Сравнительное изучение действия протеиназ ретровирусов человека на белки клетки-хозяина и плазмы крови тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА. ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И м ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

КИСЕЛЕВ Алексей Фёдорович

УДК 577.152.344.1

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ПРОТЕИНАЗ РЕТРОВИРУСОВ ЧЕЛОВЕКА НА БЕЛКИ КЛЕТКИ-ХОЗЯИНА И ПЛАЗМЫ КРОВИ

02.00.10 - биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-1995 г.

Работа выполнена в Институте гнгисны и медицинской микробиологии им. Макса фон Петтенкофсра Мюнхенского университета им. Людвига-Максимилиана, Мюнхен, Германия, и на кафедре химии природных соединений химического факультета .МГУ им. М. В Ломоносова.

Научные руководители:

профессор К. фон дер Хельм

доктор химических наук, профессор В.М.Сгеланов,

Официальные оппоненты:

доктор бмшогичсских иаук, профессор О.Г.Оглоблина, доктор химических наук ЛД.Румш

Ведущая организация: Институт биомсдишшской химии РАМН

Защита состоится 28 февраля 1995 г. в 17 часов на заседании специализированного Ученого совета Д.053.05.47 при Московском Государственном Университете ■ им. М.ВЛомоносова по адресу: 119899, ГСП—3, Москва, Лсшшские горы, Инсипут фтико-хнмической биологии им. А.Н.£елозерского МГУ, аудитория SOI.

С диссертацией можно ознакомиться » библиотеке химического факультета МГУ им. М.В Ломоносова.

Автореферат разослан

Учёный секретарь Специализированного Совета, кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Ретровирусы — семейство РНК—содержащих вирусов, две группы которых вызывают болезни человека: вирусы иммунодефицита человека (HIV—1 и HIV—2) - возбудители СПИДа и вирусы Т-клеточного лейкоза взрослых (HTLV—1 и HTLV—2). Основной мишенью действия этих вирусов являются Т—лимфоциты, при этом инфекция HIV приводит к их гибели. Протеолитичсскис ферменты, закодированные в геноме рстровирусов, осуществляют специфический протсолиз вирусных полибелков—предшественников, которьп абсолютно необходим для формирования зрелого инфекционного вируса. Прогеиназа HIV способна также расщеплять кальмодулин и белю« щггоскслста клетки-хозяина |Shoeman et al., 1993; Tomassclli & Hein'ikson, 1994], что позг^ляст предположить, что она может вносить вклад в цитопатогснность HIV.

Наличие в крови HIV—инфицированных пациентов антител к вирусной протетгсзе [Boucher et al., 1989] указывает на возможность присутствия протсиназы вне инфицированной клетки. Поэтому, рассматривая роль протсиназы в патогенезе инфекции НГ\ следует изучить её действие не только на внутриклеточные белки, но и на Пелки плазмы крови. В сравнительном аспекте также представляет интерес способность протеииазы нешггопатогенного ретровируса HTLV расщеплять белки орпишзма—хозяина. Наконец, представляется интересным сравнить эффективность падролнза белковых субстратов . аспартилышми проггеиназами HIV и HTLV и другими прогсеолмт». юскими ферментами этого же класса.

Цель работы состояла в поиске новых субстратов протеииазы HIV—I (в дальнейшем обозначается HIV) среди белков плазмы человека, в сравнении действия пропяшаз HIV и HTLV—1 (в дальнейшем обозначается HTLV) на белки клетки—хозяина и плазмы крови, а также в сопоставлении их активности по этим белковым субстратам с активностью пепсина.

Научная новизна г праятпчссжая значимость работы. Показано, что протеиназа HIV способна расщеплять ряд физиологически важных белков плазмы крови человека: оц-ингибитор протсилаз, антитромбин П1 и

некоторые факторы системы комплемента, а также быстро взаимодействовать в плазме с о^-макроглобултюм с образованием ховалентных комплексов. Проведено сравнение действия на ряд невирусных белков протеиназы HIV и пропгеиназы другого рстровируса человека — HTLV, а также пепсина; показано, что эти три фермента обладают раали'гной активностью ло невирусным белковым субстратам. Разработана % ;тодика выделения и очистки протеиназы HTLV в количествах, достаточных для проведения структурных исследований. _

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на XX Симпозиуме Европейской группы опухолевых вирусов, г.Иннсбрук, 1993 г., на IX Международном конгрессе по проблемам СПИДа, г. Берлин, 1993 г., на Кейстоуновском симпозиуме. "Структура и молскулярнг i биология функций и икгибировашм иротеиназ", г.Санта-Фс, 1994 г., на годичном собрании Немецкого вирусологического общества, г.Франкфурт—на— Майне, 199^ г., и на конференции "Структура и функция протеолитических фермаггов", посящснной 90-лстию со дня рождения В.Ь.Ореховича, г.Москва, 1995 г.

