Хроматография белковых факторов гемостаза тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РГ6 од

9 АВГ 1993

Московсгсай государственный университет им.М.В.Лоизнпсова Химический факультет

На правах рукописи

ГАЙД1

АНАТОЛИИ ВЛАДИМИРОВЕН

УДК 577.15.07, 577.156

ШЖГОГРАФИЯ БЕЛКОВЫХ ФАКТОРОВ ГЕМ0С2АЗА

Специальность: 02.00.10 -• Оиоорганичэская химия, химия природных и физиологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ - в фзрмэ научного доклада на соискание ученой стедани доктора химических наук

МОСКВА - 19ЭЗ

Работа выполнена в Львовском филиале Киевского научно-ясслэдо-ватольского института гематологии и переливания крови.

Научный консультант г

доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, вёдсдаа "нау^ша~сотрудаак

доктор биологических наук, старший научный сотрудник'

доктор химических наук, старшдй научный сотрудник

CTEÎIAHG3 В-М.

ОГЛОБЛИНА О.Г. БАСКОВА И.П. РУШ1 Л.Д.

Ведуиев учрездэние: Гематологический научный центр РАМН

. Защдта состоится 1993 г. в '"* час, на гэс&данзи

специализированного ученого совета Д 053.05.47 по хшичзскзам наукам при псковском государственном университете им.М.В.Ломоносова ш адресу: ГСП II9899, г.Москва, Ленинские Горы, МГУ, Лабораторный корпус "к", ауд. 502.

Сдиссертацией можно ознакомиться - в библиотеке Химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова .. -

Диссертация разослана /¿¿У^^Едэз г.

Ученый с&кр&тарь спедиал^з^овазного

Общая характеристика работы Актуальность проблемы.

Развитие современных методов диагностики различных нарушений свертывающей и фябринолитической системы крови, которые часто сопровождают различные заболевания (например, раковые), или сами являются причиной заболеваний (например, гемофилии), невозможно без очищенных белковых факторов гемостаза, таких например, как Тромбин, тромбопла-стин, плазминоген, шгазмин, урокиназа. В последнее время значительно возрос интерес к методам прямого определения белковых факторов, принимающих участие во-первых, в тромбообразовании (протромбин, тромбин, т.наз. белки PIVKA - бедки, синтезированные в присутствии антивитаминов К, антлтромбин Ш. фибриноген и продукты его деградации) и, во-вторых в растворении сгустков (шшшногвн, его активаторы, плазмин и его ингибиторы). Зтот интерес вызван, с одной стороны, широким применением разных корректирувдих препаратов (природные и генно-инженерные активаторы и ингибиторы свертывания и фибрзнолиза, отдельные факторы свертывания), использование которых невозможно без постянной количественной оценки их уровня в плазме или сыворотке больного, а с другой стороны тем,, что именно зти методы дают возможность осуществлять быструю и точную диагностику различных тромбо-эмболических осложнений, в частности, прединфарктшх состояний, инфарктов, инсультов, легочных и других эмболий и т.п., которые на сегодняшний дань являются причиной значительного количества летальных исходов. Кроме того. Чернобыльская катастрофа в Украине привела к значительному росту различных заболеваний, особенно раковых (и гематологических. ' .'

В основе методов функционального определения факторов свертывания или фибрзнолиза лежит воспроизведение In vitro процесссз свертывания или фибринолиза, протеканцих в плазме крови, при Помощи очищенных белковых факторов CHareed J. et al. 1982, BiclcE.l., 1982]. При этом количественные различия в' протекании этих процессов с ис- , пользованием плазмы больного в сравнении с контролем (нормой), дает возможность выявить и количественно оценить те или другие нарушения гемостаза. Для осуществления таких исследований в мировой практике используют, наряду с другими, очшцэвдаэ препараты тромбина и тром-бопластлна, которые являются кличввыми реактивами при -определении фибриногена, антитромбина Ш, протрстлбшового и тромбигового времени плазмы, белков PIVXA и т.п., а также очищенные препараты нлазминоге-на, плазминэ и урокиназы, без которых практически нэвсзможзэ определить такие показатели, как уровень олазмишгеаа, активаторов и тага-

-:--- 2

биторов фибршолиза. Однако, до начала наша исследований (1982) отечественная промышленность аз владела методами получения указанных препаратов, а сами препараты промышгешо-не изготовлялась. Очевидно, что для внедрения таких методов в практику, а также для создания новых функциональных методов анализа, необходимо, прежде всего, создать методы препаративного получения очзвденвых белковых препаратов, пригодных для применения в клинической диагностике, изучить полуденные препарата и проверить их. действие при диагностике различных нарушений в системе гемостаза.

Наиболее эффективными методами получения очинённых белковых препаратов крови являются различные хроматографическяе методы, базирующееся аа использовании производных целлвлозы, агарозы или синтетических органических полимеров. Неорганические полимеры (сшшроми, сзлвкагвлж, макропористое стекло) имеет достаточную порястисть и развитую поверхность, стойки к действию механических, химических . и биологических факторов, дот них достаточно основательно разработаны, метода химической мрдефЕсзщи поверхности С Лисичкин Г.В. и др., 1985], однако, до начала наших исследований (1982) вопрос о использовании их для очистка белковых факторов гемостаза в научной _ литературе не ставился.

Хроматографаческое исследование таких сорбентов, дадифшшрован-ных лигандаш разной специфичности, позволило бы выявить' новые возможности в фракционировании плазш крови с целью получения очищенных белковых препаратов.

Указанные проблема и определяет актуальность предпринятого исследования.

Щзль работы.'

Целью проведенных исследований было получение модифицированных кремнеземных сорбентов для выделения некоторых белковых факторов гемостаза, а именно, тромбина, тромбошгастина, плазмина, плазминогена и урогсиназы, и их громатографичаское изучение.

Для достижения этой цели были" поставлены следующие задачи: :

- разработка способа модификации кремнезегдных носителей с целью создания бяоспэцафаческих и гель-фильтрационных сорбентов для получения очищенных препаратов тромбина, тpoмбoшIacтинai, урокизазы, плазминогена и шшзмина.

- выявление основных закономерностей сорбции и десорбции тромбина, тромбозластана, урокиназы, плазминогена и плазмша. на . созданных сорбентах.

разработка методов получения указанных белковых препаратов с «¡пользованием созданных сорбентов из, утильного сырья (осадок фракции Ш Кона донорской плазмы). .

- изучение свойств подученных белковых препаратов и возможности гспользования их в клинйчвской лабораторной практике.

- разработка способа получения субстрата для определения фибри-згалитической активности на основе фибрина, модифицированного красителями. :

- изучение основных физико-химических свойств, кинетических параметров гидролиза полученных модифицированных фибринов и возможности использования их в качестве субстратов для определения фибриноли-гической активности.

Научная новизна.

1. Впервые продемонстрирована возможность использования кодифицированных кремнеземных соро'ентов для получения белков крови. Путем ковалентной модификации кремнеземных носителей впервые получен ряд новых биоспецифичных сорбентов для выделения тромбина, плазминогена, □лазмина та урокинагн, содержащих в качестве биоспецифачвых лигандов с-хлорбензильные и п-феналборонатные группы, остатки Ь-Хуэ, Ь-йг^, гексаметшюндивмин, а такзэ антибиотики-полшептида грамицидин с и бацитрациа. Впервые разработан метод активации гидроксильных груш на поверхности модифицированного кремнезема при помощи тозилхлорада, позволяющий проводить ковалентвуи иммобилизации биологически-активных соединений в "мягких" условиях (рН 7-8, комнатная температура).

2. Изучена закономерность сорбции протеизаз на иммобилизованных бацитрацине и грамицидине С. Впервые показано, что сорбция протеиназ на таких сорбентах полностью' определяется способом иммобилизации ли-ганда и зависит от рН.

3. Впервые установлено наличие в молекуле плазминогена центров специфического связывания с п-хлорбензильными и п-фенилборонатнымя группами, а также с бацятрацином и грамицидином С. Аффияно-хромато-графическам анализом фрагментов плазминогена установлено размещение этих центров в молекуле плазминогена.

4. С использованием биоспецифических кремнеземных сорбентов создана технология препаративного получения тромбина, плазминогена, плазмина и урокшазы. Для этого в качестве исходного сырья использовали осадок фракции ШШ (Ш) Кона донорской плазмы и мочу человека.

5. Впервые осуществлен синтез кремнеземных сорбентов, содержащих на поверхности гидроксильные группы, и проанализирована природ-

ность таких сорбентов для гель-фильтрационцой очистки трокбошгасти-на кадавершго мозга человека. Предложен метод оценки степени чистоты препаратов тромбопластша и разработана технология получения очищенных препаратов тромбопластша.

6. Вшрвыэ получены субстраты для. определения фибринолитичэской активности на основе фибрина, ковалентш и нековалвнтно модифицированного красителями, а тага© п-даазабешодсульфэкислотой (азск^б-рш), я осуществлено их сравнительное изучение.

7. С использованием азофибрина созданы новые мэтода определения фибршолитаческой активности, плазминогена, активаторов и ингибиторов фибршолиза. .

Практическая значимость работы.

Разработаны метода ковалентного закрепления на поверхности кремнеземов органических и природных соединений, что позволяет осуществлять целенаправленный синтез сорбентов для гель-фильтрации а бйосяэ1£ф1чэск'ой хроматографии. На осшвв полученных биоспецифа-ческих сорбентов создана технология препаративного получения очищенных препаратов тромбина и плазминогена (шшзминз) из осадка фракции П+Ш (Ш) Кона донорской плазма и урокяназы из' шчи человека. Созданная технология позволяет получать препараты с высоким выходом по активности (60-80%) и высокой степени чистоты. На основе полученных' сорбентов для гель-фильтрации разработана технология препаративного получения очищенного препарата тромбопластша из, кадаверкого мозга человека. Изучены условия лиофильного высушивания и хранения препаратов.

■ Создана технология получения азофабрина путем коваленяной мода- ., фахации фибрина (фракции I Кона) п-даазобензолсулъфокислотой, Разработана методы определения фабридалитаческой активности с использованием азофибрина. ^ . .'

Продемонстрована возможность использования в клинической' диагностике препаратов тромбина, тромбопластша, пдазмина, урокиназы и азофибрина как в виде отдельных реактивов, так и в составе наборов для определения протроиОинового и тромбинового времени' и времени -рекальцификациз, уровня белков РСТКА, антитромбина Щ, продуктов деградации фибрина/фибриногена, фибрдаолаткческой активности плазмы, плазминогена, активаторов . и ингибиторов фибринолиза, урокиназшй активности мочи.

Серийный выпуск кремнеземных сорбентов - биоспецифических сор-

бентов, содержащих остатки Ь-Хуз, L-¿rg, бацитрацша и грамицидина С, сорбентов, активированных тозилхлоридом и сорбентов дам. гель-фильтрации налажен на совместном российско-австрийско-германском предприятии "БгаХимМак" (г.Москез, Россия). Серийный выпуск препаратов тромбина, тромбопластана, плазминогепа, плазмияа, урокиназы, азофибрина, а так- же наборов, в состав которых входят указанные препараты, налажен на научно-производственной фирме "Симко" (г.Львов, Украина) и малом научно-производственном предприятии "БиоМарк" (г.Львов, Украина).

Апробация работы.

Основные результата работы представлялись на I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983), Ш Всесоюзном съезде врачей-лябораатов (Москва, 1965), П Украинском съезде гематологов и трансфузиологов (Киев, 1935), Всесоюзном симпозиуме "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1985), Всесоюзном совещании по сорбентам для хроматографии (Косов, 1985), Всесоэзяой конференции "Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике" (Москва, 1987), 17 Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии. (Алма-Ата, 1987), V Украинском биохимическом съезде (Евано-йражовск, 1987), Ш Всесоюзной научно-практп- ' ческой конференции' "Актуальные проблемы производства . кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и срганотерапевтических препаратов" (Москва, 1987), Республиканской иколе-конферечцни "Структура и функция биополимеров" (Львов, 1988), П Республиканский конференции Литовского республиканского общества гематологов и трансфузиологов (Вильнюс, 1989), I Республиканский конференции ш лектинам . "Изучение и применение лектинов" (Тарту," 1989), Х17 Международном съезде по общей и прикладная химии (Москва, 1989), V Всесоюзном симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматогрвфии (Срмала, 1990), Ш Всесоюзном съезде гематологов и трансфузиологов (Киров, 1991), Ш Симпозиуме по протеолитичвскш ферментам (Москва, 1993). •

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методы получения сорбентов на основе химически модифицированных кремнеземов, пригодных для Оиоспзцифической хроматографии белков крова и гель-фильтрации.

2. Результаты изучения взаимодействия тромбина, урокиназы и плазминогена с полученными биоспецифическими сорбентами. ,

3. Результаты изучения взаиыодействия плазмшогена с биоспеци-фачныш сорбентами, содержащими остатки ингаииторов протеиназ. ,

4. Метода препаративного получения очищенных препаратов тромбина, шгазминогена, длазмина, урокиназы и тромбопластина с применением химически модифицированных кремнеземных сорбентов.

5. Метод получения нового субстрата для определения фибраволи-тжческой активности - азофиОрзна, и результаты изучения его осноел^х ' физико-химических свойств и кинетических параметров 'гидролиза...

