Разработка новых металл-аффинных сорбентов, содержащих железо(III), для решения задач фосфопротеомики тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.11 ВАК РФ

На правах рукописи

ГЛАДИЛОВИЧ Владимир Дмитриевич

Разработка новых металл-аффинных сорбентов, содержащих железо(Ш), для решения задач фосфопротеомики

02.00.11 — коллоидная химия 02.00.02 — аналитическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

I1 НАР 2014

Санкт-Петербург 2014

005546505

005546505

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН) и Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский университет»

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Подольская Екатерина Петровна

к.х.н., в.н.с. ФГБУН Институт аналитического приборостроения РАН

Суходолов Николай Геннадьевич

к.х.н., доцент ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский

университет»

Дмитриева Ирина Борисовна

Д.Х.Н., доцент ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия»

Кокряков Владимир Николаевич

д.б.н., профессор ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

ФГБОУ ВПО Российский государственный педагогический университет имени А. И. Герцена

Защита диссертации состоится «Г£» СММ^лЗ^ 2014 г- в ^ часов на заседании диссертационного совета Д 212.232.40 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д. 41/43, БХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9. Автореферат размещен на сайте www.spbu.ru.

Автореферат разослан «П » ЛАги^Т^ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор химических наук, 1

профессор I I ' Жуков Анатолий Николаевич

■■■- - Общая характеристика работы

Актуальность темы. Метод получения пленок Ленгмюра-Блоджетт (ПЛБ) позволяет варьировать их свойства, меняя структуру полярной части амфифильной молекулы, состав монослоя, раствора (субфазы) и условия переноса на твердую подложку. Уникальность структур, получаемых по методу Ленгмюра-Блоджетт, обусловила их использование, как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Комплексная оценка физико-химических и поверхностных свойств ПЛБ позволяет прогнозировать возможность-их целенаправленного применения. В последние годы большое внимание уделено исследованиям ПЛБ на основе стеаратов трехвалентных металлов, таких как А1, Бе, У.

Стоит отметить, что трехвалентные металлы являются активными центрами многих металл-аффинных сорбентов. Металл-аффинная хроматография - это метод разделения, основанный на различном сродстве гетероатомов органических соединений к ионам металлов, согласно теории жестких и мягких кислот и оснований Пирсона. В настоящее время известны два типа сорбентов для металл-аффинной хроматографии: а) металл-хелатные на основе ионов металлов (Ре3+, Оа3+, №2+, Си2+), хелати-рованных полидентантными лигандами, иммобилизованными на вспомогательной подложке; б) металл-оксидные на основе оксидов металлов, чаще всего в виде свободных нанопорошков, либо связанные на инертном носителе.

Пленки Ленгмюра-Блоджетт или системы, полученные путем диспергирования коллапсированных монослоев стеариновой кислоты, снятых с поверхности водной субфазы, содержащей ионы Ре(Ш), имеют поверхность, которая состоит преимущественно из надежно связанных с поверхностью твердого тела ионов железа. Проведенное ранее масс-спектрометрическое исследование состава ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) показало, что основным структурным звеном монослоя является дистеарат железа(Ш). Это позволило сделать предположение о том, что такие структуры могут служить металл-аффинными сорбентами, поскольку третий заместитель при атоме железа может варьироваться, и связь металла с ним слабее, чем с остатками стеариновой кислоты. Следовательно, за счет координационных взаимодействий иона железа с различными гетероатомами органических соединений возможна их сорбция.

Поиск структур, стабильных при проведении процесса хроматографии, является важной задачей, и одним из путей ее решения может быть синтез различных материалов с малым размером частиц и, как следствие, высокой величиной удельной поверхности. К таким структурам можно отнести оксиды переходных металлов. Недавно был предложен модифицированный золь-гель метод с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением, для получения оксида циркония в нанодисперсном состоянии. Соответственно, было сделано предположение, что оксид железа(Ш) также может быть синтезирован этим методом, а полученную структуру можно использовать как металл-аффинный сорбент.

Металл-аффинную хроматографию на сорбентах, содержащих железо(Ш), применяют в фосфопротеомике — области протеомики, занимающейся белками и пептидами, содержащими фосфорные группы - в качестве метода высокоселективного и специфичного выделения фосфорилированных пептидов. По принципу Пирсона фосфорная группа, богатая атомами кислорода, имеет сродство к атомам железа(Ш). За счет координационных взаимодействий она обратимо связывается с атомом металла, что позволяет в дальнейшем получать образец, обогащенный фосфорилированными соединениями.

Известны коммерчески доступные сорбенты, содержащие железо(Ш), однако для них характерен достаточно высокий уровень неспецифичной сорбции и, как следствие, низкая селективность; невозможность получения в лабораторных условиях, а также невозможность использования в аппаратурном оформлении при потоковых анализах. Кроме того, практически отсутствует информация о возможности использования металл-аффинных сорбентов для экстракции фосфонилированных белков и пептидов, содержащих аминокислоты с присоединенными остатками эфира метил-

фосфоновой кислоты. Именно к таким соединениям можно отнести аддукты белков, в том числе сывороточного альбумина, с фосфорорганическими отравляющими веществами: зарином, зоманом, ЯУх и другими. Специфичное выделение таких аддуктов белков необходимо при ретроспективном химико-токсикологическом анализе для установления факта интоксикации и идентификации отравляющего вещества и также является одним из важнейших малоизученных направлений в фосфопротеомике.

Цель работы - разработка и характеризация новых металл-аффинных сорбентов, содержащих железо(П1), для применения в фосфопротеомном анализе.

Задачи исследования:

- Разработка и получение двух типов новых металл-аффинных сорбентов, содержащих железо(Ш).

- Определение физико-химических и поверхностных свойств сорбентов.

- Определение сорбционных свойств сорбентов.

- Исследование возможности их использования в фосфопротеомном анализе.

Научная новизна. Разработаны и охарактеризованы два новых металл-

аффинных сорбента, содержащих трехвалентное железо: коллапсированные монослои стеарата железа(Ш) и нанодисперсные частицы оксида железа(Ш), полученные золь-гель методом с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением. Исследованы структурные и поверхностные свойства новых сорбентов. Показана возможность использования разработанных сорбентов в фосфопротеомном анализе: проведена оптимизация условий металл-аффинной хроматографии, исследована специфичность и селективность сорбентов на примере фос-форилированных триптических пептидов казеина быка и синтетических пептидов, фосфорилированных по различным аминокислотам. Показана возможность селективного выделения аддуктов зарина с сывороточным альбумином человека методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих трехвалентное железо.

Реализация работы: Работа проведена в рамках бюджетной темы ИАП РАН «Разработка экспериментальных методик исследования нанокомпозитов, металло-комплексов железа и пленок Ленгмюра-Блоджетт, включающих в себя ионы железа, с привлечением методов масс-спектрометрии». Результаты работы отмечены в отчетном докладе президиума Российской академии наук: Научные достижения Российской академии наук в 2012 году. М.: Наука, 2013. Раздел IV. Нанотехнологии и информационные технологии, стр. 148.

Практическая значимость. Созданные металл-аффинные сорбенты могут быть использованы для решения задач фосфопротеомики, что востребовано в таких областях науки, как медицина, аналитическая химия, биохимия и токсикология.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 4 статьи в научных рецензируемых журналах и 6 тезисов по материалам научно-практических конференций.