Объём и структура ряботы. Диссертация общим объемом страниц состоит от »ведения, обзора литературы (лосшнцен протеиназе HIV), обсуждения результатов, экспериментальной части и выводов. Она содержит 9 таблиц, 24 рисунка и список цитируемой литературы ( ссылок).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

1. Выделение и очистка протеиназ ретровирусов человека.

Рекомбинангную прокиназу HIV получали экспрессией в b'.coli в форме гибридного белка с N-концсвой частью ß-галактозидазы ■ Солюби— лизация протеиназы из нерастворимой фракции клеточного лизата достигалась подкислсиием до pH 1,5. Последующая нейтрализация приводила к окзивации протеиназы, которую осаждали сулъф-том аммония и подвергали дальнейшей очиспсе гель—фильтрацией и ионообменной хроматографией, в

тезулътате чего ползали фермент 99% чистоты. Из 20 литров сультуралыши среды получали 0,6 мг очищенного фермента.

Экспрессию и солюбилизацию протеиназы HTLV проводили шядогичным образом. В результате осаждения сульфатом аммония удалось юлуч1пъ препарат протеиназы HTLV более 90% чистоты, который и «пользовался в настоящей работе. Из 8 литров культур ал ьнои среды юлучал!/ 6,3 мг фермента.

2. Условия эксперимента.

5—10 мкМ растворы изучаемых белков инкубировали с каждой из 1ротеиназ при pH 6,0 и 37®С. В контрольном опыте белок шисубировали в »тсутствие протеиназ или в присутствии как лГ'Тсиназы, так и сё специфического ингибитора (нспстатина А для пепсина, пептидного аналога Ro

*

11-8959 для протеиназы HIV). Через определённые промежутк времени из >еакц..онных смесей отбирали аликвоты, которые нагревали л«1 100°С в |рисутствии лодецилсульфи .а натрия (SDS) и 1,4-,щгп1оэритрита, после icro анализировали диск—электрофорезом в нолиакрилами; ном геле 11ЛАГ) в денатурируюmifx и восстанавливающих условиях, чем доспг 'лось »азделение исходных субстратов и продуктов их гидролиза. Окрашивание (елковых зон проводили Кумасси ярко—голубым или нитратом серебра, а штенсивность окраски определяли дснснтометрически.

Точки рас1дсплс1пш устанавливали, определяя N—концевые аминокислотные последовательности фрагментов пиролиза Для этого фрагменты ¡осле разделения в геле переносили на мембраны "Иммобклон" и ил'шергали деградации по Эдману на газофазно" секвснаторе.

3. Расщепление белков плазмы крови протеиназами ретровирусов человека и пепсином.

3.1. Расщепление ингибиторов сериновых протеиназ.

Три ингибитора сериновьгх протеиназ: а}—ингибитор протеиназ, юл се известный как а,—анти jpimcim, а,—антихимотр1ШС1Ш и анпгтромбин II были выбраны нами в качестве потенциальных субстратов нротеиназы

HIV. Все они относятся к семейств/ ссркинов — ингибиторов сериновы протеина:!, реактивный центр которых представляет из себя протяжённу] (10—15 аминокислотных остатков) и подвижную петлю. Это петля подвержена гидротизу многими сершювыми, цистеиновыми и мсталло-протеиназами, среди них — коллагенозами и протеинаэами патогенны микроорганизмов. Следствием гидролиза в петле реактивного центр является необратимая инактивация ссрпинов.

Электрофоре грамма на рисунке 1 показывает, что aj—ингибито] протеиназ гидродизуется протеиназой HIV (дор. 2), но не протеиназо! HTLV (дор. 3). Действие протеиназы HIV сходно с действием пепсина (дор 4). Расщенление происходит в пепле реактивного центра , (рис. 2), лричё) протспназа HIV гидролтует в равной стенсии две связи: Mct35l—Phc3S2 > Pl;c35j—Lcu3S3, пепсин — преимущественно связь Phej^—Leu35) и mchci интенсивно связи Mct35l-Phe352,. Leu3s3-GIu3J4 и Л1а355—Пе35й. Замен) остатка мс чонина— 351 в непосредственной близости от точек гидролиза w остаток глугаминовой кислоты (рекомбинантный М351Е/М358В вариан-uj—mmmmopa протеиназ) приводит к тому, что протеияаза НГ\ расщепляет только одну связь Mie352-Leu35J, Пепсин расщепляет эту ж< саязь преимущественно, атакуя также связь А1а353-Пе356 (рис. 2). При этоь M351E/M358R вариант гидролизуется протеиназой HIV в два раза быстрее а пепсином как минимум в 20 раз медленнее, чем неизмененный «ц-ннгибитор протеиназ (табл.1).

Расщепление как п псином, так и протеиназой HIV приводит i попере фуикцчоиалышй активное™ ai~ингибитора протеиназ, измерявшейся по его способности ннгибировать трипсин (табл. 2).

