Изучение самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.14 ВАК РФ

КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

НЕСМЕЛОВА ИРИНА ВЛАДИСЛАВОВНА

ИЗУЧЕНИЕ САМОДИФФУЗИИ МОЛЕКУЛ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ МЕТОДОМ ЯМР С ИМПУЛЬСНЫМ ГРАДИЕНТОМ МАГНИТНОГО ПОЛЯ

01.04.14 - теплофизика и молекулярная физика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Казань - 1998

Работа выполнена па кафедре молекулярной физики Казанского государственного университета и в лаборатории молекулярной биофизики Казанского института биохимии и биофизики КНЦ РАН.

Научный руководитель - доктор физико-математических наук,

профессор В.Д. Скирда

Научный консультант - доктор физико-математических наук,

чл.-корр. АН Татарстана, профессор В.Д. Федотов

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук,

чл.-корр. АН Татарстана, профессор A.B. Ильясов

кандидат физико-математических наук, доцент В.А. Севрюгин

Недупцая организация - Институт Молекулярной Биологии РАН,

г. Москва

Зашита диссертации состоится (О декабря 1998 в /У часов на заседании диссертационного совета Д053.29.02 при Казанском государственном университете по адресу: 420008, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Казанского государственного университета

Автореферат разослан 3 ноября 1998 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. паук, профессор ' - М.В. Еремин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование самодиффузии молекул белков в водных растворах является актуальной проблемой современной биофизики. С одной стороны, знание особенностей самодиффузии молекул белков в широком интервале концентраций и температур необходимо для понимания механизма функционирования белка в клетке. С другой, молекулы белков идентичны друг другу, обладают жесткой глобулярной структурой, имеют размеры, более чем па порядок превышающие размеры молекул растворителя - воды, имеют заряд, величину которого можно изменять, варьируя значение рН раствора. Поэтому они представляют собой хорошую модельную сисгему для изучения растворов заряженных макромолекул.

В настоящее время накоплен большой экспериментальный материал и сложились представления о самодиффузии молекул белков в области разбавленных растворов. Показано, что поведение молекул глобулярных белков в разбавленных растворах близко к поведению жестких брауновских частиц. Систематического же изучения самодиффузии молекул белков в области концентрированных растворов до сих пор не проводилось. Для ряда белков существуют данные по зависимостям их коэффициентов самодиффузии (КСД) от концентрации вплоть до 20-30 весовых %, но экспериментальные данные по самодиффузии молекул белков для всей области растворимости белка отсутствуют. Также до сих пор не проводились исследования самодиффузии молекул глобулярных белков в растворах, где произошли преобразования их внутренней или надмолекулярной структуры. Так как эти процессы связаны с изменением размеров кинетических единиц в растворе, то естественно ожидать, что измерения коэффициентов самодиффузии могут дать дополнительную информацию об этих процессах.

Целыо данной работы являлось изучение особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах в широком интервале концентраций, температур и рН, в том числе при тех значениях этих параметров, при которых происходят изменения внугри-и надмолекулярной структур молекул белков, методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля.

Научная новизна определяется тем, что в работе впервые:

1) При исследовании самодиффузии молекул глобулярных белков проведен учет индивидуальных свойств молекул белков, в частности их

склонности к ассоциации, и построена обобщенная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков; проведено сравнение полученных данных по самодиффузии молекул глобулярных белков с результатами, характерными для молекул гибкоцеппых полимеров, а также с моделью жестких брауновских частиц. Показано, что согласование экспериментальных данных с теорией растворов брауновских частиц для диапазона исследованных концентраций <р может быть достигнуто путем введения нормированной концентрации (<р-£,), где - отношение критической концентраций ф0 в растворах жестких брауновских сфер и критической концентрации ф в растворах белков. ф0 находилась из пересечение асимптоты с нулевым

наклоном и касательной с наклоном (ф) 3, проведенных к теоретической

кривой, представленной в логарифмических координатах.

2) Предложено для расчета константы равновесия реакции ассоциации молекул белков использовать КСД молекул белков. Метод расчета описан на примере исследования растворов лизоцима для модели неопределенной ассоциации.

3) Проведено детальное исследование самодиффузии молекул белков в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНК азы при рН=2.5, для которых при повышении температуры характерно не только изменение (разрушение) внутримолекулярной структуры, но и образование оптически прозрачного геля при высоких концентрациях. Показано, что процесс гелеобразования в растворах данных белков проявляется в уменьшении коэффициентов самодиффузии молекул белков с ростом температуры и изменении формы диффузионного затухания.

Практическое значение работы заключается в том, что:

1) Построенная обобщенная концентрационная зависимость может быть использована для прогнозирования КСД молекул глобулярных белков. Уменьшение критической концентрации ф по сравнению с ф0 может являться индикатором происходящей в растворе ассоциации молекул.

2) Предложенный метод расчета константы равновесия реакции ассоциации молекул по данным измерений коэффициентов самодиффузии, примененный в работе к лизоциму, может использоваться при изучении реакций ассоциации других глобулярных белков при условии, что степень ассоциирования молекул зависит от концентрации белка в растворе.

3) Обнаруженные при образовании прозрачного геля в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНКазы при рН=2.5 аномальное уменьшение коэффициента самодиффузии молекул белка с ростом температуры, уменьшение амплитуды спинового эхо, а также отклонение формы диффузионного затухания от экспоненциальной, могуг служить гестом при обнаружении гелеобразования и в растворах других белков.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: Всес. Конф. "Структура и молекулярная динамика полимерных систем" (Йошкар-Ола, 1994); 17, 18 Congress AMPERE "Magn. Res. and Related Phenomena" (Kazan, 1994; Canterbery, Great Britain, 1996); XVI, XVII International Conferences on Magnetic Resonance iu Biological Systems (Veldhoven, Netherlands, 1994; Keystone, Colorado, USA, 1996); International Symposium: "Molecular mobility and order in polymer systems" (Sankt-Petersburg, 1994); 39 Annual Biophysical Society Meeting (San Francisco, USA, 1995); 7lh Chianti Workshop on Magnetic Resonance (San Miniato (Pisa), Italy, 1997); 5 Всероссийском семинаре по спектроскопии ЯМР (Москва, 1997); ежегодных итоговых конференциях Казанского Государственного Университета за 1994-1995 гг. и Казанского Института Биологии за 1996-1997 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ; из них 4 статьи в центральной печати, 1 - в сборнике, 9 тезисов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 121 странице, содержит 22 рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 1621 ссылки. Работа выполнена при частичной поддержке гранта РФФИ №96-04-49582.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Во введении кратко обоснованы выбор темы и актуальность работы, сформулированы цель и задачи исследования.

