Влияние денатурантов на динамические поверхностные свойства растворов глобулярных белков тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

МИХАИЛОВСКАЯ Алеся Алексеевна

ВЛИЯНИЕ ДЕНАТУРАНТОВ НА ДИНАМИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТНЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

Специальность 02.00.11 - коллоидная химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

-1 АВГ 2013

Санкт-Петербург 2013

005531801

005531801

Работа выполнена на кафедре коллоидной химии химического факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

доктор химических наук Носков Борис Анатольевич

доктор химических наук, профессор Чернобережский Юрий Митрофанович

Санкт-Петербургский государственный

технологический университет растительных полимеров

кандидат химических наук, доцент Власов Андрей Юрьевич

Санкт-Петербургский государственный

университет

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 12 сентября 2013 г в часов на заседании

диссертационного совета Д 212.323.40 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, БХА.

С диссертацией можно ознакомится в Научной библиотеке им. A.M. Горького СПбГУ, Университетская наб., 7/9.

Автореферат разослан tOtflUdj^ 2013 г. Ученый секретарь

диссертационного совета, ^ v

кандидат химических наук, доцент С______l Суходолов Н.Г

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Исследование процессов сворачивания и разворачивания глобулярных белков представляет одну из основных задач современной физической химии растворов белков, важную также и для многих смежных областей, таких как биофизика, молекулярная биология и химия высокомолекулярных соединений. Поскольку большинство биохимических процессов в клетке происходит у клеточных мембран, особое значение приобретает изучение конформационных переходов белковых молекул на границе между двумя флюидными фазами. Интерес к процессу реорганизации глобулярной структуры белков в ходе адсорбции связан также с широким использованием природных высокомолекулярных соединений в качестве стабилизаторов дисперсных систем.

Большинство результатов по конформационным переходам в белковых системах, сворачиванию или разворачиванию молекул белка в растворах, полученных в последние несколько десятилетий, относятся, однако, только к процессам в объёмных фазах. В то же время информация о состоянии белковых молекул в поверхностном слое и об изменении третичной и вторичной в процессе адсорбции оказывается довольно скудной. Степень разрушения глобулярной структуры белка при адсорбции на границе раствор/газ до сих пор остаётся предметом дискуссии. Так, например, потеря активности некоторых энзимов после их адсорбции на водной поверхности, низкая скорость адсорбции белков и образование прочной сети межмолекулярных связей в поверхностном слое рассматривались в течение длительного времени в качестве доказательств разрушения третичной и вторичной структуры при переходе молекул белков из объёмной фазы в поверхностный слой. Некоторые результаты последних лет, полученные с помощью отражения рентгеновских лучей и спектроскопии кругового дихроизма, подтверждают этот вывод. В то же время данные отражения нейтронов и инфракрасной спектроскопии отражения-поглощения свидетельствуют о сохранении глобулярной структуры при адсорбции в тех же системах.

Существующие трудности при исследовании адсорбционных пленок белков вызваны, прежде всего, ограниченным набором экспериментальных методов, доступных для изучения конформационных переходов белков в поверхностном слое. В данной работе для этой цели используется дилатационная поверхностная реология. Недавно было показано, что адсорбция гибких макромолекул сопровождается возникновением локальных максимумов на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости, вызванных переходом некоторых сегментов из ближней области поверхностного слоя в дальнюю

3

область. В то же время адсорбция компактных наночастиц приводит к монотонным зависимостям поверхностной упругости, достигающей высоких значений. Это позволяет использовать дилатационную поверхностную реологию для оценки состояния третичной структуры белков в поверхностном слое.

Цель данной работы состоит в определении механизма формирования адсорбционной пленки глобулярных белков на поверхности водного раствора и оценки влияния на этот процесс различных денатурирующих агентов на основе данных дилатационной поверхностной реологии на примере растворов бычьего сывороточного альбумина (БСА) и Р-лактоглобулина (БЛГ).

Для достижения этой цели в диссертации решались следующие основные задачи:

• Определение концентрационных и кинетических зависимостей комплексной динамической поверхностной упругости растворов глобулярных белков и их смеси с денатурантами с помощью метода осциллирующего барьера.

• Определение зависимости поверхностной концентрации для растворов смеси глобулярного белка и ионогенного поверхностно-активного вещества (ПАВ) от возраста поверхности и концентрации в объеме с помощью эллипсометрии.

• Определение динамического поверхностного натяжения растворов смеси глобулярных белков и денатурантов в широкой области концентраций и времен жизни поверхности.

• Определение морфологии адсорбционных слоёв глобулярных белков в присутствии денатурантов с помощью атомно-силовой микроскопии.

• Создание кинетической модели адсорбции комплексов глобулярных белков и ионогенных ПАВ.

• Сравнение результатов расчета кинетики адсорбции с экспериментальными данными и определение эффективного заряда комплекса белок/ПАВ.

Научная новизна. Впервые обнаружены локальные максимумы на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости растворов смесей БСА и БЛГ с различными денатурантами. Полученные результаты показывают, что разрушение третичной структуры этих белков происходит в поверхностном слое при меньших концентрациях денатурантов, чем в объемной фазе, т.е. межфазная граница оказывает дестабилизирующее влияние на белковые глобулы. Возникновение дальней области поверхностного слоя происходит при некотором характеристическом для данного белка значении поверхностного давления, не зависящим от концентрации и химической природы денатуранта.

4

Показано, что скорость изменения поверхностных свойств растворов глобулярных белков и их комплексов с ПАВ в области нейтральных значений рН определяется электростатическим адсорбционным барьером. Построена кинетическая модель адсорбции заряженных глобул на поверхности жидкости и определен эффективный заряд адсорбирующихся комплексов БСА и додецилсульфата натрия (ДСН).

Практическая ценность. Белки характеризуются значительной поверхностной активностью и образуют на межфазных границах прочные адсорбционные пленки. С этим связано широкое применение белковых систем в качестве стабилизаторов пен и эмульсий в таких областях промышленности, как фармакологическая, пищевая и косметическая. Полученные данные о механизме формирования адсорбционных плёнок глобулярных белков и их комплексов с поверхностно-активными веществами, а также о реологических свойствах этих пленок необходимы для оптимизации технологических процессов, а также для создания новых высокодисперсных материалов.

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1.Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси глобулярных белков с гидрохлоридом гуанидина (ГХГ), мочевиной, ДСН, бромидом додецилтриметиламмония (ДТАБ), проявляющиеся при увеличении концентрации денатурирующего агента в растворе.

