Термодинамика и кинетика конформационного перехода типа "глобула-клубок" на примере малого глобулярного белка-ингибитора трипсина кунитца тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.06 ВАК РФ

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭЛЕМЕНТООРГАНИ ЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИИ имени А.Н.НЕСМЕЯНОВА

На правах рукописи

Варфоломеева Елена Петровна

УДК 577.322.24

ТЕРМОДИНАМИКА И КИНЕТИКА КОНФОРМАЦИОННОГО ПЕРЕХОДА ТИПА "ГЛОБУЛА-КЛУБОК" НА ПРИМЕРЕ МАЛОГО ГЛОБУЛЯРНОГО БЕЛКА - ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА КУНИТЦА

02.00.06 - химия высокомолекулярных соединений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1990

Работа выполнена в ордена Ленина Институте элементоорганических соединений имени А.Н. Несмеянова АН СССР.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ! Доктор хим.наук, профессор В.Б.Толстогузов НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ: Доктор хим.наук, ст.науч.сотр. В.Я.Гринберг

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор химических наук, профессор С.-С.А.Павлова Кандидат физ.-мат.наук, ст.науч.сотр. Н.Г.Есипова

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт органической химии имени Н.Д.Зелинского АН СССР

Защита состоится "__"_______1990 г. в___час. на заседании

Специализированного Совета К 002.99.О1 в ордена Ленина Институте элементоорганических соединений имени А.Н.Несмеянова АН СССР (ИНЭОС АН СССР) по адресу : 117813 Москва В-312, ул. Вавилова, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИНЭОС АН СССР.

Автореферат разослан "___"________1990 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

К 002.99.03 кандидат химических наук М.А.Школина

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

в£1Х§£ьность_темы._ Современный этап развития химии высокомолекулярных соединений характеризуется вовлечением белка как объекта исследования в сферу интересов этой науки. Это обусловлено развитием ряда новых отраслей промышленности, использующих белок в качестве сырья. Среди них особое место занимает промышленность по переработке белка в пищевые продукты, направленная на повышение эффективности производства продовольствия. Важной особенность» этой отрасли является широкое использование процессов, типичных для промышленности по. переработке полимеров, н.п. термопластической экструзии, мокрого и сухого прядения, прессования и т.д. Эта общность предопределяет основные тенденции в развитии научной базы промышленности по переработке белка. Наука о переработке белка становится важным разделом физической химии полимеров.

Научное содержание комплекса проблем, связанных с переработкой пищевого белка, составляет исследование закономерностей формирования его технологических или функциональных свойств., таких как растворимость, гелеобразующая способность, поверхностная активность и др. Опыт показывает, что многие.функциональные свойства пищевого белка определяются его конформацией. Это позволяет рассматривать изучение конформационных переходов в белках как перспективный путь решения проблемы регулирования их функциональных свойств.

Одним из наиболее важных конформационных переходов является переход типа "глобула-клубок", когда молекула белка переходит из упорядоченного (нативного) состояния в развернутое (денатурированное). Этот переход называют денатурацией, а устойчивость на-тивной конформации белка к денатурации — его конформационной стабильностью. Для пищевых белков особое значение имеет термическая денатурация, т.к. термические процессы широко используются в пищевой технологии.

Общую научную задачу работы можно сформулировать как исследование конформационной стабильности пищевых белков в многокомпонентных системах, моделирующих состав пищевых продуктов, на примере ингибитора трипсина Кунитца из соевых бобов.

Ингибитор Кунитца — это малый глобулярный белок с известной первичной, вторичной и трагичной структурой. Он имеет молекулярную массу 21 500 и молекулярный радиус 17.5 К. Ингибитор относится к фракции 2в-глобулинов белка сои. Эта фракция составляет существенную часть общего белка соевых бобов (20-35Х). 23-глобулины обладают высокой пищевой ценностью, т.к. сбалансированы по аминокислотному составу. Однако, функциональные свойства 25-глобулинов и, особенно их конформационная стабильность, ис-.следованы крайне недостаточно. Особый интерес к конформационной стабильности ингибитора обусловлен корреляцией между конформа-ционным состоянием этого белка и его ингибиторной активностью, т.е. способностью подавлять действие некоторых протеолитических ферментов.