6. Результате изучения пригодности полученных препаратов тромбина, тромбопластина, плазмшогена, плазмина, урастназы и азофибрлна для клинической диагностики нарушений системы гемостаза.

Содержание работы.

Синтез сорбентов.

Сорбенты для биоспецифаческай хроматографии.

. К началу наших исследований (1982) сорбэнты на основе модифицированных кремнеземов .имела ограниченное применение в биосгоцвфичес-кой хроматографии белков, а метода их химической модификации были разработаны недостаточно. Основные трудности, сдвраававдие игроков применение кремнеземов, были связаны с предотвращением нзспопифической сорйцги белков плазмы крови на остатках сшгашльных групп (Б1-СН), нейтрализовать которую было довольно тяжело. .В то же зремя, взаимодействие белков с биоспецифическими сорбентами на основе орга-ноползмврных носителей было изучено значитэльно лучше, а ' сами сорбенты интенсивно синтезировались и изучались широким кругом исследователей.

Биоспецифическая хроматография оказалась самым эффективным методом в частности при получении очищенных препаратов тромбина чело-веха, сериновой протеиназы тршкшшвого типа СНаПоп Н.У/. ег а1., 1976, Грачева Н;А.'"и др., 1581К.а также плазмшогена [Бе^асЬ Б.С., Иег1;г Е.1., 19Т0]. При получении тромбина в качестве лигандов ис-шльзоряли ингибиторы тромбина . - и-игорбензиламиа и п-аманобенз-амидин; ашшкислоты, отвачащие специфичности тромбина - Ъ-Ъуэ и Ь-Aгg, а также алифатические а,м-диамша, содержащие не менее ' 4 метиле новых звеньев. Для получения плазмшогена использовали преимущественно сорбенты с иммобилизованным Ь-Ъуз, который способен взаимодействовать со специфичными структурами молекулы шгазминогена -т.наз. лкзии-связывавздиш петлями или кринглами Шагкиз -а!..

1979 Г.

Схема I. Синтвз Оиуспецифических сорбентов

| I

с1 у -s;oax3sicch23i,ci »h2n-r -si02 3csicch2 33nhr

1 -HCl 1 '*

где nha*-r - L-t.yo, L-Arg, ГВКСЭМеТИЛеНДИаМИН ИЛИ П-ХЛОрббНЗИЛОВЫЙ эфир £ -емЕыокапроновоЗ кислоты

„I ' I

С2> -si033ösicch2i3NH2 * n-br-ch2ceh„ci ^si02x)sicch233nhch2cehhci 1 -НВг 1

1 I

13 5 -S i С2 30S ¡С СН; Э3ОСН2СК-СН2 * H2N-R ■* -S; D2 30S ¡С СН2 330СН2ГНСН2МНЯ

1 V . ' ¿н

где nh2-r - l-lya, п(ш-5минометан)фе&илборная кислота, сзцитра-■ цш ш грамицидин С

i ня0 i

:4) -si0230sicch233öch2ch-ch2 + -EI023aSiCCHa :>3осн2снсон:сн2он -■*

1 V" "а00» 1

rV-CH3CEH,,G02fcl I

-S i Э2 XIS i С CH2 Э3ОСН2СНС OH XH20S02CBH»CH3-n -HCl 1

I

1

H2N-Fol ypcplido-t.H2 -S IOv JOSiСCH2 3aOCHaCHCOHXH2NH.

■+ . yF'o I ypap L i во

"h'-CH3CfeHBS02bH -S:C2 >0S i С CH2 >aOCH2CK OH DCHiNH

где h2N"Poi yii>epiic!e^NH2 - грамицидин С ¿пи бацитрацин

i tHMo2i i n-cH3ceHwse2c:

5 5 -Si02X3SiCCH2>3NH2 + -Si D2 x5s.CCH, 530H •»

1 -M2 1 -HCl

I H2N-Polypeplido-NHj

. -S!02 JOSKCH, >3OSC,CEH,,CH,-n *■

1 . - • -h"CH3CcH1,S020H

I

-S;O2^S:CCH2 I3NH4

PoI vpcpLide

-s;o2 ->CSKCH2 J3NH где h2n-poIypcoLidä-nha - грамицидин С лли бацитрацин

Кроме того, нами ранве было показано, ,что п-(ы-аминемэтил)фэ-нилборная кислота, а также циклические антибиотики-шлипептиды баци-трацин и грамицидин С являются конкурентными ингибиторами серинових протеиназ и могут использоваться в качества лигандов при получении протеияаз путем биоспецифической хроматографии Герату 7.Ы." еЬ а1., 1931]. При этог" в качестве носителей гаюльзовались кремнеземные сорбенты - силохромы и с-иликагели.

Поэтому было решено разработать методы иммобилизации разных лигандов на кремнеземах и получить с и: помощью кремнеземные сорбенты, содержаще закрепленные на поверхности остатки п-хлорбензильных груш, п-(ы-амзномзтил)фен51лборную кислоту, Ь-Ъуз,, Ь-Агв, гексамета-лендиамин, а также циклические антибиотики-полшвптиды бацитрацин и грамицидин С, и изучить их взаимодействие с протзиназами, в частности тромбином и урокиназой, а также плазшногеном.

Для получения сорбентов использовали коммерческие препараты • грамицидина С, бацитрацина,. Ъ-1уз, Ь-Аг^ и гексаметилендиаминз. п-ХлорббЕЗИЛбромад, п-хлорбензиловый эфир е-аминокапроновой кислоты и. п(ш-аминомеган)фенилборную кислоту, сщтезировали, используя известные литературные методики. В качестве кремнеземных носителей использовали силохромы С-80 и С-120 (средний диаметр пор соответственно 44 и 65 нм).

Общий принцип получения сорбентов заключался в- модификации кремнеземной поверхности коммерческими креьшийорганичесгаши модификаторами, такими как у-бром(хлор)пропилтрихлорсилан, ^-глицддоок-сшрошлтризтоксисилан или ^-амшюпрогшлтриэтоксисилан, с последующим ковалентным присоединением лигандов к образованным на поверхности у-бром(хлор)пропильным, у-аминопронильньм или у —глицидоокси-прошльшм грушам (на приведенной ниже схеме синтеза стадия присоединения кремнийорганлческого модификатора опущена). Присоединение лиганда проводили либо непосредственно (реакции 1-3, схема I), либо после предваритель- ной активации гвдроксильных групп (реакции 4 и 5, схема I).

Сорбенты ннод-Рг, Цуо-Рг и Агд-Рг, содержащие в качестве лигандов оеттгкя Ь-Ьуз, 1г-Аг£ и гексачзтилвндиамина получали путем прямого включения лиганда при обработке силохрома, модифицированного у-бром(хлор)прошш>ными группами, водно-органическим раствором лиганда (водагдиоксан 8:1 - 4:1, КоСОд, концентрация лиганда . 0,6 ммоль/г сорбента) в течение 1,5 час при 85-30°С и осторопиом перемешивании (реакция I). Полученный таким способом сорбент промывали водой, ацетоном, эфиром и высушивали на воздухе. Содержание лиганда

б сорбенте определяли по сорбции ионов меди.

Аналогично получали также сорбент па-ЛсР. Однако, учитывая, что лиганд содержит слоакноэфирнув связь, нестойкую в щелочных условиях, иммобилизации проводили в диметилформаг/нде в присутствии пиридина при Ю0°С в течении 5 час. при острожном перемешивании. Содержание лиганда определяли по уменьшению концентрации лиганда в растворе (реакция с тринитробензолсульфокислотой).

Сорбент пС1-рр получали в условиях синтеза сорбента пС1-Аср, используя вместо ?-~бром(хлор)пропилсилохрома г-аминопропилсилохром, к которому прибавляли раствор п-С1-бензалбромида в диметилформамиде (реакция 2). Содержание лиганда в сорбенте определяли по уменьшению концентрации аминогрупп в аминосилохроме по реакции с нингидрином.

Сорбенты цуе-е и рьв получали следующим образом. К кремнеземам,. содержащим на поверхности эпоксигруппы, прибавляли водно-органичес-

Общая характеристика полученных сорбентов приведена в табл.1.

Таблица I.

Свойства полученных сорбентов для биоспецифической хроматографии

Сокращен, обозначен сорбента Структура иммобилизованной группы Метод синтеза Конц-ция лиганда, мкмоль/г

А-Рг -ССНа5,ЫНа 180-230

НМОД-Рг -С СН3 }ЭМНССН2 1 80-120 '

1-ув-Рг -с сн3 Э3МНСНС сна э„мна соон 1 80-120 1

Агд-Рг -с сна Э31ЧНСНС сна соон . ына 1 80-120

1-ув-Е "С СНа 3Э0СН2СНС ОН 5СН3МНСНС сна соон 3 во-120

пС1-Рг -ССН233ЫНСН3СеН»С1-п г 35-45

г>С1 -Дер -ССНа 33ЫНССНа 3ЕСООСН2СеНцС| -п 1 зо-ао

РЬВ -С СН2 ЗэОСНгСНС ОН >СН2МНСН3СБНиВС ОН 12-п 3 30-00

Вс-РгТ СОг-РгТЗ -с сн2 ^Ро 1 урор 11 с*«* -ссн3 }3т 5 0-ю

Вс-Т СОг-Т 3 -С СНа Э3ОСН2СНС ОН >СК2ИН ^Ро1 урерЬ1йе -С СН2 53ОСН2СНС ОН )СН2МН 4 6-10

Вс-Е СБг-ЕЭ -ССНа }3ОСН2СНСОН 5СНаЫН-Ро1 урерЬ! с(е—МНа 3 е-ю

кий щелочной раствор лиганда (вода:диоксан,7:1, К2С03, концентрация лиганда 0,1-0,6 мдаль/Г сорбонта), и выдерживали при ?0°с в течение 1,5 ч при осторожном перемешивании (реакция 3). Содержание лиганда определяли по уменьшению концентрации лиганда в растворе, (реакция о тринитробензолсульфокислотой).

Сорбента вс-е и сг-е получали путем обработки крешеземод, содержащих зпоксагрушш, водным раствором бацнтрацина или спиртовым' раствором грамицидина С при 20°С в течение 3 суток при периодическом перемешивании. Содержание лиганда определяли по результатам аминокис- лотного анализа кислотного гидролиза та навески сорбента.

Сорбенты вз-РгГ, Сг-ргТ, вс-т и Бг-т получали путем обработки водным раствором бацитрацша или спиртовым раствором грамицидина С предварительно активированных п-тодуолеульфохлоридом гидроксаяьшх • груш крешеземного носителя. Гидроксильные группы образовывались вследствие реакции дезаминирования аминопрошльных групп (реакция 5) ши гидролиза эпоксипрошиьныл груш (реакция 4). Реакцию осуществ-, вляли в течение 24-48.ч при 20°С при осторожном перемешивании. После присоединения лиганда остаточные активированные группы блокировали раствором траса или моноэтаноламина. Содержание лиганда определяла по результатам аминокислотного анализа кислотного гидролазата навески сорбента. Для сорбентов Вс-Ргт, бг-ргт, вс-т, сг-т, Вс-е и ог-е. содержащих лиганда с двумя первичными аминогруппами (рис.1),

II

гО-Рпе->1-П в-»А®р-и-Двп

О

Бацатрацан

-г Огп

1еи-0-РЬв-Рго-\/с||

т

Огп

4,

УЫ -Рго-О-РЬе-Ьеи

Грамицидин С

Рас Л. Структура бсцитрацша и грамицидина С.

что теоретически дает им дае возможности иммобилизации - за одну иди за обе амйногрушы, определяли тагов количество аминогрупп, принима-Ждх участие в иммобилизации. Для этого использовали способность те-, •фацкагохйноднметана образовывать ион-радикальные соли, облЕдащие характерны?га спектрами 'электронного диффузного отражения, с первичными, вторичными и третичными аминогруппами. Оказалось (рис.2), что в сорбентах Вс-РгТ,. Сг-РгТ. Вс-т и о-т практически не остается

2,% ' .

100

50

б35 uto 1,30 збо ^птох

Рас.2. Спектры электронного диффузного отражения тетрацианохино-димэтана с вс-е (I) и вс-т (2).

первичных аминогрупп (отсутствие поглощения при 420-430 нм), тогда как в сорбентах Вс-е и бг--е присутствует? как первичные, так и вторичные з'йшогрушш (поглощение при 340-380 , 420-430 и 625-640 нм).

Расчет содержания одно- и двуточечного присоединения лиганда б случае бацитрацина показал, что, например, в 'сорбенте бс-т одноточечное связыванио составляет лишь 20%, тогда как в сорбенте вс-е -IOOifc. т.е., В сорсэнтах Bc-PrT, Gr-Pr7. Вс-Т Й Gr-T лиганды иммоби-лнзованы одновременно за две аминогруппы, а в сорбентах вс-е и gr-E лигазды присоединены к матрице за одну аминогруппу. Таким образом, в зависимости от условий иммобилизации, лиганды, имэнкае две первичные аминогруппы в составе молекулы, могут присоединяться к кремнеземной, матрице яа одву или две "вонкн", что схеМа^ично показано на рис.3.