В первой главе дается обзор и проводится анализ современных представлений и экспериментальных исследований самодиффузии молекул глобулярных белков и воды в водных растворах. Рассматриваются теоретические основы и особенности применения метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля к изучению трансляционной подвижности молекул. Приводится описание структуры и свойств молекул глобулярных белков. В конце главы формулируется задача диссертации и обосновывается выбор объектов исследования.

Вторая глава содержит краткое описание аппаратуры, используемой в эксперименте. Даются характеристики объектов исследования, описываются методики приготовления образцов, проведения измерений и обработки результатов. Точность измеряемых в эксперименте параметров составляла 5-10%, в зависимости от концентрации образца.

В третьей главе представлены экспериментальные данные для коэффициентов самодиффузии молекул воды и белков (миогдобина, БСА, лизоцима, барстара) в широком интервале концентраций и температур.

В начале главы показано, что диффузионное затухание (ДЗ), характеризующее большинство исследованных дейтероводных растворов описывается суммой двух экспонент, при этом больший из наблюдавшихся КОД характеризует молекулы появившейся в результате протонного обмена с соответствующими группами белка легкой воды, меньший КСД - молекулы белка. Гидратная вода, как показал анализ зависимости формы ДЗ от времени диффузии, не проявляется в диффузионном затухании вследствие быстрого молекулярного обмена между молекулами объемной и гидралюй воды.

Далее приводятся полученные нами экспериментальные зависимости КСД молекул белков [1-7] I) от концентрации <р (объемная доля белка) и последовательно дается описание поведения молекул белка в разбавленных и концентрированных растворах.

При рассмотрении разбавленных растворов значения КСД при бесконечном разбавлении Дь полученные путем линейной экстраполяции экспериментальных зависимостей О(ср) на нулевое значение концентрации, сравниваются с рассчитанными по формуле Стокса-Эйнштейна для жесткой брауновской сферы:

0 бят]/? ^ ^

где к - константа Больцмана, Т - температура, ц - вязкость растворителя; а также с рассчитанными с учетом отклонения формы белка от сферической по формуле Псррена1 для сплющенного эллипсоида. Показано, что только в случае барстара наблюдается большая разница между экспериментальным и расчетным значениями Д>, что может быть связано с ассоциацией его молекул.

1 Реггш /•: -./. РЬух. \Ышт (Рат), 1936, >'. 7, р. /.

При рассмотрении концентрированных растворов делается попытка выявить закономерности трансляционной подвижности, общие для всех глобулярных белков. Для этого по аналогии с гибкоцепными полимерами2,3 построена обобщенная концентрационная зависимость КСД молекул исследованных белков (рис.1). Предварительно в работе показано, что в отличие от молекул гибкоцепных полимеров нет необходимости учитывать локальную трансляционную подвижность сегментов полилептадной цепи, и обобщенные координаты мо(уг быть взяты в виде: 1п{1.)Юц) и /л(ф/ф). Заметим, что для обобщенной концентрационной зависимости (рис.1 - сплошная линия) гибкоцепных полимеров существуют две асимптоты (<р/ф)° и (ф/ф) 3, между которыми

наблюдается плавный переход. В случае гибкоцепных полимеров, значение критической концентрации ф формально находится из пересечения указанных асимптот. В рамках представленных на рисунке данных для КСД глобулярных белков также можно выделить асимптоту (ср/ф)°, однако о существовании для растворов глобулярных белков асимптоты

D/D

1001

10-1

10-2-

Ю-з

-.....i-.....-(ф/ф

□ 1 a 5

0 2 0 6

Д 3 A 7

V 4 V 8

0 9 ♦ 10

1 11

0Л

Рис.1 Обобщенная концентрационная зависимость КСД молекул глобулярных белков, построенная но данным для БСА (р11=4.8-5.2) и миоглобина (6.8-7.2) при 10 (I, 5), 20 (2, 6), 24 (3, 7), 35°С (4, 8); лизоцима при 30°С, рН=2.9-3.0 (9) и 7.47.8 (10); барстара при 30°С, рН=8.0-8.2 (11). Сплошная линия - обобщенная концентрационная зависимость КСД гибкоцепных полиме-ров2'3.

ф/ф

v Skirt/a VAX, Simdukov V.l., Maklakov A.I., Zgcidzai O.E., GafnrovI.ll, Vasiljev G.l. -Polymer, 1988, v.29, p. 1294-1300; Maklakov A.I., Skirda V.l). andFalkullin N.P., (1990) in Encyclopedia of Fluid Mechanics, Vol.9: Polymer Plow Engineering (Cheremisinov N.P., ed.),p.702„ Gulf Publishing Company, Houston.

типа (ф/ф) 3 со стороны больших ф говорить нельзя. Тем не менее, в

достаточно большом диапазоне изменения величины О! Оо экспериментальные значения вполне удовлетворяют зависимости 1)/1)п к (ф/ф) 3. Поэтому значения критической концентрации растворов белков определялись из пересечения асимптоты с нулевым наклоном и касательной с наклоном (ф)"3. Известно2,3, что в случае гибкоцепных полимеров величина ф по смыслу близка к так называемой критической концентрации перекрывания клубков, зависящей от молекулярной массы полимера. Однако, в случае молекул глобулярных белков, если в концентрацию ф вкладывать такой же смысл, то есть интерпретировать ее как концентрацию, при которой молекулы белка начинают касаться друг друга, зависимости ф от молекулярной массы наблюдаться не должно. Тем не менее, нами было обнаружено, что критическая концентрация ф имеет разные значения в растворах разных белков (см таблицу 1). При этом, какой-либо четкой корреляции с молекулярной массой белка не прослеживается и, кроме того, в ряде случаев значение ф зависит от величины рН.

Таблица /. Значения критических концентраций ф и нормировочных коэффициентов £ для растворов исследованных белков.