Апробация работы. Результаты исследований, проведенных в рамках настоящей работы, нашли отражение в докладах на: Всероссийской Молодёжной Конференции "Химия поверхности и нанотехнология" (Казань, 2012); II всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2012); VII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматери-алам «Менделеев 2013» (Санкт-Петербург, 2013); IV Междисциплинарной конференции «Биологические активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Новый Свет, Украина, 2013); У-ой Международной конференции-школе «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения» (Санкт-Петербург, 2013); VI съезде ВМСО, V Всероссийской конференции с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы" (Москва, 2013).

Положения, выносимые на защиту:

1. Регулярная мультимолекулярная структура на основе стеарата железа(Ш), полученная по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующим коллапсированием без переноса на твердую подложку, может быть использована в качестве металл-аффинного сорбента (металл-хелатный сорбент — МХС).

2. Золь-гель метод с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением, позволяет получать высокопористые нано-дисперсные структуры на основе оксида железа(Ш) с размером частиц 50-100 нм, которые могут быть использованы в качестве металл-аффинного сорбента (металл-оксидный сорбент - МОС).

3. Методика последовательного элюирования 0.4 М водным раствором аммиака, 0.5% водным раствором пиперидина, затем 15% раствором ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина повышает степень извлечения фосфорилированных пептидов по сравнению с элюированием любым из перечисленных растворителей.

4. Результаты исследования процесса сорбции фосфорилированных пептидов и белка на полученных сорбентах.

5. Результаты экспериментального исследования селективности и специфичности сорбции фосфорсодержащих пептидов из простых и сложных пептидных смесей при использовании предлагаемых сорбентов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех разделов, заключения, списка литературы и приложения. Она изложена на 116 страницах и включает 37 рисунков, 25 таблиц, 114 наименований списка литературы и 1 приложение.

Основное содержание диссертационной работы

Во введении изложен краткий обзор проблемы и постановка задачи.

Первый раздел содержит обзор литературы, включающий общие сведения о методе металл-аффинной хроматографии, принципе его действия и применении его в фосфопротеомных исследованиях, критическое рассмотрение существующих сорбентов для металл-аффинной хроматографии. Рассмотрены особенности пленок Ленгмюра-Блоджетт и области их применения.

Во втором разделе подробно описаны условия проведенных экспериментов и способы обработки полученных данных. Представлены: а) методика получения ме-талл-хелатного сорбента, содержащего железо(Ш) - МХС Fe(III); б) методика синтеза металл-оксидного сорбента, содержащего железо(Ш) - МОС Fe(III); в) методики стандартизации сорбентов; электрокинетических исследований сорбентов; определения их удельной поверхности; построения изотерм сорбции белка и фосфорилированных пептидов, определения сорбционной емкости сорбентов и расчета термодинамических характеристик; д) методика проведения металл-аффинной хроматографии в двух вариантах аппаратурного исполнения (в микропробирке на 0.5 мл и в спиновой колонке); е) условия масс-спектрометрического и хроматографического анализа (MALDI-масс-спектрометрический анализ проводили с помощью времяпролетного масс-спектрометра Axima Performance (Shimadzu, Япония); хроматографический анализ методом ВЭЖХ-УФ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu LC-20 «Prominence» (Япония) с УФ детектором с диодной матрицей SPD-M20A; хромато-масс-спектрометрический анализ методом ВЭЖХ-МС проводили на системе, состоящей из жидкостного хроматографа Waters Alliance 2695 с масс-спектрометром РЕ Sciex API QSTAR; хроматомасс-спектрометрический анализ методом ВЭЖХ-МС-МС проводили на системе, состоящей из жидкостного хроматографа Waters Acquity UPLC с масс-спектрометром Orbitrap (Thermo Scientific).

В третьем разделе представлены и обсуждены результаты работы.

Разработка металл-аффинного сорбента на основе пленок Ленгмюра-Блоджетт, состоящих из стеарата железа(Ш)

ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) получали следующим образом: в специальной ванне на поверхность водной субфазы, содержащей ионы железа(Ш), наносили по каплям раствор стеариновой кислоты в гексане. После испарения гексана с водной субфазы на ее поверхности образовывался мономолекулярный слой, состоящий из продуктов взаимодействия стеариновой кислоты с ионами железа(Ш). После коллап-сирования монослоя была получена многослойная структура, которую переносили в микропробирку. Для определения структурных звеньев был проведен MALDI-масс-спектрометрический анализ ацетонитрильной суспензии коллапсированных монослоев. В масс-спектре, полученном в режиме положительной ионизации, был найден интенсивный сигнал с m/z 622.46, соответствующий дистеарату железа Fe(CnH35COO)2+, что подтвердило имеющиеся литературные данные. Необходимо подчеркнуть, что не были обнаружены сигналы, соответствующие тристеаратам железа. Это позволяет предположить возможность взаимодействия иона железа (в силу его стерической доступности) с различными гетероатомами органических соединений согласно принципу Пирсона.

В связи с особенностями метода получения ПЛБ можно с высокой точностью задать площадь, занимаемую пленкой, но не ее массу. Определение точной массы монослоя заданной площади позволяет вычислять массу пленок по площади полученного монослоя. По результатам стандартизации масса сухих коллапсированных ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) составляет 0.02^± 0.001 мг/дм2.

Рисунок 1 - Изображение структуры коллапсированных ПЛБ на основе стеарата железа(Ш), перенесенных на кремниевую подложку, полученное методом СЭМ, увеличение в 1000 раз (слева) и 1965

раз (справа)

С помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) на растровом электронном микроскопе Inspect S (FEI, США) была исследована структура поверхности коллапсированных ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) на кремниевой подложке (рисунок 1). Так как сжатие монослоев происходило в двух направлениях, видна зигзагообразная складчатость. Однако при более сильном увеличении видно образование ! фрагментов с гладкой поверхностью, доступной для сорбции.

Исследование процесса сорбции фосфорилироеанного белка на пленках Ленгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(Ш) методом атомно-силовой микроскопии

При помощи атомно-силового микроскопа Ntegra Aura (NT MDT, Россия) были проведены исследования процесса сорбции фосфорилированного белка казеина (casein Bos Taurus, молекулярная масса 18 кДа) на ПЛБ на основе стеарата железа(Ш), перенесенных на твердую подложку.

На рисунке 2.А представлено изображение поверхности чистой кремниевой подложки. На нее были нанесены ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) (рисунок 2.Б). При сравнении рельефов видно, что ПЛБ были успешно перенесены на подложку, так как резко уменьшилась шероховатость поверхности. Затем подложка была помещена в водный раствор казеина (концентрация 100 мкг/мл) на сутки, после чего была про-

мыта дистиллированной водой для удаления непрореагировавшего с поверхностью казеина (рисунок 2.В). На поверхности ПЛБ видны участки, на которых произошла адсорбция агрегатов казеина, со средними размерами 200-500 нм. Затем для десорбции казеина подложка была помещена на 1 час в 0.4 М водный раствор аммиака (рисунок 2.Г). Все ранее адсорбированные частицы, отнесенные к агрегатам казеина, были удалены с поверхности ПЛБ полностью. Успешная сорбция и десорбция фосфори-лированного белка в условиях, соответствующих классическому металл-аффинному анализу, доказывает возможность использования исследуемых ПЛБ в качестве металл-аффинного сорбента.

