Синтез и исследование некоторых новых фотоаффинных реагентов на основе производных n-азидоанилина тема автореферата и диссертации по химии, 02.00.10 ВАК РФ

СОДЕРЖАНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Фотореакционноспособные реагенты как инструмент исследования структуры биополимеров обзор литературы)

1.1.Применение производных и аналогов азидов в качестве фотоаффинных реагентов.

1.2 .Реагенты на основе арилазидов

1.3.Метод прямых фотосшивок ^

1.4.Фотоаффинные реагенты, содержащие остаток и-азидоанилина

1.5.Фотоаффинная модификация ферментов

1.6.Аффинная модификация хроматина реагентами, содержащими остаток и-азидоанилина.

1.7. Химизм реакций производных хинондииминов

ГЛАВА 2. Результаты и обсуждение

2.1. Конструирование реагентов общей структуры ^-МзСбЩ-МН(СН2)п№1-олигонуклеотид

2.2. Изучение взаимодействия производных, содержащих остаток /7-азидоанилина.

2.3. Изучение эффективности модификации 58 24. Компьютерное моделирование структуры дуплекса

25. Изучение однотипных реакций в дуплексе и без образования 65 дуплекса.

2.6. Изучение фотолиза К-(4-азидофенил) 1,2-диаминоэтана

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Материалы

3.2. Синтез К-(и-нитрофенил)-производных диаминов.

3.3. Синтез №(я-азидофенил)производных защищенных диаминов

3.4. Синтез М-(и-азидофенил)-производных диаминов

3.5. Синтез арилазидных производных олигонуклеотидов

3.6. Методы

3.7. Внутридуплексная фотохимическая модификация

3.8. Молекулярное моделирование и энергетическая минимизация

3.9. Установка для изучения фотохимического превращения 86 ВЫВОДЫ 89 Список литературы

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ dNTP - дезоксинуклеозид-5'-трифосфат ds4UTP - 4-тиодезоксиуридин-5'-трифосфат dsTMP - 6-тиодезокситимидин-5'-монофосфат dUTP - дезоксиуридин-5'-трифосфат dATP - дезоксиаденозин-5'-трифосфат dTTP - дезокситимидин-5'-трифосфат

GTP, - гуанозин- 5'-трифосфат

UTP - уридин5'-трифосфат

АТР, - аденозин-5'-трифосфат

СТР - цитидин-5'-трифосфат

ADP - аденозин-5'-дифосфат

GDP - гуанозин- 5'-дифосфат

Azn - остаток п-азидоанилина

PyS)2- 2,2'-дипиридил дисульфид

Ph3)P - трифенилфосфин

NTP - нуклеозид-5'-трифосфат

ДМСО - диметилсульфоксид

ДМФ - диметилформамид

ДМАП - 4-(К,1Ч-диметиламино)пиридин

УФ-поглощение - ультрафиолетовое поглощение

УФ-спектр - ультрафиолетовый спектр поглощения

ИК-спектр - инфракрасный спектр поглощения

МД - метод молекулярной динамики

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

Важнейшей особенностью белков и нуклеиновых кислот является их способность к специфическому взаимодействию с определенными партнерами - низкомолекулярными лигандам или биополимерами. Эту способность часто называют узнаванием биополимером этих партнеров. В его основе лежит нековалентное взаимодействие между определенными группами узнающего биополимера, и группами узнаваемого партнера. Поскольку биополимеры в функционально активном состоянии обладают определенной пространственной структурой, неоходимо, чтобы группы биополимера, участвующие в узнавании, находились на биополимере в полном геометрическом соответствии с несколькими группами узнаваемого партнера. Обычно в молекуле лиганда наряду с группами, непосредственно вступающими во взаимодействии с биополимером, имеются участки, которые с биополимером не взаимодействуют или, во всяком случае не имеют решающего значения для такого взаимодействия. Такие группы могут быть использованы для присоединения какой-либо реакционноспособной группы. В этом случае за счет образования специфического комплекса модифицированного лиганда с биополимером реакционноспособная группа оказывается расположенной вблизи области биополимера, обеспечивающей узнавание, и может вступить в реакцию с какими-либо остатками биополимера, расположенными в этой области, т.е. осуществить химическую модификацию биполимера в определенной области. Например, если биополимером является фермент, который должен для осуществления каталитического превращения связать субстрат (или один из субстратов) вблизи каталитического центра фермента, такой реагент будет модифицировать фермент вблизи этого центра или даже в самом центре. Поскольку в этом случае направление химической модификации обеспечивается наличием сродства реакционноспособного производного (аналога) к определенной области биополимера, то такая модификация называется аффинной модификацией (от английского слова affinity - сродство), а реакционноспосбные производные лигандов называют аффинными реагентами. [ 1 ]

