Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии и автоматического метода Эдмана при исследовании первичной структуры фактора элонгации EF-G тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ. ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ ПЕПТЩОВ

И БЕЛКОВ.

ГЛАВА I. КЛАССИФИКАЦИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ МЕТОДОВ. ОСНОВНЫЕ

ПОЛОЖЕНИЯ ТЕОРИИ ХРОМАТОГРАФИИ.

I. Оптимальные условия хроматографиче ского разделения

ГЛАВА П. ГЕЛЬ-ПРОНИКАЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

1. Стационарные фазы для высокоэффективной гель-проникаыцей хроматографии.

1.1. Неорганические поверхностно-модифицированные носители.

1.2. Жесткие органические носители для гель-проникающей хроматографии.

2. Свойства носителей для гель-проникавдей хроматографии

ГЛАВА Ш. ИОНООБМЕННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

1. Носители для ионообменной хроматографии.

1.1. Ионообменники с органической полимерной матрицей

1.2. Поверхностно-модифицированные неорганические ионообменники

2. Буферные системы для ионообменной хроматографии. Методы воздействия на хроматографическое разделение белков

3. Практическое применение высокоэффективной ионообменной хроматографии

3.1. Раздёление изоферментов.

3.2. Разделение гемоглобинов

ГЛАВА 1У. 0БРАТН0ФАЗНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

1. Методы получения обратнофазных носителей.

2. Общая характеристика обратнофазных носителей.

3. Влияние диаметра пор матрицы и процентного содержания углерода на разделение белков методом обратнофазной хроматографии.

4. Сольвофобная хроматография на обратнофазных носителях.

5. Ион-парная хроматография.

5.1. Ион-парная хроматография пептидов и белков.

6. Буферные системы для обратнофазной хроматографии.

6.1. Буферные системы для разделения пептидов и белков

ГЛАВА У. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ОБРАТНОФАЗНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ.

1. Применение обратнофазной хроматографии при исследовании гомологичных белков.

2. Применение высокоэффективной хроматографии при исследовании структуры белков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

I. МАТЕРИАЛЫ.

П. МЕТОДЫ

Ш. Разделение пептидов бромцианового расщепления фрагмента Т-5 обратнофазной хроматографией.

IV. Разделение продуктов гидролиза G-фактора трипсином по остаткам аргинина.

V. Выделение пептидов избирательным связыванием с инертным носителем.

УТ. Блокирование первичных аминогрупп пептидов флуорескамином

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА I. РАЗДЕЛЕНИЕ БРОМЦИАНОВЫХ ПЕПТИДОВ ФРАШЕНТА Т-5 ФАКТОРА ЭЛОНГАЦИИ EF-G МЕТОДАМИ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ГЛАВА П. РАЗДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ ГИДРОЛИЗА EF-G ТРИПСИНОМ ПО ОСТАТКАМ АРГИНИНА МЕТОДОМ ОБРАТНОФАЗНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ГЛАВА Ш. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЕПТВДОВ ПУТЕМ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ С

ТВЕРДОФАЗНЫМ НОСИТЕЛЕМ.

ГЛАВА 1У. АВТОМАТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПЕПТВДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ ПОСЛЕ РАСЩЕПЛЕНИЯ EF-G ПО СВЯЗИ Asp-Pro. БЛОКИРОВАНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ФЛЖСКАМИНШ.

ГЛАВА У. РЕКОНСТРУКЦИЯ СЕКВЕСТОРОВ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ, ЭФФЕКТИВНОСТИ И НАДЕЖНОСТИ АВТОМАТИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ПО

ЭДОАНУ

ВЫВОДЫ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУШ.

Установление первичной структуры белков является неотъемлемой частью изучения физико-химических основ их функционирования. Особый интерес для исследования представляют функционально важные белковые комплексы (мембранные рецепторы, компоненты биоэнергетических систем, компоненты белок-синтезирующих систем и т.д.). Другим актуальным направлением исследований является выделение белковых компонент иммунных систем организма, установление их первичной структуры и разработка методов иммуно-диагностики ранних форм раковых заболеваний. Кроме того, частичное выяснение структуры белков крайне необходимо при выведении их первичной структуры по последовательности нукяеотидов в гене.

Применение традиционных, крупномасштабных многостадийных методов разделения белков и смесей пептидов и установление их аминокислотных последовательностей затруднено из-за труднодоступ-ности белкового материала. Поэтому требуется создание необходимых методов и приемов работы, которые позволили бы проводить структурные исследования на ультрамшфоуровне.

