Молекулярная динамика белков и полипептидов. Исследование методом релаксационной и обменной ЯМР-спектроскопии тема автореферата и диссертации по физике, 01.04.07 ВАК РФ

На правах рукописи

кш

Алексей Германович Крушельницкий

Молекулярная динамика белков и полипептидов. Исследование методом релаксационной и обменной ЯМР-спектроскопии.

01.04.07 —физика конденсированного состояния АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических

наук

Казань, 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского Института Биохимии и Биофизики Казанского Научного Центра Российской Академии Наук

Научный консультант: доктор физико-математических наук, профессор

Федотов Владимир Дмитриевич Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор

Маклаков Александр Иванович доктор физико-математических наук, профессор Анисимов Александр Васильевич доктор физико-математических наук,

ведущий научный сотрудник

Кутышенко Виктор Павлович . Ведущая организация: Центр магнитной томографии и спектроскопии

Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 26 октября 2006 г. в 14.30 на заседании диссертационного совета Д 212.081.15 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина в аудитории 210 физического корпуса (ул. Кремлевская, 18) Отзывы по данной работе просим отправлять' по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, Казанский государственный университет, служба аттестации научных кадров.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при КГУ.

Автореферат разослан / Ч сентября 2006 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Еремин М.В.

Общая характеристика работы.

Актуальность. За последние десятилетия белки стали едва ли не самым популярным биологическим объектом, который интенсивно изучается различными физическими методами. Одна из основных целей исследования белков — изучение молекулярных механизмов их биологического функционирования. Сейчас является общепризнанным, что молекулярная динамика, наряду с пространственной структурой, является важнейшим и неотъемлемым фактором, обеспечивающим биологическую функциональность белков. Поэтому изучение молекулярных движений и физических факторов, определяющих их характеристики, является важной проблемой в современных исследованиях биополимеров.

Очень важным и не до конца исследованным является вопрос о влиянии межмолекулярных взаимодействий на динамическое поведение белков как в растворе, так и в твердом состоянии. В живой клетке белки находятся в непосредственном окружении других белков и различных (макро)молекул, а при анализе экспериментов на белках возможными эффектами межмолекулярных взаимодействий чаще всего пренебрегают. Поэтому данная проблема представляет интерес как с точки зрения методики экспериментального изучения физических свойств белков, так и с точки зрения получения корректной информации о молекулярных механизмах их биологического функционирования.

В растворе белки, как правило, имеют ненулевой суммарный электрический заряд и электрический дипольный момент порядка сотен Дебай. При концентрациях белковых растворов в несколько процентов межмолекулярные электростатические взаимодействия могут оказывать заметное влияние на характер броуновского вращения. Взаимное электростатическое ориентирование биомолекул - одно из определяющих понятий в изучении процесса "докинга", то есть "причаливания" двух белков (или белка и субстрата) друг к другу. С другой стороны, в гомогенных растворах белки чаще всего не имеют комплементарной электростатической структуры и не образуют стабильных комплексов, хотя межмолекулярные взаимодействия, безусловно, присутствуют и там. Но

систематического исследования влияния электростатических взаимодействий на характер броуновского вращения белков при различных условиях до недавнего времени не проводилось.

а Другая связанная с этим проблема — влияние межмолекулярных взаимодействий в твердых белковых препаратах на параметры внутренней конформационной динамики белков. В связи с этим встает вопрос: насколько корректно применять информацию, полученную из твердотельных экспериментов, для объяснения молекулярно-биологических свойств белков, которые они проявляют в растворах? Чаще всего предполагается, что в полностью гидратированном твердом состоянии и растворе динамические свойства белков если и различаются, то незначительно. Но примеры систематического изучения этой проблемы нам не известны. 1 Ядерный магнитный резонанс является сейчас самым эффективным экспериментальным средством получения разнообразной информации о молекулярной подвижности белков. В то же время, одна из основных методических проблем, возникающих при исследовании молекулярной динамики методом ЯМР, состоит в том, что из эксперимента можно определить только характерное время молекулярного движения и степень усреднения этим движением того или иного типа взаимодействия магнитных ядер либо с внешним полем, либо друг с другом. Эта степень усреднения чаще всего называется параметром порядка, он играет роль амплитудного параметра в широко известном безмодельном подходе, предложенном Липари и Сзабо (1лрап & БгаЬо, МСБ, 104, 4546, 1982). В подавляющем большинстве случаев параметр порядка невозможно однозначно переформулировать в понятные для описания молекулярной динамики параметры - амплитуды движения, выраженные в ангстремах или градусах, и геометрические модели. Именно это обстоятельство является основной причиной того, что очень большая доля работ по исследованию динамики биополимеров имеет качественно-сравнительный характер. Переход к конкретным физическим моделям движения до недавнего времени практически всегда был связан с привлечением либо независимых

данных, либо (чаще всего) неких априорных допущений. Поэтому разработка способов получения детальной картины молекулярной динамики непосредственно из экспериментальных данных является важной и актуальной задачей этой области науки.

Основные задачи исследования.

Основной задачей диссертации является изучение влияния межмолекулярных взаимодействий на динамическое поведение белков в растворе и в твердом состоянии и получение информации о физических моделях молекулярных движений биополимеров непосредственно из экспериментальных ЯМР-данных. Более конкретно, данная задача сводится к решению следующих взаимосвязанных проблем:

• Изучение влияния межмолекулярных электростатических взаимодействий

в белковых растворах на характер броуновского вращения белков; создание качественной модели, объясняющей форму корреляционной функции вращения белков, а также ее зависимость от различных экспериментальных условий (концентрация, рН, температура, ионная сила);

• Сравнительное изучение внутренней динамики глобулярных белков в

кристаллическом и аморфном (регидратированный лиофилизованный порошок) состояниях; определение степени влияния межмолекулярных контактов в твердых белковых препаратах на характеристики внутренней конформационной подвижности в широкой частотной области.

• Разработка новых методических подходов для исследования молекулярной

динамики биополимеров, основанных на комплексном применении различных ЯМР экспериментов;

• Количественное исследование влияния гидратации на внутреннюю

динамику биополимеров различной природы; физическая интерпретация молекулярных механизмов влияния гидратной воды на параметры конформационной динамики белков и полипептидов;

Научная новизна. В данной работе впервые:

• предложена модель межмолекулярного электростатического

взаимодействия, объясняющая появление медленной компоненты в корреляционной функции вращения белка как целого;

• проведено сравнение параметров внутренней динамики нескольких ::глобулярных белков в кристаллическом и аморфном состояниях в

широком частотном диапазоне с помощью ЯМР-релаксационных методов;

• предложены две модификации эксперимента по измерению времени спин-

решеточной .ЯМР-релаксации во вращающейся системе координат в твердом теле, обусловленной гетероядерным диполь-дипольным взаимодействием, которые существенно расширяют частотный диапазон измерений и позволяют исключить нежелательный спин-спиновый вклад в релаксацию;

• применен метод твердотельной обменной ЯМР-спектроскопии с

вращением под магическим углом для исследования молекулярной динамики биополимеров;

• проведен совместный количественный анализ температурно-частотных

зависимостей времен протонной и углеродной магнитной релаксации в твердых биополимерах;

• предложен алгоритм совместного количественного анализа данных по

ЯМР-релаксации и обменной спектроскопии;

Практическая значимость. Разработанные в данной диссертации методические подходы позволяют получать информацию о молекулярной динамике, недоступную с помощью применявшихся ранее рутинных методов. Эти подходы могут быть полезны во всех работах по исследованию природы молекулярных движений методом ЯМР, причем, не только биополимеров. Учет влияния межмолекулярных электростатических взаимодействий на вид корреляционной функции вращения белков в растворах имеет важное значение для корректного получения информации о внутренних движениях. Поскольку

релаксационные эксперименты в растворах белков в настоящее время очень распространены, полученные в диссертации результаты могут представлять интерес для очень большого числа исследователей. Интерес для работы многих исследовательских групп может иметь также полученный в диссертации результат по сравнению динамики белков в кристаллическом и аморфном состояниях. Данный результат является косвенным свидетельством того, что внутренняя динамика белков в твердом гидратированном состоянии и в растворе одинакова. Это очень важно для изучения биологической функциональности белков с помощью экспериментов на твердых препаратах белков.

Личный вклад соискателя. Диссертация является обобщением большей части исследований, которые соискатель выполнил за последние 15-20 лет. Все основные результаты и выводы диссертации были получены и сформулированы самим соискателем. Все ЯМР эксперименты, представленные в диссертации, и их анализ были проведены соискателем. В публикациях, в которых соискатель является первым автором, ему принадлежит основная роль в постановке задач и формулировке выводов. В остальных работах вклад соискателя заключался в основном в обсуждении результатов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались лично автором на следующих научных конференциях:

• 10 Всесоюзная Конференция молодых ученых "Синтез и исследование

биологически активных соединений" декабрь 1989, Рига;

• 5 Всесоюзное совещание "Современные методы ЯМР и ЭПР в химии

твердого тела", Черноголовка, июнь 1990;

• XXVIIth Congress AMPERE, Kazan, August 1994;

• The 29th AMPERE - 13th ISMAR Conference, Berlin, August, 1998;

• Field-Cycling NMR relaxometiy Simposium, Berlin, August, 1998;

• III Всероссийская конференция "Новые достижения ЯМР в структурных

исследованиях", Казань, апрель 2000;

• VII Всероссийская Конференция "Структура и динамика молекулярных

систем", Яльчик, Марий-Эл, июнь 2000;

• International. Workshop "Modem development of magnetic resonance imaging

and spectroscopy. Basics physics and application in medicine and biology."

Kazan, June 2001;

• European Conference on Solid State Nuclear Magnetic Resonance "New

concepts and Applications", Chamonix-Mont Blanc, France, September, 2001;

• 16th European Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference, Prague,

June 2002;

• IV Всероссийская конференция «Новые достижения ЯМР в структурных

исследованиях», Казань, апрель 2005;

• XIII Международная Конференция «Ферменты микроорганизмов: ¡ структура, функции, применение» Казань, апрель 2005.

Исследования, проводимые по теме диссертации были поддержаны инициативными грантами РФФИ №№ 94-04-12855, 95-04-12098, 95-04-12102, 9604-49582, 98-04-48090, 01-04-49071 (в трех из них соискатель являлся руководителем), двумя совместными грантами РФФИ-ННИО (№№ 96-04-00106, 00-04-04007), грантом CRDF (№ RN1-417). Первый из основных результатов диссертации (см. заключительную часть автореферата) вошел в перечень важнейших результатов Российской Академии Наук в области естественных, технических, гуманитарных и общественных наук за 1997 год.

. Публикации. По материалам диссертации было опубликовано 40 печатных работ, из которых 19 - статьи в рецензируемых журналах, из них 2 - заказные обзоры.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, основных выводов и результатов, благодарностей, и списка цитируемой литературы (268 ссылок). Работа изложена на 247 страницах машинописного текста, содержит 76 схем и рисунков и 8 таблиц. Полный текст диссертации в электронном виде доступен по адресу

http://www.kibb.knc.ru/person/krushelnitsky/DD/

Основное содержание работы

Во Введении кратко изложены: роль молекулярной динамики в биологическом функционировании белков; общее описание физических подходов к исследованию биополимеров, в частности, методические особенности экспериментального изучения конформационной подвижности в твердом состоянии и растворе; структура диссертации вместе с кратким описанием основных задач, которые решались в процессе выполнения исследования.

ГЛАВА 1. ЯМР-методы исследования динамики белков и примеры их применения. Данная глава является обзорной. В ней описаны основные типы ЯМР экспериментов, дающих информацию о молекулярных движениях, и приведен литературный обзор наиболее значимых работ по исследованию динамики белков.

В разделе 1.1. Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике посредством ядерного магнитного резонанса перечислены основные ЯМР-зонды и соответствующие им типы ЯМР-экспериментов, которые используются при изучении молекулярной динамики биополимеров. В число этих зондов входят изотропный химический сдвиг, тензор анизотропии химического сдвига (АХС) и межъядерное диполь-дипольное взаимодействие. В разделах 1.2. Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига; 1.3. Вращение образца под магическим углом; 1.4. Двумерные обменные ЯМР-эксперименты; 1.5. Одномерные обменные ЯМР-эксперименты дается детальное описание математического формализма экспериментов, использующих в качестве зонда для изучения молекулярной динамики анизотропию химического сдвига - анализа формы линии спектра статического и вращающегося под магическим углом (ВМУ) образца и обменной спектроскопии ЯМР. Особое внимание уделено описанию одномерной твердотельной обменной спектроскопии ЯМР с ВМУ. Методика одномерных обменных экспериментов была разработана в течение последних 10 лет, эти эксперименты еще не стали распространенными рутинными методами исследования молекулярной динамики. Количественный анализ данных по

обменной спектроскопии основывается на следующем схематическом выражении:

Экспериментальные Молекулярные ^

Амплитуда

= Функция

линии

параметры : параметры:

а — тензор АХС

а>с - резонансная частота

—число возможных сак — частота ВМУ ориентации тензора АХС

- период эволюции а,■, Д, у), I = 1, Л^ - эйлеровы

углы для всех ориентации

г - время смешивания

,(1)

К — обменная матрица

где модель молекулярного движения (реориентации тензора АХС) определяется эйлеровыми углами каждой из ориентаций (непрерывные распределения могут аппроксимироваться за счет большого Ns) и элементами обменной матрицы Ку, которые определяют вероятность перескока тензора АХС из ориентации i в ориентацию J. Смысл обменных экспериментов состоит в том, чтобы, измеряя амплитуду линий в спектре ЯМР при различных экспериментальных параметрах, прежде всего при различных временах смешивания, с помощью ур-я (1) определить параметры, характеризующие молекулярную динамику. При этом конкретный вид Функции в ур-и (1) зависит от типа обменного эксперимента. В разделе 1.5 подробно описываются импульсные последовательности экспериментов trODESSA (Reichert et al., J. Magn. Resort. 125, 245, 1997) и CODEX (deAzevedo et al., J. Chem. Phys. 112, 8988, 2000), которые использовались в диссертации и приводится вид Функции в ур-и (1) для этих экспериментов.