Исследуемый раствор Молекулярная масса белка, г/М Критическая концентрация, ф, объемные доли Нормировочный коэффициент, £ _ Фо/ ^ /ф

миоглобин, рН=6.8-7.2 17000 0.16 1

БСА, рН=4.8-5.2 66500 0.1 1.6

барстар, рН=8.0-8.2 11000 0.13 1.23

лизоцим, рН=2.9-3.0 14600 0.15 1.07

лизоцим, рН=7.4-7.8 0.08 2

Представляя величину ф как некоторую динамическую критическую концентрацию, которая определяет изменение динамических свойств молекул белков при переходе от области разбавленных к области концентрированных растворов, на основании полученных данных высказывается гипотеза, согласно которой значение ф может быть связано с процессами ассоциации молекул белков.

Еще одна особенность растворов бел кои проявилась в том, что обобщенная концентрационная зависимость КСД бел кои отличается от таковой доя гибкоценных макромолекул и в области промежуточных

концентраций. Переход между наклонами (ф/ф)° и (ф/ф) ' па

зависимости КСД глобулярных белков более резкий, чем у гибкоценных полимероп, что следует ожидать из структурных различий молекул глобулярных белков и гибкоценных полимеров.

Другой способ описания концентрационных зависимостей КСД молекул белков проведен в рамках теории браунонских частиц. Для этого используется результат' работы'1 , в которой концентрационная зависимость КСД жестких брауиовских сфер рассчитана с учетом гидродинамических и потенциальных взаимодействий: 7)„(1 -9ф/32)

где

1 + Л/Сф) + (<р/фо)/(1-ф/фо) Ф0 « 0.5718,

(2)

/У (с р) =

2/г

М 2 + с)

(1-й) 1/2

(1 + 2 с) (1 + с)(1 - /> + с) '

'!*рУ" с.„Цф 8 / 16 '

На рис. 2 приведены концентрационные записимостн относительных КСД 0//)ц миоглобина и БСА в координатах 1)/Ои п ф. Как видно из рисунка, концентрационные зависимост и КСД миоглобина удовлетворительно описываются теоретической кривой. Для раствором

Рис. 2 Зависимости относительных КСД миоглобина (14), р! 1=6.8-7.2, и ПСЛ (5-8), рН=4.8-5.2, измеренные при 7'=35°С (I, 5), 7-24°С (2, 6), 7=20°С (3, 7), 7-10°С (4, 8). Сплошная линия - зависимость относительных КСД жестких брауиовских сфер, рассчитанная4 теоретически с учетом гидродинамических и потенциальных взаимодействий между сферами.

О/О

0,0 0,1

Ф

* Токпучта М., Оррепцсйн /. -/%*. На-. К, /УУ/. г. 50, р. Ш6-1Ш.

-9-

лнзоцима при рН-2.9-3.0 также наблюдалось удовлетворительное согласие с теорией. Концентрационные зависимости относительных КСД молекул ЬСД оказались более сильными по сравнению с предсказаниями теории. То же наблюдалось » растворах барстара при р1Н8.0-8.2 н лизоцима при р!-1=7.4-7.8. Так как радиус сфер не входит п выражение (2), ход рассчитанных зависимостей КСД будет одинаков для растворов сфер разных радиусов, а значит, различия между экспериментальными зависимостями КСД молекул белков и теоретически рассчитанной кривой не могут быть связаны с различиями в размерах молекул исследуемых белков. При выводе формулы (2) предполагается одинаковость взаимодействии между частицами, моделируемых жесткими сферами. Однако, в случае реальных молекул белков это условие, очевидно, не выполняется. Для учета индивидуальных свойств различных систем вода-белок мы попытались использовать найденные для них выше значения ф и ввести для концентрации <р нормировочный коэффициент (см. таблицу), являющийся отношением критических концентраций, ф„ и ф. Значение Фп (критическая концентрация для гипотетического раствора брауновских сфер) находилось из пересечении асимптоты с нулевым наклоном и касательной с наклоном (ф) \ проведенных к теоретической кривой (формула 2), представленной » логарифмических координатах. Результат представления исходных экспериментальных концентрационных зависимостей 1)П)о в координатах /Ж>« - ср демонстрируется па рис. 3: все

Рис. 3 Зависимости относительных КСД (Ш)о) от нормированной концентрации (фф) для миоглобнпа (1-4), рН~б.8-7.2, и БСА (5-8), рН=4.8-5.2, измеренные при 7=35°С (1, 5), 7-24"С: (2, 6), 7-20"С (3, 7), /'= 10°С (4, 8); лизоцима при р11=2.9-3.0 (9) и 7.4-7.8 (10), барстара (1) при рН=8.0-8.2 (II), измеренные при 7~30°С. Сплошная линия - зависимость относительных КСД "жестких брауиопских сфер4.

РЮ

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

-Ю-

все экспериментальные данные с точностью погрешности эксперимента образуют единую концентрационную зависимость. Более того, п пределах ошибки эксперимента в области исследованных концентрации, общая зависимость КСД молекул глобулярных белков от концентрации совпадает с теоретической зависимостью КСД жестких брпуновских сфер. Следовательно, можно считать, что общие динамические свойства молекул глобулярных белков в растворах близки свойствам жестких брауновских частиц во всей области исследованных концентрации. Заметим, что максимальная исследованная концентрация не превышала 0.85 ф„, где ср0 - концентрация плотной упаковки сфер (формула (2)). Таким образом, отклонение зависимостей КСД молекул БСЛ, барстпра, лизоцима при рН=7.4-7.8, от теоретической концентрационной зависимости КСД брауновских сфер связано с проявлением индивидуальных свойств молекул, в первую очередь, их склонности к ассоциации.

Температурные зависимости КСД белков исследованы в работе на примере миоглобина и БСА в интервале от 5 до 85 "С. Показано, что наблюдается характерная для жестких брауновских сфер независимость энергии активации самодиффузии 11л молекул белков от концентрации Ф (формула (1,2)) по веем исследованном интервале концентрации, по значения Нл молекул белков незначительно (на 15-20%) превышают значения для молекул воды, что указывает на небольшое отклонение в поведении молекул белков от поведения жестких брауновских частиц.

