Диэлектрическая спектроскопия и молекулярное движение глобулярных белков в растворе тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.14 ВАК РФ

На правах рукописи ЕРМОЛИНА ИРИНА ВИКТОРОВНА

ДИЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ И МОЛЕКУЛЯРНОЕ ДВИЖЕНИЕ ГЛОБУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ

01.04.14 - теплофизика и молекулярная физика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

КАЗАНЬ - 1995

Работа выполнена п лаборатории молекулярной биофизики1 Казанского института биологии КНЦ РАН.

Научные руководители: доктор физико-математических

наук, профессор Федотов В.Д.

кандидат физико-математических наук, Фельдман Ю.Д.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических

наук, и.о. профессора Нигматуллии P.P.

кандидат химических наук, с.п.с. Лбагуроп Л.В.

Ведущая организация: Институт высокомолекулярных

соединении РАН (С.Петербург).

Защита состоится "7оО 0\СпйлЬр<Я-_ 1995 г. в " часов на

заседании диссертационного сонета Д 053.29.02 при Казанском государственном университете им. В. И. Ульянова-Ленина (420018, Казань, ул. Ленина, 18).

С диссертацией молено ознакомиться в Научной библиотеке университета.

Автореферат разослан I'd" тсжЛЬР^а 1995 Г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

М.В.Еремин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследоиание динамического поведения белкой в водных растворах является актуальной проблемой современной биофизики. Задача при этом распадается па два самостоятельных раздела: исследоиание локального движения внутри глобулы и поведение макромолекулы как целого. Первая задача имеет огромное значение для понимания функционирования белка. Как показали недавние исследования, знание статической структуры биополимеров является необходимым, но недостаточным условием раскрытия тайны жизни белка. Поэтому в последние годы многие исследователи направили свое внимание па анализ внутренней подвижности макромолекул. Что же касается второй задачи, то актуальны не только ее биологические аспекты, такие как узнавание взаимодействующих молекул субстрата и белка, удержание субстрата белком и т. д. , но и проблемы физики жидкости, такие как электростатические взаимодействия макромолекул в растворе, поляризация и релаксация.

Вопросу получения информации о структурных и динамических характеристиках белка в растворе с помощью диэлектрической спектроскопии было посвящено немало работ. Связано это с наличием уникальной природной метки в белках - большим динольным моментом. Удивительное сочетание достаточной жесткости структуры глобулы и некоторой подвижности ее составных частей, также обладающих динольным моментом, позволяют наблюдать за поведением как целой макромолекулы, так и ее внутренных структур. Однако интерпретации результатов в этих работах различаются, не совсем ясна природа некоторых релаксационных процессов. Имеется большое поле деятельности по анализу структуры и динамики белка при различных условиях среды, таких как температура, рН, наличие денатурантов, и т. д.

Среди многочисленных современных физических методов, использующихся для физико-химического анализа вещества метод диэлектрической спектроскопии (ДС) занимает особое место. Связано это с необычайно широким диапазоном частот, перекрываемых этим методом. Однако, несмотря на большую историю своего развития, этот метод до недавнего времени не находил широкого распространения для всесторонних исследований. Дело в том, что используемые ранее методы в частотной области обладали рядом неудобств и даже

ограничений, не позволявших тщательно исследовать объекты, подверженные изменениям во времени (например биологические объекты). Успехи последних лет в развитии метода временной диэлектрической спектроскопии (ВДС) позволили преодолеть многие трудности и коренным образом изменили отношение к ДС, превратив ее в эффективный метод исследования вещества на макроскопическом и микроскопическом уровне.

Данная работа вносит свои вклад п развитие метода ВДС п виде новых методических подходов и в исследование механизмов поляризации и релаксации водных растворов белка, отражающих структурные и динамические свойства протеинов.

Целью работы является анализ механизмов поляризации и релаксации водных растворов белка; нахождение связи параметров релаксационных процессов с характеристиками молекулярных движении; изучение межбелкопых электростатических

взаимодействий; исследование температурпо- и рН-индуцнрованных конформационных переходов в глобулярных белках; разработка новых методических подходов в ВДС-экспсриментс.

Научная новизна. В настоящей работе получены новые результаты о процессе релаксации дшгольной поляризации водных растворов миоглобипа в. диапазоне частот от 500 кГц до 2 Ггц, широком диапазоне концентраций от 0.6% по 53% и температурном интервале от 5° до 35°С. Проведен анализ функций дииольной корреляции в рамках безмодельного подхода, получены параметры релаксационных процессов и найдена нх связь с характеристиками молекулярного движения белка в растворе. Проанализирована предложенная ранее для анализа данных по ЯМР релаксации модель электростатических взаимодействии и связь ее с трансляционным движением макромолекул. Получены параметры температурпо- и рН-ипдуцированпых конформационных переходов в глобулярных белках (лизоцим и рибонуклеаза А). Развиты новые методические подходы в ВДС-эксперимснтс.