2.Обнаружение и интерпретация немонотонных кинетических зависимостей динамической поверхностной упругости растворов, содержащих глобулярные белки.

3.Механизм формирования адсорбционных пленок в растворах смеси БСА с ГХГ и мочевиной.

4.Механизм адсорбции комплексов БСА и БЛГ с ДСН и ДТАБ.

5.Кинетическая модель адсорбции комплексов глобулярных белков с ионогенными ПАВ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: Научная сессия Секции коллоидной химии и физико-химической механики Научного совета по физической химии РАН (Москва, 2010); V Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011); 7th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, 2011); 25th European Symposium

on Applied Thermodynamics (Санкт-Петербург, 2011); I Всероссийский симпозиум по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011); 25th Conference of European Colloid and Interface Society (Берлин, 2011); VI Всероссийская конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012» (Санкт-Петербург, 2012); 26th Conference of European Colloid and Interface Society (Мальмо/Лунд, 2012); Семнадцатая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых учёных и специалистов (Санкт-Петербург, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи в международных журналах и 9 тезисов докладов.

Объём и структура работы. Диссертационная работа объёмом 151 страница машинописного текста (148 страниц основного текста и 3 страницы приложения) состоит из введения, шести глав, содержащих 54 рисунка и 1 таблицу, выводов, списка литературы, включающего 202 наименования, и приложения.

Основное содержание диссертационной работы

Во введении кратко излагаются актуальность, цели и задачи исследования.

Первая глава представляет обзор литературы, большая часть которого посвящена результатам исследований объёмных и поверхностных свойств растворов глобулярных белков и их смесей с денатурирующими агентами и ионогенными ПАВ. В отдельном параграфе рассматривается кинетическая теория адсорбции белков на границе жидкость-газ. Заключительная часть обзора посвящена теоретическим и экспериментальным исследованиям поверхностной вязкоупругости растворов высокомолекулярных соединений, а также применению методов поверхностной реологии к растворам белков и их смесей с ПАВ. Отмечается, что почти все опубликованные результаты по динамической поверхностной упругости растворов белков относятся к случаю малых отклонений от равновесия.

Во второй главе описываются экспериментальные методы, используемые реактивы, методика измерений и приготовления растворов белков. Методы поверхностной дилатационной реологии основаны на регистрации отклика системы на малое растяжение (сжатие) поверхности. Если относительная деформация поверхности мала, то отклик (инкремент поверхностного натяжения 5у) определяется фундаментальным поверхностным свойством — дилатационной поверхностной упругостью е. В данной работе измерения проводились методом осциллирующего барьера. Возбуждаемые осцилляции поверхностного натяжения регистрировались методом пластинки Вильгельми. Модуль динамической поверхностной упругости определялся отношением амплитуд колебаний

6

поверхностного натяжения. и относительной площади поверхности 5А/А, а фазовый угол (р находился из разности фаз колебаний этих двух величин, что позволяло определить действительную и мнимую составляющие величины S.

s = Аду ! SA = £R + i-Si =|ff|cosç? + /|ff|sinç7 (1)

В диссертационной работе также проводилось исследование морфологии адсорбционных пленок белков методом атомно-силовой микроскопии, в основе которого лежит зависимость силы взаимодействия между зондом и поверхностью исследуемого образца от расстояния между ними. С этой целью адсорбционные пленки белков и их комплексов с ПАВ переносились с водной поверхности методом Ленгмюра-Блоджетт на подложку из слюды.

Для некоторых систем проводился контроль размеров образующихся агрегатов с помощью метода динамического рассеяния света, позволяющего оценить гидродинамический радиус частиц на основе анализа флуктуации интенсивности света, рассеянного частицами, находящимися в состоянии хаотического броуновского движения.

Поверхностная концентрация белков определялась с помощью эллипсометрии из данных по толщине d и показателю преломления адсорбционной пленки nf. Эти характеристики поверхностного слоя рассчитывались на основе экспериментальных данных по эллипсометрическим углам и Д в приближении однородной пленки.

l + i

f Ami cos (p0 sin2 <p0n\M

(2)

Я(«2 -"i2)(«i2 sin2 <p0 -n\ cos2 (p0)y где lF0 и Д0 относятся к поверхности воды без пленки, ф0 - угол падения луча, и, и п2 - показатели преломления двух соприкасающихся фаз,

П/

Исследованные глобулярные белки (БЛГ и БСА) в водном растворе в области нейтральных значений рН образуют отрицательно заряженные глобулы, но БСА характеризуется более сложной третичной структурой. Если глобула БЛГ состоит из одного домена, то в глобуле БСА можно выделить три слабо связанных между собой домена.

В третьей главе рассматриваются результаты исследования динамических поверхностных свойств растворов различных конформеров БСА, образующихся при различных значениях рН раствора. Для всех исследованных систем действительная часть динамической поверхностной упругости намного превосходила ее мнимую часть и адсорбционные пленки можно рассматривать

7

100-,

Ы-форма

В-форма

100 150 200 250 300 350 400 МИН

Рис. 1. Квиетические зависимости действительной части поверхностной упругости растворов ковформеров ЕСА при ко кцентрацви 3 • 10-8 М.

как чисто упругие. Кинетические зависимости динамической

поверхностной упругости для растворов N. Б и В форм характерны для глобулярных белков. Поверхностная упругость монотонно возрастает со временем, достигая высоких значений около 80 мН/м. Для растворов Е- и особенно А-форм изменения оказались значительно более медленными (рис. 1). В работе Регага Ь.О.С. й а1. (Ьап§тшг, -2003, - V. 19, - Р. 2349) различия в динамической поверхностной

упругости растворов БСА связывались с различиями в форме глобул, и, следовательно, их упаковки в поверхностном слое. Между тем, полученные данные показывают, что изменения заряда макромолекулы при удалении рН раствора от изоэлектрической точки могут быть определяющим фактором. При адсорбции почти нейтральной >1-формы и слабо заряженных Р- и В-форм электростатический адсорбционный барьер незначителен, но он сильно возрастает при переходе к Е- и А- формам с более высоким зарядом, и может приводить к медленным изменениям динамических поверхностных свойств.