В конце третьей главы проводится анализ самодиффузип молекул воды и растворах белков на примере растворов миоглобина и БСА. Приводятся зависимости КСД молекул воды от концентрации белка ф и показывается, что они имеют экспоненциальный вид. Дана оценка доли гидрптной воды в растворах миоглобина. Для этого были исследованы [9,10] зависимости среднего по образцу КСД О молекул в интервале температур от -30 до 35 °С в растворах с разной концентрацией воды. При больших концентрациях волы замерзание свободной воды приводит к резкому уменьшению О. Причем, степень уменьшения КСД зависит от содержания поды в растворе: увеличивается с ростом концентрации воды в образце. В то же время, при содержании поды в растворе 0.23 обьемных процента и меньше никаких аномалий п области температуры замерзания спободной воды не наблюдается. Это может означать, что вся пода в растворе при этих концентрациях гилратная. Отсюда можно рассчитать максимальное количсстпо гидратион поды па количество белка в образце миоглобина, которое оказалось рапным /7 ~ 0.43 г поды/г

- И -

белка. Ниже температуры замерзания свободной поды ц растиоре остается только гидратная иода, и КСД отражают диффузионные свойства поды п гидратиой оболочке.

Четвертая глава посвящена исследованию самодиффузии молекул белков в растворах, где пугем изменения рН среды, концентрации белка и температуры достигались изменения по внутримолекулярной и надмолекулярной (агрегация, ассоциация, гелеобразование) структурах.

При изменении рИ среды изменяется заряд молекулы белка. Полому прежде всего необходимо выяснить возможность влияния заряда молекулы на ее КСД. В результате анализа зависимостей КСД миоглобина отрЫ показано, что КСД миоглобина постоянен в интервале рН от 4.0 до ¡1.0. Следовательно, происходящее при этом изменение общего заряда молекулы белка (как показали наши оценки, от Т до 5+ элементарных зарядов) не приводит к заметному изменению КСД его молекулы.

Из рассмотрения полученных зависимостей КСД молекул белкой от величины рИ среды в растворах миоглобина (3.6<рИ<12.3) и лизоцима [10,11] (1.5<рН<8.5) вытекает, что агрегация и ассоциация молекул белков может приводить к ощутимому уменьшению их КСД. Для примера па рис. 4 приведены зависимости КСД молекул лизоцима от рН. Как видно из рисунка, на зависимостях КСД молекул лизоцима от рН наблюдается область резкого уменьшения КСД, ширина которой составляет 2 рН. За пределами згой области КСД молекул лизоцима не

О, *1010 м2/с

Рис. 4 Зависимости коэффициентов самодиффузни молекул лизоцима и растворах с весовыми концентрациями белка 4% (1), 4.4% (2), 10% (3), 7=30°С.

1,41.2 1.0 0,8 0.6

4.0 %

■ — о — о-о

— 4.4%

10.0 %

а ю РН

Д..

зависят от рН. Такой характер рН-зависимости КСД лизоцима отражает происходящую в растворе ассоциацию молекул. Так при рН<4.0 в растворах присутствуют только мономеры лизоцима и их КСД пе зависит от величины рН. Наблюдающееся в интервале рН от 4.0 до 6.5 уменьшение КСД лизоцима может быть связано с увеличением размеров движущихся единиц, вызванным происходящей в системе ассоциацией молекул. Постоянство КСД лизоцима при рН больших. 6.5 вероятно означает, что в системе установилось равновесие между числом мономеров и ассоциатов.

В результате анализа полученных зависимостей КСД молекул лизоцима от концентрации при разных значениях рН нами предложен [10-12] метод расчета константы равновесия реакции ассоциации молекул лизоцима по данным измерений КСД. Для описания реакции ассоциации молекул лизоцима использовалась модель неопределенной ассоциации, которая предполагает, что рост ассоциатов молекул лизоцима происходит путем добавления к ним мономерных единиц. При расчете сделаны следующие упрощающие предположения: а) константы равновесия реакции присоединения мономера к ассоциатам, состоящим из разного числа мономеров, одинаковы5 и равны к; б) все ассоциаты имеют сферическую форму; в) рассматриваемые растворы являются идеальными, т.е. коэффициенты активности всех компонентов раствора равны единице.

Рассматриваемая модель ассоциации может быть описана следующей системой уравнений:

Здесь М\ - мономер, М1 - ассоциат, состоящий из / мономеров, п -максимальное число мономеров в ассоциате. По определению и согласно предположению а) величина ] равна:

где концентрации /'-меров с, выражены в М/л, а для общей концентрации белка в растворе с, выраженной в молярных единицах, можно записать:

М¡_\ +МХ < *м ->А/,- где /= 1 ,п

/-1

(3)

(4)

5 НсупМ.Р., Вге12 К. -ВюрЬух. СЬст., 1975, V. З.р. 35-45.

Если формулу (2) переписать в виде D=Do/(ф) и выразить концентрацию лизоцима в М/л, то коэффициент самодиффузии имеющего сферическую форму ассоциата может быть записан в виде:

А (6)

где с - концентрация лизоцима.

В диссертации дан подробный анализ формы диффузионных затуханий, наблюдавшихся в растворах лизоцима, где присутствовали ассоциаты молекул. Оказалось, что компонента ДЗ, характеризующая трансляционную подвижность молекул лизоцима в этих растворах, в исследованном динамическом диапазоне оставалась

одноэкспоненциальной при всех концентрациях белка. Измеряемый КСД молекул, следовательно, являлся средним для всех представленных в растворе ассоциатов и мономеров:

» = (7)

или:

ъл'-цХ. (8)

с /=1 лИ

Необходимо отметить, что вид функции Дс) не зависит от размеров сфер4. Поэтому, выражение (8) будет справедливым для набора сфер разного размера. ■■''.■'■'"

С помощью уравнений (5) и (8) можно рассчитать константы равновесия реакции неопределенной ассоциации. Найденное значение А=320.5±0.5 л/М лежит в интервале приводимых в литературе из данных других методов (147-690 л/М). С помощью данного значения константы равновесия определяется состав раствора лизоцима: рассчитываются концентрации или доли ассоциатов, состоящих из разного числа молекул, в зависимости от общей концентрации белка в растворе.

Известно6, что в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНКазы при рН=2.5 в результате нагрева происходит разрушение вторичной структуры молекул белков, а при высоких концентрациях белка и образование прозрачного геля. В этих растворах нами [13,14] проведено исследование зависимостей КСД молекул белков в зависимости от температуры. Показано, что при указанных условиях размер молекул лизоцима и РНКазы в результате разрушения их вторичной структуры

6 Clark А.Н., SaundersoH IXH.P.. Suggett A. -Int. J. Peptide Protein Res., 1981. v. 17, p. 353-36-1.

изменяется примерно в два раза. Образование геля проявляется в аномальном уменьшении КСД молекул белков и уменьшении амплитуды спинового эхо с ростом температуры (рис. 5), а также в отклонении формы относящейся к молекулам белка компоненты ДЗ от экспоненциальной.