Методом прецизионной дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСЮ систематически и подробно исследована термическая денатурация ингибитора в широком интервале значений рН. Показано, что в случае ингибитора калориметрические данные осложнены кинетическими Эффектами. Предложена методика обработки таких данных, позволяющая получать информацию о термодинамике и кинетике конформационного перехода. Получены термодинамические и активационные характеристики термической денатурации ингибитора при различных рН. Их анализ в рамках теории предпочтительного связывания позволил установить роль водородных (Н-) связей с участием некоторых боковых ионогенных групп в стабилизации свернутой (нативной) конформации ингибитора, а также выяснить отдельные черты механизма денатурации этого белка. Получены дополнительные подтверждения того, что термическая денатурация ингибитора представляет собой кооперативный переход между двумя конформационными состояниями - нативным (глобула) и денатурированным (клубок). Эти данные отличаются особой достоверностью, т.к. получены с помощью метода ДСК. Систематически исследовано влияние широкого круга полисахаридов различного химического строения и происхождения на термическую денатурацию и ренатурацию (обратный переход "клубок-глобула") ингибитора в условиях термодинамической несовместимости и комплексообра-эования белков и полисахаридов. Определены границы возможных Эффектов. Установлена их природа. Детально исследована конформаци-

энная стабильность ингибитора в полиэлектролитных комплексах с кислыми полисахаридами.

Ингибиторная активность является фактором, снижающим пищевую ценность изолятов белков семян. Цанные о закономерностях ренатурации ингибитора в присутствии полисахаридов определяют простые и надежные способы его полной инактивации. Преимущество такого подхода состоит в том, что инактивация проводится в мягких условиях без деструкции белка и снижения его растворимости.

таты работы обсуждались на коллоквиуме лаборатории новых пищевых форм ИНЭШС АН СССР и были представлены на конкурсе ИНЭОС АН СССР, на лучшую научную работу (19ВВ год, 2-я премия). Отдельные результаты докладывались на II Всесоюзной конференции "Новые источники пищевого белка" (19В6 год, Кобулети) .

Основной материал диссертации опубликован е виде 1-х печатных работ.

Ст£^кт^£а_и_об^ем_диссецтации^ Работа состоит из введения,трех глав, выводов и списка литературы (198 ссылок). Во введении обоснована актуальность, новизна, практическая значимость работы, сформулированы ее основные задачи, обоснован выбор объектов л метода исследования. Первая глава содержит обзор литературы, зторая - описание объектов и методов исследования, а третья -результаты и их обсуждение. Работа изложена на 93 страницах машинописного текста (не считая иллюстративного материала и списка читературы), содержит 30 рисунков и 11 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре систематизирована информация об ингибиторе как важнейшем представителе фракции 23-белков соевых бобов. Приводятся (анные о составе этой фракции и основных физико-химических свой-:твах ее компонентов, включая ингибитор. Рассмотрена первичная, вторичная и третичная структура ингибитора. Описаны осо—

бенности его взаимодействия с трипсином. Обсуждены физиологические аспекты воздействия этого белка на организм человека и животных. Проанализированы особенности денатурации ингибитора под действием химических денатурантов и температуры. Приводится информация о практических подходах к проблеме инактивации ингибитора в технологических условиях. На основании анализа литературных данных конкретизируются цель и задачи диссертационной работы.

Глава 2. ОБ'ЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Основным объектом исследования был препарат ингибитора <Т-9003,Б1дгоа), однородный по данным гель=хроматографии и гель= электрофореза. В работе были использованы также кристаллический препарат олигомерного глобулярного белка - рибулозодифосфаткар-боксилазы (РДФК) из листьев' табака и полисахариды различного химического строения и происхождения! нейтральный — декстран, кислые карбоксил=содержащие - гуммиарабик и пектины разной степени этерификации; кислые сульфат=содержа!дие - декстрансульфат,каппа= и иота=каррагинаны. В качестве основного метода исследования был использован метод ДСК, развитый Приваловым. Методология термодинамического исследов'ания конформационных переходов белков заимствована из работ Тзнфорда, Шеллмана, Брандтса и Привалова.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.^.__Инте£П£етация_те£мог£амм_денату£ации_белков

При исследовании термической денатурации ингибитора методом ДСК была обнаружена сильная зависимость положения пика денатура-ционного твплопоглощвния по шкале температур от скорости нагревания. При понижении скорости нагревания пик теплопоглощения смещается в область более низких температур. В интервале скоростей нагревания от 0.125 до 2 К/мин температура денатурации (Т^) ингибитора изменяется почти на 13 С, причем эта зависимость носит нелинейный характер <Е>ис^>. Величины знтальпии денатура-

^,к/мин

Р{ЗЕл._Аг. Зависимость температуры денатурации ингибитора Кунитца от скорости нагревания.

Температурные зависимости констант скорости денатурации 7l) и ренатурации <2> ингибитора Кунитца ( 0.005 М глициновый бусрер, pH 3.0).

ции (Д^Н) и изменения теплоемкости при денатурации (¿^С^) практически не зависят от скорости нагревания.