Чтобы проверить это предположение, динамическая поверхностная упругость растворов Е-формы белка была измерена в присутствии различных добавок №С1. При малой концентрации соли поверхностная упругость близка к нулю в течение пяти часов после образования новой поверхности, а начиная с концентрации 0.1 М, её величина достигает примерно 70 мН/м при приближении к равновесию, т.е. становится близкой к результатам для других конформеров (рис. 2). Таким образом, изменение формы глобулы БСА при удалении от изоэлектрической точки не вызывает значительных изменений динамической поверхностной упругости вблизи равновесия. Наблюдаемые различия в динамических поверхностных свойствах представляют кинетический эффект и связаны с увеличением абсолютной величины заряда макромолекулы. Увеличение заряда приводит к увеличению отталкивания адсорбирующихся глобул от одноименно заряженной поверхности раствора, и, следовательно, к увеличению электростатического адсорбционного барьера.

В четвёртой_главе

представлены результаты

исследования динамических

поверхностных свойств растворов БСА и БЛГ в присутствии добавок ГХГ и мочевины. Результаты последних лет, полученные в лаборатории поверхностных

явлений химического факультета СПбГУ, показывают, что динамическая поверхностная

упругость растворов гибких макромолекул, дифильных

полимеров и неглобулярных белков, сильно отличается от представленных в главе 3 данных для глобулярных белков. В первом случае динамическая поверхностная упругость вблизи равновесия в несколько раз меньше, а кинетическая зависимость этой величины имеет локальные максимумы, связанные с формированием области петель и хвостов - дальней области поверхностного слоя. На начальном этапе адсорбированные макромолекулы имеют почти плоскую конформацию в поверхностном слое без длинных петель и хвостов. При этом наблюдается рост поверхностной концентрации и поверхностной упругости в процессе адсорбции. При увеличении возраста поверхности в поверхностном слое постепенно появляются петли и хвосты. Это приводит к возникновению нового механизма релаксация поверхностных напряжений за счёт обмена сегментами между ближней и дальней областями поверхностного слоя, и динамическая поверхностная упругость начинает уменьшаться. Сравнение кинетических зависимостей динамической поверхностной упругости растворов глобулярных белков и ранее исследованного неглобулярного белка, (3-казеина, может указывать на сохранение глобулярной структуры белка в поверхностном слое. Если это предположение верно, то добавки сильных денатурантов должны приводить к резкому изменению характера кинетической зависимости динамической поверхностной упругости.

Для проверки выдвинутого предположения были выбраны два денатуранта -ГХГ и мочевина, отличающиеся между собой как по денатурирующей способности, так и по способности диссоциировать на ионы в водных растворах. Добавление в раствор БСА малых количеств ГХГ, также как и добавление индифферентного электролита ЫаС1, приводит к увеличению скорости изменения

9

I, мин

Рис. 2. Кинетические зависимости действительной части поверхностной упругости растворов Е-формы БСА при концентрации белка 3-10 8 М п добавках ХаСЬ 0.003 (круги), 0.02 (ромбы), 0.04 (квадраты), 0.1 (звёздочки) и 2 М (треугольники).

поверхностных свойств на начальной стадии адсорбции, что связано с увеличением ионной силы раствора (рис. 3). При этом кинетические зависимости

поверхностной упругости остаются монотонными. Последующее

добавление ЫаС1 также приводит к ускорению адсорбции. Однако при увеличении концентрации ГХГ наблюдается новый эффект. При достижении некоторой

критической концентрации

денатуранта (~ 0.65 М) на кинетических зависимостях

динамической поверхностной упругости появляется локальный максимум, и при приближении к равновесию поверхностная упругость сильно уменьшается. Этот результат указывает на разрушение третичной и, по-видимому, также вторичной структуры белка. Гибкость адсорбированных макромолекул увеличивается, и они образуют петли и хвосты, проникающие в глубину объемной фазы (рис. 4). Возникает новый механизм релаксации поверхностных напряжений, и динамическая поверхностная упругость проходит через максимум.

Подобное поведение наблюдалось и для растворов БЛГ: при увеличении концентрации ГХГ до некоторого критического значения (~ 0.25 М) также возникает локальный максимум динамической поверхностной упругости, отвечающий разрушению глобулярной структуры белка.

Близкие результаты наблюдаются и для растворов смеси глобулярных белков и мочевины. В этом случае, однако, возникновение локальных максимумов -наблюдается при более высоких концентрациях денатуранта (~ 1.5 М для растворов БСА и 4 М для растворов БЛГ), что согласуется с меньшей денатурирующей способностью мочевины по сравнению с ГХГ. При этом при высоких концентрациях денатурантов поверхностная упругость вблизи равновесия также оказывается выше для растворов, содержащих мочевину.

При сравнении результатов для всех исследованных систем становится заметно, что наибольшее значение действительной части динамической поверхностной упругости в области локального максимума составляет около 65 мН/м и по мере увеличения концентрации денатуранта это значение снижается до

10

І, мин

Рис.3. Кинетические зависимости действительной части поверхностной упругости растворов БСА при концентрации 3-МИ М с добавками >"аС1 (заполненные символы); 0 (квадраты), 0.5 (треугольники) и 0.65 М (круги); с добавками ГХГ (пустые символы): 02 (треугольники), 0.65 (круги) и 1.5 М (ромбы).

примерно 40 мН/м. По-видимому, эти данные характерны для большинства глобулярных белков. Последнее из них соответствует образованию хвостов и петель в поверхностном слое при адсорбции относительно свободных цепочек молекул белка, когда влияние вторичной структуры белка мало. Первое значение выше, поскольку отвечает лишь частично разрушенной

денатурация

#

адсорбция

Рис. 4. Схема разрушения глобулярной структуры БСА в поверхностном слое.

вторичной структуре, которая, однако, совместима с образованием петель и хвостов.

Таким образом, представленные результаты подтверждают сделанное предположение о сохранении глобулярной структуры белков в процессе адсорбции. В то же время сильные изменения формы кинетических кривых наблюдаются при концентрациях денатурантов, меньших, чем значения, соответствующие началу разрушения третичной структуры белка в объеме раствора. Это указывает на дестабилизирующее действие межфазной границы.

Важно отметить, что поверхностное давление, при котором возникает локальный максимум, составляет 12 мН/м для растворов БСА и 19 мНУм для растворов БЛГ как в случае смесей с ГХГ, так и с мочевиной. При достижении этого поверхностного давления развернутые белковые цепочки начинают вытесняться в подложку, образуя дальнюю область поверхностного слоя. Соответствующее значение для БСА оказывается меньше, чем в случае растворов БЛГ, что согласуется с данными об относительно меньшей устойчивости глобул этого белка.