В последнее время все в большей степени в качестве аффинных реагентов используют производные лигандов, несущие группы, способные к фотохимическому взаимодействию с остатками аминокислот (при модификации белков) или нуклеотидов (при модификации нуклеиновых кислот). Такие производные принято называть фотоаффинными реагентами, а осуществляемую ими модификацию -фотоаффинной модификацией. [2] Важным достоинством фотоаффинной модификации является возможность приготовить реакционную смесь в темноте и лишь после формирования реакционных комплексов провести облучение, т.е. включить процесс модификации в определенное время, избегнув протекания процесса в период приготовления реакционной смеси.

Сравнительно недавно в практику фотоаффинной модификации был введен остаток я-азидоанилина. Его особенностью является быстрая изомеризация в водном растворе в соответствующий хинондиимин. Последний является высокоэлектрофильным реагентом, способным реагировать с боковыми радикалами тех аминокислотных остатков, которые являются нуклеофилами, такими как боковые радикалы лизина, гистидина, цистеина и цистина. Некоторые аспекты функционирования таких реагентов являются предметом представляемой диссертации.

Глава 1. Фотореакционноспособные реагенты как инструмент исследования структуры биополимеров (обзор литературы)

В настоящее время для проведения фотоаффинной модификации биополимеров используют производные, содержащие специальные фотоактивные группы, которые можно возбуждать светом в ближнем ультрафиолете (длина волны больше 300 нм), избегая при этом возбуждения и фотохимических реакций самих компонентов исследуемых биополимеров. Кроме того, использование интенсивных источников облучения позволяет проводить процесс за очень короткое время и, в определенных случаях, проследить за кинетикой фотоаффинной модификации. Например, в работах [3], [4] удалось проследить за динамикой взаимодействия ДНК фага Т7 с фаговой РНК-полимеразой в миллисекундном диапазоне времени и зарегистрировать перемещение точек фотоприсоединения фермента от начальных случайных точек до достижения ферментом промотора в результате линейной диффузии фермента вдоль матричной ДНК.

Рассмотренный пример относится к категории методов, называемых прямыми фотосшивками. Скорее всего такие сшивки обусловлены фотохимическими свойствами, присущими гетероциклам, входящим в состав нуклеиновых кислот. По фотохимическим свойствам гетероциклов имеется обширная серия работ, которые обобщены в первую очередь в обзорах и монографиях [5], [б], [7].

В качестве примера можно привести работу [8] в которой осуществлена прямая фотосшивка ДНК полимеразы-1 с с!ТТР. Интересно, что уровень прямой фотосшивки достигал величины 1,15 фмоль на 1 пмоль фермента, в то время как уровень прямой фотосшивки с другими нуклеозид-5'-трифосфатами был существенно ниже. В отдельных случаях прямые фотосшивки позволили идентифицировать точки модификации

32 белка при таких сшивках. Так, в работе [9] показано, что [а- Р] (ИчГТР, в 32 особенности [а- Р]с1ТТР, сшивается с Кленовским фрагментом ДНК полимеразы I, причем анализ пептидов трипсинового гидролизата выявил преимущественно один меченый пептид. Секвенирование последнего методом Эдмана позволило установить, что модификации подвергается остаток гистидина-881.