Рисунок 2 - Изображения, полученные методом атомно-силовой микроскопии: А - чистая кремниевая подложка; Б - подложка с нанесёнными ПЛБ на основе етеарата железа(Ш); В - подложка с ПЛБ с нанесёнными молекулами казеина, Г - подложка с ПЛБ с нанесённым белком после промывки 0.4 М водным раствором аммиака

Таким образом, полученные ПЛБ на основе етеарата железа(Ш) можно условно обозначить как металл-хелатный сорбент, содержащий железо(Ш) - МХС Fe(III).

Разработка металл-аффинного сорбента на основе оксида железа(Ш)

Для синтеза оксида железа(Ш) был использован модифицированный золь-гель метод соосаждения аморфного прекурсора с дальнейшим самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновой термообработкой с частотой 2.45 ГГц. Уравнение реакции:

2 Fe(NCb)3 + 3 NH2CONH2 -+ Fe203 + 6 NzO +3 C02 + 6 H20

При температуре синтеза (120-150°C) все продукты реакции, за исключением оксида металла, являются газообразными и удаляются из реакционной смеси (в процессе синтеза). Получение оксидов в таких неравновесных условиях обеспечивает пористую структуру и малый размер образующихся частиц. Фазовый состав полученных образцов был определен методом рентгенофазового анализа на дифрактометре Дифрей 401 (Научные приборы, Россия), который подтвердил наличие исключитель-

но рефлексов отражений, соответствующих структуре а-Ре20з, это означает, что препарат представляет собой чистый оксид железа(Ш).

Определение размеров частиц полученного оксида железа(Ш) Определение размеров частиц препарата оксида железа(Ш) было проведено ме-

Рисунок 3 - Изображение образца оксида железа(Ш), полученное методом СЭМ, увеличение в 5068

раз (слева) и 15000 раз (справа)

Согласно полученным данным, образец представляет собой пористую структуру с размером частиц порядка 50-100 нм, которые образуют более крупные агломераты (рисунок 3).

Исследование сорбции фосфорилированного пептида на оксиде железа(Ш) методом МАЫ>1 масс-спектрометрии

Металл-аффинная хроматография в основном применяется в биоорганическом анализе, а именно в такой области, как фосфопротеомика, где объектами исследования являются фосфорилированные пептиды с молекулярными массами от 500 до 3000 Да, полученные в результате ферментативного гидролиза белков. Поэтому в качестве модельного объекта был выбран фосфорилированный пептид с аминокислотной последовательностью 88МОНУ(рУ)ЕКЬ881 и молекулярной массой 1499 Да. Было проведено исследование возможности его выделения из водного образца на полученном оксиде железа(Ш).

Рисунок 4 - МАЬВ1 масс-спектры пептида 88КОНУ(рУ)ЕКЬ881: А - исходный образец, Б - промывка 0.1% ТФУ, В - элюат 0.4М ЫН40Н

Сорбцию пептида проводили в кислой среде (0.1% водный раствор трифторуксусной кислоты), десорбцию проводили с помощью увеличения рН - 0.4 М водным раствором аммиака. В масс-спектре экспериментального образца, полученного после элюирования раствором аммиака был детектирован сигнал, соответствующий протонированной форме пептида (т/г 1500.3). В масс-спектре промывки практически отсутствуют сигналы исследуемого пептида (рисунок 4).

Таким образом, эксперимент, выполненный в таких условиях, полностью доказывает возможность использования синтезированного нанодисперсного оксида железа(Ш), в качестве металл-оксидного сорбента (МОС Ре(Щ».

Определение изоэлектрической точки сорбентов

Одним из параметров, характеризующих свойства поверхности, является электрокинетический потенциал (¿¡-потенциал). Для МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш) были исследованы электрокинетические свойства при концентрации индифферентного фоно-

вого электролита (КС1) 10"3 моль/л на приборе Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания) (рисунок 5). Электрокинетический потенциал рассчитывали по формуле Гельмгольца-Смолуховского без введения дополнительных поправок.

Рисунок 5 — Зависимость электрокинетического потенциала МХС Fe(III) и МОС Fe(III) от рН раствора

В кислой области (рН 1.5-3) поверхность заряжена положительно, на поверхности образуется катион FeSt2+. По мере уменьшения кислотности среды положительный заряд уменьшается и становится равен нулю при рН 3.5 (изо-электрическая точка). При дальнейшем уменьшении кислотности наблюдается рост отрицательного заряда поверхности за счет образования гидратных форм ионов. В случае МОС Fe(III) из рисунка 5 можно определить его изоэлектрическую точку - около рН 5.5.

Таким образом, был сделан вывод, что МХС Fe(III) и МОС Fe(III) можно применять в кислой области рН, поскольку в этом случае поверхность сорбента заряжена положительно, а оптимальными условиями сорбции на исследуемых структурах будут растворы с рН < 3.

Определение удельной поверхности МОС Fe(III)

Удельная поверхность является одной из важнейших характеристик веществ, используемых в качестве сорбентов. Измерения площади и объема пор образцов МОС Fe(III) проводили методом низкотемпературной адсорбции азота на поромере ASAP-2010N (Micrometrics, США). Расчет величины удельной поверхности методом БЭТ производили по результатам измерений в интервале относительных давлений Р/Ро = 0.0-1.0 с использованием БЭТ-уравнения для полимолекулярной адсорбции пара. Зная удельную поверхность исследуемого порошка (SM), можно рассчитать средний диаметр частиц dCp. По результатам вычислений Sya = 60 м2/г, dcp составила 20 нм, что свидетельствует о наноразмерности сорбента.

Исследование изотерм сорбции фосфорилированного белка

Для определения сорбционных свойств была построена изотерма сорбции казеина на МХС Fe(III) и МОС Fe(III). Концентрацию несорбированного белка измеряли по методу Бредфорд (рисунок 6).

Рисунок б — Изотермы сорбции казеина на МХС Fe(III) и МОС Fe(III) при 19°С

В интервале концентраций до 0.0025 мкмоль/мл, то есть в области, наиболее часто используемой в фосфопротеомном анализе, вид изотермы соответствует теории Ленгмюра. Увеличение величины адсорбции при более высоких концентрациях может быть связано с изменением ориентации молекул адсорбируемого растворенного вещества или с образованием второго слоя.

^в рмтеорс МКМОЛЬ/МЛ

На изотерме сорбции казеина на МОС Ре(Н1) видно, что на начальном участке сорбция удовлетворительно может быть описана уравнениями теории Ленгмюра. Адсорбция быстро достигает некоторой предельной величины при низкой концентрации, после чего увеличивается лишь незначительно (происходит насыщение), и наблюдается выход зависимости на плато.

На основании построенных изотерм сорбции можно сделать вывод, что МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш) могут быть использованы в качестве сорбентов для выделения фосфорилированных белков, так как при низких концентрациях аналита наблюдается практически полная сорбция, и выход на плато насыщения наступает при достаточно высоких концентрациях белка в исходном образце.

Термодинамические характеристики сорбции белка

Для расчета основных термодинамических функций процесса сорбции белка казеина на МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш) на изотермах сорбции, полученных ранее, были выбраны четыре концентрации, при которых зависимость выходит на плато, что говорит об установлении равновесия. Сорбцию проводили при добавлением к сорбентам выбранных концентраций белка при трех различных температурах (19°С, 29°С, 39°С) (рисунок 7). Расчет констант адсорбционного процесса проводили по линеаризированному уравнению Ленгмюра и на основе полученных значений рассчитывали стандартные изменения энтальпии и энтропии процесса. Результаты представлены в таблице 1.

