Синтез и применение новых аффинных сорбентов для выделения сериновых протеиназ тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОНЯЙНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ Г » 41 ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.ВЛОМОНОСОВА

1 О ФЕВ ТО

ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи УДК 577.15.072:543.544.8

КУЗНЕЦОВА АННА ВИКТОРОВНА

СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ НОВЫХ АФФИННЫХ СОРБЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ

02.00.10 Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва, 1998

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

Научные руководители:

д.х.н. Г.Н.Руденская,

чл.-корр. РАН, профессор В.М.Степанов

Официальные оппоненты:

д.х.н. Л.М.Гинодман д.б.н., профессор О.Г.Оглоблина

, Ведущая организация: Институт биологической медицинской химии

Зашита состоится 24 февраля 1998 г. в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, Воробьевы Горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " января 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук

И.Г.Смирнова

Актуальность проблемы. Аффинная хроматография - удобный метод выделения протеиназ, основанный на способности избирательно взаимодействовать с субстратами или ингибиторами. При правильном тодборе лигандов можно значительно повысить выходы протеиназ и сачество их очистки. Использование аффинных сорбентов открывает юные перспективы для выделения и исследования протеолитических ферментов, выполняющих защитные функции организма.

В настоящее время одними из наиболее распространенных ¡аболеваний после сердечно-сосудистых считаются поражения почек, в тстности, гломерулонефрит. В развитии последнего основную роль тграет дисбаланс эндогенных протеолитических ферментов, причем тереход этого заболевания в хроническую форму обычно приводит к необратимым изменениям в почках и их дисфункции. Поэтому зыделение этих ферментов для изучения патогенетических звеньев ¡аболевания весьма актуально. Целью данной работы является:

I) Синтез новых аффинных сорбентов, имеющих в качестве лигандов лорфолиды трипептидов, для выделения сериновых протеиназ. >) Обнаружение с помощью хромогенных пептидных субстратов протеолитических ферментов, появляющихся в моче и сыворотке крови 1етеп, страдающих гломерулонефритом.

>) Выявление характерных изменений протеолитической активности этих ферментов в зависимости от формы и степени тяжести ¡аболевания.

0 Выделение и идентификация протеолитических ферментов, связанных патологическим процессом в почках.

Научная новизна и практическая ценность. В результате проведенной заботы были впервые синтезированы аффинные сорбенты для выделения протеиназ, имеющие в качестве лигандов морфолиды грипептидов и отвечающие специфичности различных сериновых третейназ. С помощью хромогенных пептидных субстратов калликреина

1 химотрипсиноподобных протеиназ впервые обнаружено значительное ловышение протеолитической активности в моче и сыворотке крови у хетей, страдающих гломерулонефритом. Аффинная хроматография на сорбентах с морфолидами трипептидов позволила очистить не эписанные ранее в литературе протеиназы из различных природных тсточников, в том числе и протеолитические ферменты, из мочи детей, страдающих гломерулонефритом.

Выявлены определенные закономерности изменения протеолитической жтивности в зависимости от тяжести и формы гломерулонефрита.

Показано, что в патологическом процессе участвуют ферменты ¡салликреин-кининовой системы. Выделены и охарактеризованы не описанные ранее в литературе протеиназа X и аминопептидаза. На основе проведенных исследований предложен простой неинвазивный метод диагностирования, позволяющий наряду с общепринятыми клиническими анализами следить за течением заболевания и прогнозировать результат лечения. Исследование активности протеиназ в моче детей, страдающих гломерулонефритом внедрено в нефрологическом отделении НИИ Педиатрии РАМН на кафедре Педиатрии Московского медицинского института им. Н.А.Семашко. Синтезированные сорбенты могут применяться в научных лабораториях для выделения протеиназ плазмы крови - тромбина, плазмина, калликреина, а та осе сериновых протеиназ растений, беспозвоночных и микроорганизмов.

Публикация и апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации были опубликованы в 4 статьях, а также были представлены на 7 конгрессе FAOBMB (Сидней, Австралия, 1995), 21 Международном симпозиуме по хроматографии (Штутгарт, Германия, 1996), международном конгрессе по аналитической химии (Москва, Россия, 1997), 17 международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Сан-Франциско, USA, 1997), III и IV симпозиумах "Химия протеолитических ферментов" (Москва, Россия, 1993 и 1997), 2 съезде Биохимического общества РАН (Москва, Россия, 1997). Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного лигандам для аффинной хроматографии протеиназ, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (141 ссылка). Диссертация содержит 35 рисунков и 20 таблиц.