Рис. 5 Зависимости КСД лизоцима в растворах с концентрациями белка 1.8% (1), 4.7% (2), 8.5% (3) и амплитуды спинового эха в образце с концентрацией белка 8.5% (4) от температуры, при рН=1.56.

80 70 60 50 40 30 20 Т, ОС

£

S

о "Ч

О

1

о"

ч /'

^ А

2,8

3,0

А 1

□ 2

о 3

- 4

----i

3,2 3,4

l/T(*103K-i)

ч:

О)

СП §

о

10

с Е га

ВЫВОДЫ.

1. Методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля экспериментально исследованы зависимости коэффициентов самодиффузии молекул воды и глобулярных белков (миоглобина, бычьего сывороточного альбумина (БСА), барстара, лизоцима, рибонуклеазы А (РНКазы)) в их водных растворах в широком интервале .концентраций, температур и pH.

2. Впервые установлен вид единой универсальной концентрационной зависимости приведенных (D/Do) коэффициентов самодиффузии D молекул глобулярных белков в водных растворах, не зависящей от природы и свойств молекул белков и отражающей наиболее общие закономерности их трансляционной динамики. Для этого использованы приведенные концентрации (ф/ф), где ф -динамическая критическая концентрация, которая зависит от индивидуальных свойств молекул белков. Установлено, что величина ф

зависит, в частности, от степени ассоциирования молекул белка в растворе: уменьшается под влиянием этого фактора.

Показано, что обобщенные концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул белков и гибкоцепных полимеров различаются. Это различие проявляется в существовании на обобщенной концентрационной кривой КСД белков более резкого перехода от асимптоты с нулевым наклоном к участку с наклоном

3. Установлено, что исходные экспериментально полученные концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул белков в растворах в большинстве исследованных объектов не совпадают с теоретической зависимостью, рассчитанной с учетом гидродинамических и потенциальных взаимодействий для модели жестких брауновских сфер в растворах.

Показано, что согласование экспериментальных данных с теорией растворов брауновских частиц для диапазона исследованных концентраций может быть достигнуто путем введения нормированной

концентрации (<р-£), где £ = а Фо ~ критическая концентрация в

растворах жестких брауновских сфер, которая находилась из пересечения асимптоты с нулевым наклоном и касательной с наклоном (ф) 3, проведенных к теоретической кривой, представленной в

логарифмических координатах.

4. В результате исследования температурных зависимостей КСД молекул глобулярных белков на примере растворов миоглобина и БСА обнаружено, что энергия активации самодиффузии молекул белка постоянна во всем исследованном диапазоне концентраций, что соответствует модели жестких брауновских сфер. Отклонение от поведения брауновских частиц у молекул белков проявляется в незначительном (на 15-20%) превышении значения энергии активации их самодиффузии по сравнению с энергией" активации самодиффузии молекул растворителя - воды.

5. Показано, что концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул воды в растворах разных белков примерно одинаковы и имеют экспоненциальный вид. Из анализа температурных зависимостей средних по образцу коэффициентов самодиффузии молекул, регистрировавшихся в растворах с разным процентным содержанием воды в интервале от +35 до -35 °С, оценено, что в растворе

•з

миоглобина содержится 0.43 г гидратной воды на 1 г белка. Показано, что при температурах выше 0 °С специфический для систем белок-вода вклад гидратной воды не проявляется ни в форме диффузионного затухания, ни в се зависимости от времени диффузии, что связывается с быстрым молекулярным обменом свободная вода - гидратная вода.

6. Проведено детальное исследование самодиффузии в условиях формирования надмолекулярных структур (ассоциации и агрегации) молекул миоглобина и лизоцима в растворах при изменении рН среды.

На примере миоглобина показано,, что изменение только заряда белка не приводит к существенному изменению КСД молекулы. Напротив, агрегация молекул, сопровождающая процесс денатурации белка, которая проявилась в растворах миоглобина при значениях рН<4.0 и рН>11.0, и ассоциация, происходящая в растворах лизоцима при рН>4.0, приводит к ощутимому уменьшению регистрируемого коэффициента самодиффузии.

Впервые для расчета константы равновесия реакции ассоциации к молекул белка предложено использовать данные измерений его коэффициентов самодиффузии. На примере растворов лизоцима (рН>4.0) рассчитанное значение к в модели неопределенной ассоциации составило 320.5±0.5 л/М, что соответствует литературным данным (147— 690 л/М) из других методов исследования.

7. Проведено детальное исследование самодиффузии молекул белков в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНКазы при рН=2.5, для которых при повышении температуры характерно не только разрушение внутримолекулярной структуры, но и образование оптически прозрачного геля при высоких концентрациях.

Установлена, что в результате разрушения внутримолекулярной структуры, объем молекул лизоцима и РНКазы в растворах при указанных условиях увеличивается примерно в два раза.

Впервые показано, что процесс гелеобразования в растворах данных белков может проявляется в уменьшении коэффициентов самодиффузии молекул белков с ростом температуры и изменении формы диффузионного затухания. Установлено, что не все молекулы белка входят в сетку геля; оценка доли вступивших в сетку геля молекул может быть проведена по уменьшению амплитуды сигнала спинового эхо.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Несмелова И.В., Федотов В.Д. Самодиффузия молекул миоглобина и воды в растворах. - Высокомол. Соед., 1997, Серия А, том 39, с. 521— 526.

2. Несмелова И.В., Ермолина И.В., Федотов В.Д. Динамическое поведение молекул миоглобина в растворе. - В сб: Структура и молекулярная динамика полимерных систем, Йошкар-Ола, 1995, с. 75-77. УДК 513.72

3. Несмелова И.В., Федотов В.Д. Некоторые особенности самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах, 5 Всероссийский семинар по спектроскопии ЯМР, Москва, 1997, 9-10 декабря, материалы семинара, с. 44.

4. Nesmelova I.V., Fedotov V.D. Study of self-diffusion of myoglobin molecules in solutions, XXVIII Congress AMPERE, Canterbery, Great Britain, 1996, September 1-6, in abstract book И, p. 113b.

