была абсолютно верной. И сегодня известно, что аспартильные протеиназы это не только «пищеварительные» ферменты, но они также участвуют в регуляции многих клеточных процессов.

Семейство пепсина, как группа кислых протеиназ, активных при рН 1-5, первым привлекло внимание биохимиков. В 1934 году были получены кристаллы пепсина [2]. А применение рентгеноструктурного анализа для изучения и характеристики белков открыло возможность более глубокого понимания структуры белков по сравнению со всеми предшествующими химическими и физическими методами. Первыми аспартильными протеиназами, у которых впоследствии была изучена трёхмерная структура, были пепсин [3] и химозин [4] из млекопитающих, затем эндотиапепсин [5], пенициллопепсин [6], ризопуспепсин [7], мукорпепсин [8] и кандидапепсин [9] - аспартильные протеиназы из грибов. Позднее были рассчитаны трёхмерные структуры для ренина человека [10] и катепсина Б [11], для протеиназы А из вакуолей дрожжей [12], участвующей в протеолитическом созревании других ферментов, а также для плазмепсина из малярийных комаров [13].

Аспартильные протеиназы окончательно были объединены в одну группу, когда Танг с сотр. в 1973 году определили аминокислотную последовательность пепсина [14]. Как было показано, участки этой последовательности консервативны относительно фрагментов последовательностей, определённых ранее для других ферментов - химозина [15] и пенициллопепсина [16]. Таким образом, было подтверждено существование гомологичного семейства аспартильных протеиназ. Несколько позже было доказано и удивительное сходство между аминокислотными последовательностями двух фрагментов 30-40° и 213-225, образующих активный центр аспартильных протеиназ, а также наличие в этих участках двух остатков аспарагиновой кислоты - Аэр32 и Авр215, характерных для всех аспартильных протеиназ [17].

Следующим этапом изучения аспартильных протеиназ стало исследование их субстратной специфичности.

В общем случае специфичность протеиназ устанавливают, анализируя а - Здесь и далее нумерация даётся по аминокислотной последовательности пепсина свиньи структуру фрагментов, образованных при гидролизе природных субстратов - белков. Однако гораздо удобнее для этих целей использовать набор синтетических субстратов, способных расщепляться исследуемыми ферментами. Таким образом, возникает проблема определения количества образующихся в процессе гидролиза продуктов. Все существующие методы сводятся к контролю изменений физико-химических свойств реакционной смеси в процессе гидролиза: величины рН, электропроводности, спектров поглощения в видимой или УФ-области, спектров флуоресценции и т.д. Наиболее простыми и эффективными оказались спектральные методы, которые получили широкое распространение.

Синтез пептидных хромогенных субстратов начался в 70-е годы и интенсивно продолжается в настоящее время. Для конструирования субстратов существует лишь несколько общих принципов. При создании субстратов протеолитических ферментов в первую очередь принимают во внимание первичную специфичность протеаз, т.е. их способность расщеплять пептидные связи, образованные лишь определёнными аминокислотными остатками. Однако, специфический субстрат фермента должен быть построен с учетом структуры не только аминокислот, локализованных в подцентрах Pi-Pi', но и аминокислот вторичной контактной зоны. Использование пептидных субстратов, соответствующих высокой вторичной специфичности позволяет изучать отдельные энзимы в смеси с другими родственными ферментами. Как отмечали Хасби и Смит [18], вторичные контактные зоны необходимы для правильной укладки полипептидного субстрата в активном центре фермента. Концепция протяжённости связывающего участка предполагает, что у протеиназ (например, у пепсина, химозина и др.) его длина соответствует шести-семи аминокислотным остаткам субстрата, причем, место разрыва пептидной цепи локализовано среди тех семи остатков, которые могут связаться с ферментом в активном центре. Изучение природы аминокислот, определяющих вторичную специфичность ферментов, имеет не только большое теоретическое значение, но и практическое, например, для конструирования синтетических ингибиторов ферментов.

На способность субстратов расщепляться ферментами может влиять не только аминокислотная последовательность, но и природа ацильных группировок, обычно применяемых для блокирования концевых аминогрупп. Иногда их вводят с целью изменения некоторых физико-химических свойств субстратов: гидрофобности, растворимости, заряда и др.

Субстраты аспартильных протеиназ представляют интерес, поскольку в них связь, подвергающаяся атаке, является истинной пептидной связью. Пепсин и родственные ему ферменты расщепляют в пептидах и белках связи, образованные остатками преимущественно гидрофобных аминокислот, и не обладают практически ни эстеразной, ни амидазной активностью. Это не позволяет использовать для прямого измерения их ферментативной активности такие хромогенные субстраты, как, например, п-нитроанилиды. Отдельные наблюдения, относящиеся к гидролизу сложноэфирных связей [19, 20] между природными гидрофобными аминокислотами и оксикислотами (например, ^-фенилмолочной кислотой) также не создают предпосылок для получения удобных хромогенных субстратов.

Ы. Методы определения активности аспартильных протеиназ с использованием спектров поглощения.

Спектрофотометрические методы основаны на том, что величина поглощения веществом проходящего света данной длины волны пропорциональна концентрации поглощающего вещества (закон Ламберта-Бера). Чувствительность метода зависит от молярного коэффициента поглощения соединений. Метод не пригоден для исследования мутных растворов, рассеивающих свет.

В 1967 году Фрутон и сотр. предложили использовать в качестве субстрата пепсина г-Ш-РЬе(Ш2)*Р11е-ОМер [21]. Этот пептид при рН 2-5 имеет максимум поглощения при 278.5 нм (£=9590 М^см"1). Гидролиз субстрата ферментом при рН 4.0 проходит по связи РЬе(И02)-РЬе и сопровождается батохромным сдвигом (сдвигом максимума поглощения в длинноволновую область). Наибольшее различие в спектрах поглощения субстрата и отщепляемого продукта наблюдается при 310 нм и составляет 800 М^см"1.

Таким образом, использование соединения, содержащего остаток РЬе^Ог) в - Здесь и далее знаком «*» обозначена расщепляемая при гидролизе связь. положении Pj субстрата, позволило предложить удобный спектрофотометрический метод измерения кинетики пепсинового гидролиза. Следует, однако, подчеркнуть, что изменение коэффициента молярной экстинкции Л£, = 800 МГ'см"1 незначительно, поэтому чувствительность метода с использованием в качестве хромофора п-нитрофенилаланина невысока. Кроме того, при всех измерениях, проводимых при рН выше 3, необходимо учитывать протонирование карбоксильной группы, поскольку величина батохромного сдвига зависит от степени ионизации образующегося в ходе гидролиза а-карбоксилатного иона (рКа = 3.3) [22].

Тем не менее, субстраты, содержащие остаток Phe(N02) в положении Pi, нашли широкое применение для решения различных задач, так как с их помощью можно было спектрофотометрически контролировать ход ферментативного гидролиза, не нарушая его специфичности. Субстраты, содержащие остаток п-нитрофенилаланина, были использованы прежде всего для изучения субстратной специфичности аспартильных протеиназ. Эти субстраты представляли собой олигопептиды общей формулы: A-Phe(NC>2)*Phe-B, где А = Gly-Gly, Gly-Gly-Gly; В = ОМе [23] или А = Phe-Gly, Phe-His, Z-His, Phe-Gly-Gly, Phe-Gly-His, Phe-Gly-Gly-His; В = ОМе, Gly-OMe, His-OMe, Ala, Ala-OMe, Ala-Ala, Ala-Ala-OMe [24-26]. Кинетические константы гидролиза субстратов по связи Phe(N02)-Phe определяли при рН 4.0, считая, что при 310 нм = 800 М"1см"1. Однако, было установлено, что при концентрации субстрата от 0.5 мМ до 1.5 мМ измерения должны проводиться при 326 нм [24].

Ирвин, Блумсом и Элморе использовали пептиды, содержащие последовательность Phe(N02)-Trp и Phe(N02)-Phe, для изучения специфичности свиного пепсина и катепсина D из печени кур [27]. Отличительной чертой этих субстратов являлось наличие С-концевых гидрофильных групп, повышающих растворимость пептидов в воде, например 2-гидроксиэтиламидной - NH-CH2-CH2-OH. Измерения проводились при рН 4.0. Для субстратов, содержащих последовательность Phe(N02)-Phe, А£3ю= 737 М^см"1, для субстратов с последовательностью Phe(N02)-Trp Д£зю= 620-680 М-'см'1.

Пол и сотр. предложили использовать Glp-His-Phe(N02)*Phe-Ala-Leu-NH2 и Gly-Gly-His-Phe(N02)*Phe-Ala-Leu-NH2 в качестве водорастворимых хромогенных субстратов для определения активности аспартильных протеиназ животного происхождения (куриного пепсина, пепсина А собаки, бычьего катепсина D) в присутствии их зимогенов [28]. Кинетические константы гидролиза пептидов по связи Phe(N02)-Phe измеряли по разности поглощения субстратов и продуктов их расщепления при 308 нм. Значения А^зов для обоих субстратов при рН 4.0, 5.0 и 5.5 составляют соответственно 730, 860 и 900 М^см"1.