В разделе 1.6 ЯМР-релаксация приводятся основные формулы, определяющие времена магнитной релаксации Гь Тг и Т\р как функции от спектральных плотностей движения. Поскольку в диссертации будет исследоваться релаксация только на ядрах 'Н, ПС и 1!N, для которых в биополимерах определяющим механизмом релаксации является диполь-диполыгое взаимодействие, другие механизмы не рассматриваются. Выражения для времен релаксации представлены для случаев как гомо-, так и гетеро-ядёрного дипольного взаимодействия. Раздел 1.7 Корреляционная функция

молекулярного движения и безмодельный подход посвящен описанию упоминавшегося выше безмодельного подхода - наиболее распространенного способа анализа времен магнитной релаксации в биополимерах. Основная идея этого подхода — разделение корреляционной функции внутреннего движения на усредняемую и неусредняемую части:

С(0 = ^ + (1-52)ехр(-/'/)) (2)

где г - время корреляции, характеризующее временной масштаб молекулярного движения, 53 - параметр порядка, определяющий долю усреднения диполь-дипольного взаимодействия молекулярным движением. З2 меняется от 0 до 1. При 5^=0 движение полностью усредняет межъядерное взаимодействие, что соответствует изотропному движению. ^=1 означает отсутствие движения. В разделе 1.&. ЯМР и химический обмен в белковых растворах описаны эксперименты, позволяющие изучать медленные конформационные движения в растворах за счет модуляции движением изотропного химического сдвига магнитных ядер. Эти эксперименты позволяют определять временной масштаб движения, но они в принципе не дают никакой информации о его геометрических параметрах. Раздел 1.9 Особенности проведения ЯМР-эксперимеитов на различных магнитных ядрах. Рассматриваются методические особенности проведения экспериментов на магнитных ядрах, которые применяются в исследовании белков - 'Н, 2Н, ,3С и 13Ы. Заключительный раздел первой главы 1.10 Конформационная динамика белков посвящен обзору основных работ по исследованию динамики белков, как в растворе, так и (более подробно) в твердом состоянии. Кроме описания результатов различных исследований в их историческом развитии в этом разделе представлено обобщение основной информации о конформационной динамике белков, накопленной к настоящему времени, и методических проблем, возникающих при изучении динамики белков методом ЯМР.

ГЛАВА 2. Броуновская динамика и межмолекулярные электростатические взаимодействия белков в растворе. В разделе 2.1

Качественная модель межмолекулярных электростатических взаимодействий на примере анализа концентрационной зависимости времен магнитной релаксации Т\ и Тг протонов белка в растворе лизоцима (Рис. 1) показано, что корреляционная функция броуновского вращения белка как целого в неразбавленном растворе не может быть описана одной экспонентой. Анализ проводился с помощью стандартных выражений, определяющих времена

релаксации:

Г,Г,, мс

г =11.8 НС

50 48 4644 42 40

12108-

50 100 150 200 Концентрация, мг/мл

Рисунок 1. Концентрационная зависимость времен релаксации протонов белка в растворе лизоцима белка куриных яиц в Б20 (рН=3.0, 1=20°С, резонансная частота 27 МГц). Сплошная и пунктирная линии - рассчитанные величины времен релаксации Тг, см. объяснения в тексте.

(3)

1 = -^(37(0) + 5У(«0) + 2Д2й;0))> (4)

где & — усредненный второй момент протонов белка, .Дга) — спектральная плотность движения. Если предположить, что увеличение концентрации белка приводит к увеличению эффективной вязкости раствора и, соответственно, к увеличению времени корреляции броуновского вращения гк (величины гь., соответствующие различным значениям Тл на концентрационной зависимости, показаны на Рис. 1), то тогда зависимость времени релаксации Тг должна соответствовать сплошной линии на Рис. 1. Если же предположить, что увеличение концентрации приводит к увеличению доли димеров, то тогда зависимость Тг должна соответствовать пунктирной линии. Таким образом, анализ данных показывает, что ни

то, ни другое предположение не соответствуют эксперименту.

Из Рис. 1 видно, что в диапазоне концентраций от 30 до 100 мг/мл Т\ практически не изменяется, а Т2 во всем диапазоне концентраций уменьшается при увеличении концентрации. Разница в поведении Т\ и Т2 может быть объяснена только тем, что в выражение для Тг (4) входит спектральная плотность на нулевой частоте ДО), которой нет в выражении для Т\ (3). Отсюда несложно сделать вывод о том, что при увеличении концентрации белкового раствора до определенного предела изменяется только спектральная плотность на нулевой частоте ДО), в то время как Д<Оо) и У(2ш0) практически не меняются. Отсюда можно сделать еще три вывода. Во-первых, кроме броуновского вращения со временем корреляции Тя белок участвует еще в одном движении, время корреляции которого как минимум в несколько раз больше тк. Во-вторых, броуновское вращение с временем корреляции тя должно быть анизотропно, хотя бы в очень небольшой степени. В противном случае, медленное движение не могло бы быть зарегистрировано в принципе. В-третьих, увеличение концентрации раствора до некоторого значения приводит к изменению характеристик только этого медленного движения, оставляя все остальные параметры динамического состояния белка неизменными. Необходимо отметить, что существует несколько независимых экспериментальных свидетельств того, что корреляционная функция броуновского вращения белков в растворе содержит компоненту, имеющую незначительный относительный вес и время корреляции которой значительно превышает стандартное время Тд.

Для физического объяснения такого вида корреляционной функции броуновского вращения белков нами была предложена следующая модель взаимодействия. Дипольный момент белка, который чаще всего имеет величину порядка нескольких сотен Дебай, взаимодействует с электрическим полем, создаваемым зарядами соседних белковых молекул, стараясь развернуться вдоль этого поля. Это создает анизотропию броуновского вращения белка. Однако внешнее электрическое поле не является постоянным, оно меняется как по величине, так и по направлению вследствие трансляционной диффузии белков

13

друг относительно друга. Исходя из этого, можно заключить, что относительный вес длинной компоненты корреляционной функции, т.е. степень анизотропии броуновского вращения, определяется силой межмолекулярного электростатического взаимодействия, а время корреляции этой компоненты, т.е. характерное время жизни этой анизотропии, определяется трансляционной диффузией белков. Легко показать, что характерное время трансляционной диффузии, которое можно определить как среднее время сдвига броуновской частицы на расстояние, равное собственному размеру, примерно на порядок величины превышает время корреляции вращательного движения. Это и объясняет большую разницу между временами корреляции двух компонент корреляционной функции вращения белков в растворе.

Следует отметить, что длинная компонента корреляционной функции может быть в принципе объяснена частичной олигомеризацией белков. Но этот механизм представляется гораздо менее вероятным. В этом случае должны образовываться кластеры, состоящие только из большого числа белков (порядка десяти), а число димеров и тримеров должно быть очень маленьким. Хотя такая олигомеризация действительно наблюдается в некоторых белках, но она имеет очень специфический характер, и она не может быть приписана ко всем белкам, в растворах которых наблюдалась длинная компонента корреляционной функции. Доказательством того, что олигомеризация не может служить причиной появления длинной компоненты, является также тот факт, что такой вид корреляционной функции наблюдался в релаксационных экспериментах ЯМР высокого разрешения на ядрах 13С (Ribeiro et al., JACS, 102, 4040,1980) и 15N (Lee & Wand, J. Biomol. NMR, 13, 101, 1999). В спектрах высокого разрешения линии от олигомеров значительно уширены, потому они там попросту не видны.

В разделе 2.2 ЯМР-релаксационные эксперименты на протонах белков в растворах тяжелой воды приводятся результаты анализа температурно-частотных зависимостей времен магнитной релаксации протонов белка в растворах нескольких белков при различных условиях. Пример такой зависимости показан на Рис. 2. Исходя из рассмотренной выше модели

100'

10-

Г,,2 (мс)

90 МГц

10.8 МГц

—О—Г] П о—

3.1

3.2 3-5

—I—

3.4

—Г-

3.5

Рисунок 2.

3.6

1ооо/т

Температурные зависимости времен релаксации протонов белка в растворе лизоцима (рН 3.0, кон-я 45 мг/мл). Обозначения значков: о - Т\ (частота указана на рисунке) Д - Гг на 10.8 МГц + - Тг на 27 МГц

электростатических взаимодействии белков в' растворе, корреляционная функция броуновского вращения белка как целого записывается в виде:

С ,,(!) = 51 ехр

ехР[-7^1.(5)

27 МГц

о

где - параметр порядка обычного броуновского вращения белка, г$ - время корреляции медленной компоненты корреляционной функции. Параметр определяет степень анизотропии броуновского вращения, которая вызвана межмолекулярным . электростатическим взаимодействием. Можно показать, что из релаксационных измерений при не слишком низких резонансных частотах из эксперимента нельзя определить и Гх отдельно, можно определить только произведение г^. При обработке температурно-частотных зависимостей предполагалось, что все времена корреляции зависят от температуры по закону Аррениуса. Обработка данных

заключалась в компьютерной минимизации среднеквадратичного отклонения:

' Т' -Т' ^

ехр ~

Т'

'ехр

(6)

где N - число экспериментально измеренных времен релаксации при всех температурах и резонансных частотах, Гехр и Г51т — экспериментальные и расчетные времена релаксации, соответственно.

Таблица 1. Микродинамические параметры, Основные результаты

определенные из подгонки температурных анализа вреМен релаксации зависимостей времен протонной релаксации на трех частотах резонанса. Времена корреляции соответствуют 20° С. Е$ тл Ея — энергии активации медленного движения и броуновского

% ккал/ моль Ея ккап/ моль НС не Дип. мом. О

Лизоцим рН 3.0,45 мг/мл 5.9 4.9 3.1 7.8 200

Лизоцим рН 3.0,100 мг/мл 5.9 4.9 7.3 8

Лизоцим рН 5.5,45 мг/мл 5.9 4.9 9.5 7.6

Рибонуклеаза А рН 2.7,45 мг/мл 5.9 4.8 5.0 7.5 300

Рибонуклеаза А рН 6.5,45 мг/мл 6 4.9 11.2 8

Биназа рН 2.5, 50 мг/мл 5.5 5.2 4.5 7.0 170

Биназа рН 6.0, 50 мг/мл 5.5 6.5 9.5 10.2

Триптофан-репрессор рН 6.0,45 мг/мл 8.5 5.3 80 23.5 700

БСА рН 7.0,50 мг/мл 5.0 4.8 55 38 450

(Таб. 1) подтверждают предложенную выше

модель межмолекулярных взаимодействий: изменение концентрации или рН белкового

раствора изменению параметров движения, корреляции вращения неизменным является биназа: увеличение рН приводит к частичной димеризации белка), а величина произведения т$ явно коррелирует с

приводят к только медленного время

броуновского

остается

(исключением

величиной дипольного момента белка. Необходимо отметить, что без включения в анализ длинной компоненты корреляционной функции вращения белка адекватного описания данных получить не удается: в этом случае наблюдается увеличение амплитуды внутренних движений белка при повышении концентрации. Это не имеет физического смысла, поскольку увеличение концентрации раствора не может вызывать конформационных или денатурационных переходов в белке.

Кроме того, в разделе 2.2 с помощью измерений подробных зависимостей времен релаксации от рН и ионной силы в растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) показано, что большое значение для параметров медленного

движения имеет кулоновское отталкивание белков друг от друга. Все молекулы белка имеют одинаковый заряд, его увеличение из-за кулоновского отталкивания приводит к увеличению среднего расстояния между белками в растворе и, соответственно, к уменьшению силы их взаимного ориентирования.

В разделе 2.3 Анализ дисперсий времен релаксации воды в растворах белков исследовалась корреляционная функция броуновского вращения лизоцима при различных концентрациях, рН и температурах методом измерения дисперсий (подробных частотных зависимостей в диапазоне резонансных частот от 10 кГц до 10 МГц) Г) протонов воды. Данные эксперименты были проведены на установке с циклированием магнитного поля (Kimmich & Anoardo, Prog. NMR Spectr., 44, 257, 2004). Принципиальная возможность исследования броуновского вращения белков с помощью экспериментов на протонах воды основана на том факте, что часть протонов воды связывается с глобулой белка (посредством химического обмена с лабильными протонами белка или за счет связывания молекул гидратной воды с белком) на достаточно долгое время и испытывает те же движения, что и белок. Пример дисперсий Т\ протонов воды представлен на Рис. 3. Результаты количественного анализа этих данных показали удовлетворительное соответствие с результатами экспериментов на протонах белка (см. выше). Допущение об одноэкспоненциальной корреляционной функции вращения белка (S\= 0) приводит к плохому описанию данных (пунктирные линии на Рис. 3). Главное преимущество анализа дисперсий Т\ в том, что они позволяют определить из эксперимента параметры S\ и rs отдельно друг от друга. Анализ показал, что время корреляции % имеет величину порядка 10"7 с, а параметр порядка составляет всего несколько процентов.