Практическая применимость.

Полученная информация о диэлектрических свойствах растворов белков может быть полезна как для развития теории жсткости, так и для анализа внутренней структуры и динамики белка, что в перспективе ведет к пониманию функционирования белка.

Знание о характере проявления электростатических взаимодействий макромолекул поможет грамотно выбрать условия

проведения эксперимента (например, при исследовании внутренней динамики белка) и избежать ошибок в интерпретации результатов.

Адекватный анализ корреляционной функции вращения белка как целого весьма важен при обработке данных ЯМР релаксации высокого разрешения.

Представленные и работе новые методические подходы и ВДС-эксперименте внедрены в ряде научно-исследовательских институтов и вузов: Ин-т Химической Физики АН, химический факультет МГУ, НПО Союзнефтеотдача (Уфа), КГУ, Башкирский гос. университет, ЮС'ГИ, НПО "Позитрои"(С.Петербург), где работают установки, созданные в лаборатории Молекулярной Биофизики.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на 1 Всесоюзной конференции "Химия и применение неводных растворов" (Иваново, 1986), на конференции "Физико-химические методы исследования в области химии, физики, биологии, медицины и народном хозяйстве" (Казань, 1987), на VI, VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров" (Харьков, 1988), на VI Всесоюзной конференции "Физика диэлектриков" (Томск, 1988), на Всесоюзной конференции "Нуклеазы микроорганнзмои и их практическое использование" (Рига, 1989), на IX Международном конгрессе по молекулярной спектроскопии (Дрезден, ГДР, 1989), на Всесоюзном совещании "Метрологическое обеспечение

диэлектрических измерений" (Иркутск, 1991), на Гордоновскоп научной конференции "Диэлектрические явления" (Ныо-Хампшир, США, 1992), на ежегодной конференции Диэлектрического общества (Англия, 1993, 1994), на Российской научно-технической конференции "Диэлектрики-93" (С.Петербург, 1993), на 11 Международном Биофизическом конгрессе (Будапешт, Венгрия, 1993), на Международной конференции Ампера (Казань, 1994), на Всероссийском совещании "Физико-химические методы исследования структуры п динамики молекулярных систем", (Йошкар-Ола, 1994, 1995), на Международной конференции "Диэлектрические п связанные явления" (Закопане, Польша, 1994), па Международном симпозиуме "Молекулярная подвижность и порядок в полимерных системах" (С. Петербург, 1994), па ежегодной Международной конференции Биофизического общества (Сан-Франциско, США, 1995).

Публикации. По материалам диссертации опублнкопамо 9 статей и 23 тезиса докладоп.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов, списка литературы (171 наименование). Содержание работы изложено на 171 странице, включая 46 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе диссертации, имеющей обзорный характер, рассмотрены структурные, динамические и электростатические свойства белков. Большое внимание уделено диэлектрическим моделям белка п растворе. В главе представлен обзор результатов исследования растворов белков методом диэлектрической спектроскопии. Проанализированы имеющиеся проблемы и сформулированы задачи диссертации.

Вторая глава иоспяшена описанию экспериментальной техники и новых методических подходов, разработанных для исследования диэлектрической поляризации и релаксации водных растворов белков.

В главе изложены некоторые положения теории диэлектрической релаксации н основные принципы метода временной диэлектрической спектроскопии (ВДС). В основе этого метода лежит принцип рефлектометрии во временной области, заключающийся в исследовании неоднородностей в коаксиальных трактах по изменению формы тестового сигнала. Все модификации метода ВДС могут быть описаны единой блок-схемой. Отличия заключаются лишь в конструкции измерительной ячейки и ее расположении, что приводит к различным видам связи между регистрируемыми в процессе измерения величинами и диэлектрическими параметрами исследуемых объектов. В данной работе используется метод сосредоточенной емкости, позволяющий получить диэлектрические характеристики исследуемого образца как в частотной, так и во временной области.

На рисунке 1 представлена блок-схема временного диэлектрического спектрометра. Для измерительной ячейки, помешенной на горце коаксиальной линии, электрический заряд 0(0 связан с функцией диэлектрического отклика Ф(1) и приложенным напряжением У(() соотношением:

б

0(1) = С0и-яН(/) + ^(/-/')К(о,//'] (1)

о

где ф(0=Ь" 1[(е*(1а))-есс)/1ы1, Ь" I - символ обратного преобразования

I

Лапласа, 0(1) = \ [({')(/!', С0 - емкость пустой измерительной ячейки, а

Решая интегральное уравнение (I), можно получить функцию диэлектрического отклика Ф(0. В рамках теории линейного отклика можно связать ф(0 = Ф(0 + е,л с макроскопической функцией дипольной корреляции Г(1).

