Модель транслокации ДНК - полимераз. Модифицированные нуклеозид - 5 , - трифосфаты и их использование в системах матричного биокатализа тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

со сг; сг>

На правах рукописи

ВЛАСОВ Вячеслав Алексеевич

Модель транслокации ДНК-полимераз. Модифицированные нуклеозид-5'-трифосфаты и их использование в системах матричного биокатализа.

02 оо 10 - Биоорганическая химия, химия природных и физиологически активных веществ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск 1996

Работа выполнена в Институте Цитологии и Генетики СО РАН (г. Новосибирск)

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Дымшиц Г.М. доктор химических наук, профессор Лаврик О.И.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Карпова Г.Г. кандидат химических наук Синяков А.Н.

Ведущая организация: Институт Молекулярной Биологии

им. В.А.Энгельгардта РАН (г. Москва)

_ Защита состоится « _1997 года в

«/_часов на заседании диссертационного совета К 003.52.01 в

Новосибирском институте биоорганической химии СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск-90, проспект акад. Лаврентьева, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского института биоорганической химии СО РАН.

Автореферат разослан « Г» 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук

О.С.Федорова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Работа ферментов матричного биокатализа лежит в

основе процессов, ответственных за сохранение, воспроизведение и реализацию генетической информации. Именно понимание механизмов функционирования этих ферментов позволило заложить фундамент современной молекулярной биологии. Изучение ферментов матричного биокатализа является в настоящее время одной из наиболее бурно развивающихся областей науки. Однако, несмотря на достигнутый прогресс, многие принципиальные моменты, связанные с функционированием полимераз в системах репликации, репарации и транскрипции, остаются неясными. К их числу относятся механизм перемещения полимераз вдоль матричной цепи при проиессивном синтезе полинуклеотидов и критерии отбора корректного нуклеозидтрифосфатного субстрата в каидом новом каталитическом цикле. Сложность этих двух вопросов определяется тем, что оба процесса связаны с быстрыми конформациониыми изменениями в структуре ферментов, и изучение таких изменений с помощью существующих на сегодняшний день методов выглядит проблематичным. В последнее десятилетие были получены кристаллы ряда ДНК- и РНК-полимераз, которые были изучены методом рентгеноструктурного анализа с достаточно высоким разрешением. Однако даже столь детальная структурная информация не позволяет дать точных ответов на указанные выше вопросы, поэтому остается крайне актуальным развитие новых методов исследования функционирования полиг.гегаз

Цедь_рабрть1_ В настоящей работе преследовалось несколько целей-!) Разработка модели транслокации ДНК-полимерг; вд'Х :- матричной цепи -процесса, слабо исследованного даже на уровне гипотез Основанием служили известные экспериментальные данные, метопом - компьютерно? моделирование

2) Синте» ряда модифицированных анлтогов рнЗо- >; дезокенрибонуклеознд--''-трифосфатов, несущих остатки флуоресцентных крзап. ;-сй или фотоактивируемые группировки и обладающих хорошими субстратными сномствак'и для полимераз

3) Исследование возможности использования модифицированных (с!)ЫТР в различных системах матричного бнокаталнзп для получения информации о структуре и функционировании ДНК- и РНК- полимераз.

Научная новизна и графическая ценность работы. В данной работе предложена модель транслокашш ДНК-иолимераз на примере обратной траискриптазы вируса иммунодефицита человека - одного из наиболее изученных в настоящее время ферментов матричного биокатализа. Согласно этой модели, транслокация происходит в результате перехода участка дуплекса, расположенного внутри ДНК-связывающего кармана фермента, из А- в В-форму на стадии конформащюнной подстройки субстратной молекулы сМТР в активном центре

Впервые синтезированы производные иТР, несущие остатки флуоресцентных красителей - флуоресцеина или тетраметнлродамина - введенных по положению С5 пиримидинового основания Были получены полноразмерные РНК-зонды, меченные флуоресцеином, которые были использованы при скрининге хромосомспецифичной

клонотеки для построения контига клонов из района 13-ой хромосомы человека, сцепленного с болезнью Вильсона-Коновалова.

Синтезирован набор фотоактивируемых аналогов (с1)иТР, (с1)АТР и с!СТР, несущих 2-нитро-5-азидобензоильную, н-азидотетрафторбензоильную или 0-(п-азидотетрафторбензилиденаминоокси^метнлкарбамоильную группу, присоединенную по положению гетероциклического ядра, которое не участвует в комплементарных взаимодействиях (С5 пиримиднновых и С8 пуриновых нуклеотидов).

Показано, что сингезированные флуоресцентно меченые и фотоактивируемые аналоги (с!)ЫТР являются субстратами ДНК- и РНК-полимераз н могут бьггь использованы для получения соответствующих меченых полинуклеотидов и для изучения различных ДНК- и РНК-полимераз вирусов, прокариот и эукариот и их комплексов с другими белками.

Показана возможность применения фотоактивируемых аналогов (ё)МТР для высокоселективного мечекия белкоь репликативного комплекса представителя низших эукариот - РИуштп' ро1усер1ю1ит. Установлено, что в ядерном экстракте РИуватт ро!усер1ш1ит активны ДНК-полимсразы а и е. В случае ДНК-полимеразы а активной является только интактная субъединица с полимеразной функцией - р]40. Проведен сравнительный анализ размеров ДНК-связывающих карманов ДНК-полнмераз а и е РЬушгит ро1усгрИа!ит.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на конференциях «Геном человека-93» (Черноголовка, 1993), «Геном человека-94» (Черноголовка, 1994), 3-ем германо-российском биотехнологическом симпозиуме (Берлин, 1994), международных конференциях «Регуляция репликации эукариотическои ДНК» (Монреаль, Канада,

1994), «Репликация эукариотнческой ДНК» (Колд Спринг Харбор, США, 1995), российско-французском симпозиуме по регуляции экспрессии генов (Новосибирск,

1995).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, описания использованных материалов и методов, выводов и списка цитируемой литературы из 233 наименований. Работа содержит 1 таблицу и 16 рисунков.