5. Ermolina I.V., Krushelnitsky A.G., Ivoylov I.N., Nesinelova I.V., Fedotov V.D. Investigation of molecular motion and interprotein interaction in solutions by TDDS and 1H NMR, 39 Annual Biophysical Society Meeting, San Francisco, USA, 1995, February 12-16, 1995, in abstract book, p. A343.

6. Ermolina I.V., Krushelnitsky A., Fedotov V.D., Nesmelova I.V. The dynamic behavior of protein molecules in solutions. Investigation by timedomain dielectric spectroscopy and non-selective JH NMR relaxation, International Symposium: "Molecular mobility and order in polymer systems", Sankt-Petersburg, Russia, October 3-6, 1994, in abstract book, p. 11.

7. Nesmelova I.V., Yagodina L.O. Study of myoglobin dynamics in D20 solutions by pulsed-field gradient NMR, XVI International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Veldhoven, Netherlands, August 14-19,1994, in abstract book, p. 157.

8. Kimmich R., Klammler F., Skirda V.D., Serebrennikova I.V. (Nesmelova I.V.), Maklakov A.I., Fatkullin N. Geometrical restrictions of water diffusion in aqueous protein systems. A study using NMR field-gradient teclmiques. - Appl. Magn. Res., 1993, v. 4, p. 425-440.

9. Kimmich R., Klammler F., Skirda V.D., Serebrennikova I.V. (Nesmelova I.V.), Maklakov A. I., Fatkullin N. Geometrical restrictions of water diffusion in aqueous protein systems. A study using NMR field-gradient

techniques, International workshop "Magnetic Resonance and Dynamics of Proteins", Kazan, USSR, July 1-7,1991.

10. Nesmelova I.V., Fedotov V.D. Self-diffusion and self-association of lysozyme molecules in solution. - Biophys. Biocliim. Acta, 1998, v. 1383, p. 311-316.

11. Nesmelova I.V., Fedotov V.D. "Study of protein self-association by pulsed field gradient NMR on example of lysozyme molecules", 7lh Chianti Workshop on Magnetic Resonance, San Miniato (Pisa), Italy, 1997, May 25-31, in abstract book, p.101.

12. Несмелова И.В., Федотов В.Д. Определение константы ассоциации лизоцима по данным измерений коэффициентов самодиффузии. -Мол. Биология, 1998, т.32, с. 664-667.

13. Nesmelova I.V., Ennolina I.V., FaizuIIin D.A., Translational and rotational diffusion of RNase molecules during thermal unfolding, XVII International Conference on Magnetic Resonance in Biological Systems, Keystone, Colorado, USA, 1996, August 18-23, in abstract book, p.207.

14. Nesmelova I.V., Ermolina I.V., FaizuIIin D.A. Study of translational and rotational diffusion on RNase molecules in aqueous solutions during thermal unfolding, EENC'96, Thirteenth European Experimental NMR Conference, Paris, 1996, May 19-24, in abstract book, p. 195.

. ОЦ™ 1 / Ц У-7 - У, С/ / * 3 4 / I л> *

казанский государственный университет

'А

На правах рукописи

НЕСМЕЛОВА Ирина Владиславовна

ИЗУЧЕНИЕ САМОДИФФУЗИИ МОЛЕКУЛ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЖОВ В ВОДНЫХ РАСТВОРАХ МЕТОДОМ ЯМР С ИМПУЛЬСНЫМ ГРАДИЕНТОМ МАГНИТНОГО ПОЛЯ.

Специальность 01.04.14 - теплофизика и молекулярная физика

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Научный руководитель -доктор физико-математических наук профессор В.Д. Скирда

Научный консультант-доктор физико-математических наук, чл.-корр. АН Татарстана, профессор

В.Д. Федотов

Казань -1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр

ВВЕДЕНИЕ..............................................................................................5

ГЛАВА 1 ЯВЛЕНИЕ САМОДИФФУЗИИ. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О САМОДИФФУЗИИ МОЛЕ КУЛ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ............................................9

1.1 Явление самодиффузии макромолекул и методы ее изучения. Коэффициент самодиффузии..............................9

1.2 Основные принципы измерения коэффициентов самодиффузии молекул методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля..............................................11

1.3 Особенности строения молекул белков.............................15

1.4 Ассоциация и агрегация в растворах белков.....................18

1.5 Самодиффузия молекул глобулярных белков

в растворах...........................................................................21

1.5.1 Разбавленные растворы......................................................21

1.5.2 Концентрированные растворы...........................................26

1.6 Самодиффузия молекул воды в растворах белков............31

1.7 Постановка задачи диссертации и выбор объектов исследования.......................................................................33

ГЛАВА 2 МЕТОДИКА ИЗМЕРЕНИЙ И ОБЪЕКТЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ............................................................34

2.1 Объекты исследования.......................................................34

2.2 Методика приготовления образцов....................................36

2.3 Аппаратура..........................................................................38

2.3.1 Характеристики аппаратуры для измерения коэффициентов самодиффузии методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля........................38

2.3.2 Характеристики аппаратуры для измерения времен ядерной спин-спиновой и спин-решеточной

релаксации..........................................................................39

2.4 Методика измерений коэффициентов самодиффузии......39

2.5 Методика измерений времен релаксации..........................43

ГЛАВА 3 САМОДИФФУЗИЯ МОЛЕКУЛ ГЛОБУЛЯРНЫХ

БЕЛКОВ И ВОДЫ В РАСТВОРАХ 44

3.1 Форма диффузионного затухания в растворах

белков..................................................................................44

3.2 Концентрационные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков

в растворах...........................................................................48

3.2.1 Разбавленные растворы......................................................48

3.2.2 Обобщенная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии белков для исследованных растворов.............................................................................54

3.2.3 Критическая концентрация ф*...........................................58

3.2.4 Описание концентрационных зависимостей коэффициентов самодиффузии молекул

белков в рамках теории брауновских частиц.....................61

3.3 Температурные зависимости коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков

в растворе............................................................................68

3.4 Самодиффузия молекул воды в растворах белков............73

ГЛАВА 4 СВЯЗЬ ВНУТРИ- И НАДМОЛЕКУЛЯРНЫХ

ПРЕОБРАЗОВАНИЙ И САМОДИФФУЗИИ МОЛЕКУЛ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ................77