Рис. I. Блок-схема ВДС-спектрометра. ГП - генератор перепада напряжения, АТТ - аттенюатор (Юдб), ИГ - измерительна» головка.

Для исследования водных растворов миоглобина были разработаны новые методические подходы, используемые в ВДС-эксперименте.

Одной из интересных методических разработок, позволивших сущестиенно повысить чувствительность метода, является дифференциальный или разностный подход. Сугь его заключается и записи сигнала не только от исследуемого объекта, но и от образца с известными диэлектрическими характеристиками. Такой подход позволяет компенсировать нежелательные отражения в коаксиальном тракте и повысить чувствительность при измерении слабых сигналов (например разбавленных растворов исследуемого вещества относительно раствори геля).

Вторая методическая разработка посвящена расширению

частотного диапазона (временного итервала), который может быть

перекрыт одним измерением. Это особенно актуально при

исследовании водных растворов белков, где имеется несколько

разнесенных по частоте релаксационных процессов. Одним из

возможных путей решения этой проблемы является регистрация

измеряемых в эксперименте сигналов в неэквидистантном временном

масштабе, т.е. с переменным шагом дискретизации. Если весь

диапазон разбить на п интервалов, в каждом из которых выбрать шаг

дискретизации 5; и число выборок N5, то верхняя граничная частота в

спектре сигнала в соответствии с теоремой Шенона-Котельникова

определится как Г|, = !/2от1П , а нижняя граничная частота -

и

длительностью всего сигнала Т =

¡ = 1

Наиболее трудной задачей в этом подходе является численное решение уравнения (1). Было выбрано 3 временных интервала Т|, на которые были наложены некоторые ограничения по величине шага 5| и обшей длине. Эго позволило избежать немонотонности искомой функции и перекрыть одним измерением пять порядков по частоте при ограниченном количестве выборок в измеряемом сигнале.

Третья методическая разработка связана с формой сигнала. Обработка полученных сигналов изначально была построена на предположении что падающий и отраженный сигналы являются идеальными. Однако, в реальной аппаратуре, несмотря на многочисленные технические ухищрения, достичь этого невозможно. Падающий сигнал и^оСО. также как и любой зарегистрированный сигнал, содержит искажения и может быть представлен в виде свертки идеального сигнала с производной так называемой аппаратной функции Г((), содержащей эти искажения. В такой ситуации встает задача вычленить аппаратную функцию и сформировать идеальные регистрируемые сигналы (или их разницы, т.к. мы используем лиффсрснииальньгй метод измерения). Для этой цели было введено дополнительное измерение сигнала от согласованной нагрузки и5о(0-Анализ показал, что разница между сигналом от короткозамкнутой линии ик!(() и падающим сигналом УзоО) фактически представляет собой ненормированную аппаратную функцию. Далее с помощью этой функции путем решения интегрального уравнения для каждого из регистрируемых сигналов была восстановлена его идеальная форма.

В__третьей главе представлены результаты исследования

механизмов поляризации и релаксации водных растворов миоглобипа в диапазоне частот 500 кГц - 2ГГц . Измерения проводились при комнатной температуре в широком интервале концентраций от О.бмг/мл до 530мг/мл, рН которых менялся от 6.8 до 7.2. Для некоторых образцов измерения выполнены в интервале температур 5° -35°С.

С помощью временной диэлектрической спектроскопии были получены макроскопические функции диподьной корреляции (ФДК). Анализ ФДК показал, что с достаточной точностью они могут быть описаны суммой нескольких экспонент.

Исходя из частотного диапазона, используемого в пашем эксперименте и из результатов, полученных другими авторами, мы полагали, что все релаксационные элементы принадлежат белку, т.е. полная амплитуда поляризации обусловлена только движением макромолекул. Полная амплитуда поляризации приведена на рисунке 2. Для проверки этого утверждения в работе проведено сравнение экспериментального диполыюго момента (рис. 3), рассчитанного из измеренных амплитуд поляризации по формуле Онзагера-Онкли, выведенной для случаи разбавленных растворов,

Д = (г№/2кТе0М (2)

и теоретического дипольного момента (200 Дебай), полученного с помощью кристаллографических банков данных. В выражении (2) ц -днпольный момент белка, М - молекулярный вес белка, с -концентрация белка в растворе,Т - абсолютная температура, N - число Авогадро.

Для малых концентрации (<10%) наблюдается хорошее совпадение экспериментальных и теоретических значений, полученных как нами, так и другими авторами. Это подтверждает правомочность предположения о том, что вся амплитуда поляризации обусловлена только белковыми молекулами.