Среднее значение отношения калориметрической 'А^Н) и вант-гоффовской (¿^Н ) энтальпий денатурации ингибитора близко к 1 независимо от скорости нагревания. Следовательно, молекула ингибитора представляет собой единую кооперативную систему, в которой конфорационный денатурационный переход осуществляется между двумя термодинамически стабильными состояниями! нативным , <Ы> и денатурированным (О), ^состояние - это упорядоченная глобула (апериодический кристалл), а О=состоянив, скорее всего, статистический клубок.

Существенная зависимость Т^ ингибитора от скорости нагревания требует применения кинетического подхода к анализу полученных термограмм. Данные о кинетике термической денатурации белков позволяют рассматривать этот процесс как обратимую реакцию первого порядка:

к1

N Б , (1)

к2

где к1 и к^ - константы скорости денатурации и ренатурации. Изменение во времени степени денатурации <г> описывается дифференциальным уравнением:

(¡г/аь «,к1<1 -2> - к2г (2>

Величину (г) при данной температуре (Т> можно определить непосредственно из термограммы:

г(Т) = Л^СП/Д^, (3)

где - площадь под термограммой при температуре Т; /^Н -

энтальпия денатурации.

Дифференцируя (3) по времени, получим:

йТ/й* ш (1 - ^тСгИЛ^/сТПЫТЛЮ 4 (4>

Заметим, что сМ_.Ь/с)Т=4С (Т> - избыточная теплоемкость белка а Р

при температуре Т, a dT/dt=^ - скорость нагревания. Таким образом, уравнение <2> принимает вид:

jidCpCT)/ddH = к^ (Т) - Ek1(t) + k2<T>3(4dh//ldH ) (5)

Определяя в эксперименте значения Z(T), ДСр<Т> и ^Н при различных скоростях нагревания, можно для каждой температуры Т^ в области конформационного перехода получить зависимость

fedC (Т. )/Л.Н от ¿.h (Т. )/й .Н. Согласно (5) эта зависимость линей-j р 1 d did

на. Наклон прямой и отрезок, отсекаемый на оси ординат, позволяют определить величины констант денатурации k^(Т^) и ренатурации k^tT.) при данной температуре. Этот подход был применен для расчета к^ и к^, а также равновесной температуры денатурации Td<^=0) олигомерного белка РДФК.

В случае ингибитора решение системы уравнений (5) дает для к^ нулевое значение. Это означает, что в исследованной температурной области скорость ренатурации белка пренебрежимо мала по сравнению со скоростью денатурации. Следовательно, конформацион-ный переход ингибитора можно рассматривать формально как необратимую реакцию первого порядка:

К1

N —— > D (6)

Тогда уравнение (5) принимает вид:

к. (Т.) = С ¿С < Т. ) / <1 Н 3 / С1 - ¿.h(T. ,НЗ (7)

11 pi d did

Величина к^ рассчитывается из профиля термограммы. Полученные таким образом значения k^ хорошо согласуются с данными изотермического метода. На £ис._2А_^ температурная зависимость kj представлена по уравнению Эйринга:

In <k,/Т> = Cln(k/h) + <4.S*/R>] - (¿.H#/R>(1/T), (8)

1 da

# #

где k и h-постоянные Больцмана и Планка,a J^S и Д^Н - энтропия и

энтальпия активации денатурации; ГЗ-газовая постоянная. Точки, полученные при разных скоростях нагревания, образуют единый массив и могут быть аппроксимированы одной прямой.

Для определения ингибитора был применен метод

встречной экстраполяции. Он потребовал исследования ренатурации белка при различных температурах. Ренатурацию проводили в условиях, когда можно пренебречь реакцией денатурации (Т<35°С>. Степень ренатурации (1 - 1) определяли по отношению максимальных ординат термограмм ренатурированного и нативного белка. Восстановление термограмм в процессе ренатурации коррелирует с восстановлением ингибиторной активности.

Кинетика ренатурации описывается уравнением необратимой реакции 1-ого порядка. Значения к^ определяли из уравнения:

С1 - г(0:1 = 1 - ехрС-к.,^ - 1 >3, <9>

£ о

где Ъ-время ренатурации, час; ^-время неизотермических стадий в калориметре.Температурная зависимость к^ аппроксимируется прямой по Эйрингу <¿fci.2j._22."Точка пересечения прямых 1 и 2 на рис. 2 соответствует условию равновесия. Следует отметить, что скорости денатурации и ренатурации ингибитора значительно ниже (от одного до нескольких порядков) соответствующих характеристик большинства малых глобулярных белков.

