Нативные и иммобилизованные соевые ингибиторы типа Баумана-Бирк для биомедицинских целей тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.15 ВАК РФ

' /

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.ВЛОМОНОСОВА

Химический факультет

На правах рукописи ~ УДК 577.156.152.

ГЛАДЫШЕВА Инна Павловна

НАТИВНЫЕ И ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ СОЕВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ТИПА БАУМАНА-БИРК ДЛЯ БИОМЕДИЦИНСКИХ ЦЕЛЕЙ

(Специальность 02.00.15 - химическая кинетика и катализ)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: Д.Х.Н. Ларионова Н.И.

МОСКВА - ¡994

Работа выполнена на кафедре химической энзнмологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: д.х.н. Ларионова Н.И.

Официальные оппоненты: д.х.н. проф. Ямсков И. А.,

д.б.н. Белозерский М.А.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН

Защита состоится " / 1994 г. в 16 час. на заседании

специализированного совета Д.053.05.76 в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899 ГСП, Москва, Ленинские горы, Химический факультет МГУ, кафедра химической энзнмологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ

Автореферат разослан" 994 г.

Ученый секретарь специализированного совет» кандидат химических наук

Кост О .А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Активация протеолиза является важным патогенетическим звеном в развитии деструктивных, воспалительных, аллергических реакций, нарушении процессов гемостаза, а также одним из факторов, способствующих инвазии клеток злокачественных опухолей. Наиболее деструктивным ферментом организма признана лейкоцитарная эласгаза (HLE), способная расщеплять практически все компоненты соединительной ткани. В случае патологически повышенной активности протеиназ в организм в терапевтических целях вводят ингибиторы протеолитических ферментов. Актуальность кинетического изучения взаимодействия протеиназ с их белковыми ингибиторами связана с возможностью использования кинетических параметров, измеренных in vitro, для предсказания эффективности антипротеин азных лекарственных средств in vivo. Еще более важной задачей является изучение возможности создания на основе белковых ингибиторов протеиназ нетрадиционных лекарственных средств, используя инженерно-энзимологические подходы, целенаправленно изменяя свойства белка.

Цель и задачи исследования. Целью работы является физико-химическое исследование возможностей биомедицинского применения соевых ингибиторов протеиназ типа Баумана-Бирк (BBI). В связи с этим поставлены следующие задачи:

- Разработка метода выделения и очистки соевых ингибиторов протеиназ.

- Изучение аминокислотного состава, физико-химических и иммунологических свойств выделенных ингибиторов.

- Кинетическое исследование специфичности выделенных BBI.

- Получение .высокоактивных иммобилизованных к модифицированных форм классического соевого BBI, изучение их свойств.

-Изучение фармакокинетики нативного и модифицированного классического соевого BBI.

Научная новизна и практическая значимость работы. 1) Выделены и охарактеризованы как классический BBI, так и новые, ранее неизвестные двухцептровые белковые ингибиторы протеиназ из соевых бобов (богатые глицином, высокомолекулярные ингибиторы), способные подавлять активность трипсина, HLE и химотрипсиноподобных протеиназ. 2) Определены кинетические и равновесные константы процесса взаимодействия выделенных соевых ингибиторов протеиназ с трипсином, химотрипсином, эласгазой и катепсином G гранулоцитов человека. 3) Детальное кинетическое исследование взаимодействия BBI с протеиназами привело к выводу о том, что данные ингибиторы могут быть классифицированы как медленно реагирующие и прочно связывающиеся с протеиназами. А) Проведена дискриминация механизмов инпгбирования протеиназ

классическим соевым BBÍ. Показано, что процесс ингибироагния является двухстадийным. Он включает быстрое образование фермент-ингибиторного комплекса El и последующий медленный переход в более прочный комплекс El*. 5) Продемонстрировано, что классический ВВ1 является эффективным ингибитором эласгинолиза, катализируемого HLE, на разных стадиях протекания этого процесса. 6) Установлено, что с кинетической точки зрения классический соевый BBI в микромолярном диапазоне концентраций может рассматриваться как перспективное эффективное антипротеиназное лекарственное средство. 7) Предложено использовать аффинный сорбент, содержащий классический ВВ1, для выделения KLE из экстракта лейкоцитов как более эффективный по сравнению с традиционно применяемым сорбентом, содержащим панкреатический ингибитор трипсина. 8) Впервые созданы на основе классического соевого BBI модифицированные оксиэтилхрахмалом и блоксополимером окиси этилена и окиси пропилена (прсксансяом) препараты для - потенциального медицинского применения. 9) Выявлено, что модификация классического соевого BBI проксанолом приводит к пролонгированию действия и изменению биораспредеяения препарата.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на Всесоюзных конференциях "Современные методы выделения и очистки биологически активных веществ" (Ялта, 1990), "Ферменты - народному хозяйству" (Черновцы, 1990), "Методы получения, анализа и применения ферментов" (Юрмала, 1990), VII Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимология" (Москва, 1991), Международной конференции "Современная энзимология: проблемы и пути развития" (Санкт-Петербург, 1992), III Симпозиуме "Химия протеолитичеосих ферментов" (Москва, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы (294 наззания). Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 19 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ СВОЙСТВА

СОЕВЫХ ИНГИБИТОРОВ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ

Ингибиторы сериновых протеиназ из дикой сои, трех сортов соевых бобов отечественной селекции: "Крапинка", "ВНИИС-2", "Л-636", сорта "Hodson" и двух образцов коммерческой соевой муки выделяли модифицированным нами методом, предложенным

японскими авторами. Метод включает экстракцию белков сои 60% этиловым спиртом, осаждение ингибиторов семейства Бзумаиа-Бирк ацетоном. Для отделения большей части низкомолекулярных и пигментных вешесгв вместо используемого в оригинале диализа водного раствора белков проводили гельфнльтрацию на сефадексе G-15. Множественные формы соевых ингибиторов протегаш разделяли методом ионообменной хроматографии на СМ-целгаолозе, причем в отличие от оригинала элюировали более основные формы ингибиторов растворами с более высокой ионной силой (рис.1). Для дальнейшей очистки выделенных форм ингибиторов использовали ионообменную хроматографию на ДЕАЕ-Toyopearl 650 М. Результаты типичного выделения соевых ингибиторов типа Баумана-Бирк (обозначенных двумя цифрами, арабская указывает номер пика при хроматографии на СМ-целлюлозе,' римская - на ДЕАЕ Toyopearl 650 М) приведены в таблице 1.