Для концентраций > 10% наблюдалось кажущееся уменьшение дппольного момента миоглобипа, т.е. формула Онзагера-Онкли (2) здесь не работает. Было предположено, что причиной лого является механическое трение между макромолекулами, которое возникает при уменьшении свободного объема и приводит к уменьшению максимального эффекта поляризации из-за невозможности диполям белка свободно ориентироваться вдоль электромагнитного поля. Оценки показали, что при концентрации около 30% среднее

расстояние между молекулами белка становится равным максимальному линейному размеру молекулы мпоглобина и говорить о свободном вращении неправомерно. Очевидно, что столкновитсльныс эффекты пачинаюг сказываться и при более низких концентрациях. Введение эффективного дипольного момента рэфф=на позволяет пользоваться формулой Онзагсра-Опклп по пссм диапазоне концентраций.

Рис. 2. Концентрационная записи- Рис. 3. Экспериментальным дпполь-мость полной амплитуды гюлнри- нып момент мпоглобина (в яебаях) зации раствороп мпоглобина. в записимости от концентрации

раствора.

Прежде чем приступить к описания корреляционной функции движения диполей в растворе, остановимся на некоторых исходных принципах количественного анализа. Мы переходим от макроскопического описания ФДК к микроскопическому представлению ФДК, причем ограничиваемся автокорреляционным членом. Мы понимаем, что это очень сильное предположение, однако нам неизвестно в настоящее время теории связывающей различные вклады в статическую поляризацию с временной частью корреляционной функции. Поэтому мы ограничиваемся представлением спада поляризации (как для сильно разбавленных растворов) в виде:

Г([)=ДО(1) (3)

где А -полная амплитуда поляризации образца, равная (^-г...,,), О(0 -

корреляционная функция движения диполя белка в растворе, содержащая в данном случае только автокорреляционный член.

На 'основании анализа формы ФДК, анализа исследуемого объекта и литературных данных было предположено, чго имеется три независимых типа движений белка в растворе, и которых участвуют все релаксаторы Это локальное внутримолекулярное анизотропное движение, анизотропное броуновское вращение белка как целого, медленное движение, регистрируемое п эксперименте, природа которого обсуждается ниже. Независимость этих движении следует из природы этих движений. Анизотропия внутримолекулярного движения связана со стереохимическим строением белка. Причина анизотропии броуновского вращения будет обсуждаться позже.

Для количественного анализа ФДК был использован так называемый безмодельныи подход, в котором любой тип движения описывается простой корреляционной функцией экспоненциального вида

Gj(t) - (1 -q?) + q?exp(-t/T,) (4)

где tj - время корреляции, q? - параметр анизотропии движения,

равный доле поляризации, усредняемой данным типом движения

7 1

(О < q^ < 1). При qi = 1 движение является изотропным.

Полная корреляционная функция движения релаксаторов с учетом независимости отдельных типов движений может быть записана, как произведение трех корреляционных функции: Oft) = KI -q,2) +■ q?exp(-l/T,)|.|a-q,2) + 4(2cxp(-L / г, ) | [exp(-t / ts ) | (5) где индекс "Г означает локальное движение, индекс "t" - броуновское вращение, индекс "s" - медленное движение.

В случае rj<<xt<<xs , выражение (5) может быть представлено как сумма трех компонент:

G(t) = w, exp(-t / -с,) + w2 cxp(-l / т, ) + w3cxp(-t / ts) (6)

где w, =qp W] = (I - q2)q2, w-, = ( I - q ~ )( 1 - q(2 ).

С помощью формулы (6) была проведена обработка экспериментальных ФДК. Анализ показал, что при малых концентрациях белка в растворе имеется 2 релаксационных процесса, а при концентрациях > 5% - 3 процесса (рис 4). Далее в работе был проведен пиал из этих релаксационных процессов и соответствующих им типов движения белка. Кроме времени корреляции и амплитуды поляризации рассматривалась степень анизотропии движения, описываемая параметром q^ (рис. 5).

Поведение параметров, описывающих самый быстрый релаксационный процесс, а именно независимость от концентрации времени корреляции ц (рис. 4) и параметра анизотропии qj!(pиc. 5), а также линейная зависимость амплитуды поляризации от концентрации (по крайней мере до 10%) не противоречит гипотезе об отнесении итого процесса к внутримолекулярным движениям. Это также подтверждается нашими теоретическими оценками параметра рассчитанного из банков данных координат атомов миоглобина и сопоставление всех параметров с литературными данными.

Рис. 4. Зависимость времен коррс- Рис.5. Параметры анизотропии ляции от концентрации раствора локального движения и броуновс-миоглобпна. кото вращения белка как целого.