Оказалось также, что разное присоединение лиганда приводит к разной конформзцаснзой кюбюгьзостй его молекулы. При помощи введения, нитроксилыхых радикальных меток в иммобилизованный бацитрзшы и изучения нйнформаыийннной моплльноск* меток удалось установить, что в случае сорбента е^-т, у которого лиганд присоединен .за' две аминогруппы, подвижность лйгандя значительно ниже чем подаягаость одноточечно иммобтаиззровенного лиганда в сорбенте вс-Е-

г

_I_L_1_I_

d-афп d-aon

<jWa Aep +-- Hja . . A®P *- H|e

, fHa _ II o- Lyo Q-Pho <fHa II и- Lye D-Ph-

CHaCH-CH-cC I O-Glu O-Qrn -»lie . CH3CH-<fH-c£I D-G^u D-"— — "

1ILI " t Т. . С 1IL1 ™ ___

Ив

ñho t-lou

S-DH

hc-si-oh ho-si-oh

I ' I

I I I I 1 I I I II I I II II I II i I I I I i . I I II I I II I I III И I I II i i I I I I I I M'l I 1 I I I i I 1 1 I I I

□-Д^п

_ II e-Lyo D-Phe

CH3CH-ipH-C^J D-Slu D-Orn -+ lie

"X-Leu NH

ho-sí-oh ho-s;-oh

■ I I И I I II I I I 1 П I I II I I i'l I I I 1 I I I П II I П I I t I II I П II I I I M 1 i.11 i II

Рис.3. Возможное одно- и даухточечйое присоединение ляганда

(бацитрацина) t кремнеземному носителю в случав сорбентов вс-е (верхний рисунок) и вс-т (нижний рисунок).

• i

Сорбент о активированными тозилхлоридом гидроксильвымк грушами, образующийся в качестве промежуточного цродукта при получи .таи сорбентов вс-т и Gr-т (реакция 4, схема I), использовался также для," иммобилизации белков. Оказалось, ■ что такая активация приводят к сорбенту, который удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммобилизации белков, а именно, иммобилизация протекает при комнатной температуре, проходят достаточно быътро, приводит к высокому включению белка и не нарушает функциональные свойства иммобилизованного белка. Кроме того, сорбент с^активованными группами сохранял свои свойства при хранении при 20°С в течение года. Кинетика связывания некоторых белков показана на рис.4.

Оказалось, что уже за I час иммобилизуется более 50S общего количества белка, включение которого составляло от 7,5 (лсктин щирицы) до 25 (альбумин) мг/г сорбента. Продемонстрирована шзмож-

яость использования иммобилизованных белков для группового разделения белков сыворотки крови (лектш щирицы) и получения различных генно-инжанерных антигенов (моноклональныв антитела).

Белок в .

растворе, %%

Рис.4. Кг :етака связывания альбумина сыворотки крови (*),

церулоплззмана (#), соевого ингибитора трипсина и лектина щирицы (х) на тозял-активировангом силохроме С-80 При рН 8,0. За ЮОЖ принято: 9,8 мг/мл (альбумин), 3,6 мг/мл (церулоплазмш), 4,0 мг/мл (ингибитор трипсина) и 1,6 мг/кл (лектин). •

Сорбенты для гвль-фильтрации. .

Сорбенты ■ для разделения биологически активных вэществ по размерам белковых молекул известны давно и нашли широкое применение при выделении очищенных белковых препаратов. Основные требования. к таким сорбентам заключается в следующем. Сорбента должны быть ин£;тными к выделяемым веществам (отсутствие неспецкфячной сорбции), . иметь достаточно развитую пористую структуру, характеризоваться хорошими гидродинамическими показателями (скорость потока элюента, устойчивость к гидростатическому напору). Наиболее широко до нача- . да наших исследований применялись сорбенты на основе декстранов (се-фадексы), агярозы (сефзрозэ), полиакриламидного геля (биогель, акри-леке) к им подобные [Турковг Я., 19803. В частности, для выделения очищенного тканевого тромбоплзстина, который широко используется для диагностики система свертывания и представляет собой высокомолекулярный (¡¿,.=300000) липопротевдный комплекс, использовали сефадекс С200 зли сафорозу 4В [¡ШпдаагД й. ег а!.. 19761. Кремнеземные сорбенты практотескл не использовались всло.'.зтвие неспецифичной сорбции на остаточных силанольных группах, хотя сама кремнеземная матрица

м , .

имеет некоторые преимущества перед оргашполимерныда,' 'а именно, большущ механическуш и . биологическую устойчивость, тто вместе с доступностью силохромов и сидикагелай разной пористости делает ее перспективным носителем для создания сорбентов для гель-фильтрации. С цэлыз создания гидрофильной поверхности кремнеземных носителей и устранения неспецяфлчной сорбции наш разработаны следувдие методы модификации:

Метод I. С&яохром, модифицированный ?--глш4идооясипропзлшыми группами, гидролизовали 0,05 н. ^БОд в течение, 2 час при Ю0°С, промывали водой, ацетоном, эфиром и высушивали на воздухе. В полученном сорбенте определяли содержание углерода при помощи элементного анализа. Уравнение реакции приведено в схеме (реакция 4).

Метод 2. Силохром, шдяфяцировазный г-глицидооксшропильнымя группами, промывали абсолютным диоксзшм, добавляли зфират трехфто-рист.го бора и глицерин, выдерживали 5 мин. при 20°С, 30 мин. прогревали при 1С0°С, фильтровали, промывали даоксаном, водой, 5%-ой уксусной кислотой, водой, ацетоном, эфиром и высушивала на воздухе. В полученном сорбенте определяли содержание углерода при помощи элементного анализа.

. При такой модификации на поверхности кремнезема образуется слой гидрсксилышх груш, отдаленных от матрицы "ножкой" примерно' в 6-7 атомов углерода, что, с одной стороны, должно обеспечить .гидрофиль-н ;ть поверхности, а с другой -, экранировать остаточные нвмодифа-гдарованныэ силанольные группы. - >

Основные свойства получении сорбентов приведены в табл.2. -

Марка кремнезема Содержание углерода, %

Метод I • Метод 2

Салохром СХ-2 ПО 1,3 1,45 .

Сшюхром СХ-3 •65 2,2 . 4,8

Салохром С-80 N44 ■ 2,е 3,5

Снликагель КС£-1 24 3,9 4,3

Сллакагель КСК-2 14 5,9 6,8

Силихагель КСС-3 7 6,4 9,3

, Использование подученных сорбентов для выделения очищенных белковых препаратов.

Выделение тромбина.

При фракционировании методами сяиртово-кислотзого осаадения по схеме Кона донорской плазмы на станциях переливания крови образуется так наз. осадок фрзкции С+Ш и осадок фракции Ш, которые содержат основное количество протромбина и плазминогена и которые, по данным литературы, рекомендовано использовать в качестве основного сырья при получении упомянутых белков. . Однако, кроме протромбина и плазминогена в осадках содержится, значительное количество других белков, в частности, липопротеидов и фибриногена, которые значительно ухудшают ' гидродинамические характеристики раствора, повышая його плотность и вязкость и увеличивая вероятность образования сгустков фибрина в процессе очистки. Основные этапы получения тромбина из такого сырья хорошо описаны в литературе [Penton J.W. et al.,. 1977]. Это:

1. Осаждение белковых примесей водорастворимыми полидарами.

2. Сорбция протромбинового комплекса на нерастворимых солях бария.. . . -

3. Десорбция протромбинового комплекса и активация протромбина . . в тромбин. •

4. Хромэтографаческая очистка тромбина. .

На первой стадии описано применение полнатиленгликоля с Mj.^6000, который в концентрации 40 г/л осаждает основное количество примесей, не влияя на активность протромбина. Нами проведено изучение пригодности отечествепого шэ лизтшге нгликоля с 1^4800 (ПЭГ-115, объединение "Варна", Ивано-Франковск) для этой же цели (табл.3).

Оказалось, что при концентрации ПЭГ-115 30-40 г/л образуется неплотный осадок, который тяжело удалить центрифугированием, а при концентрации ПЭГ-115 50-S0 г/л липопротеида достаточно хорошо осах- . даются и их можно-легко удалить центрифугированием прг 3000 g. При этом количество и удельная активность тромбина в подученных раство-г' pax не меньше, чем при использовании ьзрубежянх препаратов полиэтиле нгликоля с большей молекулярной массой. Поэтому именно концентрация ПЭГ'а-П5 50 г/л и была выбрана нами для предварительного осаждения примесей.

Таблица £f.

Влияние концентрации полизтиленгликоля ПЗГ-П5 на выход и активность тромбина (выделение из 100 г осадка П+Ш и Ш)

Осадок П+Ш Осадок Ш

Марка полизтиленгликоля Концентрация, Активность тромбина

г/л удельная, ед.ЮТ/мг общая, ед.МН удельная, ед.ШН/мг общая, ед.ЮТ

loba.Chemie (Австрия) 40 103, V 1 29960 40600'

Merck (Германий) 40 • 109,4 28730 141,8

Serva (Германия) 40 103,4 28200 143,0 40200

ГОГ-П5 20 * * * ■к

ПЭГ-115 30 * . * 142,0 40370

ГОГ-П5 40 100,0 ' 28300 142,0 42200

ПЭГ-115 50 96,0' 28700 139,1 . 40400

ПЭГ-115 . 60 " 100,0 28300 140,0 ■ 38800

Примечания: *— осадок липопротеидов ш образуется

Шказано. также, что, как и следовало ожидать, и удельная активность, и общее количество тромбина больше в растворах, полученных из осадков фракции I (осадок фракции Ш получается из осадка П+Ш при удалении иммуноглобулинов).

. • • К полученному таким образом раствору протромбина ? трис-цитрат-.ном буферном растворе прибавляли раствор хлорида бария, сорбированные белки протромбинового комплекса собирали при центрифугировании, промывали, десорбировали, даализовали, активировали тканевым тромбо-. пластиком кадяверного мозга человека и замораживали. Следует отметить, что замороженный раствор активированного протромбина сохранял болев 90% начальной активности при хранении при -4-в°С в течение 2-3 месяцев, а при его размораживании часть белковых примесей денатурировала и выпадала в осадок. После размораживания я удаления центрифугированием денатурованннх белков раствор, содержащий тромбин с удельной свертывающей активностью от I0Q до 250 ед.ШН/мг, очищали путем биоспвцкфичвской хроматографии при 20°С, используя полученные кремнеземные сорбенты (табл.1). Условия проведения хроматографии были одинаковы,ми для всех сорбентов, а именно, • объем колонки составлял 10 мл (1,5x3,0 см), колонку уравновешивали 0,05 М Трис-НС1/ 0,15 H NaCl, pH 8,0 шш 0,05 М Ка-фосфатным буферным раствором с

. 0,15'И ИаС1, рН 6,0. На колонку наносшш от 20 до 50 тыс. ед.ЮТ тромбина. Поело нанесения раствора сорбент последовательно промывали начальном буферным раствором, 1М раствором КаС1, 0,2555-пым раствором с-аминокапроновой кислоты и 1 М N301 в 20%-ом изопрошловом спирте. Все десорбирущие раств'оры готовили на основе начальных буферных растворов с рН 6,0 и 8,0. В растворе, выходящем из колонки, определяли поглощение при 280 нм, концентрации белка по Брадфорду, в также специфггческув активность гю времени свертывания фибриногена. Чистоту фракций, содержащих тромбин, контролировали методом электрофореза в шшмкриламиднш геле в присутствии длдецилсульфата натрия в системе Лае мили. Типовые профили злщия приведены на рис.5, результаты злектрофоретического разделения - на рис.6 ж 7.

Прежде всего оказалось, что сама кремнеземная матрица, пвэр-цое, способствует более сильному, чем в случав органополимерннх носителей, взаимодействии тромбина с лигавдами. Так, в отличие от органошламеряых носителей, для которых связывание тромбина с лигандами общей формулы Ш2 (СН)ПШ2 реализуется лишь начиная с п = 4 [НаШп М.'Я., ^оесМ Е., 1976], сорбент д-р г, для которого п = 3, прочно связывал тромбин, который десорбировался лишь 1М КаС1 в 20%-ом изопропиловом спиртэ. Для п-хлорбензильных групп раньше было показано, что если длина "ножки", соединяющей хиганд . с . сефарозой, мэньшэ 6 углрродных атомов, . то сорбция тромбина не происходит [Грачева Н.А. и др., 15813. В случае кремнеземного сорбента г>а-Рг "ножка" примерно в 2 раза короче, однако тромбин прочно связывается с ним и при рН 6,0, и при рН 8,0. Возкожно, причиной 'более сильного взаимодействия тромбина с лигандами, иммобилизованными на кремне- • земных носителях, является дополнительное взаимодействие тромбина своим катконным участком связывания, содержании остатки Ъ-Ат£,. с. остаточными отрицательно заряженными, силанольными душами кремнезема. Кроме того, связывание может усиливаться также вследствие большей поверхностной плотности лигаВДа, поскольку площздь поверхности кремнеземных носителей значительно меньше площади' поверхвости той яэ сефарозы . ...

Оказалось также, что увеличение длины "ножки" в сорбенте г>с1 -Дер в сравнении с сорбентом пС1 -Рг (6-7 и 3 углеродных атома соответственно) приводит к уменьшении силы связывания, поскольку с сорбента пс|- д=р тромбин частично десорбируется уже 1М КаС1. Скорее всего, причиной этого может быть "слипание" гидрофобных п-хлор-бензильных груш вследствие наличия длинной гибкой "ножки". Подобное объяснение ранеэ прздлохено .для уменьшения связывания тромбияз с

Активность^

2,0

1,0

2,0

1,0

2,0

1,0

А-Рр

пС1 -Дер

1 * 8 1.У.-РГ

РЬВ

Сг-Т

1-2 5

4. 4, 4,

Лгд-Рг

100.

