Разработка микрометров анализа модифицированных и некодируемых аминокислот тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им. М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ИВАНОВ АЛЕКСАНДР РАЙДОВИЧ

РАЗРАБОТКА МИКРОМЕТОДОВ АНАЛИЗА МОДИФИЦИРОВАННЫХ П НЕКОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТ

Специальность: 02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных я физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

МОСКВА 2000

Работа выполнена в группе аналитической химии белка Ордена Трудового Красного Знамени Инспптта биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН

Научный руководитель:

кандидат химических наук И.В.Назимов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Л.Д.Румш

кандидат химических наук Л.Ю.Скляров

Ведущая организация:

Московский Государственный Университет им. М.ВЛомоносова

Защита состоится » 2000 года в часов на

заседании Специализированного СоЕета Д 002.35.01 при Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН по адресу: 17871 ГСП-7, Москва В-437, ул.Миклухо-Маклая, 16/10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорпишческой химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН.

Автореферат разослан«-^» 2000 года.

Учёный секретарь Специализированного Совета, доктор химических наук

В.А.Несмеянов

Актуальность работы.

Определение аминокислотного состава и аминокислотной последовательности пептидов и белков являются необходимыми стадиями структурно-функциональных исследований. Первичная структура в значительной мере определяет физиологическую активность и физико-химические свойства пептидов и белков. Свободные аминокислоты, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение, изменение их концентраций часто является маркером метаболических нарушений. Помимо двадцати «обычных» белковых аминокислот, существует множество соединений этого класса, отличающихся от «обычных» аминокислот структурой радикала боковой цепи, либо пространственной конфигурацией, либо способом включения в полипептидный остов. В основном, модифицированные аминокислоты являются продуктами либо посттрансляционных модификаций аминокислотных остатков в составе пептидов и белков, кодируемых геномами организмов, либо метаболических ферментативных превращений, в том числе, свободных природных «обычных» аминокислот. Постгрансляционная модификация аминокислотных остатков пептидов и белков - важное явление, встречающееся в различных живых организмах - от вирусов до млекопитающих. Другой тип «необычных» аминокислот - некодируемые аминокислоты, - синтетические аналоги, не встречающиеся в природе ни в пептидах и белках, ни в свободном виде. Синтетические пептиды, содержащие такие аминокислоты, представляют большой интерес как аналоги биологически активных природных пептидов с изменёнными свойствами, необходимые для исследования механизмов ферментативных реакций и межклеточных взаимодействий. До сих пор идентификация модифицированных и некодируемых аминокислот остаётся одним из наиболее сложных этапов структурных исследований. Условия реакций, используемые в классических методах аминокислотного анализа и пептидно-белкового секвенирования могут изменять или разрушать ковалентно модифицированные остатки, либо являются недостаточно чувствительными и селективными для идентификации упомянутых аминокислот, присутствующих в природных источниках в низких концентрациях. Кроме того, идентификация свободных аминокислот и аминокислотных остатков пептидов обычно основана на известных хроматографических подвижностях двадцати генетически кодируемых аминокислот, и «необычные» аминокислоты могут быть не узнаны или утеряны. Таким образом, в настоящее время существует проблема высокочувствительного надёжного определения

некодируемых и модифицированных аминокислот в свободном виде и в составе пептидов и белков как для решения структурных задач, так и для клинико-диагностических целей.

Цель работы. Эта работа посвящена разработке комплекса инструментальных высокочувствительных методов идентификации и анализа различных некодируемых и модифицированных (фосфорилированных, гидроксилированных) аминокислот как в природных и синтетических пептидах, так и в свободном виде (гомоцистеина) в плазме крови.

Научная новизна и практическая ценность работы.

1. Разработаны методики для однозначной идентификации аминокислотных остатков 1-аминоциклогексан- 1-карбоновой кислоты, 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты и 1-аминоциклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты, О-фосфорилированных аминокислот, 5-гидроксилизина в пептидах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), высокоэффективного капиллярного электрофореза (ВЭКЭ), масс-спектрометрии (МС), автоматического газофазного секвенирования и приёмов микросинтеза.

2. Впервые выделен и охарактеризован ряд биологически активных пептидов морских кольчатых червей - полихет, показано, что полихеты являются потенциальными источниками пептидов с функционально ценными свойствами и необычными структурами.

3. Разработана методика скоростного анализа гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови для применения в клинической диагностике кардиососудистых, нейродегенеративных и других ненаследственных и наследственных нарушений метаболизма.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Содержание работы.

Анализ некодируемых аминокислотных остатков в синтетических пептидах Пептиды, содержащие генетически некодируемые аминокислоты, а именно, аминокислоты с циклическими боковыми радикалами (циклопентил, циклогексил и их аналоги с различными заместителями) используются для исследований лиганд-

рецепторных взаимодействий и механизмов ферментативных реакций вследствие жёсткости пространственных структур таких радикалов в модельных пептидах и их предсказуемой расчётными методами пространственной конфигурации. Для подтверждения структуры синтезированных пептидов и определения путей метаболизма таких биологически активных пептидов irt vivo необходима разработка методов идентификации этих АК остатков в аминокислотной последовательности. Присутствие таких некодируемых АК остатков может быть подтверждено методами масс-спектрометрической фрагментации или прямым химическим определением по Эдману. Мы предпочли выбрать совместное применение инструментальных микрометодов (ВЭЖХ, ВЭКЭ, МС и автоматическое секвенирование), которое позволило повысить надежность определения на микроуровне остатков упомянутых аминокислот. Для идентификации некодируемых АК (1-аминоциклогексан-1-карбоновой кислоты (АК1), 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты (АК2) и 1-аминоциклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты (АКЗ)) были синтезированы З-фенил-2-тиогидантоины (ФТГ) этих АК, затем очищены методом обращённо-фазовой ВЭЖХ (ОФВЭЖХ), их гомогенность была подтверждена ВЭКЭ, а структура - методом МС (MALDI TOF). Для секвенирования по методу Эдмана пептидов, содержащих остатки АК1, АК2, АКЗ, были разработаны методики разделения смесей (ОФВЭЖХ и МЭКХ (мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографией)), содержащих ФТГ производные обычных генетически кодируемых аминокислот, так и синтезированные стандарты ФТГ

необычных аминокислот (Рис.1,3).

H2N СООН H2N СООН H2N. .СООН

О

1-аминоциклогексан- 4-аминотетрагидропиран- ! 1-аминоциклогексан-1,4-

1-карбоиовая 4-карбоновая кислота СООН диКарбоновая кислота

кислота (АК1), (АК2) (АКЗ)

Различия в структуре радикалов боковых цепей аминокислот, определяющие электрофоретические и хроматографические подвижности их ФТГ производных, позволяют добиться приемлемого разделения стандартов как при ВЭЖХ, так и при ВЭКЭ. Перечисленные методы (микропрепаративный синтез, ВЭЖХ, ВЭКЭ, МС, автоматическое секвенирование) были применены к определению первичной структуры пептидов, содержащих остатки АК1 и АК2 (упомянутые аминокислоты и пептиды, содержащие АК 1 и АК 2, предоставлены д.х.н. В.П.Дёмушкиным и сотр.).