3^2.__Те2модинамические_характе2истики_кон

Эти данные были получены при рН 3.0, когда денатурация ингибитора полностью обратима. В этих условиях равновесная температура денатурации <Т^(^=0), £ис^2) равна 319.9 К, знтальпия денатурации (Д^Н) - 340 кДж/ моль, а разность теплоемкостей денатурированной и нативной форм белка (¿¿С^) - 6.6 кДж/моль К. Исходя из этих значений, были вычислены температурные зависимости энтальпии, энтропии (^Б) и свободной энергии денатурации :

¿.Н<Т) ш И.Н(Т.) + &.С <Т - Т.) <10)

□ а а а р а

Л,3<Т) = ЛИН<Т,)/Т.+ И.С 1п(Т/Т.> <И>

а й а и ар о

A,G(T) = 4.Н(Т .) (1-Т/Т .>+4 .С (Т-Т.)-ТЛ.С 1п (Т/Т .) (12) d "d d d d р d d р d

Эти зависимости имеют вид типичный для глобулярных белков. Coi— ласно Привалову, малые глобулярные белки можно разделить на две группы: А и В. Белки группы А имеют компактную структуру и характеризуются высокими значениями (около 60 Дж/г> удельной энтальпии денатурации при 110°С (Л^Н(110°С)). Структура белков группы В менее компактна. Для них характерны более низкие значения ¿dH(110°C> (30-40 Дж/г). В случае ингибитора ¿dH(110°C> = 35.2 Дж/г. Следовательно, его можно отнести к глобулярным белкам с некомпактной структурой. Этот вывод соответствует структурным данным, согласно которым- молекула ингибитора представляет собой неупорядоченную, рыхлую систему.В ней отсутствуют альфа—спирали, а доля бета-структур весьма незначительна.

Величина jJ^G часто рассматривается как мера конформационной стабильности белка. Максимальное значечение ¿J3 ингибитора соответствует температуре 0 С.Оно равно 25 кДж/моль, что несколько ниже величины других малых глобулярных белков (30-70 кДж/мо-

ль) .

3-_3.__Влияние_(зН_на_те£модинамичес^

1ЁЕ!2У^ЁЕ!1°£!_ленат^2ации_ингибито£а_т£ип На Нис^З приведены термограммы денатурации ингибитора в нейтральной, кислой и щелочной областях рН. В исследованном интервале рН денатурация характеризуется одним симметричным пиком теплопоглощения. Этот пик смещается к более низким температурам при изменении рН от нейтральных значений в кислую или щелочную область. Положение пика при данном рН зависит от скорости нагревания . При понижении р он смещается в область более низких температур. Эта особенность поведения ингибитора затрудняет термодинамическую интерпретацию калориметрических данных. Это затруднение было преодолено следующим образом.

Анализ полученных зависимостей Т^рН,^) показывает (£5ис^4а) ,

з)

Td(pH,j3> - Td<pH3.0,j3) / fíjO,

Т,К

Термограммы денатурации ингибитора Кунитца при различных рН. Скорость нагревания: 2.0 (1), 1.0 (2) и 0.5 (3) К/мин.

<"> 0 X о. 8 £ 5*8 •8

А а о

О. Ь

"—' ^-10

б

о °0о°о°0 о

о °о

X о о

ч—-315 о

■о 1— о о

310 о I. . .

1 3 5 7 9 11 РН

а) рН-зависимость приращения температуры денатурации ингибитора Ку-нитца относительно рН 3.0 (обозначения даны на рис. 2>; б) рН-зависимость равновесной температуры денатурации ингибитора Кунит-ца. Стрелкой отмечена изо-электрическая точка белка.

т.е. прирзк'зниэ температуры денатураии при изменении рН на зависит от скорости нагревания. Это обстоятельстоо позволяет определить Т^ <|з=0>=£ (рН> ' используя экспериментальное зна— чзкиэ Т^ <^=0)=319.9 К при рН 3.0.

Значения М^Н) при различных скоростях нагревания, представлении:» о заеисимссти от прирзщзния Т^, составлямт один массив (риса). Эта зависимость мо»ет быть аппроксимирована прямой с наклоном 6.6+0.2 кДй/моль К. Величина наклона практически совпадает со средней величиной 7.1+0.5 кДк/моль К, определенной калориметрически <£ис^5б). Этот результат (выполнение закона Кирхгоффа) свидетельствует о том, что полученный калориметричес-киз данные находятсп о термодинамическом соответствии друг с другом.

На [зис^5з приведены значения отношения Л^Н/Л^Н*, определенные при различных р в зависимости от приращения Т^.Отношение не претерпевает систематических изменений а исследованных условиях. Средняя величина отношения <0.93+0.02) практически равна 1. Следовательно, можно считать, что механизм денатурации ингибитора как М-П=перехода сохраняется при различных рН.