В пятой главе представлены результаты исследования

динамических поверхностных свойств растворов комплексов глобулярных белков и ионогенных ПАВ.

Добавление ДТАБ приводит к ускорению роста поверхностного давления и увеличению равновесных значений этой величины как для растворов БЛГ, так и для растворов БСА, что

1 50 200 I, МИН

Рис. 5. Кинетические зависимости действительной части поверхностной упругости растворов БСА(310-5 М) ДТАБ при концентрации ПАВ О (квадраты), 0.01 (круги). 0.05 (треугольники), 0.1 (крестики), 1 (ромбы) и 10 мМ(звёздочки).

Рис. 6. ACM изображение плёнки ECA(3-108 М)/ДГАБ при концеетраини ПАВ 0.1 мМ.

свидетельствует об образовании комплексов белок-ПАВ с поверхностной активностью выше, чем у чистого белка. Отрицательный заряд комплекса уменьшается при увеличении концентрации катионного ПАВ, приводя к уменьшению электростатического адсорбционного барьера и увеличению скорости адсорбции. При увеличении концентрации ДТАБ все кинетические зависимости поверхностного давления остаются монотонными, в то время как для динамической поверхностной упругости форма кривых изменяется. Если концентрация ПАВ превышает некоторое критическое значение, то кинетические зависимости становятся немонотонными: после быстрого роста динамическая поверхностная упругость начинает падать (рис. 5). На кинетической кривой появляется пик, как и в случае растворов смесей белков с денатурантами. Немонотонный характер кинетических зависимостей в этом случае также может быть связан с разрушением глобулярной структуры в поверхностном слое.

Переход к немонотонным кинетическим зависимостям поверхностной упругости происходит при сравнительно высоких концентрациях ПАВ, когда в растворе присутствует избыток свободных ионов ПАВ. Поэтому изменения динамических поверхностных свойств могут быть вызваны также вытеснением поверхностно-активными ионами белковых комплексов с поверхности в объёмную фазу. Для того чтобы проверить эту возможность было проведено исследование методом АСМ плёнок, адсорбированных из растворов БСА/ДТАБ. На рис. 6 представлено изображение для плёнки, которой соответствует немонотонная кинетическая зависимости поверхностной упругости. На

изображении видно, что плёнка сплошная и не содержит отдельных доменов, характерных для процесса вытеснения белка с поверхности раствора. Величины отдельных образований согласуются с размерами глобул БСА, если принять во внимание, что они деформируются как при образовании комплексов с ПАВ, так и при переносе на твёрдую подложку. Таким образом, переход к немонотонным кинетическим зависимостям поверхностной упругости не вызван нарушениями в мезоскопической структуре плёнки. Однако изображения, соответствующие микрогетерогенным 12

Рис. 7. АСМ шображенпе плёнки БСА(3-1(Н М)/ДТАБ при концентрации ПАВ 3 мМ.

поверхностным слоям, были получены при высоких концентрациях ПАВ, близких к ККМ, что подтверждает протекание процесса

вытеснения белковых

комплексов с межфазной границы в этом

концентрационном диапазоне (рис.7). В итоге поверхность

25-,

150 200 I, МИН

1.0 мМ

0.5 мМ

о м

0.005 мМ

350

Рис. 8. Кинетические зависимости поверхностного давления растворов БСА(3-10"' М)/ДСН при различных концентрациях ПАВ.

оказывается заполненной

молекулами ПАВ, и кинетические зависимости поверхностной упругости вновь становятся

монотонными.

В отличие от растворов комплексов с ДТАБ, добавление в раствор БСА малых концентраций анионного ПАВ - ДСН приводит к уменьшению скорости изменения поверхностного давления, по-видимому, за счет увеличения отрицательного заряда комплекса и роста адсорбционного барьера (рис. 8). При переходе в область кооперативного связывания молекул ПАВ рост поверхностного давления ускоряется из-за увеличения ионной силы раствора. Влияние добавок ДСН на поверхностное давление растворов БЛГ начинает проявляться только при концентрациях около 0.01 мМ, превосходящей молярную концентрацию белка на два десятичных порядка. Этот результат согласуется с предложенным в литературе механизмом взаимодействия между глобулой БЛГ и анионными ПАВ, согласно которому поверхностно-активный анион проникает в гидрофобную полость внутри глобулы и стабилизирует ее структуру за счёт взаимодействия с положительным зарядом вблизи полости. Поэтому в широкой области концентраций ПАВ макромолекула взаимодействует только с одним или двумя анионами ДСН, полностью сохраняя третичную структуру.

Во всей исследованной области концентраций ДСН кинетические зависимости динамической поверхностной упругости монотонны (рис. 9). По-видимому, в этом случае степень разрушения третичной и вторичной структур недостаточна для образования дальней области поверхностного слоя. В то же время скорость роста поверхностной упругости уменьшается с концентрацией ДСН за счёт увеличения электростатического барьера адсорбции. Наблюдаемое различие между свойствами систем с катионными и анионными ПАВ частично связано также с разными скоростями процесса адсорбции.

13

Увеличение ионной силы раствора белок/ДСН в результате добавления ЫаС1 приводит к ускорению изменения поверхностных свойств в результате экранирования кулоновских

взаимодействий и уменьшения

адсорбционного барьера. Кроме того, взаимодействия между компонентами усиливается, третичная и вторичная структуры разрушаются в большей степени, гибкость макромолекул увеличивается и они начинают образовывать хвосты и петли. Это приводит к возникновению локального максимума на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости.

Начало образования дальней области поверхностного слоя в случае систем с ионогенными ПАВ наблюдалось при тех же характеристических значениях поверхностного давления, что и в случае растворов смесей с денатурантами, т.е. при 12 мН/м для растворов БСА и при 19 мН/м для растворов БЛГ.

Сильное уменьшение скорости изменения поверхностных свойств со временем для растворов БСА при значениях рН, удалённых от изоэлектрической точки, а также при добавлении в раствор ДСН указывает на то, что помимо стерических препятствий, возникающих при заполнении поверхности в ходе адсорбции, адсорбционный барьер содержит также значительную электростатическую составляющую.