Дш^тромбнн Ш расщепляется как протеиназой HIV (рис. !, дор. б), -тек и протеиназой HTLV (дор. 7), но если под действием протеиназы HIV образуется несколько фрагментов, то под действием протеиназы HTLV -только два. Пепсин (дор. 8) расщепляет антитромбин значительно глубже, чем протспназа HIV. Интересно, что петлю реактивного центра в йнтнтромбмие III атакует только пепсин (рис. 2), но все три фермента расщепляют связи, расположенные и а-спиральных участках и участках р-

кД» 66-

43— ~ 30- •

ш-

Мг~ 1S-

\ 2 3 -г

5 5 ?

Рисунок 1. Действие протеиназ HIV, HTLV и пепсина на агингибитор протеиназ (дорожки 1—4) и антитроибин III (дорожки 5-8). Результаты диск—электрофореза падролизятов в ПААГ в присутствии 3DS. Дорожки: 1,5 - контроль (без протсиназы);

2.6 - протекши HIV-

3.7 - протеиназа HTLV;

4.8 — пепсин.

. протеиназаH(V Ф *

-ингибитор протеиназ Ala-Gly-A!a-Met-Pha-Lp.u-Gtu-Ala-lle-Pro-Met*Ser-l,d

ISO f ^ f Jit I ко

пепсин протеиназа HIV

:1-ингибитор протеиназ Afä-Gly-Ala-Qlu-Phe-Leu-Glu-Ala-lle-Pro-Arg*Ser-lle M351E/M358R вариант) ф t

пепсин Ч

нтитромбин III Ala-Ala-Ser-T|H-Ala-Val-Val-tla-Ala-Gly-Arg*Ser-Leu

Нкунок Z Пептидные связи, расщепляемые протеиназой HIV и пепсином I петле реактивною центра агингибиторы протеиназ и нтитроибина III. Ф-основные сайты гидролиза, 4 - другие сайты идролиза, *-пептидные связи, взаимодействующие с каталитическим стансом серина протеиназ—мименеи. Использована нумерация мпюкислстшк остатков ар ингибитора протеиназ.

слоев. В работе приводятся доказательства того, что столь глубок, гидролиз является следствием конформациоиной дестабилизации антитромбина Ш в условиях расщепления.

оЛ-Анп!химогфит1Сии и овальбумни (ещё один представитель семейства серников, не являющийся, однако, ингибитором протеиназ) не гидролтуются Ш1 одним из утих ферментов.

Таблица 1. Относительная скорость гидролиза (время полурасщеп-

ленив1, в часах) afUHSuöumopa протеиназ и антитромбина III _______протеиназ ой HIV и пепсином.___

фермент {li) протеиназа H1V пепсин

~ соотношение E.S 1:6. 1:15 1:130 1:7 1:50

субстрат (S)

оц-ингибитор протеиназ <0,25 0,5 3,5 1,0 22

а ингибитор протеиназ НС опр. 0.25 '.5 >22 »22 .

(M351E/M358R вариант)

аититромбш! 111 0,6 не опр. 0,5 0,5 1,0

'-время инкубации фермента и субстрата, необходимое для того, чтобы суммарная интенсивность полос продуктов реакции в ПААГ равнялась интенсивности полосы исрасщешкиного субстрата;

Таблица 2. Расщепленио агинзибитора прот ~шюз протеиназой HIV и

пепсином.

протеиназа содержание нсрасщеплсиного ингибитора, осюточная актов— ность ингибитора,

контроль (без протеиназы) 100 100

протеиназа HIV 6 12

Протеиназа HIV+Ro 31-6959 100 100

пепсин ш 27

пенсии + пепстатии А 100 .100

'—отношение интенсивности полосы иероещоплошюго ингибитора к суммарной интенсивности всех полос в геле, измерялась как способность ингибировать трипсин.

3.2. Расцепление фактороё системы комплемента.

Система комплемента осуществляет лизис попавших в кровоток пкеродных микроорганизмов и состоит из примерно тридцати белков пазмы крови, называемых факторами или компонентами. Кик HIV, так и IV—инфицированные клетки активируют систему комплемента, -по риводит к ковалентной фиксации СЗЬ фрагмеша фактора СЗ на их оверхностн, но, однако, не приводит к их лизису (Socldner et al., I989J. 1ричиной этого феномена может быть, в частности то, что HIV, как и екоторые другие вирусы (Smith, 1994|, обладает- механихмом, бсспечиваюшим расщепление связанного СЗЬ на фрагменты, не имеющие ¡ункциональной ¿асптности, что блокирует дальнейшее развитие каскада омплемента. Интересно рассмотреть возможность такого расщепления СЗЬ од действием nporcuta^i HIV.