100

1 3.5

4, 4,-4.

Вс-Т

100

10

го

ю

20

10

20 N0

фракции

Рас.5. Хроматография тромбина на модифицированных кремнеземных сорбентах. Стрелками указана смена здаонта: I - 0,05 М • трис, рН 8,0; 2 - 1 М КаС1; 3- 25%-ный изонропанол; 4 -0,25 м с-амшоканроновая кислота; 5 - I У КаС1/20%гный изонропанол. Столбиками указана суммарная активность тромбина.

ростом вше оптимальной концентрации п-хлорбэнзальных групп, связанных с синтетическим полимером гибкой "ножкой" длиной в II,углеродных атома.[Грачева Н.А. и др., 1981].

Сорбция тромбина и его очистка зависят от рН, при котором осуществляется процесс. Так, при рН 6,0 тромбин в общем связывается хуже, чем при рН 8,0, со всеми изученными сорбентами, а с сорбентами,

Таблица 4.

Очистка тромбоз на кременеземных сорбентах при рН 6,0 и 8,0

Сорбент Удельная активность ед.ШВ/мг бежа Степень очистки. Выход, %% Количество сорбированного тромбина, ед.ШЗ рн

начальная конечная раз

А-Рр 225 700 3,1 43,2 1750 *

HMDA-Pp 190 640 3.35 30,0 •".■ 3000

Lye-Pp 160 690 4,3 80,0 3300'

Apíj-Pp 160 690 4,3 80,0 3300

Lye-E 160 640 4,0 54,0 2025

nCI -Pp 180 730 4,0 60,0 2200

nCI -Дер 180 790 4,4 50,0 1800 .

PhB 150 Н/С 6,0

Be-PpT 150 Й/С .

: Bc-T 150 Н/С

Bc-E 150 н/с

Gp-PpT 150 Н/С

Bp-T 150 . Н/С

Gp-E 150 Н/С ■

A-Pp 225' 945 . .4,2 75,0 ' 3400

HHOA-Pp 190 - . 1050 5,5, 58,0 3500

Lye-Pp Г90 1250 ■ 6,5 100,0 ' 5250 .

Apg-Pp- 225 1400' ' 6,2 63,С 5250

Lye-E 225 1430 6,3 100,0 5370

nCI -Pp 190 ' 1200' 6,3 : 100,0 .'• 4500. .

nCI -Acp 190 . 1000 5,3 93,0 4200 ..

PhB 150 1140 7,6 96,0 3000

Bc-PpT 154 941 6,2 93,0 3300

Bc-T 154 , 1050 7,0. 95,0 3000 ■

Bc-E 154 Н/С

Gr-PrT 154 1700 11,0 78,0 2500 .

Gp-T 154 1750 11,6 80,0 2150

Gp-E 154 ■ Н/С

Примечания: н/с - сорбция тромбина отсутствует'

I 2 3 4 5 6 T 8 9 »11 1213.14

(9

«if * .

Рис.6. Электрофорез препаратов тромбина, полученных хроматографией на сорбентах а-Рр (лунки 2 и 3), нмод-Рг (4 и 5), Lye-Pr (6 и 7), агд-рг (8 и э), пс|-Рг (10 и II) И nCi-acf* (12 и 13) при рН 6,0 (2, 4,6,8,10 и 12) и рН 8,0 (3,5,7,9,11 и 13) в градиентном (T=5-I5%, С=3,5%) МАГ в присутствии 0,135-ного ДЦС-Na. I- исходный активированный гфотромбинованный комплекс, 14 - маркеры мол.масса (IgG - 150 кД, БСА - 68 кД, овальбумин - 43 кД и лизоцам -14,5 кД).

«23436789

»»—fit

é

Рис.7. Электрофорез препаратов громбша, полученных- грома то графив й на сорбентах вс-т (лувки 2-6), gp-t (7 и 8), при рН 7.2 (2,4,7; а рН 8,0 (3,5,8) в градиентном (T=5-I5S, С=3,5%) ПААГ в присутствии 0,135-ного ДЦС-Na. I- исходный ; активированный протромбинованный комплекс, 9 - маркеры мол.массы (Iefl - 150 кД, БСА - 68 кД, овальбумин - 43 КД И лизоцям - 14,5 кД).

содержащими полипептиды грамицидин С и бацитрацян, а тага» фенилбор-нуш кислоту, связывание при рН 6,0 совсем не происходит.

Изучение влияния фешшборной кислота и Оацхтращша на взаимодействие тромбина с фибриногеном при рН 6,0 и 8,0 показало (рис.6), г, с.

что при рН 8,0 бацитрацян и фенилборная кислота являются конкурентными ингибиторами свертывания с К^ 0,645 и 5 мМ.соответственно. При рН 6,0 фенилборная кислота вообще не влияет на активность тромбина, а взаимодействие бацитрациаа с тромбином Приблизительно в. 6 "раз. слабее (Kj=4,ü3 мМ). Известно, что при изменении рН от '6,0 до . 8,0 при рН 7,5 в молекуле тромбина происходят конфоромационвые избиения, сопровождаодиеся болёв высокой степенью экспонирования гидрофобных аминокислотных остатков на поверхности белковой молекулы. При взаимодействии тромбина с иммобилизованными лигандами, вероятно, важнув роль играет гидрофобное взиж>действие (в молекулах грамицидина и бацитрацша содержатся гидрофобные аминокислотные остатки, е — фенилборная кислота содержит гидрофобную бензильную группу). Поэтому, скорее всего, именно конформацаонвые изменения в молекуле тромбина при рЕ 7,5 (приводящие к увеличению, подробности молекулы), и являются причиной различной сорбции тромбина на перечисленных сорбентах при рН 6,0 и 8,0. -

Другим интересным фактом оказалось разное поведение тромбина на сорбентах Вс-РгТ, Вс-Т, Gr-PrT И Gr-Т, с ОДНОЙ стороны, И Вс-Е и Gr-E - с другой- Оказалось, что лиганда, иммобилизованные за одну аминогруппу (сорбенты Вс-Е и Gr-E), не связывают тромбин ни при рН 6,0, ни при рН 8,0, тогда как лигавды, иммобилизованные одновременно за две аминогруппы (сорбенты Вс-РгТ, Ве-Т, Gr-PrT И Gr-T),. Зф|вк-

T2E3D сорбировали тромбин при рН 8,0 (рис.Э).

0 - . 10 20 '- No фракции

Рис.Э. Хроматография тромбина на сорбентах Вс-е (е) и в=-т (т).

Стрелками указана смена злвента. Обозначения см. рис.5.

Такая же зависимость нзблвдалась и в случае протеиназ других классов в другого происхождения, в частности, в случае пепсина свиньи (карбоксильная протеиназя, сорбция, при рН 2,0), трипсина крупного рогатого скота, урокиназы и протеиназы из Thermoactlnoinyces vulgaris - (все - сериновые протеиназы, рН сорбции 8,0) , которые не связывались с ве-Е и Gr-E, однако . специфично, взаимодействовали с Вс-РгТ, Вс-т, Gr—РгТ и Gr-т. При изучении одно- ж двухточечно связанных лигандав нами, было показано, что во втором случве конформационная мобильность лиганда значительно меньше. Возможно, такое более жесткое закрепление лиганда на поверхности кремнэаешой матрицы стабилизирует именно ту конформацдо ингибитора, в которой,он способен взаимодействовать с тромбином (протеиназами). В пользу такого допущения свидетельствует и то, что нативная конформация грамицидша С в растворе характеризуется размещением двух боковых цепей орнитина в одну сторону от полипешэдного кольца, а молекула бацитрацина в растворе стабилизируется ионами двухвалентных металлов, образуя с ними хелатный комплекс, в котором, возможно, принимают участие первичные аминогруппу.

Анализируя результаты, представленные в табл.4 и на рис.5-7, следует заключить, что практически всв полученные нами Оиоспецифи-ческие кремнеземные сорбенты пригодны дня очистки тромбина из зкст-■ рактов фракции П+Ш или Ш Кона донорской плазмы. При последовательной ' десорбции исходным буферным раствором и I М NaCl удается избавиться от значительной части примесей, а десорбция IM NaCl в 205S-om изопро-пшювом спирте специфически десорбирует тромбин. Удельная активность

лученных препаратов тромбина при' этом составляет 1000 - 1750 ;.КШ/мг балка, а выход активного препарата близок к количест-нному. Саше лучшие результаты достигнут при использовании сор-, нгов Бг-РгТ и эг-т, содержащих гаиобилизованный грамицидин С. ©параты, юлучанныв с использованием остальных сорбентов,., харак-ризувтся более низкой удельной активностью и большой. разницы в ■внени очистки мвзду ними нет. Возможно, причиной преимущественной »рбдии тромбина на остатках грамицидина С является наличие в молвите последнего структур, тапЬмтащит специфические послвдователь-)сти в молекуле фибриногена, узнаваедае тромбином. Однако, между )рбвнт8ми HMDA-Pr.Ly.-Pr и др9-рг существует разница в специ-пноети связывания тромбина, на что указывает результаты ре грома-зграфаи тромбина, шлучвнного при помоют сорбента пс»-рг (рчс.Ю)

Гак, дополнительная очистка тромбина достигалась только щи ис-эльзоваша Ly--Pг (при этом удельная активность тромбина ¿рстигала 500 ед.ИШ/мр белке).

О 2 0 го 10 ■„. 20 10 20 Мо

■ ^ и

Рис.10. Рвхро^ятография тромбина на совбентах нмза-Рг, Ly•-Pг и Дгд-рг. Стрелками указана смена алиента. Обозначения см. рис.5.

Следует отметить, что все операции по ' выделении тромбина юущесгБЛЯли при 20°С, что имеет большое значение при очистке тром-¡иаа в прэпаративных масштабах (на станциях переливания крови или шгодах по производству бакпрепарагов).

Разработанная схомэ выделения тромбина на основе сорбента сг-т гспользовалзсь нами для препаративного получения тромбина. В этом хиучае выделение тромбина осуществляли из I кг осадке фракции П+Ш ии.Ш Кона донорской плазмы, используя колонку объемом 500 мл. Выход грсайдаа составлял . 350-400 тыс. едЛйД, ..удельная свертывавдая

активность - 13СО-15Ш ед.ИН/мг бэлка. Ксоользованиэ ■ сорбенте течение длительного периода (I год, около 20 циклов оччстки) нв вы явило изменений в эффективно ста получения тромбина,. что свидетель ствует о пригодности сорбента дая использования в производственны масштабах. ''

, : Получение урокавазы.

Урокяназа - природный активатор шшзминогена, ее стцафачеексе действие известно уже достаточно давно. Основным источником получения природной урокшазы является моча. Обычно пвред стадией биоспэ-цифаческой хроматографии готовят концентрат урокиназы при псмоиз аошбмвяаой хроматографии, поскольку низкая концентрация урокшазы е дача, а такав присутствие солей органических кислот делали прямое применение биосаецифической хроматографии на органояолимершх носителях невозможным. / "

Урокиназа принадлежат к тому жз классу прот8Иназ, что ж тромбин. Это сериновая протеиназа тршсинового типа, которая преимущественно гадролязует белковые субстраты ш пептидным связям, образованным карбоксигрушаш Ь-Хуэ и Поэтому было решено изучать пригодность сорбентов, которые связывали, тромбин, дая получения урокиназа.

Перед хроматографичэской очисткой мочу молодых здоровых кузчан подщелачивали 5 н. растаором НаОЗ да рЕ 8,0 т выдергивали при - 5°С в течение 2 час дет удаления солей органических кислот, " которые образует: щи стоянии мочи мелкозернистый осадок, способный закупорить хроматографичзскув колонку. Подготовленный тагам образом раствор нанс.аии на хромагографическиэ колонки, объемом 10 мл (1,6x6,0 см), заполненные сорбентами пс1-рг, пс1-дср, рьв, в_-г, Вс-Ргт, вг-т г Бг-Рг-т и уравновешенные 0,05 М' трис-НС1, рН 8,0,С' промывали исходным буферным раствором, I М КаС1, 20%-м изопрооиловым спиртом а десорблровали урскиназу I М НаС1 в 20%-ом изопрошшэвом спирте. В растворе, проходящем через колонку, определяли концентрация белка по Ерадфорду а специфическую плазминоген-активаруицув активность. Результата очистки урокинрад приведены в табл. 5 и на • рисЛ1. Г

• Оказалось, что на всех сорбентах, за исключением во-е и йг-е, происходит .эффективная сорбция урокинязы, однако наряду с этим про-исхода связывание большого Количества пигментов, которые в условиях десорбции урокиназы <1М каС1 в 2055-ом изопропзловои спирте) выходят с колонки одновременно с ферментом. Предполагая, что в основе связывания пигментов с ^игаядами лежит яеспеюфгческое гидрофобное ваа-

содействие, мы попытались избирательно десорбкровать пигменты 25% шм раствором нзопропллового спирта Лез соли. Оказалось, что только случае сорбента иг-т. содержащего иммобилизованный грамицидин С, го приводит к полной, десорбции пигментов в не сопровождается десор-дшй урокпн8зы. С остальных сорбентов большая честь пигментов дотировалась только с-ольв с игоарспанолом (т.е. одновремешо с уро~

1яша Активность,%

,0

100

20 No

фракции

Pkc.II- Хроматсгрсфгя урокгаазы при pH 8,0. Стрелками указана -схэва агаээнтЕ. Обозначения см.'pro.5.. ' •

жшзой). Срэда изученных сорбентов дашь Gr-т отличался достаточна ясокай стедэньы от-юяш урокзнззы, тогда как ,дяя остальных сор-Jbhtob этот показатель был значительно некв. Таким образом, как ж в ¡лучае тромбина, для урокннвза наиболее специфичным среда изученных игандов также является грамицидин С. . , • , Таблица 5.