В шестой главе представлена кинетическая модель адсорбции заряженных глобул белков и их комплексов с ПАВ, учитывающая возникновение электростатического адсорбционного барьера у межфазной границы. Диффузия частиц, в данном случае глобул белка, во внешнем поле, созданным уже адсорбированными макромолекулами, описывается с помощью уравнения Смолуховского.

дс _ _ д . _ д дс Э 5Ф (3)

д1 дх дх [_ дх кТ дх _ где с - концентрация частиц, ] - плотность потока частиц, к - постоянная Больцмана, Т — абсолютная температура, Б - коэффициент диффузии, Ф -потенциал средней силы, х - пространственная координата, отсчитываемая от межфазной границы.

I, м мн

Рис. 9. Кинетические зависимости действительной части поверхностной упругости растворов БСА(31(И М)/ДСН при концентрациях ПАВ 0 (квадраты), 0.005 (круга), 0.01 (треугольники), 0.05 (ромбы), 0.5 (крестики) и 3 иМ (звёздочки).

Основной вклад в величину потенциала средней силы вносят короткодействующие гидрофобные взаимодействия, приводящие к адсорбции глобул, и

Ф

дальнодействующие

б,

гсгах

электростатические силы отталкивания. При приближении к поверхности потенциал проходит через максимум на малом расстоянии от межфазной границы 5тах (рис. 10), поскольку

тах

Рис. 10. Зависимость потенциала средней силы от расстояния до границы раздата фаз.

радиус действия сил отталкивания

много больше, чем сил притяжения. Эффективная толщина ДЭС 5, соответствующая области, где нельзя пренебречь электростатическими силами отталкивания, т.е. где Ф « кТ, намного превышает расстояние между поверхностью жидкости и плоскостью, соответствующей максимальному потенциалу средней силы. Соотношение 5тах<< 5 позволяет рассматривать плоскость х= 5тах в качест ве поглощающей границы и считать, что с = 0 при х = бтах- Второе краевое условие задается при х = 5, где концентрация равна значению в объемной фазе.

При временах I » 52ЛЗ поток можно считать стационарным. Тогда интегрирование уравнения (3) с учетом краевых условий позволяет связать плотность потока с потенциалом Ф. Реальный поток будет меньше найденной величины из-за возникновения стерических препятствий по мере заполнения поверхности. Это можно учесть, введя функцию блокировки В, которая определялась с помощью теории случайной последовательной адсорбции.

где 0 степень заполнения поверхности.

Потенциал Ф в области 8тах.< х < 5 определяется теорией Гуи-Чепмена и может быть связан с зарядом частиц и степенью заполнения поверхности. В результате получается следующее кинетическое уравнение адсорбции заряженных частиц.

І а = Мв)

В = 1-4<9 +

г к

—<92 +1.4069<93 + 0(6>4)

я

где

V ее

а - радиус частицы, х - электрохимическая валентность частицы, гь -

электрохимическая валентность

индифферентного электролита, Я - газовая постоянная, е - диэлектрическая проницаемость среды, к - параметр Дебая-Хюккеля.

Уравнение (4) легко интегрируется. Рассчитанные таким образом кинетические зависимости поверхностной концентрации сравнивались с экспериментальными результатами для растворов комплексов БСА/ДСН, полученными при ионной силе, меньшей в 10 раз, чем для ранее исследованных систем. В этом случае выполняются основные условия справедливости представленных соотношений. Уменьшение ионной силы раствора не привело к образованию агрегатов: применение метода динамического рассеяния света показало, что раствор остаётся монодисперсным, и радиус частиц близок к значению для глобул БСА. При добавлении 1 мМ ДСН размер частиц не изменился, что свидетельствует о сохранении третичной структуры глобул в объёме раствора.

Для определения кинетических зависимостей поверхностной концентрации были проведены эллипсометрические измерения. Рассчитанные по уравнению (4) зависимости хорошо согласуются с экспериментальными данными (рис. 11). В таблице представлены значения заряда глобул, соответствующие расчетным кривым. Полученные значения оказываются в несколько раз меньше результатов расчета, учитывающего константы ионизации карбоксильных и аминогрупп молекулы белка, и в то же время хорошо согласуются с зарядом глобул БСА, вычисленным из электрофоретической подвижности (МасЫтвка В. е1 а1. Langmuir, - 2008, - У.24, - Р.6866). Данное различие может быть связано с явлением конденсации противоионов, образующих ионные пары на поверхности глобулы и снижающих тем самым её эффективный заряд. Это приводит к тому, что заряд кинетических единиц, т.е. глобул белка, движущихся вместе с частью противоионов, оказывается в несколько раз меньше заряда неподвижной глобулы в разбавленном растворе.

г, с

Рис. II. Экспериментальные (символы) в рассчитанные (пунктирные линии) кинетические зависимости

поверхностной концентрации

комплексов ЕСА(310-7 М)/ДСН при концентрации добавок ПАВ О.ООЗ (квадраты), 0.03 (круги), 0.3 (треугольники) и 1 мМ (ромбы).

Табл. 1. Рассчитанные значения зарядов комплексов БСА/ДСН при различных концентрациях ДСН._____

Концентрация ДСН, мМ Заряд комплекса БСА/ДСН, е

0.003 -5

0.03 -6

0.1 -6

0.3 -7

1 -8

Основные выводы

1. Измерение динамических поверхностных свойств растворов конформеров БСА при различных значениях рН среды показало, что замедление процесса адсорбции, наблюдаемое для ненативных форм БСА, вызвано не перестройкой глобулярной структуры, как считалось ранее, а ростом электростатического барьера адсорбции при удалении от изоэлектрической точки.

2. Показано, что разрушение третичной структуры белка приводит к появлению локального максимума на кинетической зависимости динамической поверхностной упругости растворов смеси БСА с ГХГ или мочевиной. Возникновение экстремумов на кинетических зависимостях поверхностной упругости позволяет использовать методы дилатационной. поверхностной реологии для оценки изменения конформации молекул белка в процессе адсорбции.

3. Для растворов комплексов глобулярных белков (БСА и БЛГ) и ДТАБ также обнаружен максимум на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости при концентрациях ПАВ, превышающих некоторое критическое значение, что указывает на разрушение третичной структуры белка в поверхностном слое.

4. Добавки ДСН в меньшей степени влияют на третичную и вторичную структуру БСА и БЛГ, и кинетические зависимости динамической поверхностной упругости оказываются монотонными в этом случае. Однако максимум на кинетических зависимостях поверхностной упругости в этих системах возникает при увеличении ионной силы раствора в результате усиления гидрофобного взаимодействия между компонентами.