Содержание работы.

1. Модель транслокации ДНК-полимераз.

Механизм транслокации полимераз вдоль матричной цепи н место этого процесса в общей кинетической схеме отдельного каталитического цикла остается пока неясным. Транслокация является ключевой стадией для возможности процессивного синтеза полинуклеотидов, поэтому именно непонимание природы этого процесса приводит к отсутствию ответов на многие вопросы, связанные с матричной специфичностью полимераз, скоростью и процессивносгью их работы, с механизмами терминации синтеза. Ряд авторов рассматривают транслокацию как

свободную диффузию полимеразы в состоянии открытого комплекса вдоль цепи ДНК. Такая свободная линейная диффузия описывается как балансирование между сайтами п и п+1, а не как отдельный скорость-лимнтирующий этап перемещения полимеразы вдоль ДНК. Данные рентгеноструктурного анализа открытых комплексов ДНК-полимераз и ДНК-дуплексов указывают, однако, на наличие большого количества контактов между аминокислотными остатками фермента и нуклеотидами ДНК. Модель свободного скольжения не объясняет, каким способом эти контакты разрушаются и восстанавливаются в ходе перемещения фермента. Мы предлагаем новую модель транслокации полимераз, рассмотренную здесь на примере обратной транскриптазы ВИЧ - одного из наиболее изученных в структурном отношении ферментов. Наша модель получена методом компьютерного моделирования и основана на следующих описанных в литературе экспериментальных фактах.

1) Двуцепочечная ДНК (дцДНК) внутри связывающего канала рсвертазы изогнута, и шесть - семь пар оснований вблизи З'-конца праймера находятся в А-форме (Jacobo-Molina et al, 1993). Аналогичная структура связанной дцДНК найдена для ДНК-полимеразы 0: матрица»праймер принимают в этом случае промежуточную между А- и В-формой геометрию (Pelletier et al., 1994). Известно, что химерные полинуклеотиды, содержащие участки как с А-, так и с В-формой, изогнуты в месте стыка дуплексов с разными конформациями. По этой причине изогнутый ДНК-связывающий канал является более приемлемым для аккомодации изогнутой ДНК. Изогнутость ДНК внутри связывающего канала является общей чертой многих полимераз. Кроме того, высокая гидрофобность ДНК-связывающего канала (Allen et al., 1989) также благоприятствует В—>А переходу (Conner et al, 1982). Представляется реалистичным предположить, что такой переход является общим феноменом для ДНК-полимераз

2) Те же шесть - семь пар оснований вблизи З'-кониа праймера ответственны за специфичность взаимодействия между матрицей и лрзймером внутри ДНК-связывающего кармана фермента (Дьяченко и др , ¡994),

3) В составе многих полимераз выявлена структура "helix clamp" (спиральный зажим), которая формирует неспецифические контакты с межнуклеотидными фосфатами матрицы-праймера. В ревертазе helix clamp состоит из спиралей all и al, которые контактируют со связанной дцДНК в районе стыка А- и В-форм (Hermann et al., 1994) (рис 1)

4) ДНК-полимеразы нз разных источников содержат остатки Туг вблизи З'-конца праймера (Tyrl 15 в ревертазе ВИЧ, Туг766 во фрагменте Кленова, Туг865 в ДНК-полимеразе а из тимуса теленка). Предполагается, что эти остатки вступают в стэкинг-взаимодействие с входящим в активный центр dNTP (Patel et al., 1995).

5) Кочформационная адаптация, предшествующая химической стадии нуклеотиднльного переноса, является общей стадией для многих, если не для всех, ДНК-полимераз и рассматривается как этап, отвечающий за точность работы фермента (Patel et al, 1995). Исследование изменений интенсивности флуоресценции остатков триптофана, входящих в состав ревергазы, в ходе каталитического цикла фермента показало, что этот этап сопровождается конформационной перестройкой комплекса

ДНК-полимсраза - дцДНК из открытого состояния в закрытое. Другое конформационное изменение (обратный переход из закрытого состояния в открытое) имеет место после химической стадии. Кроме того, фермент претерпевает существенные конформационные изменения при связывании dNTP в отсутствие матрицы-праймера (Painter et а!., 1991). В этом случае, также как и при связывании dNTP с комплексом фермент • дцДНК, интенсивность флуоресценции резко падает. Это свидетельствует об увеличении полярности микроокружения остатков триптофана. Возможно, это является следствием увеличения площади поверхности комплекса белок»ДНК из-за транслокации индивидуальных субдомеиов в молекуле фермента.

Рис. 1. Структурные элементы комплекса дцДНК • ревертаза ВИЧ, участвующие в формировании dNTP-связывающего кармана.

Для обратной транскриптазы ВИЧ мы предлагаем следующий механизм транслокации. Попадая в ДНК-связывающий канал, матрица-праймер изгибается, формирует контакты с helix clamp и претерпевает переход в A-форму в районе между helix clamp и З'-концом праймера. Туг115 не вступает в стэкинг с З'-концевым нуклеотидом в этом состоянии Трифосфатная группа входящего dNTP связывается с каталитической триадой (AspllO, Aspl85 и Aspl86), aero основание вступает в стэкинг с остатком Туг] 15 (в соответствии с моделью Patel et a!. (1995) и с данными Painter et al. (1991) о неспецифичности первоначального связывания^ dNTP). Основания входящего dNTP и З'-концевого нуклеотида разнесены на 3-4 A (Patel et al, 1995). Связывание dNTP в активном центре приводит к конформационной перестройке белка, увеличению площади поверхности молекулы фермента и, как следствие, возрастанию степени гидратации комплекса белок»ДНК. Последнее приводит к переходу от А- к В-форме ДНК в участке вблизи З'-конца праймера (увеличение степени гидратации