СЗЬ состоит из двух полютептидных цепей: 109 кДа f-цепи (она ороче о—цепи ненроцессированного СЗ ш 77 аминокислотных остатков с J-конца) и 70 кДа р-це».и (рис. 3). Высокоочтцснньгй СЗЬ фрагмет-одвсргается расщегшенкю цроггекназой HIV. Фермент атакует связи а— icnn Alagft—Glug7, Leujio-LCU311, His^r-Trp«! и Arg^-Sere», которые юходятся в участках молекулы, наиболее подверженных прогтсолизу (рис. ). В результате образуются фрагменты, сходные с фрагментами СЗс и C3d, :оторые не способны участвовать в образовании литического комплекса

3исунок 3. Расщеплении СЗЬ фрагмента протоиназой WV;4»-Mecra атаки. 1рямоугалы1иками показаны пзясстные протеолитические фрагменты молекулы Mueller—Eberhard, 19S8J.,- Цифры внутри прямоугольников указывают молекулярную массу (в кДа). Особо выделены C3d фрагмент (светлая штриховка) и -Зс фрагмет (тёмная штриховка). Пои-заны также межцепочечные шсульфншыс связи (S-S).

(Muellei— Eberhard, 1988]. Невысокая скорость гидролиза СЗЬ (полны* гидролиз C3t> в течение 17 часов наблюдается лншь при молярно» соотношении фермент—субстрат 1:25 и выше) не позволяет, однако утверждать, что аютшность именно вирусной протеиназы вносит рсшащиЛ вклад в защиту вируса от лизиса системой комплемента хозяина.

В работ»; также показано, что протеиназа HIV расщепляет нативный факгор СЗ и факторы Ç6 н С7. Ни один из этих белков протеиназой HTLV не пщролизуется, а пепсин расщепляет только фактор СЗ и его фрагмент СЗЬ.

3.3. Взаимодействие протеиназы IUV с a-j—макроглобулином (а.2Ы).

к2М ~ нссасцнфический ингибитор протешшз г ех классов, присутствующий в плазме крови человека в высоких концентрациях (2-3 мг/мл). Он состоит из четырёх идентичных полипептидных цепей с молекулярной массой 185 кДа. Первоначально ингнбнрусмая протеиназа гидро;п!зуст одну из пептидных связей а районе—приманке, ч.о активирует тяоэфиряуто связь в активном центре ингибитора, которая реагирует с молекулой протенназы. Протеиназа остаётся активной, но заключенной внутрь "кчетки" а2М таким образом, что доступ белковых субстратов к ней затруднён, и поэтому они практически не расщепляются.

Мы инкубировали протеиназу НГУ с нормальной плазмой человека, 'после чего измеряли активность протыг'ззы по рекомбинантному лолибелку HFV p55~gag. В препарате р55, обработанном плазмой крови без добавления протеиназы (рис. 4. вор. 1), также хах м в исходном препарате р55 (данные не представлены) содержится не только ,р55, но и ряд более коротких гкштетпцдов, реагирующих с антителами к зрелому белку р24. Эти полипептвды могут представлять из себя продукты нсспсцифического протеолиза р55. В отсутствие плазмы крови протеиназа HIV полностью гидролизует р55 и все промежуточные продукты с образованием р24 (рис. 5, дор. 2). Обработка протеиназы HIV нормальной плазмой приводит к потере активности по р55—gag (дор. 3), также как и обработка пептидным ингибитором протеиназы Ro 31-8959 (дор. 5). Активность протеиназы.

|реш1кубироваш<ой с плазмой, подвергшейся предварительной обработке ктшшашом, инактивирующей а2М, (дор. 4), была практически такой же :ак в контрольной пробе (дор. 2). Поэтому очевидно, что ингибировзние ■ротсиназы HIV плазмой крови может быть обусловлено о2М.

Рисунок 4. Ингибирование проте-иназы HIV плазмой крови человека. Иммуноблот, проявленный при помощи антител к "p24-gap; HIV, демонстрирует активность по р55— gag: I — нормальной плазмы; 2 — протсиназь» H1V, 3 — протештзы HIV, инкубированной с нормальной плазмой, 4 — протсиназы HIV, инкубированной с плазмой, обработанной метиламином, 5 — протеиназы HIV, инкубиропатюй с пептидным ингибитором Ro 31—R959.

Для подтверждения образования ковалентных комплексов между ротс1шазой HIV и а2М смесь лротсиназы HIV и плазмы после епродолжителыюй тгкубации анализировалась методом .иммуноблоттинга. л mi сыворотка к а2М реагирует с зоной этого белка (185 кДа) в еобработаиной плазме (рис. 5Б, дор.1), а антисыворотка к протеиназс HIV ■ с зоной протешниы (И кДа), если последняя не подвергалась обработке ормальной плазмой (рис. 5А, дор. 3). Инкубация протейная* HIV с ормалыюй плазмой приводила к появлешто двух ношах зон (110 и 120 Да), реагирующих с антителами к протеииазе HIV, и трёх зон (95, 110 и 20 кДа), реагирующих с антителами к а2М (дор. 2). При этом зоны ротеиназы (11 кЦа) и нерасщеплённого а2М (185 кДа) исчезали. 120 кДа ipameirr представляет соСой, видимо, мономер протсиназы HlV, овалентно присоединённый к С.'—концевой части о2М, которая