4.1 Связь внутри- и надмолекулярных преобразований и

самодиффузии молекул глобулярных белков в растворах при варьировании рН среды...............................................78

4.1.1 Зависимости коэффициентов самодиффузии молекул белков от рН среды.............................................................78

4.1.2 Влияние ассоциации молекул лизоцима на

концентрационную зависимость их коэффициентов

самодиффузии.....................................................................84

4.1.3 Определение константы ассоциации лизоцима по

данным измерений его коэффициентов самодиффузии ... 85 4.2 Связь внутри- и надмолекулярных преобразований и

самодиффузии молекул глобулярных белков в растворах при варьировании температуры.........................................93

4.2.1 Зависимости коэффициентов самодиффузии молекул миоглобина и лизоцима от температуры при некоторых значениях рН среды............................................................93

4.2.2 Влияние разрушения нативной структуры и гелеобразования в растворах лизоцима и РНКазы на

их самодиффузию...............................................................96

ВЫВОДЫ............................................................................................105

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................108

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Исследование самодиффузии молекул белков в водных растворах является актуальной проблемой современной биофизики. С одной стороны, знание особенностей самодиффузии молекул белков в широком интервале концентраций и температур необходимо для понимания механизма функционирования белка в клетке и представляет большой интерес для биологов. С другой -молекулы белков идентичны друг другу, обладают уникальной жесткой глобулярной структурой, имеют размеры, более чем на порядок превышающие размеры молекул растворителя - воды, имеют заряд, величину которого можно изменять, варьируя значение рН раствора, и поэтому они представляют собой хорошую модельную систему для изучения растворов заряженных макромолекул.

В настоящее время накоплен экспериментальный материал по изучению особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков в области разбавленных растворов, и показано, что их поведение в разбавленных растворах близко к поведению жестких брауновских частиц. Что касается области концентрированных растворов, то здесь систематического изучения самодиффузии молекул белков не проводилось, причем в настоящее время данные по самодиффузии молекул белков для всей области растворимости белка отсутствуют. Также до сих пор не проводились исследования самодиффузии молекул глобулярных белков при изменении их внутренней структуры и агрегации. Так как эти процессы связаны с изменением размеров кинетических единиц в растворе, то естественно ожидать, что измерения коэффициентов самодиффузии могут оказаться информативными для их изучения.

Одним из наиболее распространенных для изучения особенностей самодиффузии малых и макромолекул в растворах является метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля [1], обладающий такими преимуществами как быстрота проведения эксперимента и небольшое

количество требуемого образца, извлечение информации об объекте на молекулярном уровне без внесения в него сторонних меток.

Целью данной работы являлось изучение особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков в водных растворах в широком интервале концентраций, температур и рН, в том числе при тех значениях этих параметров, при которых происходят изменения внутри-и надмолекулярной структур молекул белков, методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля.

Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы.

Первая глава посвящена обзору и анализу современных представлений и экспериментальных исследований самодиффузии молекул глобулярных белков и воды в водных растворах. Рассматриваются теоретические основы и особенности применения метода ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля к изучению трансляционной подвижности молекул. В конце главы формулируется задача диссертации и обосновывается выбор объектов исследования.

Вторая глава содержит краткое описание аппаратуры, используемой в эксперименте. Даются характеристики объектов исследования, описываются методики приготовления образцов, проведения измерений и обработки результатов.

В третьей главе представлены экспериментальные результаты для коэффициентов самодиффузии молекул белков (миоглобина, БСА, лизоцима, барстара) и воды в широком интервале концентраций и температур. Рассматриваются наиболее общие закономерности самодиффузии молекул белков в сравнении с имеющимися в литературе экспериментальными и теоретическими данными по самодиффузии молекул гибкоцепных полимеров и жестких брауновских частиц.

В четвертой главе проводится исследование самодиффузии молекул белков в растворах, где путем изменения рН среды, концентрации белка и температуры достигались изменения во внутримолекулярной и надмолекулярной (агрегация, ассоциация,

гелеобразование) структурах белков. Анализируются возможности метода ЯМР с ИГМП в исследованиях указанных явлений.

На защиту выносятся следующие основные результаты:

На защиту выносятся положения, сформулированные в выводах.

Научная новизна.

1) При исследовании самодиффузии молекул глобулярных белков проведен учет индивидуальных свойств молекул белков, в частности их склонности к ассоциации, и построена обобщенная концентрационная зависимость коэффициентов самодиффузии молекул глобулярных белков; проведено сравнение особенностей самодиффузии молекул глобулярных белков с результатами, характерными для молекул гибкоцепных полимеров, а также с моделью жестких брауновских частиц. Показано, что согласование экспериментальных данных с теорией растворов брауновских частиц для диапазона исследованных концентраций может быть достигнуто путем введения нормированной концентрации (ср-£), где - отношение критической концентраций ф0 в растворах жестких брауновских сфер и критической концентрации ф в растворах белков. ф0 находилась из пересечение асимптоты с нулевым наклоном и касательной с наклоном (ф) 3, проведенных к теоретической

кривой, представленной в логарифмических координатах.

2) Предложено для расчета константы равновесия реакции ассоциации молекул белков использовать КСД молекул белков. Метод расчета описан на примере исследования растворов лизоцима для модели неопределенной ассоциации.

3) Проведено детальное исследование самодиффузии молекул белков в растворах лизоцима при рН=1.56 и РНКазы при рН=2.5, для которых при повышении температуры характерно не только разрушение внутримолекулярной структуры, но и образование оптически прозрачного геля при высоких концентрациях. Показано, что образование прозрачного геля в этих растворах проявляется в

аномальном уменьшении коэффициента самодиффузии молекул белка с ростом температуры, уменьшении амплитуды спинового эхо, отклонении формы компоненты диффузионного затухания, характеризующей молекулы белка в растворе, от экспоненциальной.

Аппробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: Всес. Конф. "Структура и молекулярная динамика полимерных систем" (Йошкар-Ола, 1994); 17, 18 Congress AMPERE "Magn. Res. and Related Phenomena" (Kazan, 1994; Canterbery, Great Britain, 1996); XVI, XVII International Conferences on Magnetic Resonance in Biological Systems (Veldhoven, Netherlands, 1994; Keystone, Colorado, USA, 1996); International Symposium: "Molecular mobility and order in polymer systems" (Sankt-Petersburg, 1994); 39 Annual Biophysical Society Meeting (San Francisco, USA, 1995); 7th Chianti Workshop on Magnetic Resonance (San Miniato (Pisa), Italy, 1997); 5 Всероссийском семинаре по спектроскопии ЯМР (Москва, 1997); ежегодных итоговых конференциях Казанского Государственного Университета за 1994-1995 гг. и Казанского Института Биологии за 1996-1997 гг.

