Динамические поверхностные свойства растворов комплексов белков и полиэлектролитов тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

// <?

МИЛЯЕВА Ольга Юрьевна

ДИНАМИЧЕСКИЕ ПОВЕРХНОСТЫЕ СВОЙСТВА РАСТВОРОВ КОМПЛЕКСОВ БЕЛКОВ И ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ.

Специальность 02.00.11 - коллоидная химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

ь АВГ 2015

Санкт-Петербург 2015

005571273

005571273

Работа выполнена на кафедре коллоидной химии Института Химии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет».

Научный руководитель: Носков Борис Анатольевич,

доктор химических наук, профессор, Санкт-Петербургский государственный университет

Официальные оппоненты: Бибик Ефим Ефимович,

доктор химических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»

Писарев Олег Александрович,

кандидат химических наук, доцент, ФГБУН «Институт высокомолекулярных соединений Российской академии наук» Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Мурманский государственный

технический университет»

Защита состоится (¡/¿у> сентября 2015 г в /J~ часов на заседании диссертационного совета Д 212.323.40 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, БХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького СПбГУ по адресу: Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9.

Автореферат разослан ii/t&u-iA 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических науАдо!

Суходолов Н.Г.

Общая характеристика работы

Актуальпость работы. Исследование взаимодействия белков и полиэлектролитов в растворах представляет важную задачу как с фундаментальной, так и с прикладной точки зрения. Подбирая компоненты и меняя их концентрации можно получить широкий набор систем с различными свойствами. Разнообразие комплексов белков и полиэлектролитов в растворе обуславливает широкий круг практических применений этих систем используемых в качестве биокатализаторов, бисенсоров, для разделения и очистки белков, направленной доставки лекарств. В большинстве работ по растворам комплексов белков и полиэлекгролитов исследуются объемные фазы. Информация о поверхностных свойствах растворов смесей белок-полиэлектролит в литературе практически отсутствует. В то же время изучение конформационных переходов белковых глобул на границе раздела флюидных фаз в присутствии полиэлектролита представляется важным по нескольким причинам. Во-первых, при практическом применении смесей белков и полиэлекгролитов обычно приходится сталкиваться с дисперсиями и тонкими пленками, устойчивость и динамика которых определяются поверхностными реологическими свойствами, и, следовательно, конформахщей макромолекул у межфазной границы. Во-вторых, большинство биохимических процессов в клетке происходит у клеточных мембран. Поэтому особое значение приобретает изучение конформационных переходов белковых молекул в адсорбционных и нанесенных поверхностных пленках. Поскольку биологические функции белков во многом определяются их структурой, исследование химических взаимодействий и физико-химических процессов, приводящих к изменению вторичной и третичной структур белка у межфазной границы, представляет одну из важных задач современной коллоидной химии.

Цель работы состоит в определении механизма формирования адсорбционной пленки из растворов смеси белок - полиэлектролит на границе раствор - газ и оценю! влияния на этот процесс денатурирующих агентов на основе данных дилатационной поверхностной реологии.

Для достижения этой цели в диссертации решались следующие основные задачи:

Исследование совместной адсорбции амфифильного неионного полимера и белка на границе жидкость - газ.

Определение морфологии адсорбционных слоев амфифильного неионного полимера и белка с помощью атомно-силовой микроскопии

Определение концентрационных и кинетических зависимостей комплексной динамической поверхностной упругости и поверхностного натяжения растворов смеси белков и полиэлекгролитов методами осциллирующего барьера и осциллирующего кольца.

Определение кинетических зависимостей поверхностной концентрации растворов смеси глобулярных белков и полиэлектролитов с помощью эллипсометрии. [у

Определение морфологии адсорбционных слоев глобулярных белков в присутствии полиэлектролитов с помощью атомно-силовой микроскопии.

Определение влияния денатурангов на кинетические и концентрационные зависимости поверхностных свойств растворов смеси глобулярных белков и полиэлектролитов.

Сравнение результатов расчета кинетической зависимости поверхностной концентрации с экспериментальными данными для растворов комплексов белок/полиэлектролит и определение эффективного заряда комплекса.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние синтетических полиэлекгролитов на третичную структуру белков в поверхностном слое и механизм формирования адсорбционного слоя комплексов белок/полиэлектролит на границе водный раствор - воздух. Обнаружено, что хотя комплексы могут образовываться в объеме раствора в случае одноименно заряженных компонентов, разрушение третичной структуры в поверхностном слое происходит только тогда, когда белок и полиэлектролит противоположно заряжены. Показано, что скорость адсорбции комплексов белок/полиэлектролит определяется их суммарным зарядом и зависит от образования мультимолекулярных агрегатов в растворе. Установлено, что различие в механизме денатурирующего действия между гидрохлоридом гуанидина (ГХГ) и мочевиной приводит к различным эффектам при взаимодействии этих веществ с комплексами лизоцим/полистиролсульфонат натрия (ПСС) в поверхностном слое, в частности, в первом случае возникает сильный синергетический эффект, отсутствующий при взаимодействии этих комплексов с мочевиной. Сравнение расчетных и экспериментальных кинетических зависимостей поверхностной концентрации избытка позволило оценить эффективную величину заряда адсорбирующегося глобулярного комплекса ПСС/бычий сывороточный альбумин (БСА).