В разделе 2.4 Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина представлены результаты исследования функции дипольной корреляции (ФДК) в растворах миоглобина методом временной диэлектрической спектроскопии (эксперименты проведены И.В. Ермолиной). Эти эксперименты наглядно демонстрируют неэкспоненциальность ФДК при увеличении концентрации белка (Рис. 4). Было показано, что с увеличением концентрации в растворе миоглобина

17

2.25Н 2

1.75 1.51.251-

t,\V

c=130 мг/мл

10J

IF

10'

107 у,Гц

Рисунок 3. Дисперсии 7]"' протонов воды в растворе лизоцима при 4° С при двух рН. Сплошные и штриховые линии - подгоночные кривые, соответствующие подгонкам при свободном параметре ^ и при 5^=0, соответственно.

изменяются параметры только медленного движения

(увеличиваются и г$), в то время как остальные динамические параметры практически не изменяются. То, что

диэлектрическая спектроскопия приводит к таким же результатам, что и ЯМР, свидетельствует о том, Рисунок 4. ФДК для раствора миоглобина что длинная компонента

t,HC

400

при концентрации 50 (а) и 150 (Ь) мг/мл. Измерения проводились при t=20° С, рН=7. Штриховая линия обозначает является длинную компоненту корреляционной функции.

корреляционной функции не экспериментальным артефактом.

Раздел 2.5 Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия белков и компьютерное моделирование броуновской динамики электрических диполей посвящен оценкам энергии взаимного электростатического вазимодействия белков в растворах и описанию результатов моделирования броуновской динамики белков при различных условиях (моделирование было проведено Е.А. Ермаковой). Белки представлялись в виде шаров с точечными электрическими диполями в центре. Результаты этого моделирования также наглядно демонстрируют появление длинной компоненты в корреляционной функции вращения белков при росте межмолекулярных электростатических взаимодействий.

В заключительном разделе 2.6 второй главы обобщаются основные результаты представленных экспериментов. Анализ множества независимых экспериментальных данных по ЯМР и диэлектрической спектроскопии показывает, что корреляционная функция броуновского вращения белков в неразбавленных растворах содержит компоненту со временем корреляции, превышающим время корреляции броуновского вращения белка как целого. Это означает, что броуновское вращение является анизотропным. Относительный вес этой компоненты в большинстве случаев очень мал, так что определить ее параметры можно только с помощью скрупулезного количественного анализа данных. Характеристики этой компоненты зависят от концентрации, рН и ионной силы белкового раствора. Отсюда можно сделать вывод, что причиной усложнения характера броуновского вращения белков являются межмолекулярные электростатические взаимодействия. Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия в модели точечных диполей и зарядов при типичных значениях дипольных моментов белков и концентраций в несколько процентов показывают, что эта энергия сравнима по величине с энергией теплового движения. Компьютерное моделирование броуновской динамики частиц, обладающих электрическим дипольным моментом, подтвердило эффект появления длинной компоненты корреляционной функции.

Что касается внутримолекулярных движений, то эксперименты в растворе позволили получить только очень ограниченную информацию об их характеристиках. В растворе во временных масштабах больше, чем время корреляции броуновского вращения молекулы, усредняются до нуля многие из взаимодействий, посредством которых ЯМР позволяет получать информацию о динамике молекулы, прежде всего диполь-дипольные межъядерные взаимодействия и анизотропия химического сдвига. Это приводит к тому, что все внутренние движения со временами корреляции длиннее, чем время корреляции броуновского вращения, становятся практически невидимыми для ЯМР и других физических методов, регистрирующих реориентацию того или иного природного зонда. Детально изучать внутримолекулярные движения белков во всем частотном диапазоне можно только в твердом состоянии.

ГЛАВА 3. Исследование внутренних конформационных движений белков и полипептидов в твердом состоянии. Эта глава является наиболее объемной в диссертации. Большая часть результатов, представленных в данной главе, была получена в рамках совместной работы с коллегами из Университета Мартина Лютера (г. Халле, Германия). Раздел 3.1 Расширение частотного диапазона твердотельного ЯМР-эксперимента по релаксации во вращающейся системе координат для случая гетероядерной дипольной релаксации. Измерение времени релаксации Т\9 - один из основных способов получения информации о молекулярной динамике в микросекундном диапазоне времен корреляции. Однако, как было показано Вандерхартом и Гарровеем (Vanderhart & Garroway, J.Chem.Phys., 71, 2773, 1979), в жестких полимерах время определяется в основном т.н. спин-спиновым вкладом в скорость релаксации, который появляется в результате релаксационного стока в решетку через дипольный резервуар протонов и который практически не зависит от параметров молекулярной динамики. Это существенно ограничивает возможности этого метода. В данном разделе представляются две модификации эксперимента по измерению 7ip в твердых телах для случая релаксации ядер 13С и 15N, которая обусловлена гетероядерным дипольным взаимодействием с

■н

СР

декаплинг

протонами. Смысл этих модификаций состоит в расширении частотного диапазона релаксационных измерений и избавлении от нежелательного спин-спинового вклада в скорость релаксации.

Для решения этой проблемы было

предложено использовать 1) отстройку от резонанса частоты спин-лок поля и 2) дипольную развязку от протонов («декаплинг») во время действия спин-лок поля по ядрам углерода (азота). Импульсные

Рисунок 5. Импульсные последовательности для последовательности этих

двух модификаций

эксперимента представлены на Рис. 5.

90*

'н

СР

декаплинг

тч СР спин-лок Ц/и.

1

измерения Г]р с отстройкой от резонанса поля спин-лока (вверху) и с дипольной развязкой от протонов (внизу). "СР" обозначает кросс-поляризационную секцию последовательности.

Первая модификация позволяет значительно (в несколько раз) увеличить амплитуду эффективного поля спин-лока без увеличения мощности передатчика за счет использования отстройки от резонанса частоты спин-лока. В этом случае эффективное поле будет равно:

(7)

где Дсо/2л — отстройка от резонанса в частотных единицах, у - гиромагнитное отношение магнитных ядер, Вх - амплитуда спин-лок поля. Протонный «декаплинг» во второй модификации разрывает сток релаксации через

21

дипольный резервуар протонов, и это позволяет использовать очень низкие поля спин-лока, вплоть до сотен герц, в то время как в первой модификации поле спин-лока можно поднимать до 200-300 кГц (для ядер 13С).

Время релаксации, измеренное с использованием отстройки от резонанса поля спин-лока, определяются следующим образом:

1 +зт2е

_1___1_

^р 275

(8)

(9а)

-л—[^(«„Я-З^а*)], (9Ъ)

где

1 23

— = 77 - со,) + ЗУ(ы7 ) + 6У(ю5 + со/)], 1 э

26

5 - константа диполь-дипольного взаимодействия ядер 15М(13С)-'Н, 9 - угол между эффективным полем В\е и внешним постоянным полем В0 ^в=В]/(В0-2%\'/у), V -его частота), — круговая резонансная частота в наклоненной вращающейся системе координат. Выражения (8) и (9) были получены Р.Х. Курбановым.

Время релаксации, измеренное с использованием «декаплинга» во время действия спин-лока, определяется следующим феноменологическим выражением:

Т{р = Ха — ^ У(а>, + 2сог)+1 + со,)+1 ./(со, - шг )+1 /(со, - 2сог )^, (10)

где сог — круговая частота ВМУ, Хй - параметр, определяющий степень усреднения диполь-дипольного взаимодействия 15К(ПС)-'Н за счет «декаплинга». Данные модификации эксперимента были апробированы на простых модельных системах (глицин и диметилсульфон) на ядрах 13С и 15Н. Эти модификации были использованы в следующих разделах третьей главы диссертации.

Раздел 3.2 Сравнение внутренней динамики белков в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях. Одна из основных проблем, возникающих при исследовании глобулярных белков в твердом состоянии, состоит в следующем: насколько влияют межбелковые контакты, которые отсутствуют в естественном для глобулярных белков водном

окружении, на структурные и динамические свойства белка? Иначе говоря, насколько правомочно применять информацию, полученную из твердотельных экспериментов, для объяснения молекулярно-биологических свойств белков, которые они проявляют в растворах? Что касается структуры, то уже достаточно давно было показано,' что структуры одних и тех же белков, определенных рентгеноструктурным (твердое тело) и ЯМР (растворы) методами, за исключением отдельных специфических случаев одинаковы. Можно ожидать, что и динамика белков в двух состояниях тоже одинакова, однако явного и однозначного ответа на этот очень важный вопрос пока нет.

Для решения этой проблемы было предпринято систематическое сравнение внутренней динамики трех различных белков (лизоцим белка куриных яиц, лизоцим фага Т4 и барстар) в форме регидратированного лиофильно высушенного порошка и микрокристаллов (образцы микрокристаллов белков были приготовлены Ю.В.Гоголевым). Индикаторами молекулярной динамики были времена релаксации Ту и (см. 3.1) ядер |3С естественного содержания.

Эти времена релаксации чувствительны. к молекулярной динамике в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции, соответственно. Широкий разброс химических сдвигов химически неэквивалентных углеродов позволяет проводить анализ динамики для основной и боковых цепей по отдельности.

В качестве примера на Рис. 6 представлены спектры 13С естественного содержания куриного лизоцима в микрокристаллическом и порошкообразном состояниях. Можно видеть, что спектральное разрешение белка в микрокристаллическом состоянии несколько лучше чем в порошкообразном, что является следствием однородности микроокружения молекулы белка в кристалле. Для построения релаксационных спадов. в спектрах белков были определены четыре спектральные полосы А-Б,. по которым определялись интегральные интенсивности (площадь участка спектра) при различных релаксационных задержках. Полосу А составляют в основном метиновые (СН) альфа-углероды основной цепи, полосу В - метиленовые (СН2) углероды боковых цепей, полосы

а_ в с о

аморфн!

микрок|

ТТ

80 70 60 50 40 30 20 ХИМ. СДВИГ, М.Д.

10 о

Рисунок 6. Спектры лизоцима белка куриных яиц при ВМУ и дипольной • развязке от протонов. Резонансная частота 100.5 МГц, степень увлажнения 1 порошка - 0.5 г воды на г сухого белка. Отрезки А-Э обозначают участки спектра, по которым строились релаксационные спады интегральных ' интенсивностей данных участков. Узкие линии при 71 и 65 м.д. в спектре • микрокристаллов относятся к углеродам полиэтиленгликоля, который был составной частью кристаллизационного раствора.

С и Б - метальные (СН3) углероды с некоторой долей метиленовых углеродов в

С полосе.

Релаксационные спады Т\ для трех белков и спектральных полос А и В представлены на Рис. 7. Визуальное сравнение этих спадов ясно показывает, что наносекундная динамика как основной, так и боковых цепей в кристаллическом и аморфном состояниях одинакова. Сравнение спадов приводит к

аналогичному выводу относительно динамики в микросекундной области. Из этого . можно сделать вывод, что либо воздействие белок-белковых взаимодействий на внутреннюю конформационную динамику в аморфной и кристаллической фазах одинаково, либо это воздействие незначительно. Последнее представляется гораздо более вероятным и правдоподобным, поскольку геометрия межбелковых контактов и тип взаимодействия между соседними белками в этих двух типах образцов неодинаковы. Таким образом,

50

90

80

60

70

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

0.0 0 5 1 0 1.5 2.0 2.5 3.0

г/с

х/с

Рисунок 7. Релаксационные спады Т\ спектральных полос А и В. Закрашенные и незакрашенные значки обозначают микрокристаллические и аморфные образцы, соответственно. Обозначения символов:

■ □ - куриный лизоцим (верхние кривые) А А— лизоцим Т4 (средние кривые) • О - барстар (нижние кривые) полученный результат является косвенным свидетельством того, что внутренняя динамика глобулярного белка в твердом состоянии и в растворе тоже одинакова, конечно, при условии, что в твердом состоянии белки полностью шдратированы и не образуют специфических белок-белковых комплексов. Справедливости ради необходимо заметить, что проведенные эксперименты по своей природе являются интегральными, и нельзя исключить, что в определенных ограниченных участках структуры белка межбелковые взаимодействия могут приводить к каким-то специфическим изменениям в динамике, но, в то же время, очевидно, что такие изменения, если и существуют, не носят глобального характера.

Представленные в разделе 3.2 эксперименты являются типичным примером качественно-сравнительного подхода к изучению молекулярной динамики. Хотя такие исследования могут ответить на некоторые важные вопросы, они не дают

никакого представления о параметрах и природе молекулярных движений. Для получения более детальной информации о динамике необходим количественный анализ широкого набора экспериментальных данных. Этому посвящена остальная часть третьей главы.

В разделе 3.3 Исследование динамики биополимеров с помощью ЯМР-релаксации на ядрах 'Н и !3С естественного содержания представлены результаты исследования внутренней динамики модельной системы, полилизина, и лизоцима белка куриных яиц в твердом (порошкообразном) состоянии при различных степенях увлажнения. Определение параметров внутренней динамики проводилось с помощью компьютерной минимизации (подгонки) квадратов отклонения (аналогично уравнению (6)). Подгонка проводилась по температурно-частотным зависимостям времен релаксации Т\, и Т^ (см. 3.1). Для каждого

образца измерялось 15-25 времен релаксации, которые одновременно обрабатывались в процессе подгонки. Такой подход позволял определять динамические параметры в широкой частотной области достаточно точно и однозначно. Спектральная плотность движения в процессе подгонки записывалась в виде

сю

® 1 + (йя0)

где То - время корреляции молекулярного движения, 5й - упоминавшийся выше параметр порядка молекулярного движения (см. уравнение (2)), ¡5 — феноменологический параметр ширины распределения времен корреляции (ур-е (11) соответствует функции распределения Фуосса-Кирквуда). /7 изменяется от нуля (бесконечно широкое распределение) до единицы (функция распределения становится дельта-функцией). Введение распределения времен корреляции необходимо для адекватного описания экспериментальных данных: поскольку в полимерах характер движения может быть достаточно сложным, единственное время корреляции в большинстве случаев не может обеспечить удовлетворительного качества описания эксперимента. Допуская, что

температурная зависимость времени корреляции определяется законом Аррениуса, молекулярное движение может быть количественно описано набором из четырех микродинамических параметров: параметр порядка, время корреляции, параметр ширины распределения времен корреляции и энергия активации. Если межъядерный вектор участвует в двух типах молекулярного движения с сильно различающимися временами корреляции, спектральная плотность движения имеет вид:

(12)

где нижние индексы параметров обозначают номер движения. При такой записи предполагается, что Т|»Т2. Таким образом, четыре (для одного движения) или восемь (для двух движений) микродинамических параметров определяют весь набор времен релаксации, измеренных при различных резонансных частотах и температурах.