Однако, значительно чаще для фотоаффинной модификации используют производные, содержащие специальные фотоактивные группы, которые можно возбуждать светом в ближнем ультрафиолете (длина волны больше 300 нм), избегая при этом возбуждения и фотохимических реакций самих компонентов исследуемых биополимеров. Наиболее широкое применение нашли такие фотохимически активные производные гетероциклов, как тиоуридин, 4-бромуридин, 5-йодуридин, 5-йодцитидин и. их дезоксианалоги.

Производные, содержащие 4-тиоуридин, встречаются в природе, поскольку они входят в состав некоторых транспортных РНК. В этом случае, как и в случае немодифицированных гетероциклов, они являются внутренними метками природных субстратов или их аналогов [10], [11].

Простые модели для использования их в качестве фотоаффинных методов могут быть получены синтетическим путем. Так, используя в качестве реагента додекамер, являющийся субстратом эндонуклеазы рестрикции Eco RY и метшпрансферазы RV, сайтом узнавания которых является гексануклеотидная последовательность d(GATATC) и в который в сайте узнавания введен 4-тиотимидин или 6-тиодезоксигуанозин была осуществлена фотоаффинная модификация этих ферментов. Установлено, что модификация эндонуклеазы проходит по метионину-137 или вблизи него [12]. Такие производные рибонуклеиновых кислот могут быть также получены проведением транскрипции матриц с остатками аденозина в определенных местах транскрибируемой цепи при 4 введении в реакционную смесь ds UTP в качества субстрата, заменяющего UTP.

Достоинством последнего подхода состоит в том, что фотоактивная группа может быть введена в определенный участок нуклеиновой кислоты либо в ходе химического синтеза олигонуклеотида, либо в ходе ферментативного получения реагента путем введения в реакционную смесь соответствующего нуклеозид-5'-трифосфата. Если такая нуклеиновая кислота фотохимически ковалентно связывается с белком в исследуемом белково-нуклеиновом комплексе, то автоматически выявляется какой нуклеотидный остаток связывается с белком [13]. Такой подход с использованием в качестве исходного субстрата dsTMP позволил определить точки контакта дрожжевых генов 5 S РНК и супрессорной тирозиновой тРНК. Он также позволил показать, что по крайней мере 10 из субъединиц дрожжевой РНК полимеразы III имеют контакты с ДНК

Аналогичный подход может быть использован и для модификации белков, взаимодействующих с олигонуклеотидами, в определенное место которых введены фотоактивные галогенированные нуклеотиды. Примером такой работы может служить исследование точки взаимодействия олиготимидилата, имеющего в определенном положении фотореакционноспособный остаток бромдезоксиуридина Было осуществлено фотоаффинное связывание декануклеотида d(32P-T-T-T-T-T-brU-T-T-T-T) с РНК полимеразой из E.coli. Анализ пептитов, полученных последовательным гидролизом модифицированной ß-субъединицы с учетом специфичности фотохимических реакций урацила и его производных позволил авторам придти к заключению, что реакция проходит по остатку тирозина-726. Аналогичным образом авторы пришли к заключению, что в ß'-субъединице модификация проходит по остатку фенилаланина-986 [14].

Этот же прием был продемонстрирован на примере взаимодействия фрагментов РНК, входящих в состав РНК фага R17, с белком оболочки фага и содержащих в определенном положении 5-бромуридин или 5-йодуридин. Аналогичным способом было исследовано взаимодействие фрагмента ДНК, взаимодействующего с теломеразой. В обеих системах наблюдался высокий уровень фотоприсоединения гена, содержащих один галогенированный уридин [ 15], [16].

Предельная степень модификации в случае йодпроизводных выше, чем в случае бромпроизводных.