кДа_

66J > '

-Р55

; „ «Ц*

'* «г* •

*..........• -А:.—

30_ . "7 ... , ,

га^

1 г з 4 Г

образовалась после расщепления связи Р1»е«м—Тугю$ [\laier с1 а!., 1991 Ат1;аи<±л м а1..1993| в районе—приманке. Появление 110 кДа фрагмент может быть следствием ограниченного расщепления молекулы а2Ь пролеиназой НГУ после ее захвата. 95 кДа фрагмент является, видимо, 1Ч-концевым фрагме1гюм молекулы а2М. 110 и 120 кДа полосы отсутствовали если нротенназа инкубировалась с плазмой, обработанной метила шном, н< 95 кДа полоса наблюдалась отчётливо (дор 5). Это гоьорит о том, что дл образования комплекса прагскназы Н1У с а2М необходимы не тольк расщсплгние района-приманки протсиназой, но и активная тиоэфирна связь в а2М.

кД»

205 _

S5SS

_ii6 _ 97 _

- 66 _

43 _

— 30

— 20 _ ~ 14 _

12 3 4 5 6

1 2

.4 5

J 6

Рисунок 5. Комплексы протеиназы HIV и о2М а ялазие человек

- Иммуноблоты, проявленные при помощи антитсывороток к прогеинаэ HIV (А) и к2М (Б). Дорожки: 1 - нормальная плазма, 2 - нормальна плазма и пропсипаза HIV, 3 — протеиназа HIV, 4 - нормальная плазме протеиназа HIV и пептидный ингибитор Ro 31-8959, 5 — плазма обработанная метиламином, и протеиназа HIV, б - плазма, обработали» метиламином, протеиназа HIV и юпибитор Ro 31-8959.

Одной ми»гуты инкубации протеиназы HIV с плазмой дос! .точно для того, чтобы полностью блокировать последующий гидролиз полнбслка gag. Даже при одновременном смсшсшт плазмы, лротенназы и этого субсграта наблюдается частичное ингибирование фермента. Столь высокая скорость взаимодействия протеиназы HIV с а2М позволяет предположить, что в случае попадают протеиназы в кровяное русло она будет практически сразу же захвачена а2М, а это исключает возможность ее взаимодействия с другими белками в плазме. Это взаимодействие будет, видимо, возможно только во внеклеточном матриксе и на поверхности инфицированной клетки, где протсиназа может быть недоступна действию объёмной молекулы «2 M вследствие стерических затруднений, создаваемых структурами матрикса. Поэтому наблюдавшееся нами in vitm расщепление ингибиторов серинойых протештз и факторов системы комплемента может нгр)^т> лишь ограниченную роль в патогенезе шн)>екнии HIV.

«

Конъюгация белков с а2М вызывает многократное усиление их антигенных свойств [Chu et al., 1994J. Поэтому мы предполагаем, что образование антител к вирусной лротеиназе в организме HIV-инфицировашшх может быть вызвано в основном не свободной протсинаэой, а её комплексами с <х2М.

4. Расщепление балков кп«тки-х<ияина.

Цитопатогешюсть протеипаты HIV при лшической инфекции может быть связана с гидролизом белков щпосхелста ш, например, кальмодулшт — важнейшего регуляторного белка клетки. Показано, чти актин, виментнн и миозин расщепляются вирусной протеиназой в культуре HIV-инфицированньа клеток (Adams et al., 1992; Lindhofer et al., 1992], a микромнъехлия протеиназы в культивируемые клетки лр;шоднт к конденсации хроматина, разрушению напряжённых нитей и коллапсу аиментнновых филаментов (Hocncr et al., 1991).

Мы изучили действие протеиназы HT'V и пепсина на пять внутриклеточных белков, по крайней мере in vitro расщепляемых протсиназой HIV (Shocman et al., 1993} Tomasselli & Hcinrikson, 1994]: актин

(vWHi.itiKift белок тонких филам ентов цитоскелста), вимситин (основной <ч;л'.1К промежуточных фнламентоь), миозин (основной белок толстых ф!с;аменгон), тропомнознн (регулятор!шй белок цтоскслста), и каль-модулнн (основной калышй-с вяишшщий белок клетки, не содержащий, очнако, в условиях расщепления связанных ионов Са2+). Все они i ндроли'ювалнсь нротсимзой HIV и в наших экспериментах. Прогсиназа Н Г'V, однако, расщепляла только три из них: актин, виментин и миозин и не пщролн юаала кальмояулиц и тропомнознн. Пепсин расщепляет акпш, шшентпл , .шомш, тропомиозин, по не атакует кальмодулин.