5. Разрушение третичной структуры белка в поверхностном слое происходит при меньших концентрациях денатурирующих агентов (ГХГ, мочевины и ионогенных ПАВ), чем в объемной фазе. Поверхностное давление, соответствующее

максимуму динамической поверхностной упругости, не зависит от концентрации и химической природы денатуранта, и оказывается... характеристической величиной для данного белка.

6. Полученные результаты по поверхностным реологическим свойствам свидетельствуют о сохранении глобулярной структуры белков в поверхностном слое их водных растворов, не содержащих денатурирующих добавок.

7. Получено кинетическое уравнение адсорбции заряженных глобул на границе жидкость-газ. Применение этого уравнения для описания адсорбции комплексов БСА/ДСН позволило оценить эффективный заряд адсорбирующихся глобул, согласующийся с данными по электрофоретической.подвижности БСА в водном растворе.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:,

1. Noskov В. A., Mikhailovskaya A. A., Lin S.-Y., Loglio G.,.Miller R. Bovine Serum Albumin Unfolding at the Air/Water Interface as Studied by Dilational Surface Rheology // Langmuir, - 2010, - V.26, -P. 17225-17231.

2. Mikhailovskaya A. A., Noskov B. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Formation of Protein/Surfactant Adsorption Layer at the Air/Water Interface as Studied by Dilational Surface Rheology // J. Phys. Chem. B, - 2011, - V.l 15, - P.9971-9979.

3. Mikhailovskaya A. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R„ Noskov B. A. Impact of a cationic surfactant on the protein unfolding at the air/solution interface // Mendeleev Commun., - 2011, - V.21, - P.341-343.

4. Михайловская А.А., Носков Б.А. Влияние ионных ПАВ на разрушение третичной структуры белка по данным дилатационной поверхностной реологии // Научная сессия Секции коллоидной химии и физико-химической механики Научного совета по физической химии РАН, - 2010, - Москва, - С.12-13.

5. Михайловская А.А. Динамическая поверхностная упругость растворов комплексов белок-ПАВ // V Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире», - 2011, - Санкт-Петербург, - С. 549-550.

6. Mikhailovskaya A. A., Lin S.-Y., Loglio G„ Miller R., Noskov B. A. Impact of addaed surfactant on protein structure at the aqueous solution-air interface // 7th International Symposium "Molecular Mobility and Order in Polymer Systems", - 2011, Saint-Petersburg, - P-125.

7. Mikhailovskaya A. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R., Noskov B. A. Dilatational rheology of the adsorption films of complexes between globular proteins and ionic surfactants // 25th European Symposium on Applied Thermodynamics, - 2011, - Saint-Petersburg, - P.190-191.

8. Михайловская А.А., Носков Б.А., Лин Ш.-Ю. Поверхностная дилатационная реология растворов комплексов глобулярных белков и ионогенных ПАВ //1 Всероссийский симпозиум по поверхностно-активным веществам «От коллоидных систем к нанохимии», - 2011, - Казань, - С. 94.

9. Mikhailovskaya A., Noskov В., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Protein unfolding at the liquid-gas interface as studied by dilational surface rheology // 25th European Colloid and Interface Science conference, - 2011, - Berlin.

10. Михайловская A.A. Влияние денатурантов на динамические поверхностные свойства растворов глобулярных белков // VI Всероссийская конференция молодых учёных, аспирантов и студентов с международным участием «Менделеев-2012», - 2012, - Санкт-Петербург, - С. 87-89.

11. Mikhailovskaya A., Nikitin Е., Noskov В., Lin S-Y., Loglio G., Miller R. Impact of dénaturants on the dynamic surface properties of globular protein solution // 26th European Colloid and Interface Science conference, - 2012, - Malmo/Lund.

12. Михайловская A.A. Разрушение глобулярной структуры белка в поверхностном слое // Сборник тезисов Семнадцатой Санкт-Петербургской Ассамблеи молодых учёных и специалистов, - 2012, - Санкт-Петербург, - С.86.

Сдано в набор 25.06.13. Подписано в печать 27.06.13. Формат 60 х 84 '/je Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Печать цифровая. Усл. печ. л. 1.00. Тираж 100 экз. Заказ 6784

Отпечатано в отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504 Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., д. 26 тел.: (812) 428-4043, 428-6919

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

04201 361 344

МИХАЙЛОВСКАЯ Алеся Алексеевна

ВЛИЯНИЕ ДЕНАТУРАНТОВ НА ДИНАМИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТНЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ

Специальность 02.00.11 - коллоидная химия

Научный руководитель: д.х.н. Носков Борис Анатольевич

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петербург 2013

Оглавление

Введение......................................................................................4

I. Обзор литературы..........................................................................8

1.1. Глобулярная структура белков....................................................8

I. 2. Химическая денатурация глобулярных белков...............................10

I. 3. Взаимодействие белков и ПАВ в растворе....................................16

1.4. Поверхностные свойства растворов белков....................................18

1.5. Поверхностные свойства растворов комплексов белок - ПАВ............22

1.6. Кинетика адсорбции белков.......................................................25

I. 7. Основы теории дилатационной поверхностной вязкоупругости и её применение к растворам высокомолекулярных соединений....................32

I. 8. Применение дилатационной поверхностной реологии к растворам белков и смесей белок-ПАВ.............................................................42

II. Методы измерений и исследуемые растворы.......................................48

ПЛ. Экспериментальные методы и методика измерений..........................48

Н.2. Используемые реактивы............................................................51

III. Динамические поверхностные свойства растворов бычьего сывороточного альбумина..........................................................................................................57

IV. Динамические поверхностные свойства растворов глобулярных белков в

присутствии денатурирующих агентов...............................................59

IV. 1. Влияние гидрохлорида гуанидина на динамические поверхностные свойства растворов глобулярных белков.............................................64

IV.2. Влияние мочевины на динамические поверхностные свойства растворов бычьего сывороточного альбумина и (3-лакто-глобулина.......................................................................................76

V. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов [3-лакто-глобулина и бычьего сывороточного альбумина с ионогенными ПАВ........85

VI. Кинетика адсорбции комплексов глобулярный белок/ПАВ на границе жидкость-газ...............................................................................109

Выводы......................................................................................126

Литература.................................................................................128

Условные обозначения..................................................................149