з

рис.1. ОФВЭЖХ смеси ФТГ АК (-20 пмоль каждой из 19 ФТГ обычных АК и-35 пмоль ФТГ АК1 (Рис.1 а), -35 пмоль ФТГ АК2 (Рис.1 б) и -15 пмоль ФТГ АКЗ (Рис.1 в)). Колонка: РТН С18 (220x2.1мм, 5 мк.м, Brownlee), скорость потока - 325 мкл/мин, детектирование - при 269 нм; элюенты: А-5% тетрагндрофуран в воде, В - ацетонитрил; профиль градиента: 0-0.04 мин - 8%В, 8-44%В -за 17.6 мин, 44-90%В -за 0.5 мин, 90°'оВ - за 2.5 мин, 90-8%В - за 0.5 мин. Обшее время анализа: 21.5 мин.

ФТГ 5-гидроксилизина был синтезирован, очищен ОФВЭЖХ и подвергнут МС анализу. ФТГ 5-гидроксилизина предполагается использовать в качестве стандарта при секвенировании пептидов коллагена. В ходе эксперимента стандартная методика Эдмана была модифицирована для микрозагрузок. Оптимизация условий синтеза ФТГ проводилась ВЭЖХ анализом соответствующих реакционных масс.

При разработке ВЭКЭ идентификации ФТГ АК методом мицеллярной электрокинетической капиллярной хроматографии была проведена оптимизация условий разделения многокомпонентных смесей фенилтиогидантоиновых производных аминокислот и побочных продуктов деградации по Эдману по следующим параметрам разделения:

•Влияние рН на время миграции ФТГ АК и их разрешение при МЭКХ анализе было исследовано с использованием 5 мМ боратного буфера в 200 мМ додецилсульфате натрия (ДСН). рН разделяющего буфера изменяли в диапазоне 7.5-^11.5. Лучшее разрешение компонентов смеси ФТГ АК и наилучшая воспроизводимость времён удерживания получены при рН 10.03.

13

МЭКХ идентификация ФТГ аминокислот.

1 -пик электроосмотического потока (ЭОП); 2 - аспарагиновая кислота; 3 - глутаминовая кислота; 4 -аспарагин; 5- дегидроаданин; 6 - серии; 7 - треонин; 8 - глицин; 9 - глутамин; 10 - гистидин; 11 -диметилфенилтиомочевина (сЗтрт); 12- аланин; 13 - сс-амино-изомасляная кислота; 14 - тирозин; 15 - а-аминомасляная кислота; 16-метионин; 17-валин; 18-пролин; 19-норвалин; 20-дифенилтиомочевина ((ЗрШ) ; 21 - изолейцин; 22 - лейцин; 23 - триптофан; 24 - фенилаланин; 25 - норлейиин: 26 -дифенилмочевина (с1ри); 27 - лизин; 28 - аргинин.

Капилляр: внутренний диаметр - 50 мкм, полная длина - 100 см, эффективная пина-75 см. Буфер: 200 мМ додецилсульфат натрия (ДСН), 5 мМ борат натрия. рН 10.03. Напряжение - 30 кВ, сила тока - 55 чкА. Время анализа - 45 мин. Время забора пробы - 5 сек. Скорость протяжки ленты интегратора: 0-7.5 мин. - 1 мч/мин.; 7.5-10 мин.-З мм/мин.; 10-13.5 мин,- 1 мм/мин.; 13.5-15 мин.-4 чм/мин.; 15-35 мин.-З мм/мин.; 35.5-37 мин. - 5 ммУмин.; 37-40 мин. - 3 мм/мин.; 40-45 мин. - 1 мм чин.

О 45 мин

Рис.3.

МЭКХ идентификация ФТТ аминокислот в смеси (-15 пмоль каждой из 19 ФТГ обычных АК и ФТГ АК1 (Рис.3 а), ФТГ АК2 (Рис.3 б) и ФТГ АКЗ (Рис.3 в)).

1- аспарагиновая кислота; 2- глутаминовая кислота; 3 - аспарагин; 4 - серии; 5 - треонин; 6-глицин; 7 — гдутамин; 8 - гистидин; 9 - диметилфенилтиомочевина (dmpш); 10- аланин; И -тирозин; 12 - метионин; 13 — валин; 14 - пролин; 15 — дифенилтиомочевина (dptu); 16 -неидентифицированный пик; 17 - изолейцин; 18 — лейцин; 19 - триптофан; 20 - фенилалании; 21 -дифеннлмочевина (йри); 22 - лизин; 23 - аргинин. Условия см. рис.2.

•Влияние ионной силы на разрешение было исследовано на боратных буферах пят

различных концентраций ((Ы 50 мМ), рН 10.0, содержащих 200л(Л/ДСН. Выбор низко

концентрации бората в буфере (5 мМ) обусловлен минимальным размыванием пиков;

также стремлением к уменьшению джоулевого тепловыделения, возрастающего пр

увеличении ионной силы разделительного буфера, что особенно важно пр

оптимизации времени разделения с использованием высоких напряжений.

•При уменьшении концентрации детергента в разделительном буфере ниже 130 мМ наблюдалось резкое ухудшение селективности разделения ФТГ АК. • При изменении температуры разделения от 30 до 45 °С наилучшие результаты удалось получить при температуре 30 °С, минимально возможной для используемой модели прибора.

Таким образом, условия МЭКХ идентификации ФТГ АК и побочных продуктов деградации по Эдману оптимизированы по перечисленным параметрам анализа (см. разделение 27 компонентов на Рис.2) и применены для идентификации фенилтиогидантоинов АК1, АК2 и АКЗ (Рис. 3).

Анализ фосфорилированных аминокислотных остатков.