благоприятно для В-формы ДНК (Conner et а!, 1982)) Конформгционные изменения в молекуле фермента и б ДНК могут ослабить и/или частично разрушить белково-нуклеиновые контакты в районе helix damp. С другой стороны, поскольку расстояние между соседними иуклеопдами равно 2.6 К в А-форме и 3,4 А в В-форме ДНК, переход А->В приводит к удлинению Т-'-пуклеотидного участка между helix clamp и 3-кошюм праймера примерно на 6 А (от 18 до 24 Д.). Такое удлинение может служить движущей силон, позволяющей продвинуть З'-кокцевой нуклеотщт к основанию tlNTP, связанного а активном центре, а протолкнуть весь дуплекс на 2-3 А' гга^чд вдоль ДЧК-связывающего канала, используя Туг 13 5 гак точку опоры Такси механизм позволяет одновременна транслонировать ДНК и пространстеенно сблизить атакую:д>Кк З'-ОН группу праймера и а-фосфат dNTP (последнее становится возможным в результате вступления в стэкинг-взаимодействие азотистых оснований 3 -концевого !п/клсотида и dNTP) Комплекс способен достигнуть критической каталитической конфигурации только в том случае, если сформировавшаяся пара нуклеотидпв имеет Уотсон-Криковскую геометрию. Если находящийся в активном центре dNTP некорректен, закрытый комплекс нестабилен и легко претерпевает переход в открытое состояние, что сопровождается обратным переходом ДНК в А-форму с последующей диссоциацией dNTP. Быстрая стадия транеэтерификации протекает только после стабилизации, закрытого комплекса за счет комплементарного взаимодействия. Гидролиз dNTP обеспечивает энергию, необходимую для обратного перехода В—»А в районе связанного дуплекса между helix clamp и удли:гавшимся З'-концом праймера. Этот переход термодинамически и кннсти'.ески невыгоден в закрытом комплексе ДНК в А-форме восстанавливает ранее ослабленные контакты с helix clamp, что приводит к коиформацнонной перестройке фермента в открытое состояние, в результате чего система в целом возвращается к изначальному состоянию, но уже на новой позиции матрицы

Следует отметить дне принципиальные черты описанной модели Во-первых, транслокацня в данной модели происходит одновременно со стадией конформационной подстройки субстрата, г е. предшествует включению б праймер нового остатка dNMP Во-вторых, конформацнонные изменения в белке сами по себе не ответственны за перемещение молекулы фермента вдоль ДНК - вместо этого ДНК, посредством удлинения и укорочения фрагмента дуплекса вблизи активного центра, "переползает" внутри ДНК-связываюшего канала, подобно движущемуся в земле черню

Одним из возможных подходов для экспериментальной проверки предложенной модели могло бы быть использование флуоресцентно меченых аналогов dNTP. При использовании специально подобранной последовательности матрицы, два нуклеотида, один из которых несет остаток флуоресценна, а другой -родамина, могут быть введены в праймерную цепь на расстоянии примерно одного витка спирали друг от друга. При облучении, светом с длиной волны максимума поглощения флуоресценна, остатки этого красителя будут испускать свет с длиной волны, при которой может возбуждаться флуоресценция родамина Регистрация

интенсивности флуоресценции родамина в такой системе позволила бы оценить расстояние между двумя флуорохромамн: интенсивность флуоресценции будет тем выше, чем ближе расположены красители друг к другу. Если предложенная модель транслокации верна, то при быстрой регистрации флуоресценции родамина в ходе одного каталитического цикла будет наблюдаться минимум интенсивности флуоресценции, связанный с конформационным переходом ДНК из А- в В- форму и назад и, следовательно, изменением расстояния между флуорохромами Если же конформационных изменений ДНК не происходит, интенсивность флуоресценции родамина в процессе введения нового нуклеотида на З'-конец праймера меняться не будет.

В данной работе были синтезированы аналоги (d)UTP, несущие остатки флуоресцеина и тетраметилродамина, и исследованы субстратные свойства одного из этих аналогов.

2. Синтез флуоресцентно меченых аналогов UTP.

Флуоресцентно меченые аналоги дезокси- и дидезоксинуклеозид-5'-трнфосфатов нашли широкое применение в различных областях молекулярной биологии, в первую очередь для замены радиоактивной метки при осуществлении широкомасштабных проектов по секвенированию ДНК и автоматизации процесса секвенирования. В настоящее время, однако, появился ряд задач, требующих использования нескольких типов меток одновременно. Так, ряд векторов, используемых для клонирования фрагментов генома (плазмиды pGEM) и получения геномных библиотек (космиды Lorist), позволяет осуществлять клонирование ДНК непосредственно под промоторы РНК-полимераз фагов Т7 и SP6, что дает возможность получать транскрипты с минимальным размером участка, комплементарного векторной ДНК, и значительно снизить трудоемкость получения гибридизационных РНК-зондов к обоим концам клонированных фрагментов, так как не требуется освобождения вставки от векторной ДНК. Число гибридизационных экспериментов может быть резко сокращено благодаря одновременному использованию нескольких зондов с разными типами сигнальных соединений. Наиболее простым подходом для введения различных меток в РНК-зонды представляется использование модифицированных аналогов NTP, несущих эти метки (радионуклиды, бнотин, дигоксигенин, флуорохромы), в ходе транскрипции с помощью высокопроцесснвных фаговых РНК-полимераз. В настоящей работе впервые предложен метод синтеза флуоресцентно меченых аналогов UTP, несущих остатки флуоресцеина и тетраметилродамина по положению С5 гетероциклического ядра (рис. 2) и исследованы свойства одного из этих аналогов в системе транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы фага Т7. До нашей работы подобных производных рибонуклеозид-5'-трифосфатов синтезировано не было.