Для изучения субстратной специфичности катепсина D была синтезирована серия пептидов общей формулы A-Phe(N02)*Phe~Val-Leu-B, где А = Phe-Ala-Ala, Phe-Gly-Gly, В = OMe или ОМ4Р (4-пиридил-метиловый эфир) [29]. Эти субстраты являются аналогами предложенного ранее Ферпоссоном субстрата для катепсина D — Phe-Ala-His-Phe(N02)*Phe-Val-Leu-0Me (Км = 0.09 мМ, кках = 0.87 с"1) [26], но имеют лучшие кинетические характеристики (Км = 7.1 мкМ, k^ = 29 с"1).

В 1973 году Раймондом и соавт. в качестве хромогенного субстрата химозина был предложен гексапептид Leu-Ser-Phe(NO2)*Nle-Ala-Ile-0Me [30]. Аминокислотная последовательность субстрата была аналогична участку первичной структуры к-казеина в районе чувствительной к гидролизу химозином связи Pheios-Met^. При рН 4.7 субстрат расщепляется между остатками Phe(N02)-Nle. Гидролиз сопровождается батохромным сдвигом за счёт образования Leu-Ser-Phe(N02)-C00-, причём, как и в предыдущих случаях наибольшее значение А£, = 900 М^см"1 было зафиксировано при 310 нм.

Представленный выше субстрат использовался для изучения специфичности химозина [31], при выделении и очистке бычьего гастриксина [32], а также при исследовании свойств аспартильной протеиназы из энтероцитов тонкого кишечника свиньи, сходной с катепсином D [33]. С помощью Leu-Ser-Phe(N02)*Nle-Ala-Leu-0Me проводили сравнительное изучение каталитических свойств аспартильных протеиназ различного происхождения - химозина, пепсина свиньи и быка [34], пепсина А быка [35], протеиназ из Mucor miehei и Mucor pusillus [36]. В работе Мартина П. [35] исследовалось влияние рН на разницу между спектрами поглощения Leu-Ser-Phe(N02) и Leu-Ser-Phe(N02)*Nle-Ala-Leu-0Me (рис. 1). Представленный рисунок демонстрирует, что в интервале рН от 1.0 до 2.5 имеет место незначительный гипохромный эффект, так как разница между спектрами поглощения три- и гекса

11.4

Рис. 1. Влияние рН на разницу между УФ-спекграми Н-Ьеи-8ег-РЬе(ТЧ02)-0Н и Н-Ьеи-8ег-РЬе(К02)-Ме-А1а-Ьеи-0Ме. пептида отрицательная в пределах 260-350 нм и имеет минимум при 260-295 нм в зависимости от рН. При рН 2.5 возникает батохромный сдвиг, и разница между спектрами поглощения становится положительной, достигая максимума около 307310 нм, величина которого возрастает с увеличением рН.

В литературе последних лет также встречаются примеры использования данного субстрата. Например, для определения протеолитической активности аспартильной протеиназы из Мисог ЪасИЩогтга [37], которая обладает молокоствораживающей активностью и рассматривается как потенциальный заменитель химозина в сыроделии. Гидролиз Ьеи-8ег-РЬе(Ы02)*Ме-А1а-Ьеи-0Ме этой протеиназой характеризуется следующими значениями протеолитических констант: Км = 16 мкМ, ккат = 3.8 с \ ккаЖм = 239 мМ^с \

Протеиназы ретровирусов продолжительное время являются объектом интенсивных исследований, так как они, в частности, препятствуют проведению терапии такого заболевания как синдром иммунодефицита человека. Найшид и соавт. описали первый хромогенный субстрат ШУ-1 протеиназы, содержащий Р11е(>Ю2) в положении Р! [38]. Пептид Ас-Ьу8-А1а-8ег-01п-А$п-РЬе(М02)*Рго-Уа1-Уа1-Ш2 специфично и эффективно расщепляется ферментом по связи РЬе(Ж)2)-Рго, что приводит к сдвигу А^х поглощения от 279 до 282 нм. Значение К„, как было оценено, превышает 450 мкМ.

В 1982 году Хофман и Ходжес [39] обнаружили, что чувствительность спекторофотометрического определения можно повысить, если остаток п-нитрофенилаланина ввести в положение Рг1 субстрата. Ими был синтезирован Ас-А1а-А1а-Ьу8*РЬе(К02)-А1а-А1а-ЫН2. Аспартильные протеиназы: пенициллопепсин, ризопуспепсин и эндотиапепсин - с высокой скоростью расщепляют этот пептид по связи Ьув-РЬе^Ог). Химозин телёнка и ренин из почек человека также гидролизуют этот субстрат, но со скоростью в 10000 раз меньшей, чем пенициллопепсин. Максимум поглощения Ас-А1а-А1а-Ьуз*РЬе(КОг)-А1а-А1а-№Н2 наблюдается при 277 нм (£=10970 М^см"1). Гидролиз субстрата при рН 4.5 сопровождается незначительным сдвигом максимума поглощения до 272 нм за счёт протонирования аминогруппы остатка п-нитрофенилаланина в отщепившемся продукте - КНз+-РЬе(Ж)2)-А1а-А1а-ЫН2. При этом максимальное изменение коэффициента молярной экстинкции АЕ, = 1800 М^см"1 более чем в два раза превышает изменение этой характеристики, когда остаток п-нитрофенилаланина находится в положении Рь Поскольку рКа а-аминогруппы этого пептида равняется 6.65, то в диапазоне рН 1-5 определение активности не зависит от рН.

Преимущества, которые дало введение остатка п-нитрофенилаланина в положение Рх' расщепляемой связи, были использованы при создании "универсального" хромогенного субстрата аспартильных протеиназ, отличающихся по специфичности от микробных. В работе [40] описан гептапептидный субстрат Pro-Thr-Glu-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu, аминокислотная последовательность которого была выбрана после тщательного анализа частоты встречаемости той или иной аминокислоты в каждом из семи положений (от Р4 до Рз'), соответствующих области активного центра аспартильных протеиназ.

Субстрат оказался хорошо растворимым в водных буферах (до 10 мМ) в диапазоне рН 2-7. Его расщепление пепсином и другими аспартильными протеиназами проходит однозначно по связи между гидрофобными остатками фенилаланина и п-нитрофенилаланина. Изменение молярного коэффициента экстинкции максимально при 310 нм и составляет 1700-2000 М^см"1 в диапазоне рН от 2 до 5. Кинетические характеристики гидролиза этого субстрата свиным пепсином при рН 3.0 и 37 °С: Км = 0.13 мМ, ккат = 130 с"1, WK* = 726 mMV.

С помощью синтезированного субстрата удалось определить кинетические константы гидролиза для нескольких аспартильных протеиназ из различных источников (табл. 1) [41-43].

Приведём также данные, полученные при гидролизе некоторыми аспартильными протеиназами другого пептида Lys-Pro-ne-Glu-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu (табл. 2) [42].

Использование представленных выше "универсальных" субстратов сделало возможным проведение систематического сравнительного анализа аспартильных протеиназ, хотя очевидно, что кинетические константы гидролиза "универсального" субстрата будут ниже характеристик субстрата, специфичного для определённой протеиназы.

Посредством кинетического анализа серии субстратов общей формулы Lys-Pro-Xaa-Yaa-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu проводилось сравнение специфичности S3- и S2-подцентров связывания таких аспартильных протеиназ как свиной пепсин, химозин телёнка и аспартильной протеиназы из Endotia parasitica [44], катепсина D человека [45], а также изоферментов пепсина человека [46].

Субстраты на основе A-Phe*Phe(N02)-B широко используются для выявления субстратной специфичности ферментов и влияния на связывание аминокислот субстрата, соответствующих вторичной контактной зоне активного центра

Таблица 1.

Кинетические константы гидролиза Pro-Thr-Glu-Phe-Phe(N02)-Arg-Leu некоторыми аспартильными протеиназами. (pH 3.1, 0.1 М формиатный буфер, 37 °С) [41-43].

Фермент Км, мкМ кот, с1 mkNTV1 Цитируемая литература

Свиной пепсин 77 90 1.17 [41]

80 89 1.11 [42]

Свиной гастриксин 95 100 54 55 0.568 0.55 [41] [42]

98 55 0.561 Г43]

Бычий химозин 200 38 0.19 [41]

460 51 0.11 Г42, 43]

Бычий катепсин D 240 60 0.250 [41]

240 59 0.245 Г42, 43]

Куриный пепсин 91 110 17 17 0.184 0.155 [41] Г42]

Пепсин человека 170 72 0.425 [42]

Гастриксин человека 370 2000 23 9 0.062 0.004 [41] [42]

Катепсин D человека 550 173 0.315 [42]

Протеиназа из Mucor miehei 96 11 0.115 [431

Протеиназа из Mucor pusillus 63 16 0.254 [43]

Протеиназа из Endothia parasitica 3 12 4 [43]

Протеиназа из Rhizopus chinensis 8 1 0.125 [43]

Таблица 2.

Кинетические константы гидролиза Lys-Pro-Ile-Glu-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu некоторыми аспартильными протеиназами (pH 3.1, 0.1 М формиатный буфер, 37 °С) [42].