Практическая значимость работы Информация о взаимодействии белков и полиэлектролитов в поверхностном слое, о структуре адсорбционной пленки белок/полиэлектролит должна способствовать пониманию функционирования белков в живых организмах, а также может быть использована при создании биосенсоров, для развития и оптимизации новых методов доставки лекарств в живом организме, методов разделения и очистки белков. Изменение внешних условий и подбор компонентов позволяет широко варьировать не только физико-химические свойства таких систем, но и влиять на вторичную и третичную структуры молекулы белка, изменяя ее биологическую активность, что может найти применение при создании новых биотехнологий. Данные по поверхностным реологическим свойствам позволяют найти оптимальные условия для стабилизации пен и эмульсий, содержащих белки и используемых в пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей и 10 тезисов докладов.

Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде докладов на следующих научных мероприятиях: Всероссийском симпозиуме «От коллоидных систем к нанохимии» (Казань, 2011), V Всероссийской конференции «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011), VI Всероссийской конференции «Менделеев 2012» (Саша-Петербург, 2012), VII Всероссийской конференции «Менделеев - 2013» (Санкт-Петербург, 2013), 14th European Student Colloid Conference (Потсдам, 2013), XIX international conference on chemical thermodynamics in Russia (Москва, 2014), IV International Conference on colloid chemistry and physicochemical mechanics (Москва, 2013), VIII Всероссийской конференции «Менделеев -2014» (Санкт-Петербург,2014), 8th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, 2014), 20th International Symposium on Surfactants in Solution (Коимбра, 2014).

Положения и результаты, выносимые на защиту:

1. Обнаружение трех локальных максимумов на кинетической зависимости динамической поверхностной упругости растворов смеси поли(М-изопропилакриламида) (ПНИПАМ) с ß-казеином и их интерпретация.

2. Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси белков с полистиролсульфонатом натрия (ПСС) и хлоридом полидиаллилдиметиламмония (ПДАДМАХ) при различных pH.

3. Особенности поверхностной вязкоупругости растворов смеси белков с ПСС и ПДАДМАХ в присутствии денатурантов,

4. Синергетическое действие ПСС и ГХГ на динамические свойства адсорбционной пленки лизоцима.

5. Механизм формирования адсорбционных пленок в растворах смеси белков и полиэлектролитов в присутствии и отсутствии денатуранта.

6. Определение влияния структурной организации белка на механизм взаимодействия с полиэлектролитом в поверхностном слое.

Личный вклад автора.

Авторский вклад состоит в постановке основных задач, непосредственном выполнении экспериментальных исследований, в обработке полученных результатов, анализе и обобщении полученных данных и формулировке выводов.

Структура п объем работы. Диссертационная работа объемом 140 страниц машинописного текста состоит из введения, семи разделов, содержащих 64 рисунка и 1 таблицу, выводов и списка литературы, включающего 207 наименований.

Основное содержание работы Во введении кратко излагаются актуальность и цели исследования. Первая глава содержит обзор литературы, в котором представлены общие сведения о структуре белков и механизмах их химической денатурации, детально рассмотрен процесс образования комплексов между белками и полиэлектролитами. Приведены уравнения, описывающие кинетику адсорбции белков. Особое внимание уделено работам по теории динамической поверхностной упругости и результатам исследований динамических поверхностных свойств белков и их смесей с денатуратами различной химической природы. Исследованию поверхностных свойств растворов комплексов белок/полиэлектролит посвящено всего несколько работ, в которых взаимодействие между белками и полиэлектролитами на межфазной границе рассматривается в основном для растворов комплексов белков и полисахаридов.

Во второй главе описываются экспериментальные методы, методика измерений и приготовление растворов белков. Поверхностное натяжение измерялось методом пластинки Вильгельми. Использованные методы дилатационной поверхностной реологии (метод осциллирующего кольца и метод осциллирующего барьера) основаны на регистрации отклика системы на малое механическое возмущение поверхности жидкости. При слабом растяжении (сжатии) поверхности этот отклик определяется фундаментальным поверхностным свойством системы - динамической дилатационной поверхностной упругостью. Морфология адсорбционных пленок определялась методом микроскопия атомных сил. С этой целью пленки с водной поверхности переносились на поверхность слюды методом Ленгмюра-Блоджетт. Кинетика адсорбции исследовалась с помощью эллипсометрии. Разность между эллипсометрическими углами Д для тонких однородных адсорбционных пленок и для водной поверхности оказывается пропорциональной поверхностной концентрации. Размеры возникающих в объеме раствора агрегатов определялись методом динамического рассеяния света.

В третьей главе рассматривается дилатационная динамическая поверхностная упругость и динамическое поверхностное натяжение растворов смеси Р-казеина и ПНИПАМ с целью оценки влияния относительно слабых гидрофобных взаимодействий между компонентами в поверхностном слое на кинетические зависимости поверхностных свойств. Все измерения проводились в области концентраций полимера от 8*10"5 до 0,02мг/мл при постоянной концентрации белка 0,004 мг/мл.