1. Синтез и применение новых аффинных сорбентов для выделения протеиназ. ,

1.1. Синтез сорбента сефарозы-AALmrp. Основной целью работы был синтез аффинных сорбентов для выделения сериновых протеиназ со специфичностью химотрипсина и калликреина, появляющихся в моче детей, страдающих гломерулонефритом, поэтому в качестве лигандов мы синтезировали аналоги субстратов этих ферментов - производные трипептидов. Для того, чтобы предотвратить возможность гидролиза лигандов протеиназами, были использованы нерасщепляемые циклические амиды - морфолиды. Лиганд, рассчитанный на связывание химотрипсиноподобного фермента, H-Ala-Ala-Leu-NXC^C^hO, представляет собой производное трипептида, гидрофобная С-концевая кислота которого - лейцин - соответствует первичной специфичности

химотрипсина. Нами показано, что К-замещенный трипептид - Z-Ala-Ак-Ьеи-Г^СНгСНг^О- слабый ингибитор субтилизина (К;=1.4*10"4М).

Синтез лиганда проводили конденсацией бензилоксикарбонил-аланил-аланина с морфолидом лейцина в присутствии дициклогексилкарбодиимида и одного эквивалента 1 -оксибензотриазола. Аналогично получали морфолид трет-бутилоксикарбонил-лейцина (рис. 11). Структура пептида подтверждена данными аминокислотного анализа и ЯМР-спектров.

Сорбенты получали двумя способами.

1) К аминогруппам АН-сефарозы - путем реакции с бензохиноном. Полученный аффинный сорбент (сефароза-АА1-тгр-1) содержал по данным аминокислотного анализа 9 мкмоль лиганда на 1 г сорбента, что соответствует модификации 25% активных аминогрупп АН-сефарозы.

2) К СН-сефарозе лиганд присоединяли путем образования амидной связи между карбоксильными группами носителя и аминогруппой пептида в присутствии водорастворимого карбодиимида (сефароза-ААЬтф-П). Для блокирования непрореагировавших активированных карбоксильных групп и подавления связывания ферментов по ионообменному механизму, сефароза-ААЛтгр-П была обработана моноэтаноламином. Степень включения лиганда А1а-А1а-Ьеи-ЬКСНзС^ЬО составила 25 мкмоль/г сорбента, что отвечает 60 %-ной модификации карбоксильных-групп (рис. 1).

/ /

/

/ / / /

-(СИ ,1»— МП -

-А1а-А1а-Ьсц ■

-<СН ,)„— МН-

-о

-1СН ,),- СО -А1а-Л1а-

-(.еи -.М"^,

О

-(СН ,) -СО-о А1а-Ьси-А

-а

Рис. 1. Предполагаемое строение: а) сефарозы-ААЬтгр-!, б) сефарозы-ААЬтгр-П, в) сефарозы-А1Лтгр.

1.2. Синтез сорбента сефарозы-АЬКшгр. Аналог субстрата калликреина -Н-0-А1а-Ьеи-^-К(СН2СИ2)20 содержит на С-конце не расщепляемый протеиназами морфолид аргинина и слабо ингибиует трипсин (К,=2.4*10"4М). Аффинный лиганд был синтезирован конденсацией морфолида аргинина с пептидом 2-0-А1а-Ьеи-0Н карбодиимидным методом. Соответствующий И-замещенный морфолид аргинина также был получен с использованием дициклогексилкарбодиимида. Присоединение лиганда к СН-сефарозе проводили с использованием водорастворимого карбодиимвда, как и при синтезе сефарозы-ААЬшгр-II, после чего активированные карбоксильные группы блокировали моноэтаноламином. По данным аминокислотного анализа около 25% свободных карбоксильных групп носителя прореагировали с лигандом Н-0-А1а-Ьеи-Аг§-Н(СН2СН2)20. Степень включения лиганда - 10 мкмоль/г сорбента.

1.3. Модельные опыты по хроматографии очищенных протеаз. Для

оценки специфичности и емкости сорбентов на них хроматографировали коммерческие препараты протеиназ различных классов в условиях полного насыщения ферментом (табл. 1). Сефароза-ААЬтгр-1 обладала наибольшей емкостью по отношению к папаину, пепсина, химотрипсина и термитазы сорбировалось в 5 раз меньше. Все эти протеиназы способны гидролизовать белки и пептиды по связям гидрофобных аминокислот и, вероятно, могут взаимодействовать с ароматическим кольцом бензохинона сорбента (рис. 1). Такая неспецифическая сорбция ферментов может привести к увеличению локальной концентрации их на поверхности сорбента, а значит, облегчит взаимодействие протеиназ с пептидным лигандом. Наименьшей емкостью сорбент обладал по отношению к бычьему трипсину, что согласуется с субстратной специфичностью этого фермента, предпочтительно расщепляющего пептидные связи положительно заряженных аминокислот - аргинина и лизина.