Параграф 3.3.1 Полилизин - релаксация на ядрах 13С естественного содержания. Химическая структура полилизина представлена на Рис. 8. Он исследовался при четырех степенях увлажнения (от 0 до 0.2 г воды на грамм сухого полипептида) с помощью релаксационной ЯМР-спектроскопии на ядрах

13С естественного содержания. В твердотельном

ЫНТ спектре ЯМР разрешены линии от всех пяти

с ^ алифатических углеродов этого полипептида, от

„ N альфа-углерода, находящегося на основной цепи до 8 СИ,

/ эпсилон-углерода, локализованного близко к концу у СН,

\ боковой цепи. Это позволяет измерить времена В СИ

1 уг релаксации для каждого углерода по отдельности и

...» * ••• получить селективную динамическую информацию.

С м

|| | Типичные примеры частотно-температурных

ОН

Рисунок 8 зависимостей времен релаксации Т\, и для

Химическая структура отдельных углеродов при различных влажностях полилизина.

Са 11=0.12 Г (V-100.5 МГц)

С)3 11=0

СЕ Ъ-0.2

Г, (у-50.3 МГц)

Т° (V -117 кГц 6=19°)

Г° (у-5.5 кГц V-).! кГц) ---т^-Х-Т —

' 1 1 I Г"; г^у,-209 кГц е-9°) —Х_ Т X т Х-С'«^24 кГп 8-6.5") г^-.мхЪГ4^. 8-16.5°)

^>,-119 кГц 6=21°) 0.01. Ъ. К (V,-5.5 кГц \т V «1.5 кГц)

Т^ (у-5.5 кГц V »1,5 кГц)

1>-

3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 103 К/Т

3.0 .3.2 3.4 3.6 3.8 103К/Т

3.0 32 3,4 3.6 38 103К/Т

Рисунок 9. Примеры температурных зависимостей для различных углеродов и уровней гидратации (Ь обозначает уровень увлажнения полпептида). Сплошные линии - подгоночные кривые, построенные по параметрам, представленным на Рис. 10 и 11.

представлены на Рис. 9. Микродинамические параметры, определенные из анализа времен релаксации, представлены на Рис. 10 и 11.

Анализ показал - как основная, так и боковые цепи дегидратированного полилйзина участвуют в двух типах молекулярных движений. Быстрое движение имеет время корреляции порядка нескольких наносекунд, относительно небольшую энергию активации и узкое распределение времен корреляции. Медленное движение имеет более высокую энергию активации и более широкое распределение времен корреляции. Время корреляции этого движения в сухом полипептиде имеет величину порядка 10"4 с как для основной, так и для боковых цепей.

Зависимость микродинамических параметров от степени гидратации для основной и боковых цепей совершенно различна. Время корреляции медленного движения основной цепи практически не изменяется во всем диапазоне исследованных уровней гидратации, а время корреляции медленного движения

ь=о

Ь=0.05 Ь=0.12 Ь=0.2

^ у ^ ^

0.9- т А 0.9- й9-

V-

т/м кс

300 200 100 0

г^с 8

6

4

2

О

Р у 5 е Ь=0

Рубе Ру 6 £ р У б Б

Ь=0.05 тЪасс Ь=0.12 Ь=0.2

б 4 Г "■

20 1 '»-Н

тЛк . т/нс Т. 8 г'нс

6- 6

4- 4 4 •

2 0- 2 ||.| 0 2- • . 0- ♦

р Г 8 Е 0 у 5 е р у 6 б р у 5 е

Рисунок 10а. Зависимости параметров порядка (вверху) и времен корреляции (внизу) от степени гидратации для четырех углеродов боковой цепи полилизина. Закрашенные и незакрашенные значки при уровнях гидратации 0 и 0.05 соответствуют параметрам быстрого и. медленного движений.

боковых цепей уменьшается примерно на 5 порядков величины. При уровнях гидратации больше 10% быстрое и медленное движения экспериментально друг от друга неразличимы. Амплитуда медленного движения основной цепи увеличивается с ростом гидратации, но это увеличение незначительное, и даже при максимальном уровне гидратации амплитуда остается достаточно низкой. Амплитуда быстрого движения основной цепи не проявляет практически никакой зависимости от гидратации.

Отдельного комментария заслуживают абсолютные величины энергии активации медленного движения. Они являются слишком высокими, высота активационного барьера 100-150 кДж/моль не может соответствовать времени

р

0.7060.50.40.3 ■ 0.2 0.1 0.0

и=о

д

р

0.70.60.5 0.4

аз аг

0.1

Ь=0.05

Ч

Ь=0.12

Ь=0.2

р у 5 Е 1т=0

У"*

V.

Р у 5 е ¡¡уде

11=0.05

кДж/йаль

Ь=0.12

кДж/моль

р у 5 е Ь=0.2

Е.

кДмс/моль

Р у б Е РубЕ (3 у б Е РубЕ

Рисунок 10Ь. Зависимости параметров ширины распределения (вверху) и энергии активации (внизу) от степени гидратации для четырех углеродов боковой цепи полилизина.

корреляции этого движения в микросекундном диапазоне при комнатной температуре (Рис. 10 и 11). Данное противоречие объясняется тем, что высота энергетических барьеров низкочастотных движений в полимерах имеет температурную зависимость (Слуцкер с соавт., Физ. Те. Тела, 44, 1529,2002; Жур. Техн. Физики, 72, 86, 2002). Это приводит к тому, что энергия активации, определенная по наклону температурной зависимости времени корреляции движения в относительно узком температурном диапазоне, является величиной кажущейся. Реальная энергия активации, оцененная по соотношению времени корреляции при комнатной температуре и при бесконечно высокой температуре (Ю-12 - 10"13 с), имеет величину в пределах 35-50 кДж/моль (для сухого полипептида).

1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90

\

\ т

О''

—4

4

... О

г.охю-1!

ЬОхЮ^ф 5.0x10''

3.0x10"' 2.0x10'8 1.0x10"'-

0-

т/с

-о—

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

0.01

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2

О.,

100

50

О"

.....О

Еа/кДж/моль »---•

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

А

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20

А

Рисунок 11. Микродинамические параметры, полученные из обработки релаксационных данных для альфа-углерода полилизина. Закрашенные и незакрашенные символы обозначают параметры быстрого и медленного движений, соответственно.

Все изменения в динамике полилизина, происходящие при увеличении

уровня гидратации, не могут быть отнесены за счет гидратационно-зависимых конформационных переходов, поскольку при всех исследованных уровнях гидратации полилизин не меняет своей вторичной структуры, оставаясь преимущественно в конформации бета-слоя. Исходя из этого, объяснить различную гидратационую зависимость динамики основной и боковых цепей совсем не трудно. При всех уровнях гидратации основная цепь стабилизирована системой водородных связей, которая ограничивает ее движение вне зависимости от присутствия молекул воды. Что касается боковых цепей, то они, в отличие от нативной структуры глобулярных белков, не имеют строго определенной пространственной структуры. Это позволяет молекулам воды свободно проникать внутрь структуры полилизина и таким образом способствовать увеличению подвижности боковых цепей.

Отдельно следует отметить методическое значение представленных результатов. Большое количество .экспериментальных параметров (времен релаксации), измеренных на одном и том же образце, позволило с привлечением минимального числа априорных допущений, во-первых, достаточно достоверно определить минимальное количество молекулярных движений, необходимых для адекватного описания всего набора экспериментальных данных и, во-вторых, количественно определить параметры этих движений. Без такого широкого набора данных детальное количественное исследование молекулярной динамики было бы невозможно.

В параграфе 3.3.2 Сравнительный анализ динамики полилизина и лизоцима по данным релаксации на ядрах 13 С естественного содержания было проведено аналогичное полилизину исследование динамики глобулярного белка - яичного лизоцима в сухом и увлажненном до уровня 0.4 г воды на грамм белка состояниях. Основная цель данного исследования— проследить разницу во влиянии гидратации на конформационную динамику биополимеров различной природы и интерпретировать эту разницу с физической точки зрения. В случае Лизоцима было, конечно, невозможно получить разрешение линий отдельных углеродов, как в полилизине, но, тем не менее, в спектре можно было различить линии СН, СН2 и СНз углеродов, что позволяло характеризовать динамику основной и боковых цепей лизоцима по отдельности. Как и в полилизине, динамика всех углеродов описывалась двумя движениями, одно из которых имело времена корреляции порядка наносекунд, другое - доли миллисекунды. Но зависимости времен корреляции молекулярных движений от уровня гидратации в лизоциме не наблюдалось. Амплитуда движений с ростом гидратации увеличивалась, но не так, как в полилизине. При увлажнении подвижность боковых цепей сильнее увеличивается в полилизине, а основной цепи - в лизоциме. Эта разница в динамическом поведении объясняется различной природой этих двух биополимеров, С одной стороны, лизоцим имеет жесткую плотноупакованную структуру, внутрь которой молекулы воды свободно проникать не могут, а у полилизина такой структуры нет, и молекулы воды могут

свободно проникать между бета-слоями, создавая пространство для движения боковых цепей. Это объясняет разницу в подвижности боковых цепей двух биополимеров. С другой стороны, почти вся пептидная цепь полилизина включена в образование вторичной структуры (бета-слоя), а у лизоцима только 40% основной цепи образует альфа-спирали и бета-слои. Следствием этого является различная низкочастотная динамика основной цепи этих двух биополимеров: в полилизине амплитуда этого движения от гидратации почти не зависит, а в лизоциме зависимость достаточно сильная. Обобщая эти результаты, можно сказать, что механизм влияния гидратной воды на конформационную динамику биополимеров сводится к созданию свободного объема вокруг кинетической единицы, будь то отдельная боковая цепь или более объемный элемент структуры белка, например, альфа-спираль. Поскольку молекулы воды не имеют свободного доступа к гидрофобному ядру белка, подвижность боковых цепей белка возрастает только благодаря поверхностным эффектам. В то же время, если полипептидная цепь стабилизирована системой водородных связей, образующих вторичную структуру, то добавление воды и создание свободного объема уже роли не играет - цепь остается жесткой.

При всем обилии количественной информации, полученной о динамике полилизина и лизоцима с помощью релаксационной спектроскопии на ядрах 13С, она имеет существенный недостаток, упоминавшийся выше: параметр порядка не дает представления о физической природе движения, поскольку переход от 5? к конкретной модели движения неоднозначен. Эта проблема решается в параграфе 3.3.3 Полилшин - сравнительный анализ ЯМР-релаксации на ядрах 'Н и13С. В дополнение к описанным выше углеродным экспериментам были проведены аналогичные релаксационные эксперименты на протонах при тех же степенях гидратации (увлажнение проводилось тяжелой водой). Времена протонной и углеродной магнитной релаксации определяются различными магнитными взаимодействиями, а именно межъядерными диполь-дипольными взаимодействиями 'Н-'Н и 13С-'Н, соответственно. Таким образом, даже для одного и того же типа движения параметры порядка, определенные из протонных

и углеродных релаксационных экспериментов могут быть разными. Анализ данных показал, что в сухом полилизине для быстрого движения соблюдается неравенство 5,|н>^нн. где и 5,2{н - параметры порядка, определенные соответственно из углеродного и протонного экспериментов. То есть, судя по протонным данным, амплитуда движения больше, чем это следует из анализа углеродных данных. А для медленного движения наблюдается обратное, соотношение параметров порядка: ¿'¿н< ^нн • При анализе данных учитывалось следующее важное обстоятельство: в метальных и метиленовых группах расстояния С-Н и Н-Н равны соответственно 1.08 А и 1.78 А. В то же время, наиболее короткое расстояние между атомами разных химических групп примерно 2.3-2.5 А. Величина диполь-дипольного взаимодействия обратно пропорциональна межъядерному расстоянию в шестой степени. Отсюда очень легко оценить, что релаксация углеродов практически полностью определяется взаимодействием с ковалентно связанными протонами одной и той же химической группы (СН, СН2 или СН3). А в случае протонов магнитная релаксация определяется взаимодействием между протонами не только одной и той же химической группы, но и между протонами различных химических групп, в том числе и весьма удаленных друг от друга по первичной последовательности. Кроме ЯМР экспериментов использовалось компьютерное моделирование Монте-Карло динамики полилизина, которое позволяло определять параметры порядка высокочастотного движения для углеродного и протонного релаксационного экспериментов, а также рассчитывать величину диполь-дипольного взаимодействия для протонов.

Анализ всех данных позволил получить следующую физическую картину молекулярной динамики этого полипептида. Как указывалось выше, полилизин имеет конформацию бета-слоя, при этом боковые цепи каждого бета-слоя были вставлены в промежутки между боковыми цепями противолежащего бета-слоя, как показано на Рис. 12. Вся молекулярная динамика полилизина является композицией из трех различных типов движения. Первый тип - это малоамплитудные колебания двугранных углов (степеней конформационной

Рисунок 12. Часть молекулярной структуры, использованной в моделировании Монте-Карло: две цепи (Ьуз-01у)3, принадлежащие двум противолежащим бета-слоям. Поскольку боковые цепи соседних остатков полилизина ориентированы в разные стороны по отношению к плоскости бета-слоя, динамика тех боковых цепей, которые

ориентированы наружу не анализировалась. Эти остатки были заменены на глицин для сокращения времени вычислений.