Кинетические зависимости динамической поверхностной упругости меняются с увеличением концентрации ПНИПАМ от результатов, типичных для растворов чистого 0-казеина, к зависимостям, ранее полученным для растворов чистого ПНИПАМ. В области

средних концентраций можно наблюдать процесс перехода от адсорбционной пленки р-казеина к поверхностному слою ПНИПАМ во времени. В этом случае белок адсорбируется быстрее, однако, более высокая поверхностная активность ПНИПАМ приводит к вытеснению Р-казеина из поверхностного слоя, даже если концентрация последнего в объеме в несколько раз выше концентрации ПНИПАМ.

к. мН/м

Рис. 1. Зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления растворов смеси [3-казеина (при концентрации 0,004 мг/мл) и ПНИПАМ с отношениями молярных концентраций (Р-казеин/ПНИПАМ) <х> (квадраты), 50 : 1 (круги), 20 : I (снежинки), 10 : 1 (треугольники), 5: 1 (звезды), 2 : 1 (ромбы), 1 : 1 (пятиугольники), 1 : 5 (крестики).

•Щ

Рис. 2. Морфология пленок, полученных при переносе на поверхность слюды адсорбционных пленок с поверхности растворов чистого р-казеина (слева) и смеси р-казеин/ПНИПАМ при молярном соотношении 10:1 (справа).

Изменение формы и величины пиков на кинетических кривых динамической поверхностной упругости или на кривых зависимостей этой величины от поверхностного давления указывают на взаимодействие между (5-казсином и ПНИПАМ в поверхностном слое (рис.1). Увеличение поверхностного давления, соответствующее первому максимуму поверхностной упругости указывает на влияние полимера и возникающие в результате затруднения при образовании петель и хвостов. Взаимодействие р-казеина с гидрофобными группами ПНИПАМ приводит к увеличению критического поверхностного давления, соответствующего началу вытеснения более гидрофобных частей молекулы белка с 16 мН/м до 19 мН/м (при молярном соотношении 5:1), и к увеличению поверхностной упругости (область второго максимума). Слабое уменьшение третьего пика на кинетических кривых поверхностной упругости для раствора с соотношением компонентов 5:1. указывает на то, что Р-казеин все еще присутствует в поверхностном слое спустя примерно два часа с момента образования поверхности Исследование морфологии пленок, полученных методом Ленгмюра-Блоджет, подтверждает вывод об образовании микрогетерогенных пленок при вытеснении белка полимером (рис.2).

В четвертой главе рассмотрено применение дилатационной поверхностной реологии к растворам комплексов глобулярный белок/полиэлектролит с целью оценки влияния на третичную структуру белков взаимодействия с полиэлектролитом в поверхностном слое.

Динамические поверхностные свойства растворов смеси БСА/ПДАДМАХ и БСА/ПСС измерялись как функция возраста поверхности и концентрации полиэлектролита при концентрации БСА 8* 10"5 мМ и четырех разных рН: 2,3, 3,8, 7 и 10,4. В первом параграфе этой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПДАДМАХ. При рН ниже изоэлектрической точки близость кинетических зависимостей динамических поверхностных свойств к результатам для растворов чистого белка указывает на отсутствие взаимодействия между компонентами.

С увеличением рН электростатическое взаимодействие между молекулами белка и полиэлектролита приводит к образованию комплексов. Поверхностная активность комплекса увеличивается по сравнению с результатами для раствора чистого белка. В то же время уменьшение общего заряда комплекса с увеличением концентрации полиэлектролита приводит к уменьшению электростатического барьера адсорбции, и, следовательно, к увеличению скорости изменения поверхностных свойств на начальном этапе адсорбции. Кроме того, зависимости динамической поверхностной упругости от возраста поверхности и поверхностного давления становятся немонотонными (рис. 3), что указывает на начало разрушения глобулярной структуры БСА в результате взаимодействия с полиэлектролитом. Поверхностное давление, соответствующее локальному максимуму (12 мН/м), является характеристическим значением для БСА и соответствует вытеснению частей развернутой молекулы из ближней области поверхностного слоя в дальнюю область в виде хвостов и петель. При поверхностном давлении, меньшем 12 мН/м, зависимости поверхностной упругости от поверхностного давления близки к данным для растворов чистого белка, и добавление

75

полиэлектролита не влияет на структуру адсорбционного слоя.

60'

15-

45

У

0

0

5 10 15 20 25

7Г.мН/м

Рис. 4. Схема адсорбционного слоя первичных комплексов БСА/ПДАДМАХ.

Рис. 3. Зависимость динамической поверхностной упругости от поверхностного давления растворов смеси БСА/ПДАДМАХ при рН=7 и концентрациях ПДАДМАХ: 0 (квадраты), 2*10"5 (снежинки), 2*10"4 (ромбы), 2*10"3 (звезды), 2*10"2 (круги), 2*10"' мг/мл (треугольники).

Можно предположить, что первичный комплекс БСА/ПДАДМАХ состоит из относительно жесткой глобулы, окруженной гибкой и мягкой оболочкой полиэлектролита.

