Синтез фотоактивируемых реагентов на основе арилтрифторметилдиазирина для использования в биологических исследованиях тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ

И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА ХИМИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Л Т V. ; 1

1 1 ПОП 1325

ТОПИН АНДРЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

СИНТЕЗ ФОТОАКТИВ И РУЕМЫХ РЕАГЕНТОВ НА ОСНОВЕ АРИЛТРИФТОРМЕТИЛДИАЗИРИНА ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

02.00.10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически

активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 1996

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, вед.научн.сотр. Института Физиологии и Биохимии Микроорганизмов РАН М.А.Несмеянова кандидат химических наук, вед.научн.сотр. Института Молекулярной Биологии им.В.А.Энгельгардта РАН А.Л.Жузе

Ведущая организация: Институт Биоорганической Химии им.М.И.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

Защита состоится 29 октября 1996 г. в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.47 по химическим наукам при Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, ГСП-3, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ.

Автореферат разослан "27" сентября 1996 г.

Ученый секретарь ■ Диссертационного совета

доктор химических наук, Г.А.Коршунова

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Метод фотоаффинной сшивки приобрел огромное значение в молекулярно-биологических исследованиях. До ^давнего времени в качестве фотоактивируемой наиболее часто употребляюсь такая нитрен-генерирующая группа как арилазидная, которая однако обладает существенными недостатками. Рассматриваемая в настоящей работе арил-3-трифторметилдиазириновая (АТФМД) группа имеет ряд важных преимуществ по сравнению с арилазидными и другими фотоактивируемыми группировками. АТФМД группа быстро фотолизируется с образованием высокореакционного карбена, который может атаковать даже алифатические связи. Время жизни такого карбена (один из главных параметров в методе фотосшивки) находится, предположительно, в наносекундном интервале, в частности поэтому АТФМД группа пригодна для кинетических исследований. Фотолиз этой группы протекает в мягких условиях (длинноволновый УФ-свет), что не вредит биологическим структурам. Кроме того, АТФМД группа стабильна в широком диапазоне химических условий, с ней можно работать без специальных предосторожностей, избегая только прямого облучения УФ или солнечным светом.

В настоящее время синтезировано и использовано в биологических исследованиях большое число фотоактивируемых реагентов, содержащих АТФМД группу. Поскольку эта группа обладает явно выраженным гидрофобным характером, дизайн фотоактивируемых реагентов был направлен в основном на производные фосфопипидов и жирных кислот с целью изучения компонентов мембран. Исследования нуклеиново-белковых взаимодействий методом фотоаффинной сшивки с использованием АТФМД развиваются медленно из-за отсутствия достаточного числа таких реагентов для введения в молекулы белков и нуклеиновых кислот. В литературе описано лишь несколько случаев применения АТФМД производных нуклеотидов и аминокислот. На данный момент не существует хорошо разработанного универсального спосо-

Оа сайт-направленного введения фотоактивируемых групп в белки. Исходя и: преимуществ карбен-генерирующей АТФМД группы, очевидно, что проблем; дизайна фотоактивируемых АТФМД производных нуклеотидов и аминокисло* и включения их в нуклеиновые кислоты и белки является актуальной задачей В частности, перспективными соединениями в последнее время являются так называемые "расшиваемые реагенты", позволяющие значительно упростить анализ продуктов фотопришивки.

Цель исследования заключалась в разработке методов синтеза АТФМД-содержащих фотоактивируемых реагентов для изучения нуклеиново-белковых взаимодействий, а также в изучении методов сайт-направленного включения фотоактивируемой АТФМД группы в белки.

Цель исследования обусловила постановку следующих научных задач:

1. Синтез фотоактивируемых производных нуклеотидов, в которых фотоактивная функция максимально приближена к гетероциклу. Проверка возможности включения фотоактивируемых производных нуклеотидов в олигонуклеотидную последовательность.

2. Синтез фотоактивируемых производных аминокислот и изучение включения их в белковые молекулы.

3. Разработка подходов к синтезу расшиваемых АТФМД реагентов.