Определение положения фосфоаминокислот в структуре пептидов и белков важно для изучения молекулярных механизмов клеточных функций, включающих процессы, контролируемые фосфорилированием белков. Наиболее часто используемыми методами для количественного и полуколичественного определения фосфорилированных остатков являются методы введения 32Р метки in vitro или in vivo в исследуемый белок и последующими хроматографией или электрофорезом и авторадиографией. Огромный интерес к определению местоположения сайтов фосфорилирования в фосфобелках вызван необходимостью изучения специфичности протеинкиназ и понимания влияния фосфорилирования на биологические функции белков. Проблема, возникающая при определении аминокислотной последовательности, заключается в том, что результаты прямого определения ФТГ О-фосфоаминокислот по стандартной процедуре деградации по Эдману часто не даёт надёжных результатов по причине нестабильности ФТГ производных О-фосфосерина и О-фосфотреонина. ФТГ производные этих остатков, получаемые при секвенировании, спонтанно разрушаются с выделением неорганического фосфата после стадии образования фенилтиокарбамоильных (ФТК) производных. Причиной этого является лабильность фосфоэфирной связи фосфорилированных аминокислот в щелочных условиях реакции Эдмана. Дальнейшее отщепление N-концевого остатка в виде ФТГ аддукга дегидроаминокислоты и дитиотреита приводит к неоднозначности идентификации отщеплённого остатка. Для решения данных проблем, особенно острых при секвенировании фосфорилированных по серину и треонину пептидов в микроколичествах, мы провели модификацию пептида по остаткам фосфоаминокислот, которая позволила нам получить их устойчивые ФТГ

производные. Остаток фосфорилированной аминокислоты, например О-фосфосерин, в щелочных условиях, в результате реакции р-элиминирования и последующего взаимодействия получаемого дегидроаланина с 2-меркаптоэтанолом, превращается в этанолтиоэфир. Аналогичные превращения в 3-метил-8-этанолцистеин претерпевает О-фосфотреонин. В данной работе для определения первичной структуры пептида, содержащего фосфосерин, используется такая модификация фосфопептида 2-меркаптоэтанолом. Таким образом, были получены аминокислотные остатки, модифицированные в боковой цепи, значительно более устойчивые в условиях реакции Эдмана, по сравнению с исходными фосфорилированными аминокислотами. Условия реакции модификации 2-меркаптоэтанолом подобраны так, что при обработке пептида, содержащего фосфорилированный серии или треонин, реакция протекает только по их фосфорилированным остаткам, не затрагивая другие аминокислотные остатки, содержащиеся в пептиде. После модификации пептида проводилось стандартное отщепление аминокислот по Эдману.

Мы применили реакцию р- элиминирования О-фосфорилированного остатка с последующей модификацией в щелочных условиях для структурного исследования пептида, фосфорилированного по серину. Были синтезированы ФТГ О-фосфосерина и О-фосфотреонина, модифицированных р-меркапоэтанолом. Реакционные смеси анализировали МАЬИ ТОР МЭ и целевые компоненты идентифицировали ОФВЭЖХ с последующим МАЬО! ТОР МБ анализом (Рис.4). Синтезированный ФТГ 5-этанолцистеина использовали для идентификации О-фосфосерина (Б*) в изучаемом пептиде (Я-К-БМ-Ги-О-Р-О-д-Т-Р-У-А-Т-О).

В данной работе предложен микроколоночный ОФВЭЖХ метод разделения фосфорилированного пегггида 11-К-8М-К-1-С-Р-0-<3-Т-Р-У-А-Т-0, его нефосфорилированного предшественника и соответствующего модифицированного пептида с использованием 0.1% ТФУК в воде и ацетонитрила. Далее исследуемый пептид подвергался модификации Р-меркагггоэтанолом и после этого очистке ОФВЭЖХ. Каждая форма пептида подвергалась анализу МАЬБ1 ТОР МБ (Рис.4), гомогенность выделенных форм пептида подтверждалась ВЭКЭ. После очистки модифицированный пептид секвенировали на газофазном секвенаторе и отщеплённые ФТГ АК идентифицировали ОФВЭЖХ. Фосфосериновый остаток был однозначнс определён на третьем цикле деградации по Эдману как ФТГ 8-этанолцистеина (Рис.5).

Инг

R-K-S-I-R-I-G-P-G-Q-T-F-Y-A-T-G

1750.9(M+íT) Нефосфорилирован-ный пептид (NP)

0=< .4 2 я,

но —Р = 0 РР он

У-N Н

У

МР

1812.5 (М+Н*)

Модифицированный пептид (МР)

1832.6

(М+ЬГ) Фосфорилированный пептид (РР)

1550 1600 1650 1700 1750 1900 1850 1300 12

Рис.4.

Масс-спектр пептида R-K-S-I-R-I-G-P-G-Q-T-F-Y-A-T-G в различных формах.

ФТГ S-этанолиистеина

2000 2050 M/z

ON

Я

я а с

3

В щ

о.

ОТ"

й 10 20 мин

Рис.5.

ОФВЭЖХ третьего цикла М-концевого анализа модифицированного пептида Р-С-О-Т-Р-У-А-Т-а (-10 пмоль). ОФВЭЖХ условия см. Рис.1.

О-гликозилированный серии склонен к быстрому р-элиминированию в щелочных условиях с образованием тех же производных, что и О-фосфосериновый остаток во время реакции модифицирования. Тождественность продуктов дефосфорилирования и дегликозилирования, образующихся при реакции Р-эл«минирования, не позволяет установить природу исходного соединения при идентификации только методами высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это ограничение преодолено в нашем подходе использованием масс-спектрометрического анализа пептида до и после

модификации (Рис.4) в дополнение к ВЭЖХ и ВЭКЭ анализам, что должно позволить отличить фосфорилированные остатки от гликозилированных. Таким образом, комплексный (ВЭЖХ, ВЭКЭ, МС) анализ исходных и модифицированных пептидов на микроуровне делает метод универсальным для О-фосфорилированных и О-гликозилированных серинов и высокочувствительным, с однозначной идентификацией каждой из упомянутых посттрансляционных модификаций.

В отличии от фосфосерина и фосфотреонина О-фосфотирозин более устойчив в условиях протекания реакции Эдмана, и ФТГ этой аминокислоты был получен без применения реакции модификации. Синтезированные, очищенные ОФВЭЖХ ФТГ 3-метил-5-этанолцистеина и ФТГ О-фосфотирозина анализировали МАЬО! ТОР МБ, в дальнейшем они могут быть использованы для идентификации О-фосфотреонина и О-фосфотирозина, соответственно, в пептидах и белках.

В результате проделанной работы разработана методика совместного использования инструментальных микрометодов идентификации фосфорилированных аминокислотных остатков в природных и синтетических пептидах. Данная методика может применяться для однозначного определения необычных аминокислот с различным типом бокового радикала на уровне ~ 1 Он-100 пикомоль стартового пептидного материала без использования радиоактивного изотопа 32Р.

Структурный анализ биологически активных пептидов, выделенных ю морских потает.

В последние несколько лет беспозвоночные стали пристальным объектом изучения, в них обнаружены пептиды, проявляющие ряд биологических активностей (миоакгивная, кардиовозбуждающая, опиатоподобная), аналоги вазопрессина и окситоцина, и др. Среди пептидов беспозвоночных найдены как структурные аналоги пептидов млекопитающих, так и пептиды с необычным строением. В некоторых изученных биологически активных пептидах беспозвоночных обнаружены разные виды модифицированных аминокислот (О-аминокислоты, гидроксилированные, алкилированные, галогенированные и т.д.). К началу нашего исследования была показана перспективность кольчатых морских червей - полихет как нового источника противоопухолевых и противовирусных соединений (д.х.н. Л.А.Елякова и др. сотрудники ТИБОХ РАН). Одной из причин, вызвавших наш интерес к структурному изучению пептидов морских беспозвоночных (рода полихет) с неисследованными

пептидно-белковыми структурами, была высокая вероятность обнаружения остатков необычных аминокислот в пептидах с интересными биологическими активностями.