энергетического барьера, вызванного

лизиновых остатков.

Наконец, третий тип движения -

свободы полипептида) в пределах стерических ограничений, которые определяются плотностью

молекулярной упаковки структуры полимера. Этот тип движения соответствует быстрому движению, которое наблюдалось в углеродных экспериментах, см. выше. Второй тип - редкие поворотно-изомерные конформационные скачки боковой цепи лизиновых остатков, которые изображены на Рис. 13. Характерное время этих скачков — микросекунды, они имеют высокую энергию активации, поскольку такие конформационные переходы связаны с преодолением высокого

стерическими ограничениями соседних

это локальные увеличения расстояния

Рисунок 13. Переходы между конформациями «анти» и «син» боковой цепи полилизина,

Плоскости бета-слоев

Рисунок 14. Схематическое изображение процесса диффузии дефектов •■' вдоль основной цепи полилизиновой структуры, состоящей из параллельных бета-слоев.

изображен на Рис. 14. Модель этого движения (диффузия дефектов) была предложена в работе (Миэяег а!., X Ркуз. СИет., 92, 6808, 1988) и использована нами для объяснения экспериментальных данных. Это движение имеет низкую энергию активации, поскольку оно не связано с преодолением высоких энергетических барьеров, и характерное время в наносекундном диапазоне. Важно отметить, что этот тип движения не виден напрямую в углеродных экспериментах, поскольку он приводит минимальным реориентациям С-Н векторов. В то же время, протонные эксперименты могут «почувствовать» этот тип движения, поскольку он приводит к усреднению диполь-дипольного взаимодействия между протонами, локализованными на боковых цепях лизиновых остатков противолежащих бета-слоев. Таким образом, данная работа наглядно демонстрирует, что количественное сопоставление параметров порядка, определенных из релаксационных экспериментов на различных магнитных ядрах, может дать ясное представление о физической природе молекулярных движений, которое было бы недоступно в случае анализа экспериментальных данных только одного типа.

Раздел 3.4 Применение твердотельной обменной ЯМР-спектроскопии для исследования низкочастотной внутренней динамики белков. Мы были первыми в мире, кто применил твердотельную обменную ЯМР-спектроскопию

между двумя противолежащими бета-слоями, которые, скорее всего, диффундируют вдоль полипептидной цепи. Схематически этот тип движения

для исследования динамики биополимеров (Krushelnitsky et al., J. Magn. Resort. 138, 244, 1999), Параграф 3.4.1 Исследование динамики основной цепи барстара и полиглицина с помощью последовательности tr-ODESSA излагает основные результаты этой работы. Была исследована динамика основной цепи барстара и полиглицина в сухом и увлажненном (h=0.2) виде. Эксперименты в барстаре проводились на ядрах 1SN (для чего белок был изотопно обогащен), в полиглицине - на ядрах ,3С естественного содержания. В обменных экспериментах была использована импульсная последовательность trODESSA. Одна из основных проблем, которая рассматривалась в данной работе, - влияние спиновой диффузии на получаемую из эксперимента информацию о молекулярном движении. В подобных экспериментах наблюдается одновременно два процесса - молекулярное движение и спиновая диффузия. При всей разнице в физике этих процессов, в обменном эксперименте они проявляются совершенно одинаково, и единственная экспериментальная возможность разделить их — проведение экспериментов при различных температурах. Время корреляции молекулярного движения от температуры зависит, а скорость спиновой диффузии - практически нет. Было теоретически показано, что молекулярное движение может проявиться в обменном спаде (зависимости интенсивности линии спектра от времени смешивания), только если время корреляции движения короче, чем характерное время спиновой диффузии. Именно поэтому в увлажненном барстаре наблюдалась зависимость формы обменного спада от температуры только при высоких температурах, а при низких температурах такой зависимости не было (Рис. 15). В сухом барстаре и полиглицине (в сухом и увлажненном виде) наблюдалась только спиновая диффузия.

Что касается молекулярного движения основной цепи барстара, его детальное исследование представлено в параграфе 3.4.2 Совместный анализ обменных и релаксационных ЯМР-данных — метод SREDA. Для того, чтобы исключить нежелательное влияние спиновой диффузии, в этой работе использовался белок с 15% обогащением изотопом 15N. Обменные эксперименты проводились с помощью импульсной последовательности CODEX. Основная

Рисунок 15. Нормализованные обменные спады для увлажненного (Ь=0.2) барстара при различных температурах.

цель этого исследования — количественное сопоставление параметров порядка, определенных из релаксационных и обменных данных ЯМР. Ядра 15Ы на основной цепи белка представляют собой очень удобный объект для подобных экспериментов: магнитная релаксация определяется взаимодействием с единственным ковалентно связанным протоном, тензор АХС азотов близок к осевой симметрии, а направление главной оси этого тензора почти совпадает с химической связью Ы-Н. Параметры порядка для релаксационного и обменного экспериментов определяются следующими выражениями:

' ^ ) 2|Р(91 ■ Ф1 )Р(6г.Ф2)3("(8''Ф') ф2))2~ав^ФгёЭд, (13)

оооо

я!«* =] 1 ] 1 Р№, ■ ф. )Р(02 ,Ф2) 'ф|' 9й2' ф\)еЗф,а91аф2ае2, (и)

О П О О Д01.Ф1.01.Ф1) _ . ,

где р(0,ср) - ориентационная функция распределения для N-H вектора (или главной оси тензора АХС), которая, собственно, определяет модель движения, 0 и ф - углы полярной системы координат, л(9,<р) - единичный вектор с ориентацией, определяемой 0 и ф, 1(6],фъ02,ф2) - интенсивность сигнала в обменном эксперименте при условии, что до времени смешивания ориентация главной оси тензора АХС определялась углами 6] и фь а после - углами 02 и ф2. Интенсивность 1(01,фь02,ф2) определяется ур-ем (1) в форме, определяемой конкретным экспериментом, в предположении обмена только между двумя положениями. Допущение об осевой симметрии тензора АХС и совпадении главной оси тензора АХС и N-H вектора означает, что функция р(0,ф) в ур-ях (13) и (14) одна и та же.

Хотя S^iax и SjXch определяются одной и той же функцией р(0,ф), но определяются они по-разному. Следовательно, для разных р(9,ф) соотношение параметров S„lax и SjXCh будет различным. Это в свою очередь дает возможность селекции различных моделей движения непосредственно из эксперимента. Это является ключевой идеей данного методического подхода, которому была присвоена аббревиатура SREDA (Simultaneous Relaxation and Exchange Data Analysis). Возможности подхода SREDA были иллюстрированы модельными расчетами для четырех различных моделей движения, представленных в Таб. 2. Взаимозависимость параметров S^ и S*xch для этих моделей движения при различных угловых амплитудах 0а представлена на Рис. 16. Как видно, сопоставление S^]a4 и SjXCh позволяет отличить одну модель движения от другой непосредственно из экспериментальных данных, хотя сделать это можно только для высокоамплитудных движений.

Этот метод был применен для анализа динамики основной цепи барстара в свободном и связанном с биназой состояниях. Кроме обменных спадов измерялись времена релаксации Ту и T{f при нескольких температурах.

Таблица 2. Различные модели движения и соответствующие им ориентационные функции распределения. 5(х) обозначает дельта-функцию

Модель Ориентационная функция распределения

а. Скачки между двумя равновероятными ориентациями р(9,ф)=5(ф)(0.55(9)+0.5 5(9-9а))

Ь. Скачки между двумя ориентациями с населенностями 20% и 80% р(9,ф)=8(ф)(0.25(9)+0.8 5(9-90)

с. Диффузионные колебания внутри пленарного угла (модель «веер») р(0, ф) = ^ при 0<9<9а р(9,ф)=0 при 9„<9<я

с!. Диффузионные колебания внутри конуса р(6,<р) = ,1ЗШ8 . , при 0<9<9а р(9,ф)=0 при 9а<9<7Г

Совместный количественный анализ релаксационных и обменных данных заключался в минимизации среднеквадратичного отклонения

RMSD=

1 b (Т' -Т1 Y Ä г г" -Г. Y1

NR+NC i-1 иъ J * тшах* _ттт* I ^'ехр ехр )

(15)

где Nr и Nc - число экспериментальных точек в релаксационных и обменных экспериментах, l"txp и Isim - экспериментальные и теоретические интенсивности амплитуды линии спектра при различных временах смешивания в эксперименте CODEX; I™"' и I™' - максимальная и минимальная экспериментальные интенсивности в обменном эксперименте. Времена релаксации определялись ур-ми (8) и (9), интенсивности амплитуды линии в обменном эксперименте определялись как

.fiil-U

где р(т/т0) - функция распределения Фуосса-Кирквуда, тт - время смешивания.

Анализ данных показал, что основная цепь барстара участвует в двух типах молекулярных движений со временами корреляции 10'9-10'7 с и 10"4-10"3 с.

40

i(Tm)=sLh+a-sLh)Jp[ —

dx.

(16)

101 Вычленение двух типов движения с

0.9- ^^$

^^ такими временами корреляции

довольно типично, оно хорошо

согласуется и с нашими

предыдущими, и со многими

литературными данными. Связывание

барстара с биназой ведет к

уменьшению угловой амплитуды

медленного движения основной цепи

барстара в полтора раза. Это также

приводит к значительному

уменьшению амплитуды быстрого

движения, хотя для наносекундных

движений метод ЭВДЮА не может

дать никаких количественных оценок,

поскольку обменный эксперимент не резонансная частота для ядер 15Ы 40.5

чувствителен к динамике такого временного масштаба. Амплитуда движения основной цепи белка очень небольшая (параметр порядка 5^1ах равен 0.87±0.03 для свободного барстара и 0.94±0.01 для комплекса барстар-биназа), поэтому определить модель реориентации из сопоставления и

невозможно. Однако, исходя из угловой амплитуды движения, можно утверждать, что модель с! (колебания в конусе) является наиболее реалистичной.

Параграф 3.4.3 Эффект зависимости скорости спиновой диффузии между ядрами от частоты ВМУ. Зависимость скорости спиновой диффузии между ядрами в тотально обогащенном белке от скорости ВМУ -хотя и достаточно частная, но методически важная проблема. Скорость спиновой диффузии определяется величиной диполь-дипольного межъядерного взаимодействия, которая может усредняться за счет ВМУ, если скорость ВМУ больше, чем межъядерное взаимодействие, выраженное в частотных единицах.

41

"I—I-Г—I—1—1-1-1-■-1-■-1—Т-

}.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1-Srdax

Рисунок 16. Взаимозависимость параметров S^ и SeXCh при различных угловых амплитудах движения для моделей a-d из Таб. 2. Расчеты S^xch были проведены при значениях скорости ВМУ 3 кГц, АХС Дст=160 м.д., период эволюции в последовательности CODEX 0.333 мс,

Нам удалось впервые измерить зависимость скорости спиновой диффузии между ядрами I!Nb тотально обогащенном белке от частоты ВМУ. Эксперименты были выполнены с помощью импульсной последовательности CODEX. Дня сравнения аналогичные эксперименты были проведены в поликристаллическом ВОС-глици'не, также обогащенном l5N (Рис. 17). Спиновая диффузия — один из основных способов определения межъядерных расстояний в" молекулах с помощью твердотельного ЯМР. С другой стороны, спиновая диффузия очень мешает1 при исследовании молекулярной динамики. Полученные результаты говорят о том, что в зависимости от цели эксперимента следует осознанно выбирать частоту ВМУ. Тем не менее, даже при самой высокой частоте ВМУ спиновая диффузия очень быстрая для спин-решеточной релаксации азотов белка (7i обычно имеет величину порядка десятков секунд). Это приводит к усреднению релаксационных спадов соседних ядер 13N и, следовательно, к невозможности корректно извлечь селективную динамическую информацию. Это значит, что исследование динамики на отдельных магнитных ядрах с помощью измерения времени релаксации Т\ можно проводить только на селективно

Рисунок 17. Зависимость характерного времени спиновой диффузии (гя>) от частоты ВМУ для ВОС-глицина и лизоцима Т4. Сплошные линии — описание

экспериментальных данных линейными

зависимостями.

обогащенных белках.

j .

Основные выводы и результаты

1. Обнаружена анизотропия броуновского вращения глобулярных белков в водных растворах, вызываемая взаимным ориентированием белков за счет электростатических взаимодействий.

Методами ЯМР-релаксации, диэлектрической спектроскопии и моделирования броуновской динамики обнаружена сложная форма корреляционной функции, свидетельствующая об анизотропии броуновского вращения белков. Параметры этой анизотропии различны для разных белков и зависят от концентрации, рН и ионной силы раствора. Для объяснения этого эффекта предложена модель броуновского движения белков, учитывающая взаимодействие электрического диполъного момента белка с электрическим полем, создаваемым ближайшими белковыми молекулами. Это взаимодействие вызывает анизотропию вращения, время жизни которой определяется трансляционной диффузией белков друг относительно друга. Данная модель позволяет на качественном уровне объяснить все наблюдаемые в эксперименте особенности броуновского вращения белков, вызываемые межмолекулярнъти взаимодействиями.

2. Установлено, что внутренняя динамика . глобулярных белков в кристаллическом и аморфном (регидратированный лиофильно высушенный порошок) состояниях в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции одинакова.