С.ритеорт.МКМОЛЬ/МЛ

Рисунок 7 - Изотермы сорбции казеина при 19°С, 29°С, 39°С: А

■ на МХС Ре(Ш), Б - на МОС Ре(Ш)

Сорбент Т, °С К среднее ДН°, кДж/моль среднее ДБ0, Дж/моль-К

МХС Ре(Ш) 19 11607 -139 ±20 89 ± 15

29 53608

39 255740

МОС Ре(Ш) 19 1908 -83 ±16 57 ±9

29 2226

39 2911

Таблица 1 - Значения величин К, АН0 и ДЭ0 при проведении сорбции казеина на МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш) при 19°С, 29°С, 39°С

Усредненные (п=3) значения стандартных изменений энтальпии АН0 и энтропии ДБ0 подтвердили возможность протекания процесса сорбции (таблица 1). Более того, как предел насыщения сорбентов (исходя из изотерм сорбции), так и значения термодинамических параметров сорбции указывают на различную чувствительность сорбентов по отношению к казеину: МХС Ре(ПГ) имеет большую емкость в отношении казеина по сравнению с МОС Ре(Ш).

Определение сорбционной емкости по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSI Важнейшей характеристикой сорбента является его сорбционная емкость, поскольку именно она определяет значимость сорбента для практического применения. В качестве аналита был выбран ранее исследованный фосфорилированный пептид 88№НУ(рУ)ЕКЬ881. Пептид был взят с заведомым избытком, чтобы добиться насыщения сорбента. По его содержанию в проскоке, определенному методом

ВЭЖХ-УФ, рассчитывали сорбционную емкость, которая составила 0.035 ± 0.001 мкмоль/мг для МХС Fe(III) и 0.019 ± 0.002 мкмоль/мг для МОС Fe(III), что значительно превышает емкость коммерческого сорбента PHOS-Select™ Iron Affinity Gel (Sigma Aldrich), содержащего железо(Ш), (до 0.0003 мкмоль/мг).

Изучение специфичности сорбции пептидов, фосфорилированных по различным аминокислотам

В фосфорилированных пептидах остаток фосфорной кислоты может быть присоединен к трем аминокислотам: серину (S), тирозину (Y) и треонину (Т), чаще всего к первым двум. В связи с различием в их структурах, можно ожидать, что пептиды с разными сайтами фосфорилирования будут связываться с изучаемыми сорбентами в различной степени. Были выбраны синтетические фосфорилированные пептиды SSNGHV(pY)EKLSSl (ранее исследованный при определении сорбционной емкости сорбентов) и FGE(pS)AGAAS (отличающиеся тем, к какой аминокислоте присоединен остаток фосфорной группы), а также его нефосфорилированный аналог FGE-SAGAAS. Все три пептида были взяты в равных количествах с заведомым избытком, чтобы по их содержанию в проскоке оценить долю связавшихся с сорбентом пептидов. Общее количество пептидов в 2 раза превышало нагрузку, выбранную при определении сорбционной емкости сорбентов, при том же количестве сорбентов. Усредненные результаты (п=3) представлены в таблице 2.

Таблица 2 — Содержание связавшихся с сорбентом пептидов

Пептид Сорбция относительно начальной нагрузки, %

МХС Fe(III) МОС Fe(III)

SSNGHV(pY)EKLSSI 67 ±2 61 ±2

FGE(pS)AGAAS 52 ±2 70 ±2

FGESAGAAS 9 ± 1 12 ± 1

Действительно, к МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш) исследуемые пептиды имеют различную специфичность: на МХС Ре(Ш) пептид, фосфорилированный по тирозину, сорбируется в более высокой степени, чем фосфорилированный по серину, а на МОС Ре(Ш) ситуация обратная. Нефосфорилированный пептид удерживается слабо в обо-

их случаях.

0.0S ..................

А

Г:

~«~*39*С —Ф—29'C "

Рисунок 8 - Изотермы сорбции пептида SSNGHV(pY)EKLSSl при 19°С, 29°С и 39°С: А - на МХС

Fe(III), Б - на МОС Fe(III)

С, ркгаор» мкмоль/мл

0.06 0.09

р«т»оре< мкмоль/мл

Рисунок 9 - Изотермы сорбции пептида FGE(pS)AGAAS при 19°С, 29°С и 39°С: А - на МХС Fe(III), Б

- на МОС Fe(III)

Таблица 3 - Значения величин К, ДН° и ДЭ0 при проведении сорбции пептидов на МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш) при 19°С, 29°С, 39°С___

Сорбент Пептид Т, °С К среднее ДН°, кДж/моль среднее ДЭ0, Дж/мо ль • К

МХС Ре(Ш) 88ЫОНУ(рУ)ЕКЬ881 19 243 -52 ±2 51 ±5

29 505

39 955

РйЕ(р8)АОАА8 19 114 -6± 1 40 ± 1

29 125

39 135

МОС Ре(Ш) 88МОНУ(рУ)ЕКЬ881 19 108 -23 ±4 42 ±3

29 158

39 202

РСЕ(р8)АОАА8 19 197 -30 ±6 47 ±3

29 325

39 442

Термодинамические расчеты (рисунки 8, 9, таблица 3), проведенные аналогично описанным выше, подтвердили выявленную специфичность сорбентов по отношению к пептидам, фосфорилированным по различным аминокислотам.

Оптимизация условий металл-аффинной хроматографии фосфорилиро-ванных пептидов

Метод металл-аффинной хроматографии позволяет в достаточно широких пределах варьировать условия проведения анализа, исходя из природы аналита и последующих стадий детектирования. В случае фосфопротеомного подхода ключевым параметром успешности обогащения является степень извлечения фосфорилированных пептидов из многокомпонентной смеси.

Был исследован ряд элюентов для десорбции фосфорилированных пептидов с МХС Ре(Ш) на примере пептида 88ЫОНУ(рУ)ЕКЬ881. Помимо классических растворителей для металл-аффинной хроматографии, были опробованы альтернативные подходы, а именно (таблица 4): замещение аналита растворителем родственной структуры (фосфорная кислота); добавление вещества, образующего очень устойчивые комплексы с железом (роданид натрия, трилон Б), способного вытеснить аналит за счет комплексообразования; добавление вещества, которое может вытеснить аналит с сорбента за счет более сильного связывания (перфтороктановая сульфокислота (ПФОС), перфторгексановая кислота, додецилсульфат натрия (ДСН)).

Таблица 4 - Степени извлечения пептида 88ШНУ(рУ)ЕКЬ881 с МХС Ре(Ш) различными элюен-тами

Анализ элюатов был проведен методом ВЭЖХ-УФ (таблица 4). Наилучший результат по степени извлечения был достигнут при использовании 15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина (это означает 15%-е содержание раствора перфтороктановой сульфокислоты в метаноле (концентрация 1 мг/мл) в 0.5% водном растворе пиперидина). Молекула ПФОС содержит большое количество атомов фтора, а также богатую атомами кислорода сульфогруппу, имеющих высокое сродство к атомам железа по принципу Пирсона, что, по-видимому, способствует вытеснению пептида за счет более прочного

Элюент Степень извлечения, %

0.4М Ш4ОН 40 ± 1

15% ПФОС в 0.4М 1ЧН4ОН 59 ±3

5% в 0.4М маон 45 ±2

10% трилон Б в 0.4М ЫН4ОН 44 ±3

0.5% Н3Р04 44 ±2

0.5% пиперидин 63 ±3

15% ПФОС в 0.5% пиперидине 86 ±3

10% н-С6Р|2СООН в 0.5% пиперидине 10± 1

0.05% ДСН в 0.5% пиперидине 13 ±2

0.0005% Н3РО4 в 0.5% пиперидине 12 ± 2

связывания с сорбентом. При использовании 0.5% водного раствора пиперидина без добавок удалось достигнуть степени извлечения лишь 63%. Таким образом, по результатам исследования для увеличения степени извлечения фосфорилированных пептидов была предложена методика последовательного элюирования 0.4 М водным раствором аммиака, 0.5% водным раствором пиперидина и, затем, 15% раствором ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина.