Применение сефарозы-АЬКтгр, синтезированной конденсацией трипептида Н-0-А1а-Ьеи-Аг§-Ы(СН2СН2)20 с СН-сефарозой, позволило получить гомогенные препараты ферментов системы свертывания крови - калликреина и тромбина, а также трипсина. На рис. 2 представлена хроматограмма очистки тромбина на сефарозе-АЬЯтгр. Примеси не связывались с сорбентом и элюировались при промывании колонки стартовым буфером. Тромбин удерживался сорбентом и элюировался 25% изопропиловым спиртом с выходом 73% и степенью очистки - 3.4

раза. Как показал электрофорез в денатурирующих условиях, фракции элюата содержали практически гомогенный тромбин (М. м. 38 кДа).

Таблица 1.

Сорбция коммерческих препаратов протеиназ на сефарозе-ААЛтгр-Г.

Фермент Нанесено Получено Выход по активности, % Емкость сорбента мг/мл

Белок, A-2S0 Активность, ед. акт. Белок, А280 Активность, ед. акт.

Термитаза 69 46 56 47 100 0.4

а-Химотрипсин 34 0.20 4 0.14 70 0.34

Трипсин 17 3.2 8 0.8 25 0.08

Папаин 40 2.5 28 2.1 84 2

Пепсин 20 148 16 106 72 0.4

трис HCl в 1 М NaCl и 25% изопропаноле, pH 8.0. Столбиками показана активность тромбина во фракциях (в % по отношению к активности фермента, нанесенной на колонку).

В выбранных условиях емкость сефарозы-АЬКтгр по отношению к тромбину составила 0.14 мг/мл"сорбента. Наибольшее сродство (0.68 мг/мл) сефароза-АЫ1тгр имела к калликреину - ферменту, аналогом субстрата которого является лиганд. При хроматографии частично очищенного калликреина плазмы крови кролика, часть фермента десорбировалась при промывании колонки стартовым буфером, а часть связывалась прочно и элюировалась только 25% изопропиловым спиртом. По данным электрофореза, фракции элюата содержали гомогенный калликреин.

Еще менее прочно связывался с сефарозой-АЫ1тгр бычий трипсин, который десорбировался уже при промывании колонки стартовым буфером.

1.4. Выделение протеиназ из природных источников. В табл. 2 суммированы результаты выделения протеиназ непосредственно из природных источников - культуральных жидкостей микроорганизмов, экстрактов растительного и животного происхождения. Как и следовало ожидать исходя из специфичности лиганда, с сефарозой-АА1тгр-1 хорошо взаимодействовали бактериальные субтилизины (табл. 2, NN 13).

Таблица 2.

Очистка некоторых протеиназ из природных источников на сефарозе-ААЬтгр-!

Фермент и его Белок, Актив- Уд. акт., Выход Степень

источник A2S0- ность, ед. акт./ по очистки

ед. акт. А280 актив-

ности,

%

1. 77г. vulgaris ИНМИ-

4А. субтилизнн 49 101 2.1 74 16

2. Actinomyces Sp.,

субтилизин 42 22 0.5 73 18

3. В. licheniformis, 72,

субтилизнн 36 119 3.3 68 2

■4. Корни одуванчика,

сериновая протеиназа 28 0.9 0.03 90 17

Гепатопанкреас

камчатского краба

5. Трипсин PC 37 9.2 0.26 158 4

6. Сериновая

протеиназа PC 33 5.5 0.17 87 2

7. Карбоксипептидаза

PC 33 3.4 0.07 100 2

С помощью биоспецифической хроматографии на сефарозе-/\ALmrp-I была очищена в 17 раз сериновая протеиназа из корней одуванчика. Из суммарного препарата протеиназ гепатопанкреаса камчатского краба на сефарозе-ААЬшгр-1 удалось успешно выделить три фермента. Карбоксипептидаза РС, сериновая протеиназа РС и трипсин РС, демонстрируют заметное сродство к сефарозе-АА1лпгр-1. Первые два фермента - карбоксипептидаза РС и сериновая протеаза РС -элюируются 1М №С1, не разделяясь, а трипсин РС краба сорбируется более прочно и элюируется только при добавлении 25%-ного изопропанола. При рехроматографии фракции, содержащей карбоксипептидазу РС и сериновую протеиназу РС, в тех же условиях, в отсутствие трипсина наиболее прочно связывается с сорбентом сериновая протеиназа РС. Таким образом, за две последовательные хроматографические стадии удалось разделить три фермента.

2. Активность протеолитических ферментов в моче и сыворотке крови детей, страдающих хроническим гломерулонефритом.