В процессе адсорбции эта оболочка вытесняется в дальнюю область поверхностного слоя и не влияет на взаимодействия между глобулами в поверхностном слое при поверхностном давлении меньше 12 мН/м (рис. 4).

Во втором параграфе четвертой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА/ПСС. При рН=7 и рН=10,4, когда компоненты одноименно заряжены, полиэлекгролит не влияет на структуру поверхностного слоя, однако, скорость изменения поверхностных свойств уменьшается с ростом концентрации полиэлектролита (рис. 5). Этот результат указывает на образование комплексов БСА/ПСС за счет взаимодействия полиэлектролита с участками поверхности глобулы имеющими заряд, противоположный суммарному заряду молекулы белка. Взаимодействие между компонентами облегчается высокой гибкостью молекулы ПСС и возможной стабилизацией комплексов за счет гидрофобных взаимодействий. Образование комплекса приводит к увеличению суммарного заряда адсорбирующихся частиц, и, следовательно, адсорбционного барьера.

Рис. 5. Кинетические зависимости действительной части Динамической поверхностной упругости растворов смесей БСА/ПСС при рН=7 (слева) и рН=3,8 (справа) и концентрациях ПСС: 0 (квадраты), 2*10"!(снежинки), 2*10'4 (ромбы), 2* 10'3 (звезды), 2*10'2 (круги), 2*10"'мг/мл (треугольники).

При переходе к рН=2,3 и рН=3,8 характер кинетических зависимостей меняется (рис. 5). При низких концентрациях ПСС динамические поверхностные свойства растворов БСА/ПСС оказываются близкими к свойствам растворов смеси разноименно заряженных БСА и ПДАДМАХ. Образующийся комплекс имеет меньший заряд и более поверхностно активен по сравнению с БСА. Скорость изменения поверхностных свойств увеличивается и на зависимостях динамической поверхностной упругости появляется максимум, соответствующий характеристическому давлению образования петель и хвостов. При увеличении концентрации полиэлектролита (> 2*10"3 мг/мл) наблюдается сильное уменьшение скорости изменения

поверхностных свойств. Этот эффект можно объяснить переменой знака заряда комплекса в области эквимолярных концентраций компонентов и увеличением абсолютной величины заряда при высоких концентрациях полиэлектролита. Таким образом, взаимодействие между компонентами в растворах БСА/ПСС оказывается сильнее, чем в случае растворов БСА/ПДАДМАХ, что, вероятно, связано с большей гибкостью цепи ПСС по сравнению с ПДАДМАХ.

Динамические поверхностные свойства растворов комплексов лизоцим/ПСС и лизоцим/ПДАДМАХ измерялись как функция возраста поверхности и концентрации полиэлектролига при постоянной концентрации белка 3,5* 10"6 М и при рН выше (рН = 11,3) и ниже (рН = 7) изоэлектрической точки. В третьем параграфе четвертой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов комплексов лизоцим/ПСС

Для растворов чистого лизоцима при рН=7 поверхностные свойства начинают меняться после индукционного периода (~ 1 час). Добавление ПСС приводит к увеличению индукционного периода при малых концентрациях ПСС (2*10"5 мг/мл) и к его уменьшению при концентрациях полиэлектролита выше 2*10'2 мг/мл (рис. 6). Скорость изменения поверхностных свойств заметно уменьшается с ростом концентрации ПСС, что по данным динамического рассеяния света сопровождается образованием мультимолекулярных агрегатов в объеме раствора. Растворы начинают опалесцировать, когда концентрация ПСС превышает 1*10"2 мг/мл. При увеличении концентрации полиэлектролита растет концентрация и размер агрегатов, характеризующихся низким коэффициентом диффузии, приводя к уменьшению скорости адсорбции. Данные эллипсометрии подтверждают замедление адсорбции бежа при увеличении концентрации ПСС.

100

125

О 50 100 150 200 250 300 350

0.0 2.5 5.0 7,5 10.0 12,5

^ МИН

Я,мН/м

Рис. 6. Кинетические зависимости действительной части динамической поверхностной упругости растворов лизоцим/ПСС при рН=7 и концентрациях ПСС 0 (квадраты), 2Ч0-5 (круги), 24 О"4 (треугольники), 2*10"3 (снежинки), 2*10~2 (звезды), 5*10"2 (ромбы), 1 * 1 СГ'мг/мл (пятиугольники).

Г'

Рис. 7. Зависимости действительной части динамической поверхностной упругости от поверхностного давления растворов лизоцим/ПСС при рН=7 и концентрации ПСС: 0 (квадраты), 2*10"5 (круги), 2*10"4 (треугольники), 2*10"2 (звезды), 1*10" 'мг/мл (пятиугольники).

На начальной стадии адсорбции зависимости динамической

поверхностной упругости от поверхностного давления отличаются от соответствующих данных для растворов чистого белка (рис. 7). Этот результат указывает на то, что ПСС может проникать в ближнюю область адсорбционного слоя, изменяя поверхностное давление на начальной стадии адсорбции, когда

поверхностная упругость мала.