Соответствие полученных данных закону Кирхгоффа и модели доух состояний позволяет провести термодинамический анализ влияния рН на денатурацию ингибитора. С этой целью была рассчитана рН-за— езисимость его избыточной свободной энергии денатурации <^БВ>:

¿уЗе<рН> = ¿^(рН) - ^(рНЗ.О) • <13>

В целом она имеет вид, характерный для глобулярных белков (дис^б). В кислой и щелочной областях величина Д^В0 убывает, что свидетельствует о понижении конформационной стабильности белка. Особенностью ингибитора является наличие широкого плато в нейтральной и слабощелочной области.

Изменение конформационной стабильности белков при изменении рН обычно связывают с электростатическими эффектами или с наличием боковых Н-связей между ионогенными группами в нативной структура белка. Признаками существенной роли электростатических эффектов являются максимальная стабильность в изоэлектричвекой точке,

<

5

-о <

V* 15

•4 ю

л

а

¿й

А А* __

■В о

_1_

-10 -6 -2

Рис.__Температурные зависимости основных термодинамических характеристик денатурации ингибитора Ку-нитца: а) энтальпия денатурации, б) изменение теплоемкости при денатурации, в) отношение калориметри-2 ческой и вант-гоффовской энтальпий денатурации(обозначения даны на рис. 2).

снижение стабильности слева и справа от нее симбатно изменению абсолютной величины среднего заряда белка, а также повышение стабильности при повышении ионной силы. Эти закономерности не наблюдаются в случае ингибитора . Поэтому для интерпретации полученных данных была использована концепция боковых Н-связей в изложении Шераги-Ласковского.

Согласно термодинамической теории Шераги-Ласковского зависимость /3£|Бе(рН) описывается функцией, в которую в качестве параметров входят число Н-связей данного типа <гк>, показатели констант ионизации донора (рК^ и акцептора протона, участвующих в образовании таких связей; и константы их образования

£

Теоретическая зависимость Л^Б <рН> для ингибитора изображена сплошной линией на £ис._6. В целом она согласуется с экспериментальными данными. Теоретическая зависимость имеет параметры: п^ = 1, п2=1, РК0>1=9.6, ркВ12=ю.в, ркЙ11=2.а, ркй>1=з.о, КГ50, К2 =50. Этот результат свидетельствует о наличии в молекуле ингибитора двух боковых водородных связей. Значения показателей констант ионизации доноров соответствуют тирозину <рК 9.6) и лизину <рК 10.8), а значения показателей констант ионизации акцепторов — карбоксильным группам (рК 3-4). Следовательно, нативная кон— формация ингибитора стабилизирована одной боковой Н—связью типа карёоксилат-тирозил и одной - типа карбоксилат-лизил. Повышенная стабильность ингибитора в щелочной области <Еис.6) обусловлена, по-видимому, участием в одной боковой Н-связи сильно основной эпсилон-аминогруппы лизина с рК 10.В.Полученные значения констант образования Н-связей несколько выше соответствующих величин для модельных соединений . Причиной этих различий может быть влияние соседних гидрофобных групп или частично ионный характер таких связей в молекуле ингибитора, особенно связи карбоксилат-лизил.

3.__Влияние_дН_на_кинетические^

Температурные зависимости константы скорости денатурации ингибитора при различных рН приведены на по Эйрингу (8).

-9

2,9

3,0

103/Т .К"1

3,1

Рис.__Темпаратурнысз зависимости константы скорости денатурации ингибитора Кунитца при различным рН.

4.300

* 200 I

100

700

500

300

□

й р я ° лз * е а • ^ 1 п. §1 а

5

А ® о

в | »а 1|

I 1 , , , - ,

13 5 7 РН

Рис._0._ рН-зависимости энтальпии (а) и энтропии (б) активации денатурации ингибитора Кунитца. Стрэлкой отмечена изоэлектрическая точка белка (обозначения даны на рис. 2).

?? ^

Параметры прямых определяют энтальпию Л^Н и энтропию актива-

ции денатурации белка. Значения этих характеристик при различных рН приведены на £ис-0. По порядку величины они согласуются с данными для других глобулярных белков. Кроме того, значения Д^Н и Л^З^при рН 3.0 согласуются с данными Кунитца, полученными традиционным кинетическим методом. Активационные характеристики денатурации ингибитора максимальны в нейтральной области рН и понижаются в кислой и щелочной областях. Таким образом, влияние рН на кинетическую и термодинамическую стабильность ингибитора в основных чертах однотипно.

Рис. 9 показывает, что между активационными характеристиками денатурации ингибитора существует положительная линейная корреляция. Известны многочисленные примеры такого соотношения между энтальпией и энтропией активации различных процессов в белках, получиЕшего название "компенсационного эффекта". Наклон компенсационной прямой называется "температурой компенсации"СТ 1.По данным £ис^9 Тс=349+1 К. Постоянство этой величины указывает на то, что при активации молекулы ингибитора в процессе денатурации имеет место один и тот же тип конформационных изменений независимо от рН.