С помощью измерения спин-решеточной релаксации в лабораторной и вращающейся системах координат на ядрах /3С естественного содержания был проведен сравнительный анализ молекулярной динамики в нано- и микросекундном диапазонах времен корреляции для трех различных белков (лизоцим белка куриных яиц, лизоцим Т4 и барстар) в микрокристаллическом и гидратированном порошкообразном состояниях. Визуальное сравнение релаксационных спадов для всех трех белков показало, что внутренняя динамика как основной, так и боковых цепей в двух состояниях одинакова. Этот результат важен в связи с обсуждающимся в литературе вопросом о корректности применения твердотельных экспериментов для объяснения биологических свойств белка в растворе. Идентичность динамических параметров белка в порошке и кристалле говорит о том, что межбелковые взагшодействия, если белки не образуют специфических комплексов, не оказывают заметного влияния на внутреннюю динамику, в отличие от уровня гидратации, который имеет для белков большое значение. Данный результат является косвенным свидетельством того, что внутренняя динамика глобулярного белка в твердом гидратированном состоянии и в растворе тоже одинакова.

3. Разработаны способы определения физических моделей молекулярной динамики, основанные на одновременном количественном анализе степеней усреднения различных магнитных взаимодействий.

Одной из основных методических проблем исследования молекулярной динамики методом ЯМР является, невозможность однозначного построения физической модели движения из определяемой в эксперименте степени усреднения (параметра порядка) того или иного магнитного взаимодействия. Эту проблему предложено решать путем сопоставления степеней усреднения различньгх взаимодействий, которые экспериментально измеряются на одном и том же образце. Такой сопоставительный количественный анализ данных ЯМР-экспериментов различного типа позволяет делать обоснованный выбор в пользу той или иной модели движения непосредственно из эксперимента. Данный подход . был продемонстрирован двумя разными способами. В полилизине с л помощью протонной и углеродной ЯМР-спектроскопии исследовалось - движение межъядерных векторов 'н-'н и Н- С. Совместный анализ протонных и углеродных данных позволил констатировать наличие в полилизине трех различных динамических процессов и наглядно представить их физические модели. Другой способ реализации этого подхода заключается в одновременном проведении релаксационных и обменных экспериментов (подход БКЕОА), что позволяет сопоставлять движение межъядерного вектора и тензора анизотропии химического сдвига. Хотя данный метод позволяет определять модели только для высокоамплитудных движений, даже при низких амплитудах динамики совместный анализ обменных и релаксационных данных позволяет проводить гораздо более точную и однозначную количественную характеристику движений по сравнению с анализом этих данных по отдельности. Это было продемонстрировано при изучении динамики основной цепи барстара.

4. Установлено, что определяющую роль в молекулярном механизме влияния гидратации на внутреннюю конформационную динамику белков играет соотношение между стерической доступностью элементов структуры белка для молекул воды и наличием сети водородных связей, стабилизирующих вторичную структуру.

Данный вывод получен из сравнительного анализа гидратационной зависимости параметров внутренней динамики куриного лизоцима и полилизина, который был проведен с помощью релаксационной ЯМР-спектроскопии на ядрах ,3С естественного содержания. Показано, что при увеличении гидратации полилизина значительно увеличивается подвижность боковых цепей, а подвижность основной цепи почти не изменяется. Важно отметить, что 80% основной цепи полилизина образует бета-слой и, следовательно; связано сетью водородных связей. Для лизоцима наблюдается обратная картина: плотная -упаковка структуры не позволяет проникать молекулам воды внутрь структуры белка, и потому увеличение гидратации ведет только к слабому росту подвижности боковых цепей, в основном за счет поверхностных эффектов. А рост амплитуды низкочастотного движения основной

цепи, наоборот, по сравнению с полилизином очень значителен. Причиной этой разницы является то,.\что только 40% основндй Цепи* лйзоцима образуют элементы вторичной структуры за счет образования сети водородных связей. Этот результат является шагом от феноменологического описания влияния гидратации на различные свойства белков к детальному анализу молекулярных механизмов этого влияния.

5. Разработаны две модификации ЯМР-эксперимента по измерению спин-решеточной релаксации во вращающейся системе координат в твердом теле, которые позволяют исключить нежелательный спин-спиновый вклад в релаксацию и существенно расширить частотный диапазон измерений.

Дополнительный т.н. спин-спиновый вклад в спин-решеточную релаксацию во вращающейся системе координат в твердых телах — принципиальное препятствие для широкого использования времен релаксации Т1р в количественном исследовании молекулярной динамики жестких (био)полимеров. Для подавления этого вклада при измерении релаксации, обусловленной гетероядерным (в частности, С- Н или "N-'Н) диполь-дипольным взаимодействием, предложены две модификации традиционного эксперимента по измерению Tip: I) использование отстройки от резонанса поля спин-лока, что позволяет значительно увеличивать амплитуду спин-лока без увеличения мощности передатчика; 2) использование дипольной развязки от протонов во время действия спин-лока на частоте ядер >3С или 15N. Эти эксперименты были опробованы на модельных системах, и было показано, что они, - во-первых, позволяют подавить спин-спиновый вклад в релаксацию и,' во-вторых, существенно расширить частотный диапазон релаксационных измерений. Эти модификации явились основой для проведения последующих количественных исследований молекулярной динамики нескольких биополимеров.

6. Обнаружена зависимость скорости спиновой диффузии между ядрами ,5N от частоты вращения образца под магическим углом.

Эксперименты по измерению скорости спиновой диффузии между ядрами !1 N в тотально обогащенных белке (лизоцим Т4) и поликристаллическом ВОС-глицине, проведенные с помощью одномерной обменной ЯМР-спектроскопии (импульсная последовательность CODEX) показали, что характерное время спиновой диффузии между ядрами 15N линейно растет с ростом частоты ВМУ. Учет этого эффекта важен для осознанного выбора частоты ВМУ при проведении экспериментов, в которых спиновая диффузия может быть как полезным (структурные и корреляционные эксперименты), так и мешающим (динамические эксперименты) явлением. Определение абсолютных значений характерных времен спиновой диффузии в тотально обогащенном изотопом lsN белке показало, что даже при самых высоких

экспериментально достижимых скоростях ВМУ спиновая диффузия быстрее, чем спин-решеточная релаксация большинства ядер J1N основной цепи белка. Отсюда следует вывод о том, что получение селективной динамической информации с помощью измерения Т\ ядер l}N в тотально обогащенном белке невозможно, для этого необходимо проводить селективное изотопное обогащение.

7. Экспериментально продемонстрирована возможность применения одномерной обменной ЯМР-спектроскопии твердого тела с ВМУ для исследования молекулярной динамики белков в миллисекундном диапазоне времен корреляции.

Одномерная твердотельная обменная ЯМР-спектроскопия была впервые применена для исследования параметров конформационной динамики основной цепи белка (барстара). Бело показано, что обменный эксперимент (импульсная последовательность tr-ODESSA) способен детектировать движения в белке со временем корреляции порядка миллисекунды. В то же время, анализ данных существенно затрудняет спиновая диффузия, которая накладывается на обменный процесс, связанный с молекулярным движением. На основании анализа обменной схемы, включающей в себя молекулярное движение и спиновую диффузию, было продемонстрировано, что молекулярное движение не может наблюдаться, если оно медленнее, чем спинованя диффузия.

Автор выражает свою благодарность всем коллегам из Казанского Института Биохимии и Биофизики РАН, которые оказывали поддержку в проведении данных исследований. Автор также признателен коллегам из Университета Мартина Лютера (г. Халле, Германия, руководитель группы — профессор Хорст Шнайдер) за многолетнее сотрудничество и предоставление возможности проведения экспериментов на современных ЯМР-спектрометрах. Особая благодарность — профессору Владимиру Дмитриевичу Федотову, без участия которого эта работа не смогла бы состояться.

Список публикаций соискателя по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах

1. Fedotov, V. D. NMR and dielectric spectroscopy investigation of protein dynamic structure / V. D. Fedotov, Y. D. Feldman, A. G. Krushelnitsky, I. V. Ermolina // J.

. Mol. Struct.- 1990.-Vol. 219.-P. 293-298.

2. Крушельницкий, А.Г. Влияние электростатических межмолекулярных взаимодействий на броуновское вращение белков в растворе. / А. Г. Крушельницкий, В. Д. Федотов // Мол. Биол. - 1992. - Т. 26. - С. 424-431.

3. Krushelnitsky, A. G. Overall and internal protein dynamics in solution studied by the nonselective proton relaxation / A. G. Krushelnitsky, V. D. Fedotov // J. Biomol. Struct. Dyn. - 1993. - Vol. 11. - P. 121-141.

4. Ermolina, I, V. Investigation of molecular motions and interprotein interactions in solutions by NMR and TDDS /1. V. Ermolina, A. G. Krushelnitsky, I. N. Ivoylov, Y. D. Feldman, V. D. Fedotov И Appl. Magn. Reson. - 1993. - Vol. 5. - P. 265-283.

5. Файзуллин, Д. А. Исследование динамических свойств биназы в растворе методами водородного обмена и 'Н релаксации / Д. А. Файзуллин, Е. А. Ступишина, А. Г. Крушельницкий, В. Д. Федотов // Мол. Биол. - 1995. - Т. 29. -

C. 563-573.

6. Крушельницкий, А. Г. Исследование динамики триптофан-репрессора в растворе методом неселективной протонной релаксации / А. Г. Крушельницкий // Мол. Биол. - 1996. - Т. 30. - С. 631-636.

7. Krushelnitsky, A. G. Dynamic structure of proteins in solid state. 'H and I3C NMR relaxation study / A. G. Krushelnitsky, V. D. Fedotov, J. Spevacek, J. Straka // J. Biomol. Struct. Dyn. - 1996. - Vol. 14. - P. 211-224.

8. Крушельницкий, А. Г. Исследование броуновской динамики бычьего ' сывороточного альбумина методом протонной релаксации / А. Г. Крушельницкий, Е. В. Юдина, В. Д. Федотов И Мол. Биол. - 1997. - Т. 31. - С. 293-299.

9. Krushelnitsky, A. Superslow backbone protein dynamics as studied by ID solidstate MAS exchange NMR spectroscopy / A. Krushelnitsky, D. Reichert, G. Hempel, V. Fedotov, H. Schneider, L. Yagodina, A. Schulga // J. Magn. Reson. -1999.-Vol. 138.-P. 244-255.

10.Krushelnitsky, A. G. Study of slow molecular motions in alpha-crystallin by proton magnetic spin-lattice relaxation in the doubly rotating frame / A. G. Krushelnitsky, A. E. Mefed, A. A. Kharitonov, V. D. Fedotov // Appl. Magn. Reson. - 2001. - Vol. 20. - P. 207-229.

11 .Krushelnitsky, A. Expanding the frequency range of the solid-state Ttp experiment for hetcronuclear dipolar relaxation / A. Krushelnitsky, R. Kurbanov, D. Reicher, G. Hempel, H. Schneider, V. Fedotov // Solid State Nucl. Magn. Reson. - 2002. - Vol. 22.-P. 423-438.

12.Ermakova, E. Brownian dynamics simulation of electrostatically interacting proteins / E. Ermakova, A. G. Krushelnitsky, V. D. Fedotov // Mol. Phys. - 2002. - Vol. 100. - P. 2849-2855.

13.Krushelnitsky, A. G. Simultaneous processing of solid-state NMR relaxation and ID-MAS exchange data: the backbone dynamics of free vs. binase-bound barstar / A, G. Krushelnitsky, G. Hempel, D. Reichert // Biochim. Biophys. Acta - 2003. -Vol. 1650.-P. 117-127.

14.Krushelnitsky, A. Hydration dependence of backbone and side chain polylysine dynamics: A C-13 solid-state NMR and IR spectroscopy study / A. Krushelnitsky,

D. Faizullin, D. Reichert//Biopolymers - 2004. - Vol. 73. - P. 1-15.

15.Krushelnitsky, A. Response of lyso2yme internal dynamics to hydration probed by C-13 and H-l solid-state NMR relaxation / A. Krushelnitsky, D. Reichert // Appl. Magn. Reson. - 2004. - Vol. 27.-P. 501-518.

16.Krushelnitsky, A. Complex 'H, 13C NMR relaxation and computer simulation study of side-chain dynamics in solid polylysine / A. Krushelnitsky, D. Reichert // ' Biopolymers - 2005. - Vol. 78. - P. 129-139.

17.Крушельницкий, А.Г. Обменная ЯМР спектроскопия твердого тела: применение для изучения крупномасштабной конформационной динамики биополимеров / А.Г. Крушельницкий // Усп. Физ. Наук - 2005. - Т. 175. - С. 815-832.

18.Krushelnitsky, A. Solid-state NMR and protein dynamics / A. Krushelnitsky, D. Reichert // Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectros. - 2005. - Vol. 47. - P. 1-25.

19.Krush"elnitsky, A. Intermolecular electrostatic interactions and Brownian tumbling in protein solutions / A. Krushelnitsky // Phys. Chem. Chem. Phys. - 2006. - Vol. 8. -P. 2117-2128.

20.Krushelnitsky, A. 1SN spin diffusion rate in solid-state NMR of totally enriched proteins: the magic angle spinning frequency effect / A. Krushelnitsky, T. Brauniger, D. Reichert // J. Magn. Reson. - 2006. - in press.

21.Krushelnitsky, A. Comparison of the internal dynamics of globular proteins in the microcrystalline and rehydrated lyophilized states / A. Krushelnitsky, Y. Gogolev, R. Golbik, F. Dahlquist, D. Reichert // Biochim. Biophys. Acta - 2006. - in press.

Статьи в сборниках и тезисы выступлений на конференциях

1. Крушельницкий, А.Г. Изучение внутренней динамики белков с помощью продольной и поперечной протонной релаксации / А.Г. Крушельницкий // Синтез и исследование биологически активных соединений: Тез. докл. 10-ой Всесоюз. конф. молодых ученых. - Рига, 1989. - С. 139.