Последующая адсорбция

комплексов лизоцим/ПСС

сопровождается

вытеснением сегментов полиэлектролита из ближней области поверхностного слоя, и зависимости поверхностной упругости от поверхностного давления становятся близкими к данным для растворов чистого лизоцима (рис. 8). Все зависимости динамической поверхностной упругости растворов лизоцим/ПСС от поверхностного давления остаются монотонными. Это означает, что в отличие от системы БСА/ПСС при рН=7 в процессе адсорбции не происходит заметных изменений третичной структуры белка в поверхностном слое.

При смещении рН в щелочную область (рН= 11,3) знак заряда глобул лизоцима меняется. В этом случае кинетические зависимости динамических поверхностных свойств растворов комплексов близки к соответствующим зависимостям для растворов чистого белка, что указывает на отсутствие взаимодействия с полиэлектролитом.

В четвертом параграфе четвертой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов комплексов лизоцим/ПДАДМАХ. При рН = 7 в области относительно низких концентраций (< 2*10"2 М), когда оба компонента заряжены положительно, скорость изменения динамической поверхностной упругости и поверхностного натяжения уменьшается, а индукционный период увеличивается. Так как суммарный заряд комплексов заметно превышает заряд глобулы, электростатический барьер адсорбции возрастает, что приводит к замедлению изменения поверхностных свойств. Добавление ПДАДАМАХ, как и ПСС, влияет на структуру адсорбционного слоя на начальном этапе адсорбции - зависимости динамической

лнзоанм первичный комплекс белою'полоэлектролнт

большой рыхлый агрегат

при малы* концентрации! ПСС

при высоки! концентрациях ПСС

воздух воздух

вода & £ ® » * л

Рис. 8. Схема взаимодействия белок/полиэлектролит в объеме раствора лизоцим/ПСС и в поверхностном слое.

поверхностной упругости от поверхностного давления для растворов смесей лизоцим/ПДАДМАХ смещены в сторону меньших поверхностных давлений по сравнению с результатами для растворов чистого лизоцима. Однако взаимодействие между лизоцимом и ПДАДМАХ слабее, чем с ПСС, и этот эффект менее выражен.

При увеличении рН, когда заряд глобул лизоцима меняет знак, поверхностная активность комплексов лизоцим/ПДАДМАХ растет. При этом скорость изменения поверхностных свойств растворов комплексов близка к скорости изменения свойств растворов чистого лизоцима. Это связано с тем, что рН = 11,3 близок к изоэлектрической точке белка и заряд комплексов недостаточен для возникновения заметного электростатического барьера адсорбции. Зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления близки к результатам для растворов чистого лизоцима. Дисульфидные мостики в молекуле лизоцима между аминокислотными остатками, принадлежащими различным частям основной цепи, приводят к большей устойчивости глобулы лизоцима по сравнению, например, с глобулой БСА. Поэтому даже в случае растворов смеси лизоцима с противоположно заряженными полиэлектролитами кинетические зависимости динамической поверхностной упругости остаются монотонными.

В пятой главе рассмотрены динамические поверхностные свойства растворов комплексов глобулярный белок/полиэлекгролит/ГХГ. Для растворов БСА/ПДАДМАХ без добавок ГХГ динамическая поверхностная упругость проходит через максимум, уменьшаясь затем примерно на 20 мН/м. В случае растворов БСА/ПДАДМАХ/ГХГ наблюдается синергетический эффект, и поверхностная упругость падает более чем на 30 мН/м после локального максимума.

Более высокая устойчивость глобул лизоцима по сравнению с глобулами БСА к воздействию химических денатурантов приводит лишь к частичному разрушению третичной структуры и более слабому падению динамической поверхностной упругости после локального максимума для растворов лизоцим/ГХГ, чем для растворов БСА/ГХГ. Однако в случае растворов, содержащих одновременно ПСС и ГХГ, поверхностная упругость снижается сильнее, и при концентрации ПСС выше 2*10'3 мг/мл при приближении к равновесию падает до значений, характерных для растворов неглобулярных белков и амфифильных линейных полимеров.

Уменьшение динамической поверхностной упругости после максимума указывает на практически полное разрушение третичной структуры белка (рис. 9), и скорость этого процесса сильно зависит от концентрации полиэлектролита. Разворачивание глобул приводит к изменениям структуры адсорбционного слоя (рис. 10). Отдельные части адсорбированных развернутых макромолекул проникают в водную фазу. В результате релаксация поверхностных

5 10 15

71. мН/м

Рис. 9. Зависимости действительной части динамической поверхностной упругости от поверхностного давления растворов

лизоцим/ПСС/ГХГ при рН=7 и концентрациях ГХГ ЗМ, лизоцима 3,5*10"6М, ПСС 0 (квадраты), 2*10"5 (круги), 2*10*4 (треугольники), 2*10'2 мг/мл (снежинки).

Рис.10. Схема взаимодействия белок/полиэлекгролит в объеме раствора лизоцимУПСС/ГХГ и в поверхностном слое.

напряжений может происходить за счет обмена отдельных участков макромолекул между двумя областями поверхностного слоя.