Очистка урэкаеззи мочи нл бзоспецифических кремнеземных сорбентах

Сорбент Удельная активность бд.Ллоугз/мг белка Степень очистки, раз Выход, ЖЕ

начальная конечная

i nCl -Рг .94,8 1200 - -'12,8 62,0

riCI -Дер 94,8 1600 . 17,1 - 70,0

РКВ 94,8 ...'2000 " 21,4 75,0

Вс-Т . ■94,8 2400 . ■ 25,5 56,0

Вс-Е 94,8 : и/с

Ог-Т 94,3 . 4000 * . 42,7 . ео.о

Gi—Е , S4.8 н/с

Исходя т результатов аналитических опытов, . был предлоэв] укрупненный метод получения, который позволил осуществить выделение фермента в одну стадию аз 20 л мочи на колонке объемом 250 мл, заполненной сорбентом Gr-т. Выход активной урокиназы составил прг зтсм около 80%, очистка 20 раз, удельная ' активность '6С0С ед.Шюуга/мг белка. Повторная хроматография этого препарата дозволяет повысить удельную активность до 20000 ед.Шюуга/мг белка.

Таким образом, показано, что для очистки урокипазы можно использовать сорбенты» содержащие иммобилизарованвыэ п-хлорбензильные и п-(ш-аминометш:)фенилСоронатшв группы, а такав остатки голапеп-тидон Сацитрадина и грамицидина С. Наилучшие результаты достигается при использования последнего сорбента, применение которого приводит к получению препарата урокиназы удовлетворительной степени чистоты за одну хрома тогрвфиче скую стадию баз предварительного концентрирована: мочи аонобменной хроматографией. Взаимодействие урокиназы с иммобилизованными на крекааземе лигандамк непосредственно аз жчи еще раз указывает на роль матрицы в усилении взаимодействия фермент-иммобилизованный на крэмнеоэме лигавд. \

' Подучевкэ плазминогвва.

. Известным и широко используемым методом получения пдззкишгена является биоспециЕичесхая хроматография с использованием в качества биосиецифического сорбента L-Ijs-сефэрооы. При этом с остатками Ir-Itfa плазминоген связывается за счет спецафгшых структур, присутствующих в е. о молекуле и называемых "лизиз-связывашими" петлями шш "кранглами". В нашей работе мы решили изучить взаамодейсп is штзмаЕогена с L-I^a-произюдными кремнеземных сорбентов в завися- С" мости от pH а длины "ножи", соединяющей лягаид с матрицей.

Из литературы известно, что основным источником плазманогеаз при фракционировании донорской плазмы методом Кода является фракция П+Ш (Ш). Поскольку свойства зтЬй^фракция в значительной мере определяются условиям» es приготовления и могут довольно сально изменяться в зависимости от дас& ее получения, мы изучили распределение плаз-миногенз между раствором и осадком при фракционировании осадка фракции IM (Ш) полизтшгенгликолем ПЭГ-П5. Для этого осадок зкстрагиро-вали 53Ишм раствором ПЭГ-IIö при pH 6,0; 7,0; 8,0 и 9,0. Оказалось, что максимальное количество шшзшногона переходит в раствор ера pH 8,0-9,0 (рис.12), причем, чем больше срок хранения фракции,' тем меньше шгагминоге^а переходит в раствор. В осадке при этом оста-

ногена пепгином - кринглов 1-4 и мини-плазминогеиа, который предварительно очищали на Lye-E. ОКЗЗЛОСЬ, ЧТО С сорбентами nCI -Рг, nci -дер, рьв, Вс-т и gr-f взаимодействует только мяни-плазмшоген (рис.13, 14), а кринглы Г-4 не сорбируется. Т.е., центр специфачес-

1 г з

Рис.Г4. Электрофорез препаратов плазминогена (рд) и продуктов с его пепсинового гидролиза Си-4 и т\п\-рэ) в 7,52 ПАЛГ

в присутствии О.К-ного ДЦС-Ма.: I - злззат 0,25 М Ъ-Агд

(т!т-Рд), 2 - ПрОСКОК На Вс-Т (XI-4), 3 - ПЭПСШГОШЙ

• гидролизат рд, 4 - исходный препарат рд, полученный хроматографе а на ц-цуз-Е,

даго взаимодействия штазмзногеяз с ингибиторами протеиназ размещен в мини-плазминогене. Раньшэ в молекуле шгазмияогвна были идентифицированы т.яаз. "бензамидан-связывавщиз" центры, локализованные в минз-плазминогэнэ, а немного позже - "аргшнл-связываищго'' центры,' два из которых, как полагает, совпадавт с бегоамидан-связыващаш центрами, а третий локализован в крявглах 1-3. Нзпш результаты указывают на то, что выявленные нами центры специфичного взаимодействия шгазмяно-гена с остатками феяалборной кислоты, п-хлорбензаньными группами, бацитрацином и грамицидином с, скорее всего, совпадают с аргзнил-(бегоамидин)-связывающими центрами молекулы плазманогена, которые размещены в районе молекулы плазманогена, отвечавшем шни-плззмяпс -гена. Вероятно, зш центры должны быть достаточно объвмныш и но ■ содержать в себе заряженных груш. Последнее предполоавние основывается, на одинаковом 'связывания с плазманогеном как Еэзаряжшши ос-

32 .

татков, так и остатков, содержащих отрицательный (фенилборная кислота) и положительный (п-аминобензамидан, Ъ-Arg) заряд. В случае сорбентов с иммобилизованными грамицидином С и бацитрацином сорбция шкзминогеяа также зависит от способа иммобилизации. Так, связывание на нзблвдзлось при использовании сорбентов Вс-е а gг-е, содержащих одноточечно связанные лиганды, в отличие от вс-т и сг-т, содержащих двухточечно связанные лиганды.

Получение цлазмина.

Для. получения шэзмшэ использовали очищенные препараты плазми-ногена- Его активацию осуществляли при помощи урокиназы. Изучение одтимзльпых условий активации (соотношение плазминоген/урокиназа, температура, время реакции)"показано, что практически количественное Превращение плазминогена в плазмин достигается при соотношении плазминоген/урокиназа в.дредвлах 10:1 - 100:1 (мг/мг) за I час при 37°С. При этом ионная сила раствора существенного.влияния на активацию не имеет (в пределах 0,01 -0,2 М). После завершения активации избыток активатора (урокиназы) и мелкие продукты активации (ективационные пептида) удаляли путем хроматографии на Ly®-e- При этом с сорбентом связывался плазмин, а урокиназа и активационвые пептиды не сорбировались. Активный плазмин десорбировали 0,2 М раствором -с-аминокапро-новой кислоты, pH 8,0. После: десорбции 'плазмин обессоливали путем гель-фальтрацаи на сорбенте тойоперл HW-40P и лиофильно высушивали. Выход плазмзпа составлял S0-S0? (по белку).

Получение тромбэялЕсгсша.

Тканевой тромбепластан представляет собой высокомолекулярный лапопротеидный комплекс (Мр около 300000), который инициирует бцэш-ний путь свертывания крова, активируя шесте с фактором Ш1а тромбо-кшазу (фактор X), которая, в свои очередь, активирует протромбин в тромбин.. Именно это действие тромбопластина используется в таких тестах, как определвниз прогромЭинового времени плазмы, а также дефицита. фактора Ха. К началу наших исследований для очистки тромбопластина цутэм гель-фильтрации использовали софарозу или сефадекс G200. Однако, такие методы не приобрели препаративного развития вследствие невысокой их продуктивности, а также , низкой механической

серия крепе йбземвых сорбентов для гель-фильтрации и проверена их пригодность для очистки тромбопластина. Тромбопластлн хроматографпровз-ли в колонках (0,8x20 см), на которые наносили по 0,5 мл экстакта кэдаверного мозга человека (основной источник тромбопластина, используемого в отечественной диагностической практике). Во фракциях, выходящих с колонки, определяли мутность (поглощение .при 54о нм), содержание белка по Брэдфорду, а также специфическую активность (протромбшэвое время нормальной донорской плазмы). Для сравнения проводили очистку с использованием органополимерных гелей, таких как сефадеке 0200, ультрогэль 1сА34 я тойоперл ШГ-55?. Результата очистки с использованием сорбентов, полученых методом 2 (допол-. нательная обработка глицерином) приведены на рис.15 и в табл.7).

С, мг/мл

г.о

1.0

г 1.0

1.0

г.о

1.0

СТ-2 \-- •V сх-з А 1 / V. /V- V 1 1 • • . с-во .д 11 / \ > ^ 1 . \ . 1 1 ^

кск-1 г > _ КСЖ-2 Л ■■ 1 1 ■ п ■ ' ксс-з ■ /Л' ■ У'

<3200 - * А - /У \ ■ ; \ АсД34 '. Л \ \ .... _1. .1 Н»-55Р Л /\ . /УЛ 1 1

1.0

1.0

1.0

10 20

10 20

10

20 Но

- фракции

Ряс.15. Очистка тромбопластина путем гель-фильтрацяи» Сплошная линия - концентрация.белка, пунктирная - мутность. .

и

Таблица 7.

Результаты очистки • тромбозластша гель-фильтрацией

Марка кремнезема (сорбент) ^ор* НМ Содержание С, % Белок, (С) мг/мл ЕБЦ.О Стасов, раз ВЫХОД.

Силохром СХ-2 НО 1.45 0,32 0,56 .1,75 3,3 79

Силохром СХ-3 ■ £5 4,8 0,27 0,73 2,7 5,4 85

Силохром С-8Э 44 О С V« О 0,23 0,62 2,7 5,4 83

Сшшквгель КСК-1 24 4.3 0,49 0,52 1,1 2,2 75

Силикагель КСК-2 - 14 6,8 1.1 0,65 0,6 1,2 80

Силикатель КСС-3 7 9,8 1,23 0,63 0.52 1.0 77

Сефздекс С203 0,62 1,45 2,3 . . 4,6 80

Ультрогедь АсА~34 0,42 0,85 2,0 4,0 78

Тойоперл ЕЯ-55? 0,55 1,32 2,5 " 4*8 83

Экстракт 7,9 4,0 0,5 -1,0 =100

Поскольку понятпэ удвльзой активности ^оьйопйастайа к началу наших исследований не, было определено, мы предложили использовать в качестве характеристики чистоты препаратов величину соотношения мутности раствора к концентрации белка в нем. При этом мы исходили из предположения, что специфическая протромбин-актиБирушдая активность присуща лишь определенному белково-липэдному составу ййпопротеидного • комплекса и что в идеале абсолютно чистый препарат • тромбоыгастина характеризуется определенным соотношением мутности 'к концентрации белка. Тогда это соотношение не должно зависеть от концентрации белка и должно быть постоянным для препаратов чромбойдзспша разной степени чистоты. Действительно, оказалось» (табД.8), что как для неочищенного, так ж для очищенных препаратов ^ромбоШшСТина, соотношение практически но зависит от концентрации бзлка и может быть принято ^ качестве критерия чистоты препаратов ЛРромбопластина.

Таблица В.

Зависимость соогаоиения Е,ио/С от разведония для тромзрпластипа разной стопопи очистки

Исходный экстракт Очистка на СХ-2 Очистка на С-80

Белек, (С) МГ/МЛ Е5ио/С Белок, (0) мг/мл . Белок, (С) ыг/шг Сздо £*ио/С

0,(35 0,025 0,50 ОД . 0,18 1,30 о,сз о,с8 2,7

0,13 0,064 0,44 0,25 0,43 1,70 ОД 0,27 2,7

0,19 0,090 0,47 0,3 0,50 1,67 0,25 0,7 2,8

0,40 0,020 0,50 0,4 0,70 1,73 0,33 0,87 2,64

Как видно из табл.7 лучшие результаты (наивысшая степень очистки) среди кремнеземных сорбентов достигаются при использовании сорбентов с диаметром пор 45-65 нм. При этом получензыз препараты тромбопластина немного превосходят по степени очистки препараты, полеченные. на органвголимврннх носителях. Кроме того, на модифицированных кремнеземах достигается большая скорость потока злюента, что сокращает время анализа. Данные, приведенные в табл.7, хорошо согласуются с профилями алэдии ляиопротеидных комплексов, приведенными .на рис.15. Действительно, наилучшее отделение белка, обладающего тромбопластшоЕой активность»,■ от неактивных белков достигается при использовании сорбентов с диаметром. пор 44-65 нм (силохромы С-80 и СХ-3). При использовании в аналогичных условиях сорбентов, полученных по методу Г (гидролиз эпоксигрупп), которые характеризуются меньшим количеством гидроксильных груш на •'. поверхности), были получены практически такие же результаты, т.е., дополнительная обработка, эпоксигрупп глицерином на приводит к значительному улучшению разделяющей способности сорбента. Возможно» такая обработка будет иметь значение при гель-фидьтрацяи' других белков плазмы крови.