UTP, несущий остаток флуоресцеина, (2) был синтезирован обработкой сухой триэтиламмонийной соли 5-(/про«с-3-аминопропенил-1) уридин-5'-трифосфата 1а 3х-кратным избытком FITC в безводном DMF в присутствии триэтиламина в течение 24 ч при комнатной температуре. Продукт 2 был отделен от избытка FITC хроматографией

на ОЕАЕ-целлюлозе ПН-32 и окончательно очищен с помощью ионообменной ВЭЖХ Производное иТР 3, несущее остаток тетраметилрозамина, было получено в аналогичных условиях (за тем исключением, что реакция проводилась в течение I ч при 57°С) и выделено хроматографией на силикагеле с окончательной очисткой обращекно-фазовой хроматографией Соединение 2 удалось получить с большим выходом - 65%. Напротив, выход соединения 3 редко превышал несколько процентов при использовании различных условий проведения реакции и различных процедур выделения Причина такого различия остается нам неясна

о

о о о

Рис 2 Схема синтеза флуоресцентно меченых производных иТР

Рис 3 Электронные спектры поглощения флуоресцентно меченых аналогов 11ТР н свободных красителей в 0,1 М ТЕАВ, рН 8,0.

Соединения 2 и 3 имеют характерные спектры поглощения (рис. 3). Сравнение этих спектров со спектрами исходных красителей выявляет теоретически ожидаемое большее поглощение 2 и 3 в УФ-области, чем у Р1ТС и ТМЯЗИ. Спектры возбуждения и испускания флуоресценции соответствуют таковым для исходных красителей.

3. Изучение включения остатка производного ИТР, меченного флуоресцеивом, в состав РНК с помощью РНК-полнмеразы фага Т7.

Соединение 2 было изучено в качестве субстрата для РНК-полимеразы фага Т7. Транскрипция проводилась с промотора этой полимеразы, встроенного в плазмиду рОЕМ1, линеаризованную по сайту рестрикции Бвр!. Такая матрица позволяет получать РНК длиной 960 нуклсотидов. Транскрипция осуществлялась в стандартных условиях при 0,5 мМ концентрациях каждого МТР за исключением 11ТР. Последний частично или полностью замещался на флуоресцентный аналог 2 так, чтобы суммарная концентрация 1)ТР и соединения 2 была равна 0,5 мМ. При полном замещении иТР на . его флуоресцентное производное скорость синтеза РНК падает в 14 раз. Как следует из данных таблицы 1, увеличение доли флуоресцентного аналога в реакционной смеси приводит к значительному уменьшению выхода РНК. Анализ реакционных смесей в 1% агарозном геле показал, что увеличение доли флуоресцентного аналога до 60% и более приводит к синтезу укороченных транскриптов. Степень модификации РНК (доля остатков флуоресцентно меченых нуклеотидов, включившихся в РНК, выраженная в процентах) также зависит от количества введенного в реакционную смесь модифицированного нуклеотида. Степень модификации 8-9% может быть достигнута при 80% и более замещении ЦТР флуоресцентным аналогом, и 4% - при 50% замещении. Ранее было показано, что введение более чем 4% остатков флуоресцеина в полинуклеотиды не приводит к увеличению чувствительности детекции при гибридизации вследствие безизлучательного переноса энергии между близхо расположенными флуорохромами. Вследствие этого приготовление флуоресцентных зондов для гибридизации оптимально проводить при 50% замещении ЦТР на соединение 2 в транскрипционной смеси.

Таблица 1. Зависимость выхода и степени модификации РНК от доли аналога ЦТР, несущего остаток флуоресцеина, (2) в реакционной смеси. Относительная

Г2ИиТР1 Выход РНК, % Степень модификации

0 100 0

0,5 79 4,0

0,8 19 9,2

0,9 12 «3

1,0 11 8,9

С помощью описанного метода были получены полноразмерные РНК-зонды, которые были использованы в нашей лаборатории при скрининге хромосомспецифичной клонотеки для построения контига клонов из района 13-ой хромосомы человека, сцепленного с болезнью Вильсона-Коновалова.

4. Синтез фотореакционноспособных аналогов (d)NTP.

Сшивающие реагенты являются очень удобным инструментом для изучения структурно-функциональной организации биополимеров и их комплексов друг с другом и низкомолекулярными лигандами Их использование позволяет получить детальную информацию о том. какие участки взаимодействующих молекул находятся в непосредственной близости. Основными преимуществами фотоактивируемых агагтов по сравнению с химическими сшивающими реагентами являются независимость их реакцнонноспособности от большинства внешних факторов, таких как рН, ионная сила, присутствие других реакционноснособных соединений, температура (если она не слишком высока), и их инертность в довольно жестких условиях при отсутствии света, т е они сочетают высокую реакционную способность и стабильность в растворе.

Использование аналогов (ёЖТР содержащих в нуклеиновом основании зиизгруипу. открывает новые возможности для фотоаффикного мечения ферментов матричного биокатализа, таких как ДНК- и РНК-полимеразы. Введение реакционноспособной группы в З'-концевое основание растущей цепи ДНК (РНК) с помощью этих ферментов позволяет модифицировать под действием УФ-облучения как нуклеиновую кислоту, так и белок вблизи активного центра полимеразы Производные (с1)>}ТР, в которых фотоактивируемый остаток присоединен к нуклеиновому основанию через спейсер, могут сохранять субстратные свойства даже после их ковалентного присоединения и поэтому могут быть использованы для каталитически компетентного мечения фермент"», ха:г тго ^писало ниже Фотоастиркруемыс пронззодные моно- и слигмгуклеотидов, несущие н-ачидотетрлфзорбензонльиую и 2-нигро-5-азил,.и,ензг,илыгую '-руппи, нашли широкое примечен,>е для комплементарно-адресованной «о.чифихацин ДНК и для аффинного меченая некоторых ферментов матричного онок^тгллза (Доориков и до 1002, 1.а\'пк й а!, 1ч96) Мы енптезировглн набор новых производных приводных (с!)ТчтТГ' (всех, кроме (а}ОТР), которые содержат фотсаю ивирусму ю группу (2-ннтро-5 азидобензеильную, н-азидотетрафторбензонльнум или 0-(н-

азидогетрафторбенз1«л1:денаминоохси)-ме1!1лкарбау.о«льн}ю>, присоединенную к гетероциклическому оснозанию. Структурные формулы использованных фотореагентов представлены на рис, 4.