Научная новизна и практическая ценность работы

Осуществлен синтез новых фотоактивируемых производных уридина, содержащих АТФМД группу и показана возможность их введения в синтетический олигонуклеотид. Разработаны оптимальные условия получения трифторметил-диазирин-производных коричной кислоты - лимитирующей стадии в синтезе расшиваемых фотореагентов. Осуществлен синтез не описанного ранее фотоаффинного аналога энкефалина, содержащего в 4 положении остаток 1.-4'-[(3-трифторметил)-ЗН-диазирин-Э-ил]фенилаланина, и показана перспективность его использования для изучения опиатных рецепторов. На примере фермента люциферазы показано преимущество метода сайт-направленного мутагенеза

чЗ

с применением некодируемых аминокислот для введения фотоактивируемой АТФМД группы в белки.

Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликована одна статья и две поданы в печать, результаты работы докладывались на 23-ем Европейском пептидном симпозиуме (1994, Брага, Португалия), 37-ой ежегодной конференции по биохимии и молекулярной биологии (1994, Колумбия, США), 1-ом Съезде Российского научного общества фармакологов (1995, Волгоград), Ш-ем Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (1996, Москва).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного синтезу фотоактивируемых соединений на основе АТФМД, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В соответствии с поставленными задачами работа состояла из четырех основных частей.

1 .Синтез фотоактивируемых производных уридина и 2'-дезоксиуридина и проверка возможности включения в олигонуклеотид методом ТФС.

Основной задачей данной части работы стал синтез фотоактивируемых реагентов на основе АТФМД - производных уридина и 2'-дезоксиуридина, к которым предъявлялись следующие требования:

1) Фотоактивируемая группа должна находиться в нуклеиновом основании, причем она не должна мешать уотсон-криковскому взаимодействию в ДНК-дуплексе.

2) Фотоактивируемая группа должна располагаться на минимально возможном расстоянии от нуклеинового основания для того, чтобы свести до минимума "радиус фотосшивки", то есть расстояние от модифицированного нуклеинового основания до возможного места фотопришивки.

3) Фотоактивируемое производное 2'-дезоксиуридина должно выдерживать условия включения в олигонуклеотид при помощи твердофазного олиго-нуклеотидного синтеза.

5'-0-(4,4'-диметокситритил)-5-(4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил)-2'-дезокс'иуридин (4) (Рис. 1) стал соединением, наиболее полно удовлетворяющим предъявленным требованиям.

НО-у^ Нд(ОАсЬ

ОН

УгРсЮЦ

ОН

( 1 )

ШРсЮЦ

О

ЮМТгС)

( 2 )

ОН

( з )

он { 4 )

Рис.1. Схема синтеза 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-5-(4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил)-2'-дезоксиуридина (4)

Вначале из 2'-дезоксиуридина (1) получали ртуть-органическое производное по положению 5 урацила, которое затем вводили в реакцию с 4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)-иодбензолом в присутствии палладиевого катализатора.'Диметокситритильное производное (4) получали стандартным способом.

Синтез 4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)-иодбензола (5), которое использовали на стадии палладиевого катализа проводили в пять стадий, начиная с п-дииодбензола (6) (Рис.2).

I ) I

( 9 ) (10) ( 5 )

Рис.2. Схема синтеза 4-(3-(трифторметил)- ЗН-диазирин-3-ил)иодбензола (5)

На первой стадии при помощи литий-органической реакции с применением этилового эфира трифторуксусной кислоты получали производное трифтор-ацетофенона (7), которое превращали далее в оксим (8) и тозилокоим (9). При аммонолизе последнего аммиаком под большим давлением получали диазиридин (10). Окисление диазиридина (10) до диазирина (5) проводили действием оксида серебра (I) в среде абсолютного эфира.

Индивидуальность соединений проверяли по ТСХ. Структуры целевых соединений доказывали с помощью масс-спектрометрии и ПМР-спектров, наличие АТФМД группировки подтверждали УФ-спектром (характерный максимум при 360 нм).