Информацию об активированном состоянии белка в процессе денатурации представляет анализ зависимостей (рН) ■ Максимальный наклон такой зависимости пропорционален изменению числа связанных белком протонов ) при активации. Предельный наклон зависимости 1пСк.(рН)3 в кислой области соответствует величине =1. Таким образом, при переходе белка из нативного состояния в активированное сорбируется один протон. Сорбция протона обусловлена титрованием карбоксильной группы, сопровождающим разрыв боковой Н—связи. Как было указано выше, в молекуле ингибитора имеется две такие Н-связи. Следовательно, вторая связь разрывается при переходе белка из активированного состояния в денатурированное.

Важно, что значения к^ ингибитора при различных составляют один массив <Еис^10). Это обстоятельство является свидетельством корректности определения констант скорости денатурации по данным ДСК.

Д^Б^*, Дж/жоль-К

Рис._ 9. Корреляция значений энтальпии и энтропии активации денатурации ингибитора Кунитца при различных рН.

Рис._10._ рН-зависимости константы скорости денатурации ингибитора Кунитца при различных температурах. Стрелкой отмечена изозлектрическап точка белка (обозначения даны на рис. 2).

3^5^_Вликние_полисахаридов_на_тв£Мическ

Белки и полисахариды, как правило, термодинамически несовместимы друг с другом при рН выше изоэлектрической точки <рI) белка. В этом случае можно было ожидать повышения конформационной стабильности белка*под действием полисахарида вследствие эффекта исключенного объема. Тем не менее, многочисленные эксперименты показали, что в области термодинамической несовместимости полисахариды различного химического строения и происхождения (от нейтральных до сульфат=содержащих — линейных"и разветвленных) практически не влияют на конформационную стабильность ингибитора. Это указывает, вероятно, на относительно малое изменение объема молекулы ингибитора в процессе термической денатурации. Согласно последним данным такое поведение является, возможно, типичным для многих глобулярных белков.

В нейтральной и слабощелочной области рН при низкой ионной силе, т.е. в условиях термодинамической несовместимости белков и полисахаридов, ингибитор после термической денатурации практически полностью ренатурирует за сутки при комнатной температуре. Интересно, что в этих условиях полисахариды (декстран, декстран-сульфат, каппа= или иота=каррагинан) лишь в незначительной степени влияют на ренатурацию ингибитора . Исключение составляет гуммиарабик. Этот полисахарид заметно подавляет способность ингибитора к ренатурации в результате усиления агрегации белка в О=состоянии.

Кислые полисахариды могут образовывать с белками растворимые полиэлектролитные комплексы при рН<р1. Для выяснения общих закономерностей конформационного поведения белков в таких комплексах было исследовано влияние сульфат= и карбоксил=содержащего полисахаридов (декстрансульфата и пектина) на конформационную стабильность ингибитора в условиях комплексообразования.

На рисприведены данные седиментационного и калориметрического исследования растворимых комплексов Ингибитор=Декстрансу-льфат при рН 3.0. Седиментационный состав системы характеризуется наличием двух компонентов (Еус ._1Ла). Коэффициент седиментации компонента 1 резко возрастает с ростом отношения массовых

fg q.

Рис. 11. а) Зависимость средних коэффициентов седиментации компонентов системы ингибитор Кунитца=Декстрансульфат от приведенной концентрации белка; б,в) Зависимости температуры (б) и энтальпии (в) денатурации ингибитора в присутствии декстран-сульфата от приведенной концентрации белка. Пунктирные линии соответствуют значениям коэффициента седиментации, температуры и энтальпии денатурации ингибитора в фоновом буфере (0.005 М глицин +■ 0.002 М ЭДТА ).

D (0) 6 AGn — ÜGd C

DCD ÜG0 To(U-TD(o)

N(0) N(0 ÄG«

T0(L)

Рис^г^Схематические температурные зависимости свободной энергии и Р=форм белка в свободном <N(0) и 0(0)) связанном (N(1.) и 0(1.) > состояниях: а) случай предпочтительного связывания Б=формы; б) случай предпочтительного связывания Ы=формы. Т^(0) и Тн(1-) - соответственно, температура денатурации свободного и связанного белка.

концентраций белка и полисахарида (я>. При этом он значительно превышает коэффициент седиментации ингибитора (25). Это позволяет полагать, что компонент 1 соответствует комплексам Ингиби-тор=Декстрансульфат. Коэффициент седиментации компонента 2 равен 35 независимо от q. Поскольку декстрансульфат имеет коэффициент седиментации* около 2Б, точное отнесение компонента 2 затруднено. Он может соответствовать комплексам постоянного состава с низким содержанием лигандов или свободному декстрансульфату. □бе ситуации являются признаком систем с кооперативным характером связывания. Важно, что в исследованной системе свободный ли— ганд (ингибитор) не наблюдается даже при больших ч- Это обстоятельство позволяет относить величины, измеряемые в калориметрическом эксперименте, к связанному белку.