Ингибиторы гомогенны при щелочном диск-элострофорезе в столбиках ПААГ, при капиллярном электрофорезе НРЕ-100 при рН 8,3 и обратнофазовой гидрофобной ЖХВД на колонке Zorbax С8.

Молекулярные массы соевых ингибиторов, определенные методом электрофореза в присутствии додец ил сульфата натрия, меркаптоэтанола и мочевины равны для форм 1-1V, 2-IV 8000±500 Да, дня 3-И, 4-II - 17000±1000 Да.

Значения pl, определенные методом изоэлектро-фокусирования, равны 4,8, 5,5, 6,1 для форм 2-IV, 3-Й, 4-И соответственно.

Аминокислотный состав выделенных ингибиторов приведен в таблице 2. Следует отметить полное совпадение аминокислотного состава ингибитора 2-IV, выделенного из всех используемых образцов сои, с классическим соевым ингибитором типа Баумана-Бирк BBI-A. Ингибитор 1-IV отличается от них на один аминокислотный остаток Ser. Высокомолекулярные формы ингибиторов 3-П и 4-И отличаются от классического BBI-A большим содержанием Gly и малым - l/2Cys.

Рис.1. Ионообменная хроматография соевого экстракта на СМ-целлюлозе СМ-32. Злюент - 5 мМ NaCHjCOO, рН 4,0, (0-0,6) М NaC!.

Таблица 1

Очистка ингибиторов протеиназ из сои сорта "ВНИИС-2 '

Белок, Уд. активность, Выход, Степень

Стадам мг мг Трипсинаакт-, % очистки

заинг. 1 мг бсяха

Обезжиренная соезая мука (300 г)

Экстракт 3900 0,65 100 1

Хроматография на

сефадексе С-15 1600 1 63 1,5

Хроматография на

СМ-целлюлозе СМ-32

пик 1 27 2,33 2.5 3.6

2 150 2,54 15 3,9

3 370 0,9 13 1,4

4 35 1,4 2,0 2,2

Хроматография на

ДЕАЕ-Тоуореаг! 650 М

пик ¿-IV 45 3,1 5,5 4,8

3-И 85 2,5 8,4 3,9

Таблица 2

Аминокислотный состав ингибиторов протеиназ из соевых бобоз

Аминокислота Число остатков на моль

2-IV 3-Й 4-И BBI-A* ВВ-А" SBTí*

Asx 12 16 16 12 16 26

Thr 2 12 12 2 9 9

Ser 8 10 12 8 40 П

Glx 7 24 39 7 31 18

Pro 6 12 14 6 8 10

Gly 0 19 20 0 42 16

Ala 4 12 10 4 13 8

1/2 Çys 14 4 А 14 2 4

Val 1 . 7 5 1 8 14

Met 1 3 3 1 1 2

Ile 2 7 4 2 5 . 14

Leu 2 10 6 2 7 15

JF 2 ' "2 4 2 4 4

Phc 2 2. 1 2 4 9

Lys 5 10 14 5 6 10

His 1 4 4 1 3 2

Arg 2 7 5 2 •4 9

Всего: 71 161 173 71 203 181

*BBI-A (Odani & Ikenaka, 1972), ВВ-А' (Tan-Wilson et al., 1987), SBTI (Koide & Ikeaaka, 1973)

От соевого ингибитора типа Кунитца (SBTI) формы 3-11 и 4-11 отличаются значительно большим содержанием остатков Glx, значительно меньшим количеством остатков Asx и алифатических гидрофобных аминокислот. Подобные ингибиторы, например ВВ-А', были выделены Tan-Wilson et al, 1987 и охарактеризованы как богатые глицином ингибиторы типа Баумана-Бирк. Иммунологическое исследование выявило значительные структурные различия белковых глобул традиционных BBI (1-IV и 2-IV) и выделенных нами богатых глицином (3-II, 4-II) форм соевых ингибиторов протеиназ.

2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ СОЕВЫХ ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ, МЕХАНИЗМ И ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНГИБИРОВАНИЯ

2.1. Спектр ингибирующего действия соевых ингибиторов протеиназ

Все выделенные нами ВВ1 способны подавлять активность трипсина, а-химотрипсина, лейкоцитарных эластазы и катепсина С и не действуют на свиную панкреатическую эласгазу. Высокомолекулярные богатые глицином формы 3-11 и 4-11 отличаются по специфичности от форм, подобных ВВ-А', выделенных американскими исследователями, поскольку последние ингибируют лишь трипсин.

Для классического ингибитора 2-1У показано, что он способен одновременно и независимо связывать трипсин на одном, а а-химотрипсин (НЬЕ, катепсин О на другом реактивных центрах. Комплекс трипсин-ВВ1(2-1У) ингибирует о-химотрипсин/НЬЕ без увеличения активности трипсина (рис.2).

£ ' о.

: Н

. О .2

в

-. о ' я

I .. - 10 _13 ... яо

Рис.2. Кпнетика ингибирования ' а-химотрипсина^ _ комплексом трипсин-2-1У. Условия: смесь эквимолярных концентраций (34 нМ) трипсина и ВВ1(2-1У) инкубировали при рН 7,8; 25°С, через 15 мин добавляли 34 нМ химотрипсина.