Изучение специфичности сорбции на примере смеси различных фосфорилированных пептидов

Следующим шагом стало исследование более широкого круга пептидов, а именно: смесь 8 пептидов-фрагментов тау-белка, SSNGHV(pY)EKLSSI, FGE(pS)AGAAS, FGESAGAAS, взятых в равных количествах (таблица 5). В качестве сорбента сравнения был выбран коммерческий железосодержащий Iron Affinity Gel. Все сорбенты были взяты в равных количествах по сухой массе.

Таблица 5 - Набор исследованных синтетических пептидов

№ Аминокислотная последовательность пептида P1 [M+H]+

1 SRTPSLPTPPTREPK 10.83 1663.913

IP SRpTPSLPTPPTREPK 7.07 1743.879

1рр SRpTPpSLPTPPTREPK 5.05 1823.846

2 VAVVRTPPKSPSSAK 11.17 1523.891

2р VAVVRpTPPKSPSSAK 8.67 1603.857

2рр VAVVRpTPPKpSPSSAK 6.98 1683.824

3 TDHGAEIVYKSPVVSGDTSPR 5.35 2215.100

Зрр TDHGAEIVYKpSPVVSGDTpSPR 4.03 2375.032

4 FGESAGAAS 4.00 796.345

4р FGEpSAGAAS 3.30 876.314

5р SSNGHVpYEKLSSI 7.82 1500.673

Рисунок 10 - Диаграммы степеней извлечения синтетических пептидов после металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III), МОС Fe(III) и Iron Affinity Gel

Анализ, проведенный методом металл-аффинной хроматографии в оптимизированных условиях с последующим ВЭЖХ-МС детектированием показал, что оба исследуемых сорбента демонстрируют высокую селективность к фосфорилированным пептидам (1р, 1рр, 2р, 2рр, Зрр, 4р, 5р) по сравнению с нефосфорилированными (1, 2, 3, 4) (рисунок 10). Хорошо видно, что последние практически отсутствуют в элюате, тогда как первые имеют сравнительно высокую степень извлечения. При этом существует четкая обратная зависимость между pi пептида и его степенью извлечения. Например, в ряду 2->1->3->4 чем ниже pi, тем выше степень извлечения, а значит и их неспецифическая сорбция. В ряду 2рр->1рр->3рр наблюдается схожая корреляция для МХС Fe(III) и обратная для МОС Fe(III). Это может быть обусловлено большим сродством МХС Fe(III) к анионным пептидам по сравнению с МОС Fe(III). Следует отметить также более высокую специфичность сорбции дифосфорилированных пеп-

тидов по сравнению с монофосфорилированными, причем особенно значимо это проявляется при использовании МХС Ре(Ш).

Сорбент сравнения в целом проявляет аналогичную специфичность по отношению к разной степени фосфорилирования каждого пептида, однако, степени извлечения при его использовании существенно ниже.

Металл-аффинная хроматография триптического гидролизата казеина

Казеин является нативно фосфорилированным белком, и поэтому его удобно использовать в качестве модельного объекта для металл-аффинной хроматографии. Поскольку содержание фосфорилированных пептидов в его триптическом гидролиза-те составляет не более 5% от общего числа пептидов (а нефосфорилированные пептиды способны неспецифично сорбироваться за счет других кислотных функциональных групп), необходимо использовать достаточное количество сорбента, чтобы избежать его пересыщения. Был проведен ряд экспериментов по подбору оптимального соотношения сорбент:аналит, оказавшегося равным 310:1. Для одного из фосфорилированных пептидов (Р0(р8)ЕЕ000>ТЕОЕЬ0ОК), было проведено сравнение степени извлечения при параллельном и последовательном элюировании тремя растворителями (0.4М водный раствор аммиака, 0.5% водный раствор пиперидина, 15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина, детектирование пептида методом ВЭЖХ-МС, рисунок 11).

FQ.pSEEQQQ.TEDE LQDK

сорбент : аналит 310:1

FQpSEEQQQTEDELQDK

сорбент : аналит 310:1

0МХС Fe(lll) «мое Fe(lll)

Проскок Промывка

0.4 М NH40H

0.5% 15%

пиперидин ПФОС/О.5% пиперидин

I J 5 i s с I

1 Ii

= □ ¡¡jjjl

Рисунок 11 - Диаграммы степеней извлечения пептида Р0(р8)ЕЕ(20(2ТЕОЕЬСЮК в различных фракциях при проведении металл-аффинной хроматографии на МХС Ре(Ш) и МОС Ре(Ш): А — последовательное элюирование; Б — параллельное элюирование

Как в случае МХС, так и в случае МОС суммарная степень извлечения пептида, фосфорилированного по серину, при последовательном элюировании превышает степень извлечения при элюировании любым из растворителей, поскольку при таком подходе процесс десорбции проходит с участием различных механизмов.

РЦрЗЕЕааЦТЕОЕЩОК

сорбент : аналит 310:1

100?6 am 60% 40Si 20%

Рисунок 12 — Диаграмма степеней извлечения пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK при проведении металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(III), МОС Fe(III) и Iron Affinity Gel

Iron Gel Iron Gel 8000:1

После установления оптимальных условий десорбции фосфорилированных пептидов, следующим этапом стало проведение металл-аффинной хроматографии триптического гидролизата казеина на трех сорбентах (МХС Fe(III), МОС Fe(III) и сорбент сравнения PHOS-Select™ Iron Affinity

Gel). Для пептида FQ(pS)EEQQQTEDELQDK степени извлечения на изучаемых сорбентах составили 70-80% при низких потерях вследствие неудерживания (проскок) или сильного удерживания (потери) на сорбенте (рисунок 12). Более того, в случае пептида ТVDME(pS)TEVFTK степень извлечения достигла 95%. Коммерческий сорбент продемонстрировал крайне низкие степени извлечения.

Стоит заметить, что все сорбенты были взяты в равном количестве по массе, в случае коммерческого сорбента это количество было меньше рекомендованного производителем. Однако, даже при существенном увеличении количества коммерческого сорбента степень извлечения не превысила значения для МХС Fe(III) и МОС Fe(III) (рисунок 12.А). Это говорит о более эффективном выделении фосфорилированных пептидов на разработанных сорбентах.

Выделение пептидов альбумина, модифицированных остатком зарина

В последние годы успешно проводятся работы по разработке методик извлечения из биологических образцов фосфонилированных пептидов с использованием метода металл-аффинной хроматографии. Одним из применяемых в этих целях сорбентов является коммерческий гель PHOS-Select™ Iron Affinity Gel, содержащий желе-зо(Ш). Следовательно, можно было ожидать, что МХС Fe(IH) и МОС Fe(III) также способны селективно сорбировать из сложных смесей не только фосфорилированные, но и фосфонилированные пептиды.