При действии на миозин, актин, вимешин каждый из трёх срапннвясмых ферментов образует свои, отличный от двух других, набор нолинептндных фрагментов. Так, тяжёлая цепь миозина (205 кДа) расщепляется с образованием 140 кДа фрагмагга под действием протеиназы HIV, 155 кДа фрашеша — под действием протеиназы HTLV, 135 кДа фрашента — под действием пепсина.

При действии протеиназы HIV на щзш (44 кДа) образуется

•V *

несколько мелки фрагментов (рис. 6, дор. 2), а под действием протеиназы HTLV один крупный фрагмет в 41 кДа (дор. 3). Его появление является следствием расщепления связи Pliej2— Ргозз. Пепсин гидродизует актнн . ■бразованнем 39 кДа фрагмента (дор. 4).

При действии лротеннззы .IIV на 57 кДа молекулу ттещица выявляется фрагмет в 40 кДа (рис. 7А, дор. 2), а протеиназы HTLV — в 54 кД (дор. 3). Пепсин расщепляет этот белок на два фрагмента (54 и 44 кДа, дор 4). Молекула виментнна состоит из центрального а-спиральногс, стсржнеобразного домена и глобулярных N— и С— котквых доменов (рис. 7Б). Известно, что прогсиназа HIV в первую очередь атакует С—концевой, а затем и N—концевой домен вимеитина, сохраняя нетронутым центральный домен, которому, видимо, соответствует 40 кДа фрагмент на электрофоре— грамме. Деградация но Эдману смеси вимеитина и протеиназы HTLV, инкубирошншых в молярном соотношении 1:4, показала наличие N— концевых последовательностей виментина и протеиназы HTLV, а также последовательности Pro—Не—Ala—Leu, соответс. дующей остаткам 41—44

кД*

43—^Щ)' •

за_ -

20_ 14-

■tss?

Рисунок 6. Расщепление актина протеина ж» W/V, HTLV и пепсином: Результаты диск—электрофореза лиролизатов в Г1ЛЛГ в присутствии SDS. Дорожка; 1— контроль (без протеиназы), 2— протеиназа HIV, 3— протеиназа HTLV, 4— пепсин.

12 3 4

кДл 66-

43_'

14_

С-? " »

Э .4

Рисунок 7. Расщепление вииентина протаиназаии HIV, HTLV и попсинои.

А. Результаты диск—электрофореза гидро— лизатов в в ПЛАТ присутствии SDS. Дорожки: I— контроль (без протеншзы), 2— преггсиназа HIV, 3— протегчаза HTLV, 4— пепсин.

Б. Схема молекулы с указанием точек атаки: Ф — пролгеиназой HIV (цифры нал стрелками указывают очередность атаки) (Shoeman et al.t 19901; ^ ~ протенназой HTLV (предпалогаемая точка атаки). Нижний ряд цифр обозначает порядковые номера аминокислотных остатков.

2 3 4 фф Ф

^"тотга-

счсржь-оОращыа доисн

1

_ФФ

—1 ш^соон ТГо

н|кутсмназы HTLV. Это позволяет предположить, что, ьо—первых, действие протсиназы H'fLV на вимипин приводит к удалению С—концевого домена (рис. 7Б), который теряет i при расщеплении по Эдману, и, что, во-вторых, протеиназа HTLV одновременно подвергается автолизу по связи Ьеицо—Рго^.

Протеиназа HTLV — регровируса, который не вызывает лизиса юг~ок, расщепляет белки цитоскелета актин, виментин и миозин на порядок-два медлсшее, чем протеиназа литического ретровируса HIV. Так, ни один з этих белков не расщепляется полиостью протсиназой HTLV даже в ходе 17-часовой инкубации при соотношении фермент—субстрат 1:10, в то время как протеиназа HIV в таких же условиях полностью расщепляет эти белки в соотношении 1:100 и ниже. Кроме того, фрагменты виментина и акпша образующиеся под действием протсиназы HTLV, которые значительно крупнее фрагментов, образующихся под действием протсиназы HIV, могут сохранять способность образовывать структуры цитоскелета. Так, например, изучение гидролиза состоящих из виментина промежуточных ¡лмаментов показало, что гидролиз С-концевого домена недостаточен для того, чтобы вызвать разрушение филаментов, необходимо расщепление N—концевого домена (Shocn>an et al., I990J. Поэтому маловероятно, что в цитоплазме HTLV—инфицированной клетки п^д действием вирусной протсиназы может быть достигнута такая степень расщепления белков, которая могла бы вызвать разрушение юггоскелста или отдельных его компонентов.

Наличие у протеиназы исцитопатогенного вируса активности по белкам клетки—хозяина, сравнимой с живностью протеиназы цитопа гогегаюго вируса, свидетельствовало бы пропш того, что вирусная протеиназа может быть фактором цшопатогснности. Мы же наблюдали, что протеиназа исцитопатогенного вируса HTLV значительно менее активна по невирусным белкам, чем протеиназа родственного, но цитопатогенного вируса HIV. На наш взгляд, это может служить дополнительным аргументом в пользу гипотезы о протеииаэе HIV как одном из факторов цитопатогснности этого вируса.