Поверхностное давление в области максимума поверхностной упругости при низких концентрациях ПСС (~15 мН/м) совпадает с характеристическим значением для растворов этого белка, соответствующим образованию петель и хвостов в поверхностном слое.

Изменения структуры адсорбционного слоя под действием ПСС не приводят к заметным изменениям кинетических зависимостей поверхностного натяжения. Основные изменения происходят в дальней области поверхностного слоя, а концентрация относительно гидрофобных аминокислотных остатков в ближней области поверхностного слоя почти не зависит от концентрации ПСС в объеме раствора и степени разрушения глобулярной структуры.

По данным эллипсометрии поверхностная концентрация возрастает с ростом концентрации ПСС. Этот результат согласуется предположением о полном разворачивании глобул лизоцима под действием смеси ПСС и ГХГ, приводящем к образованию дальней области поверхностного слоя и увеличению адсорбции.

Сильное влияние ПСС на структуру адсорбционного слоя лизоцима характерно только для растворов, содержащих ГХГ. Если ГХГ заменить на другой сильный денатурант -мочевину, то добавление полиэлектролита не приводит к значительным изменениям кинетических зависимостей динамической поверхностной упругости. Различие в степени влияния ГХГ и мочевины на поверхностные свойства растворов лизоцим/ПСС связано с различиями в механизме разворачивания глобул белка под действием этих денатуратов. ГХГ

взаимодействует с гидрофильными участками на поверхности глобулы. При образовании комплекса лизоцим/ПСС эффективный заряд этих участков уменьшается, что облегчает взаимодействием глобул с ГХГ. В то же время мочевина присоединяется, прежде всего, к гидрофобным участкам на поверхности глобул, и полиэлектролит лишь незначительно влияет на этот процесс.

В шестой главе кинетическая модель адсорбции была применена для оценки заряда адсорбирующейся частицы на основе сравнения расчетных и экспериментальных кинетических зависимостей величины адсорбции для растворов комплексов БСА/ПСС при рН=7 (рис. 11). При этом использовалось кинетическое уравнение адсорбции заряженные сферических наночастиц:

Л У ЛкТ я

где у , а — радиус частицы, г — электрохимическая валентность

V ЕС гъ

частицы, хъ - электрохимическая валентность индифферентного электролита, Я — газовая постоянная, е — диэлектрическая проницаемость среды, к — параметр Дебая-Хюккеля, 9 — степень заполнения поверхности.

Это уравнение легко интегрируется и позволяет рассчитать кинетическую зависимость поверхностной концентрации.

Так как на поверхности адсорбируются в основном молекулы белка, то можно приближенно принять, что размер адсорбирующейся частицы сопоставим с размерами глобулы БСА (4 нм). Тогда при сравнении экспериментальных и расчетных кинетических зависимостей поверхностной концентрации заряд частицы оказывается единственным подгоночным параметром.

Результаты расчета удовлетворительно согласуются с оценками поверхностной концентрации из эллипсометрических данных на начальной стадии адсорбции. Полученные значения заряда комплексов лежат в интервале от -3 до -5 (таблица 1). Эти результаты заметно меньше величин, которые можно было бы ожидать для данной системы, учитывая, что заряд БСА, рассчитанный из констант диссоциации аминокислотных остатков, равен -18. Однако полученные значения заряда удовлетворительно согласуются с данными по элекгрофоретической подвижности БСА в водном растворе. Полученное расхождение с оценкой, вероятно, можно связать с явлением конденсации противоионов на поверхности глобулы. В результате кинетические единицы в рассматриваемой системе представляют комплексы белок/полиэлектролит, движущиеся вместе со связанными противоионами.

—__к—ггт^оооЦМяйооооверо

»1ÜL

1,с.

Рис. 11. Расчетные (сплошные линии) и экспериментальные (символы) кинетические зависимости поверхностной концентрации растворов БСА/ПСС при различных концентрациях полиэлектролита: 2*10'® (квадраты), г'Ю"4 (круги), 2*10"3 (треугольники), 2*10"2(звезды).

В седьмой главе рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов фибриногена и комплексов фибриноген/полиэлектролит.

Динамическое поверхностное

натяжение и динамическая поверхностная упругость растворов комплексов фибриноген/ПСС и фибриноген/ПДАДМАХ измерялась как функция концентрации полиэлектролита и времени жизни поверхности при рН = 3,8 и рН = 7.

Концентрация Заряд

ПСС, мг/мл комплекса

БСА/ПСС,

е

2*10"5 -3

2*10^ -4

2*10"J -5

2*10"2 -5

Табл. 1. Рассчитанные значения зарядов комплексов БСА/ПСС при различных концентрациях ПСС.

50 40

г зо й * 20 со*

10

о

О 2 4 6 8 10 12 14 16

Л.мН/м

Рис. 12. Зависимости действительной

части динамической поверхностной упругости от поверхностного давления для растворов фибриногена с концентрацией: 5*10"9 (квадраты), 1*10'8 (круги), 2*10'8 (треугольники), 5*10"8 (ромбы), 1 * 10"7 М (снежинки).