Синтезированные сорбенты нашли применение при решении проблемы, связанной с разработкой неинвазивных методов диагностики и прогноза течения гломерулонефрита (ГН) у детей. Широкая распространенность этого заболевания у детей и высокая частота его прогрессирования обуславливают необходимость изучения патогенетических звеньев заболевания. Основными проявлениями болезни являются протеинурия, отеки, гипертензия, гематурия (иногда), нарушение функции почек и т. д. Протеолитическая активность в моче и сыворотке крови определялась с помощью хромогенных пептидных субстратов 2-ОА1а-Ьеи-А^-рНА, 01р-А1а-А1а-1_еи-рНА и Ьеи-рЫА, отвечающих специфичности калликреина, химотрипсина и аминопептидазы. Исследования проводились у 118 детей с первичным гломерулонефритом от 3 до 14.5 лет, находившихся на лечении в нефрологическом отделении НИИ Педиатрии РАМН в условиях диеты N 7. Контрольную группу составили 16 практически здоровых детей..

У здоровых детей в моче присутствуют незначительные количества тканевого калликреина, а при воспалении некоторое количество калликреина попадает в мочу из плазмы крови. Наиболее высокие показатели активности калликреина в моче мы наблюдали у детей с нефротпческой и смешанной формами гломерулонефрита е активной стадии заболевания (табл. 3). Несмотря на однотипность клинических проявлений гематурической формы ГН и А-нефрита, установлены различия активности калликреина в моче. При Г§А-нефрите эти показатели были значительно выше, чем при гематурической форме ГН.

При гломерулонефрите в моче детей также возрастает активность протеиназы со специфичностью химотрипсина (протеиназы X). В отличии от детей контрольной группы, в моче которых обнаруживались лишь следовые количества активного фермента в моче больных при всех клинических формах гломерулонефрита наблюдалось повышение уровня протеолитической активности, особенно заметное при остром и хроническом гломерулонефрите (табл. 3). Наиболее низкий уровень протеолитической активности выявлен при гематурической форме гломерулонефрита. В результате лечения активность протеиназ снижалась, но не достигала нормы.

Таким образом, определение активности калликреина и протеиназы X в моче и сыворотке крови целесообразно использовать в качестве критерия разграничения гематурической формы гломерулонефрита и 1§А-нефрита. При выявлении высокого уровня активности протеиназ в период ремиссии можно предполагать, что ремиссия будет нестойкой.

3. Исследование протеиназ, содержащихся в моче детей, страдающих хроническим гломерулонефритом.

Схема разделения ферментов приведена на рис. 3. Процесс очистки на каждой стадии оценивали по активности ферментов по специфическим субстратам, о гомогенности препаратов судили по данным нативного (рН 8,3) и 808-электрофореза в полиакриламидном геле.

М оча

Рис. 3. Схема разделения ферментов.

Таблица 3. Активность калликреина и протенназы X в моче и сыворотке крови в зависимости от _формы и активности гломерулонефрита у детей._

Группы детей Активность калликреннов, НМ<)ЛЬ/МЛ + М11|| Активность нротеиназы X, иМоль/мл+мин

Сыворотка крови Моча Сыворотка крови Моча

М+ш M+in М+т М+т

N Ф N Ф N Ф N Ф

I. ГН в активной стадии, п=70, в т.ч. 65±3 14 86 7±2 16 84 1.5Ю.2 43 57 5.7±0.6 10 90

Нефротическая форма, в том числе 1) Острый ГН, затяжное теч., а) активная стадия, п=7 94±9 0 100 5±1 14 86 1.8±0.4 14 86 8±3 0 100

б) Стадия частичной ремиссии, п=7 49±2 0 100 1.4±0.5 43 57 1.3±0.3 43 57 1.8±0.8 43 57

2) Хронический ГН а) активная стадия, п=22 75±7 9 91 15±4 0 100 1.5±0.3 45 55 7.6±0.9 0 100

б) Стадия частичной ремиссии, п=17 47±5 35 65 1.6±0.2 47 53 0.9±0.2 47 53 1.0±0.3 35 65

в) Стадия полной ремиссии, п=7 38±4 43 57 1.0±0.2 43 57 0.6Ю.1 86 14 0.5±0.1 71 29

II. ХГН смешанная форма а) активная стадия, п=21 77±4 0 100 7±1 10 90 1.8±0.3 38 62 7±1 5 95

б) Стадия частичной ремиссии, п=6 40±7 33 67 4±1 17 83 1.0±0.5 67 33 3.7±0.6 33 67