Соединение (рис 5) било получено в соопч'тсгвнн с рг^ее опубликованным методом с небольшими модификациями ([.апрс! е! а' 1081) Лморы оригинального метода не обнаружили ((»»изомера в продуктах синтеза, однако мы наблюдали в наших образцах около 11% этого изомера. Аналогичное производное сШТР 1Ь было синтезировано из (ШМР следующим способом. <ШМР был превращен в 7 меркурированием с последующей обрабожой меркурнрованного куклеотида тетрахлоропалладатом калия и ацетатом аллиламмоння я Мг-ацетатном буфере (рН 5,0) (использование dUMP вместо сИЛР приводит к увеличению выхода продукта на этой стадии до 8<5% (включая 13% от«-изомера);, соединение 7 было превращено в соответствующий трифосфат ]_Ь по методу Богачева (Богачев, !905) Взаимодействие триэтиламмонийной соли 7_с трифторуксусным ангидридом в сухом ацетонитриле

Рис. 4. Структурные формулы фотореагентов, использовавшихся для синтеза ' фотоактивируемых аналогов (¿)КТР.

Рис. 5. Схема синтеза фотоактивируемых аналогов (с!)иТР

ведет к образованию смешанного ангидрида трифторуксусной и 2'-дезоксинуклеозид-5'-фосфорной кислот. В присутствии Ме1ш этот смешанный анпшрид реагирует с пирофосфатом. бмс(три-и-бутиламмония) с формированием нуклеозид-5'-трифосфата 1Ь Основное преимущество этого метода состоит в его быстроте (синтез занимает

несколько минут в отличие от 3-4 дней при использовании стандартных методов) и отсутствии необходимости в предварительной защите алифатических аминогрупп -трифторуксусная защитная группа присоединяется к ним параллельно с формированием смешанного ангидрида Обработка реакционной смеси концентрированным водным аммиаком по окончании реакции позволяет количественно удалить защитные группы Синтез фотореакционноспособных производных ЪТР и (Ш'ГР 8а, 8Ь и 9 был выполнен, исходя из Ы-гидроксисукцинимидных зфнров фоторем ентоз 4 и 6 и триэтиламмонпйкых солей модифицированных нуклеотидов ¿я и 1Ь, несущих алифатические аминогруппы Рекцни проводились в смеси ОМР/вода в присутствии Ме1т ил» триэтидамина в темноте при комнатной температуре в течение 2-3 ч. Продукты были выделены ионообменной и обращенно-фазовой хроматогрзфиячн. Выход обычно составлял 8090%,

о о о о

Кг-

I- А ¡-1-1-

о ООО

Рис 6 Схема синтеза фотоактивируемых аналогов (¡1)АТР

\

Рис. 7. Схема синтеза фотоактнвируемого аналога dCTP.

8-(4-Аминобутил)ам1ШО-2'-дезоксиаденозин-5'-монофосфат 11» и 8-(4-аминобупш)амш1оаденознк-5'-монофосфат ИЬ (рис. 6) были синтезированы соответственно из dAMP и А\1Р по методу, ранее предложенному для синтеза аналогичных производных дезоксиаденозина (Sarfati et al., 1987). (d)AMP был бромирован по положению С8, продукт 10 был выделен обрашенно-фазовой хроматографией и обработан избытком днаминобутана в воде при 75°С а течение 12 ч Соединение П. было очищено ионообменной хроматографией. Превращение Ц в соответствующий трифосфат 12 было осуществлено по методу Богачева (Богачев, 1995), как описано выше. Использование (d)AMP вместо аденознна (2!-дезокснаденозина) позволило существенно сократить количество стадий при синтезе И по сравнению с ранее описанным методом и, соответственно, увеличить выход продукта Фотоактнвируемые производные (d)ATP 13 и 14 были синтезированы взаимодействием ПЬ с 4 и 12а с 5 соответственно, как это описано в объяснении к рис 5

5-(йу\шг-3-Аминопропенил-!)-2'-дезоксицитидин-5'-трифосфат 15 (рис. 7) был получен в соответствии с ранее описанной процедурой (Strobe! et al, 1989) Авторы оригинальной статьи не упоминают о выходе 15, мы же нашли процедуру неэффективной синтез проходит с выходом 10-12%. включая небольшое количество (около 1 %) //м-изомера Производное dCTP |6 было получено взаимодействием .[5 с 5 как это было описано выше для сннтеза фотоактивируемых производных (d)UTP

0.0 т~г~т г-г-у-т—-т .^111111 V 1-Г1 I » : I 1 ' ■ т-

210 260 310 360

Рис. 8. Кинетика фотолиза соединения 13 под действием УФ-облучения.

Все полученные соединения были охарактеризованы с помощью УФ- и ЯМР-спекгроскопии, исследована кинетика их фотолиза под действием длинноволнового УФ-облучения Соединения Ва, <$Ь, % ¿3, Ы, имеют характерные УФ-спектры, представляющие собой суперпозицию спектров соответствующих модифицированных нуклеотидов 1а, Ц>, Пя, Ш>, 15 и амидов фотореагентов 4. 5, 6 Под действием УФ-облучения спектральная компонента, соответствующая фотоактивируемой группировке, постепенно исчезает (рис. 8). Скорость фотолиза (с!)!^ТР, несущих фотоактивируемые группы, соответствует скорости фотолиза соответствующих свободных фотореагентов

5. Исследование структуры различных полнмеряз с использованием фотоактивируемых аналогов ((])!ЧТР.