2. Федотов, В.Д. Изучение внутренней динамики белков методом протонной релаксации в широкой частотной области II В.Д. Федотов, А.Г. Крушельницкий // Современные методы ЯМР и ЭПР в химии твердого тела: Тез. докл. 5-го Всесоюз. сов. - Черноголовка, 1990. - С. 181-182.

3. Faizullin, D.A, Dynamic properties of binase solutions as revealed by H-D exchange and H-NMR relaxation / D.A. Faizullin, E.A. Stupishina, A.G. Krushelnitsky // Congress AMPERE, 27th: Abstracts. - Kazan, 1994. - P. 771.

4. Krushelnitsky, A.G. The anisotropy of protein Brownian tumbling in solution as studied by the low field proton relaxation and time domain dielectric spectroscopy / A.G. Krushelnitsky, I.V. Ermolina, V.D. Fedotov // Congress AMPERE, 27th: Abstracts. - Kazan, 1994. - P. 899.

5. Ermolina, I.V. The use of TDDS for structural and dynamic investigations of protein molecules in solution / I.V. Ermolina, A.G. Krushelnitsky, I.N. Ivoylov, V.D. Fedotov // Dielectric and Related Phenomena: Abstracts of the Int. Conf. -Zakopane, Poland, 1994.

6. Ermolina, I.V. Investigation of molecular motion and interprotein interactions in solutions by TDDS and !H NMR / I.V. Ermolina, A.G. Krushelnitsky, I.N. Ivoylov, I.V. Nesmelova, V.D. Fedotov // Biophys. J. - 1995. - 68, № 2. A343. - Abstracts of the 39th Ann. Meeting of the Biophysical Society, 12-16 February 1995, San-Francisco.

7. Fedotov, V.D. *H and 13C nuclear magnetic relaxation and the effects of dehydration on local dynamics in solid proteins / V.D. Fedotov, A.G. Krushelnitsky, J. Spevacek, J. Straka // NMR in Molecular Biology: Abstracts of the Int. Conf. -Wildbad-Kreuth, Germany, 1995. - P16.

8. Faizullin, D.A. Enzyme dynamics in the range of catalytic activity / D.A. Faizullin, E.A. Stupishina, A.G. Krushelnitsky, V.D. Fedotov // International Conference on Molecular Structural Biology: Proc. - Vienna, 1995; - P. 236. \ • '

9. Fedotov, V.D. The effect of the internal protein dynamics on the enzymatic reaction rate / V.D. Fedotov, A.G. Krushelnitsky // Karadeniz J. Med. Sci. - 1995, Vol. 8. -P. 199-200. - Abstracts of the Euroasian Symposium on Current Trends in Biotechnology: Gene Diagnostics, Gene Therapy and Informational Immunity. 29 Oct.-6 Nov., 1995, Ankara, Turkey.

10.Krushelnitsky, A. Superslow backbone protein and polypeptide dynamics as studied by solid state MAS exchange NMR spectroscopy / A. Krushelnitsky, D. Reichert, V. Fedotov, H. Schneider // AMPERE 29th - ISMAR 13th International Conference: Proc.-Berlin, 1998.-P. 466-467. -

11.Krushelnitsky, A. NMR relaxation in doubly rotating frame as a tool for studying slow protein dynamics / A. Krushelnitsky, D. Markov, A; Kharitonov, A. Mefed, V. Fedotov П Field-Cycling NMR relaxometry Simposium: Proc. - Berlin, 1998., - P. 20-21.

12.Fedotov, V.D. The study of protein and polypeptide dynamics by solid state NMR relaxation methods / V.D. Fedotov, A.G. Krushelnitsky, L.O. Yagodina, D. Reichert, H. Schneider, A.E. Mefed, J. Spevacek // Molecular mobility and order in polymer systems: Proc. of the 3rd Int. Symp., St. Petersberg, 1999. - P-002.

13.Ermakova, E.A. Brownian dynamics simulation of electrostatically interacting proteins / E.A. Ermakova, A.G. Krushelnitsky, V.D. Fedotov // Molecular mobility and order in polymer systems: Proc. of the 3rd Int. Symp. - St. Petersberg, 1999. - P-034.

14.Ермакова, E.A. Исследование броуновской динамики в концентрированных белковых растворах методом компьютерного моделирования / Е.А. Ермакова, А.Г. Крушельницкий, В.Д. Федотов // Структура и динамика молекулярных систем: Сб. статей 6-ой Всерос. конф. - Казань; Йошкар-Ола, 1999. - С. 370373.

15.Мефед, А.Е. Протонная магнитная релаксация в дважды вращающейся системе координат и медленная молекулярная динамика белков / А.Е. Мефед, А.Г. Крушельницкий, А.А. Харитонов, В.Д. Федотов // Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях: Тез. докл. 3-ей Всерос. конф. - Казань, 2000. - С. 22.

16.Крушельницкий, А.Г. Исследование медленных молекулярных движений глобулярных белков методом протонной магнитной релаксации в дважды вращающейся системе координат / А.Г. Крушельницкий, А.Е. Мефед, А.А. Харитонов, В.Д. Федотов // Структура и динамика молекулярных систем: Тез. докл. 7-ой Всерос. конф. — Казань; Йошкар-Ола, 2000. - С. 54-55.

17.Крушельницкий, А.Г. Исследование медленных молекулярных движений глобулярных белков методом протонной магнитной релаксации в дважды вращающейся системе координат / А.Г. Крушельницкий, А.Е. Мефед, А.А. Харитонов, В.Д. Федотов // Структура и динамика молекулярных систем: Сб. статей 7-ой Всерос. конф. — Казань; Йошкар-Ола, 2000. - С. 206-209.

18.Krushelnitsky, A. Expanding frequency range of the solid state Tip experiment for heteronuclear dipolar relaxation / A. Krushelnitsky, R. Kurbanov, D. Reichert, G. Hempel, H. Schneider, V. Fedotov II Modern development of magnetic resonance imaging and spectroscopy. Basics physics and application in medicine and biology: Proc. International Workshop. - Kazan, 2001. - P. 66,

19.Krushelnitsky, A. Expanding frequency range of the solid state TiP experiment for heteronuclear dipolar relaxation / A. Krushelnitsky, R. Kurbanov, D. Reichert, G. Hempel, H. Schneider, V. Fedotov II European Conference on Solid State Nuclear Magnetic Resonance. New concepts and Applications: Abstracts. - Chamonix-Mont Blanc, France, 2001. - P. 60.

20.Krushelnitsky, A. NMR relaxation and ID MAS exchange study of backbone protein dynamics in solid state / A. Krushelnitsky, D. Reichert, G. Hempel, H. Schneider, V. Fedotov // European Experimental Nuclear Magnetic Resonance Conference; 16th: Abstracts. - Prague, 2002. - PA48.

21 .Крушельницкий, А.Г. Современные методы ЯМР твердого тела и информационная динамика белков / А.Г. Крушельницкий // Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях: Тез. докл. 6-ой Всерос. конф. -Казань, 2005.-С. 18.

Отпечатано в ООО «Печатный двор». г. Казань,ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-5% 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПДМ7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 12.09.2006 г, Усл. п.л 2,0. Заказ М К-5255. Тираж 130 экз. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать - ризография.

Введение

ГЛАВА 1. ЯМР-МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ДИНАМИКИ БЕЛКОВ И ПРИМЕРЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ (литературный обзор)

1.1. Природные зонды, дающие информацию о молекулярной динамике посредством ядерного магнитного резонанса

1.2. Форма линии спектра ЯМР твердого тела, обусловленная анизотропией химического сдвига

1.3. Вращение образца под магическим углом

1.4. Двумерные обменные ЯМР-эксперименты

1.5. Одномерные обменные ЯМР-эксперименты

1.6. ЯМР-релаксация

1.7. Корреляционная функция молекулярного движения и безмодельный подход

1.8. ЯМР и химический обмен в белковых растворах

1.9. Особенности проведения ЯМР-экспериментов на различных магнитных ядрах

1.10. Конформационная динамика белков

1.10.1. Белки в растворе

1.10.2. Белки в твердом состоянии

1.10.3. Обобщающие замечания

ГЛАВА 2. БРОУНОВСКАЯ ДИНАМИКА И МЕЖМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ

2.1. Качественная модель межмолекулярных электростатических взаимодействий

2.2. ЯМР-релаксационные эксперименты на протонах белков в растворах тяжелой воды

2.2.1. Методы измерения и анализа времен релаксации

2.2.2. Результаты экспериментов и их обсуждение

2.3. Анализ дисперсий времен релаксации воды в растворах белков

2.4. Диэлектрические эксперименты в растворах миоглобина

2.5. Теоретические оценки энергии межмолекулярного электростатического взаимодействия белков и компьютерное моделирование броуновской динамики электрических диполей

Наряду с ДНК белки являются основными биологическими макромолекулами, благодаря которым на Земле существует жизнь во всех ее формах. Они выполняют множество важных для живых организмов функций - транспортных, ферментативных, регуляторных, механохимических и других. Белок представляет собой длинную одномерную полимерную цепь, состоящую из звеньев -аминокислот. Всего существует 20 различных типов природных аминокислот, которые различаются друг от друга химическим строением боковой цепи. Длина полипептидной цепи для различных белков варьируется от 30-40 до многих сотен и даже тысяч аминокислот. Принципиально важным отличием белков от синтетических полимеров является то, что каждый белок имеет свою уникальную нативную конформацию, то есть пространственную укладку полипептидной цепи, благодаря которой белок способен выполнять свою биологическую функцию. Эта конформация закодирована в первичной структуре белка, т.е. в последовательности аминокислот. В качестве примера на рисунке слева изображена структура основной цепи одного из глобулярных белков, лизоцима фагаТ4.

За последние десятилетия белки стали едва ли не самым популярным биологическим объектом, который интенсивно изучается физическими методами. Основная цель исследования белков - это изучение молекулярных механизмов их биологического функционирования. Иными словами, люди пытаются понять, как белок работает. Кроме того, что это интересно само по себе, эти исследования также имеют и сугубо практическое значение: если знать механизм действия белка, его можно модифицировать или придать ему новые функции. А это очень важно для биотехнологии и медицины.

Хотя и очень условно, работы по изучению механизмов функционирования белков можно разделить на два направления. Одно из них - это структурные

Схематическое изображение пространственной структуры основной цепи лизоцима Т4. исследования, другое - изучение молекулярной динамики белков. К настоящему времени не подвергается сомнению, что оба эти фактора крайне важны для понимания молекулярных основ биологической работы белков. Однако исторически сложилось так, что структурные исследования белков начались гораздо раньше, и в этой области науки сделано намного больше, чем в исследованиях по молекулярной динамике. Сильный толчок развитию науки о белках дала первая расшифровка пространственной структуры глобулярного белка (гемоглобина) методом рентгеноструктурного анализа [1], за что в 1962 году Макс Перутц получил Нобелевскую премию. За прошедшее с тех пор время этим методом расшифровано уже много тысяч структур различных белков. Знание пространственной структуры действительно во многом объясняет многие свойства и функциональные возможности белка. Часто это достигается сравнительным анализом структур одного и того же белка в различных биологических состояниях, например, белка дикого типа и мутанта, свободного и связанного с лигандом и т.д. Достижения в структурном анализе обусловили развитие исследований корреляции между первичной и пространственной структурами, что очень важно для понимания механизмов фолдинга (самосборки) белка.

Второй всплеск интереса к структурным исследованиям белков пришелся на конец восьмидесятых - девяностые годы прошлого столетия. Он связан с развитием другого мощного метода определения структуры белков - многомерного и мультиядерного ЯМР высокого разрешения в растворах. За эти работы тоже была присуждена Нобелевская премия, которую в 2002 году получил швейцарец Курт Вютрих [2]. И рентгеноструктурный анализ, и ЯМР обладают своими методическими достоинствами и недостатками, но у ЯМР есть одно важное и бесспорное преимущество: в то время как рентгеноструктурный анализ может работать только в монокристаллах белков, ЯМР определяет пространственную структуру белков непосредственно в водных растворах, то есть в их естественной среде.

Следует отметить, что в природе существует очень широкий класс белков, которые не кристаллизуются и, в то же время, нерастворимы, как, например, большинство мембранных белков. Для определения их структуры наиболее приемлемым методом является ЯМР твердого тела. Но у твердотельного ЯМР есть несколько существенных методических проблем, которые пока не позволяют использовать его в структурных исследованиях белков так же широко, как рентгеноструктурный анализ и жидкостный ЯМР. Тем не менее, в последние годы идет интенсивное развитие методик твердотельного ЯМР, позволяющих соотносить линии в спектрах и определять расстояния, планарные и торсионные углы между магнитными ядрами [3-5]. Не так давно группой Хартмута Ошкината в Германии была расшифрована первая структура белка в твердом состоянии методом ЯМР твердого тела [6]. И не исключено, что через некоторое время мы будем свидетелями очередного бума структурных исследований.

Несмотря на то, что знание пространственного строения полипептидной цепи открывает путь к пониманию очень многих свойств белка, почти сразу же стало ясно, что одной только этой информации недостаточно для полного детального объяснения механизма функционирования белка на молекулярном уровне. Это можно продемонстрировать на примере того же самого гемоглобина. Его биологическая функция состоит в транспортировке кислорода в крови. Молекула кислорода связывается в активном центре белка, геме, и таким образом переносится в нужное место. Детальный анализ пространственной структуры показывает, что щель, соединяющая гем с поверхностью белка, очень узка для молекулы кислорода, и для того, чтобы она сквозь нее "протиснулась", необходимо предположить, что структура белка подвижна. В те моменты, когда щель приоткрывается, гем становится стерически доступным, и тогда возможно связывание белка с молекулой кислорода. Детально роль молекулярной динамики в биологическом функционировании гемоглобина была рассмотрена в серии работ Мартина Карплюса (см. обзор [7] и ссылки в этой работе).