2.2. Кинетические параметры взаимодействия множественных форм соевых ингибиторов с протеиназами

Большинство белковых ингибиторов сериновьи протеиназ взаимодействуют с протеошггическими ферментами по "стандартному механизму" (схема I) (Laskowski & Каю, 1980):

Е + I • + Е

(1)

где I » Г* - иатпвный ингибитор и ингибитор с расщепленной пептидной связь» в реактивном центре (модифицированный) соответственно; Ь и Ь* - непрочные комплексы типа Михаэлиса ме;:<ду протеиназой и нативным и модифицированным белковым ингибитором соответственно; С - стабильный комплекс.

Модифицированные формы бсяксвых ингибиторов могут быть получены при рН меньше 2 и каталитических количествах фермента. При рН>4,5 равновесле едчлнуто в сторону образования прочного комплекса С, промежуточный комплекс Ь присутствует лишь в незначительных концентрациях, [Ь]«[С]. Принимая во внимание все сказанное выше, схема (!) может быть упрощена следующим образом: кас

Е + I —-Е1 (2)

¿ВИС

где /сас - кажущаяся "константа скорости реакции ассоциации фермента с белковым ингибитором, кЯК - кажущаяся константа скорости реакции диссоциации стабильного комплекса. Величины констант ингибирования (К^) и кинетических констант взаимодействия соевых ингибиторов сернновых протеиназ (табл.3) определены следующим образом: а) рассчитаны из кривых титрования протеиназы ингибитором (1ч); б) путем изучения скорости установления равновесия при одновременном присутствии фермента, ингибитора и субстрата (/см, К,) (рис.3);

Р = У5Н^0-У5)(1-схр(-Ахаж1)]/Л1саж+с1 (3)

где Р - текущее значение концентрации продукта реакции (или соответствующее ей значение оптической плотности); У0 - начальная скорость реакции; - стационарная скорость; с! - отклонение Р от нуля при 1 = 0;

^аЖ = ^к+Л«с[1)/(1+[5]/Кт) (4)

^ = (5)

где Ус - контрольная скорость гидролиза субстрата в отсутствие ингибитора;

^ = [1]/(У</^-!Ж!+[3]/^ (6)

в) как константа скорости необратимой реакции второго порядка (/сас);

г) путем изучения кинетики смещения равновесия (2) в сторону диссоциации комплекса под действием субстрата (А:дае).

В соответствии с данными таблицы 3 классический ВВ1(2-1У) является значительно более эффективным ингибитором изученных сериновых протеиназ, чем выделенные нами высокомолекулярные глицин-богатые ингибиторы 3-11 и 4-И. Что касается специфичности ингибиторов, то очевидно, что ВВ1(2-1 V) наиболее специфичен к трипсину, в то время как -химотрипсин, НЬЕ и катепсин в он ингибирует с примерно одинаковым сродством, которое в 20-100 раз ниже, чем для трипсина. Высокомолекулярные формы демонстрируют

сравнимое сродство хс всем перечисленным выше лротемназам, т.е. ягляются малоспецифичными ингибиторами. На основе полученных К, и кпс сериновых прогенназ изученными ингибиторами можно сделать вывод о том, что классический соевый ингибитор ВВ1(2-1У) относится к классу медленно-реагирующих прочно связывающихся, а иигябмторм 3-11, 4-11 - к классу медленно-реапгрующш ингибиторов протеингз.

Рис.3. Кинетика гидролиза МеОЗисА1аА1аРгоУа1рНА, катализируемого НЬЕ, в присутствии ВВ1 (2-1У): [Е]0 = 4,3 нМ, р]0 = 1,0x10-4 М, [Цо = 0(0), 30(1), 40(2), 50(3), 60(4), 70(5), 80(6) нМ, 0,1 М Нере$; рН 7,5; 0,5 М ИаС1; 0,005%Тр::тон Х-100.

Таблица 3

Константы ингибирования и кинетические параметры взаимодействия протеиназ с множественными формами соевых ингибиторов

ВВ1 Е К|, М Ьг, М-'с1 к с1 «■«иг» ^

2-1У Т а-Х НЬЕ КС (1,4+0,2)10-10(6) (6,4±0,6)10-'(б) (2,0+0,4) Ю-'(б) (1,2±0,2)10-'(а) (1,1±0,2)10«(б) (2,0±0,3)105(б) (3,7±0,5)10<(б) (6,4±1,0)106(в) (4,2±0,7)1(Н(б) (2,3±0,3) 10-3(6) (1,0+0,3)10-«(б) (8,0+1,2)10-"(г)

3-И Т а-Х НЬЕ Кв (2,0x0.4)10-8(2) (2,1±0,3)10-«(б), (1,1±0,2)10-7(б) (8,0+1,ЗМО-«('а) (2,8±0,4) 1(Р(б) (2,2+0,3)103(6) (6,041,0)10-5(6) (2,4±0,4)10-0(6)

4-И Т а-Х НЬЕ (1,2±0,2)10-5(6) (3,0±0,5)10-'(б) (1,4±0,2) 10-7(6) (5,1±0,7)104(б) (1,3+0,2)103(6) (1,0±0,2)1(Н(б) (6.0+1,0)10-^(6) (3,9+0,6) 10-^(5) (1,4±0,2) 10-3(6) (8,7+1,2)10-3(г)

Т - трипсин быка, а-Х - а-химот?кпсин быка, К С - катепсин О гранулоцитов Человека.

2.3. К вопросу о формально-кинетическом механизме взаимодействия классического соевого ингибитора типа Баумана-Бирк с сериновыми

протеиназами

Принято считать, что ""механизм взаимодействия белковых ингибиторов с протеиназами довольно детально изучен. Однако, в последние годы рядом авторов продемонстрировано, что каждая конкретная пара протеиназа-белковый ингибитор имеет свои особенности взаимодействия, заключающиеся в разном числе стадий в классической схеме Ласковского.

Ингибирозание протеиназ белковыми ингибиторами, принадлежащими к классу медленно ззаимодейсгвующих- прочно связывающихся, может быть описано двумя механизмами. Механизм А является одностадийным, при котором фермент-ингибиторный комплекс образуется медленно. Механизм" Б - двухстадийным и включает быстрое образование комплекса Е1 и последующий медленный переход его в более прочный комплекс ЕГ. На практике эти два механизма трудно различимы. Однако некоторые объективные кинетические данные позволяют склониться к одному из механизмов.