Фракции водно-солевых экстрактов морских полихет были предварительно выделены по следующей общей схеме: 1) препаративная гидрофобная хроматография на Полихром-1 в ступенчатом градиенте изопропанола; 2) разделение биологически активных фракций высокоэффективной тонкослойной хроматографией (ВЭТСХ) на целлюлозных пластинках или 3) гель-фильтрация на Biogel Р-4. Некоторые фракции проявляли ингибиторную активность по отношению к ДНК-полимеразе I, вирусной обратной транскриптазе и РНК-полимеразе, а часть их имела опиатную активность (первичное выделение пептидных фракций проводила сотрудник ИБХ РАН д.х.н. Л.А.Елякова, биологические испытания проводила сотрудник ИМБ РАН к.б.н. В.Л.Туницкая). Выделенные таким образом биологически активные фракции подвергались более тонкому разделению обращённо-фазовой Cjg высокоэффективной хроматографией на пептидные подфракции и далее на индивидуальные компоненты.

В рамках тематики представляемой работы рассмотрим проведённый анализ одной из низкомолекулярных фракций пептидного экстракта полихеты Eunicidae, gen. sp., содержащей несколько биологически активных пептидов, в том числе, пептид, предположительно, с необычным аминокислотным остатком. Биологически активная пептидная фракция «3», была разделена на индивидуальные компоненты методом ОФВЭЖХ, проанализирована ВЭКЭ и MC. Первичные структуры выделенных пептидов были определены газофазным секвенированием по Эдману. Выделенный пептид W-V-G (см. Рис.6) подобен N-концевому фрагменту модифицированного пептида сна (W-A-G-G-D-A-S-G-E). Как известно, уже дипептид W-G, обнаруженный в гипофизе человека, продемонстрировал опиатоподобные свойства. Обнаруженные пептиды A-L-P-H-A и A-L-P-H-A-A являются аналогами консервативного фрагмента различных типов актина как высших, так и низших животных, и подобны фрагментам галанинов (...-L-G-P-H-A-...). Следующий выделенный из Eunicidae, gen. sp. пептид (Рис. 6) представляет наибольший интерес в связи с тематикой данной диссертационной работы. По материалам наших исследований пептид имеет аминокислотную последовательность: Y-P"-I-E-R. Предположение о «необычности» пролина во втором N-концевом положении пептида было сделано по результатам масс-спектрометрического анализа пептида (см. Рис.7) после выделения ОФВЭЖХ (см. Рис.6). Пептид имел массу, отличающуюся от расчётной на четыре дальтона. Было

1S 20 25 30 мин

Время элюции. Рис.6.

Микроколоночное ОФ ВЭЖХ разделение фракции 3-4, выделенной ВЭТСХ ю фракции экстракта полихеты Е gen.sp. (№3) (хроматограф «Милихром А-02»; колонка: Nucleosil С-18, 75x2 мм, dp 5мкм; элюент А: 0.1% элюент В: ацетонитрил; градиент: Омкл - 0Í4B; ЗООмкл - 5%В; 2200мкл - !5%В; температура - 35°С; скорость - 70 мкл/мин; объйм пробы 25 мкл; детекция - 210,280 нм.). Инт.

Y-P -I-E-R

M/z=672.2 (М+Н+)

694.2

710.2

(M+Na+) (М+К*)

Рис.7.

Масс-спектр фракши 3-4-2 Eunisidae, gen. sp. (№3), содержащей пептид Y-P*-I-E-R.

M/z

сделано предположение о наличие в выделенном пептиде генетически некодируемой аминокислоты тетрадегидропролина (пиррол-2-карбоновой кислоты, Р), что подкреплено литературными данными.

Ранее пиррол-2-карбоновая кислота была обнаружена в моче млекопитающих в свободном виде и в виде Ы-(пиррол-2-карбоксил)глицина как продукт метаболизма 4-гидроксипролина и деградации сиаловых кислот. Также пиррол-2-карбоновая кислота и её гомологи были обнаружены в виде аминокислотных остатков в антибиотике штамма $1гер1отусез хап&ос'иксиз, олигопегггидных антибиотиках группы дистамицинов из &гер1отусе$ ¿¡¡¿¡аИсш и в циклодепсипептидных антибиотиках кохиномицинах, антогонистах пептидного гормона эндотелина, выделенных из М'югоЬ'ирога ¿р. При

ВЭЖХ анализе времена удерживания отщеплённого на секвенаторе ФТГ второго аминокислотного остатка пептида ФТГ Pro* и синтетического стандарта ФТГ Pro практически совпадают. Предположение о структуре пептида Y-P'-I-E-R требует дополнительного подтверждения другими аналитическими приёмами. Проведение ЯМР анхтиза этого пептида в настоящий момент невозможно из-за труднодоступности исходного материала. В дальнейшем планируется проведение препаративного выделения данного соединения и сравнительный анализ (ВЭЖХ, ВЭКЭ, MC, биоиспытания, секвенирование) с синтетическим аналогом. Пептид Y-P-I-E-R гомологичен N-концевым фрагментам пептида YY (кишечный гормон Y-P-I-K-P-E-A-P-G-...) и экзорфина С (Y-P-I-S-L) и близок по структуре Туг- MIF-I (Туг-меланоцит-ингибирующий фактор Y-P-L-G-NH2, для человека MIF-1 является антагонистом аналгезии, вызванной наркотиками, т.е. может служить для снятия наркотической депрессии). Пептид Y-P -I-E-R показал активности по отношению к полимеразным ферментам.

Таким образом, в данной работе показано наличие в беспозвоночных пептидов, проявляющих ряд ценных биологических активностей, кроме того, обнаружен биологически активный пептид, предположительно содержащий необычную аминокислоту (пиррол-2-карбоновую кислоту).

Анализ гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови.

Изменение содержания модифицированной аминокислоты гомоцистеина (Hey), как и других низкомолекулярных аминотиолов (цистеина (Cys), глутатиона (GSH)) в плазме крови и иных физиологических жидкостях является маркером многих нарушений метаболизма, в т.ч. кардиососудистых и нейродегенеративных заболеваний. Поскольку более 90% низкомолекулярных аминотиолов (AT) плазмы крови находятся в связанном состоянии (дисульфидными связями, главным образом, с альбумином), то общее содержание гомоцистеина (tHcy), цистеина и глутатиона определялось в плазме крови человека в несколько этапов: 1) восстановление дисульфидных связей трифенилфосфином; 2) депротеинизация плазмы крови; 3) модификация аминотиолов плазмы монобромобиманом (шВгВ); 4) разделение модифицированных низкомолекулярных аминотиолов ОФВЭЖХ с флуориметрическим и фотометрическим детектированием или ВЭКЭ с фотометрическим детектированием.