Описанные в предыдущем разделе фотоактивируемые аналоги (¿)МТР использовались моими соавторами из лаборатории биоорганической химии ферментов ННБХ СО РАН для изучения различных ДНК- и РНК-полимераз вирусов, прокариот и эукариот и их комплексов с другими белками. В ходе этой работы было обнаружено, что большинство этих аналогов являются эффективными субстратами поллмераз, несмотря на наличие введенных по основанию объемных заместителей (Оогопт е1 а!, 1994, Ьаупк е1 а1, 1996, Сафронов и др., 1996), Этот факт может быть объяснен тем, что модификация проводилась по позициям гетероциклического ядра, не участвующим в комплементарных взаимодействиях (С5 пнримидиновых и С8 пуриновых оснований)

Соединение 8b было использовано для изучения ревертазы ВИЧ. Было показано, что dNTP-связывающий участок расположен на тяжелой субъединице ревертазы (рбб) вблизи области контакта этой субъединицы с малой субьедшшцей р51 в структуре гетеродимера (р66/р51). Участок связывания матрицы-праймера формируется с участием обеих субъединиц.

Этот же аналог dUTP был использован в экспериментах по изучению порядка связывания субстратов ревертазой ВИЧ, ДНК-полнмеразой ß крысы и фрагментом Клеиова ДНК-полимеразы I. Было показано, что dNTP, ковалентно присоединенный к аминокислотным остаткам внутри активного центра в отсутствие матрицы-праймера, обладает субстратными свойствами в реакциях элонгации, катализируемых этими ДШС-полимеразами. Эти результаты позволили высказать предположение, что dNTP может связываться в активном центре каталитически компетентно и в отсутствие матрицы-праймера, матрица же только дополняет комплекс «элементами опознавания» корректного dNTP на стадии нуклеотидильного переноса.

Фотоактивируемые производные АТР и UTP (13 и 8а соответственно) были использованы для локализации активных центров на субъединицах комплекса ДНК-полимераза а • праймаза тимуса теленка. Показано, что аналог АТР является инициирующим субстратом для праймазы и модифицирует под действием УФ-облучения б-субъединицу (48 кДа) комплекса, несущую каталитическую активность праймазы Показано, что происходит также модификация сх-субъединицы, которая обладает ДНК-полимеразной активностью. Последний факт свидетельствует в пользу близкого пространственного расположения активных центров этих ферментов в составе комплекса.

6. Фотоаффинное мечение ферментов реплнкационного комплекса Physarum polycephalum.

Physarum polycephalum является представителем наиболее примитивных эукариот - миксомицетов, филогенетически отстоящих очень далеко от других грибов Макроплазмодий Physarum polycephalum обладает уникальным свойством -естественной синхроиизированностью деления ядер (число которых превышает 108 на клетку), что делает его идеальной моделью для изучения клеточного цикла Закономерно ожидать, что репликационный аппарат этого эволюционно древнего организма должен существенно отличаться от такового у высших эукариот, и ряд уникальных особенностей регуляции репликации у Physarum polycephalum действительно обнаружен в последнее время. Несмотря на большой интерес к этому объекту, ферменты репликации Physarum polycephalum практически не изучены: на сегодняшний день выделены ДНК-полимеразы а и 6, а также ß-подобная ДНК-полнмераза (Holler et а!., 1987; Weber et al, 1988; Achhammer et al., 1995). Лишь несколько месяцев назад была идентифицирована ДНК-полимераза е Ни для одного из указанных белков не ' установлена полная аминокислотная последовательность, остаются неизученными все остальные белки репликационного аппарата, такие как хеликазы, топоизомеразы и др Отчасти это объясняется огромными трудностями, с которыми приходится сталкиваться при попытках выделения ДНК-полимераз

Physarum polycephalum - в большинстве эти ферменты крайне нестабильны и подвержены протеолнзу уже на ранних стадиях выделения Образующиеся протеолтгические фрагменты часто обладают полимеразной активностью, и поэтому остается неясным вопрос о возможности (или невозможности) vix функционирования и роли т vivo (Achhammer et al., 1992).

Настоящая часть работы выполнялась в лаборатории проф. Э.Холлера в Университете г Регенсбурга (Германия) в рамках проекта, направленного на изучение ренликационного комплекса Physarum polycephalum т vivo, поскольку реконструкция этого комплекса in vitro на сегодняшний день невозможна. Исследовалась возможность применения реакиионноспособных аналогов dNTP для выявления ферментов репликации, присутствующих в экстракте ядер Physarum polycephalum. В дальнейшем разработанные подходы будут использованы для идентификации этих ферментов непосредственно в ядрах и в макроплазмодии.

Рис. 9. Структурная формула фотоактивируемого аналога dCTP, использовавшегося для фотоаффинного мечения белков репликативного комплекса Р)гу.чагит ро1усерЬа\чт.

Экстракт ядер инкубировали в буфере, состав которого бьш подобран с целью

проявления наиболее высокой полимеразной активности, в присутствии фотоактивируемого аналога dCTP Г7 (рис 9), активированной ДНК спермы лосося и а-[32Р]-ёАТР в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем пробы облучали УФ-светом, обрабатывали эндонуклеазой (бензоназой) и анализировали с помощью ЯЙЗ-электрофореза. Такая процедура позволяет визуализовать на радиоавтографе ковалентные комплексы бепков с фрагментами ДНК, защищенными этими белками от деградации нуклеазой, при условии, что фрагмент ДНК содержит радиоактивную метку. Однако в облученных пробах наряду с такими конъюгатами всегда наблюдали дополнительные полосы, присутствующие также на дорожке с контрольной необлученной пробой (рис 10) Природа этого процесса, приводящего к переносу радиоактивной метки на различные белки (в т.ч. и на полимеразы) ядерного экстракта, пока неясна. По всей видимости, этот процесс протекает лишь в незначительной степени, однако его роль в общей картине становится заметной по той причине, что

F

F

ОН Н

полимеразная активность в ядерном экстракте всегда довольно низка и, как следствие, сигнал специфического меченая сравним с результатом неспецифического переноса метки. Тем не менее, таким способом удается проследить ряд полос, которые могут соответствовать только белкам, непосредственно контактирующим с ДНК, в т ч полосу субъединицы р140, ответственной за полимеразную активность ДНК-полнмеразы а

' УФ + -

Рис 10. Радиоавтограф геля после БОБ-электрофореза проб, полученных инкубацией ядерного экстракта ¡'Иу^агит ро1уссрМит в присутствии аналога с!СТР 17, активированной ДНК спермы лосося и а-[*2Р]-<ПТР.