Описанные выше фотоаффинные реагенты являлись производными нуклеотидов или олигонуклеотидов, и фотоаффинному мечению подвергался белок. Однако, перспективным является также подход, основанный на использовании пептидов или белков, несущих фотоактивный радикал. Такой радикал может быть введен в пептид, специфичный к исследуемому биополимеру. Например, в работах [17], [18] описан синтез 4'-(трифторметил-диазиринил)-фенилаланина, который может в ходе синтеза пептидов включаться вместо фенилаланина. Этот фрагмент при освещении генерирует соответстующий карбен.

С этой же целью в работах [19], [20] синтезирован другой фотоактивный аналог фенилаланина - 4'-бензоил-фенилаланин: н3м-сн-соо~

Второй подход к созданию фотоактивных пептидов основан на введении фотоактивной группы в белок. Представительным примером этого подхода является работа А§§е1ег [21]. В этой работе использованы реагенты - производные мутантов бактериальной АТР-синтетазы, у которых оставлен лишь один остаток цистеина, а два других заменены на остатки серина. Проводилась обработка этих мутантов производным, структура которого выглядит следующим образом :

Показано, что азидотетрафторфенильный остаток вводился по единственному остатку цистеина в результате его реакции с фрагментом малеимида.

Третий подход основан на использовании аминоацил-тРНК синтетаз. Ключевыми моментами этого подхода основаны на химическом О О аминоацилировании олигонуклеотида рСА фрагментом, несущим реакционноспособную группу, с последующим присоединением с помощью РНК-лигазы полученного производного к тРНК, укороченной на два нуклеотида (рАи рС) [22], [23], [24].

выводы

1. Синтезирована серия производных я-азидоанилина, в которых к аминогруппе, находящейся в «-положении к азидогруппе, присоединен радикал -МН(СН2)гДН2 (п=2-6). Часть полученных производных присоединена к 5'-концевому фосфату олигонуклеотида рвАТАССАА (соединения (1УЬ) с п=3, (ГУс) с п=4, (1Уе) с п=6), а производное с п=3 присоединено к олигонуклеотиду рСгСС (УЬ).

2. Показано, что при фотолизе (1УЬ) и (УЬ) происходит расщепление связи Р-К, в то время как при фотолизе соединений (1Ус) и (1Уе) с более длинными спейсерами такого расщепления не наблюдается.

3. Проведено исследование фотолиза в составе дуплекса, образованного производными комплементарных олигонуклеотидов (ЮТАТСр и рОАТАССАА, причем к 3'-концу первого был присоединен радикал, моделирующий боковые радикалы аминокислот - лизина, цистеина или гистидина, а к 5'-концу второго - фотоактивная группа. Фотолиз всех исследуемых дуплексов приводил к образованию ковалентной сшивки между производными олигонуклеотидов.

4. Установлено, что предельные выходы продуктов сшивки при использовании реагентов, содержащих остаток и-азидоанилина в случае мишеней, содержащих алифатическую аминогруппу, существенно выше, чем в случае использования реагентов, несущих 4-Кз-СбР4СО- и 2-Ж)2-5-Кз-СбНзСО- остатки.

5. Установлено, что при использовании в качестве мишени производного, несущего остаток гистамина, предельный выход сшивки существенно ниже, чем в случае мишеней, несущих №Х2(СН2)288(СН2)2№1- и ЖЬ(СН2)бМ1- остатки.

6. Проведено компьютерное моделирование дуплекса содержащего остаток гистамина на одном из несущих олигонуклеотидов и фрагмент 4-^-СбН4Ж1(СН2)бМ1- на комплементарном олигонуклеотиде. Показано, что в одной из конформаций, соответствующей минимуму энергии, остаток имидазола направлен в сторону концевой комплементарной пары в»С и может образовывать водородную связь с ИНг-группой гуанозина, дополнительно стабилизирующую дуплекс. Эта конформация не обеспечивает достаточного сближения имидазольного кольца с образующимся при облучении хинондиимином.

7. Для выяснения природы процесса взаимодействия алифатической аминогруппы с остатком и-азидоанилида при фотолизе изучен фотолиз К-(4-азидофенил)-1,2-диаминоэтана. Конечным продуктом фотолиза оказался 6-аминохиноксалин.