Два других процесса мы отнесли к движению макромолекулы как целого. Анализ показал, что параметры более быстрого из них хорошо согласуются с представлением об этом движении как о броуновском вращении белка с временем корреляции т5 около 30нс, почти ненеизменном во всем исследуемом интервале концентраций. Однако, в отличие от более рапных представлений мы полагаем, что броуновское движение молекул белка является анизотропным и степень анизотропии растет с уиеличеспием концентрации. Было предположено, что это связано с наличием межбелкового электростатического взаимодействия, как днполь-дипольного, так и заряд-дппольного. Качественная картина движения макромолекул в растворе выглядит следующим образом. Белки, обладающие большим дииольным моментом и, как правило, зарядом, зависящим от рН раствора, создают па выделенной молекуле локальное ноле, неусредняемое за время броуновского вращения х(. Это поле

флуктуирует с более длинным временем корреляции т<;. Таким образом, липольнын момент молекулы белка, находящейся в локальном электрическом поле, подвергается его воздействию и пытается сориентироваться вдоль поля, что приводит к анизотропии броуновского вращения макромолекул.

В работе приведены теоретические опенки параметра анизотропии броуновского вращения. Было показано, что

qt2 = l-L2(x)=l-L2(nEIoc/kT) (?)

где L - функция Ланжевена, Е|ос - локальное электрическое поле, Т -абсолютная температура, к - фактор Больпманп. На рисунке 6 представлены теоретические и экспериментальные значения параметра q2, из которых следует, что энергия взаимодействия диполя белка р с

локальным электрическим полем Е|ос достигает нескольких единиц кТ. Однако следует помнить, что время жизни ts этого поля очень

мало и составляет 100-250нсск для растворов мпоглобнна.

Липоции (ямг) ' - 130 иг/ил 2 -- 200 иг/ил

I ООО

Мкогппвян (НДС) 5-52 иг/мп 4 - /7 у г/и л 5-55 иг/ил

6 - 0J иг/ил

7 - 9J иг/ил - 122 иг/ил

Рис. 6. Теоретический параметр анизотропии в зависимости от концентрации белка в растворе. На график нанесены экспериментальные точки.

100 ■

Т

т 1Г (Дпфф)

rs (вде)

О 10 20 30 40 50 60 70

С, %

Рис. 7. Концентрационные зависимости времен корреляции, полученные из двух методов: т|г(Дифф) -из коэффициентов диффузии, ts(ßflC) - in ВДС эксперимента.

Для анализа природы медленного движения были привлечены результаты измерения трансляционной диффузии в растворах мпоглобнна, полученные на ЯМР релаксомстре на кафелре Молекулярной физики КГУ И.В Нссмсдооой. С помощью формулы <.х2>=2ГЭI были получены времена трансляционной диффузии %, в предположении, что это время I, за которое молекула перемещается на расстояние, равное размеру белка (рис. 7). Синхронное поведение

параметров т^ и т(, позволило сделать вывод о том, что трансляционная диффузия белка непосредственно влияет на время медленного движения макромолекул, регистрируемого в ВДС эксперименте. Более того, используя корреляционное время медленного движения и размеры макромолекулы, можно определять коэффициент трансляционной диффузии.

Четвертая глава посвящена исследованию влияния параметров среды на диэлектрическую поляризацию и релаксацию растворов белка. Было рассмотрено влияние температуры и рН раствора на корреляционную функцию и микродинамические параметры движения белка в растворе. Исследовались малые глобулярные белки панкреатическая рибонуклеаза А (РНКаза А) и лизоцим куриного яйца.

В главе представлены результаты исследования:

1). 4% раствора лизоцима в в интервале рН 2 до 9.

2). 2% раствора РНКазы А в В20 с 0.1М ЫаС1 и рН 2.7 в температурном интервале от 10" до 95°С

3). 2% раствора РНКазы А в Н->0 в интервале рН от 1.37 до 11.4.

Анализ параметров релаксационных процессов раствора лизоцима (рис. 8, 9), проведенный совместно с данными по

Лиэоциы 4ж

60

20

Мсшеиу/щрций но датшы седиментации

п I I ,ТТ [~1 I ■ Г'["П I . |ТГГ1] 1ТГГ,г

2 3 4 Ь 6 ?

рН

12.00 10 00 8.00 6 00 4.00 2 00 0 00

А

Дизоциы 4%

Рис 8. рН-зависимость времени броуновского вращении С[ и молекулярного веса лизоцима.