Таким образом, на полученных наш кремнеземных сорбентах с иммоОилизованими гздроксшгьними группами, можно осуществлять

аффективную очистку, тканевого 'тромбопластина путем гель-фильтрации. При атом пэ столеыи очистки'и выходу активного препарата (больше 5 J.и 83-8555 соответственно) получение препараты тромбопластина не превосходят препараты, очищенные с использованием гель-фильтрации на оргьясиэлямэршх носителях.

Получение азофибрина.

Определение фибришлитической активности является важным информативным тестом, особенно при тромботических ослозшвшшх. К началу nasas исследований в основе клинических методов анализа -лежало использование реакции гидролиза природного субстрата пяазмина - фибрина. Баиболэе известными среда таких методов изучения лфЕбринолпзз бют метода лизиса сгустка зуглобулзновой фракцией плазмы крови и метод фабриновкх пластан [Astrup, Mullertz, 1952]. Эти методы имелт ряд недостатков, основные из которых - длительность (5-24 час) и недостаточная точность определения. Главная идея нашего исследования состояла в создании нового субстрата на основе фибрина,- который позволил бы сократить время определения,'расширить функциональные возможности метода, а также давал Сы точную количественную характеристику фибршоляза. Для этого фибрин человека, ковалентно и нековалонт-но модифицировали различными красителями и изучали действие плазминэ и других протеиназ на подученные модифицированиие фибрина. Модификацию фибрина осуществляли елвдуищим образом..

Ыэтод I. Сгусток фибрина, образованный при действии тромбина на акстракт фракции I Кона {основной источник фибриногена при фракционировании донорской плазмы), прогревала в течение 2 "час при 85°С для инактивации активаторов плазманогена, .измельчали в гомогенизаторе и прибавляли раствор красителя, в качестве которого использовали свежеприготовленный щелочной раствор .диззотиров-знноЗ сульфаншювой кислоты (езофибрин), щелочной раствор даазосоли fast Black К (Рнфзбрш), щелочной раствор гидрохинона (В-фибрин) ш щелочной раствор CuS04, с последующей обработкой реактивом Фолина (Ь-фибрип).'

Метод 2. К раствору фибриногена (экстракта фракции I Кона) прибавляли кумасси ярко-голубой В250 шеи G250 (К-фнбрт и G-фибрин . соответственно) или.дзкетран голубой 02000 (G-фибрин), перемешивали и прибавляли тромбин. Образованный сгусток измельчали в гомогенизатора.

Все производные фибрича отмывали от избытка модификатора в фосфатном буферном растворе, pH 7,3 с 'последующим центрифугированием.

пока оптичйзкая плотность нэдосадочной эддаости нэ становилась мепь-ше 0,05 при соответствующей длине волны, и лаофшьно высушивали. Ео-которые физпко-химячоскио показатели полученных флбршгов приведены в табл.9.

Как видно из результатов табл.9, среди полученных наш производных фибрина максимальной хромогенностью и одновременно стойкостью к дзсорбярующам "агентам обладают азофибрин л Ь-фибрин. тогда как 11-,

Таблица 9.

' Характеристика производных фибрина

Производное фибрина Содержание,ЯЖ X гткзх Хромогенность , ед./мг Действие дэ сорб.агентов

Белка Красит. 102 ИТОН 0,12 БЕЗ Ш КаС1

?-фибриз 94 5 333 а,с73 ■ + +

В-фибрин 79 21 345 й.зэ + + +

Ь-фибрин 97 3 . 750 0,84' + + + ,

В-фибрин 57 33 625 0,145 ' + - -г

И-фибрин 92 8 558 0,34 - - -

в-фибрин 87 13 . 585 0,343

¿зофибрин 85 - 15 ' 333 0,80 + "Г +

- Примечание г Хрочогеняостъ определяли как оптическую плотность при Хтах раствора, полученного при исчерпывающем тршси-

новом гидролиза 0,0535-ной суспензии.производной фибрина;

"+' - десорбции красителя не происходит; "-" - краситель десорбяруется з раствор.

й- и В-фибрины имеет в 2-3 раза меньиуш хромогенность, хромогенность Б-фибрина примерно в 6 раз нижа, а кроме того- Е-, С- л В-фибрзш-нестойки к действию таких агентов, как КЗ-ный раствор изопрошт-лового спирта, 0,1%-ви,1 раствор додоцнлсулв£а тэ натрия и Ш Г?аС1. Все полученные нами производные фибрина использовались для определения фибр дгюлитич еской активности разных протеиназ (табл.10, для сравнения приведены дапные по гидролизу азоказеина и казеина - популярных белковых.субстратов протеиназ).

Оказалось, что лучшим субстратом среди полученных пата производных фибрина, а также взятых для сравнения азокззеина и казэиьэ, оказался езофибрин, для которого нзблздалась ■ максимальная чувствительность (минимальная концентрация фермента, .которая дает з стандартных условиях нормированный, прирост оптической плотнбсгл) - от

.____58

О.ЕхЮ"^" моль для пепсина до 0,7x10"1а моль для плазминз и

Габлицз 10.

. Зависимость удельной активности и чувствительности от субстрата для протеиназ разного происхождения

Субстрат Плазмин. Трипсин Пепсин Теркитаза

ед./мг МОЛЬх ед./мг МОЛЬх ед./мг МОЛЬх ед./мг МОЛЬх

1 о10 10" 10" 10»

Р-фибрин 1,58 0,7 24 ' 11,2 _ 15 357,0

В-фибрин 2,19 2,1 20 240,0 370 1.5 . н.о. н.о.

1г-фибрзн 0,05 40,0 19 490,0 - - 7 357,0

В-фибрин 1,9 2.1 ' 66 ,17,5 3660 1,2 38 143,й

К-фибрин 0,92 14,0 117 70,0 н.о. н.о. 38 172,0

С-фнбрин 1,34 11,2 ПО 140,0 н.о. н.о. 27 192,0

Азофибрин £.5 ■ 0,7 1С600 0,8 5900 0,6 1700 ' 2,0

Азоказонн .6,0 2.1 3280 - • 610 3,6

Казевн. 2,9 .2,8 '820 10,5 ■ — — 180 10,7

Примечания: - субстрат не гвдролизуется;

н.о. - определение го проводилось.

максимальная удельная активность,. Эти даннные свидетельствуют о том, - что определение фибршолмгической активности при помощи азофибрина практически не уступает методам с использованием синтетических хро-могешшх пептидных субстратов (чувствительность моль).

Кинетический анализ гидролиза азофибрина проводили, исходя из предположения, что. реакция гидролиза подчиняется механизму Ыихаэлиса-Ментен. Оказалось, что азофибрин характеризуется тахж. ез сродством к ллззшну (близкие значения К^), как и фибрин (табл.11), т.е., модификация не затрагивает остатки, с которыми связывается гчазмин,

' .Таблица II.

Кинетические параметры гидролиза азофибрина и фибрина плазшшом

Субстрат • к , мкмоль 1Л V , мкмоль/с пах ./-К ка1 гг.

Азофибрин Фибрин4 ■ •35,2 . 27,4 , 0,12 0,0033 0,3 .0,01 8,6 0,4

однако, е ело дс.та из увеличения к^,- в случае модифицированного фибрина ферментативная эффективность гидролиза возрастает примерно в 20 рь^1.

Такчм образом, модификация фибрина ц-диэ£>обэнзолсуль5скислэто2 приводит к субстрату, пригодному для определения фибринолитической активности протеиназ разного происхождения при разних значениях рН (от рН 2,0 для пепсина до рН 8,5 для трипсина). При этом сродство немодифщировашого фибрина к протеиназам, в частности, к плазмину, практически не изменяется. Т.е., гидролиз азофибрша можно считать адекватной моделью гидролиза немодифщированного фибриза. По сбоим характеристикам (чувствительность, устойчивость к детергентам, смене рН, ионной силе и органических растворителям) азофибриз превосходит как полученные нами другие производные фибрина, так и коммерческие препараты белковых субстратов протеизаз азоказеин и казеин и может использоваться для определения протоолитической (фибртаолитаческой) активности протеизаз при их получении и изучении.

Изучение пригодности полученных препаратов для использования их в клинической 'диагностике

Тромбин.

Очищенные при помощи биоспецафзческой хроматографии препараты тромбина диалэзовала против 20-40 объемоЕ 0,15 М раствора 1ТаС1, рН 7,4 в течение 24 час при 4°С и лиофипьно высушивали.

Установлено, что в' раствори (10,50 -я 100 ед.ЭТН/мл, 0,15 М КаС1, 0.01%-нкй мертиолат, рН 6,0, удельная активность больше 1000 ед.ЭТ.Н/мг белка) очищенный тромбин гарантеризуется высокой стабильностью. Так, при хранении п^л 20°С в течение 6-8 час потеря свертывающей активности не превышала ЮЖ. Через 100 час в растворэ оставалось больше 75% начальной активности. Такая стабильность растворов тромбина имеет принципиально важное значение с точиа зрения пригодности их .для клинической диагностики. В замороженном состоянии при -8-Ю°С активность фермента - полностью сохранялась в течение I месяца, Еыдерхюая при этом 3-4-кратяоэ замораживание-оттаивание. Лаофильно внсуиэнше препараты тромбина сохраняли около 98-100% начальной активности в течение 4 лет при -8-Ю°С. При хра-нензи их при 4-8°С и 20°С уже через I год. активность падала соот-ветствэнно на 15 и 50%.

.Для улучшения сохранности тромбина при температурах выпе 0°С

перед лиофидьным высушиванием к раствору прибавляли альбумин сишротки крупного рогатого скоте до концентрации I мг/мл, что приводило к уменьшению потерь активности до 2,-5% при хранении при 4-8&С к до 10-15% при хранении при 20°С в течение I года.

Лдафяльно высушенные препараты тромбина легко растворялись в буферных растворах, образуя прозрачный раствор, который использовали в известных тестах по определении уровня антитромбипв ш (метод Абальдгаарда), троыбинового Времени плазмы, фибриногена, продуктов деградации фибрина/фибриногена, для приготовления фибриновых пластин и т.п. В частности, установлено, что коэффициент вариации При определении буферного времени составлял 5?, а в серии определений антитромбину Ш - 1,9%, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости результатов. __ .•■•

Таким образом, очищенные наш препараты тромбина по своим свойствам соответствуют требованиям, предъявляемым к препаратам такого типа в клинически» диагностике и могут быть использованы вместо зарубежных аналогов.

ТромЗопластш.

Основное назначение препарата - определение протромбина и белков РГО1А в плазме при контроле терацин антивитаминами К и диагностике определенных видов, гемофалий. Требования к препарату такого типа известны СВОЗ. Комитет экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов. 28 доклад. 19803. Это: I. Хорошая растворимость; 2. Стабильность при хранении в растворе. 3. Хорошая воспроизводимость результатов. 4. Достаточное время свертывания нормальной плазмы и хорошая чувствительность к белкам Р17КА. Изучение препарата тромбопла стана, очищенного путем гель-фальтиацик на модифицированных кремнеземных сорбентах с посладущим лиофильным высушиванием, показало, что зтим требованиям пр&нарзт тромбошг стана отвечает. 1'ак, он легко суспвндировался в дистиллированной воде с образованием стойкой эмульсий, которая сохраняла стабильную активность .в течение 5. дней при 4сС и не менее 5 час при 37°С. Тромйопластин-кальцизвая смесь была стабильной при 4°С 1-3 дая, а при 37°0 - 4-5 час. Лиофильно высушенные препараты сохраняли не менее 95% начальной активности при хранении в течение I года при -25°С и Б -эскц&е при 4-8°С. Коэффициент вариации при опредэ-гэпии протромбанового времена на пуле донорской» алазш колебался в пределах 1,8-4,7555. При сравнительном изучении "полученного нами пропарата с неочищенным препаратом тромбоплас-

таза (Кировский; ШИ гематологии. Россия) и лиофилизованным препаратом фирмы "Еое11г1щег" (Германия) оказалось (рис.16), что полученный нами препарат и тромбопяастш Кировского НИИ гематологии имеют практически одинаковые терапевтические предела (2,5-3,5 и 2,2-3,3 г соответственно) и превышают по этому показателю тромбопластин ' фирмы "ВоеЬг1п£ег" (1,6-2,3 г), поскольку при одинаковом снижении уровня факторов протромбинового комплекса они демонстрируют большее удлинение протромбинового времени (большие значения г). Практически одинаковые функциональные показатели полученного нами тромбопластсгаа и тромбопластина производства Кировского НИИ гематологии подтверждается результатами относительного калибрования тромбопластина с использованием различных плазм более 60 больных (рис.16). Из них следует, что калибровочный коэф&щиент близок к I. Однако, препарат

Львов

1 8 . 0 -

//х г

y?.til"

Г 1 , 1 1 ! 1,1 1 i i

0 1 4- 7

Разведение плазмы, раз

Киров

Рис.16. 'Зависимость протромбинового коэффициента (г) от разведения плазмы (а) и калибровка очищенного тромбопластина относительно "тзомбош^стина Кировского НИИ гематологии (б). I - тромоопластин Кировского НИИ гематологии; 2 -тромбопластин, очищенный гель-фильтрацией; 3 - тромбопластин фзрмы "Boehrlnger".