Наиболее перспективным подходом для установления первичной структуры белков является создание комплекса методов, который включает одно-, двухстадийное выделение пептидов - продуктов расщепления исходной молекулы белка химическими или энзиматическими методами; автоматическую деградацию полученных пептидов на микроуровне в газофазном, жидкофазном и в твердофазном вариантах в и, наконец, высокочуствительное детектирование отщепленных производных аминокислот.

Для изучения физико-химических основ функционирования факторов элонгации (EP-G из E.cold,EP-2 из клеток эукариот в лаборатории химии белка Института белка АН СССР проводятся исследования их первичной структуры. Данная диссертационная работа является частью исследований по определению полной первичной структуры фактора элонгации ef-g.

Целью настоящей работы явилась разработка методических приемов, позволяющих проводить разделение пептидных смесей в одну-две стадии и открывающих возможность установления первичной структуры на микроуровне, в частности, разработка общих схем разделения пептидов бромцианового расщепления и триптических пептидов среднего размера (10-30 аминокислотных остатков) высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), а также методов избирательного связывания пептидов с полимерным носителем и установление н-концевых последовательностей аминокислот связанных пептидов автоматическим методом.

Другой задачей явилось усовершенствование секвенаторов для повышения эффективности проведения автоматической деградации по Эдману.

В результате цроделанной работы разработана схема разделения бромциановых и триптических пептидов методом ВЭЖХ, выделены бромциановые пептиды фрагмента и ряд пептидов из триптическо-го гидролизата фактора элонгации ef-g , одного из крупнейших белковых компонентов системы трансляции e.coli. Автоматическим методом Эдмана установлены и-концевые аминокислотные последовательности в пептидах, выделенных методом ВЭЖХ. Методом избирательного связывания выделен ряд пептидов фактора элонгации ef-g и установлена их аминокислотная последовательность.

Путем реконструкции жидкостного и твердофазного секвенаторов повышена надежность и чувствительность определения аминокислотных последовательностей. Разработанные методы и приемы позволили получить значительную информацию при реконструкции полной аминокислотной последовательности молекулы фактора элонгации ef-g.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В последнее время опубликовано несколько прекрасных обзоров (1-10), посвященных различным цроблемам разделения биологически активных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В настоящем обзоре литературы рассмотрены наиболее общие свойства носителей и подвижных фаз для высокоэффективной хроматографии, и практическое применение этого метода дом разделения микроколичеств пептидов и белков.

I. Классификация хроматограджческих методов.

Основные положения теории хроматографии

Любое хроматографическое разделение возможно, когда подвижная фаза вместе с которой перемещается разделяемое вещество, может быть газообразной или жидкой. В случае, если подвижная фаза газ, метод носит название газоадсорбционной хроматографии, если же подвижная фаза жидкость, то это жидкостная хроматография. Жидкостную хроматографию можно классифицировать по способу разделения на несколько видов: адсорбционную, ионообменную (II), ситовую (или гель-проникающую) (12) и обратнофазную (13).

Для цростых соединений, разделяющихся при прохождении через колонку, цроисходит взаимодействие как со стационарной, так и с подвижной фазами (14). Степень удерживания вещества в неподвижной и подвижной фазах может быть охарактеризована коэффициентом распределения К'. Отношение двух коэффициентов при постоянных внешних условиях является мерой селективности (<* ) разделительной колонки.

Разрешение двух компонент характеризуется величиной (R), определяемое расстоянием между максимумами двух пиков, выраженным как разность времен удержания и среднеарифметической шириной обоих пиков у основания. Коэффициент разрешения математически связан с другими параметрами хроматографического разделения, в результате получается одно из важнейших уравнений хроматографии: где ж - число эффективных теоретических тарелок, определяемое как t I2 n = 16 [£т

Знание числа эффективных теоретических тарелок для одного типа носителя позволяет провести сравнение разделяющей способности двух или нескольких колонок.

Наиболее подробно общая теория жидкостной хроматографии, и в частности, высокоэффективной хроматографии, изложена в ряде обзоров (15,16).

I.I. Оптимальные условия ^оматогда^ического разделения

Оптимальными условиями разделения считаются такие условия, при которых удается добиться максимального разрешения при наименьшей затрате времени. Для данного типа носителя свойства разделительной колонки, а, следовательно, и оптимальные условия разделения, зависят как от способа заполнения колонки, так и от диаметра используемых частиц (17).