S. Последовательности аминокислот в точках расщеплении как характеристика специфичности лротеиназ.

В настоящей работе идентифициропаны некоторые пептидные связи, расщепляемые протекшими рстровирусов человека в а|—ингибиторе лротеиназ, антитромбине III, СЗЬ и актине. Они приведены в таблице 3. Как видно из этой таблицы, в изучаемых субстратах протсиназа HIV и пепсин предпочтительно гидролизуют связи между гидрофобными шшюкислотньши остатками, но способны также растоплять связи, содержащие зараженные и поля иные остатки в PI и РГ (Arg, Ser, Glu), что

Таблица 3. Пептидные связи, раыцегшяеиые протеиназами HIV, HTLVи

пепсином.

Фермент

Субстрат

Сайт гидролиза Р4 РЗ Р2 Р1 Р1* Р2* РЗ'

Р4'

т^ютеиназа а,-ингибитор лротеиназ

его (M351/M358R) вариант антитромбин III

СЗЬ

Ala-GI/-Alo-Met*Phe-Leu-Glu-Ala ^ly-Ala-Met-Phe*Leu-Glu- А!а- Ile Gly-Ala-Glu-Phe4Leu-Glu- Ala- Ile Ala-Thr-Ala-Phe*Tyr -Gin- His-Leu Ser-Thr-Ala-Phe*Ala -Met-Thr-Lys Hls-Lys-Ala-Phe#Leu-Glu -Val-Asn Thr-Arg- Ile -Leu*Leu-Gln - Gly-Thr Asp- Ile- Ile -Ala *Glu -Glu -Asn- Ile His-Arg- Ile - His*Trp- Glu -Ser -Ala Ser-Leu-Leu-Arg*Ser-GI -Glu -Tnr

юлсик at-ингибитор лротеиназ

его (M351E/M358R) вариант антитромбин III

Gly-Ala-Met-Phe*Leu-Ala-Gly-Ala- Met'Phe Ala-Met-Phe-Leu*Glu-Phe-Leu-Glu- Ala* Ile -Gly-Ala -Glu-Phe*Leu-Ala-Asn-Arg-Leu*Pha Leu-Thr-Val-Leu* Val Ala-Ser-Thr- Ala*Val • Ser-Ser-Lya- Val'Ser

Glu-Ala-Ile •Leu-Glu-Ala Ala- Ile -Pro Pro-Arg-Ser Glu-Ala-Ile Giy-Aep-Lys -Leu-Val-Asn Val -Ile-Ala -Ala-Asn-Arg

1ротеиназа автолиз

■JTLV

актин AT1II • gag HTLV gag HTLV gag-pol HT-V gag-pol HTLV

Met-Thr-Val-Le.u*Pro- Ile -Ala-Leu Arg-Ala -Val-Phe'Pro-Ser- Ile-Val Leu-Thr-Val-Leu*Val -Leu-Val-Asn Pro-GIn-Val-Leu'Pro- Val-Met-His Thr-Lys Val-Leu*Val - Val-GIn-Pro Ala-Seï- Ile -Leu'Pro- Val- Ile -Pro Pro-Val- Ile -Leu*Pro- Ile -Gin- Ala

Гасщенлсние всех связей, за исключением связсП в полиоелках gag и gag-xJ HTLV, устаноатсно в настоящей работе.

согласуется с литературными данными. В положении Р2\ снова в согласии с литературными данными, протсиназа HIV предпо<штаст остатки глутамина и глутамииовой кислоты, а в положении Р2 наблюдается определённое предпочтение к нсароматическим гидрофобным остаткам. Мы не наблюдали предпочтения пепсина к каким—либо аминокислотным остаткам в положениях Р2 и Р2\

Протсиназа HTLV предпочитает остатки прошена в положении РГ, лейцина в Fl, а также валина и изолейцина в положении Pi. Из лтератур.. известно, что протсиназа HIV также способна расщеплять субстраты с пролином в РГ, которые при этом не должны, в отличие от протеиназы HTLV, содержать остатки валина или изолейцина в Р2. Связи между большими шдрофобными аминокислотными остатками, предпочитаемые протриназой HIV и пепсином, видимо, не гидролизуются протеиназой HTLV.

6. Заключение.

Таким образом, в настоящей работе показано, что протсиназа HIV способна расщеплять не только вирусные полибелки и белки клетки-хозяина, но и белки плазмы крови. Проведённое нами сравнение активности протеиназ HIV, HTLV и пепсина по белковым субстратам показало (табл. 4), что протсиназа HIV проявляет большее сходство с пепсином — ферментом, который в физиологических условиях осуществляет неспецифическую деградацию белков, чем с протеиназой HTLV, которая выполняет сходные с протеиназой HIV физиологические функции, осуществляя специфический проггеолиз вирусных полибелков. Из одиннадцати белков, тидролизуемых протеиназой HIV, пепсин гидролизуст восемь, а протсиназа HTLV — лишь четыре. При этом некоторые белки (например, антитромбин III) пепсин гидролизует глубже, чем протсиназа HIV, а гидролиз протеиназой HTLV всегда происходит в меньшей степени, чем протеиназой НГУ.