очищенного тромбопластина превосходит препарат производства Кировского НИК гематологии по таким показателям как стабильность при хранении, простота приготовления рабочего раствора, легкость определения конечной точки при образовании сгустка.

Таким образом, полученный нами препарат тромбопластина отвечает требованиям, предъявляемым в клинической диагностике к препаратам такого типа. Он может использоваться как в iдде отдельного реактива, так и в составе наборов для определения протромбинового я тромбинового времени я времена рекальцификации плазмы»

Плазмшогеы, плазмиа, урокиназа, язофибрин.

После очистки путем Оиоспецифической хроматографии препараты пг«зминэгвна даализовали против 0,15 И КаС1 при 4°С в течение £4 чес, препараты шгазмипа и урокиназы освобождали: От солей и йзоцро-пшкшого спирта гель-фильтрацией, а потом лйсфильао высушивали. Изучение стабильности препаратов показало, что препараты хорошо сохраняясь в лгофвльно высушенном состоянии при -25°С (потери активности не прЕВЫЕ2зт 10-153 за I год хранения), быстро инактйвирувтся цри хранении в растворе при 20°С (за исключением препаратов плазми-вогена). Так, за I сутки хранения активность Их падает на 10-15« (урокиназа) или 45Х (плазмин). Плазминогон в таких условиях более стабилен (потеря активности не превышает Ь%). Однако, при использовании их в течение рабочего дня (4-5 час) препараты сохраняет- в .растворе болев 90£ начальной активности, что делает их тфигодными для использования\в клинической диагностике.

Азофибрин, лаофильно высушенный после удаления избытка красителя, практически, не менял свои характеристики в течение 2 лет хранения гри 20°С.

Полученные наш препараты изучались с точки зрения пригодности их дли осуществления анализа состояния фибринолитической системы крови. Препараты плазминогена, плазмина и урокиназы использовались при проведении таких известных тестов, как определение уровня быстро- и медленно-действующих антиллазмиков в плазме, определение уровня плазминогена в плазме и урокиназы в моче (все тесты основаны на определении изменения времени гидролиза стандартного сгустка фибрина в сравнении с нормой). Оказалось, что они полностью пригодны для таких тестов, быстро растворяются, стабильны, дают хорошуг воспроизводимость рэзультатов.

При помощи азофнЗрина 'нами были разработаны ноше мгтоды определения антипяазминов, активаторов шк.зминогена и спонтанной флбрйдолатичэской активности плазмы.. Суть этих методов состойт в следующем. Стандартная навеска азофибринз (5-10 мг) выдерживается в растворе с плаамином, который: I. Образуется вследствие активации алазминогена плазмы урокипазой или стрептоканазой; 2. Присутствует в .плазме вследствие частичной активации д-ззмзгаегвна; 3. Образуется из очищенного плазкизогена при действии урокиназы мочи; 4. Остается пзо;й связывания избытка .плазмина ингибиторами плазмы.

• Бри действии длвзмиев нз азофибрин из ' последнего выщепляются

короткие растворимые пептиды, концентрацию которых (активность плазмща) определяют спиктрофотоме1трически после удаления негидроли-зовзн..ого 'азофибрша путем фильтрация. Перед сгочтрофотометричьскзм определением к реакционной смеси прибавляют 3 мл дистиллированной вода (до общего объема 4 мл) я 0,02 мл 5 я. КаОЕ. Введение щелочи изменяет спектр поглощения азопептадов, смещая максимум поглощения до 410 нм и увеличивая его максимальное значение.

Принцип методов определения плазминогена/ллэзмлнз, антиплазми-нов и урокиназа шчл представлон в табл.12.

Таблица 12.

Соотношения меаду реагентами при определении плвзминогеча/шгазмина, антяплазминов и урокиназы мочи при помощи азофибрина

Плазминоген/Пгазчин Антаплзгмины Урокиназа мочи

Реактив Проба, мл Контроль мл Проба п!Л Контроль мл Проба мл Контроль, мл

1 2 1 2

Буфер 0,85 0.7 0,85 0.7 0,7 0,8 0,8 0,8

Плазма 0,15 0.15 - 0,3 - . - -

Активатор*' - 0,15 - - - 0,1 - 0,1

Плазма+ - - - 0,3 - - - -

Плазмин -

Елазмин - - - - 0,15 - - -

Плазминогея - - - - - 0,1 0,1 -

Ч е р е з I час инкубации

Плазма - - 0,15 - 0,15 - - -

Плазминогзн - - ' - - - ■ - - 0,1

Моча - •- - - - - 0,1

Н30 ' 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0

3 N МаОН 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

СбЩИй объем 4.С2 4,02 4,02 4,02 4,02 4,02 4,02 4,02

Е3 Е3 Е* Е3 Е1 Ез

Примечания: - 1рл определении плэзмана в качестве активатора используют стрептокшазу или урокзназу, при определении урокиназы агтнватором служит исслэ-дувмая моча

Рассчет содержания плазминогена (Пг), плазмина (Пн), антиплаз-миноь (¿Пн) и урокиназной активности мочи (УкА) проводили по следующим формулам:

ПН ДО) = СЕл-ЕзЭ х Кг . ПГ (%%) =(Еа-Е1-Е3) х К3

где:

ез., е2 и е3 - поглощение пробы I, пробы 2 и контрля соответственно;

' ^ ка и ка - расчетные коэффициенты, определенные для пула плазма 20 здоровых доноров, для которых уровень Пн и ИТ принимали за 100Й.

АПН ДО) = (Е^Ег) х К

' ' где:

е, и е, - поглощение пробы и контроля соответственно;

к - расчетный коэффициент, определенный для пула плазмы

20 здоровых доноров, для которых уровень Пн и Пг принимали за 100а.

УКА. (ВД./ИЛ) = (Еь-Еа-Ез) х К

тде: х

е1? е2 яе3 - поглощение пробы, контроля I и контроля 2;

к - расчетный коэффициент, определенный для пула мочи

20 здоровых молодых мужчин

Разработанные наш методы определения состояния системы фибри-нэлиза использовались в клинической диагностике. Оказалось, что с их помощью можно определить повышение уровня плэзмина до 145% (некоторые формы лейкозов), снижение уровня плазминогена и шюзмина до 64 и 42% соответственно (гематурический синдром), снижение урощя плазминогена вплоть до полного исчезновения с одновременным _ ростом содержания плазмина (при терапии препаратами стрептокичазы). Уровэнь антшказминов у. больных острым панкреатитом составлял в средам 64Ж, а после введения, контрикала (препарат ингибитора протеиназ) .возрастал до 11455. Установлено, что, для здоровых молодых мужчин уровень урокиназной активности мочи составлял 35 ед./мл. Кроме урокиназной активности может быть определена и фибринолитическая активность мочи (аналогично определению плазмана в плазме). Оказалось, что у больных, которым удалена' аденома простаты, ее уровень возростает в 10-20 раз в сравнении с нормой.

V. Для зсех приведенных выше методов коэффициент вариации составлял 2,65-7,8%, что свидетельствует о хорошей воспроизводимости методов.

.. Ныявдсжь так».-..., что цалученше результаты хорошо согласуются с

результатами, полученными при использовании классических методов (лизис фябртовых пластин).

Таким образом, полученные нами препараты плазминогена, плазмина и урокиназы могут быть использованы в клинической лабораторной практике для выполнения известных тестов, а вместе с азофибрином их можно использовать для количественного определения уровня шгазминогена, плазмина, активаторов и ингибиторов фибрлнолиза в плазме крови.

Основные выводы '

1. Разработаны методы активации поверхности кремнеземных носителей и коваяэнтиого присоединения к ней органических соединений, а именно Ь-гаминокислот (1-Ьуз и Ь-А^), гексзметилендиаминэ, п-хлор-бензильных груш, п-(«-амшюмэтил)фенилборной кислоты, циклических антибиотазсов-полипрптидов (грамицидина С и бацатрацлна) и глицерина, отдэленых от матрицы на 3-7 углеродных атома.

2. Установлено, что з зависимости от условий иммобилизация, лиганды. содержащие два потенциальных центра иммобилизации, могут

■ присоединяться к сорбенту за одну либо две "вояки". Разработаны способы направленной и?,мобилизации таких лигандов 'за один или два иммобилизацшнных центра.

3. Изучены закономерности сорбции и десорбции плазминогена, шгасмина, тромбина, урокиназы, а такав -других протеиназ на полученных сорбентах. Установлено, что сама кремнеземная матрица з ряде случаез способствует более прочному, з сравнении с аналогичными

■ сорбентами на основе сефарозы, связыванию белков с биоспецифичннмл лигаддамн. Выявлено, что для связывания протеиназ с пммобядизоваными грзмицяданом с и бвцзтрацином необходимым условием является иммобилизация указанных лагандов одновременно за две аминогруппа, что, вероятно, фиксирует нативнуа конформацив лиганда, которую он жест в растворе. При иммобилизации за одну аминогруппу указанные лиганды с протеиназами нр взаимодействуют.

4. 3 молекуле плазминогена найден(ы). центр(ы) специфического взаимодействия с л-хлорбензшгьными и фенияборонатшми группами, бащгграцаном и грамицидином С. При аф$шшо-хроматографическлх свойств фрагментов плэзмтгногенз осуществлена локализация этих центров в часта молекулы плазминогена, соответствующей мини-плазкз-ногена. Они идонтйфицированы как ранее описанные арппшл(бензамл-дин)-связывавдие центры.

5. Разработаны новые методы очистки тромбина, плазминогена, плазмина и урокиназы с использованном биоспецифичной хроматографии

на модафзцироЕанных кремнеземных сорбентах. Эта методы позволяют осуществлять препаративное выделение тромбина и шгазминогена из осаггка фракции ШШ ,'Ш) Кона донорской плазмы, а также очистку уро-киназы непосредственно из мочи без ее предварительного концентрирования .

6. Разработан метод препаративной очистки тромбопластина из кадаверного мозга путем гель-фильтрации на шдафщнрованных гвдрсксильными грушами кремнеземных сорбзнтах. Предложен новый метод оценки чистоты препаратов тромбопластина.

7. Осуществлен синтез ряда производных фибрина, модифицированного красителями. Установлено, что фибрин, ковалентно модифицированный диазотированкой сульфаниловой кислотой (азофибрш), представляет собой универсальный субстрат для определения фибринолити-ческой активности протеиааз в диасазояе рН 2,0 - 8,5 и уровня плазминогена, плззмша, активаторов и ингибиторов фибринолиза в плазме крови. Изучение Кзнетичес-КЕХ параметров ги,*ролиза азофибрина плазманом показало, что модификация даазотированием не влияет на связывании плгзмзна с фибрином (практически не меняот , однако примерно р 20 раз увеличивает фэрмсштативную эффективность гидролизе '5Чшг/7*гп ^ аз°Фибрша и фибрина соответственно составляет 8,56 х Ю с'-юль"1 и 0,44 х Ю^с^моль-1).

8. Изучена стабильность полученных препаратов тромбина, тромбопластина, шхгзшгногена, плвзмяна, урокинвзы и азофибрина при хранении их при разных темперзтурах в растворе, замороженном и лиофилько высушенном состоянии. Продемонстрирована пригодность указанных препаратов для, использования в известных тестах, которые исгользуг.тся в клинической диагностике нарушений системы гемостаза. .Созданы новые методы определения уровня- илазминогена, пла^мина, ■активаторов и ингибиторов фибринолиза нз основе'азофибрина.

9. В совместном р>ссийско-авсчрийско-германском предприятии "БзоХимМак" (г.Москва, Россия) налаген серийнкй шпуск кремне.-емных сорбентов - ОиоспЕцгфичных сорбентов, содержащих остатки Ъ-1уз, Ь-Агв, бацаграцина и грамицидина С, сорбентов, активированных тозялхлоридом, и сорбентов для гель-фильтрации. В НШ> "Симко" и Ш "ВизМарк" .(г.Львов, Украина) налажен серийный выпуск препаратов тромблна, /тромбопластина, Плазминоге-а, плазмгаа, урокинэзы, азофибрина, -а такзаз наборов, в состав которых входят указанные прэ^араты. 1

4Г

Основное содержание работы отображено в статьях:

1. Руденская Г.Н., Остерман А.Л., Степанов З.М., Гайда A.B. Аффинная хроматография протеиназ на сорбентах, полученных присоединением пептидных антибиотиков к производному кремнезема. //Биохимия и биофизика микроорганизмов. -Горький: 1983.-й II.-С.36-41.

2. Монастырский З.А., Магеровский Ю.Б., Гайда A.B. Применэнпэ поли-зтиленгликоля для выделения протромбинового комплекса .//Гематология и траясфузиол.-1986.-М2.-С.51-53.

3. Гайда A.B., Магеровский Ю.В., ?,5онастырский В.А. Бацитрацин и грамицидин С как биоспецафические лигаяды при аффянной хроматографии тромбина человека.//Биохимия.-1987.-Т.52, М.-С.569-576.

4. Galda A.V., Konastyrskli V.A., MagerovsM.1 Yu.7., Starovero? S.M. Llsictkln G.T. AÍIlnlty clrromatograpby oí human thrombln on modi— íied silica.'//J.Chromatogr.-1987.-v.424, No 2.-P.385-391..