В первом параграфе седьмой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов фибриногена в зависимости от концентрации белка. Поверхностная упругость вблизи равновесия оказалась заметно ниже (— 50 мН/м), чем для растворов исследованных глобулярных белков - лизоцима и

БСА (~ 80 мН/м). Зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления смещаются в сторону более высоких поверхностных давлений с увеличением концентрации фибриногена (рис.12). Эта особенность, по-видимому, связана с более сложным строением молекулы фибриногена. Можно предположить, что при низких концентрациях вытянутые молекулы фибриногена располагаются параллельно поверхности, а

при увеличении концентрации происходит переориентация макромолекул в поверхностном слое.

Во втором параграфе седьмой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов комплексов фибриноген/ПСС. Несмотря на различия в строении молекулы фибриногена и типичных глобулярных белков, характер изменения кинетических зависимостей поверхностных свойств растворов фибриноген/ПСС при рН=7 с увеличением концентрации полиэлектролита близок к соответствующим результатам для растворов БСА/ПСС и лизоцим/ПДАДМАХ при рН=7, когда компоненты одноименно заряжены.

При уменьшении рН скорость изменения поверхностных свойств падает. Уже при концентрации полиэлектролита 2*10"4 мг/мл поверхностные свойства раствора фибриноген/ПСС близки к поверхностным свойствам воды в течение пяти часов. Характер зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления указывают на то, что ближняя область поверхностного слоя содержит только молекулы белка. Результаты эллипсометрических измерений и данные по агрегации в объеме раствора позволяют предположить, что поверхностная концентрация фибриногена снижается с ростом концентрации ПСС за счет связывания белка агрегатами, характеризующимися более низкой поверхностной активностью и значительно меньшим коэффициентом диффузии.

В третьем параграфе седьмой главы рассматриваются динамические поверхностные свойства растворов комплексов фибриноген/ПДАДМАХ. Скорость изменения поверхностных свойств меняется немонотонно. Противоположно заряженные компоненты образуют комплексы с зарядом меньшим, чем заряд белка. Уменьшение заряда приводит к снижению электростатического барьера и росту скорости адсорбции. В области эквимолярных концентраций происходит перезарядка комплекса, и скорость адсорбции уменьшается, вызывая смещение кинетических зависимостей в сторону результатов для раствора чистого белка. Зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления совпадают с результатами для растворов чистого белка. Полиэлектролиты оказывают относительно слабое денатурирующее действие на белки и в случае фибриногена возможное изменение третичной структуры не отражается на поверхностных свойствах этого белка. С уменьшением рН, также как и в случае растворов БСА/ПДАДМАХ, взаимодействие между компонентами уменьшается и при рН = 3,8 добавки полиэлектролита не приводят к изменению динамических поверхностных свойств.

Выводы

1. Обнаружены три локальных максимума на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости растворов смеси р-казеин/ПНИПАМ. Показано, что первые два максимума связаны с последовательным вытеснением относительно гидрофильных и

относительно гидрофобных участков молекул р-казеина из ближней области поверхностного слоя. Третий максимум вызван образованием петель и хвостов молекул ПНИПАМ у межфазной границы.

2. Обнаружено относительное изменение величины первых двух пиков на кинетических кривых динамической поверхностной упругости растворов р-казеин/ПНИПАМ при увеличении концентрации ПНИПАМ, свидетельствующее об усилении гидрофобного взаимодействия между компонентами.

3. Для растворов смеси БСА и ПСС при значениях рН, соответствующих одноименному заряду макромолекул, обнаружено сильное уменьшение скорости изменения поверхностных свойств при увеличении концентрации полиэлектролита, свидетельствующее об образовании комплексов БСА/ПСС в объеме раствора за счет взаимодействия молекул ПСС с противоположно заряженными участками на поверхности глобулы БСА. Показано, что в этом случае ближняя область поверхностного слоя растворов комплексов БСА/ПСС состоит в основном из глобул белка, а полиэлектролит вытеснен в дальнюю область.

4. Для растворов смеси БСА и ПДАДМАХ при значениях рН, соответствующих одноименному заряду макромолекул, комплексы белок/полиэлектролит не образуются из-за более низкой гибкости цепей ПДАДМАХ.

5. Для растворов смеси БСА с полиэлектролитами (ПСС и ПДАДМАХ) при значениях рН, соответствующих разноименному заряду макромолекул, на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости обнаружен локальный максимум, указывающий на разрушение третичной структуры БСА и образование дальней области поверхностного слоя (области петель и хвостов). Сравнение результатов для растворов БСА/полиэлектролит и БСАУГХГ показывает, что третичная структура белка в первом случае разрушается лишь частично.

6. Для растворов смеси лизоцима и полиэлектролитов (ПСС и ПДАДМАХ) в широкой области значений рН монотонные кинетические зависимости динамической поверхностной упругости указывают на сохранение третичной структуры белка в поверхностном слое. Влияние добавок полиэлектролитов на скорость изменения поверхностных свойств в этом случае связано, прежде всего, с образованием мезоскопических агрегатов в объеме раствора, а также с проникновением цепей полиэлектролита в ближнюю область поверхностного слоя.