I 23456789 10 рН

Рис. 9. График зависимости амплитуд поляризации соответствующих локальному движению (Д|), броуновскому вращению (Д^, и полной амплитуде (Д1+|). седиментации и ЯМР, показал, что при переходе из кислой области в щелочную в интервале 4.5-7 р11 наблюдается переход мономер -димер. Этот переход сопровождался замедлением

внутримолекулярного движения, амплитуда которого при этом оставалась неизменной. Наблюдалось двухкратное увеличение времени броуновского вращения и уменьшение полно)! амплитуды поляризации. Оценки показали, что диполи белков в дпмере расположены под углом 126" относительно друг друга.

Температурные исследования РНКазы Л показали, что с помощью ВДС можно наблюдать процесс денатурации белка. Этот процесс является сложным и многостадийным и проявляется как в изменениях времен корреляции, так п в амплитуде движения (рис. К) и II). Существует область температур 10°-30°С (нативная), п котором белок обладает температурно-независимой структурой. Имеет место так называемое промежуточное состояние, в котором белок денатурирован, но не перешел в состояние расплавленного клубка, а обладает глобулярной структурой, стабильной во времени и в некоторой области температур (45"-65°С). При высоких температурах (более 90°С) начинается процесс полной денатурации белка, т.е. потеря его третичной структуры.

ю

77 не

РНК-аэа рН = 2.7 2 ж

7 6

7 7

О 6

2.6

2.8

3.0

3.2

0.2

б

РМК-ааа р И = 2 7 2 %

10 70 30 Ю 50 60 70 ЯП 90 100

С

Рис. I 1. Температурная зависимость полного диэлектрического инкремента (5| + |) и инкремента броуновского вращения (й|).

3.4 3.6

1 ООО/Т

Рис 10. Температурная зависимость времен корреляции броуновского вращения (т() и пнутримолекуллрных движении (тц) и (т|2).

Анализ параметров показал, что процесс денатурации сопровождается увеличением объема белка, амплитуды поляризации, а следовательно и диполыгого момента глобулы, а также увеличением параметра анизотропии, характеризующего степень свободы внутримолекулярного движения.

При исследования РНКазы А при различных рН были получены параметры релаксационных процессов, связанных с броуновским вращением макромолекулы и внутримолекулярными движениями в белке (рис. 12 и 13). Анализ результатов показал, что данный белок ведет себя устойчиво в области рН от 2.7 до 8. В сильно кислой среде белок начинает денатурировать, однако полного развала третичной структуры в эксперименте не наблюдалось. В щелочной области от 8.3 до 10.8 белок РНКаза А демонстрирует некоторую агрегацию, однако при рП > II также наступает процесс денатурации.

г

70 -ВО -50 -40 30 -20 10 О

РНК-ааа 2 *

. о*:»

1.6 - 6 1 + 1

1.4 -

1.2 -

1.0 -

О-в - \

0.6 О

0.4 -

0.2

Г) П

РНК-аза 2 ж

0 2 4 6 а 10 12

рН

Рис. 12. рН зависимость времен корреляции броуновского вращения (с() и внупшмолеку-лярных движении (тц) и (т|2)-

О 2 4 6 а 10 12

рН

Рис. 13. рН зависимость полного диэлектрического инкремента (8=Л/с, где с -концентрация раствора в кг/м-*).

о

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. В работе представлены результаты исследования процессов поляризации и релаксации водных растворов белка в широком диапазоне концентрации, температур и рН раствора методом ВДС в диапазоне частот ЗООкГц - 2ГГц.

2. Анализ результатов показал, что поляризация в данном диапазоне частот обусловлена ориентационпым механизмом поляризации флуктуирующих диполей белка. Получены параметры релаксационных процессов, связанных как с внутримолекулярным движением, так и с поведением макромолекулы как целого.

3. Представленный анализ функций дппольной корреляции растворов миоглобпна в широком интервале концентраций показали, что в области концентраций 6-50мг/мл имеется 2 релаксационных процесса,

СООТВСТСТйуЮЩИХ пнутримолскулярному Л Iii (ЖС1 шю п броуновскому вращению белка. В интервале концентрации 50-540мг/мл обнаружен третий, низкочастотный процесс.

4. Показано, что третий релаксационный процесс обусловлен флуктуациями электростатических межбелковых взаимодействий, приводящих к анизотропии броунопского вращения макромолекул. Характерное время этого процесса связано с трансляционной диффузией белка и составляет 100-250псск.

5. Электростатические взаимодействия белков не меняют существенно параметры локального движения и время корреляции броуновского вращения, но приводят к анизотропии последнего. Проведен анализ параметров анизотропии движений.

6. При исследовании тепловой денатурации РНКазы Л было получено, что при температуре 35°-45°С белок переходит в компактно-денатурированное состояние. Макромолекулы в этом состоянии представляют собой глобулы, обладающие Польшей внутренней подвижностью и увеличенным в 2.5 раза объемом. При температуре более 90°С глобула переходит в неупорядоченный клубок.