8. На специальной установке для измерения спектров исследована начальная стадия процесса фотолиза 1М-(4-азидофенил)-1,2~ диаминоэтана. Зарегистрировано образование промежуточного соединения с характерным УФ-спектром поглощения и изучена динамика его накопления в течение 100 с. Полученные в ходе экспериментов данные позволяют сделать вывод о многоступенчатом механизме процесса фотомодификации.

1. Knorre D G , Vlassov V.V. Affinity Modification of Biopolymers, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1989).

2. Brunner J. New photolabeling and crosslinring methods. Ann. Rev. Biochem. 62, pp. 483-514 (1993).

3. Meisenheimer, Т.Н. Koch, Photocross-linking of nucleic acids to associated proteins, Critical Rev. Biochem. Mol. Biol., 32, №2, pp. 101-140 (1997).

4. Бенассон, Лэнд Э., Траскот Т., Флеш-фотолиз и импульсный радиолиз. Применение в биохимии и медицинской химии. Перевод с англ. Мир 1987 .

5. Кочетков Н.К., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д.,.Симукова Н.А, Органическая химия нуклеиновых кислот, изд. "Химия" (1970).

6. Pandey V.N., Williams .R, Stone K.L., Modak M.J., Photoaffininty labeling of the the thymidine binding domain in Escherichia coli DNA polymerase I: Identification of histidine-881 as the site of cross-linking. Biochemistry 26, №24, pp. 7744-7748 (1987).

7. O.Favre A., 4-Thiouridine as an intrinsic photoaffinity probe of nucleic acid structure and interactions. Bioorganic Photochemistry: Photochemistry and Nucleicr Acids 1, pp. 379-425 (1990).

8. Favre A, Saintome C., Fourrey J.-L., Clivio P., Laugaa P., Thionuclearbases as intrinsic photoaffiniy of nucleic acid structure and nucleic acid protein interactions. J. Photochem. Photobiol. B\ 42, pp.109-124 (1998).

9. Nikiforov T.T., Connolly B.A., Oligonucleotides containing 4-thiothymidine and 6-thiodeoxyguanosine as affinity labels for the Eco RV restriction endonuclease and modification methylase, Nucleic Acids Res., 20, №6, pp. 1209-1214 (1992).

10. Bartholomew В., Brown B.R, Kassavetis G.A., Geiduschek E.P., Probing close DNA contacts of RNA polymerase transcription complexes with the photoactive nucleoside 4-thiodeoxythymidine. Biol. Chem. 269, №27, pp. 18090-18095 (1994).

11. Скиба Н.П., Ефимов В.А., Липкин B.M., Чахмахчева О.Г., Овчинников Ю.А., Локализация мест связывания ДНК-зависимой РНК-полимеразы E.coli с фоточувствительными аналогами матрицы. Биоорг. химия 12, №8, стр. 1023-1029. (1986).

12. Willis М.С., Hicke B.J., Uhlenbeck О.С., Cech T.R., Koch Т.Н., Photocrosslinking of 5-iodouracil-substituted RNA and DNA to proteins. Science 262, p. 1255 (1993)

13. Willis M.C., LeCuyer K.F., Meisenheimer K.M., Uhlenbeck O.C, Koch T.H., An RNA-protein contact determined by 5-bromouridine substitution, photocrosslinking and sequencing. Nucleic Acids Res. 22, № 23, pp. 4947 4952 (1994)

14. Shih L.B., Bayley H., A carbene-yielding amino acid for incorporation into peptide photoaffinity reagents. Anal. Biochem. 144, pp. 132-141 (1985).

15. Nassal M. 4'-(l-Azo-2,2,2-trifluorethyl)phenylalanine, a photolabile carbene-generating analogue of phenylalanine./. Am. Chem. Soc. 106, №24, pp. 7540-7545, (1984).