Введение

Исследование процессов сворачивания и разворачивания глобулярных белков представляет одну из основных задач современной физической химии растворов белков. Эта задача также важна и для многих смежных областей, таких как биофизика, молекулярная биология и химия высокомолекулярных соединений. В медицине значительное внимание уделяется дефектам вторичной и третичной структур белков, возникающих в процессе сворачивания под влиянием внешних воздействий и приводящих к развитию таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, некоторые виды диабета и рака [1]. Поскольку большинство биохимических процессов в клетке происходит вблизи клеточных мембран, особое значение приобретает изучение конформационных переходов белковых молекул на границе между двумя флюидными фазами [2]. Белки характеризуются значительной поверхностной активностью и образуют на межфазных границах прочные адсорбционные пленки. С этим связано широкое применение белковых систем в качестве стабилизаторов пен и эмульсий в таких областях промышленности, как фармакологическая, пищевая и косметическая. Физическая химия белковых пленок и водных дисперсий, стабилизированных белками, представляет обширный раздел современной коллоидной химии [3-5].

Большинство результатов, полученных в последние несколько десятилетий по конформационным переходам в белковых системах, свертыванию или развертыванию молекул белка в растворах, относятся, однако, только к процессам в объёмных фазах. Для этой цели широко применялись методы электронной и флуоресцентной микроскопии, малоуглового рассеяния рентгеновского излучения и нейтронов, статического и динамического рассеяния света, кругового дихроизма, инфракрасной Фурье-спектроскопии, ядерно-магнитного резонанса, дифференциальной сканирующей калориметрии и изотермической турбидиметрии. В то же время информация о состоянии белковых молекул в поверхностном слое и об изменении третичной и вторичной структур в процессе адсорбции оказывается довольно скудной. Степень разрушения глобулярной структуры белка при

адсорбции на границе раствор/газ, до сих пор остаётся предметом дискуссии [6-19]. Так, например, потеря активности некоторых энзимов после их адсорбции на водной поверхности [20], низкая скорость адсорбции белков [8, 9, 21] и образование прочной поверхностной сети межмолекулярных связей [6, 7] привело ряд авторов к заключению, что третичная и вторичная структура белков частично утрачивается при переходе из объёмной фазы в поверхностный слой. На это указывают также некоторые результаты по спектроскопии кругового дихроизма адсорбционного слоя бычьего сывороточного альбумина (БСА) [10]. С другой стороны, с помощью метода отражения рентгеновских лучей и нейтронов было показано, что для ряда белков, включая БСА, третичная структуры в ходе адсорбции меняется незначительно [14-18]. В соответствии с данными инфракрасной Фурье-спектроскопии, вторичная структура БСА, бета-лактоглобулина (БЛГ) и глицинина также мало изменяется при адсорбции на границе раствор/воздух [11. 13, 22].

Существующие трудности при исследовании адсорбционных пленок белков вызваны, прежде всего, ограниченным набором экспериментальных методов, доступных для изучения конформационных переходов белков в поверхностном слое. Очевидно, что прогресс в этой области должен быть связан с применением новых экспериментальных методов.

Недавно было показано, что методы дилатационной поверхностной реологии позволяют определить основные стадии формирования адсорбционной пленки высокомолекулярных соединений, в частности, переход от тонкой почти двумерной поверхностной плёнки к трехмерной структуре большей толщины в результате образования петель и хвостов (дальней области поверхностного слоя) [23, 24]. Если у поверхности возникают петли и хвосты макромолекул, то релаксация поверхностных напряжений становится возможной за счёт обмена сегментами между ближней и дальней областями поверхностного слоя. Этот процесс сопровождается образованием локального максимума на кинетической зависимости дилатационной поверхностной упругости. Первые подобные результаты были получены для растворов неионных полимеров [23. 24]. Применение методов дилатационной поверхностной реологии к растворам

синтетических полиэлектролитов и их смесей с ионогенными ПАВ позволило выявить микрогетерогенность адсорбционных плёнок для этих систем [25]. Возникновение дальней области поверхностного слоя в ходе адсорбции также было обнаружено для растворов неглобулярных белков и их комплексов с ПАВ [26, 27]. В случае растворов глобулярных белков подобные немонотонные кинетические зависимости динамической поверхностной упругости можно ожидать только в случае, если гибкость макромолекул достаточна для образования петель и хвостов, то есть при разворачивании глобулы. Это позволяет использовать методы дилатационной поверхностной реологии для исследования механизма адсорбции белков на границе раствор - воздух и разрушения глобулярной структуры белков в процессе адсорбции.

Методы поверхностной дилатационной реологии основаны на регистрации отклика системы на малое механическое возмущение поверхности жидкости. При слабом растяжении (сжатии) поверхности этот отклик определяется фундаментальным поверхностным свойством системы - динамической дилатационной поверхностной упругостью. Если в системе протекают процессы релаксации механических напряжений, то эта величина оказывается комплексной, и зависит как от равновесных поверхностных свойств, так и от кинетических коэффициентов химических и физико-химических процессов в поверхностном слое, что позволяет применять методы поверхностной реологии для исследования кинетики различных процессов у межфазной границы.

Цель данной работы состоит в определении механизма формирования адсорбционной пленки глобулярных белков на поверхности водного раствора и оценки влияния на этот процесс различных денатурирующих агентов на основе данных дилатационной поверхностной реологии на примере растворов БСА и БЛГ.

Для достижения этой цели в диссертации решались следующие основные задачи:

Определение концентрационных и кинетических зависимостей комплексной динамической поверхностной упругости растворов смеси глобулярных белков и денатурантов с помощью метода осциллирующего барьера.

Определение зависимостей поверхностной концентрации от возраста поверхности и концентрации в объёме для растворов смеси глобулярных белков и ионогенного ПАВ с помощью эллипсометрии.

Определение динамического поверхностного натяжения растворов смеси глобулярных белков и денатурантов в широкой области концентраций и времен жизни поверхности.

Определение морфологии адсорбционных слоев глобулярных белков в присутствии денатурантов с помощью атомно-силовой микроскопии.

Создание кинетической модели адсорбции комплексов глобулярных белков и ионогенных поверхностно-активных веществ (ПАВ).

Сравнение результатов расчета кинетики адсорбции с экспериментальными данными и определение эффективного заряда комплекса белок/ПАВ. Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси глобулярных белков с гидрохлоридом гуанидина (ГХГ), мочевиной, додецилсульфатом натрия (ДСН), бромидом додецилтриметиламмония (ДТАБ), проявляющиеся при увеличении концентрации денатурирующего агента в растворе.