Фермент Км, мкМ ккаи с1 ккат/км, mkNT'c1

Свиной пепсин 50 106 2.120

Гастриксин человека 560 8 0.014

Катепсин D человека 640 124 0.195

Бычий химозин 360 190 0.530

Протеиназа А из дрожжей 290 54 0.185

Протеиназа из Mucor pusillus 43 19 0.440

Протеиназа из Rhisopus chinensis 1 3 3.0

Протеиназа из Endothia parasitica 3 16 5.330 аспартильных протеиназ. Например, Pi'-Phe(N02)-coдержащие пептиды применялись для изучения специфичности ризопуспепсина (протеиназы из гриба Rhizopus chinensis) [46], катепсина Е человека [47, 48], а также при исследовании свойств катепсина D коры головного мозга быка [49] и печени антарктической рыбы Chiotiodraco hamaíus, продемонстрировавшего необычную активность и стабильность при высоких температурах [50].

Исследование гидролиза Ac-AlaM-Lys*Phe(N02)-Alae-NH2 (m, п варьируются от 1 до 4) эндотиапепсином и ризопуспепсином при pH 5.5 (25 °С) и Ac-AlaM-Phe-Phe(N02)-Arg„-Alan-NH2 (m = 0, 1, 2; п = 0, 1) пепсином при pH 3.5 (25 °С) показало, что удлинение пептидной цепи субстрата (т.е. вторичные взаимодействия аминокислотных остатков, удалённых от расщепляемой связи) могут значительно влиять на величину ккат без существенных изменений Км [51]. Эти данные согласуются с ранними работами по исследованию субстратной специфичности пепсина [52] и свидетельствуют о том, что активный центр аспартильных протеиназ имеет протяжённый характер.

Масштабный сравнительный анализ субстратной специфичности аспартильных протеиназ из различных источников провели Данн и сотр. [53]. Первоначально на основании окталептида Lys-Pro-Ala-Lys-Phe*Phe(N(>2)-Arg-Leu была синтезирована серия пептидов с систематическими заменами аминокислот в каждом из Р2-Р5, Рг- и Рз- положений. Влияние замен на эффективность гидролиза субстратов авторы представляли в виде графиков.

Например, для пепсина (рис. 2) исходный пептид является прекрасным субстратом с высоким значением кит/К»,. Единственный субстрат, содержащий Leu в Р2'-положении, имеет превосходящую характеристику. Другие субстраты также показали хорошие кинетические свойства: Leu в положении Р5, Ala в Рг, в этих положениях также возможны другие замены. Но очевидно, что, например, Pro в Р4 и Leu в Рз' лучше любой другой замены в этих положениях.

Для сравнения, катепсин Е (рис. 3) обладает более высокой селективностью. Только пептиды, в которых проводились замены в положении Рг, показали легко детектируемую скорость расщепления. Максимальное значение киДм наблюдалось для пептида, содержащего Leu в Р2-положении.

Ьу$-Рго-А1а-Ьу«-РЬе*КрЬ-Аг5-Ьеи Р5 Р4 Рз Р2 Р2' Рз'

0.8---------

0.6

0.4 -0.2 0 пепсин Ь I и и

А в I. й 11 Ав LDR А8 Юй А Эй

Р5 Р4 РЗ Р2

АЭЬОЯ Ав ЮР

Р2' РЗ'

Рис. 2. Величины кгат/Км гидролиза пепсином пептидов, полученных систематическими заменами каждой из аминокислот в Ьу8-Рго-А]а-Ьу8-РЬе*РЬе(М02)-Аг§-Ьеи.

Ьу8-Рго-А1а-1у8-РЬе*КрЬ-А^-Ьн1 Р5 Р4 Рз Р2 Рз' Рз'

1.6 1.4 1.2 ккаУКм «I 0.8 0.6 0.4 0.2 0 катепсии Е

Ж"ЖГ лЬ

А 8 1. О !! А в 1- Р Я А 5 I. 0 I! А Э I. О Г! А Э I О I» А в I. й Я

Р5 Р4 РЗ Р2 Р2' РЗ'

Рис. 3. Величины к^т/Км гидролиза катепсином Е пептидов, полученных систематическими заменами каждой из аминокислот в Ьу$-Рго-А1а-Ьуз-РЬе*РЬе(1М02)-Аг§-Ьеи.

Соответствующие данные для грибной протеиназы ризопуспепсина (рис. 4) показали, что все замены в исходном пептиде приводят к получению субстрата с хорошими кинетическими характеристиками. Исключением являются две замены: Arg в Р4 и Asp в Р2'-положениях. Эти заряженные аминокислоты, очевидно, не способны связываться гидрофобными S4 и 82'-подцентрами активного центра фермента. В некоторых случаях замены приводят даже к более эффективному расщеплению по сравнению с исходным пептидом, что не кажется удивительным после данных, полученных для катепсина Е.

Lys-Pro-Ala-Lys-Phe*Nph-Arg-Leu Ps Р4 Рз Р2 Р2' Рз'

2.5 -кка/Км 2 1.5 1

0.5 -I ризопуспепсин I

A S L О R

A S L О R

ASIDR ASL0R ll-l lllll

A S L О R ASIDR

Р5

Р4

РЗ

Р2

Р2'

РЗ*

Рис. 4. Величины к^Ж« гидролиза ризопуспепсином пептидов, полученных систематическими заменами каждой из аминокислот в Ьу8-Рго-А1а-Ьу$-Р11е*Р11е(Ж)2)-А^-Ьеи.

Двенадцать различных ферментов, принадлежащих классу аспартильных протеиназ, по эффективности расщепления описанной серии пептидов разделились на две группы. Первую группу образовали ферменты, способные эффективно расщеплять как исходный, так и многие другие синтезированные пептиды. В неё вошли пепсин и ризопуспепсин. Другая группа протеиназ эффективно расщепляет лишь Р2замещённые пептиды, например, катепсины D и Е. Так как многие аспартильные протеиназы были отнесены именно, к последней группе, Данном и сотр. была синтезирована новая серия субстратов на основе пептида Lys-Pro-Ile-Glu-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu.

В новой серии субстратов осуществлялись замены в положениях Рз, р2',Рз' исходного пептида, причём использовались также неприродные аминокислоты, например, Nie, так как многие ферменты предпочитают гидрофобные замены.

Полученные данные (рис. 5) свидетельствуют о том, что для катепсина Е в Рг-положении более предпочтительны гидрофобные аминокислотные остатки; положительно заряженные Arg, Lys и His значительно уменьшают скорость расщепления субстратов. Пептид с Pro в Р2-положении не гидролизуется катепсином Е. Некоторые варианты замен приводят к высоким скоростям расщепления и соответственно высоким значениям ккаЖм, несколько превосходящим лучшие значения для ризопуспепсина. Одинаковый порядок лучших кинетических констант свидетельствует о сходстве каталитических механизмов этих ферментов.

Lys-Pro-He-Glii-Phe*Nph-Arg-Leu ккат/Ки 10 8 6 4 2

Г2 Гj nL, Е n s d

Uliiiih

H p катепсин £ d v

S 1 R К

IUI y l nl; 1 F R lui

P2

P2'

P3'

Рис. 5. Величины к^/Км гидролиза катепсином Е пептидов, полученных систематическими заменами каждой из аминокислот в Ьу8-Рго-Пе-01и-РЬе*Р11е(]М02)-А^-Ьеи.

Интересно, что пептид, содержащий Glu в положении Рг' является лучшим субстратом для катепсина Е. В то же время пептид с Asp в Рг'-положении характеризуется наименьшим значением ккат/Км для всей серии замен в Рг'. Причиной такого различия является более короткая боковая цепь Asp.

В Рз'-положении, напротив, наилучшей заменой оказалась Asp, однако, любая из исследуемых замен приводит лишь к незначительному изменению к^^/Км. Исключением является пептид с Ser в Рз'-положении, который не гидролизуется катепсином Е.

Кинетический параметр киДм часто называют константой специфичности фермент-субстратной пары, которая характеризует и процесс связывания субстрата и факторы, лимитирующие скорость расщепления.

На первый взгляд, описанные авторами субстраты, имеющие высокие значения ккат/Км, характеризуются также лучшими значениями к^т (рис. 6) и худшими К« (рис. 7). Однако, некоторые примеры иллюстрируют как раз компенсирующий эффект этих двух параметров. Иными словами, факторы, приводящие к более прочному связыванию могут также быть причиной худшего катализа по причине образования непродуктивной конформации фермент-субстратного комплекса. Напротив, очевидно слабое связывание способно аккумулировать более эффективный катализ за счет большей скорости освобождения продуктов.

Таким образом, оптимальный субстрат должен выбираться с учетом его дальнейшего применеия. Например, для более чувствительного контроля в процессе очистки белка необходим субстрат, характеризующийся высоким значением кит, а для изучения ингибирования фермента более подойдет субстрат с кгат в пределах 10-100 с"1 в сочетании с относительно большим значением К« (выше 50 мкМ).