5. Фадеева И.Ю., Староверов C.M., Лисичкин Г.З., Гайда A.B.', Магеровский ELB., Монастырский В.А. Гель-хроматография высокомолекулярных комплексов тромбошастана.//Высоксмол. соединения.-1987.-Т.29, сер.А, .-С.I6S5-I667.

6. Швачко Л.П., Киберев В.К., Гайда A.B., Магэровс'ай ¡O.B., Монастырский В.А. Получение тромбина человека с помощью аффинной хроматографии на грамицидин С- силохрсчэ _С~30. //Укр. биохлм.з. -19-33. -Т. 60. -С.3-7.

7. Монастырский В.А., Воропяк М.И., Бирка И.И., Гайда A.B., Магеровский Ю.В. Эффективность и механизм действия плазмина при повреа-дэнии миокарда коагуляциошгого генеза.//Врачебное дело.-1988. -йЗ.-С.70-73. -

8. Магеровский П.В.,Монастырский В.А., Гайда A.B., Бирка И.И., Во-роняк U.U. Частичная очисткз тканевого тромбопластинз методом гель-проникающей хроматографии и воспроизведение с его помощью синдрома генерализованного декомпенсзрованного тромбшогенеза.// Вопр.мед.химии.-1988.-J63.--2. С.34-39.'

9. Монастырский В.А., Гайда A.B., Магеровский Ю.В., Даныи Т.В. Новые методы исследования системы плазмина с использованием азрфибрипа. Лаб.дело.-1988.-ЖШ.-С.49-53.

10. Дакыш Т.В., Гайда A.B. Перспективы использования нового хромоген-гого субстрата дал определения фибрянолитической активности.// Гомятол. и трзнсфузиол. (Респ.междуведом.сб.), Киев: ;19&Я, вып.23, С.13-16.

■ab . ■

11. Гайда A.B., Магеровский D.B., Монастырский В.А. Торик Ж.Н. Контроль антикоагулянтной терапии при помощи препарата "ТромЗопластин растворимый" .//Лаб. дело.-1989. -JSI0.-С. 20-23.

12. Гайда A.B., Монастырский В.А., Брагинец Е.Г., Магеровс-кий Ю.В. Фракционирование шшзманогеыа полазтилвЕгликолем.//Биотехнология. 1989.-Т.5, Ж.- С.45-48.

13. Гайда A.B. , Монастырский В.А., Магеровскпй Ю.В., Староверов С.М., . Лисичкин Г.В. Хроматография тромбина на модифицированных кремне-

земгх: роль матрицы, спэйсера, величины pH.//Биотехнология.-1989. Т.5, М.- С.444-454.

14. Даныш ТЛЗ., Гайдэ A.B., Монастырский В.А. Определение активности протеиназ с помощью азофибрина.//Прикл. биохимия и микробиол.-198Э Т.XXV, вып.5.-С.715-719... " -

15. Гайда A.B., Староверов СгМ. Модифицированные кремнеземные носители в биотехнологии.//SBX0 им.Д.И.Мецделеева.-1989.-Т.34, №&.-

С.356-353.

16._ Faäeev l.Yu., MingalyovH.G., Staroverov S.K., lunlna E.V., Ilsl-' chkln G.V., Gäläa A.7., Eonastyrskil V.A. Silica sorfcents with

■ one- and two-site -attache! bacitracin .In afilnlty ctaomatograpby. . J. Cbroinatogr.-1932. -v.596.-P. 114-117.

тезисах докладов на республиканских, всесоюзних и международных • конференциях:

17. Гайда A.B., Магеровский D.B., Монастырский В.А., Староверов С.М.,

■ Малиновский В.А., Лисичкин Г.В. Баоспецифические сорбенты на основа кремнезема для выделения тромбина и плазминогена.//Тез.докя. I Всесоюзн. конф. "Хроматография в медицине' и биологии" М.: 1983.,:.- -С.372. • _ ' •

18. Гайда A.B., Даныш Т.В. Способ определения плазминогена в плазме крови .при ломощи окрашенного фибрина.//Тез.докл.Ш Всесоюзн. съезда врачей-лаборантов "Лабораторная диагностика. Клиническая био, хтгая и коегулохогия". Ы.: I985.-C.202.

19. Магеровский D.B., Гайда A.B. Получение препаратов протромбиновог< комплекса.//Тез.докл. П Украинского съезда гематологов и транс. .. фузшлогов, К.:. I986.-C.I2.

20. Магеровский D.B., Монастырский В.А., Даныш. Т.В., Гайда A.B. Био-спецафическая хроматография тромбина и урокиназы на кремнеземных

. сорбентах, модифицированных ингибиторами протеиназ.//В кн.: Хро-V мзтография- в биологии и медицине (Тез. докл.).-М.:-1986.-С.183-184.- •

2Г. МагероЕзкиЯ В.З., Гайда А.3. Стабильный и полностью растворядаД препарат тромбина для коагулологичестах исследований.//Тез.Всо-союзн.конф. "Актуальные проблемы гемостаза в клин. практике". М.: 1987,- С.227-228.

22. Гайда A.B., Даншн Т.В. Разработка набора реактивов для количественного" определения плазминогена.//Там гаэ. С.21.

23. Гайда А.В.,'Магеровский П.В., Монастырский В.А. Препаративная аффинная хроматография тромбина человека.//Тез.Есесоюзн. сов. по сорбентах для хроматографии (Косов, 21-24 октября 1986 г.) М.:

1986.- С.127-128.

24. Гайда A.B., Антонюк В.А. Иммобилизация лзктина фасоли и изучение его взаимодействия с белкаш сыворотки крови.//Там :га. С.223.

25. Гайда A.B., МагеровскзЗ J3.B., Монастырский З.А. Использование ан-■шбиотиков-полипептадов гра?,тацидана С и бадитрацина в качестве биоспепифических лигандов при выделении тромиза человека.//Там же. С.130.

26. Гайда A.B., Монастырский В.А., Ерагинэц Е.Г., МагеровсяиЗ С.В. Выделение плазминогенэ. человека нг силохромах, модифицированных остатками Ьг-лизиза. Влияние длины спейсера.//Тез.17 Еесовзн.спмп. по мол., жадк. хроматографии (Алма-Ата, 16-20 тая 1387 г.). М.:

1987.-c.i03-i09. ■

27.^Монастырски'* в.А., Магэровскяй D.B., Гайда А.З. Аффинная хроматография на шдифицировааанх кремнеземных сорбентах как метод получения очищенного тромбина.//Там а®. С.Ю9-П0.

28. Фадеева И.В., Староверов С.М., Лисичкин Г.В., Гайда A.B., Маге-ронскнй D.B., Монастырский В.А. Ситовая хроматография на кремнеземных сорбентах для получения очищенного'тромбопластина.// Там же. С.245-246. .

29. Гайда A.B., Монастирський В.А., Магеровський В.В., Даниш Т.В. Вплив антибиотикив-полипептидив на активность тромбину та плаз-мину .//Тез.доп. V Укрэ'хнського бзохимичного з* 1зду (1вано-Фран-кивськ, верэсень 1987 р.). чЛ. К.: 1987, С.32.

30. Магеровский.Ю.В., Гайда A.B. Тромбопластия растворимый для коагу-лологических исследований.//Тез.. ПГ Всесоюзн. научно-техн. копф. "Актуальные проблемы производства кровезаменителей, консервантов крови, гормональных и органотерапевтических' препаратов" -М.: 1387, С.205. - - ■ ■

31. Монастырский В.А., Брагинец Е.Г., Гайда A.B. Внсокоочищенный препарат плазмнногена: значение, получение, пришнаяяа«/£Тш. га-С.208.

32. Монастырский В.А., Магеровский Г .В., Гайда A.B. Новая технология получения очищенного тромбина методом аффинной хроматографии.// Там же. С.204.

33. Гайда A.B., Монастырский В.А., Ерагинец Е.Г. Дальнейшее изучение аргннвд-связывающих сайтов шгазминогена человека.//Структура и функция биополимеров (Тез.респ.школы-конф., г.Львов,1989 г.). К.: 1988. С.13.

34. Гайда A.B., Монастырский В.А., Магеровский В.В., Староверов С.М., Фадеев Ю.В. Связывание протеиназ с иммобилизованными антибиотиками: влияние конформзции лигацца.//Там же. С.14.

35. Магеровский Ю.В., Монастырский В.А., Брагинец Е.Г., Гайда A.B. Аффинная хроматография в технологической схемэ выделения тромбина

- и плазминогана из фракции Ш по Кону.//Акт.вопр.развития службы крови Лит.ССР (Тез. И Рееп.конф.Лит.респ.научн.общ.гем. и транс-фузиол., Вильнюс, 20-21 апреля 1989 г.). Вильнюс: 1989, С.59-60.

3S. ДанышТ.В., Монастырский В.А., Гайда.A.B. Выделение и очистка угрокиаазы из мочи человека.//Там же. С.62-63.

37. Староверов С.Ы., С-ердан A.A., Лисичкин Г.Б., Гайда A.B., Монастырский В.А. Шдафицярованныэ кремнеземные сорбенты в биотехнологии, биохимии, медицине./ГШ Мевднар.съезд по общей и прикл. химии.Реф.докл.и сообщений.' М.: Наука, IS89, Ш, С.148.

38. Гайда A.B., Врагинэц Е.Г., Староверов С.М., Фадеев С.А., Минга-лев П.Г.Направленный синтез биоспецифических сорбентов.//? Все-союзн.сиш.по молек.хвдк.хроматографа;:. Тез.докл. (Юрмала, 20-22 ноября 1930 г,). .Рига: 1990, jC.244.

39. Монастырский В.А., Мывдшк Ы.В., Гайда A.B.', Магеровский Ю.В.. Да-ныш Т.В., Брагинец JEJ. Расширенная схема фракционирования донор. скбй плазмы с целью получения ..диагностических препаратов.//Тез.

докл. Ш Всесоизн. съезда гематол. ж трасфузиол. (Киров, 1991b С.88-83.. .

'40. Монастырский В.А., Гайда A.B., Магеровский Ю.В., Даныш Т.Б. Кошх-лекс наборов для диагностики нарушений свертывания и фибриноли-за.//Там.же. С.595-596. .

' 41. Гайда Г.З.', Логинская З.В., Вус М.М., Гайда A.B. Очистка антитромбина Ш и тромбина на' гепариновых сорбентах.//Тез.докл. Ш Симпозиума ""Химия протесиштических ферментов" (Москва, 1993). М., ЕБОХ: 0.43.'

.42лТ'а2д8.A.B.,-'Орищенко Е.В., Фадеев A.C., Мингалев П.Г. Различное хроматографическое поведение тромбина и трипсина на бацитрацино-. новых сорбентах./УТам же, С.44. .

43. Гайда 2.3., Гайда A.B., Bye М.М. Применение аффинной хроматографии для выделения фрагментов пепсинового гидролиза ллазмяногэна человека.//Там же, С.45.

авторских свидетельствах:

44. A.c. ,'51255641 (СССР). Способ определения фибринолитической активности (Гайда A.B., Монастырский З.А., Магеровский Ю.В., Дзныш).

45. A.c. JH309584 (СССР). Сорбент для получения плазминогена (Староверов CJJ., Лисичкин Г.В., Малиновский В.А., Гайда A.B., Монастырский В. А., Магеровский Ю.В., Самарский . В.А.).

46. A.c. $1325746 (СССР). Способ получения плазминогена (Гайда A.B., Монастырский В.А., Магеровский D.B., Самарский В.Д.).

47. A.c. JH428464,(СССР). Сорбент для выделения и очистки тромбо-штастина и способ его получения (Староверов С.М.. Лисичкин Г.З., Фадеева И.В., Магеровский D.B., Монастырский В.А., Гайда A.B.). Опубл. в Б.И., 1988, JS37.

48. A.c. Ш474924 (СССР). Способ получения трсмбопластинэ (Гайда A.B., Монастырский S.A., Магеровский В.В., Староверов С.М., Лисичкин Г.В., Фадеева И.В.). Опубл. в Б.И., 1988, ЖЕ5. '

49. A.c. Ж489183 (СССР). Способ получения иммобилизованных бишго-гичвски активных веществ (Гайда A.B., Монастырский В.А., Да- ■

сшш Т.В., Староверов С.М., Лисичкин Г.В., Луценко В.В., Удовен-ко Л.В.). _ -

50. A.c. ЖГ478393 (СССР). Сорбент для связывания биологически'активных веществ и способ его получения' (Гайда A.B., Монастырский

В.А., Ерагинзц Е.Г., Староверов С'.М.,-Лисичкин Г.В., Луценко В.В., Григорьев В,Ф.).

51. A.c. ЖГ300710 (СССР). Сорбент для выделения и. очистки протеиназ

и способ его получения (Староверов С.М., Малиновский В.А., Лисичкин Г.В., Гайда A.B., Монастырский В.А., Магеровский Ю.В.).

52. A.c. Ш3692Э1 (СССР). Способ выделения и очистки протеолитичес-

,' ких ферментов (Магеровский Ю.В., Монастырский В.А., Гайда A.B.).

53. A.c. И478112 (СССР). Способ получения сорбента для разделения биологических жидкостей жидкостной хроматографией (Сердан A.A., Ляшенко А.Г., Староверов С.М., Лисичикш Г.В., Гайда A.Bj).