2. Обнаружение и интерпретация немонотонных кинетических зависимостей динамической поверхностной упругости растворов, содержащих глобулярные белки.

3.Механизм формирования адсорбционных пленок в растворах смеси БСА с ГХГ и мочевиной.

4.Механизм адсорбции комплексов БСА и БЛГ с ДСН и ДТАБ.

5. Кинетическая модель адсорбции комплексов глобулярных белков с ионогенными ПАВ.

I. Обзор литературы 1. Глобулярная структура белков

Белки являются природными высокомолекулярными соединениями, построенными из остатков двадцати аминокислот, соединенных пептидными связями в длинные цепи. Во всех живых организмах белки играют исключительно важную роль: они участвуют в построении клеток и тканей, являются биокатализаторами (ферменты), гормонами, дыхательными пигментами (гемоглобины), защитными веществами (иммуноглобулины) и др. Уникальные свойства белковых молекул, состоящих из строго ограниченного набора аминокислотных остатков, определяются особенностями их пространственного строения, которое может быть весьма разнообразным.

Строго определённую последовательность аминокислот в полипептидной цепи белковой молекулы называют первичной структурой белка. В свою очередь, аминокислотные цепи могут образовывать высокоупорядоченные локальные элементы вторичной структуры, стабилизированные водородными связями. Существует два главных типа таких структур - а-спирали и складчатые р-слои. В а-спирали каждый карбонил пептидной группы служит акцептором при образовании водородной связи для донора Ы-Н другой пептидной группы, отстоящей от него на расстояние четырёх остатков. На один виток а-спирали приходится 3.6 аминокислотных остатка, диаметр спирали без учёта боковых групп составляет примерно бА. В (3-форме полипептидная цепь находится в растянутом состоянии, а её С=0 и Ы-Н-группы связаны водородными связями с такими же группами соседней, параллельно ориентированной полипептидной цепи. Обе цепи могут быть независимыми или представлять фрагменты одной, общей для них цепи. Участки полипептидной цепи, которые по конформации нельзя отнести ни к а-спирали, ни к |3-слою называют беспорядочным клубком. Однако речь здесь не идёт о произвольной конформации: такие структуры в основном определяются взаимодействием боковых цепей входящих в них аминокислотных остатков, и в молекулах любого конкретного белка она фиксирована, а не беспорядочна, поэтому более правильный термин - соединительные петли [28, 29].

Полипептидная цепь в глобулярных белках в естественном состоянии свёрнута в компактную структуру - глобулу, в отличие от фибриллярных белков, длинные цепи которых вытянуты вдоль одной оси. Сворачиваясь в глобулу, белок приобретает определённую пространственную третичную структуру, которая и является биологически функциональной. Так, например, восемь из девяти антипараллельных Р-листов молекулы Р-лактоглобулина образуют структуру, напоминающую приплюснутый конус, внутренняя поверхность которого гидрофобна [30]. Такое образование играет роль гидрофобного кармана, внутри которого могут прикрепляться различные лиганды, такие как жирные кислоты [31] и ретинол [32], а также низкомолекулярные ПАВ [33, 34], на чём и основывается транспортная функция данного белка в организме.

Итак, элементы вторичной структуры скрепляются в единую третичную структуру. Некоторый вклад в стабилизацию такой укладки вносят ионные и водородные связи между боковыми цепями аминокислотных остатков, однако главную роль играют гидрофобные силы, которые определяют локализацию гидрофобных цепей в центральной части молекулы, уменьшая, таким образом, площадь их контакта с водой и увеличивая Ван-дер-Ваальсово взаимодействие. Высокая плотность упаковки, наблюдающаяся в белках, свидетельствует об эффективном использовании всех нековалентных взаимодействий в организации их структуры [35].

В ряде случаев белок обладает четвертичной структурой - молекула белка или надмолекулярная белковая система состоит из некоторого числа глобул. Такие комплексы называют олигомерными, мультимерными или субъединичными белками [28]. Их состав и стехиометрия постоянны. Например, молекула гемоглобина содержит 4 глобулы двух сортов. Характер структуры на каждом уровне организации определяется геометрическими свойствами структур предыдущего уровня, силами взаимодействия их элементов и взаимодействием с окружающей средой. Возникновение «высшей» структуры происходит как бы автоматически в результате самосборки системы [36].

В трёхмерной структуре больших белков иногда обнаруживается не одна, а несколько в той или иной степени независимо образованных компактных областей,

соединённых малоструктурированными полипептидными участками. Такие фрагменты полипептидной цепи, сходные по своим свойствам с самостоятельными глобулярными белками, выделяют в отдельные белковые модули или домены. Домены характеризуются значительной автономностью. Так, например, конформационные изменения в макромолекуле БСА, вызванные снижением рН раствора, происходят только в пределах одного из трёх доменов, составляющих структуру этого белка [37].

Белок с исходной, природной укладкой цепи называют нативным. Процесс разворачивания нативной структуры в беспорядочную цепь при воздействии различных внешних факторов, сопровождающийся потерей биологической функции белка, называется денатурацией. Денатурация подразумевает различные превращения молекулы белка, но не разрыв полипептидной цепочки, т.е. она не затрагивает первичную структуру. Очевидно, что макромолекула в денатурированном состоянии является как бы отправной точкой для последующей самосборки белковой структуры. Протекание именно этого процесса без искажений будет влиять на восстановление физиологических функций белка. Определение механизма такого процесса самоорганизации является одним из принципиальных вопросов современной биологии [38].

2. Химическая денатурация глобулярных белков

Одним из способов воздействия на глобулярную структуру является химическая денатурация, то есть разворачивание макромолекул белка в присутствии определённых денатурирующих агентов.

Под действием денатурирующих агентов в водном растворе происходит частичное или полное разрушение третичной и частично вторичной структуры белка. В литературе предложено два механизма взаимодействия денатуранта с белком - прямой и косвенный [39-44]. Прямой механизм подразумевает прикрепление денатуранта к полипептидной цепочке белка за счёт электростатического, Ван-дер-Ваальсового взаимодействия и образований водородных связей. Простейшая модель связывания предполагает наличие на

поверхности белковых глобул специфических мест для прикрепления молекул или ионов денатуранта, количеств