5'-0-(4,4'-диметокситритил)-5-(4-(3-(трифторметил)-31Н-диазирин-3-ил)фенил)-2'-дезоксиуридин (4) использовали далее вместо сГГ в синтезе оли-гонуклеотида СССААССТ*СССТСТ. Из этого олигонуклеотида и комплементар-

ной ему последовательности был сконструирован дуплекс, который является аналогом субстрата ферментов рестрикции-модификации EcoRII. Олигонукле-отид синтезировали твердофазным методом на автоматическом приборе, используя CPG-полимер и фосфорамидитный способ активации. Снятие фотоак-тивируемого олигонукпеотида с носителя проводили одновременно с удалением защитных групп фосфатов и аминофункций гетероциклических оснований при 50° С в концентрированном растворе аммиака. Очистку проводили ВЗЖХ на обращенной фазе, используя колонку RPC18. Последовательность олигонуклертида была доказана секвенированием по методу Максама-Гилберта. Фотоактивируемое производное уридина в условиях сиквенса ведет себя аналогично с!Т. Для проверки влияния фотоактивируемой группы на стабильность ДНК-дуплекса использовали метод тепловой денатурации. Было показано, что температура плавления фотоактивируемого дуплекса составляет 60° С, что на 4° С меньше немодифицированного соединения. Наблюдаемое уменьшение температуры плавления указызает на незначительное влияние фотоактивируемой группы на структуру и устойчивость ДНК-дуплекса. Полученный фотоаффинный дуплекс предполагается использовать далее для зондирования активных центров ферментов рестрикции-модификации ДНК в группе проф. Е.С. Громовой.

Синтез 2',3'-диацетил-5-{4-(3-(грифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фе-иилЬуридмна .(11) проводили по аналогичной схеме (Рис.1.), используя в качестве исходного 2',3'-диацетилуридин. Все, что говорилось о требованиях, предъявляемых к фотоактивируемому реагенту (4), справедливо и для соединения 11, с тем исключением, что вводить фотореагент в молекулу РНК предполагается энзиматическим путем. Полученное АТФМД производное уридина (11) может быть фосфорилирозано по 5'-гидроксилу, а затем деацетилиро-вано стандартным методом. Из литературы известно, что производные ури-дин-трифосфата, модифицированные по пятому положению узнаются РНК-полимеразой, поэтому весьма вероятно, что уридин-трифосфат, содержащий АТФМД группу в пятом положении, также будет включаться в РНК.

Таким образом, синтезированы два фотоактивируемых аналога уридина, содержащих АТФМД группу, которые являются перспективными реагентами для изучения взаимодействий нуклеиновых кислот с другими биологическими молекулами.

2. Синтез нового фотоаффинного лиганда опиоидных рецепторов и исследование его свойств

Первым этапом данной части работы стала оптимизация синтеза 1.-4'-[(3-трифт0рметил)-3н-диазирин-3-ил]фенилаланина - РИе(ТРМО) (12). В результате анализа литературных данных по методу синтеза РЬе(ТРМО) мы остановились на пути, объединяющем преимущества трех описанных подходов. Путь синтеза изображен на рис.3. Использование магнийорганического производного на стадии получения (14) не является оптимальным по выходу конечного продукта, но позволяет отказаться от более сложного в техническом исполнении метода, основанного на применении литий-органического соединения. Дальнейший путь синтеза продукта (17), включающий получение оксима (15) и тозилоксима (16) с его последующим аммонолизом избытком аммиака, является оптимальным. На данных стадиях использовали альтернативные методы очистки промежуточных веществ, что позволило упростить процесс выделения соответствующих соединений. Окисление 17 до 18 в мягких условиях проводилось нами с использованием в качестве окислителя кристаллического иода. Выбор последнего метода удешевляет синтез по сравнению с использованием в данных целях АдгО. Последующие стадии синтеза 12 проводили, следуя описанным в литературе методам. Таким образом, предложенная схема синтеза позволяет наиболее оптимальным путем получить карбен-генерирующую фотоактивируемую аминокислоту - 1_-4'-[(3-трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]фенилаланин.

В качестве объекта для изучения включения фотоактивируемой аминокислоты в пептид был выбран аналог энкефалина следующей структуры: Туг-

0-А1а-61у-Р(1е(ТРМ0)-0-1.еи (23). Синтез проводили классическим способом в растворе (ОСС/НОВ!:), используя фрагментную конденсацию по схеме (3+2). Целевой пептид последовательно очищали гель-проникающей хроматографией и ВЭЖХ, структуру подтверждали аминокислотным анализом и масс-спектрометрией.