Модификация цистеина (-2.4 нмоль) при разных рН реакционногой смеси. Колонка: >1ис1ео5П С18, 5-мкм (7 температура 35°С, скорость потока 75 мкл/мин; Условия элюированил: Профиль 1.5.: 0 мкл - 6%В; 900 мкл 1820 мкл - 12%В; 2800 мкл - 50%В; скорость потока: 75 мкл/мин;

В данной работе использовались два вида детектирования аминотиолов дл разработки метода и рутинных анализов плазмы. ВЭЖХ система, оснащённа спектрофотометрическим детектором, использовалась преимущественно дл оптимизации химических этапов метода и рутинного анализа стандартов аминотиоло (Рис.8). Система ОФВЭЖХ с флуориметрическим и фотометрическим детекторам использовалась для оптимизации разделения и детектирования производны аминотиолов при анализе плазмы крови. Затем эта система была усовершенствована дл рутинного анализа плазмы (Рис.9-13,). Длина волны возбуждения флуоресценци монобиман-тиолов при флуориметрическом детектировании: 300 нм, эмиссии: 470 m Длина волны фотометрического детектирования 250 нм была выбрана как локальны максимум экстинкции тиол-бимановых коньюгатов. Более высокая селективность

чувствительность флуориметрнческого детектирования позволяли проводить количественный анализ АТ-тВ коньюгатов в более широком диапазоне концентраций АТ точнее и надёжнее, по сравнению с использованием фотометрического детектирования. Однако, и более дешёвый, и поэтому более распространённый фотометрический детектор также может быть успешно применён для достоверного определения высоких патологических концентраций гомоцистеина, а также других аминотиолов плазмы.

При разработке нашего метода мы стремились объединить сильные аспекты ранее опубликованных методических решений, упростить систему пробоподготовки и разработать эффективные и удобные хроматографические условия разделения с фотометрическим и флуориметрическим определением производных АТ. В соответствии с результатами анализов, показанными на Рис. 9-13, эти попытки привели к приемлемому разделению АТ-монобимановых (АТ-тВ) коньюгатов исследуемых аминотиолов, позволившему получить количественные данные, воспроизводимые в условиях данной работы и хорошо коррелирующие с ранее опубликованными.

Определение общего содержания низкомолекулярных аминотиолов в плазме (как и в сыворотке) крови требует восстановления дисульфидных структур. В данной работе использованы подкисление и добавление ЕОТА для удаления катионов тяжёлых металлов, - приёмы, обычно применяемые для подавления окислительных процессов. Трифенилфосфин (ТФ) выбран в качестве восстанавливающего агента по причине высокой реакционной способности и безопасности в использовании. Мы разработали условия быстрого и полного восстановления дисульфидов с высвобождением низкомолекулярных АТ со свободными сульфгидрильными группами. Применение ТФ позволило получить более надёжные и воспроизводимые результаты, чем использование борогидридов натрия и калия. Стадия восстановления не увеличила существенным образом общее время анализа. Для предотвращения ре-окисления аминотиолов перед стадией дериватизации в разработанном методе применяется большой избыток трифенилфосфина. Добавление соляной кислоты в раствор трифенилфосфина создает условия для каталитического восстановления дисульфидов.

Для депротеинизации плазмы крови была использована 44% сульфосалициловой кислота. Из разнообразных тиол-специфических модифицирующих агентов мы выбрали шВгВ исходя из следующих посылок: АТ-монобимановые аддукты обладают высокой флуоресценцией, что является существенным для измерения низких концентраций

аминотиолов в плазме; шВгВ быстро (менее двух минут) реагирует со свободными тиолами при комнатной температуре. Более того, высокая экстинкция АТ-шВ позволила нам оптимизировать стадии восстановления и модификации стандартов и выполнить первые оценочные анализы с использованием ВЭЖХ системы, оснащённой УФ-детеетором, для качественного и количественного определения АТ в плазме. Монобромобиман является относительно стабильным в водно-ацетонитрильных растворах при хранении в темноте при -20°С.

Хорошо известно, что в физиологических условиях тВгВ мгновенно образует коньюгаты с тиолами. Максимальный выход монобиман-тиольных производных наблюдался при рН -8.5 (Рис.8). Оптимальное значение рН реакционной среды после стадии кислотной депротеинизации достигалось защелачиванием гидроксидом натрия. Поэтому перед модификацией образца монобромобиманом рН повышали до ~8,5 добавлением 15 мкл 1 М гидроксида натрия. Оптимизация по значению рН позволяла избежать добавления большого избытка тВгВ и минимизировать образование флуоресцирующих побочных продуктов, возникающих при гидролизе монобромобимана, усложняющих разделение и детектирование АТ-монобимановых коньюгатов.

Дальнейшая оптимизация метода заключалась в разработке наиболее эффективных условий быстрого хроматографического анализа модифицированных аминотиолов. Быстрое и селективное разделение АТ-монобимановых коньюгатов (Рис, 9-13), обеспечивает хорошую корреляцию количественных характеристик, получаемых разработанным методом, с данными, опубликованными ранее. Был разработан мето; быстрого хроматографического разделения с использованием предложенной ранее системы элюентов: 30 мМ нитрат аммония, 40 мМ формиат аммония - ацетонитрил, \ показана сильная зависимость селективности разделения тВ-АТ производных от рр подвижной фазы (Рис.9). Для быстрого качественного и количественного определен»; гомоцистеина и глутатиона в изократических условиях элюирования разработан условия разделения тВ-АТ с использованием широко распространённой элюционно! буферной системы вода-0.1% ТФУК- ацетонитрил (Рис.12, 13). Предложении! изократический метод выполняет основную задачу (определение содержани гомоцистеина) за очень короткое время (меньше 5 мин) сравнимое с описанным! условиями разработанного нами градиентного разделения производных аминотиоло (Рис.9-11) и опубликованными методами разделения, выгодно отличаясь сокращениеу

0.6

Нсу

0.6

Сув

10 мин 0

Нсу

и/"

О.б

Н у

СУ5

(¡БН

и*

10 мин о

10 мин

рН 3.5 рНЗ.б рН 3.7

а) 6) в)

Рис.9. ОФВЭЖХ монобимановых производных аминотиолов с ф"у°риметр ическим детектированием. Влияние рН элюцнонного буфера А на селективность разделения тВ-аминотиолов. Содержание аминотиолов: 200.0 нмоль/мл - для цистеина (а) - 2.94 мин, б) - 2.97 мин, в) -2.93 мин), 450.0 нмоль/мл-для гомоцистеина ( а) - 5.07 мин, б) - 5.10 мин, в) - 5.04 мин) и 180.0 нмоль/мл - для глутатиона (а) - 5.61 мин, б) -5.48 мин, в) - 5,29 мин). Профиль градиента олюирования: 0 мин - 5% В; 0-5 мин- 5-9% В; 5-9 мин - 9-100% В (Профиль З.2.). Элюент А: 30 тМ нитрат аммония 40 тМ формиат аммония а) рН 3.5, б) рН 3.6, в) рН 3.7; элюент В - ацетонитрил. Колонка (75x4.6 мм), (Лй^рЬеге ОЭБ, 3-мкм. Температура колонки 25°С.