Справа от рисунка указаны положения маркеров молекулярной массы белков, «+» - проба облучалась УФ-светом, «-» - необлученная проба.

12 3 4

Рис 11 Радиоавтограф геля после ЗОБ-электрофореза проб, полученных инкубацией экстракта ядер Р/?уиагнт /ю/усер/ш/пт в присутствии аналога <1СТР |7, олигонуклеотидной матрицы»праймера (26/16) и а-['2Р]-с1АТР.

Справа от рисунка указаны положения маркеров молекулярной массы белков, дорожки 1 и 2 - пробы после бензоназной обработки, дорожки 3 и 4 - пробы без бетона шой обработки, дорожки I и 3 - УФ-облученные пробы, дорожки 2 и 4 -пробы бе! УФ-обд\ченпя

Более четкие картины мочения белков ядерного экстракта с /гомсшью фотоактизчого аналога (1СТР П бмпи получены при использовании в качестве мприцы-праймера системы коротких дезокгирибоолигоцуклеотидов следующего состава.

Матрица (26-мер). З'-С.^АДЛСССТСЛОТС-СТСТТААССТАСр

Праймер (16-чер) .У-рОТТТТСССАОТСАСОА Использовалось два варианта мечения, которые привели к различным результатам. В первом гдучае ма1рииа*праймер инкубировалась с ядерным экстрактом в присутствии соединения ¿7 м а"1 ~Р]-с1ЛГР « этом случае остаток фогоакт.чвиругмогт. аналога (1СТР встраивался полимеразами в З'-конец праймера, а затем, комплементарно к "ст?ткрм тимппиня матричной цепи, включается два остатка и-г*?] «2АМР. Дальнейшее удлинение праймера невозможно из-за б ¿е-шпопной смеси

необходимого для этого сПТР. Таким образом, введенный в праймер фотоактивируемый нуклеотид остается в непосредственной близости от активного центра фермента (в позиции «-3» от З'-конца праймера) и способен образовывать ковалентные сшивки с ним под действием УФ-облучения. Использование такой системы позволило получить четкую картину мечения только одного полипептида -субъединицы р 140 ДНК-полимеразы а (рис. 11, дорожки 3 и 4). Обработка проб после облучения бензоназой приводит к небольшому смещению соответствующей р140 но лис.-: ма рэлноаягографс з.чиз (рис !. дорожки I и "), '¡-(■.ус,н.(.д-т1'т!-;таугт сб уменьшены! м>>яек>лчрной массм кг.змеьтисго гзшссксд ДИК - челок в чозс бензонамеч обработки вследствие деградации ую/.тков ДНК. иг чимкегяиш ое.чко»; -ги- -,;цтж р'Алает. что мечен«? р'.40 про,гулило » соотгет тс:н с, описгнш ;! схемой Возможность фогогффннного мс-екия Д}1Х-го:шм^!:>1ы ч Р'/,уыт,трЫ\герЬе>Ьт с помощью данного аналога ¿С1Р была показана ранее на очитчевчых тртаратд.ч фермента

Во втором случае были использованы те же магрнцавпраймер. но пр'-ймер был радиоактивно мечен '2'.' по 5'-кснцу Инкубация с ядерным экстрактам нрюоднлась в присутствии лишь одного фотоактивного аналога без других ¿N1?, поэтому тлытс-Гпдее удлинение праймера после включения этого аналога не происходит. В этом случае на радиоавтографе после ^ОБ-электрофореза (рис 12) обнаружилась ишенсивная полоса ыгчения ДНК-полимеразы £ (молекулярная масса 230 а

также более слабые полосы мечения субъединицы р140 и двух полипептидов в районе 50-60 кДа, которые возможно соответствуют двум субъединицам праймазы (молекулярные массы 57 и 52 кДа).

Интересно отметить существенное различие о картина* мечения при использовании двух рассмотренных подходов 13 первом случае происходит меченне только одного полипептида (см. рис. 11), во втором - четырех, причем наиболее интенсивно метится полипептил, мечение которого не происходит при использовании первого варианта (см рис ¡2). Это различие может быть объяснено тем, что ДНК-полимераза е, в отличие от ДНК-полимеразы а, не способна встраивать (1АМР после введения остатка фотоактивного аналога на З'-конец праймера В этом случае образующиеся в ходе облучения ковалентные комплексы ДНК-полимеразы в с ДНК не

- 205

--116

Рис. 12. Радиоавтограф геля после БОБ-электрофореза проб, полученных инкубацией ядерного экстракта РЬужтт ро/уссрНЫит в присутствии матрицы«5'-["Р]-меченного праймера (26/16) и соединения 17

Справа от рисунка указаны положения маркеров молекулярной массы белков. Стрелками указаны полосы специфического мечения белков (см. текст); «+» - проба облучалась УФ-светом; «-»- необлученная проба