На термограммах денатурации ингибитора в комплексе с декст— рансульфатом наблюдается всегда один пик, форма и ширина которого мало отличаются от аналогичных характеристик термограмм свободного белка. Связывание вызывает лишь сдвиг пика денатурации в область более низких температур. При малых я этот Эффект особенно заметен . По мере увеличения ц Т^ связанного белка вначале слабо меняется,а затем возрастает,достигая уровня "^свободного белка при ц>20. связанного ингибитора не претерпевает систематических изменений с ростом я 'Ei2Ei.ii._5' ' однако она

всегда значимо ниже й .Н свободного белка. а

Рис^12 поясняет причины изменения Т^ белка в результате комп-лексообразования. В зависимости от того, связывание какой формы предпочтительно(Ы или Б) , должна наблюдаться стабилизация (¿П*^>0) или дестабилизация (ДТ^О) белка. Как правило, Б=форма белка обладает большим числом центров связывания, чем ^форма. Поэтому ее связывание почти всегда предпочтительно (рис^ХЗа). По-видимому, этот случай реализуется в комплексах Ингибитор=Декстран— сульфат. По мере насыщения комплекса белком число свободных центров связывания на полисахаридной матрице уменьшается, что снижает вероятность предпочтительного связывания 0=формы <Еис^13б). В таком комплексе стабильность связанного белка приближается к стабильности свободного, но не превышает ее. Это обстоятельство указывает на отсутствие стабилизации ^формы ингибитора при

Схематическое представление денатурации белка, связанного заряженной матрицей, при редкой (а) и плотной (б) посадке на матрице.

345

20

*10

■о <1.0

а

0.6

0.2

Рис._14._ Зависимости температуры денатурации - ингибитора Кунитца в присутствии пектина со степенью этерификации 60'/. (1) и пектата (2) от приведенной концентрации белка при рН 4.0 (пунктирная линия соответствует значению температуры денатурации белка в фоновом буфере).

Зависимости температуры (а) и энтальпии (б) денатурации ингибитора Кунитца в присутствии пектина от степени этерификации (СЭ)полисахарида при рН 4.0 (пунктирной линией обозначены соответствующие характеристики денатурации белка в фоновом буфере); и зависимость мутности (в) системы ингибитор Кунитца=Пектин от степени этерификации пектина (концентрация белка 0.137., ц=1; пунктирная линия соответствует оптической плотности раствора белка в фоновом буфере).

20

40 60 80 С Э. V»

100

связывании с декстрансульфатом.

представлены данные о влиянии комплексообразования ингибитора с пектином и пектатом на его Т^. В случае пектина Тс, связанного белка ниже Т^ свободного -независимо от величины я ■ Можно полагать, что механизм дестабилизации ингибитора в комплексам с пектином, как и в случае декстрансульфата, сводится к предпочтительному связывании О=формы. Слабая зависимость Т^ от я означает, по-видимому, что посадка И=формы на матрицу такова, что при любых ч в исследованном интервале имеются свободные соседние центры дополнительного связывания при переходе молекулы белка в С=состояние. Зависимость "^(ч) для комплексов Ингибитор=Пектат носит иной характер • малых значениях ч "[^связанного белка ниже "[^свободного, причем величина этого Эффекта приблизительно такая же, как и в случае пектина. При увеличении ч наблюдается возрастание Т^ до уровня, превышающего Т^ свободного белка. Следовательно, при связывании ингибитора пектатом наряду с Эффектом дестабилизации проявляется и эффект стабилизации.

При редкой посадке белка на матрицу пектата наряду со связыванием Оформи имеет место дополнительное связывание О=формы (после денатурации) на вакантных соседних центрах. Преобладание последнего фактора вызывает смещение равновесия денатурации в сторону О=формы, что выражается в снижении Т^. Напротив, при более плотной посадке белка преобладает Эффект связывания Ы=формы, что выражается в повышении Т^.

Изменение стабильности ингибитора в комплексах с пектином и пектатом при больших ч имеют противоположный характер. В то время как в первом случае преобладает связывание О=формы, во втором - предпочтительно связывается М=форма белка. Из этого следует, что центрами связывания этих форм могут быть разные функциональные группы полисахаридной матрицы.