III. ХГН гематурнческая форма активная стадия, п= 11 35±5 64 36 0.7±0.2 73 27 1.1±0.3 55 45 1.0±0.3 36 64

IV. IgA-гломерулонефрит а) активная стадия, п=9 58±7 11 89 1.9±0.5 22 78 1.0Ю.З 56 44 1.8±0.3 22 78

б) Стадия частичной ремиссии, п=5 46±7 20 80 1.0±0.2 20 80 0.5±0.1 80 20 1.1±0.2 20 80

Здоровые дети, п=16 29±2 0.40± ±0.05 0.43± 0.04 0.40± ±0.05

3.1. Выделение и некоторые характеристики ферментов, активных по Ъ-Ъ А1а-Ьеи-А^-р^тА, субстрату калликреина. В качестве сорбента дл выделения калликреинов использовалась Aгg-aгapoзa. Фермент, акггивны по С1р-А1а-А1а-Ьеи-рНА (протеиназа X) не взаимодействовал с сорбенто.ч Фракция, прочно связывающаяся с сорбентом, содержала препарат с 38£ исходной активности по 2-0-А1а-Ьеи-Аг§-рКА. Применение аффинног метода разделения позволило значительно обогатить фракции ферментам1-Степень очистки калликреина составила 29 раз, а протеазы X - 34 раза.

С целью дальнейшей очистки белок наносили на колонку с ДЭАЭ сефадексом. При изменении концентрации ИаС1 от 0 до 1 N десорбировались четыре пика, содержащие белки. Активными по Z-DAla Ьеи-А^-рИА были лишь первые два из них.

Две активные фракции с ДЭАЭ сефадекса были в дальнейшее" подвергнуты гель-хроматографии на Суперозе 12В в режиме ИРЬС. Пр] этом было найдено, что во фракции 1 содержится два белка молекулярной массой 100 (I) и 47 (II) кДа. Вторая фракция содержал только фермент II с молекулярной массой 47 кДа. Удельные активност] фракций I и II по 7-ОА1а-Ьеи-Агв-рМА практически одинаковы, зато п< эффективности гидролиза другого субстрата - Е-ОРго-РЬе-А^-рИ/ ферменты значительно различались. Фермент I в восемь раз быстре расщеплял этот субстрат, чем фермент II (табл. 4).

Таблица 4.

Свойства выделенных нами калликреинов

Свойство Калликреин плазмы Калликреин из мочи Фракции калликреина, выделенные нами из мочи

(Лит. данные) I II

Молекулярная масса, кДа 100 34-41, 40, 54 104 47

Изоэлектрическая точка 3.8-4.5 4.0-4.5 5.7 5.7

Ингибмрование СИТ 100% 0% 100% 0%

Отношение активностей калликреинов плазма/ткань по г-ОР-Р-К-рЫА 35:1 8:1

т чистых калликреинов плазмы и тканей по литературным данным это ичие составляет 35 раз. Такое расхождение может объясняться имным загрязнением препаратов. Короткий субстрат трипсина Вг-Аг§-А практически не гидролизовался ферментом.

Таким образом, свойства выделенных ферментов - значения текулярных масс, изоэлектрических точек, субстратная специфичность и актер взаимодействия с ингибиторами позволяют сделать вывод, что в 1е детей, страдающих гломерулонефритом, обнаруживаются в активной эме калликреин плазмы и тканевый калликреин.

. Выделение и свойства фермента, активного по С1р-А1а-А1а-Ьеи-р^ отеиназы X). Фракцию, не сорбирующуюся на А^-агарозе и ержащую 78% фермента активного по С1р-А1а-А1а-Ьеи-рКА отеиназы X), после концентрирования очищали на РВЕ-94. сорбенте : хроматофокусирования. При понижении рН от 8 до 5 основная часть явного белка не связывалась с сорбентом. Интересно, что несмотря на чительную потерю общей активности (5 раз), степень очистки фермента той фракции составила 80 раз. Появление протеиназы X, активной по )-А1а-А1а-1.еи-рМА в элюатах с РВЕ-94, вероятно, можно объяснить [ичием комплекса чистого фермента с другим белком (сывороточным бумином с р1=4.7). Альбумин - основной белок мочи, содержание орого увеличивается при почечной патологии. Малая степень очистки эата может объясняться, образованием комплекса протеиназы X с бумином.

Для дальнейшей очистки протеиназы X полученный препарат, ивный по С1р-А1а-А1а-Ьеи-рЫА, фракционировали методом )ащеннофазовой хроматографии в градиенте ацетонитрила в режиме IX. Эта операция привела к разделению препарата на три белка. Для с был сделан аминокислотный анализ и определена молекулярная масса ■одом БОБ-электрофореза. И-концевые последовательности фракций 2 и редставлены на рис. 4. Оказалось, что самый большой пик - фракция 2 яется сывороточным альбумином человека, а фракция 3 - ингибитором темы свертывания крови, а!-антитрипсином.