могут быть визуализованы радиоавтографией. При использовании же 5'-['гР]-меченого праймера ковалентные конъюгаты обоих полимераз с ДНК легко выявляются, однако интенсивность мечения р140 и предполагаемых праймазных субъединиц существенно ниже. Более того, при долгом времени инкубации эти полосы совсем исчезают. Ядерный экстракт содержит существенное количество нуклеаз, поэтому при длительной инкубации олигонуклеотиды могут деградировать и, соответственно, радиоактивная метка, находящаяся на 5'-конце праймера, может высвобождаться из комплекса ДНК-полимераза • ДНК (что невозможно при введении метки в 3'-конец праймера, который защищен ферментом от нуклеазного гидролиза). Таким образом, возможно, что участок дуплекса от активного центра в направлении 5'-конца праймера, защищенного ДНК-связывающим карманом ДНК-полимеразы а. имеет размер менее 16 нуклеотидов, а в ДНК-полимеразе е размер этого участка больше. Отсутствие мечения полипептидов в районе 50-60 кДа при введении радиоактивной метки в 3'-конец праймера свидетельствует либо о том, что модификация праймазных субъеднниц из позиции «-3» праймерной цепи невозможна, либо о том, что данные полипептиды являются не субъединицами праймазы, а другими белками репликативного комплекса, которые пока неизвестны. Таким образом, при использовании метода фотоаффинной модификации в исследовании ферментов репликации /Упдагил; ри/уи'р/ю/ит оказалось возможным получить некоторую структурную информацию об этих совершенно неизученных в данном аспекте белков.

В обоих вариантах мечения в системе с короткими матрицами»праймерами метится только одна субъединица ДНК-полимеразы а - р140. Препараты этого фермента практически всегда содержат большой набор протеолитичсСких фрагментов, которые также обладают полимеразной активностью и метятся с помощью соединения

УФ +

Í7. Один из этих фрагментов - рПО - всегда обнаруживается в экстракте ядер, что

привело к предположению о его присутствия в ядрах т vivo. Оставалось неясным, может ли JTOT прогсолнтический фрагмент быть в ядрах функционально активным. Н?ши данные однозначно свидетельствуют, что по крайней мере в ядерном экстракте полкмеразноЛ активностью обладает только иигакткал субъединица.

Обращает на себя внимание тот фзьл-, что ни в одном из описанных :кспериментов не наблюдалось мечения ДТТК-полнмеразы 5 (молекуляоная масса !25 кДа) ответственной за снитм лидирующей цепи Возможно, что эта полимераза не экстрагируется из ядер при использованном способе приготовления экстракта. С тсугой стороны, одновременное мечение ДНК-полимерго а и с может свидетельствовать о том. что они действительно контактируют при синтезе запаздывающей цепи ДНК, как это и предполагалось.

Bi-IEOALl

1. На основе метода компьютерного моделирования с использованием известных экспериментальных данных о взаимодействиях ДНК-полимераз с дцДНК и dNTP предложена модель транслскашш этих ферментов вдоль матричной цепи. Согласно этой модели, транслокация происходит в результате перехода участка дуплекса, расположенного внутри ДНК-связывающего кармана фермента, из А- в В-форму на стадии конформационной подстройки субстратной молекулы dNTP в активном центре.

2 Бперпме сиителфован:.! производные '.'Tí1, ;,-ссущ;тг оспто: флусрессеггл^гх ::"р:.с;!Тс;;.'П - флуоресцеина или •,етр*мел>лроя1чина - по положение С:;

ШГРИ.'Н'ДП^ОГ.ОЮ ОСНОВ'ИМЧ.

3 Cniüosiposj» ы ф<тмг>..зиру-гмые гналога (d)b"¡!\ (cí)ATP •> dCT?, несущие --нитр ;~5 зчидооегаовя^ную, н-азидотетрафтор«еизонльк>-ю кли 0-(/?-азнаотетрафторбеч!ял1!.".<'нам1шоокс:1)-ме1ил»арбамоильную группы, присоединенные по положениям 05 пиримидиноных и С8 пуриновых нуклеошдов

4 Показано, что синтезнровгнчые флуоресцентно меченые и фотозктнвируемые аналоги (d)N ГР являются субстратами различных ДНК- и РНК-полимераз и могут быть использованы для получения соответствующих меченых полинуклеотпдов и изучения различных ДНК- и РНК-полимераз вирусов, прокариот и эукариот и их комплексов с другими белками

5. Показана возможность применения фотоактивируемых аналогов dNTP для высокоселективного мечения белков репликативного комплекса представителя низшнх эукариот - Physamm polycephalum. Установлено, что в ядерном экстракте Physanim polycephalum активны ДНК-полимеразы а и е. В случае ДНК-полимерззы а актизнон является только интактная субъединица с полимеразной функцией -рИО Проведен сравнительный анализ размеров ДНК-связывяющнх карманов ДНК-полимераз а и Е Physanim polycephalum

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Власов В.А., Калачиков С.М., Дымшиц Г.М. Синтез флуоресцентных производных уридин-5'-трифосфата для получения нерадиоактивно меченных РНК-зондов. // Биоорган, химия 1992 Т.20. № 6. С. 676-681.

2. Дымшиц Г.М., Власов В.А., Калачиков С М., Попов А Н. Техника гибридизации для анализа клонотек сложных геномов с использованием флуоресцентных зондов // Тезисы докладов конференции «Геном человека - 93». Черноголовка, 1993. С. 22.

3. Wlassoff W.A., Dobrikov M.I., Safronov I.V., Dudko R.Y., Bogachev V S., Kandaurova V.V., Shishkin G V., Dymshits G.M., Lavrik O.I. Synthesis and characterization of (d)NTP derivatives substituted with residues of different photoreagents // Bioconjugate Chem 1995. V. 6. P. 352-360.

4. Safronov I S, Khodyreva S.N., Wlassoff W.A., Dobrikov M.I., Doronin S.V., Scherbik N.V., Shishkin G.V., Lavrik 01 Photoreactive analogues of dNTP as a tool for investigation of HIV-RT // Abstracts of papers presented at the Russian - French Symposium on Regulation of Gene Expression. Novosibirsk, 1995, p 34.

5. Wlassoff W.A., Dymshits G.M., Lavrik O.I. A model for DNA polymerase translocation worm-like movement of DNA within the binding cleft // FEBS Lett. 1996. V.390. P.6-9.