На Еисприведены зависимости Т^ и ¿^Н ингибитора в комплексах с пектином от степени этерификации <СЭ> пектина. При малых СЭ преобладает стабилизация белка. При СЭ=40—607. Т^ и ¿^Н довольно резко падают. При дальнейшем увеличении СЭ параметры денатурации повышаются, стремясь к уровню, характерному для сво-

водного белка.Следовательно, при малых СЭ, когда на матрице преобладают карбоксильные группы, предпочтительным является связывание N'tpopMbi. Напротив, при высоких СЭ, когда на матрице преобладают сложноэфирные группы, предпочтительным является связывание D=q>opMbi. Переходная область отвечает СЭ около 50Х. Эта величина коррелирует с положением максимума на кривой зависимости мутности системы Ингибитор=Пектин от СЭ пектина (gnc^Se).Максимум мутности отвечает образованию нерастворимых электронейтральных комплексов Ингибитор=Пектин. Уменьшение мутности при более высоких СЭ объясняется, по-видимому, ослаблением взаимодействия компонентов и появлением свободного лиганда в системе. Это согласуется с тем,что при СЭ около 1007. Т^ ингибитора в присутствии пектина приближается к Td свободного белка.

Природа комплексообразования ингибитора с декстрансульфатом и пектином носит преимущественно электростатический характер. При ионной силе 0.1, когда по данным скоростной седиментации комп-лексообразование ингибитора с этими полисахаридами не наблюдается, Т^ белка в таких системах соответствует Т^ свободного белка.

Процесс термической денатурации ингибитора в комплексах с декстрансульфатом и пектинами необратим даже при очень малом со-держаннии этих полисахаридов в системе. Следовательно, связывание 0=формы ингибитора с полисахаридной матрицей носит необратимый характер. Ренатурация белка не наблюдается и при введении соли в систему как до нагревания, так и;после него. Этот результат важен с практической точки зрения, т.к. указывает пути решения проблемы полного подавления ингибиторной активности в продуктах на основе белков сои при кислых значениях рН.

выводы

1.Термическая денатурация ингибитора Кунитца из соевых бобов представляет собой кооперативный переход между двумя конформаци-онными состояниями - нативным (глобула) и денатурированным (клубок ) .

2.В стабилизации нативной конформации ингибитора Кунитца принимают участие две боковые водородные связи .типа карбоксилат ион - тирозил и карбоксилат ион - лизил. Денатурация сопровождается разрывом этих связей.

3»В процессе денатурации ингибитор Кунитца проходит через стадию активации, которая сопровождается разрывом одной из указанным боковых водородных связей.

4.Изменения активационных и термодинамических характеристик денатурации ингибитора Кунитца при изменении рН симбатны, что свидетельствует об общей природе этих закономерностей.

5.Термическая денатурация ингибитора Кунитца сопровождается, вероятно, относительно малым изменением его молекулярных размеров, поскольку полисахариды, термодинамически несовместимые с белками, практически не влияют на этот конформационный переход.

6.Температура денатурации ингибитора Кунитца может повышаться или понижаться в результате его связывания полисахаридной матрицей в полиэлектролитный комплекс в зависимости от предпочтительности связывания нативной или денатурированной форм белка в данных условиях. Величина эффекта сильно зависит также от плотности посадки молекул белка на матрице.

7.Термическая денатурация ингибитора Кунитца в полиэлектрот литных комплексах с полисахаридами полностью необратима, что имеет определенное практическое значение, т.к. указывает на возможность эффективного подавления нежелательной биологической активности ингибитора в пищевых продуктах, в состав которых входят белки соевых бобов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Варфоломеева Е.П., Бурова Т.В., Даниленко А.Н., Гринберг В.Я. Термостабильность ингибитора трипсина из соевых бобов по

данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.— В сё.: "Новые источники пищевого белка". Тезисы II.Всесоюзной конференции, Кобулети, 1986, С. 91.

2. Бурова Т.В., Варфоломеева Е.П. , Гринберг В.Я., Сучков В.В. Папков B.C., Бауве X., Толстогузов В.Б. К вопросу об интерпретации термограмм денатурации белков в неравновесных условиях. Биофизика, 1990, Т. 35(2), С. 222-227.

3. Варфоломеева Е.П., Бурова Т.В., Гринберг В.Я., Толстогузов В.Б. Термодинамическое и кинетическое исследование термической денатурации ингибитора трипсина Кунитца из бобов сои методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.— Молекулярная биология, 1989, Т. 23, С. 1263-1272.

4. Варфоломеева Е.П., Бурова Т.В., Гринберг В.Я., Толстогузов В.Б. Влияние полисахаридов на конформационную стабильность ингибитора трипсина (Кунитца) из бобов сои.- Деп. в ВИНИТИ, 21.11.89 No. 6986-ВВ9.

TI0930' от -19/71-90 г. Заказ 226 Тираж 100

Формат 60x84Д6 - 1,5 п.л. - 1,56 уч.-изд.л.

Механизированное множительное производство ВНИКИМПа