Е + 1. 1 ЕГ Механизм А

медленно

Л, /<з

Е + 1 Е1-. 'ЕГ Механизм Б

/с2 Л-4

медленно

Для выбора между механизмами А и Б следует принять во внимание, что наиболее простой механизм А является диффузионно-контролнруемым. Однако, полученные нами константы бимолекулярных реакций ВВ1 с протеиназами, лежат в пределах 1х1(И-1x106 М-'с-1 (табл. 3), что намного ниже констант скоростей реакций, контролируемых диффузией.

Важным свойством, позволяющим различить механизмы А и Б является зависимость начальной скорости (У0) ингибируемой реакции от концентрации ингибитора ([Ц0). Для механизма А У0 не зависит от [1]0 и равна скорости в отсутствии ингибитора. Из веера кинетических кривых (рис. 3) наглядно видно, что V,, зависит от [1]0 и отлична от скорости неингибируемой реакции. Это соответствует механизму Б.

Недавно предложен дополнительный метод дискриминации механизмов А и Б (ТБао, 1989). Механизм А описывается интегральной зависимостью концентрации продукта от времени, содержащей одну экспоненту (ур-е (3)), а механизм Б - интегральным-уравнением, в которое входит одна или две экспоненты (ур-я (3) и (7)) '

Р = У51+<*-С,ехр(-г,1)-С2ехр(-г,0 (7)

Р"—'

1 стаи

О количестве стадий можно судить по Еиду зависимости натурального логарифма разности концентрации продукта в стационаре н наблюдаемом концентрации продукта от времени. Отклонение от линейной зависимости для системы ВВ!(2-1У)-НЬЕ позволяет предположить 2-х стадийный механизм процесса ннгнбирования (рис.4). Следовательно, измеряемые константы скоростей кгс и ктс (табл.3) представляют собой эффективные величины, состоящие из микроскопических констант.

Рис.4. Зависимость 1п(Рстгщ - Р) от времени для системы HLE-BBI.

Нами были рассчитаны констангы скоростей элементарных стадий процесса взаимодействия BBJ с зла стаз ой лейкоцитов к3= =1,2х10-9 с-! и /c4=i,0xlО*4 с1, K¡=2,8х10-8 М - первого равновесия и общая константа равновесия - K¡*=2,3xl0-9 М. Видно, что константа первого равновесия достаточно мала, и стабильный комплекс ЕГ имеет константу дпссоции лишь на порядок более низкую. Полученные значения кинетических и равновесных констант хорошо согласуются с расчгггактдми ранее значениями /<ас=/<4/Кр4,2х10' М-'с-' и K¡, исходя из предположения одностадийносги процесса (л. 2.2. табл. 3).

Отметим,- что существует не так много систем протеипаза-белковый ингибитор, для которых определены константы скоростей элементарных стадий.

2.4. Ингибирование гидролиза эластина, катализируемого HLE, классическим соевым ингибитором Баумана-Бирк

Исследование способности соевых BBI тнибировать гидролиз природных субстратов, катализируемый HLE, до сих пор не проводилось, а именно способность подавлять гидролиз эндогенных субстратоз является определяющей при рассмотрении эффективности ВВ1 в условиях in vivo.

Гидролиз эластина HLE описывается кинетической схемой (8), предложенной Robert (1974).

Е + S==^ES-=^ES*—"Е + Р (8)

На первой стадии происходит быстрое обратимое образование комплекса ES с последующей медленной обратимой изомеризацией его

в комплекс ЕБ* (при этом возможны конфориационные изменения эластина, увеличивающие локальную концентрацию пептидных связей, доступных НЬЕ). Гидролиз эластина на этих двух стадиях очень незначителен. На третьей стадии эластинолиз протекает со стационарной скоростью. Из рассмотренной схемы следует, что эффективность ингибирования эластинолгаа может зависеть от предадсорбции фермента на субстрате и от того, на какой стадии был введен ингибитор. Нами показано, что классический ВВ1(2-1У) эффективно ингибирует гидролиз эластина, катализируемый НЬЕ, как при одновременном введении фермента и ингибитора, так и в условиях предварительной адсорбции НЬЕ на эластине (рис.5). Эффективность ингибирования сохраняется при высоких степенях гидролиза эластина.

5 W 1S 20

1Чо. Í.1K.M

Рис.5. Ингибирование гидролиза эластика HLE BBI(2-iV):

кривая 1 - без предварительной адсорбции HLE на эластине;

кривая 2-е предварительной адсорбцией HLE на эласткяг.

[HLE] = 10-6 М; [эластин] = 20 мг/мл; 0,05 М Трис-HC!, pH 8,0, 0,15 М

NaCi, 37вС.

2.5. Оценка эффективности действия классического соевого ингибитора типа Баумана-Бирк in vivo

Кинетические параметры, описывающие взаимодействие протеиназ с их белковыми ингибиторами, измеренные в системах in vitro, могут быть использованы для предсказания эффективности антипротенназных лекарственных средств in vivo. Согласно теория, развитой Bieth (1980, 19S4) и Baici (1988), для того, чтобы ингибитор был эффективен in vivo, он должен связывать целеаые протеиназы очень быстро и практически необратимо. Условиями псевдонеобратимости процесса ингибирования, подчиняющегося схеме (2), являются: [í]o,'[E]o=!0; [I]o/K¡>1000. Тогда процесс ассоциации белкового ингибитора с протеиназой можно рассматривать как реакцию псевдопервого порядка с константой скорости./сгс*[1]а. Знание величины кк позволяет рассчитывать время, необходимое для практически полного ингибирования протеиназы, t99»/0.'

t99%=7n1/2=0,693/(/cac*ÍI]o)=5/(¿ac4i]o) W

Основной функцией ингибиторов протеиназ in vñ-o является защита биологических субстратов от действия внезапно освобождающихся протеиназ. Степень гидролиза белкового субстрата ([Р|»*№]о) за время, необходимое для практически полного ингибировання протеиназы, равна:

Mj.=(W[E].*tW5 0°)

Степень гидролиза субстрата под действием трипсина и химотрипсина рассчитана, используя величины К„ для активации трипсиногена и химотрипсиногена (Garcia-Moreno a al., 1991). В качестве сывороточного субстрата HLE и катепсина G рассматривали JgG3 человека (Baíci et al., 1980).