7. Обнаружен сильный синергетический эффект ПСС и ГХГ на динамические поверхностные свойства растворов лизоцима. В этом случае кинетические зависимости динамической поверхностной упругости близки к соответствующим результатам для растворов амфифильных линейных полимеров и указывают на полное разрушение третичной структуры белка в поверхностном слое. В то же время подобный эффект не возникает при замене ГХГ на

мочевину, что связано с различными механизмами денатурации белков под действием ГХГ и мочевины. .......

8. Зависимости динамической поверхностной упругости от поверхностного давления показывают, что в растворах комплексов фибриногена с полиэлектролитами ближняя область поверхностного слоя состоит в основном из молекул белка. В то же время добавки ПСС к растворам фибриногена сильно влияют на кинетику адсорбции, даже когда компоненты одноименно заряжены. При значениях рН, соответствующих противоположному заряду компонентов, в растворе образуются мезоскопические агрегаты, что приводит к уменьшению величины адсорбции и скорости изменения поверхностных свойств. ПДАДМАХ взаимодействует с фибриногеном, только когда этот белок противоположно заряжен.

9. Применение кинетического уравнения адсорбции для описания адсорбции комплексов БСА/ПСС позволило оценить эффективный заряд адсорбирующихся глобул. Полученные значения удовлетворительно согласуются с результатами по электрофоретической подвижности БСА в водном растворе и показывают, что кинетические единицы представляют глобулярный комплекс белок/полиэлектролит вместе со связанными противоионами.

Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Noskov В. A., Milyaeva O.Yu., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Dynamic properties of p-casein/surfactant adsorption layers//Colloids Surf. A, 2012,413, 84-91.

2. Milyaeva O.Yu., Noskov B. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Influence of polyelectrolyte on dynamic surface properties of BSA solutions // Colloids Surf. A, 2014,442, 63-68.

3. Milyaeva O.Yu., Lin S.-Y., Noskov B. A. Influence of sodium polystyrene sulfonate on dynamic surface properties of bovine serum albumin solutions // Colloid J., 2014, 76,459-464.

4. Milyaeva O.Yu., Noskov B. A., Akentiev A.V., Lin S—Y. Dynamic surface elasticity of the mixed solutions of bovine serum albumin and synthetic polyelectrolytes // Mendeleev Commun., 2014, 24, 264-265.

5. Milyaeva O.Yu., Campbell R.A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R., Tihonov M.M., Varga I., Volkova A.V., Noskov B.A. Synergetic effect of sodium polystyrene sulfonate and guanidine hydrochloride on the surface properties of lysozyme solutions // RSC Adv., 2015, 5, 7413-7422.

6. Миляева О.Ю., Лин Ш.-Ю., Носков Б.А. Влияние добавок различной химической природы на дилатационную поверхностную упругость растворов р-казеина // Всероссийский симпозиум «От коллоидных систем к нанохимии», Казань, 2011, С. 91

7. Миляева О.Ю., Лин Ш.-Ю., Носков Б.А. Влияние добавок различной химической природы на дилатационную поверхностную упругость растворов р-казеина // V Всероссийская конференция «Химия в современном мире», Санкт-Петербург, 2011, С. 546-547.

8. Миляева О.Ю., Носков Б.А.1 Дилатационная реология адсорбционных пленок ПНИПАМ/р-казеин // VI Всероссийская конференция «Менделеев 2012», Санкт-Петербург, 2012, 82-83.

9. Миляева О.Ю. Динамические поверхностные свойства растворов комплексов БСА и полиэлекгролитов // VII Всероссийская конференция «Менделеев 2013», Санкт-Петербург,

2013, 192-193.

10. Milyaeva O.Yu., Miller R., Noskov В.A. Formation of protein-polyelectrolyte adsorption layers by dilatational rheology data // 14th European Student Colloid Conference, Potsdam, 2013, P. 74.

11. Milyaeva O.Yu., Influence of polyelectrolyte on dynamic surface properties of BSA solutions //

*

XIX international conference on chemical thermodynamics in Russia, Moscow, 2013, P. 355.

12. Milyaeva O.Yu., Noskov B. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Dilatational viscoelastisity of protein-polyelectrolyte adsorption layers // IV International Conference on colloid chemistry and physicochemical mechanics, Moscow, 2013, P. 432-433.

13. Миляева О.Ю., Носков Б.А. Влияние полиэлектролитов на динамические поверхностные свойства БСА. // VIII Всероссийская конференция «Менделеев 2014», Санкт-Петербург,

2014, С. 66.

14. Milyaeva O.Yu., Noskov В. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Dynamic surface properties of mixed lysozyme/strong denaturats/polyelectrolyte solutions // 8th International Symposium "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems", St.Petersburg, 2014, P. 218.

15. Milyaeva O.Yu., Noskov B. A., Lin S.-Y., Loglio G., Miller R. Impact of polyelectrolytes on dynamic surface properties of mixed solutions of lysozyme and strong dénaturants // 20th International Symposium on Surfactants in Solution, Coimbra, 2014, P. 250.

Подписано в печать 04.06.2015. Формат 60x84 Vle. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ № 016.

Отпечатано в Издательстве ВВМ 198095, Санкт-Петербург, ул. Швецова, 41