Таким образом, полученный препарат протеиназы содержал 1ктивные примеси - сывороточный альбумин и а1-антитрипсин.

Антитрипсин, Мг=54 кДа [123] Е-О-Р-0-О-О-А-А-(2-К*-Т-О

4 Ь1-концевые последовательности фракций после разделения методом ЖХ.

епарат "пик 3", Мг=67 кДа ьбумин, Мг=66 кДа епарат "пик 2", Мг-бб кДа

Е-0-Р-С>-0-Е-А-А-(2-Т*-Т-Е

О-А-Н-К-Б-Е-У-А-Н-К-Р-К-О-Ь

0-А-Н-К-5-Е-У-А-Н-11-Р-К-0-Ь

Субстратную специфичность белка изучали, используя акгивн фракцию, не взаимодействующую с сорбентом для хроматофокусирован РВЕ-94. Выделенный фермент лучше расщеплял связь Ьеи-Х и РЬе-Х, ч< А1а-Х и Пе-Х. Это означает, что в положении Р1 субстрата долж присутствовать лейцин или фенилаланин. В области Р2 предпочтительнь оказывается небольшой остаток - аланин (табл. 5). Однако, эффективное расщепления даже наиболее специфичного субстрата - С1р-А1а-А1а-Ье рИА невелика Кт =0.285 тМ.

Таблица 5

Субстратная специфичность протеиназы X

Субстрат Относительная активность, %

1. Glp-AIa-AIa-Leu-pNA =100

2. Z-AJa-Ala-Leu-pNA 102

3. Glp-Ala-AIa-Leu-pNA + DTT 112

4. Glp-Phe-pNA 94

5. Glp-Phe-Ala-pNA 30

6. Glp-Phe-Leu-pNA 15

7. Glp-Ala-Ala-Phe-Leu-pNA 2

S. Boc-Phe-Pro-IIe-pNA I

9. Z-AIa-AIa-Ala-pNA 0

Белковые субстраты, азоказеин, бычий сывороточный альбумин глобин, не гидролизовались протеиназой даже после 24 часов инкубаш-Скорее всего, именно особенность фермента расщеплять только небольш пептиды объясняет присутствие большого количества нерасщепленно белка при значительном возрастании протеолитической активности в мо больных.

Протеиназа X эффективно гидролизует короткие вазоактивн! пептиды - ангиотензин и брадикинин (рис. 5), инактивируя их, вероятно, представляет собой кининазу, функционирующую в почк; Интересно отметить, что протеиназа X способна расщеплять связи пос остатка пролина.

Ангиотензин Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro I Phe-His-Leu Брадикинин Arg-Pro-Pro-Gly-Phe i Ser-Pro i Phe-Arg Рис. 5. Гидролиз пептидных гормонов протеиназой X

Протеиназа X ингибируется PMSF, что свидетельствует принадлежности ее к классу сериновых протеиназ. Полная инактивац фермента происходит также в присутствии ионов ртути, что характерно д многих протеиназ серинового типа и свидетельствует о присутствии

¡екуле фермента свободного цистеинового остатка, важного для ивности фермента. Возможно, потеря активности в присутствии ЭДТА зана с необходимостью ионов кальция для стабилизации фермента, ютвительно, по нашим наблюдениям обессоливание фермента ровождается значительной потерей активности, а добавление 2 мМ тата кальция в буферные растворы способствует сохранению активности лапазоне рН 6-9.5 в течение длительного времени.

Большинство ингибиторов растительного и животного происхождения оказывает заметного влияния на активность протеиназы X, (табл. 6.). актически полностью подавляет активность протеиназы X лишь соевый •ибитор трипсина типа Кунитца. Этот белок способен оказывать ибирующее действие как на трипсин, так и на химотрипсин.

Таблица 6.

Ингибирование протеиназы X

•ибитор Ингибирование, %

+ 100

ГА 92

:к 0

:к 26

77

анемоны, 1:1 0

1:100 25

кукурузы, 1:1 0

1:100 18

|Мукоид, 1:1 25

1:100 20

гитца, 1:1 -

1:100 92

:, 1:1 0

1:100 9

И, 1:! 0

1:100 17

. Выделение и свойства лейцииаминопептидазы. Лейцинаминопептидаза па получена в гомогенном состоянии после очистки на аффинном >бенте с морфолидом трипептида А1а-А1а-Ьеи-К(СН2СН2)20 с следующей эксклюзионной хроматохрафией на Суперозе 12В. шекулярная масса протеиназы составила 83 кДа и 72 кДа по данным :клюзионной хроматографии и электрофореза в денатурирующих овиях, соответственно. Фермент преимущественно расщеплял амидные пептидные связи, образованные незаряженными аминокислотами: нином, лейцином, фенилаланином и т.д. и гораздо слабее связи инина и аспарагиновой кислоты (табл. 7, рис. 6)

Таблица 7.