Как видно из таблицы 4 выделенный нами BBI(2-IV) в концентрации 10 шМ за время 14,3 с, кроме химотрипсина и трипсина, практически полностью ингибирует HLE и катепспн G. Причем гидролиза нерастворимого субстрата HLE - эластина за время менее нескольких минут вообще не происходит, а гидролиз сывороточных белков за время ингибировання также крайне незначителен. Таким образом, тлассический ВВ1 может рассматриваться с кинетической точки зрения как потенциальное эффективное аятипротеиназное лекарственное средство.

Таблица 4

Степень гидролиза субстрата ([PlswJ/[S]0) за время полного

ипгибиросгния и tWc протеиназ под дейсгвкем BBI(2-IV) в концентрации 10 мкМ

Протеиназа* [PlmJ/fSJo,%

Тркпсин 0,00002 0,5

а-Химотрипсин 0,0001 2,5

HLE 0,0018 14.3

Катепсин G 0,00032 0,08

*[Е]о=0,1 мкМ соответствует концентрациям протеиназ в поджелудочной железе и сыворотке крови, 'освобождающихся при остром панкреатите.

3. ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ КЛАССИЧЕСКОГО СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТИПА БАУМАНА-БИРК

Нами разработаны два типа препаратов иммобилизованного классического ВВ1: нерастворимое производное ВВ1(2-1У) для аффинной хроматографии и водорастворимые высокомолекулярные производные, характеризующиеся длительной циркуляцией в кровотоке и изменением биораспределения.

3.1. Аффинная хроматография эластазы гранулсцитов человека

Низкое значение К, комплекса ВВ1(2-1У) и НЬЕ позволяет предположить, что классический ВВ1 может служ1ггь более эффективным аффинным лигандом для выделения эластазы из экстракта лейкоцитов, чем обычно используемый для этой цели основной панкреатический ингибитор трипсина (ВРТ1) с ^=3,6x10-« М.

Результаты выделения представлены в таблице 5 и на рис.6 (для сравнения: препарат НЬЕ, полученный нами хроматографией на ВРТ1-сефарозе, имел удельную активность почти вдвое ниже -5,4 мкмоль/ыин.мг, степень очистки 53 и выход активности 68 %)..

Титрованием полученного препарата НЬЕ 1-протеиназным ингибитором, ВВ1(2-1У) и азапептидом АсА1аА1аА1аАп1ерИРЬ показано, что содержание активного фермента в нем составляет около 100%.

Рис.6. Аффинная хроматография экстракта лейкоцитов ВВЬсефарозе. А - 0,05 М Трис-НС1, рН 7,8,1 М ЫаС1,0,1% бридж-35, В - 0,05 М №СН3СОО, рН 5,2, 1 М ЫаС1,0,1% бридж-35, С - 0,05 М ЫаСН3СОО, рН 4,5, 1 М ИаО, 0,1% бридж-35, 20% изопропанола.

Выделенная по приведенной выше схеме НЬЕ представляет собой смесь четырех изоформ и не содержит балластных белков, что доказано методом электрофореза в 7,5 % полиакрипамидном геле (рН 4,5) с окрашиванием белка в геле Кумасси 11-250 и по ферментативной активности, используя в качестве субстрата

2-А1а-2-(Жар (окрашивание проводили гранатовым прочным).

Таким образом биоспецифический сорбент, содержащий классический ВВ1, позволяет за одну стадию выделить НЬЕ из экстракта лейкоцитов с выходом в 1,5 раз большим и степенью очистки в 1,3 раз выше, чем используемый обычно сорбент тразилол-сефароза.

Таблица 5

Выделение HLE из экстракта лейкоцитов на BBI-сефарозе

Белок, Активность HLE

Стадия мг общая. удельная, Выход, Степень

мкмоль/ мкмоль/ % очистки

мин мин-мг

Экстракция 112 16,0 0,14 100 1

Аффинная

хроматография 1,54 16,0 10,4 100 70

на BBI-сефарозе

3.2. Конъюгирование классического соевого ингибитора Баумана-Бирк с водорастворимыми полимерными носителями

Классический соевый BBI изучается пока лишь в эксперименте в качестве эффективного средства при лечении эндотоксемии и злокачественных новообразований, так как обладает способностью в нетоксичных концентрациях подавлять трансформацию клеток in vitro и канцерогенез в модельных системах на животных. BBI удовлетворяет всем критериям, позволяющим использовать ингибитор в качестве идеального антиракового агента: химически стабилен, имеет сравнительно небольшой молекулярный вес, способен ингибировать химотрипсиноподобные протеиназы и процессы сгущения крови, способен интернализоваться клеткой. Однако при оральном и внутривенном введении нативный BBI быстро выводится из организма животных через почки, и лишь незначительное количество введенного BBI достигает органов-мишеней. Можно ожидать, что получение макромолекулярных производных BBI приведет к пролонгированию его нахождения в кровотоке и изменению биораспределения.

3.2.1. Синтез конъюгатов классического соевого ингибитора типа Баумана-Бирк с блоксополимером окиси этилена и окиси пропилена

В данной работе проведена модификация BBI(2-IV) моноальдегидным производным полиэфира - блоксополимера окиси этилена и окиси пропилена (РЕ) (проксанола М.М. 2 кДа) со следующей структурой:

СН3

C4H90(CHCH20)I4(CH2CH20)MCH20H Блоксополимер является поверхностно-активным дифильным соединением, которое может встраиваться в биологические мембраны и. проникать через них. Ранее было показано, что РЕ обладает иммуномодуляторными и противоопухолевыми свойствами в наномолярных концентрациях.