Рисунок 13 - Масс-спектр образца, содержащего гидролизат сывороточного альбумина человека, обработанного зарином в концентрации 0.1 мг/мл: А -до металл-аффинной хроматографии; Б - после металл-аффинной хроматографии на МХС Fe(HI) (элюирование 0.5% водным раствором пиперидина); В - после металл-аффинной хроматографии на МОС Fe(III) (элюирование 15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина)

lvry TKKVPQVST В пептическом гидролизате сывороточного альбумина человека, модифицированного зарином, могут присутствовать два пептида, содержащие тирозин-411, модифицированный остатком зарина (сдвиг массы относительно нативных пептидов составляет 120 Да): LVRY3aP„„TKKVPQVST (m/z 1638.9) и VRY3aP„„TKKVPQVST (m/z 1525.8) Следует отметить, что при низкой интенсивности искомых сигналов в масс-спектре гидролизата (рисунок 13.А), после металл-аффинной экстракции сигналы, соответствующие аддуктам, становятся мажорными компонентами спектра (рисунок 13.Б). Наличие модификации в пептидах было доказано методом тандемной масс-спектрометрии по отщеплению нейтральной частицы. Практически полное отсутствие примесных сигналов свидетельствует о высоком уровне специфичности МХС Fe(III) к фосфонилированным пептидам. Аналогичные результаты были получены и при использовании МОС Fe(III), элюент - 15% ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина.

Выводы

1. Впервые показана возможность использования коллапсированных монослоев пленок Ленгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(Ш) - МХС Fe(lII) - в качестве сорбентов для металл-аффинной хроматографии.

2. Впервые золь-гель методом с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением, были получены наноразмерные

1400 1500 1600 1700 1800

структуры на основе оксида железа(Ш) - МОС Fe(III). Установлено, что размер полученных частиц составляет 50-100 нм. Показана возможность их использования в качестве металл-аффинных сорбентов.

3. Изучены структуры поверхности сорбентов методом сканирующей электронной микроскопии. Определены физико-химические свойства полученных структур МХС Fe(III) и МОС Fe(III): удельная поверхность (15 и 60 м2/г соответственно), изо-электрическая точка (pH 3.5 и 5.5 соответственно).

4. Определена сорбционная емкость МХС Fe(III) и МОС Fe(III) по пептиду SSNGHV(pY)EKLSSI (0.035 и 0.019 мкмоль/мг соответственно), изучены изотермы сорбции белка казеина быка (casein Bos Taurus) и фосфорилированных пептидов, показано, что они соответствуют теории Ленгмюра.

5. Оптимизированы условия выделения фосфорилированных пептидов с целью повышения селективности анализа. Показано, что добавление перфтороктановой сульфокислоты к элюенту приводит к улучшению десорбции фосфорилированных пептидов с разработанных сорбентов и, соответственно, повышению степени их извлечения.

6. Показана возможность использования разработанных сорбентов в фосфопро-теомном анализе, исследованы специфичность и селективность сорбентов на примере фосфорилированных триптических пептидов казеина быка и синтетических пептидов, фосфорилированным по различным аминокислотам. Показано, что разработанные сорбенты обладают высокой селективностью и могут быть применены для анализа биологических образцов.

7. Впервые показана возможность селективного выделения аддуктов зарина с пептидами сывороточного альбумина человека методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих железо(Ш).

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК: 1. Гладилович В.Д., Федорова A.B., Подольская Е.П. Металл-оксидный сорбент на основе РегОз. Получение, изучение поверхностных и сорбционных свойств // Научное приборостроение. 2013. Т. 23. N 4. С. 63-65.

2. Кельциева O.A., Гладилович В.Д., Прусаков А.Н., Колоницкий П.Д., Суходолов Н.Г., Селютин A.A., Краснов Н.В., Бонитенко Е.Ю., Подольская Е.П. Регулярные мультимолекулярные сорбенты (МХС). Получение, изучение поверхностных и сорбционных свойств // Научное приборостроение. 2012. Т. 22. N 4. С. 50-55.

3. Гладилович В.Д., Шрейнер Е.В., Дубровский Я.А., Колоницкий П.Д., Краснов К.А., Бабаина Е.В., Мурашко Е.А., Бабаков В.Н., Кельциева O.A., Краснов И.А., Ануров М.С., Русских Я.В., Чернова E.H., Жаковская З.А., Суходолов Н.Г., Селютин A.A., Александрова M.JL, Подольская Е.П. Исследование специфичных свойств регулярного мультимолекулярного сорбента Fe(III) // Научное приборостроение. 2013. Т. 23. N 1.С. 106-114.

4. Суходолов Н.Г., Гладилович В.Д., Колоницкий П.Д., Шрейнер Е.В., Янкло-вич А.И., Селютин A.A., Краснов Н.В., Подольская Е.П. Исследование электрокинетических свойств регулярных мультимолекулярных сорбентов на основе стеаратов трехвалентных металлов // Научное приборостроение. 2013. Т. 23. N 1. С. 123-129.

Другие публикации по теме диссертационного исследования:

5. Колоницкий П.Д., Шрейнер Е.В., Гладилович В.Д., Суходолов Н.Г., Подольская Е.П. Адсорбция казеина на регулярных мультимолекулярных структурах, содержащих ионы трехвалентных металлов // Сборник материалов с Всероссийской Молодёжной Конференции: «Химия поверхности и нанотехнология». г. Казань, 2012 г. С. 88.

6. Гладилович В.Д., Суходолов Н.Г., Селютин A.A., Александрова М.Л., Фролов A.A., Подольская Е.П. Новые металл-аффинные сорбенты, содержащие ионы же-леза(Ш) и возможности их применения в фосфопротеомном анализе // Сборник тези-

сов II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, 2012. С. 270-271.

7. Шрейнер Е.В., Гладилович В.Д., Суходолов Н.Г., Подольская Е.П. Исследование поверхностных и сорбционных свойств регулярных мультимолекулярных структур на основе стеарата железа (III) // VII Всероссийская конференция молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматери-алам «Менделеев 2013», Санкт-Петербург, 2013.

8. Подольская Е.П., Гладилович В.Д., Шрейнер Е.В., Мурашко Е.А., Кельциева O.A., Чернова E.H., Суходолов Н.Г., Селютин A.A., Краснов Н.В., Александрова М.Л., Бонитенко Е.Ю. Новые металл-аффинные сорбенты, содержащие железо(Ш), для выделения фосфорилированных пептидов и ряда токсичных соединений // Сборник тезисов IV Междисциплинарной конференции «Биологические активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет, Украина, 2013. С. 403.

9. Гладилович В.Д., Шрейнер Е.В., Колоницкий П.Д., Кельциева O.A., Чернова E.H., Суходолов Н.Г., Селютин A.A., Александрова М.Л., Подольская Е.П. Новые металл-аффинные сорбенты, содержащие ионы железа (III), и возможности их применения в масс-спектрометрическом химическом анализе // V-ая Международная конференция-школа «Фундаментальные вопросы масс-спектрометрии и ее аналитические применения», Санкт-Петербург, 2013. С. 88.

10. Гладилович В.Д., Шрейнер Е.В., Суходолов Н.Г., Селютин A.A., Подольская Е.П. Новые металл-аффинные сорбенты, содержащие ионы железа (III), и возможности их применения в масс-спектрометрическом химическом анализе // VI съезд ВМСО, V Всероссийская конференция с международным участием "Масс-спектрометрия и ее прикладные проблемы", Москва, 2013. С. 61.