7. В результате исследования растворов лизоцима при различных pH было показано, что параметры релаксационных процессов чувствительны к переходу мопомер-лимер. Время корреляции броуновского вращения при переходе из кислой области в щелочную увеличилось в 2 раза.

8. Разработано программное обеспечение ВДС спектрометра. Реализованы новые методические подходы в измерении и обработке сигналов: дифференциальная методика измерений, неэквиднетант-ная методика измерений, учет аппаратной функции спектрометра.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

С гатьи

1. Оалитов В.М., Ермолина И.В., Зуев 10.Ф., Фельдман Ю.Д. Автоматический временной диэлектрический спектрометр. - Ж. физ. химии, 1987, т. 61, N 2, с. 564-569.

2. Фельдман Ю.Д., Зуев Ю.Ф , Ермолина И.В., Гончаров В.А. Разностная методика анализа днэлекфичеекпх данных во временной области. - Ж.физ. химии, 1988, т. 62, N 2, с. 557-561.

3. Валитов В.М., Ермолина И.В., Зуев Ю.Ф.. Фельдман 10 Д. Автоматизированная система измерения диэлектрических

I •

характеристик образной во временной области. - Научное приборостроение. Автоматизация науч. исслед. - Л.: Наука, 1988, с. 19-28.

4. Ennoliiia I.V., Polygalov П.A., Romanychev G.D., Zuev Yu.F., Feldman Yli.D. Time domain dielectric spectroscopy with nonuniform signal sampling. - Rev. Sci. lustrum., 1991, v.62, p. 2262-2265.

5. Ермолина H.В., Зуев Ю.Ф., Полыгалои Е.А., Романычеи Г.Д., Фельдман Ю.Д. Применение неэквидистантной дискретизации сигналов во временной диэлектрической спектроскопии. Измерительная техника, 1992, N 8, с. 58-61.

6. Романычеи Г.Д., Ермолина И.В., Полыгалов Е.А., Зуев Ю.Ф., Упшинский Д.В., Фельдман Ю.Д. Анализ источников погрешностей метода временной диэлектрической спектроскопии. - Измерительная техника, 1992, N 8, с. 61-63.

7. Fedotov V.D., Feldmau Yu.D., Krushelnitsky A.G., Ermolina I.V. NMR and dielectric spectroscopy investigation of protein dynamical structure. -J.Mol. Struc.,1990, v. 219, p. 293-298.

8. Ermolina I.V., Krushelnitsky A.G., Ivoylov I.N., Feldrnan Yu.D., Fedotov V.D. Investigation of molecular motions and interproton interactions in solutions by NMR and TDDS. - Appl.Magn.Reson., 1993, v. 5, N 2, p. 229-248.

9. Ermolina I.V., Fedotov V.D., Feldman Yu.D., Ivoylov I.N. Investigation of molecular motion and interprotein interactions in solutions by TDDS: A comparison with NMR data. - J.Non.Cryst.Solids, 1994, v. 172-174, p. 1103-1108.

Тезисы докладов

1. Фельдман Ю.Д., Ермолина И.В. Дифференциальные методы ВДС. -Химия и применение неводных растворов: 1 Всесоюз. конф. -Иваново: ИХНР АН СССР, 1986, т 3, с. 435.

2. Зуев 10.Ф., Ермолина И.В. Анализ данных ВДС во временной области. - Там же, с. 443.

3. Валнтов В.М., Ермолина И.В., Зуев Ю.Ф., Фельдман Ю.Д. Автоматический временной диэлектрический спектрометр. - Там же, с. 438.

4. Ермолина ИВ. Программное обеспечение автоматического временного диэлектрического спектрометра. - Физико-химические методы исследования в области химии, физики, биологии, медицины и народном хозяйстве. - Казань, 1987, с. 153.

5.« Федотов В.Д., Фельдман Ю.Д., Крушелыишкии Л.Г., Ермолина ИВ. Исследование рН зависимостей параметров ядерной и диэлектрической релаксации в растворах некоторых глобулярных белков. - Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. 6-я. - Харьков, 1988, с. 307.

6. Ермолина И.В., Зуев Ю.Ф., Полыгалов Е.А., Романычсв Г.Д., Фельдман Ю.Д. Временной диэлектрический спектрометр с нсэквидистантной дискретизацией сигнала. - Там же, с, 123.

7. Зуеп Ю.Ф., Фельдман Ю.Д., Ермолина И.В., Полыгалов Е.Л. -Методы временной диэлектрической спектроскопии и диэлектрическая релаксация в жидких и твердых диэлектриках. -Всесоюзная конференция по физике диэлектриков. 6-я. Сек. Диэлектрическая релаксация. Томск, 1988, с. 55.