Следовательно, настоящая работа показывает не только значительные различия , в специфичности протеиназ рсгровирусов человека, обладающих

различной биологической активностью, но и опровергает представление о том, что вес вирусные протсиназы обладают гораздо более уткой специфичностью, чем протеиназы млекопитающих, осуществляющие деградацию белков в организме.

Таблица 4. Активность лротеиназ HIV и HTLVu пепсина по белковый субстратам (сводная таблица).

Субстрат

протеиназа HIV

фермент протеиназа H7LV

пепсин

Серпшнък

оц—ингибитор протеинаэ «ц—антпхимотрипсин антитромбин III* овальбумнн

Факторы системы комплемента:

СЗ

СЗЬ

С6

С7

С5

фактор П

Белкн клетки—хозяина:

кальмещулин вименпш актин миозин тропомиот н

++

++

+ + ++ +

++ ++ ++ ++ ++

+ ++

+ +

+ +

++ + ++ ++

- белок не расщепляется, ++ белок расщепляется,

+ белок расщепляется медленно (менее 50% расщепления в течение!^—22

* часов при молярном соотношении фермент—субстрат 1:50),

* субстрат конформациоиио дестабилизирован в условиях гидролиза.

выводы.

1. Протсиназа HIV способна расщеплять не только иирусныс белки белки клетки—хозяина, ио и внеклеточные белки организма. Он пщролнзуст и viuv при pH 6.0 белки плазмы человека: о^-иигибкто протсиназ («[—антитрнпсин), ангитромбин III, факторы cuctcmi комплемента СЗ, СЗЪ, С6 и С7. Действие нрспеИназы HIV на белки плазм чс-.овека более сопоставимо с действием на них пепсина, чем с действие» протеиназы HTLV. Расщепление этих белков протсиназой HIV in vivo i плазме человека маловероятно вследствие того, что проггеииаза P^V быстр« взаимодействует с содержащимся в плазме кропи aj—макроглобулином образу ковалентные комплексы, кспорыс не проявляют активности ni бел копим субстратам, ^vth комплексы могут способствовать образовании антител к п^итенназе >v организме НIV—инфшшрованных папьентов.

2. Нротеиназа нсцитонатогенного ретроаируса человека HTLV расщепляет три белкп клеткл-хозяина из пяти изученных: актин, виметин и миозин, действуя на них гораздо менее dNJkkthbjío, чем проггеииаза HIV — цитопатогеиного ретровируса. Два других субстрата нротеипазы HIV, кальмодулин и трономиозин, протеиназой HTLV не расщепляются. Эти различия позволяют предположить, «по прстеиназа HIV, и отличие ers прооенназы HTLV, может быть одним из факторов шпопатогенности вируса.

3. Нротеиназа HIV, как и пспсии, предпочтительно гидролизует в изучаемых субстратах связи между остатками больших гидрофобных аминокислот. Протештза HTLV предпочитает пептидные связи с остатками валила и изолейцина в Р2 и пролила в РГ, обычно нсрасщсплясмые протеина той HIV.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор благодарит З.Зслмайер (Ии—i им. Макса фон Петтенкофсра. Ьонхен) за существенную помощь при очистке ферментов и редостаалсние субстрата протеиназы HIV — р55—gag, а также; Р.Мснтеле ia6. клинической биохимии хирургической клиники Мюнхенского ниверситста) за определение N-концевых последовательностей ратоентов гидролиза.

СПИСОК РАЗОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. A.Kissclev & К. von der Helm. Involvement of HIV proteinase in complement :tivation?//J; Canccr Res. Clin.Oncol. - 1993 - v.l 19 - p. S130.

K. von der Helm, S.Seclmcier, A.Kissetcv, H.Nitschko. Identification, irification and cell wolture assays of retroviral proteases.// Meth.Enzymol. — »94 —л.241 - pp. 89-104.

A.F. Kissclev A K. von der Helm. Human immunodeficiency virus type 1 oteinase is rapidly and efficiently inacu -atcd in human plasma by <xi~ acroglobulin.// Biol.Chem.Hoppe—Seyler — 1994 - v.375 - pp. 711-714. A.F. Kissclev, R.Mentele, A. Schulzc <St K. von der Helm. Cleavage of human rpins by HIV-1 proteinase.// J.Cell.Biochem. - 1994 - Suppl. 18D - p. 168. K. von der Helm, A. Kissclev, S.Seelmeij. Proteolytic activity of the HTLV oteinase// J.Cell.Biochem. - 1994 - Suppl. 18D - p. 175.