Подписано к печати 14.02.14. Формат 60 х 84 'Лб . Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Печать цифровая. Печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 5997.

Отпечатано в Отделе оперативной полиграфии химического факультета СПбГУ 198504, Санкт-Петербург, Старый Петергоф, Университетский пр., 26 Тел.: (812) 428-4043, 428-6919

На правах рукописи

04201456976

Гладилович Владимир Дмитриевич

Разработка новых металл-аффинных сорбентов, содержащих железо(Ш), для решения задач фосфопротеомики

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

02.00.11 - коллоидная химия 02.00.02 - аналитическая химия

Научные руководители: к.х.н., в.н.с Подольская Екатерина Петровна к.х.н., доцент Суходолов Николай Геннадьевич

Санкт-Петербург 2014

Содержание

Введение....................................................................................................................................6

Актуальность темы...................................................................................................................6

Научная новизна работы..........................................................................................................8

Практическая значимость работы...........................................................................................8

Основные положения, выносимые на защиту.......................................................................8

Апробация работы....................................................................................................................9

Публикации...............................................................................................................................9

Благодарности...........................................................................................................................9

1 Обзор литературы.............................................................................................................11

1.1 Металл-аффинная хроматография...........................................................................11

1.1.1 Общие сведения и принцип действия метода металл-аффинной хроматографии.....................................................................................................................11

1.1.2 Сорбенты для металл-аффинной хроматографии.................................................12

1.1.3 Использование металл-аффинной хроматографии в протеомных и фосфопротеомных исследованиях.....................................................................................14

1.2 Фосфопротеомный масс-спектрометрический анализ...........................................19

1.3 Пленки Ленгмюра-Блоджетт....................................................................................20

1.3.1 Основные задачи, решаемые с помощью метода Ленгмюра-Блоджетг.............21

1.3.2 Выбор концентрации соли металла в водной субфазе при получении

пленок Ленгмюра-Блоджетт стеариновой кислоты..........................................................22

1.3.3 Изотермы сжатия пленок Ленгмюра-Блоджетт, содержащих железо(Ш).........22

Цели и задачи исследования..................................................................................................24

2 Материалы и методы........................................................................................................25

2.1 Материалы..................................................................................................................25

2.2 Получение и структурные свойства сорбентов......................................................26

2.2.1 Получение металл-хелатного сорбента (МХС).....................................................26

2.2.2 Определение доли перехода кислоты в соль.........................................................27

2.2.3 Установление структурного звена МХС................................................................28

2.2.4 Атомно-силовая микроскопия................................................................................28

2.2.5 Сканирующая электронная микроскопия..............................................................28

2.2.6 Стандартизация МХС..............................................................................................29

2.2.7 Определение влажности МХС................................................................................29

2.2.8 Синтез металл-оксидного сорбента (МОС)...........................................................29

2.2.9 Определение фазового состава МОС.....................................................................29

2.2.10 Исследование сорбции фосфорилированного пептида на МОС.....................30

2.3 Электрокинетические исследования сорбентов.....................................................30

2.3.1 Определение электрокинетического потенциала МХС методом потенциала течения..............................................................................................................30

2.3.2 Определение электрокинетического потенциала МХС методом микроэлектрофореза............................................................................................................31

2.3.3 Определение электрокинетического потенциала МХС и МОС..........................32

2.4 Определение удельной поверхности сорбентов.....................................................32

2.4.1 Определение удельной поверхности МХС............................................................32

2.4.2 Определение удельной поверхности МОС методом низкотемпературной адсорбции азота....................................................................................................................33

2.4.3 Определение удельной поверхности МОС методом адсорбции красителей.....33

2.5 Исследование изотерм сорбции и сорбционной емкости сорбентов...................34

2.5.1 Определение сорбционной емкости сорбентов по белку.....................................34

2.5.2 Расчет термодинамических характеристик сорбции белка..................................35

2.5.3 Определение сорбционной емкости сорбентов по пептиду.................................36

2.5.4 Расчет термодинамических характеристик сорбции пептидов...........................37

2.5.5 Определение специфичности сорбции на сорбентах...........................................37

2.6 Металл-аффинная хроматография...........................................................................37

2.6.1 Металл-аффинная хроматография фосфорилированного пептида для оптимизации десорбции......................................................................................................37

2.6.2 Металл-аффинная хроматография смеси фосфорилированных и нефосфорилированных пептидов.......................................................................................38

2.6.3 Металл-аффинная хроматография триптического гидролизата казеина............39

2.6.4 Металл-аффинная хроматография гидролизата клеточного лизата НеЬа..........39

2.6.5 Металл-аффинная хроматография пептидов модифицированного зарином альбумина человека.............................................................................................................40

2.7 Масс-спектрометрический и хроматографический анализ...................................40

2.7.1 Качественный масс-спектрометрический анализ методом МАЛДИ..................40

2.7.2 Количественный хроматографический анализ методом ВЭЖХ-УФ..................41

2.7.3 Количественный хромато-масс-спектрометрический анализ методом ВЭЖХ-МС............................................................................................................................41

2.7.4 Качественный хромато-масс-спектрометрический анализ методом

наноВЭЖХ-МС....................................................................................................................42

Результаты и обсуждение................................................................................................43

3.1 Разработка металл-аффинного сорбента на основе пленок Ленгмюра-Блоджетт, состоящих из стеарата железа(Ш)................................................................43

3.1.1 Получение пленок Ленгмюра-Блоджетт на основе стеарата железа(Ш)............43

3.1.2 Исследование структурных звеньев ПЛБ на основе стеарата железа(Ш)..........46

3.1.3 Стандартизация ПЛБ на основе стеарата железа(Ш)...........................................47

3.1.4 Микроскопические исследования ПЛБ на основе стеарата железа(Ш).............48

3.1.5 Исследование процесса сорбции фосфорилированного белка на ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) методом атомно-силовой микроскопии..............................50

3.1.6 Определение влажности ПЛБ на основе стеарата железа(Ш).............................53

3.2 Разработка металл-аффинного сорбента на основе оксида железа(Ш)...............54

3.2.1 Получение оксида железа(Ш).................................................................................54

3.2.2 Определение фазового состава оксида железа(Ш)...............................................55

3.2.3 Определение размеров частиц оксида железа(Ш)................................................57

3.2.4 Исследование сорбции фосфорилированного пептида на оксиде

железа(Ш) методом МАЛДИ масс-спектрометрии..........................................................58

3.3 Сравнение поверхностных свойств сорбентов.......................................................59

3.3.1 Определение электрокинетического потенциала МХС.......................................59

3.3.2 Определение электрокинетического потенциала МОС.......................................64

3.3.3 Определение удельной поверхности МХС Ре(Ш)................................................65

3.3.4 Определение удельной поверхности МОС Ре(Ш) методом низкотемпературной адсорбции азота...............................................................................66

3.3.5 Определение удельной поверхности МОС Ре(Ш) методом адсорбции красителя...............................................................................................................................67

3.4 Сравнение сорбционных свойств сорбентов..........................................................70

3.4.1 Сорбция белка на МХС Ре(Ш)................................................................................70

3.4.2 Сорбция белка на МОС Ре(Ш)................................................................................71

3.4.3 Термодинамические характеристики сорбции белка...........................................72

3.4.4 Определение сорбционной емкости МХС Ре(Ш).................................................74

3.4.5 Определение сорбционной емкости МОС Ре(Ш).................................................76