Влияние температуры на условия и время разделения сказывается только косвенно (18), так как с увеличением температуры снижается вязкость элюента, что приводит к увеличению скорости элю-ента при постоянном давлении. Значения коэффициентов диффузии с увеличением температуры также возрастают, что приводит к сужению зон разделяемого вещества. Кроме того, температура влияет на кинетику и термодинамику удерживания вещества.

Характерной особенностью высокоэффективной хроматографии является специфическое требование, предъявляемое к стационарным носителям, так как для достижения максимально возможного числа теоретических тарелок необходимы носители с малым диаметром частиц, оказывающих значительное сопротивление потоку элюента. В силу этого, стационарные фазы для ВЭЖХ должны быть устойчивы к действию давления.

П. Гель-шзоникаюшая хроматогоайия

Теоретически, гель-проникающая хроматография наиболее простейший и предсказуемый хроматографический метод. Поскольку пористые тела характеризуются удельной поверхностью, объемом и диаметром пор, то хроматографичеокое разделение макромолекул на таких носителях происходит за счет распределения молекул меаду подвижной и стационарной жидкостью, т.е. большие молекулы элюирутотся раньше, чем малые (12). Теория хроматографического процесса разделения подробно изложена в ряде книг и обзорных статьях (12,18, 19).

П.1. Стащона]эные$азы для высокоэффективной гель-проникающей эдроматох^афии

Для высокоэффективной жидкостной хроматографии необходимы фазы с твердой матрицей, преимущество которых заключено в том, что они не набухают, легче заполняются колонки с большим числом теоретических тарелок, обеспечивая при этом высокую проницаемость носителя независимо от давления. Разделение на таких фазах возможно с любым видом элюента. Перечисленные свойства значительно увеличивают возможности высокоэффективной гель-проникающей хроматографии.

В настоящее время выпускается два класса носителей для гель-хроматографии:

- неорганические, поверхностно-модифицированные носители; -органические носители с жесткой матрицей;

В последнее десятилетие были развиты методы получения жестких матриц с контролируемым размером пор на основе еиликагеля и пористого стекла. Описан метод (20) приготовления пористого стекла с размером пор от 40 до нескольких тысяч ангстрем. Аглютинацией субмикронных частиц еиликагеля получен другой пористый носитель (Zorbax) (21), с диаметром пор от 60 до 3000 А.

Эмульсионной полимеризацией полиэтоксисилана получен крупноо пористый силикагель с диаметром пор 300 А, размер которых может о быть увеличен до 3000 А кальцинированием (22).

Прямое использование неорганических носителей для гель-проникающей хроматографии не всегда возможно, так как отрицательно заряженные силанольные группы поверхности носителя либо адсорбируют катионные образцы, либо отталкивают анионные (23). Использование подвижной фазы с высокой концентрацией соли лишь частично устраняет эту проблему. Поэтому, для подавления активных группировок носителя, используют модификацию активных центров низкомолекулярными органосиланами.

выводы

1. Разработана общая схема разделения пептидов бромцианового расщепления и триптических пептидов среднего размера методом обратнофазной хроматографии. Выделены бромциановые пептиды фрагмента Т-5 и ряд пептидов трипсического гидролиза EF-G -фактора, модифицированного по остаткам лизина.

2. Автоматическим методом Эдмана определены и-концевые аминокислотные последовательности пептидов, выделенных обратнофазной хроматографией.

3. Разработаны методы избирательного выделения С-концевых гомосеринсодержащих пептидов из смеси. Определены последовательности 80 аминокислотных остатков в этих пептидах на твердофазном секвенаторе.

4. Разработан метод блокирования первичных аминогрупп пептидов, образующихся в результате неспецифического расщепления белка по связям Asp-Pro и автоматическим методом Эдмана определена последовательность 73 аминокислотных остатков в пептидах с N-концевым пролином. Установлены перекрытия бромциановых пептидов cbg-13, cbg-14, cbg-15 2 Двух фрагментов, т-4 и т-5 из ограниченного трип-синолиза ef-g.

5. Проведена реконструкция ряда систем жидкофазного секвенатора, позволившая сократить количество исследуемого пептидного материала при автоматическом методе Эдмана и увеличить надежность и чувствительность работы секвенатора. В результате чувствительность метода повышена в пять раз.

Я приношу свою искреннюю благодарность моему научному руководителю Юлию Борисовичу Алахову за поддержку и внимание к моей работе, за критические замечания, за помощь в выборе направления исследований

Всем сотрудникам лаборатории химии белка, оказавшим поддержку в выполнении данной работы.