С использованием той же пептидной библиотеки (серия Pi'-Phe(N02)-содержащих субстратов с заменами аминокислот в Р5-Р2, Рг' и Рз'-положениях) была составлена карта субстратной специфичности аспартильной протеиназы А (РгА) из дрожжей Saccharomyces cerevisiae [54]. Сравнивалась эффективность расщепления субстратов РгА, пепсином, катепсинами Е и D и ризопуспепсином. На основании проведенного исследования AJa-Pro-A]a-Lys-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu оказался лучшим субстратом для определения активности РгА (Км=0.012 мМ, ккат=14.4 с"1).

Ь>^-Рго-11с-С1и-РЬе*КрЬ-Аг«-Ьси

Р2 Р2' Рз' ккаг

250 200 150 100 50 0

Е < катепсин Б А 0 8 пЬ

V || 1 1 К 1||И |||||| 1

Р2

Р2'

РЗ'

Рис. 6. Величины к^ гидролиза катепсином Е пептидов, полученных систематическими заменами каждой из аминокислот в Ьу5-Рго-11е-01и-РЬе*РЬе(Ж)2)-Аг§-Ьеи.

Ьу8-Рго-Пе-Ии-РЬе*КрЬ-Аг8-Ьеи г2 л-з км

140 120 100 80 60 40 20 катепсин £ ш 1 к I

Р2

Р2'

РЗ'

Рис. 7. Величины Км гидролиза катепсином Е пептидов, полученных систематическими заменами каждой из аминокислот в Ьу5-Рго-11е-С1и-РЬе*РЬе(Н02)-А^-Ьеи.

Описанный выше подход создания карт специфичности протеиназ на основе субстратов, содержащих п-нитрофенилаланин в Pi'-положеиии, использовался также при исследовании рекомбинантного ризопуспепсина [55], нативного и рекомбинантного катепсина D [56], HIV-1 протеиназы [57], при сравнении влияния замен в Ps- и Р4-положениях на эффективность связывания в активном центре пепсина и катепсина Е [58].

Изучение природы аминокислот, определяющих специфичность аспартильных протеиназ, имеет не только большое теоретическое значение, но и практическое, например, для конструирования синтетических ингибиторов этих ферментов -потенциальных лекарственных препаратов для терапии различных заболеваний.

Хилл Дж. и соавт. клонировали, выделили и охарактеризовали рекомбинантный плазмепсин П - аспартильную протеиназу из малярийного паразита Plasmodium falciparum [59]. Ппазмепсины (1-го и П-го типа) вовлечены в начальный этап деградации гемоглобина и, следовательно, представляют собой важный объект антималярийной гемотерапии. Изучение субстратной специфичности плазмепсина II открывает возможность получения селективных ингибиторов данного фермента, т.е. потенциальных лекарств. Авторы определили кинетические константы гидролиза в присутствии плазмепсина II нескольких хромогенных субстратов, содержащих Phe(N02) в Pi'-положении (рН 4.7): Ala-Leu-Glu-Arg-Thr-Phe*Phe(N02)-Ser-Phe-Pro-Thr (Км = 110 мкМ, кют = 3.8 с'1, кит/Км = 35 мМ'У1), Lys-Pro-Ile-Val-Phe*Phe(N02)-Arg-Leu (Км =10 мкМ, кит =1.6 с"1, к,ц„/Км =160 mIVTV1). Был установлен интересный факт, что субстрат, получающийся при замещении Уа1 в Р2-положении на Lys, полностью устойчив к действию плазмепсина II.

В последние годы отмечается, что систематические кандидомикозы становятся одними из наиболее серьёзных вторичных клинических осложнений. Вследствие этого резко возрос интерес к протеиназам из грибов. Поражение слизистых оболочек ротовой полости, а также другие специфические грибковые инфекции чаще всего вызываются патогенами типа Candida. Фузек М. и соавт. провели иследование субстратной специфичности аспартильных протеиназ из Candida albicans, Candida Iropicalis и Candida parapsilosis в сравнении с аспартильными протеиназами человека (пепсином, ренином и катепсином D) [60]. На основании кинетического анализа библиотеки Р 1'-РЬе(Н02)-содержащих синтетических субстратов, была составлена карта специфичности ферментов по Р5-Р2, Р2 и Рз'-положениям. Для субстрата Lys-Pro-Ala-Leu-Phe-Phe(N02)-Arg-Leu величина кка1УКм составляет 2.95 mkM'V1 при расщеплении протеиназой из Candida albicans, 1.60 mkM'V1- для протеиназы из Candida tropicalis и 0.59 mkM'V1- для протеиназы из Candida parapsilosis. Полученные результаты показали, что исследуемые аспартильные протеиназы отличаются по субстратной специфичности как между собой, так и от физиологически присутствующих аспартильных протеиназ человека, что открывает возможность для создания специфических ингибиторов данных грибковых протеиназ.

Создание ингибиторов HTV-1 протеиназы является одним из стратегических направлений в получении терапевтических средств дои лечения СПИДа. Изучение расщепляемых ШУ-1 последовательностей выявило два основных мотива чувствительной к гидролизу связи. Разрыв преимущественно происходит между двумя аминокислотами с гидрофобными боковыми цепями или по связи ароматическая аминокислота - пролин. Таким образом, как в Pi-, так и в Pi'-положении может находиться фенилаланин или модифицированный фенилаланин. Основанные на подобном дизайне субстраты нашли широкое применение для исследования ШУ-1. Субстраты, содержащие Phe(N02) в Pi -положении использовались для определения субстратной специфичности ШУ-1 протеиназы [61-64]. Ричарде Д. и соавт. использовали Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Phe(N02)-Glu-Ala-Met (Км = 22 мкМ, кит = 20 с"1) для изучения влияния pH и ионной силы на активность протеиназы [62]. His-Lys-Ala-Arg-Val-Leu*Phe(N02)-Glu-Ala-Nle-Ser-NH2 (Км = 17 мкМ, ккат = 16.3 с1, кках/К* = 940 мМ"1с~' при гидролизе ШУ-1 дикого типа) применялся для исследования протеолитических свойств и ингибирования рекомбинантной протеиназы ШУ-1 и её различных мутантных форм [65].

Таким образом, предложенные субстраты позволяют изучать различные аспартильные протеиназы в водных растворах при оптимальных значениях pH. Однако, необходимость высокочувствительной спектрофотометрической аппаратуры не позволяет использовать субстраты с п-нитрофенилаланином для массовых определений активности аспартильных протеиназ.

Описаны в литературе и примеры косвенного метода определения активности аспартильных протеиназ при помощи хромогенных субстратов. Например, Филипповой и соавт. был предложен двухферментный способ [66, 67]. Суть метода состоит в том, что пепсин и аспергилло пепсин А расщепляют п-нитроанилиды пироглутамил-пептидов, освобождая п-нитроанилиды фенилаланина и лейцина, которые затем подвергаются исчерпывающему гидролизу лейцинаминопептидазой. Реакция сопровождается выделением п-нитроаншшна, который определяется спектрофотометрически по поглощению при 410 нм.

Первоначально была синтезирована серия субстратов общей формулы Glp-Pj-Pi'-pNA, где Pi = Phe, РЬе(ЫОг), Туг, aPj' = Phe, Leu [66]. Для улучшения кинетических характеристик был получен Glp-Ala-Ala-Phe-Leu-pNA, отличающийся от описанных выше вставкой из двух остатков аланина [67]. Удлинение пептидной цепи субстрата не повлияло на Км, однако к^т пепсина возросла в 1300 раз (табл. 3). Аспергиллопепсин А - аспартильная протеиназа из микроскопического плесневого гриба - имеет близкое значение Км, но кмт в 50 раз ниже чем у пепсина.

Таблица 3.

Кинетические константы гидролиза субстратов в присутствии пепсина и аспергиллопепсина А [66, 67]. (0.1 М ацетатный буфер, рН4.0, содержащий 0.5 М NaCl и 20% DMF).

Субстрат, мМ Фермент [Е], мМ V кках/Км, мМ с1 MlVrV1

Glp-Ala-Ala-Phe-Leu-pNA, Пепсин, l .lxlO"5 0.55 18,5 31,7

0.15-1.5 Аспергиллопепсин А, 0.66 0,326 0,49

2.3x10"*

Glp-Phe-Leu-pNA, 0.05-1.6 Пепсин, 25x10"3 0,56 0,014 0,025

Таким образом, преобладающее большинство описанных в литературе хромогенных субстратов аспартильных протеиназ содержат остаток РИеОЧСЬ) в Рг или Р^-положениях.

выводы

1. Предложена тактика синтеза новых хромофорных субстратов аспартильных протеиназ, сочетающая химические и ферментативные методы.

2. Разработан ферментативный метод синтеза хромофорных гексапептидов из соответствующих трипептидов с применением пепсина в качестве катализатора. Изучена зависимость эффективности синтеза в присутствии пепсина от типа органических растворителей, соотношения компонентов, времени реакции, содержания и ионной силы буфера, добавляемого в реакционную смесь и используемого при нанесении пепсина на целит.

3. В разработанных условиях проведены успешные ферментативные конденсации пептидных фрагментов, обеспечивающие получение гексапептидов с удовлетворительными выходами.