расхода элюента (более чем в два раза).

Оптимизация условий ОФВЭЖХ алкилированных аминотиолов позволила добиться быстрого и воспроизводимого разделения применительно к определению низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови, что и было использовано в дальнейшем для рутинных клинических анализов. Градиентное разделение и идентификация гомоцистеина, цистеина и глутатиона в человеческой плазме показаны на Рис.10, 11, в изократических условиях - на Рис. 12, 13. В описанных условиях коныогат гомоцистеин-монобимана имеет время удерживания 5.06 (+0.09) мин в градиентном профиле элюции и 4.70 (±0.06) мин - в изократических условиях; глутатион-монобиман - 5.47 (±0.11) мин и 5.27 (±0.12) мин, соответственно, и цистеин-монобиман, шВ-производное основного низкомолекулярного аминотиола плазмы крови, элюирует со временем удерживания 2.96 (±0.06) мин в элюционном градиентном профиле.

Калибровочные кривые для измерения гомоцистеина, цистеина и глутатиона были построены с помощью добавления заведомо известных количеств экзогенных стандартов ОЬ-теяо-гомоцистина, Ь-цистина или окисленного глутатиона к нормальной плазме здорового донора; описанной процедуры, включающей восстановление

0.6

а

и 8.

4/ji

ц

0.1 AU

«С'

Всу

г' » А

} ih VGSH

j

О 4 8 мин 0 4 8 мин

Рис.11. ОФВЭЖХ аминотиолов в плазме крови с фотометрическим детектированием. Концентрации и условия см. Рис.10.

Рис.10. ОФВЭЖХ аминотиолов в плазме крови с флуоресцентным детектированием. Содержание аминотиолов: 181.4 нмоль/мл - для цистеина (3.03 мин), 67.5 нмоль/мл (патология) - для гомоцнстеина (5.09 мин) и 5.7 нмоль/мл -для глутатиона (5.51 мин). Элюент А: 30 шМ нитрат аммония 40 тМ формиат аммония, pH 3.6; элюэнг В -ацетонитрил. Профиль элюирования 3.2.: 0 мин - 5% В; 0-5 мин- 5-9% В; 5-9 мин-9-100% В; 10-11 мин- 100-5%В. Скорость потока: 1.5 мл/мин. Инжектируемый объём: 7.5 мкл. Колонка (75x4.6 мм), Ultrasphere ODS, 3-мкм. Температура колонки 25°С.

дисульфидов, депротенизацию, , модификацию тВгВ; и дальнейшего хроматографического анализа. Общее содержание (мкмоль/л) трёх указанных AT в плазме (±SD), полученное при использовании разработанных условий хроматографического анализа с флуориметрическим детектированием в плазме крови 17 здоровых мужчин, взятой из вены утром, натощак, представляло собой 219.32 (±31.14) -для Cys; 11.68 (±3.67) - для Hey и 7.12 (±2.61) - GSH, а в плазме 16 здоровых женщин -было 215.28 (±34.57) - для Cys, 9.75 (±2.91) - для Hey и 6.63 (±2.49) - для GSH. Эти результаты подобны ранее опубликованным данным по содержанию аминотиолов е плазме. Метод был применён для определения содержания AT в крови пациентоЕ кардиореанимации и в ряде случаев продемонстрировал патологический уровеш содержания tHcy (Рис. 10-13).

Точность метода внутри параллельных определений рассчитывала« поочерёдным инжектированием одинаковых аликвот одного и того же образца в

0.6

а

и 8.

О 1 A4

/GSH

V чсу

ШSH

_1_

_1_

-I

О 2.5 5 7.5 мин

Рис.13. Определение

аминотиолов в плазме крови изократической ОФВЭЖХ с фотометрическим детектированием. Концентрации и условия см. Рис. 12.

О 2.5 5 7.5 мин Рис.12. Определение аминотиолов в плазме крови изократической ОФВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Содержание аминотиолов: 97.3 нмоль/мл (патология) - для гомоцистеина (4.65 мин) и 10.8 нмоль/мл - для глутатиона (5.22 мин). Профиль элюирования 3.3.: Профиль 3.3.: 0 мин - 12.5%В; 7.5-8 мин - 12.5100% В, 9-10 мин - 100-12.5%В. Скорость потока: 0.75 мл/мин. Инжектируемый объём 5 мкл. Колонка (75x4.6 мм), Ultrasphere ODS, 3-мкм. Температура колонки 25°С.

систему ОФВЭЖХ трижды для каждого элюирующего состава (Профили 3.2. и 3.3., Рис.10, 12) и сравнением абсолютных площадей пиков производных гомоцистеина, цистеина и глутатиона, получаемых при каждом вводе пробы. Таким образом, были получены коэффициенты стандартного отклонения внутри одной пробоподготовки, которые составляли 1.83% - для Cys, 1.69% - для Hey и 1.88% - для GSH. Точность метода между параллельными определениями рассчитывалась дериватизацией трёх одинаковых аликвот одного и того же образца плазмы и независимым анализом одинаковых аликвот трёх получившихся реакционных смесей на системе ОФВЭЖХ для каждого элюирующего состава (Профили 3.2. и 3.3., Рис.10, 12). Аналитическая точность 4.91%RSD была получена без использования внутреннего стандарта. Чувствительность метода позволяет детектировать ~2+5 пмоль аминотиола. Разработанный ВЭЖХ анализ с применением только фотометрического детектирования позволяет с высокой надёжностью определять Hey на патологическом уровне концентраций (>30 нмоль/мл) в плазме крови с помощью наиболее дешёвого, распространённого и доступного УФ-детектора.

2

Чувствительность разработанного метода сравнима с чувствительностью опубликованных методов определения низкомолекулярных аминотиолов. Хорошее хроматографическое разрешение, низкий шум, комбинация двух типов детектирования, линейность калибровочных кривых во всём требуемом диапазоне концентраций АТ, а также высокая интенсивность флуоресценции АТ производных обусловили точность и надёжность определения. Разработанные условия хроматографии просты в исполнении, не требуют использования сложных и дорогостоящих подвижных фаз и применения нескольких колонок разных типов.