При осуществлении поставленной цели - создании препарата, обладающего более высокой биологической активностью in vivo, нами было учтено, что антиканцерогенная активность ВБ1 связана с его антихимотрипсиновым центром. При использовании метода восстановительного алкилирования для получения конъюгата нативного BB1(2-IV) с сополимером отсутствует возможность непосредственной химической модификации этого центра, однако стерическое экранирование этого центра возможно. В связи с этим, была предпринята попытка защитить данный центр, модифицируя для сравнения как нативный ингибитор, так и комплекс BBJ(2-IV)- с химотрипсином. Удаление избытка проксанола представляет серьезную задачу в связи с его способностью взаимодействовать с полимерными цепями конъюгата. В случае модификации нативного BBI для отделения от избытка сополимера и неакгипнсго белка нами впервые предложен метод аффинной хроматографам на трипсин-агарозе (рис.71.

Рис.7. Хроматографическое выделение конъюгата BBI-PE на трипсин-агарозе.

А - 0,05 M Трис-HCl, рН 6,0,

В - lxlO-4 M СН3СООН, рН 4,0,

С - 0,1 M СН3СООН, 20 % изопропанол, рН 2,0.

Гомогенность полученного конъюгата и отсутствие в нем немодифицированного белка показана методом обратаофазовой ЖХВД. Для доказательства отсутствия в конъюгате примеси сополимера использовали метод тонкослойной хроматографии.

При модификации комплекса BBI- химотрипсин в процессе очистки используются две стадии. Избыток проксанола удаляли методом гельфильтрации на Toy opear! HW-40, применяя в качестве элюента 20 % этанол. Конъюгат BBI-химотрипсин-РЕ разрушали при рН 1,5. Путем гельфильтрации на колонке с сефгдексом G-75 удалось провести полное разделение таким образом полученного конъюгата (ВВ1„Щ-РЕ) от химотрипсин-РЕ (рис.8).

Состав конъюгзтов рассчитан на основе'определения белка и аминохислотного анализа. Оба конъюгата содержат по пять цепей сополимера на молекулу белка.

А280 0.5

0,25

200

400 V.vm

Рис.8. Разделение химотрипсин-РЕ и BBIilin-PE при гель-хроматографии на сефадексе G-75 (3,5x45 см). Элюент - 0,01 M уксусная кислота, рН 4,0.

3.2.2. Синтез конъюгата классического BBI с оксиэтнлкрахмалом

Второе высокомолекулярное производное BBI(2-IV) получено при модификации ингибитора оксиэтилированным крахмалом (HES), М.М.100-160 кДа, который широко используется в США и Японии в качестве кровезаменителя при шокзх и эндотоксемии. Именно при этих заболеваниях нативный BBI был эффективно использован в экспериментах на животных Фритцем. HES имеет время полужкзни 24 часа, ои расщепляется амияолитическими ферментами и полностью выводится из организма лишь через 30 дней.

Синтез конъюгатов BBI с HES проводили путем активации носителя хлористым циакуром. Модиф1щированный препарат отделяли от непрорея тировавшего нативного белка хроматографией на неуглсводком носителе Toyopearl HW 60. Производные, содержат небольшое количество белка в препаратах (3 и б мг/г). Это связано с тем, что при ■ данном методе синтеза, происходит поперечное связывание макромолекул носителя между собой как на стадии активации, так и через макромолекулу беяха, содержащую в случае BBI шесть аминогрупп и две гидроксильных группы остатков тирозина.

3.2.3. Изучение антипротеиназного действия конъюгатов BBI

Для того, чтобы модифицированный 331 был эффективным лекарственным средством, в нем должно быть сохранено янгибирующее действие катанного белка.

Константы ингибирования серинопых протеипаз конъюгатами BBI с HES и РЕ, определенные из кривых титрования протеиназы ингибитором или путем изучения скорости установления равновесия при одновременном присутствии фермента, ингибитора и субстрата, приведены в таблице 6. Значения величин К; изученных протеиназ для конъюгатов показывают, что хотя эффективность ингибирования

уменьшается в процессе модификации, иммобилизованные препараты ингибитора остаются довольно сильными антипротеиназными агентами. В отдельно»; эксперименте показано, что конъюгаты ВВ1-HES сохраняют способность к одновременному связыванию трипсина и HLE. Полученный результат говорит о достаточной пространственной доступности BBI в составе котлогата с HES. Этот вывод подтверждается тем фактом, что конъюгат BBI-HES способен реагировать с антителами к нативному ВВ1, что свидетельствует о сохранении антигенных детерминант при модификации ингибигора HES.

f Таблица 6

Константы ингибирования протеиназ нативным и • модифицированными BBI 2-IV

Препарат ингибитора Кол-во белка в препарате мг/г преп. Kj.M

трипсин а-химотрипеш: HLE

BBI 1000 1,0x10-ю 6,4x10-? 2,0x10-9

BBI-PE 350 1,0x10-5 4,0x10-* 1,2x10-7

ВВ1МЩ-РЕ 350 1,0x10-'° 7,0x10-« 3,0x10-8

BBI-HES 3 2,0х10-7 2,0x10-7 1,2x10-7

BBI-HES с 4.0x10-' 2,0x10-7 3,0x10-7

Антипротеиназкая активность конъюгатоЕ BBI-PE в целом более высокая, чем BB1-HES конъюгатов. Некоторое увеличение К; ферментов, взаимодействующих с актихимотрипсиновым центром модифицированного ингибитора может быть объяснено на основе предполагаемого строения BBI-PE коныогггов. Модель конъюгата построена нами на основе данных р?нтгеносгруктурного анализа и ЯМР нативпого BBI и наших экспериментальных данных с конъюгатами (рис.9). Особенности строения нативной белковой глобулы ингибитора состоят в том," что на поверхности BBI экспонировано большое количество гидрофобных аминокислотных остатков, гидрофобный инкремент которых значительно больше, чем у пропиленоксидных блоков проксанола. Суммарная 1шощгдь экспонированных гидрофобных остатков, сконцентрированных в антримотрипсиновом домене и интердоменной области, составляет 87 А2. Столь мощные гидрофобные участки _ притягивают к себе полипропиленохеидные блоки проксанола, что может приводить к уменьшению гидрофобности белка в процессе модификации. Результаты HPLC подтверждают • это предположение. Модифицированный BBI элюируется с гидрофобной колонки значительно раньше нативного. В результате гидрофобных взаимодействий цепей сополимера и BBI происходят некоторые