СНз

Шз

1. Мд

2. СРзСООН

СНз

СНз

КНгОН*НС1

ТояС!

РзС

РзС Н

ОН

( 14)

I 15)

СНз

СНз

СНз

ЫНэ

РзС

' N — ОТоь

< 16)

ЫНАс

НзСгООС — С—СООСгНь

I

СНгЕг СНг

ЪСЧ. Ач НН —

I 17)

(16)

(19)

(20)

ЫНАс

I

ноос—с— СООН I

СНг

АсШ —СН—СООН

I

СН2

НзМ—сн— СООН

I

СНг

ОХ [.-форма

<21) (22) ( 12) Рис.3. Схема синтеза РЬе(ТГМО).

Полученный фотоаффинный пептид 23 исследовали на взаимодействие с опиоидными рецепторами мозга крыс. Специфическое связывание изучали

методом радиорецепторного анализа по конкурентному вытеснению меченных тритием селективных лигандов опиоидных рецепторов (5-селективный лиганд DTLET и ц-сел'ективный лиганд DAGO). Пептид 23 показал уменьшение активности по отношению к [H3]DTLET, но более высокое сродство к ц-рецепторам по сравнению с DADLE. В целом было показано, что присутствие TFMD группы в п-положении остатка фенилаланина не влияет на связывание пептида с опиоидными рецепторами мозга крыс.

0 2 4 6 В 10 12 14 16 18 t(mirt)

Рис.3. Зависимость инактивации опиоидных рецепторов (А) и фоторазложения пептида 23 (Б) от времени облучения УФ-светом.

Поскольку до настоящего времени ничего не было известно о влиянии длинноволнового УФ-света на белки опиоидных рецепторов, мы провели серию экспериментов, целью которых было подобрать оптимальные условия облучения опиоидных рецепторов. Нас интересовали такие условия фотооблучения, при которых наблюдается максимальный фотолиз ТФМД группы с образованием карбена, но в то же время сохраняется активность опиоидных

рецепторов. Для этого изучали инактивацию рецепторов в зависимости от времени облучения УФ-светом. О степени инактивации судили по количеству радиоактивного [H3]DTLET, связанного с мембранами мозга крыс. В эксперименте мы использовали фильтр УФС-8, который не пропускает жесткий УФ-свет и обладает максимумом пропускания при 350 нм. Как показано на кривой А (Рис.3), опиоидные рецепторы мозга крыс оказались относительно устойчивы к облучению в условиях эксперимента, и, по крайней мере, за 15 мин наблюдалось лишь незначительное уменьшение их активности. Синтезированный опиоидный лиганд 23 подвергли облучению в тех же условиях. Кинетику фоторазложения 23 изучали с помощью ВЭЖХ по уменьшению величины пика, соответствующего исходному пептиду. Зависимость степени фотолиза пептида 23 от времени облучения показана на рис.3 (кривая Б). Таким образом, оптимальным временем облучения лиганд-рецепторного комплекса является 2 - 3 мин, при этом рецептор сохраняет 98 - 95% своей первоначальной активности.

Таким образом, можно сделать вывод, что новый синтезированный аналог энкефалина может быть использован как перспективный фотоаффинный реагент для изучения опиоидных рецепторов.

3. Синтез производных коричной кислоты, содержащих АТФМД группу, -исходных для получения расшиваемых фотореагентов

Впервые синтез фотореагентов на основе АТФМД, содержащих остаток коричной кислоты, описан в 1992 году Когоном A.A. и со авт. Авторами был предложен очень интересный, на наш взгляд, способ синтеза 3-(3-(трифтор-метил)- ЗН-диазирин-3-ил)коричной кислоты. Основная идея синтеза заключалась в получении производного АТФМД, содержащего бром в качестве дополнительного заместителя в бензольном кольце в мета-положении по отношению к ТФМД циклу. Бром-производное АТФМД вводили в реакцию палладие-вого катализа с акриловой кислотой и получали с выходом около 15% фотоак-тивируемое производное коричной кислоты. Это вещество интересно тем, что