Разработанный метод имеет следующие преимущества: 1) высокая восстанавливающая активность трифенилфосфина; 2) высокая реакционная способность и специфичность дериватизации тиолов монобромобиманом; 3) отсутствие флуоресценции модифицирующих реагентов и высокая интенсивность флуоресценщп целевых продуктов дериватизации; 4) простой процесс пробоподготовки; 5) малаг степень гидролиза алкилирующего агента в условиях реакции дериватизации оптимизированных по температуре и рН реакционной среды; 6) быстро« хроматографическое разделение модифицированных аминотиолов; 7) использованш простых и широко распространённых подвижных фаз; 8) одновременное определена всех трёх упомянутых низкомолекулярных аминотиолов.

Анализ гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы кров: методом ВЭКЭ.

Общее содержание гомоцистеина, цистеина и глутатиона в человеческой плазм крови определялось в несколько этапов: 1) восстановление дисульфидо трифенилфосфином; 2) депротеинизация сульфосалициловой кислотой; 3) модификаци восстановленных аминотиолов монобромобиманом; 4) разделение аминотиох монобимановых коньюгатов методом зонального высокоэффективного электрофореза фотометрическим детектированием. Пробоподготовка первых трёх этапе производилась аналогично вышеописанной процедуре обработки плазмы крови пере хроматограф ическими анализами. Таким образом, один и тот же образец мс подвергаться как хроматографическому анализу, так и капиллярн электрофоретическому. Длины волн детектирования 234 нм и 250 нм были выбраны ке локальные максимумы тВ-аминотиолов. В данной работе показано, чп фотометрическое детектирование может быть успешно применено для определен!

итологических концентраций гомоцистеина, а также других ннзкомолекулярных

1мин0ти0л0в.

Разделение стандартов аминотиолов. Разделение до базовой линии методом юнального капиллярного электрофореза модифицированных монобромобиманом "омоцистеина, цистеина и глутатиона (соединения указаны в порядке миграции) троведено менее, чем за 10 мин (Рис.14 а). При описанных условиях разделения 'омоцистеин-монобимановый коньюгат имеет время миграции 6.01 (±0.19) мин; -лутатион-монобиман - 8.72 (±0.22) мин, соответственно, и цистеин-монобиман, эсновной низкомолекулярный аминотиол плазмы, элюирует со временем миграции 7.46 [±0.15) мин.

ВЭКЭ анализ плазмы. Модифицированные аминотиолы плазмы элюировали с шалогичными временами миграции в тех же условиях разделения (Рис.14 а, б). Калибровочные кривые для гомоцистеина, глутатиона и цистеина плазмы были аналогично схеме, описанной для хроматографического анализа. Общие концентрации (мкмоль/л) трёх аминотиолов (±SD) в плазме крови, полученной из вены, натощак, утром из 17 здоровых мужчин (23^-58 лет) составили: 211.32 (±36.44) -для Cys; 12.21 (±4.09) -для Hey и 7.68 (±2.43) - для GSH, а также из 16 здоровых женщин (21-ь46 лет) составили: 209.83 (±31.48) - для Cys, 9.51 (±2.90) -для Hey и 7.16 (±2.94) -для GSH. Данные результаты сходны с вышеуказанными данными, полученными с помощью хроматографических анализов (см. выше), а также с описанными в литературе. Метод также использовался для определения содержания указанных аминотиолов в плазме крови пациентов кардиологической реанимации и в ряде случаев продемонстрировал обнаружение патологического содержания гомоцистеина (Рис.14 б).

Статистические характеристики надёжности метода ВЭКЭ анализа, его воспроизводимости определялись аналогично хроматографическому анализу. Стандартный коэффициент отклоненга внутри параллельных определений для аликвот одного образца составил 3.73% - для Cys производного, 3.06% - для Hey производного и 3.69% - для GSH производного. Величина стандартного коэффициента отклонения между параллельными определениями для повторно приготовленных реакционных смесей из одинаковых аликвот одного образца плазмы (4.97%RSD) была получена без применения внутреннего стандарта. В соответствии с Рис.14 разработанный метод позволяет получить приемлемое разделение АТ-монобимановых коньюгатов.

обеспечивая достоверный количественный анализ, дающий хорошую корреляции: полученных данных с опубликованными ранее. Высокое электрофоретическоб разрешение в подобранных условиях анализа, низкий шум, линейность стандартны? калибровочных кривых, а также значительное фотометрическое поглощение А1 производных обеспечивает приемлемую точность метода. Его чувствительносп сравнима другими вариантами фотометрического анализа низкомолекулярны? аминотиолов. Показано, что для надёжного определения Шсу в плазме в патологически? концентрациях достаточно использования ВЭКЭ с широко распространенны?, фотометрическим детектированием.

Рис.14 а. Рис.14 6. Рис.14 в.

Рис.14. ВЭКЭ аминотиолов с фотометрическим детектированием (234 нм): а) ВЭКЭ разделение стандартов аминотиолов. Содержание AT: 1700 нмоль/мл - для гомоцистеина (6.15 мин), 800.0 нмоль/мл - для цистеина (7.51 мин) и 900.0 нмоль/мл - для глутатиона (8.81 мин), б) ВЭКЭ анализ плазмы крови. Содержание аминотиолов: 57.6 нмоль/мл - для гомоцистеина (патология) (6.19 мин), 185.2 нмоль/мл-для цистеина (7.56 мин) и 5.1 нмоль/мл - для глутатиона (8.86 мин), в) ВЭКЭ анализ плазмы крови: 7.67 нмоль/мл — для гомоцистеина (норма) (6.20 мин), 181.4 нмоль/мл - для цистеина (7.46 мин) н 10.06 нмоль/мл - для глутатиона (8.79 мин). Пик, обозначенный звёздочкой, соответствует продукту гидролиза монобромобимана. Буфер: 80 мМ фосфат натрия, pH 8.0. Капилляр: 80 см (эффективная длина 60 см)х50 мкм I.D. Напряжение: +250 V/см, сила тока: -67 цА; температура: 30°С, время ввода пробы: 7 сек.

Помимо перечисленных выше преимуществ разработанной пробоподготовки пр анализе плазмы, данный капиллярный электрофоретический метод имеет следую [щ преимущества: 1) для исследования необходим очень малый объём анализируемс пробы; 2)простая пробоподготовка идентична таковой для описанного выше ОФВЭЖ анализа аминотиолов плазмы крови человека; 3) одновременное определение все

помянутых выше аминотиолов в ходе одного анализа; 4) метод ВЭКЭ дешевле роматографического; 5) использует простой, широко распространённый фосфатный уфер; 6) небольшая длительность анализа (~10 мин).

Выводы.

1. Синтезированы, выделены и охарактеризованы методами ВЭЖХ. ВЭКЭ, МС устойчивые фенилтиогидантоиновые производные 1-аминоциклогексан-1-карбоновой кислоты, 4-амннотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, 1-аминоциклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты, О-фосфосерина, О-фосфотреонина, О-фосфотирозина и 5-гидроксилизина.