4. Установлена возможность использования синтезированных гексапептидов в качестве субстратов аспартильных протеиназ из различных источников: пепсина, химозина телёнка, аспергиллопепсина А и трансгенного химозина. Разработана методика определения активности аспартильных протеиназ.

5. Определены кинетические характеристики новых субстратов при гидролизе пепсином, химозином телёнка и аспергиллопепсином А.

6. Разработана методика определения суммарной активности аспартильных протеиназ абомина. Составлены технические условия на субстрат Опр-А1а-А1а-РЬе-РЬе-А1а-А^-ЫБЬ.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор чрезвычайно признателен безвременно ушедшему от нас руководителю работы В.М. Степанову за его постоянный интерес к проводимым исследованиям, внимательное, плодотворное и критическое обсуждение полученных результатов и планирования эксперимента.

Автор выражает глубочайшую благодарность Г.Н. Баландиной за обучение практическим навыкам, неоценимую помощь в обсуждении, постановке и проведении эксперимента и огромную моральную поддержку в ходе выполнения и оформления данной работы. Автор приносит искреннюю благодарность Г. И. Лавреновой, И.Ю. Филипповой, E.H. Лысогорской, Г.Н. Руденской и сотрудникам ВНИИГенетика Т. Л. Воюшиной и МП. Юсуповой за полезные дискуссии и ценные практические советы. Большую помощь при исследовании полученных соединений оказали сотрудники отдела хроматографии Л. А. Баратова, М.Б. Вирясов и А. Л. Ксенофонтов.

Автор признателен всем сотрудникам, аспирантам и студентам лаборатории химии протеолитических ферментов химического факультета МГУ и ВНИИГенетика за интерес к данной работе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Краткое рассмотрение структуры и свойств хромогенных и флуорогенных субстратов аспартильных протеиназ показывает, что существующие в настоящее время пептидные субстраты отвечают требованиям не только первичной, но и вторичной специфичности ферментов. Хотя гомологичные аспартильные протеиназы имеют одинаковый каталитический центр и сходную первичную специфичность, их зоны связывания различаются. Особенности в организации вторичного связывающего центра индивидуальных протеиназ можно с успехом использовать для создания селективных субстратов даже для сходных ферментов. Это достигается путём варьирования аминокислотной последовательности и природы защитных групп.

В настоящее время наиболее распространенными хромогенными субстратами аспартильных протеиназ являются производные на основе п-нитрофенилаланина. РЬе(Ы02)-содержащие субстраты доступны, поскольку контроль гидролиза осуществляется посредством УФ-спектрофотометрии. Однако, метод требует, чтобы РЬе(Н02) участвовал в образовании пептидной связи, расщепляемой впоследствии ферментом, и, следовательно, может использоваться в ограниченном числе аминокислотных последовательностей. Вдобавок электронный эффект РЬе(МОг) имеет тонкий механизм, и гидролиз субстрата сопровождается незначительными спектрофотометрическими изменениями, что в результате ограничивает чувствительность метода.

Методы с использованием флуорогенных субстратов гораздо чувствительнее спектрофотометрических, но в тоже время выдвигают и более высокие требования к чистоте применяемых реагентов, а также нуждаются в специальной более дорогой аппаратуре. Таким образом, целью нашей работы было создание новых удобных и доступных субстратов аспартильных протеиназ, а также разработка новых подходов определения их активности.

П. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Данная работа посвящена синтезу и изучению свойств новых пептидных хромофорных субстратов аспартильных протеиназ. Работа состоит из 4 частей:

1) выбор аминокислотной последовательности новых субстратов;

2) синтез новых хромофорных субстратов и изучение закономерностей, характеризующих процесс образования пептидной связи в присутствии пепсина;

3) изучение свойств новых субстратов и разработка методики определения активности аспартильных протеиназ с их использованием;

4) практическое применение субстратов (разработка методики определения активности аспартильных протеиназ лекарственного препарата - абомина).

В нашу задачу входило получение субстратов, которые отвечали бы следующим требованиям: во-первых, соответствие аминокислотной последовательности субстрата специфичности пепсина и химозина и, во-вторых, наличие в субстрате таких структурных элементов, которые обеспечивали бы возможность разделения продуктов гидролиза и прямого спектрофотометрического контроля ферментативной активности.

В соответствии с этими требованиями структура синтезированных соединений может быть выражена общей формулой: Dnp-(HN-CH-COVArg-NH2, где R

Dnp - 2,4-динитрофенильная группа, Кшх - 360 нм, = 15000 NT'cm"1 [92];

HN-CH-CO) - остатки аминокислот в последовательности, соответствующей I субстратной специфичности аспартильных протеиназ. R п - число аминокислотных остатков между хромофором (Dnp) и С-концевым аргинином в молекуле субстрата.

Особенностью предложенных нами субстратов является наличие постоянного хромофора - Dnp-группы, поглощающей в УФ-области, и остатка Arg на С-конце пептида, которые используются нами в качестве структурных элементов, позволяющих придать субстратам необходимые физико-химические свойства: хромофорная Dnpгруппа - обеспечивает возможность спектрофотометрической оценки степени его расщепления; Arg — определяет возможность использования ионнообменной хроматографии для разделения продуктов гидролиза.

ПЛ. Выбор аминокислотной последовательности субстратов.

Исследование субстратной специфичности пепсина и химозина на пептидах различной длины показало, что фермент-субстратное взаимодействие зависит как от длины пептидной цепи субстрата, так и от характера аминокислот окружающих разрываемую связь. Пепсин и родственные ему ферменты расщепляют в пептидах и белках связи, образованные остатками преимущественно гидрофобных аминокислот. Также установлено, что активный центр аспартильных протеиназ имеет протяженный характер, и субстрат должен содержать как минимум шесть аминокислотных остатков, по три с каждой стороны от расщепляемой связи [31, 93-98].

В двух независимых работах - Антонова В.К с сотр. [99] и Пауэрса Д. с сотр. [100] был проведён статистический анализ белковых и пептидных последовательностей, соответствующих положениям Р5-Р5' [99] (табл. 11) и Р-гРз' [100] (табл. 12), гидролизующихся под действием пепсина. В обоих исследованиях отмечается, что пепсин наиболее специфичен к аминокислоте Pi, взаимодействующей с Si подцентром связывания фермента (рис. 14).

20 г^ 18 16 н с V

Ss 14

1 12

2 10

8 Н л

6 -4 2 0 et

Uf

-2 s & o о

-1,5 л S cd

-0.5

Р7 Р6 Р5 Р4 РЗ Р2 Р1 РЧ Р2 Р'З РЧ Р'5 Р'6

Рис. 14. Степень влияния аминокислотных остатков в положениях Р7-Р6' субстрата на эффективность связывания в активном центре пепсина. (7)—[ 100], (2)-[99].

1. Darwin C. // Insectivorous Plants. London: John Murray. 1875. 88 P*.

2. Bernai J.D., Crowfood D. H Nature. 1934. V. 133. P. 794-795*.

3. Sielecki A.R., Fedorov A.A., Boodhoo A., Andreeva N.S., James M.N.G. Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at 1.8 A resolution. // J. Mol. Biol. 1990. V. 214. P. 143-170.

4. Newman MP., Safro M., Frazao C., Khan G., Zdanov A., Tickle I.J., Blundell T.L., Andreeva N.S. X-ray analyses of aspartic proteinases. IV. Structure and refinement at 2.2 A resolution of bovine chymosin. // J. Mol. Biol. 1991. V. 221. P. 1295-1309.

5. James M.N., Sielecki A.R. Structure and refinement of penicillopepsin at 1.8 A resolution. //J. Mol. Biol. 1983. V. 163. P. 299-361.

6. Suguna K., Bott R.R., Padlan E.A., Subramanian E., Sheriff S., Cohen G.H., Davies D R. Structure and refinement at 1.8 A resolution of the aspartic proteinase from Rhizopus chinensis. // J. Mol. Biol. 1987. V. 196. P. 877-900.

7. Sielecki A.R., Hayakawa K., Fuginaga M., Murphy M.E.P., Fraser M., Muir A.K., Carilli C.T., Lewicki J.I., Baxter J.D., James M.N.J. Structure of recombinant human renin, a

8. Tang J., Sepulvelda P., Marsiniszyn J., Chen K.C.S., Huang W.Y., Tao. N., Liu D., Lainier J.P. Amino-acid sequence of porcine pepsin. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1973. У. 70. P. 3437-3439.

9. Pedersen V.B., Foltmann B. The amino acid sequence of the first 61 residues of chymosin(rennin EC 3.4.4.3). //FEBS Lett. 1973. V. 35. № 2. P. 250-254.

10. Sodek J., Hofmann T. Amino acid sequence around the active site aspartic acid in penicillopepsin. // CaaJ. Biochem. 1970. V. 48. P. 1014-1022.

11. Sepulvelda P., Marsiniszyn J., Liu D., Tang J. Primary structure of porcine pepsin. Ш. Amino acid sequence of a cyanogen bromide fragment, CB2A, and the complete structure of porcine pepsin. //J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 5082-5088.