двойную углерод-углеродную связь в его структуре можно в мягких условиях окислить перманганатом калия до диола. Образующаяся диольная группировка является удобной расшиваемой функциональной частью фотореагента. Ее можно расшить обработкой периодатом натрия в мягких условиях. Основным недостатком предложенного метода явился низкий выход производного коричной кислоты. Поэтому нами была поставлена задача оптимизировать условия каталитического синтеза фотоактивируемых производных коричной кис-поты, содержащих ТФМД группу. В результате анализа литературы, консультаций с к.х.н. Быковым В.А. (химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова), а также серии экспериментов с использованием в качестве модельной реакции иодбензола с акриловой кислотой в присутствии палладиевого катализатора были подобраны оптимальные условия реакции (температура 85° С, 0,5 часа, ДМФА/Н20,9:1), позволяющие получить целевое соединение с выходом более 90%.

В качестве субстрата для проведения реакции палладиевого катализа с акриловой кислотой применяли 4-(3-(трифторметил)- ЗН-диазирин-Э-ил)иод-бензол (5) и 3-(3-(трифторметил)- ЗН-диазирин-3-ил)-5-гидрокси-бромбен-зол. Выходы реакции в обоих случаях оказались практически одинаковыми. Таким образом, были найдены универсальные условия, позволяющие с высоким выходом синтезировать фотоактивируемые производные коричной кислоты, содержащие АТФМД группу. Разработанный метод может стать основой для синтеза новых фотореагентов, содержащих расшиваемую диольную группу, потенциально полезных для модификации белков и нуклеиновых кислот.

4. Оптимизация и сравнение двух способов сайт-направленного введения арилтрифторметилдиазириновой группы в белки

Для введения фотоактивируемой группы в белковую молекулу существует несколько хорошо разработанных способов. Наиболее широко применяется химическая модификация боковых радикалов цистеина или лизина, при этом фотоактивируемый реагент вводится в строго определенное положение бел-

ковой молекулы, соответствующее расположению модифицируемой аминокислоты. При наличии в молекуле белка нескольких остатков цистеина или лизина в процессе химической модификации фотоактивируемым реагентом образуется набор продуктов, что создает трудности как при очистке нужного соединения ,так и при интерпретации результатов фотопришивки. Таким образом, логичной явилась разработка способов сайт-направленного введения фотореагентов в белки, позволяющих получать белковую молекулу, содержащую фотогруппу в одном строго определенном положении. В настоящий момент можно выделить только два таких универсальных способа: 1) метод сайт-направленного мутагенеза с использованием некодируемых аминокислот, разработанный в лаборатории Schultz Р. (США); 2) модификация фотореагентом £-аминогруппы лизина, присоединенного к амбер-супрессирующей тРНК с последующим ее использованием в системе in vitro-трансляции. Целью нашей работы стала разработка оптимальных условий введения АТФМД группы в определенное положение белка и сравнение эффективности двух существующих методов. Работа проводилась на базе лаборатории и под руководством проф. Folk W.R. (США).

Метод сайт-направленного мутагенеза с применением некодируемых аминокислот основан на получении амбер-супрессирующей транспортной РНК, заряженной некодируемой аминокислотой (Рис.4). Получение амбер-суп-рессирующей тРНК включает в себя два параллельных направления: наработка амбер-супрессирующей тРНК без CA на 3'-конце в системе in vitro трансляции и химический синтез динуклеотида (pdCpA) с последующим присоединением к нему аминокислоты (АА). Полученное соединение (pdCpA[AA]) вводится в реакцию лигирования с тРНК(-СА) при помощи Т4 РНК-лигазы. В результате лигирования с выходом 80 - 90 % получается амбер-супрессирующая тРНК, заряженная некодируемой аминокислотой.

тРНК-ген

тРНК-ген ТАЗ

Т7

Сайт-

/<" 1 рестрикции

ПлазмидаТ

^рестрикция тРНК-ген

Т7

ТАЙ с

)П уйго

транскрипция

Амбер тРНК-СА

идс

рсГСрА

+Рго1(АА)

V

рйСрА[РгоЦАА)]

Удалении защиты

о\\о

рс!СрА(АА)

Легирование Т4 РНК лигазой

Амбер тРН1С 11А6

О 0|[0

СйСА[АА]

Рис. 4. Схема получения амбер-супрессирующей тРНК, заряженной некодируемой аминокислотой [РИе(ТРМО)].