2. Разработана методика однозначной идентификации некодируемых и модифицированных аминокислотных остатков в синтетических и природных пептидах в виде фенилтиогидантоиновых производных с использованием комплекса инструментальных микрометодов анализа, включающего высокоэффективную жидкостную хроматографию, высокоэффективный капиллярный электрофорез, масс-спектрометрию, автоматическое газофазное секвенирование. С помощью синтезированных производных в пептидных образцах были определены аминокислотные остатки 1-аминоциклогексан-1-карбоновой кислоты, 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты и фосфосерина. Показана возможность применения комплекса инструментальных микрометодов для идентификации необычных аминокислотных остатков с радикалами различной природы в пептидах и белках.

3. Разработан метод достоверного определения О-фосфосерина в аминокислотной последовательности на микроуровне с применением комплекса аналитических методов (микро-ВЭЖХ, капиллярного электрофореза, масс-спектрометрии), позволяющий исключить использование радиоактивного ^Р.

4. Впервые обнаружены, выделены и охарактеризованы хром^тографически, масс-спектрометрически и методом автоматического секвенирования пептиды морских полихет, проявляющие активности по отношению к ДНК- и РНК- полимеразам. Исходя из полученных данных, выдвинуто предположение о наличии в одном из выделенных пептидов остатка модифицированной аминокислоты тетрадегидропролина (пиррол-2-карбоновой кислоты).

5. Разработаны простые методики скоростного, селективного и надёжного анализа общего содержания гомоцистеина и других низкомолекулярных аминотиолов плазмы крови обращённо-фазовой хроматографией и капиллярным электрофорезом для применения в клинической диагностике кардиососудистых, нейродегенеративных и других ненаследственных и наследственных нарушений метаболизма.

Основные материалы дисертации изложены в следующих работах:

1. A.R.Ivanov, I.V.Nazimov, E.N.Shepel, B.V.Vaskovsky, M.P.Filatova, Structural Analysis of Peptides and Proteins Containing Unusual Amino Acids. International Congress on Analytical Chemistry, Moscow. Abstracts, 1997, vol.2, p.8.

2. A.R. Ivanov, I. V. Nazimov, D.D.PergamentiTechniques for Identification of Modified and Non-encoded Amino Acids in Peptides. Peptides 1998, Sandor Bajusz and Ferenc Hudecz (Eds), Akademiai Kiado, Budapest, p.292-293, 1999.

3. L.A. Elyakova, A.R. Ivanov, I.V. Nazimov, V.A. Mamontova and V.L. Tunitskaya, Primary Analysis of Physiologically Active Peptides Isolated from Marine Polychaetes. Peptides 1998, Sandor Bajusz and Ferenc Hudeez (Eds), Akademiai Kiado, Budapest, p.424-425, 1999.

4. L.A.Elyakova, A.R.Ivanov, I.V.Nazimov, V.A. Mamontova, V.L.Tunitskaya, Separation and Primary Characterization of Physiological Active Peptides Isolated from Marine Polychaetes. J. Neurochem., 1998, vol.71, Suppl., S45.

5. A.R.Ivanov, I.V.Nazimov, D.D.Pergament, Structural Analysis of Natural and Synthetic Peptides Containing Unusual Amino Acids. J.Pept. Sci., v.4, p.45, 1998.

6. L.A.Elyakova, A.R.Ivanov, I.V.Nazimov, V.A.Mamontova, V.L.Tunitskaya, Separation and Primary Characterization of Physiological Active Peptides Isolated from Marine Polychaetes. J.Pept.Sci., v.4, p. 65, 1998.

7. Л.А. Елякова, A.P. Иванов, И.В. Назимов, В.А. Мамонтова, В.Л. Туницкая, Разделение и первичная характеристика физиологически активных пептидов морских полихет. Материалы XVI Менделеевского Съезда. С-Петербург. Химия живого. 1998.С.49-50.

8. А.Р. Иванов, И. В. Назимов, Д.Д. Пергамент, Структурный анализ природных и синтетических пептидов, содержащих необычные аминокислоты. Материалы XVI Менделеевского Съезда. Химия живого. 1998.С.61.

9. А.Р. Иванов, И.В. Назимов, Д.Д. Пергамент, Определение необычных аминокислот в природных и синтетических пептидах. Материалы Всероссийского симпозиума по теории и практике хроматографии и электрофореза, Москва, 1998. С.85.

10.A.R.Ivanov, I.V.Nazimov, Hyphenated Techniques (HPLC, HPCE, MS) in Identifying Modified and Non-encoded Amino Acid Residues in Peptides. Abstracts of 23-rd International symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC'99, Granada.~Spain, v.l, pA4/33, 1999.

11 .A.R.Ivanov, I.V.Nazimov, L.A.Baratova, Quantitative and Qualitative Determination of Several Biolagically Active Thiols by RPHPLC with Photometry and Fluorescence Detection. Abstracts of 23-rd International symposium on High Performance Liquid

Phase Separations and Related Techniques, Granada, Spain, HPLC'99, v.l, pA4/34, 1999.

12. A. R.Ivanov, I. V.Nazimov, Identification of Unusual (Modified and Non-Encoded) Amino Acid Residues in Peptides by Combination of High-Performance Liquid Chromatography and High-Performance Capillary Electrophoresis with Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. J.Chrom. A, vol.870, 1-2, p.255-269, 2000.

13.A.Ivanov, I.Nazimov, L.Baratova, Qualitative and Quanitative Determination of Biologically Active Low-Molecular-Weight Thiols in Human Blood by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with Photometry and Fluorescence Detection, J.Chrom. A, vol.870, 1 -2, p.433-442, 2000.

[-1. A.Ivanov. I.Nazimov. A.Lobazov, G.Popkovich, Direct determination of amino acids and carbohydrates by high-performance capillary electrophoresis with refractometric detection, Abstracts of 13111 International Symposium on High-Performance Capilary Electrophoresis and Related Microscaie Techniques, HPCE 2000. Saarbrucken, Germany, p. 152.2000.

15.A.Ivanov, I.Nazimov. L.Baratova, Determination of biologically active low-molecular-weight thiols in human blood by high-performance capillary electrophoresis with photometric detection. Abstracts of 13th International Symposium on High-Performance Capillary Electrophoresis and Related Microscaie Techniques, HPCE 2000, Saarbrucken, Germany, p. 179. 2000.

16.А.Р.Иванов, И.В.Назимов, Инструментальные методы микроанализа необычных аминокислот в пептидах и белках. Тезисы Всероссийского Симпозиума по химии поверхности, адсорбции и хроматографии, SCAC'99, Москва. С.8, 70, 1999.

V.A.P. Иванов, И.В.Назимов, Анализ модифицированных и некодируемых аминокислот в пептидах, белках и свободном виде комплексом инструментальных микрометодсз, Тезисы Всероссийского Симпозиума ■■(Химический анализ веществ и материалов», Москва, С.9, 67. 2000.