3.4.6 Изучение специфичности сорбции пептидов, фосфорилированных по различным аминокислотам.................................................................................................77

3.4.7 Термодинамические характеристики сорбции пептидов.....................................78

3.5 Фосфопротеомный анализ с использованием металл-аффинной хроматографии..................................................................................................................81

3.5.1 Оптимизация условий металл-аффинной хроматографии...................................81

3.5.2 Изучение специфичности сорбции на примере смеси различных фосфорилированных пептидов...........................................................................................83

3.5.3 Оптимизация условий металл-аффинной хроматографии триптического гидролизата казеина.............................................................................................................85

3.5.4 Фосфопротеомный анализ клеточного лизата НеЬа.............................................91

3.5.5 Выделение пептидов альбумина, модифицированных остатком зарина............92

4 Основные результаты.......................................................................................................95

Список сокращений................................................................................................................96

Список литературы.................................................................................................................97

Приложение...........................................................................................................................109

Введение Актуальность темы

Метод получения пленок Ленгмюра-Блоджетт (ПЛБ) позволяет варьировать их свойства, меняя структуру полярной части амфифильной молекулы, состав монослоя, раствора (субфазы) и условия переноса на твердую подложку. Уникальность структур, получаемых по методу Ленгмюра-Блоджетт, обусловила их использование как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях. Комплексная оценка физико-химических и поверхностных свойств ПЛБ позволяет прогнозировать возможность их целенаправленного применения. В последние годы большое внимание уделено исследованиям ПЛБ на основе стеаратов трехвалентных металлов.

Стоит отметить, что трехвалентные металлы являются активными центрами многих металл-аффинных сорбентов. Металл-аффинная хроматография - это метод разделения, основанный на различном сродстве гетероатомов органических соединений к ионам металлов, согласно теории жестких и мягких кислот и оснований Пирсона. В настоящее время известны два типа сорбентов для металл-аффинной хроматографии: а) металл-хелатные на основе ионов металлов (Ре(Ш), Са(Ш), N1(11), Си(П)), хелатированных полидентантными лигандами, иммобилизованными на вспомогательной подложке [1]; б) металл-оксидные на основе оксидов металлов, чаще всего в виде свободных нанопорошков, либо связанные на инертном носителе [2].

Пленки Ленгмюра-Блоджетт или системы, полученные путем диспергирования коллапсированных монослоев стеариновой кислоты, снятых с поверхности водной субфазы, содержащей ионы Ре(Ш), имеют поверхность, которая состоит преимущественно из ионов железа, надежно связанных с поверхностью твердого тела. Проведенное ранее [3] масс-спектрометрическое исследование состава ПЛБ на основе стеарата железа(Ш) показало, что основным структурным звеном монослоя является дистеарат железа(Ш). Это позволило сделать предположение о том, что такие структуры могут служить металл-аффинными сорбентами, поскольку третий заместитель при атоме железа может варьироваться, и связь металла с ним слабее, чем с остатками стеариновой кислоты, и за счет координационных взаимодействий иона железа с различными гетероатомами анализируемых соединений возможна их сорбция.

Поиск структур стабильных при проведении процесса хроматографии является важной задачей, и одним из путей ее решения может быть синтез различных материалов с малым размером частиц и, как следствие, высокой величиной удельной поверхности. К таким структурам можно отнести оксиды переходных металлов. Недавно был предложен модифицированный золь-гель метод с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением для получения оксида циркония в нанодисперсном состоянии [4]. Соответственно, можно сделать предположение, что оксид железа(Ш) также может быть синтезирован этим методом, а полученную структуру можно использовать как металл-аффинный сорбент.

Металл-аффинную хроматографию на сорбентах, содержащих железо(Ш), применяют в фосфопротеомике - области протеомики, занимающейся белками и пептидами, содержащими фосфорные группы - в качестве метода высокоселективного и специфичного выделения фосфорилированных соединений [5]. По принципу Пирсона фосфорная группа, богатая атомами кислорода, имеет сродство к атомам железа(Ш). За счет координационных взаимодействий она обратимо связывается с атомом металла, что позволяет в дальнейшем получать образец, обогащенный фосфорилированными соединениями.

Известны коммерчески доступные сорбенты для задач фосфопротеомики, содержащие железо(Ш), однако для них характерен достаточно высокий уровень неспецифичной сорбции и, как следствие, низкая селективность; невозможность получения в лабораторных условиях, а также невозможность использования в аппаратурном оформлении при потоковых анализах. Кроме того, практически отсутствует информация о возможности использования металл-аффинных сорбентов для экстракции фосфонилированных белков и пептидов, содержащих аминокислоты с присоединенными остатками эфира метилфосфоновой кислоты. Именно к таким соединениям можно отнести аддукты белков, в том числе сывороточного альбумина, с фосфорорганическими отравляющими веществами: зарином, зоманом, Ю/х и другими [6]. Специфичное выделение таких аддуктов белков необходимо при ретроспективном химико-токсикологическом анализе для установления факта интоксикации и идентификации отравляющего вещества.

Научная новизна работы

Разработаны и охарактеризованы два новых металл-аффинных сорбента, содержащих трехвалентное железо: коллапсированные монослои стеарата железа(Ш) и нанодисперсные частицы оксида железа(Ш), полученные золь-гель методом с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением. Исследованы структурные и поверхностные свойства новых сорбентов. Показана возможность использования разработанных сорбентов в фосфопротеомном анализе: проведена оптимизация условий металл-аффинной хроматографии, исследована специфичность и селективность сорбентов на примере фос-форилированных триптических пептидов казеина быка и синтетических пептидов, фосфорилированных по различным аминокислотам. Показана возможность селективного выделения аддуктов зарина с сывороточным альбумином человека методом металл-аффинной хроматографии на сорбентах, содержащих трехвалентное железо.

Практическая значимость работы

Созданные металл-аффинные сорбенты могут быть использованы для решения задач фосфопротеомики, что востребовано в таких областях, как медицина, аналитическая химия, биохимия и токсикология.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Регулярная мультимолекулярная структура на основе стеарата железа(Ш), полученная по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующим коллапсированием без переноса на твердую подложку может быть использована в качестве металл-аффинного сорбента (металл-хелатный сорбент - МХС).

2. Золь-гель метод с совместным самораспространяющимся синтезом, индуцированным микроволновым излучением, позволяет получать высокопористые нанодисперсные структуры на основе оксида железа(Ш) с размером частиц 50-100 нм, которые могут быть использованы в качестве металл-аффинного сорбента (металл-оксидный сорбент - МОС).

3. Методика последовательного элюирования 0.4М водным раствором аммиака, 0.5% водным раствором пиперидина, затем 15% раствором ПФОС в 0.5% водном растворе пиперидина повышает степень извлечения фосфорилированных пептидов по сравнению с элюированием любым из перечисленных растворителей.

4. Результаты исследования процесса сорбции фосфорилированных пептидов и белка на полученных сорбентах.

5. Результаты экспериментального исследования селективности и специфичности сорбции фосфорсодержащих пептидов из простых и сложных пептидных смесей при использовании предлагаемых сорбентов.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на: Всероссийской Молодёжной Конференции "Химия поверхности и нанотехнология" (Казань, 2012); II всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2012); VII Всероссийской конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по химии и наноматериалам «Менделеев 2013» (Санкт-Петербург, 2013); IV Междисциплинарной конференции «Биологические активные вещества и материалы: фундаментальные и прикладные вопросы получения и �