8. Федотов В.Д., Крушелышцкий Л.Г., Фельдман Ю.Д., Ермолина И.В., Ступишина Е.Л., Давыдов Р.Э., Файзуллин Д.Д., Ягодина Л.О. Методы ЯМР, диэлектрической спектроскопии и дейтерообмена в изучении динамической структуры природной и модифицированных форм бактериальной РНК-азы ВассШш ниеппесЛия 7Р при различных значениях рН и температуры. - Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование. - Рига, 1989, с. 27.

9. Ермолина И.В., Крушелыпшкпй Л.Г., Федотов В.Д. Влияние молекулярных электростатических взаимодействий макромолекул миоглобина на характер их броуновского вращения в водных растворах. - Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров. 7-я. - Харьков, 1991, с. 98.

10. Зуев 10.Ф., Ермолина И.В., Федотов В.Д. Влияние растворителя на диэлектрическую релаксацию и молекулярное движение в системе миоглобин-вода. - Там же, с. 115-116.

11. Зуев Ю.Ф., Полыгалов Е.А., Фельдман Ю.Д., Федотов В.Д., Ермолина И.В. Временная диэлектрическая спектроскопия - новый эффективный инструмент физико-химических исследований Метрологическое обссечсние диэлектрических измерений. Всесоюз. совсщ. - Иркутск, 1991, с. 49.

12. Ермолина И.В., Полыгалов Е.А.. Романычсв Г.Д., Зуев 10.Ф., Фельдман Ю.Д. О повышении точности измерений методом временной диэлектрической спектроскопии с использованием новых теоретических подходов и программными средствами. - Там же, с.65.

13. Романычсв Г.Д., Полыгалов Е.А., Ермолина И.О. Погрешности измерений временной диэлектрической спектроскопии. - Там же, с.65.

14. Anclrianov A., Chepurnov A., Polygalov E., Romanychev G., Ermolina I., Zuev Yu., Fcdotov V., Krol I., Milgotin В., Garti N. Tmie domain dielectric spectroscopy. A new Measuring Sistem. - The Dielectric Society Annual meeting. - London, 1993, p. 16.

15. Ермолина И.В., Крушелъницкий А.Г., Федотов В.Д. Исследование механизмов поляризации и релаксации в водном растворе белка методом ВДС. - Диэлектрики-93: Росс. науч.-техн. конф. С.Петербург, 1993, е. 167.

16. Зуев 10.Ф., Ермолина И.В., Полыгалов Е.А., Романычев Г.Д., Федотов В.Д., Фельдман Ю.Д. Временная диэлектрическая спектроскопия - состояние и перспективы. - Там же, с. 112.

17. Ermolina I.V., Krushelnitsky A.G., Ivoylov I.N., Fedotov V.D. The dynamical behaviour of protein molecules in solutions. - International Biophysics Congress, 11th. - Budapest, 1993, p. 74.

18. Krushelnitsky A.G., Ennolina I.V., Fedotov V.D. The anisotropy of protein Brownian tumbling in solution as studied by the low field proton relaxation and time domain dielectric spectroscopy. - Magnetic resonance and related phenomena. 27th Congress Ampere. - Kazan, 1994, v.l, p. 899.

19. Ермолина И.В., Каджев В.Ю., Федотов В.Д. Электростатические взаимодействия белков в растворе. - Физико-химические методы исследования структуры и динамики молекулярных систем. Всероссийское совещание, - Йошкар-Ола, 1994, с. 35.

20. Ennolina I., Fedotov V., Ivoylov [., Feldman Yu. Dielectric relaxation and polarization in protein solution. - The Dielectric Society. Annual meeting. - London, 1994, paper 8.2.

21. Ennolina I.V., Ivoylov I.N., Kiushelnitsky A.G., Fedotov V.D. The use of TDDS for Structural and Dynamics Investigations of Protein Molecules in Solutions. - Dielectric and Related Phenomena. - Zakopane, Poland, 1994, p.41.

22. Ermolina I.V., Krushelnitsky A.G., Nesmelova I.V., Fedotov V.D. The dynamic behaviour of protein molecules in solutions. Investigations by Time Domain Dielectric Spectroscopy and non-Selective 1H NMR - Relaxation. - Molecular mobility and order in polymer systems. Intern. Simp. -St.Petersburg, Russia, 1994, p. 11.

23. Ermolina I.V., Kiushelnitsky AG., Ivoylov I.N., Nesmelova I.V., Fedotov V.D. Investigation of molecular motion and interprotein interactions in solution by TDDS and 1H NMR. - Biophysical J. 1995, v. 68, N 2, Pt. 2, p. A343. (39th Annual Meeting of Biophysical Society, San-Francisco, CA).