В работе мы использовали ген лизиновой транспортной РНК из АгаЫ-dops¡s рИаПапа, у которой с помощью ПЦР-реакции и переклонирования

(Рис.4) заменяли лизиновый кодон на амбер-кодон и вводили С на З'-конец. После линеализации ДНК использовали в системе in vitro транскрипции. Полученную тРНК-СА очищали ионообменной хроматографией на колонке и осаждали этанолом.

Химический синтез динуклеотида pdCpA с присоединенным к нему фе-нилаланином, содержащим фотоактивируемую АТФМД группу (12), проводили, начиная с аденозина (24) (Рис.5). На первой стадии получали 5'-димет-окситритильное производное аденозина (25), которое вводили в реакцию с бензоилхлоридом и получали соединение 26. После снятия с 26 диметокси-тритильной защиты образующийся продукт (27), вводили в реакцию с 4-N-бензоил-5'-0-(4,4'-диметокситритил)-2'-диоксицитидил-3'-[(2-цианоэтил)-(Ы,М-диизопропил)]фосфорамидитом и очищали соединение 28, которое, после снятия диметокситритильной защиты с 5'-гидроксила цитидина (29) и фосфорилирования 5'-гидроксила ди(2-цианоэтил)-Ы,Ы-диизопропиламино-фосфорамидитом, давало соединение 30. Обработка последнего насыщенным раствором привела к динуклеотиду pdCpA (31). Соединение 31 очищали ВЭЖХ и затем получали три-бутиламмониевую соль при помощи ионнообмен-ной хроматографии. Три-бутиламмониевая соль pdCpA более растворима в органических растворителях по сравнению с исходным динуклеотидом, что необходимо для реакции конденсации с активированной по карбоксилу аминокислотой. Аммониевую соль соединения 31 вводили в реакцию с цианоэти-ловым активированным эфиром N-Вос-защищенного фенилаланина, содержащего АТФМД группу, в результате чего получали соединение 32. После снятия защиты и очистки на ВЭЖХ, получали pdCpA[Phe(TFMD)] (33), которое вводили в реакцию лигирования с амбер-тРНК(-СА) при помощи Т4 РНК-лига-зы. В результате лигирования получалась амбер-тРНК, содержащая на З'-кон-це Phe(TFMD), которая непосредственно использовалась в реакциях in vitro трансляции-супрессии.

15

NHj

CU

Vf

-UoÍV

Vf

(25)

<a .

к-

- Vf.

(27)

DMTrO

I

«С—wo— F" i.

НМЭг

Л*

K<32¡2

Vi <28>

CiO OBx

rCM ш,

' A

NC—4-0—p=0 (| Ï

i-, „Nr^O

но

"Ъл

(28)

lA

но~\у

-». j WBda

Vi <2£»

ВгО Oñz

НИ г

HO I

I х-ч.

но—p«=o il I

I v-A.

NC-^_o— P=0 (f

WS7b

<AJ

M

BzO ОВг

к

у/

"tw

rT oí)

to он

//Yj

O—I

\ J

ГТ

;0H 3

HO

I

Ю —P = O II I

ц JV4*

Вое—

F3C

(32)

N=- N

0

1

o"— ¡>=0

í w

0H J

HaN

133)

✓ N N=N

Рис.5. Схема синтеза pdCpA[Phe(TFMD)] <33).

Второй способ сайт-направленного введения фотоактивируемой группы в белки, использовавшийся в работе, основывался на модификации активированным производным TFMD бензойной кислоты г-аминогруппы лизина, присоединенного к амбер-тРНК, с последующим использованием полученной модифицированной тРНК в системе in vitro трансляции-супрессии. Для аминоаци-лирования амбер-тРНК использовали аминоацил-тРНК-синтетазу из Arabi-dopsis thailana. Было показано, что изменение лизинового кодона на амбер кодон приводит к уменьшению Vmax/KM аминоацилирования на три порядка, причем уровень аминоацилирования падает до 10%. В результате оптимизации реакции аминоацилирования было найдено, что при использовании трип-тофановой амбер-тРНК и проведении аминоацилирования в 10% диметил-сульфоксиде удается увеличить выход аминоацилированной тРНК до 30%. Для модификации £-аминогруппы лизина использовали условия, разработанные Бочкаревым Д.Е., которые позволяют получить практически количественный выход.