По материалам диссертации опубликовано 14 работ. Из них 4 статьи в центральной печати, 1 статья в сборнике, 9 тезисов.

ГЛАВА 1

САМОДИФФУЗИЯ МОЛЕКУЛ И МЕТОДЫ ЕЕ ИЗМЕРЕНИЯ. СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА МОЛЕКУЛ БЕЛКОВ. САМОДИФФУЗИЯ МОЛЕКУЛ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ.

1.1. Явление самодиффузии макромолекул и методы ее изучения. Коэффициент самодиффузии.

Под самодиффузией понимают тепловое хаотическое пространственное

перемещение молекул в результате их теплового движения в

термодинамически равновесной системе. Эти перемещения имеют случайный

характер и описываются с помощью плотности условной вероятности Р(г - г0,1) обнаружить центр тяжести рассматриваемой молекулы в точке

пространства с радиус-вектором г в момент времени t, если в начальный момент времени /=0 он находился в точке г0. При временах наблюдения t

>^тах, где ттах является наибольшим из времен корреляции, связанных с

пространственными степенями свободы рассматриваемой молекулы, Р(г -гописывается только одним параметром D и имеет вид:

Параметр В называется коэффициентом самодиффузии (КСД), а режим движения при выполнении условия ? >ттах диффузионным [1].

Выражение (1.1) позволяет получить соотношение Эйнштейна для среднеквадратичного смещения молекулы за время V.

Коэффициент самодиффузии О из общих принципов статистической физики определяется через автокорреляционную функцию скорости молекулы <у(/)-у(0)>, где V - вектор скорости центра масс молекулы

следующим образом [2]:

ч

/

(1.1)

(1.2)

(1.3)

Другое, часто используемое в теории и эксперименте, определение КСД, связывающее коэффициент самодиффузии с коэффициентом трения /, следует из классической теории брауновского движения [3], а именно, из

решения уравнения Ланжевена:

кТ

Д = (1.4)

где к - постоянная Больцмана, Т - температура.

Для жесткой непроницаемой сферы радиусом Я, движущейся в жидкости, коэффициент трения равен:

/^впцЯ, (1.5)

где г| - вязкость растворителя.

В этом случае коэффициент самодиффузии сферы равен:

ь-т .... ' -.. В = (1.6)

бпцЯ.

Если система многокомпонентна, то аналогичным образом можно ввести парциальные КСД Д, характеризующие трансляционную подвижность /-ой компоненты.

Следует различать самодиффузию и взаимодиффузию, которая происходит в неравновесной среде из-за наличия в ней градиента концентрации или, в общем случае, градиента химического потенциала [4].

При взаимодиффузии возникает направленный против градиента концентрации (химического потенциала) поток частиц, который может наблюдаться макроскопически. Для наблюдения самодиффузии молекул должны применяться методы, которые могут «метить» отдельные молекулы, не нарушая термодинамического равновесия в системе и по возможности меньше изменяя свойства самой молекулы.

В настоящее время наиболее распространенными методами для изучения самодиффузии являются: метод квазиупругого рассеяния нейтронов [5], метод вынужденного релеевского рассеяния света [6], метод радиоактивного мечения атомов [7], метод ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля (ИГМП) [1,8-11]. Каждый из этих методов отличается по чувствительности к смещениям молекул. Метод радиоактивного мечения атомов детектирует смещения порядка нескольких миллиметров и пригоден

для молекул, имеющих достаточно большие коэффициенты самодиффузии. Напротив, метод нейтронного рассеяния может детектировать смещения порядка нескольких А, т.е. действительно микроскопические смещения. Что касается методов светорассеяния и ЯМР с ИГМП, то диапазоны детектируемых ими смещений одинаковы и равны ~ 100 А - 10 мкм.

Так как в данной работе в качестве метода исследования самодиффузии молекул глобулярных белков был выбран ЯМР с ИГМП, то остановимся на описании этого метода подробнее.

1.2. Основные принципы измерения коэффициентов самодиффузии молекул методом ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля.

Теории метода ЯМР и, в частности, обоснованию его применения к измерению трансляционной подвижности посвящено большое количество работ [12-19]. В методе ЯМР меткой молекулы является магнитный момент или спин ядер Д, входящих в ее состав атомов (чаще всего протонов 1Н, а

также и других магнитных ядер, таких как 13С, 31Р, 15И и др.). Явление ЯМР заключается в резонансном поглощении (испускании) энергии радиочастотного (рч) поля системой спинов, помещенных во внешнее магнитное поле. Рассмотрим кратко это явление с классической точки зрения.

При наложении внешнего постоянного магнитного поля Н0 (пусть для определенности вектор Н0 ориентирован вдоль оси г лабораторной системы координат) в результате взаимодействия с ним ядерных моментов иг в

образце возникает макроскопическая намагниченность М, направленная по полю и представляющая собой векторную сумму М - X Дг магнитных

моментов отдельных ядер, прецессирующих вокруг Я0 с частотой = уН0,

где у - гиромагнитное отношение ядра. Облучение образца в течение времени т переменным рч полем с частотой у0 = м?0/2%, направленным перпендикулярно полю Н0 приводит к отклонению вектора намагниченности от направления Я0 на угол 0 = у/У,т (чаще всего используют повороты на тс/2

и к). При этом в приемно-передающей катушке, ось которой направлена ± полю //0, фиксируется сигнал свободной индукции с амплитудой Л(0),

пропорциональной проекции вектора М на плоскость ху лабораторной системы координат. С течением времени вектор М релаксирует к своему первоначальному состоянию, и амплитуда сигнала свободной индукции затухает. Различают два вида релаксации М. Первый связан с уменьшением составляющей вектора намагниченности _1_ полю Н0 (М±) и обусловлен спин-

спиновыми взаимодействиями (спин-спиновая релаксация - ССР). Второй связан с увеличением составляющей вектора намагниченности || полю Н0

(Мц) и обусловлен передачей энергии возбужденных ядерных спинов в

решетку (спин-решеточная релаксация - СРР). Каждый �