структурные изменения в молекуле белка. Изучение вторых производных спектров поглощения нативного и модифицированного белка демонстрирует изменение экспонированности одного из двух тирозинов, входящих в состав классического BBI. Наши данные и предстапленная модель конъюгата согласуются с известными из литературы данными, что антахимотрипсиновый активный центр BBI более чувствителен к структурным изменениям, чем анпггрипсинсвый.

Значение Kj трипсина практически не изменилось при модификации BBI(2-IV) проксанолом, то есть остаток Lys, входящий в антитрипсиновый активный центр ингибитора, не участвовал в реакции восстановительного алкилнрования. Этот факт может быть объяснен способностью нативного ингибитора к самоассоциации в условиях синтеза.

Рис. 9. Схематическое строение BBI-PE конъюгата

Несмотря на то, что BBI,ain-PE несколько более активен, чем ВВГ-РЕ, мы считаем, что в данном случае предварительная защита антихимотрипсинового центра в полной мере не оправдывает себя, а в значительной мере усложняет процесс синтеза и очистки. Кроме того, количество цепей полиэфира одинаково в этих двух конъюгатах. Поскольку для антиканцерогенного действия BBI большое значение имеет его способность ингибировать химотрипсиноподобные протеиназы, конъюгат BBI-PE, синтезированный оптимальным 'способом и обладающий значительным антихимотриптическим действием, может рассматриваться в качестве потенциального противоопухолевого средства.

3.3. Фармакокинегика нативного и модифицированного полиэфиром препаратов классического ВВ1

Несмотря на то, что исследования противораковой активности ВВ1 проводятся длительное время, фармакокинетнканптивного ВВ1 и его производных у животных изучена слабо. В связи с этим нами совместно с сотрудниками Государственного НИИ оргеничссксй химии и технологии д.мед.н. Горбатовой Е.Н., с.н.с. Полехиной О.В., вед.инж. Окаемовым М.И. бьша изучена фармакокикеппсз у мышей как нативного ВВ1 (2-1V), так и ВВ1-РЕ, и проведен статистический анализ полученных данных. На рис.10 представлена динамика изменения концентрации меченого белка в крови хшшсй при введении нативного и модифицированного ВВ1.

■10' С, ыкг/ыл

2} К Я № МИНУТЫ '

Время после введения препаратов

Рис.Ю. Выведение препаратов ВВ1(-о-) и ВБ1-РЕ (-о-) из кровотока мышгй после однократного внутриБСнкого введения препарата в дозе 3 мг белка/кг. Сплошные линии - теоретические распределения.

Начальное распределение ВВ1 и ВВ1-РЕ в организме иышей происходит одинаково быстро. Через 30 минут после введения препаратоз их концентрация в крови примерно одинакова, ио дальнейшая элиминация препаратов происходит с существенно различающимися скоростями. В результате, через сутки ВВ1

регистрируется в крови в следовых количествах, в то время как ггондагграция ВВ1-РЕ через сутки лишь в 2 раза ниже, чем через 30 у.чнут. Ввиду того, что BBI-PE значительно медленнее элиминируется из системы, его среднее время пребывания в организме животных (MRT) в 7,5 раз выше, чем для BBI. Конъюгирование с сополимером приводит к уменьшению удельного клиренса в 5 раз. Отношение площадей под фармакокинетическими кривыми "концентрация в крови - время" (AUC), характеризующее сравнительную системную биодоступность BBI-PE по отношению к BBI, равно 5,4. Тканевая доступность для почек, • измеренная как отношение площади под фаомакокинетической кривой в почках и крови, уменьшилась в 4 раза (рис.11).

MRT, мин

Ул. клиренс, мл/мин-г

2220

0,00075

293

BBI

BBI-PE

АИС,ф0ВЬ, мг/мл-мин

857

BBI ВВ1-РЕ

АИСпочи/АИОфо вь

2.1

BBI

BBI-PE

BBI

BBI-PE

Рис.1!. Фармакокинетика BBI-PE конъюгата (мыши).

Таким образом, на основании сравнительного анализа значений интегральных фармакокинетических параметров распределения двух форм ВВ1 у мышей можно заключить, что наличие полиэфирных цепей в структуре конъюгата существенно улучшает медико-биологические свойства препарата, увеличивая продолжительность пребывания ингибитора в организме животных и изменяя его биораспределение в органах.

выводы

1. Выделены двухцентровые ингибиторы протеиназ из соевых бобов, как классический ингибитор типа Баумана-Бирк, так и новые, ранее неизвестные (богатые глицином, высокомолекулярные формы). Изучен их аминокислотный состав, физико-химические и иммунологические свойства.

I. измерены кинетические и равновесные константы взаимодействия выделенных соевых ингибиторов протеиназ с трипсином, а-химотрипсином, эласгазой и катепсином О лейкоцитор человека. На основе величин констант ингибировакия и констант скоростей ассоциации с протеииазами классический соевый ингибитор типа Баумана-Бирк отнесен к классу медленно-реагирующих прочно связывающихся, а богатые глицином высокомолекулярные формы - к классу медленно-реагирующих ингибиторов протеиназ.

3.Проведена -дискриминация механизмов ингибирования сериновых протеиназ классическим соевым ингибитором типа Баумана-Бирк. Кинетическими методами показано, что процесс ингибирования является двухстадийным. Для системы классический ингибитор типа Баумана-Бирк' - эластаза лейкоцитов человека определены константы скоростей элементарных стадий, константы первого и общего равновесия.