12. Huseby R.M., Smith R.E. Synthetic oligopeptide substrates: their diagnostic application in blood coagulation, fibrinolysis, and other pathologic states. // Semin. Thromb. Hemostasis. 1980. V. 6. № 3. P. 175-314.

13. Локшина JI.А., Орехович B.H., Склянкина В.А. Расщепление пептидами сложноэфирной связи. // Вопр. мед. химии. 1964. Т. 10. № 5. С. 552-554.

14. Inouye К., Fruton J.S. Pepsin As an Esterase. // Am. Chem. Soc. 1967. V.89. № 1. P. 187-188.

15. Inouye К., Fruton J.S. Studies on the specificity of pepsin. // Biochemistry. 1967. V. 6. № 6. P. 1765-1777.

16. Hofmann Т., Hodges R. A new chromophoric substrate for penicillopepsin and other fungal aspartic proteinases. // Biochem. J. 1982. У. 203. № 3. P. 603-610.

17. Hollands R, Voynick I., Fruton J.S. Action of pepsin on cationic synthetic substrates. // Biochemistry. 1969. V. 8. № 2. P. 575-585.

18. Medzihradszky K., Voynick I., Medzihradszky-Scheiger H., Fruton J.S. Effect of secodary enzyme-substrate interections on the cleavage of synthetic peptides by pepsin. // Biochemistry. 1970. V. 9. № 5. P. 1154-1162.

19. Voynick I., Fruton J.S. Comparative specificity of acid proteinases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. № 2. P. 257-259.

20. Ferguson J., Andrews J., Voynick I., Fruton J.S. The specificity of cathepsin D. // J. Boil. Chem. 1973. V 248. Na 1. P. 6701-6708.

21. Irvine G., Blumsom N., Elmore D. The kinetics of hydrolysis of some synthetic substrates containing neutral hydrofilic groups by pig pepsin and chicken liver cathepsin D. //Biochem. J. 1983. V. 211. № 1. P. 237-242.

22. Pohl J., Baudys M., Kostka V. Chromophoric peptide substrates for activity determination of animal aspartic proteinases in presence of their zymogens: a novel assay. H Anal. Biochem. 1983. V. 133. № 1. P. 104-109.

23. Agarwal N., Rich D. An improved cathepsin D substrates and assay procedure. // Anal.Biochem. 1983. V. 130. №2. P. 158-1165.

24. Raymond M., Bricas ESalesse R., Gamier J., Gamot P., Dumas R.D. Proteolytic unit for chymosin (rennin) activity based on a reference synthetic peptide. // J. Dairy Sci. 1973. V. 56. № 4. P. 419-422.

25. Visser S., Van Rooiyen P., Schattenkerk C., Kerling K. Peptide substrates for chymosin (rennin). // Biochem. Biophys. Acta. 1977. V. 481. № 1. P. 171-176.

26. Martin P., Trieu-Cuot P., Collin J., Dumas R.B. Purification and characterization of bovinegastricsin. //Eur. J. Biochem. 1982. V. 122. № 1. P. 31-39.

27. Зильберман М.И., Воротынцева Т.И. Протеиназы энтероцитов тонкого кишечника свиньи. Очистка и свойства аспартильной протеиназы, сходной с катепсином D. // Биохимия. 1985. Т. 50. № 9. С. 1453-1462.

28. Raymond M., Bricas E. New chromophoric peptide substrates for chymosin (remrin). // J. Dairy Sci. 1979. V. 62. № 11. P. 1719-1725.

29. Martin P. Hydrolysis of the synthetic chromophoric hexapeptide Leu-Ser-Phe(NC>2)-Nle-Ala-Leu-OMe catalyzed by bovine pepsin A. // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 791. № 1. P. 28-36.

30. Martin P., Raymond M., Bricas E., Dumas R.B. Kinetic studies on action of Mucor pusillus, Mucor miehei acid proteases and chymosins A and B on a synthetic chromophoric hexapeptide. //Biochim. Biophys. Acta. 1980. V. 612. №2. P. 410-420.

31. Venera G.D., Machalinski C., Zumarraga H., Biscoglio M. Futher characterization and kinetic parameter determination of a milk-clotting protease from Mucor bacilliformis. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V. 68. P. 207-216.

32. Nashed N T., Louis J.M., Sayer J.M., Wondrak E.M., Mora P.T., Oroszlan S.,Jerrina D.M. Continuous spectrophotometric assay for retroviral proteases of HIV-1 and AMV. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. V. 163. №2. P. 1079-1085.

33. Hofmann T., Hodges R. A new chromophoric substrate for penicillopepsin and other fungal aspartic proteinases. // Biochem. J. 1982. V. 203. № 4. P. 603-610.

34. Dunn B., Kammermann B., Mc Curry K. The synthesis purification and evaluation of chromophoric substrate for pepsin and other aspartyl proteases: design of a substrate based on subsite preference. // Anal. Biochem. 1984. V. 138. № 1. P. 68-73.

35. Kay J., Valler M.J., Dunn B.M. Naturally-occurring inhibitors of aspartic proteinases. // Proteinase Inhibitors, Medical and Biological Aspects. Berlin: Springer-Verbg. 1983. P. 201-210.

36. Dunn B.M., Jimenez M., Parten B.F., Valler M.J., Rolph C.E., Kay J. A systematic series of synthetic chromophoric substrates for aspartic proteinases. // Biochem. J. 1986. V. 237. P. 899-906.

37. Dunn B., Kay J. Design, synthesis and analysis of new synthetic substrates for aspartic proteinases. //Biochem. Soc. Trans. 1985. V. 13. №6. P. 1041-1043.

38. Scarborough P.E., Guruprasad K., Topham C., Richo G.R., Conner G.E., Blundell T.L., Dunn B.M. Exploration of subsite binding specificity of human cathepsin D through kinetics and rule-based molecular modeling. // Protein Sci. 1993. V. 2. P. 264-276.

39. Baxter A., Campbell C.J., Grinham C.J., Keane R.N., Lawton B.C., Pendlebury J.E. Subsite and inhibitor studies with human gastric aspartic proteinases. // Biochem. J. 1990. V. 267. P. 665-669.

40. Kay J., Dunn B.M. Substrate specificity and inhibitors of aspartic proteinases. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 1992. V. 52. P. 23-30.

41. Rao-Naik C., Guruprasad K., Batley B., Rapundalo S., Hill J., Blundell T., Kay J., Dunn B.M. Exploring the binding preferences/specificity in the active site of human cathepsin E. // Proteins. 1995. V. 22. P. 168-181.

42. Azaryan A.V., Galoyan A.A. Subsite specificity of cerebral cathepsin D and high-Mr aspartic endopeptidase. // J. Neurosci. Res. 1988. V. 19. № 2. P. 268-271.

43. Balbaa M., Cunningham A., Hofmann T. Secondary subsite bindin in aspartic proteinases: contributions of subsites S3 and S2' to kcat H Arch. Biochem. Biophys. 1993. V. 306. № 2. P. 297-303.

44. Fruton J. The mechanism of the catalytic action of pepsin and related acid proteinases. // Adv. Enzymol. Relat. Areas. Mol. Biol. 1976. V. 44. P. 1-36.

45. Kondo H., Shibano Y., Amachi T., Cronin N., Oda K., Dunn B.M. Subsite specificities and kinetic properties of proteinase A from the yeast Saccharomyces cerevisiae and the development of a novel substrate. //J. Biochem. 1998. V. 124. P. 141-147.

46. Lowther W.T., Chen Z., Lin X.L., Tang J., Dunn B.M. Substrate specificity study of recombinant Rhizopus chinensis aspartic proteinase. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 306. P. 275-279.

47. Scarborough P.E., Richo G.R., Kay J., Conner G.E., Dunn B.M. Comparison of kinetic properties of native and recombinant human cathepsin D. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 306. P. 343-347.

48. Jupp R.A., Richards A.D., Phylip L H., Kay J., Konvalinka J., Strop P., Kostka V., Scarborough P.E., Farmerie W.G., Dunn B.M. Substrate cleavage by HIV-1 proteinase. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 306. P. 461-467.

49. Rao C., Scarborough P.E., Lowther W.T., Kay J., Batley B., Rapundalo S., Klutchko S., Taylor M.D., Dunn B.M. Structure-function database for active site binding to the aspartic proteinases. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 306. P. 143-147.

50. Hill J., Tyas L., Phylip L.H., Kay J., Dunn B.M., Berry C. High level expression and characterisation of plasmepsin II, an aspartic proteinase from Plasmodium falciparum. II FEBSLett. 1994. V. 352. P. 155-158.

51. Konvalinka J., Strop P., Velek J., Cerna V., Kostka V., Phylip L.H., Richards A.D., Dunn B.M., Kay J. Subsite preferences of the aspartic proteinase from the human immunodeficiency virus, HIV-1. // FEBS Lett. 1990. V. 268. № 1. P. 35-38.

52. Dunn B.M., Grestchina A., Wlodawer A., Kay J. Subsite preference of retroviral proteinases. II Method of Enzymology. 1994. V. 241. P. 254-278.

53. Pazhanisamy S., Stuver C.M., Cullian A.B., Margolin N., Rao B.J., Livingston D.J. Kinetic characterization of human immunodeficiency virus type-1 protease-resistant variants. //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 30. P. 17979-17985.