Для подбора оптимальных условий реакции in vitro трансляции-супрессии использовали матричную РНК люциферазы, у которой в четвертом положении был вставлен стоп-кодон (TAG). В процессе in vitro трансляции синтез останавливался на четвертой аминокислоте, что приводило к неактивному продукту. При супрессии стоп-кодона в четвертом положении люциферазы получался фермент, по активности которого можно судить о количестве синтезируемого белка. В работе использовали системы in vitro трансляции из ретикулоцитов кролика, ростков пшеницы и E.coli. Наибольший выход белка получается в системе in vitro трансляции из ретикулоцитов кролика. Были подобраны оптимальные условия реакции in vitro трансляции-супрессии и показано, что методом сайт-направленного мутагенеза с применением некодируе-мых аминокислот удается получить около 10% супрессии. В случае модификации Е-аминогруппы лизина TFMD бензойной кислотой супрессия уменьшается в 7 раз по сравнению с немодифицированной aM6ep-TPHK(Lys), что дает около 1-2% супрессии. Таким образом, было показано, что модификация е-ами-

ногруппы лизина ингибирует трансляцию-супрессию и, следовательно, метод сайт-направленного мутагенеза с применением некодируемых аминокислот является более предпочтительным для введения АТФМД группы в белки.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен синтез неизвестных ранее фотоактивируемых аналогов нукле-отидов: 5-(4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил)уридина и 5-(4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирии-3-ил)фенил)-2'-дезоксиуридина, в которых фотоактивная функция максимально приближена к гетероциклу.

2. Впервые показана возможность включения 5-(4-(3-(трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил)фенил)-2'-дезоксиуридина в олигонуклеотидную последовательность твердофазным методом. Синтезирован 14-звенный ДНК-дуплекс -фотоактиеный аналог субстрата ферментов рестрикции-модификации ЕсоНИ. Показано, что арилтрифторметилдиазириновая группа практически не искажает структуру двойной спирали.

3. Предложен усовершенствованный метод синтеза 1_-4'-[(3-трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]фенилаланина.

4. Осуществлен синтез нового фотоаффинного аналога энкефалина, содержащего 1_-4'-[(3-трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]фенилаланин, потенциально перспективного лиганда для изучения опиатных рецепторов.

5. Проведено сравнительное изучение двух способов сайт-направленного введения фотоактивируемой арилтрифторметилдиазириновой группы в белки, показано преимущество метода сайт-направленного мутагенеза с применением некодируемых аминокислот.

6. Разработаны оптимальные условия синтеза трифторметилдиазирин-произ-водных коричной кислоты - исходных для получения расшиваемых бифункциональных фотореагентов.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Топин А.Н., Коршунова Г.А. Оптимизированный синтез L-4'-[(3-трифторметил)-ЗН-диазирин-3-ил]фенилаланина. - Вест. Моск. Ун-та. Сер.2, Химия. 1995. Т.36. №6. С.583-87.

2. Topin A.N., Korshunova G.A. Synthesis and properties of photoaffinity enkephalin analogues. - The 23rd European Peptide Symposium, Braga (Portugal). 1994. Sept. Programme and Abstracts. P121. P. 3-87.

3. Topin A.N., Korshunova G.A. Synthesis of photoaffinity peptides for the opioid receptor investigation. - Thirty-Seventh Annual Biochemistry and Molecular Biology Conference. 1994. Oct. 28-29. Univ. Missouri-Columbia. P-61.

4. Чиченков О.H., Коршунова Г.А., Сумбатян H.В., Топин А.Н. Успехи в создании избирательных лигандов опиатных рецепторов. - Сборник тезисов 1-го Съезда Российского научного общества фармакологов "Фундаментальные исследования как основа создания лекарственных средств". Волгоград. 9-13 октября 1995 г. С. 481.

5. Чиченков О.Н., Топин А.Н., Сумбатян Н.В., Коршунова Г.А. Фотоаффинные лиганды опиатных рецепторов. - Конгресс "Человек и лекарство". Москва. 1620 апреля 1996г. С. 57.