4. Показано, что с кинетической точки зрения классический соевый ингибитор типа Баумана-Бирк может рассматриваться как потенциальное эффективное лекарственной средство.

5. Показано, что классический ВВ1 является эффективным ингибитором эластинолиза на разных стадиях протекания этого процесса.

6. Предложен новый метод выделения эластазы гранулоцитов с использованием биоспецифического сорбента, содержащего классический соевый ингибитор типа Баумана-Бирк.

7. Синтезированы и охарактеризованы водорастворимые высокомолекулярные производные классического ВВ1 - конъюгаты ингибитора с блоксополимером окиси этилена и.окиси пропилена и с плазмозаменителем - оксиэтилхрахмалом. Показано, что модифицированные препараты являются эффективными антипротеиназными агентами.

8. Продемонстрировано, что кокъюгирование классического ВВ1 с проксанолом улучшает медико-биологические свойства белкового ингибитора, изменяя его распределение в органах. Конъюгат ВВ1-РЕ циркулируют в системном кровотоке в большем количестве и более длительное время.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Ларионова Н.И., Гладышева И.П. "Растительные ингибиторы протеиназ семейства Баумана-Бирк"// Новости науки и техннки. сер. Биотехнология. М.:ВИНИТИ. 1990. вып.З. С.20-80.

2. Ларионова Н.И., Гладышеза И.П.,. Тихонова Т.В., Вартанов С.С., Галю:: М.А., Карасева ГЛ. Полисахаридные производные соевого ингибитора протеиназ типа Баумана-Бирк в качестве аффинного сорбента и пролонгированного антипрокхзлятика. // Всесоюзная научно-практическая конференция "ферменты - народному хозяйству". Тез докл. Черновцы. 1990. С. 132.

3. Тихонова Т.В., Гладышева И.П., Ларионова Н.И., Галюк М.А., Карасеза ГЛ., Казанская Н.Ф. Сравнительная характеристика методов выделения эласгазы из лейкоцитов крови человека. // Всесоюзная конференция "Методы получения, анализа й применения ферментов". Тез докл. Юрмала. 1990. С.44.

4. Larionova N.I., Vartanov S.S., Sorochinskaya E.I., Malitskaya E.A., Sorokina N.V., Gladysheva I.P. Conjugation of the Bowman-Birk proteinase inhibitor with hydroxyethylstarch. // Russian Biochem. Biotechnol. Express. 1991. V. 1. N 1. P.27-33.

5. Gladysheva I.P., Vartanov S.S., Neshkova E.A., Larionova N.I. Inactivation of leukocyte elastase by Bowman-Birk soybean inhibitor: kinetics of time-dependent inhibition in the presence of substrate. // Russian Biochem. Biotechnol. Express. 1991. V.l. M 2/3. P.76-77.

6. Tikhonova Т.V., Gladysheva I.P., Larionova N.I., Karasyova G.L., Galyuk M.A. Affinity sorbents for human leukocyte elastase. // Russian Biochem. Biotechnoi. Express. 1991. V.l. N 2/3. P.93.

7. Гладышева И.П., Вартанов C.C., Нешкова E.A., Ларионова Н.И. Инактивация лейкоцитарной эласгазы соевым ингибитором типа Баумана-Бирк: кинетиха временной зависимости ингибнрования. // VII Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзимология". Тез.докл. Москва. 1991. С.89-90.

8. Тихонова Т.В., Гладышева И.П., Ларионова Н.И., Галюк М.А., Карасева Г.Л. Аффинный сорбент для выделения эластазьг из лейкоцитов человека. // VII Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзимология". Тез.докл. Москва. 1991. С.94.

9. Гладышева И.П.,' Шарафутдинов Т.З., Тихонова Т.В., Ларионова Н.И. Высокомолекулярные соевые изоингкбиторы типа Баумана-Бирк: выделение, характериспжа, кинетика взаимодействия с протеиназами. //III Симпозиум "Химия протеолитических ферментов". Тез .докл. Москва. 1993. С.92.

10. Гладышева И.П., Тихонова Т.В., Ларионова Н.И. Использование аффинной и высокоэффективной гидрофобной хроматографии для выделения мембранотропных производных соевого ингибитора типа Баумана-Бирк. //III Симпозиум "Химия протеолитических ферментов". Тез.докл. Москва. 1993. С.93.

11. Балабушевич Н.Г., Донецкий И.А., Гладышева И.П., Мороз H.A., Казанская Н.Ф., Ларионова К.И. ' Природные ингибиторы как основа для создания новых, лекарственных средств. // III Симпозиум "Химия протеолнтическнх ферментов". Тез.докл. Москва. 1993. С.94.

12. Ларионова Н.И., Гладышева И.П., Тихонова Т.В., Казанская Н.Ф. Ингибировакие хатепсина G и злзстазы гранулоцитов человека множественными формам:! соевого ингибитора типа Баумана-Бирк. // Биохимия. 1993. Т.58. вып.9. С.1437-1444.

13. Ларионова Н.И., Гладышева И.П., Топчиева И.Й., Казанская Н.Ф. Конъюгирование классического соевого ингибитора типа Баумана-Бирк с сополимером окиси этилена и окиси пропилена. // Биохимия. 1993. Т.58. вып.10. С.1658-1664.

14. Тихонова Т.В., Ларионова Н.И., Гладышева И.П., Казанская Н.Ф. Соевый ингибитор Баумана-Бирк как аффинный лиганд для выделения лейкоцитарной эластазы. Ингибирование им гидролиза эластина, катализируемого лейкоцитарной эласгазой. // Биохимия. 1993. Т.58. вьш.11. С.1669-1676.

15. Гладышева И.П., Шарафутдинов Т.З., Ларионова Н.И. Высокомолекулярные соевые изоингибиторы типа Баумана-Бирк: выделение, характеристика, кинетика взаимодействия с протеиназами. //Биоорг. хим. 1994. Т.20. Но 3. С.281-289.