Субстратная специфичность аминопептидазы по расщеплению г нитроанилидов аминокислот.

Субстрат Относительная активность, %

1. Leu-pNA 100

2. Ala-pNA 177

3. Arg-pNA 20

4. Phe-pNA 19

5. Pro-pNA 0

MetlArgi Phe-Ala LeulTrpJ-Meti Arg-Phe LeulTrplMet^ Arg-Arg-Phe-Ala Glyl Gly-Val Leul Gly-GIy ArglLysJ-Asp-Val-Tyr

Tyr-DMet-Gly-Phe-ProNH2 - не гидролизуется

Рис. 6. Действие аминопептидазы на незащищенные пептиды

N-концевая последовательность аминопептидазы сравнивалась известными в компьютерном банке Genebee последовательностям: Найдено, что фермент по N-концевой последовательности на протяжеш-12 аминокислот практически идентичен плазменному белку all гликопротеину (рис. 7). Этот белок имеет молекулярную массу 63 кДа вероятно, принадлежит к семейству иммуноглобулинов, причем функщ его в плазме неизвестна. Вероятно, при гломерулонефрите, ко г, нарушается естественная фильтрующая способность почки, белок попада из плазмы в мочу.

N-концевая последовательность S(A)IFYE TQPSL LA аминопептидазы, М. м. 71 кДа

N-концевая последовательность AIFYE TQPSL IVA alB-гликопротеина, М. м. 63 кДа

Рис. 7. Сравнение N-концевой последовательности аминопептидазы известной N-концевой последовательностью alB-гликопротеина.

Можно предположить, что лейцинаминопептидаза завершает проце расщепления брадикинина протеиназой X до отдельных аминокисл< Изучение протеиназ, появляющихся в моче детей, страдающ

1ерулонефритом, представляет значительный интерес, и до сих пор нет ективных методов их выделения.

На рис. 8 приведена хроматограмма мочи ребенка, страдающего гическим гломерулонефритом на колонке с сефарозой-ААЬшгр-Г. Все протеиназы удерживаются сорбентом. Элюируются вместе протеиназа выходом 57% и степенью очистки 8 раз и лейцинаминопептидаза с. шом 55% и семикратной очисткой при линейном увеличении дентрации МаС1 в элюенте до 0.5 М. Калликреин сильнее удерживается ¡ентом и десорбируется лишь_25%-ным изопропиловым спиртом в 1 М '1 с выходом 22% и 14-кратным концентрированием. Сродство ['икреина к данному сорбенту неожиданно, так как для связывания с 1 ферментом субстрат обычно имеет в Р1 положительно заряженный ток аргинина.

V, мл

S. Хроматограмма мочи ребенка, больного хроническим гломерулонефритом, на розе-AALmrp-I. Колонка (1.5*10 см) уравновешена 0.05 М трис HCl, pH 8.0. - Поглощение при 280 нм, (2) - активность лейцинаминопептидазы, (3) -зность калликреина. (4) - активность кининазы X, (5) концентрация NaCl, iKofi показано начало элюции 0.05 М трис HCl, 1 М NaCl с 25% изопропанола, pH

Таким образом, аффинные сорбенты с морфолидами трипептидов аналогами субстратов протеолитических ферментов, позволили повысит выход и значительно очистить протеиназы мочи, активность которы коррелирует с формами и степенью тяжести гломерулонефрита у детей.

Выводы работы.

1) Синтезированы новые аффинные сорбенты с морфолидами трипептидо - аналогами субстратов протеиназ со специфичностью трипсина i химотрипсина.

2) Показано успешное применение этих аффинных сорбентов дл. выделения различных протеолитических ферментов из природны источников - бактерий, растений и животных.

3) Выявлена корреляция тяжести гломерулонефрита у детей с активность! протеиназ в моче по расщеплению Glp-Ala-Ala-Leu-pNA и Z-DAla-Leu Arg-pNA и предложен метод контроля течения заболевания эффективности лечения по активности этих ферментов в моче.

4) Выделены и охарактеризованы ферменты, появляющиеся в моче детей гломерулонефритом. Показано, что они являются калликреинами плазмы : ткани, кининазой, расщепляющей пептидные гормоны и аминопептидазой

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1) Kuznetsova A.V., Bogacheva А.М., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. Synthesis an application of sorbents for affinity chromatography of serine proteases. Chromatography 1997, V. 45. P. 44-48.