54. Лысогорская EH., Филиппова И.Ю., Бойцова С.Е., Оксенойт ЕС., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Ферментативный синтез пироглугамил-пептидов -хромогенных субстратов пепсина. // Биоорг. химия. 1983. Т. 9. № 4. С. 470-477.

55. Филиппова И.Ю., Лысогорская Е.Н., Оксенойт Е С., Люблинская Л.А., Степанов В.М. Новый хромогенный субстрат пепсина п-нитроаншшд пироглутамил-аланил-аланил-фенилаланил-лейцина. // Биоорг. химия. 1984. Т. 10. № 3. С. 390-393.

56. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. И М.: Мир. 1980. 582 с.

57. Турро Н. Молекулярная фотохимия. // М.: Мир. 1967. 328 с.

58. Sachdev G.P., Johnson М.А., Fruton J.S. Fluorescence studies on the interaction of pepsin with its substrates.//Biochemistry. 1972. У. 11. P. 1080-1086.

59. Deyrup C., Dunn B.M. A new substrate for porcine pepsin possessing cryptic fluorescence properties. //Anal.Biochem. 1983. V. 129. P. 502-512.

60. Yonezawa H., Uchikova Т., Kaneda M., Izumiya N. Sensitive fluorometric assay for the activity of chymosin. //Int. J. Peptide Protein Res. 1996. V. 47. P. 56-61.

61. Geogheran K.F., Spenser R.W., Danley D.E., Contillo L.G., Andrews J., Andrews G.C. Fluorescence-based continuous assay for the aspartyl protease of human immunodeficiency virus-1. //FEBS Lett. 1990. V. 262. № 1, P. 119-122.

62. Biogegrain R.A., Fehrentz J.A., Castro В., Coletti-Previero M.A. Fluorogenic substrate peptides for aspartyl proteases. // Crit. Acad. Sci. Ser. 1990. V. 310. P. 465-470.

63. Wang W., Liang T.C. Fluorogenic peptides containing only a-aminoacids. // Biochem. Biophys. Res. Com. 1994. V. 201. № 2. P. 835-848.

64. Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Оксенойт E C., Комаров Ю.Е., Степанов В.М. Флуорогенные субстраты аспартильных протеиназ с внутренним тушением флуоресценции. // Биоорг. химия. 1986. Т. 12. С. 1172-1180.

65. Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Anisimova V.V., Suvorov L.I., Oksenoit E.S., Stepanov V.M. Fluorogenic peptide substrates for assay of aspartyl proteinases, d Anal. Biochem. 1996. V. 234. P. 113-118.

66. Филиппова И.Ю., Лысогорская E.H., Лавренова Г.Н., Оксенойт Е.С., Суворов Л.И., Старовойтова В.В. Пептидные субстраты с внутримолекулярным тушением флуоресценции для изучения аспартильных протеиназ. // Биоорг. химия. 2000. Т. 26. № 6. С. 197-202.

67. Oliveira M.C.F., Hirata I.Y., Chagas J.RR., Boschcov P.,Gomes R.A.S., Figueiredo A.F.S., Juliano L. Intramolecularly Quenched fluorogenic peptide substrates for human renin. //Anal. Biochem. 1992. V. 203. P. 39-46.

68. Juliano M.A., Filira F., Gobbo M., Rocchi R., Del Nery E., Juliano L. Chromogenic and fluorogenic glycosylated and acylglycosylated peptides as substrates for serine, tiol and aspartyl proteases. //J. Pept. Res. 1999. V. 53. P. 109-119.

69. Toth M.V., Marshall G.R. A simple, continuous fluorometric assay for HTV protease. // Int J. Pept. Protein Res. 1990. V. 36. P. 544-550.

70. Szeltner Z., Polgar L. Rate-determining steps in HIV-1 protease catalysis. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. № 50. P. 32180-32184.

71. Fitzgerald M., Laco G.S., Elder J.H., Kent S.B.H. A continuous fluorometric assay for the feline imunnodeficiency virus protease. // Anal. Biochem. 1997. V. 254. P. 226-230.

72. Yasuda Y., Kageyama T., Akamine A, Shibata M., Kominami E., Uchiyama Y., Yamamoto K. Characterization of new fluorogenic substrates for the rapid and sensitive assay of cathepsin E and cathepsin D. // J. Biochem. 1999. V. 125. P. 1137-1143.

73. Murakami K., Ohsawa T., Hirose S., Takada K., Sakakibara S. New fluorogenic substrates for renin. // Anal. Biochem. 1981. V. 110. P. 232-239.

74. Matayoshi E.D., Wang G.T., Krafft G.A., Ericson J. Novel fluorogenic substrates for assaying retroviral proteases by resonance energy transfer. // Science. 1990. V. 247. P. 954-958.

75. Wang G.T., Matayoshi E., Huffaker H.J., Krafft G.A. Design and synthesis of new fluorogenic HIV protease substrates based on resonance energy transfer. // Tetrahedron Lett. 1990. V. 31. № 45. P. 6493-6496.

76. Maggiora L.L., Smith C.W., Zhond-Yin Zhang. A general method for the preparation of internally quenched fluorescent protease substrates using solid-phase peptide synthesis. // J. Med. Chem. 1992. V. 35. P. 3727-3730.

77. Gulnik S.V., Suvorov L.I., Majer P., Collins J., Kane B.P., Johnson D.G., Ericson J.W. Design of sensitive fluorogenic substrates for human cathepsin D. // FEBS Lett. 1997. V. 413. P. 379-384.

78. Capobianco J.O., Lerner C.G., Goldman R.C. Application of a fluorogenic substrate in assay of proteolytic activity and in the discovery of a potent inhibitor of Candida albicans aspartic proteinase. // Anal. Biochem. 1992. V. 204. P. 96-102.

79. Степанов B.M. Молекулярная биология. Структура и функции белков. // Москва, "Высшая школа". -1996 г. 336 с.

80. Hill R.D. The nature of the rennin-sensitive bond in casein and its possible relation to sensitive bonds in other proteins. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968. V. 33. № 4. P. 659-63.

81. Inouye K., Voinick I.M., Delpierre J.R., Fruton J.S. New synthetic substrates for pepsin. // Biochemistry. 1966. V. 5. № 7. P. 2473-2483.

82. Trent G.E., Fruton J.S. The side-chain specificity of pepsin. // Biochemistry. 1969. V. 8. № 10. P. 4183-4190.

83. Hollands T.R., Voinick I.M., Fruton J.S. Action of pepsin on cationic synthetic substrates. //Biochemistry. 1969. V. 8. № 2. P. 575-584.

84. Oka Т., Morihara K. Specificity of pepsin: size and property of the active site. // FEBS Lett. 1973. V. 10. № 4. P. 222-224.

85. Зинченко A.A., Румш Л.Д., Антонов B.K. Статистический анализ специфичности пепсина в отношении гидролиза белков. //Биоорган, химия. 1976. Т. 2. № 6. С. 803810.

86. Powers J.C., Harley A.D., Myers D.V. Acid proteases. Stracture, function and biology. // Ed. by Tang J. 1977. Plenum Press. New York, London. P. 141-157.

87. Cooper I. V., Khan G., Taylor G., Tickle I. J., Blundell T.L. X-ray analyses of aspartic proteinases. Tree-dimentional structure of the hexagonal crystal form of porcine pepsin at 2.3 A resolution. //J. Mol. Biol. 1990: V. 214. P. 199-222.

88. Raymond M.N., Gamier J., Bricas E., Cilianu S., Blasnik M., Chaix A., Lefrancier P. Studies on the specificity of chymosin (rennin). I. Kinetic parameters of the hydrolysis of synthetic oligopeptide substrates. // Biochimie. 1972. V. 54. P. 145-154.

89. Visser S., Van Rooijen P.J., Slangen K.J. Peptide substrates for chymosin (rennin). Isolation and substrate behaviour of two tryptic fragments of bovine kappa casein. // Eur. J. Biochem. 1980. V. 108. P. 415-421.

90. Vreeman K.J., Van Rooijen P.J., Visser S. Segmented flow analysis as applied to kinetic studies of peptide bond hydrolysis. // Annal. Biochem. 1977. V. 77. P. 251-264.

91. Visser S., Rollema H.S. Quantification of chymosin action on nonlabeled kappa-casein-related peptide substrates by ultraviolet spectrophotometry: description of kinetics by the analysis of progress curves. // Annal. Biochem. 1986. V. 153. P. 235-241.

92. Hill R.D., Lahav E., Givol D. A rennin-sensitive bond in alpha-sl B-casein. // J. Dairy Res. 1974. V. 41. P. 147-153.

93. Carles C., Dumas R.B. Kinetics of the action of chymosin (rennin) on a peptide bond of bovine alpha si-casein. Comparison of the behaviour of this substrate with that of beta- and kappa-caseins. // FEBS Lett. 1985. V. 185. № 2. P. 282-286.

94. Carles C., Martin P. Kinetic study of the action of bovine chymosin and pepsin A on bovine kappa-casein. // Arch Biochem Biophys. 1985. V. 242. № 2. P. 411-416.