Это один из самых простейших и очевидных, но далеко не самый исчерпывающий пример важности динамики для биологической функции. Механизмы вовлечения молекулярной подвижности в работу белка могут быть весьма замысловатыми и не столь легко объяснимыми. Пока не существует, да, наверное, и не может существовать в принципе, единого рецепта или алгоритма связи тех или иных молекулярно-динамических параметров с той или иной биологической функцией. Это очень специфическая проблема, которая должна анализироваться в каждом конкретном случае по-своему. Молекулярным механизмам вовлечения динамики в биологическую функцию посвящен ряд последних обзоров по динамике белков [8-13].

Кроме внутримолекулярной конформационной динамики белков, о которой шла речь выше, для глобулярных белков в растворе существует еще один, практически независимый от внутренней динамики, тип движения. Это броуновская трансляционная и вращательная диффузия белка как целого. Биологическая роль броуновской динамики более проста и прозрачна - обеспечить пространственное сближение и необходимую ориентацию друг относительно друга белка и его субстрата.

Частотный диапазон колебаний атомов белка очень широк. Характерное время самых быстрых движений - фемтосекунды, самых медленных - секунды и даже минуты. Фемтосекундная область соответствует колебаниям валентных связей и валентных углов. Пикосекундная область и все, что медленнее, обуславливается конформационными степенями свободы структуры белка - двугранными (торсионными) углами ф и ср, обеспечивающими гибкость основной цепи белка, а также двугранными углами %, определяющими конформацию боковых цепей аминокислотных остатков. Колебания этих углов могут быть очень быстрыми, если речь идет о движении отдельных химических групп. Например, характерное время вращения трех метальных протонов вокруг оси симметрии метальной группы при комнатной температуре составляет единицы пикосекунд. Низкоамплитудные некоррелированные колебания отдельных боковых цепей или небольших участков основной цепи в пределах стерических ограничений могут составлять доли и единицы наносекунд. Крупномасштабные конформационные переходы всегда являются высококоррелированными изменениями многих степеней свободы белка, поскольку обычно белки - довольно плотноупакованные структуры, практически без свободного объема внутри глобулы. Сколько-нибудь заметные смещения одного участка структуры белка могут происходить только при согласованном смещении соседних участков. Характерное время внутренней динамики этого типа находится в микро- и миллисекундном диапазонах. Следует отметить, что временной масштаб этой медленной динамики совпадает с временным масштабом многих молекулярно-биологических процессов, например, таких как связывание с субстратом, катализ, фолдинг и т.п. Поэтому вполне естественно предположить, что именно медленная конформационная динамика наиболее значима для биологической функции белка и именно ее изучение представляет наибольший интерес с точки зрения биологии.

Комплекс методов, применявшихся до сих пор для изучения молекулярной динамики белков, включает в себя ЯМР, ЭПР, диэлектрическую, флуоресцентную, инфракрасную и мессбауэровскую спектроскопии, нейтронное рассеяние, компьютерное моделирование и даже рентгеноструктурный анализ, который дает информацию о т.н. В-факторах, т.е. степени "размазывания" координат атомов в пространстве из-за молекулярной подвижности. Не в обиду будь то сказано специалистам из других областей, однако к настоящему времени стало совершенно очевидно, что для белков самым мощным, самым информативным методом, имеющим самый широкий спектр возможностей, является ЯМР. Для этого есть целый ряд причин, самая главная из которых - это селективность структурной и динамической информации, получаемой с помощью ЯМР. Это обусловлено тем фактом, что магнитные ядра, на которых можно проводить эксперименты, прежде всего, протоны, азоты и углероды, распределены по всей структуре белка. А современные методики ЯМР позволяют, хотя, конечно, и не во всех случаях, различать эти ядра и соотносить их с химической структурой белка. Практически все остальные экспериментальные методы дают информацию о природных зондах, которые либо локализованы только в одном месте белковой глобулы (мессбауэровская спектроскопия, флуоресценция, ЭПР), либо являются интегральной характеристикой всей глобулы, не дающей информации о различных ее частях (диэлектрическая спектроскопия, нейтронное рассеяние). Более детальную и обширную по сравнению с ЯМР информацию о молекулярной динамике может дать только компьютерное моделирование. Но этот метод только условно может считаться истинно экспериментальным, поскольку все силовые поля, используемые при моделировании таких сложных молекул как белки, являются только приближением.

К настоящему времени накоплен обширный экспериментальный материал, характеризующий динамику многих биополимеров в различных состояниях и при различных экспериментальных условиях. Тем не менее, не до конца решенными остаются несколько важных проблем, которые имеют фундаментальное значение для дальнейшего развития этой области научных исследований. В частности, нет ясного общего представления о том, как межбелковые контакты и взаимодействия влияют на динамическое поведение белков. В живой клетке белки находятся в непосредственном окружении других белков и различных (макро)молекул. Очевидно, что вопрос о влиянии межмолекулярных взаимодействий на различные параметры динамики является очень существенным для выяснения молекулярных механизмов биологического функционирования белков.

В растворах очень важным является эффект взаимного электростатического ориентирования биомолекул. Он является ключевым в процессе "докинга" (docking), то есть "причаливания" двух белков (или белка и субстрата) друг к другу. Комплементарные электростатические свойства двух молекул могут на много порядков ускорять процесс нахождения, распознавания и связывания их друг с другом по сравнению с простым механизмом тепловой броуновской диффузии. В то же время, даже если белки в растворе не обладают комплементарной электростатической структурой, их межмолекулярные взаимодействия на относительно длинных расстояниях могут сказываться на характере их броуновской диффузии. До сих пор при анализе различных экспериментальных данных этим эффектом в подавляющем большинстве случаев пренебрегали. Но следует отметить, что без точной информации о вращении белка как целого корректно определить параметры его внутренних движений невозможно.

Остается также открытым вопрос о влиянии межмолекулярных контактов на динамические свойства белков в твердых препаратах. Если вопрос об идентичности структур белков в кристаллах и растворах был в целом благополучно разрешен путем сравнения структур, определенных методами рентгеноструктурного анализа и ЯМР высокого разрешения [14], то в отношении динамики ясной картины на этот счет нет. Это, кстати говоря, является одной из причин неоднозначного отношения некоторых исследователей к биологической значимости изучения глобулярных белков в твердом состоянии.

Другая проблема - это механизмы влияния гидратной воды на внутреннюю динамику белков. Изучение взаимодействия белков с водой является одним из самых популярных направлений исследований в физике белков, поскольку вода обуславливает их многие биологические свойства. То, что гидратация оказывает значительное влияние на динамические свойства биополимеров, известно очень давно. Но в силу ряда методических причин, которые будут подробно обсуждаться ниже, большинство работ по изучению влияния гидратации на динамику носит качественно-сравнительный характер. Из таких результатов однозначно определить физические факторы и механизмы влияния гидратации на внутреннюю динамику достаточно сложно. Почему на разные биополимеры и на разные параметры динамики гидратная вода влияет по-разному - здесь еще много неясного.

Наконец, еще одна очень важная проблема - это определение физической модели молекулярного движения из экспериментальных данных. Практически любой ЯМР-эксперимент, ориентированный на изучение молекулярной динамики, позволяет определить только степень усреднения того или иного типа взаимодействия магнитных ядер либо с внешним полем, либо друг с другом (эта степень часто называется параметром порядка, который был введен Липари и Сзабо в рамках так называемого безмодельного подхода [15,16]) и временной масштаб этого усреднения. В подавляющем большинстве случаев эту степень усреднения невозможно однозначно переформулировать в понятные для описания молекулярной динамики параметры - амплитуды движения, выраженные в ангстремах или градусах, стереометрические модели, степень корреляции между движениями различных элементов структуры. Это принципиальное отличие динамических ЯМР-экспериментов от структурных. В последних конечным результатом являются как раз вполне «осязаемые» для определения структуры параметры - межатомные расстояния и различного рода углы. А конечным результатом динамических экспериментов являются некие промежуточные параметры, чувствительные к молекулярной динамике, но связанные с ней неоднозначно.

Кроме того, следует иметь в виду, что сам процесс получения этих промежуточных параметров из эксперимента зачастую неоднозначен. Например, из измерения одного или двух времен релаксации невозможно однозначно определить параметр порядка молекулярного движения и/или времени корреляции. Из формы линии твердотельного спектра, записанного при одной температуре, невозможно однозначно определить параметры реориентации тензора АХС. Для определения этих параметров необходимо или проведение большого числа различных экспериментов, и/или априорное использование той или иной модели.

Говоря о медленных конформационных движениях, которые, как мы отметили выше, наиболее интересны с точки зрения биологии, следует упомянуть о еще одной важной методической проблеме, которая существенно усложняет изучение молекулярной динамики этого типа в белковых растворах. Дело в том, что изотропное броуновское вращение белка как целого накладывается на внутреннюю динамику, и все медленные внутренние движения, которые имеют время корреляции длиннее, чем время корреляции броуновского вращения (для большинства белков Q порядка 10" с), становятся практическими невидимыми для физических методов, регистрирующих механическую реориентацию того или иного природного зонда. В число этих методов попадают ЯМР-релаксация, диэлектрическая и флуоресцентная спектроскопии, ЭПР. Впрочем, ситуация не безнадежна, есть эксперименты, позволяющие регистрировать медленные движения и в растворах. Например, метод водородного обмена, который определяет скорость химического обмена лабильных протонов белка на дейтероны растворителя. Хотя и косвенно, он дает информацию о крупномасштабных конформационных переходах, обеспечивающих контакт молекул растворителя с тем или иным доменом структуры белка. Кроме того, ЯМР позволяет регистрировать медленные движения, если они приводят к изменению изотропного химического сдвига магнитного ядра (эти эксперименты будут более подробно рассмотрены в первой главе). Однако эти методы позволяют только зарегистрировать сам факт наличия медленного движения и оценить его время корреляции. Информация об амплитуде и геометрии движений с помощью этих методов недоступна. Решением проблемы здесь может стать только изучение динамики белков в твердом состоянии, то есть в виде порошков или кристаллов, где броуновское вращение отсутствует. На настоящий момент, область изучения динамики биополимеров с помощью твердотельного ЯМР очень привлекательна тем, что она в гораздо большей степени представляет собой terra incognita по сравнению с жидкостным ЯМР и открывает широкий простор для применения новых нестандартных подходов и решений, особенно в методологии ЯМР-экспериментов. Этим исследованиям посвящается большая часть диссертации.

Основными задачами данной работы являются, во-первых, изучение влияния межмолекулярных взаимодействий на динамическое поведение белков, как в растворе, так и в твердом состоянии и, во-вторых, разработка способов получения информации о физических моделях динамики биополимеров непосредственно из экспериментальных данных. Диссертация состоит из трех глав. В первой главе дано систематическое изложение основных типов ЯМР-экспериментов и их математического формализма, позволяющих получать информацию о молекулярной динамике. Особое внимание уделено описанию твердотельных одномерных обменных ЯМР-экспериментов с вращением образца под магическим углом. Методика этих экспериментов была разработана совсем недавно и, в отличие от релаксации или анализа формы линии спектра, их пока нельзя причислить к числу рутинных методов исследования молекулярных движений. Поскольку в диссертации этот метод используется в детальном количественном исследовании динамики белков, описание математических основ обменных экспериментов является важной частью первой главы. Кроме того, в первой главе представлен краткий литературный обзор основных направлений исследований динамики белков, как в растворе, так и в твердом состоянии. В этом обзоре описаны основные методические подходы, обобщение ключевых результатов, полученных к настоящему времени, и основные нерешенные проблемы в этой области науки.

Вторая глава посвящена изучению влияния межмолекулярных взаимодействий между белками в растворе на характер их броуновской диффузии и построению модели, адекватно объясняющей наблюдаемые в эксперименте особенности движения белков при различных экспериментальных условиях. Для изучения динамики белков в растворе был применен целый комплекс различных физических методов - ЯМР-релаксация, временная диэлектрическая спектроскопия и компьютерное моделирование динамики броуновских частиц.

Третья глава посвящена изучению внутренней динамики белков и полипептидов в твердом состоянии. Причина проведения экспериментов именно в твердом состоянии была изложена выше. В этой главе было изучено влияние межмолекулярных контактов на внутреннюю динамику нескольких белков, проведено количественное исследование влияния гидратации на динамику полилизина и лизоцима, а также разработано два метода, позволяющих переходить от безмодельного подхода в анализе экспериментальных данных к получению реальных физических моделей молекулярной подвижности. Ключевым моментом в наших методах является совместный количественный анализ данных различных

ЯМР-экспериментов, проведенных на одном и том же образце. Хотя разработка новых методических подходов не является основной целью диссертации, методические результаты имеют существенное значение, поскольку именно они позволили в результате получить ту информацию о молекулярной динамике, которая была недоступна с помощью стандартных экспериментов.

Работа была выполнена в лаборатории молекулярной биофизики Казанского Института биохимии и биофизики КазНЦ РАН. Все твердотельные ЯМР-эксперименты, представленные в диссертации, были проведены в группе ЯМР-спектроскопии Университета Мартина-Лютера г. Халле, Германия, в рамках многолетнего сотрудничества между нашими лабораториями. Работа была поддержана рядом инициативных грантов РФФИ и совместных грантов РФФИ и Немецкого Научно-исследовательского Общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft). Результаты диссертации докладывались на многих российских и международных конференциях и были опубликованы в различных рецензируемых журналах.