2) A.B. Кузнецова, Г.Н. Руденская, A.M. Богачева, Т.Л. Воюшина, В.М. Степано] Аффинные сорбенты для выделения протеиназ, содержащие в качестве специфически лнгандов морфолиды трипептидов. Биоорган, химия. 1997. Т. 23. N 11. С. 868-876.

3) О.В. Чумакова, A.B. Кузнецова, А.М. Цигин, Е.К. Кутафина, Н.З. Зокиров, Т.1 Сергеева, Г.Н. Руденская. Состояние системы эндогенных протеиназ пр гломерулонефрите у детей. Педиатрия. 1997. N 6. С. 13-17.

4) Чумакова О.В., Кузнецова AB., Руденская Г.Н., Сергеева Т.В., Степанов В.М Воюшина T.JI. Активность эндогенных протеиназ при гломерулонефрите у дете! Вопросы Мед. Химии. 1998. принято в печать.

5) О.В.Чумакова, А.В.Кузнецова, Г.Н.Руденская, Е.Л.Панченко. Определен! протенназной активности крови и мочи с помощью хромогенных субстратов у детей гломерулонефритом. III Симпозиум "Химия протеолитических ферментов". Моей 1993. С. 112.

6) О.В.Чумакова, В.И.Наумова, AB.Кузнецова, Г.Н.Руденская, Т.И.Раздолькин Протеиназная активность сыворотки крови и мочи у детей с первичны гломерулонефритом. III областной съезд акушеров-гинекологов, педиатров терапевтов. Самара. 14-15 декабря 1993 г. С. 161.

7) О.В.Чумакова, А.В.Кузнецова, Г.Н.Руденская, В.И.Наумова. Активность серинов! протеиназ сыворотки крови и мочи у детей с первичным гломерулонефрита Российская научно-практическая конференция и рабочее совещание главнь нефрологов и урологов России. Оренбург. 19-21 апреля 1994 г. С. 84.

О.В.Чумакова, А.В.Кузнецова, Г.Н.Рудекская, В.И. Наумова. Активность сернновьи ютеппаз при первичном гломерулонефрите у детей. III Санкт-Петербургски! фрологический семинар 26 мая-3 июня 1995 г. С.260.

Kuznetsova A.V., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M., Tchumakova O.V., Viryasov M.B. jyushina T.L. Proteolytic enzyme detected in urine of children with glomerulonephritis. 7tl ЮВМВ Congress "Advances in Biochemistry and Molecular Biology", 1995, Sydne; ustralia), Incorporating v.27 of the Proc. of the Australian Society for Biochemistry am olecular Biology, POS-1-106.

) A. V. Kuznetsova, O.V.Tchumakova, G.N.Rudenskaya, M.B.Viryasov, V.M.Stepanov ptide ligands for affinity chromatography of proteases. 21st International Symposium oi iromatography, 1996, Stuttgart (Germany), P320.

) Кузнецова A.B., Богачева A.M., Макевнина Л.Г., Руденская Г.Н., Степанов В.М штез и применение новых сорбентов для аффинной хроматографии сериновьп ютеиназ. IV Симпозиум "Химия протеолитических ферментов". Москва 1997. С. 129. ) Кузнецова А.В., Чумакова О.В., Воюшина Т.Л., Руденская Г.Н. Протеолитически ¡рменты в моче детей, больных хроническим гломерулонефритом. Г/ Симпозиум Симин протеолитических ферментов". Москва 1997. С. 141.

) Кузнецова А.В., Богачева А.М., Руденская Г.Н., Степанов В.М. Морфолщц ипептидов - лиганды для аффинной хроматографии протеаз. 2-й съез. юхимического общества РАН. Москва. 19-23 мая 1997 г. С. 510. ) O.V. Tchumakova, A.V. Kuznetsova, G.N. Rudenskaya, T.L.Voyushina, V.M. Stepanov. rum and urinary protease activities in children with nephrotic syndrome. - Internationa ingress on Analytical Chemistry. - Moscow. - Russia. June 15-21. - 1997. - (K-21). ) A.V, Kuznetsova, G.N. Rudenskaya, AM. Bogacheva, T.L. Voyushina, V.M. Stepanov Flinty chromatography of proteases. Synthesis and application of affinity sorbents. - Moscow Russia. June 15-21. - 1997. - (P-52).

) Anna V. Kuznetsova, Galina N. Rudenskaya, Anna M. Bogacheva, Valentin M. Stepanov otease that Appear in Urine of Children with Glomerulonephritis. P. A1394, abstract ? 46. 17 th international Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San-Franciskc ilifomia, FASEB Journal, V. II, N 9. 1997.