95. Carles C., Dumas R.B. Kinetics of action of chymosin (rennin) on some peptide bonds of bovine beta-casein. //Biochemistry. 1984. V. 32. P. 6839-6843.

96. Gilliland GL, Oliva MT, Dill J. Functional implications of the three-dimensional structure of bovine chymosin. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V. 306. P. 23-37.

97. Antonov V.K. New data on pepsin mechanism and specificity. // Adv. Exp. Med. Biol. 1977. V. 95. P. 179-198.

98. Гершкович А.А., Кибирев B.K. Синтез пептидов. Реагенты и методы. // Киев. Наукова думка. 1987. 263 с.

99. Люблинская Л.А., Якушева Д., Степанов В.М. // Биоорг. химия. 1977. Т. 3. С. 273-279.

100. Люблинская Л. А., Бойцова С.Е., Степанов В.М. Катализируемый термолизином синтез метиловых эфиров ацилированных пептидов в концентрированных водных растворах. //Биоорг. химия. 1986. Т. 12. С. 1301-1305.

101. Schulz G.E., Schirmer R.H. Principles of Protein Structure. // Ed. Springer-Verglad. New York. 1979. P. 74-76.

102. Kuhl P., Hailing P.J. Salt hydrates buffer water activity during chimotrypsin-catalyzed peptide synthesis. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1078. № 3. P. 326-328.

103. Ito Y., Fujii H., Imanishi Yu. Catalitic peptide synthesis by tripsin modified with polysteren in chloroform. И Biotechnol. Prog. 1993. V. 9. P. 128-130.

104. Sakurai K., Kashimoto K., Kodera Y., Inada Y. Solid phase synthesis of peptides with polyethylene glycol-modified protease in organic solvents. // Biotechnol. Lett. 1990. V. 12. № 9. P. 685-688.

105. Gaerter H., Puigserver A. Kinetics and specificity of serine proteases in peptide synthesis catalyzed in organic solvents. // Eur. J. Biochem. 1989. V. 181. № 2. P. 207213.

106. Luthi P., Luisi P.L. Enzymatic synthesis of hydrocarbonsoluble peptides with reversed micelles. //J. Am. Chem. Soc. 1984. V 106. №17. P. 7285-7286.

107. Larsson K.M., Adlercreutz p., Mattiasson B. Activity and stability of horse-liver alcohol dehydrogenase in sodium dioctylsulfosuccinate/cyclohexane reverse micelles. // Eur. J. Biochem. 1987. V. 116. № 1. P. 157-161.

108. Oyama K., Nishimura S., Nanaka Yu., Kihara K., Hashimoto T. Synthesis of an aspartame precursor by immobilized thermolysin in an organic solvent. // J. Org. Chem. 1981. V 46. № 19. P. 5241-5142.

109. Cassels J.M., Hailing P.J. Protease-catalyzed peptide synthesis in low water organic two-phase systems and problems affecting it. // Biotechnol. & Bioeng. 1989. V. 33. № 6. P. 1489-1494.

110. Kise H. Difference in catalitic activity of subtilisin Carlsberg and subtilisin BPN' and immobilization- activation for esters synthesis and transesterefication in ethanol. // Bioorg. Chem. 1990. V 18. № 1. P 107-115.

111. Gololobov M.Yu., Voyuchina T.L., Stepanov V.M., Adlercreutz P. Organic solvents changed the chymotrypsin specificity with respect to nucleophiles. IIFEBS Lett. 1992. V 307. №3.C. 309-312.

112. Wescott C.R., Klibanov A.M. Solvent variation inverts substrate specificity of an enzyme. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. № 7. P. 1629-1631.

113. Wang C.H., Wang K.T. New developments in enzymatic peptide synthesis. // Experimentia. 1991. V. 47. № 5. P. 1123-1129.

114. Wangikar P.P., Graycar T.P, Estell D.A., Clare D.S., Dordick J.S. Protein and solvent engineering of subtilisin BPN' in nearly unhydrous organic media. // J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. №26.P 12231-12237.

115. Юсупова М.П., Котлова E.K., Тимохина E.A., Степанов В.М. Ферментативный синтез пептидов аргинина хромофорных субстратов металлопротеиназ и карбоксипептидаз. //Биоорг. химия. 1995. Т. 21. № 1. С. 33-38.

116. Philipp М., Lender M.L. Kinetics of subtilisin and thiolsubtilisin. // Mol. Cell Biochem. 1983. V. 57. P. 5-32.

117. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Воюшина Т.JI., Тимохина Е.А., Степанов В.М. Влияние температуры и рН на стабильность и каталитическую активность сериновой протеиназы из Bacillus subtilis штамм 72. Н Биохимия. 1991. Т. 56. С. 230-239.

118. GronH., Meldal М., Breddam К. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching. // Biochemistry. 1992. V. 31. P. 6011-6018.

119. Morichara K., Oka., Tsuzuki M. Subtilisin BPN': kinetic study with oligopeptides. // Arch. Biochem. Biophys. 1970. V 138. P. 515-525.

120. Юсупова М.П, Новгородова С.А., Степанов В.М. Последовательное присоединение остатков аргинина к пептидам, катализируемое субтилизином. Влияние состава смеси органических растворителей. // Биоорг. химия. 1996. Т. 22. № 7. С. 523-527.

121. Reslow М., Adlercreuts P., Mittiasson В. The influence of water on protease-catalyzed peptide synthesis in acetonitrile/water mixtures. // Eur. J. Biochem. 1988. V. 177. P. 313-318.

122. Анисимова B.B., Лысогорская E.H., Филиппова И.Ю., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Катализируемый пепсином синтез пептидов в органических растворителях. // Биоорган, химия. 1994. Т. 20. № 3. С. 316-322.

123. Morihara К., Oka Т. Peptide bond synthesis catalyzed by subtilisin, papain and pepsin. // J. Biochem. 1981. V. 89. № 3. P. 385-395.

124. Isowa Y., Nagasawa Т., Kuroiwa K., Narita K. Verfahren zur herstellung eines peptids. //Pat. Swiss 597158 (CI.: С 07 С 103/52, 31 Mar 1978).

125. Козлов Л.В., Гинодман Л.М., Орехович В.Н., Валуева Т.А. Свободная энергия гидролиза пептидной связи и ферментативный синтез эфиров N-ацетилдипепгидов. // Биохимия. 1966. Т. 31. Вып. 2. С. 315-321.

126. Анисимова В.В. Пепсин в ферментативном синтезе пептидов. // Диссертационная работа. Москва. 1995.

127. Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Anisimova V.V., Abdel Malak C.A., Lavrenova G.I., Stepanov V.M. Pepsin behavior as a catalyst in equilibrium-controlled peptide synthesis. //Biomed. Biochim. Acta. 1991. V.50. № 10/11. P. 98-101.

128. Лысогорская E.H., Филиппова И.Ю., Абдель Малак К.А., Лавренова Г.И., Анисимова В.В., Оксенойт Е.С., Степанов В.М. Пепсин в ферментативном синтезеэфиров и п-нитроанилидов пептидов. // Биоорган, химия. 1992. Т. 18. № 8. С. 10811088.

129. Wehtje Е., Adlercreutz P., Mattiasson В. Stabilization of enzymes desposited on solid supports for use in organic media. // Paramatares influencing enzyme activity in organic media. Ed. by Wehtje E. Lund. 1992.

130. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. // Мир. Москва. 1976. 364 с.

131. Попов М.К., Кашпаров И.В., Ружейников С.Н. Теоретическое моделирование точечных мутаций белков. // Горизонты физико-химической биологии. Школа-конференция. Тезисы стендовых сообщений. Пущино. 2000. Т. 3. С. 99.

132. Anisimova V.V., Filippova I.Yu., Lysogorskaya E.N., Oksenoit E.S., Kolobanova S.V., Stepanov V.M. Proteinase-catalyzed peptide synthesis in concentrated solution of urea and other denaturing agents. //Int. J. Pept. Prot. Res. 1996. V. 47. P. 28-35.

133. Фермент сычужный пищевой. Технические условия ТУ 9219-002-05331581-98 (взамен ТУ 10 РФ 1038-92). Разработано Демидович С. С. (нач. производственно-испытательной лаборатории ОАО «Московский завод сычужного фермента»),

134. Хайс И.М., Мацек К. Хроматография на бумаге. // Иностр. Лит. Москва. 1962. 720 с.

135. Соловьёва Т.А., Беляев СВ., Степанов В.М. Очистка карбоксильных протеиназ на аминосилохроме. // Химия природн. соед. 1977. № 3. С. 398-403.

136. Гололобов М.Ю., Морозова И.П., Степанов В.М. Выделение протеиназы Bacillussubtilis штамм 72. //Биохимия. 1991. Т.56. С.33-40.

137. Степанов В.М., Лобарева Л.С., Руденская Г.Н., Боровикова В.П., Ковалёва Г.Г., Лавренова Г.И. Грамицидин S как специфический лиганд в афинной хроматографии карбоксильных протеиназ. // Биоорг.химия. 1977. Т. 3. № 6. С. 831835.