16. Kauer J.C., Erickson-Viitanen S., Wolfe H.RJr, DeGrado W.F.,/?-Benzoyl-L-phenylalanine, a new photoreactive amino acid. Photolabeling of calmodulin with a synthetic calmodulin-binding peptide. J. Biol. Chem. 261 pp. 10695-10700 (1986).

17. Miller W.T., Kaiser E.T., Probing the peptide binding site of the cAMP-dependent protein kinase by using a peptide-based photoaffinity label. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85, pp. 5429-5433 (1988).

18. Pezzuto J.M., Hecht S.M., Aminoacid substitutions in protein biosynthesis. Poly(A)-directed polyphenylalanine sinthesis., J. Biol. Chem. 255, №3, pp. 865-869 (1980).

19. Heckler T.G., Zama Y., Naka T., Hecht S.M, J., Dipeptide formation with misacylated tRNAPheS*A, J. Biol .Chem. 258, №7, pp. 4492-4495 (1983).

20. Heckler T.G., Chang L., Zama Y., Naka T., Choghade M.S., Hecht S.M., T4 RNA ligase mediated preparation of novel "chemically misacylated" tRNAPheS*. Biochemistry, 23, №7, pp. 1468-1473 (1984).

21. Sylvers L.A., Wower J., Nucleic Acid-incorporated azidonucleotides: probes for studying the interaction of RNA and DNA with proteins and other nucleic acids. Bioconjugate Chem. 4, №6, pp. 411-418 (1993).

22. Schaefer H.-J., Thomas J.H., Modified nucleosides: Synthesis of 2-substituted adenosine derivatives. J. Am. Chem. Soc., 80, pp. 37-38 (1958).

23. Smith P. AS., Aryl and heteroaryl azides and nitrenes, In azides and nitrenes: reactivity and utility, Scriven E.F.Y, ed., Academic Press, Orlando pp. 95204. (1984).

24. Dontsova O., Rosen. K.V., Bogdanova S.K., Skripkin E.A., Kopylov A.M., Bogdanov A.A., Identification of the Escherichia coli 30S ribosomal subunit protein neighboring mRNA during initiation of translation. Biochimie 74, pp. 363-371 (1992).

25. Lee D.K., Evans R.K., Blanko J., Gottesfeld J., Johnson J.D., Contacts between 5S DNA and Xenopus TFIIIA identified using 5-azido-2'-deoxyuridine-substituted DNA. J. Biol. Chem. 266, pp. 16478-16484. (1991)

26. Evans R.K., Johnson J.D., Haley B.E., 5-azido-2'-deoxyuridine 5'-triphosphate: a photoaffinity labeling and tool for the enzymatic synthesis of photoactive DNA. Proc. Nat. Acad. Sei. U.S.A. 83, pp. 5382-5386. (1986).

27. Meffert R., Dose K., UV-induced cross-linking of proteins to plasmid pBR322 containing 8-azidoadenosine 2'-deoxyribonucleotides. FEBS Lett. 239, pp. 190-194 ( 1988).

28. Srivastava D.K., Evans R.K., Kumar A., Beard W.A., Wilson S.H., dNTP binding site in rat DNA polymerase ß revealed by controlled proteolysis and azido photoprobe cross-linking. Biochemistry 35, № 12, pp. 3728-3734 (1996).

29. Rush J., Königsberg W.H., Photoaffinity labelling of the Klenow fragment with 8-azido-dATP. J. Biol Chem. 265, №9, pp. 4821-4827 (1990).

30. Farrar Y.J., Evans R.K., Beach C.M., Coleman M.S., Interaction of photoactive DNA with terminal deoxynucleotidyl transferase: identification of peptides in the DNA binding domain. Biochemistry 30, №12, pp. 30753082 (1991).

31. Shuster G.B., M.S.Platz, Photochemistry of phenyl azide. Adv. Photochem,.\l, pp. 69-142 (1992).

32. Грицан Н.П., Притчина E.A., Механизм фотолиза ароматических азидов. Успехи химии 61, №5, стр. 910-939 (1992).

33. Gritsan N.P., Yuzava T.and Platz M.S., Direct observation of singlet phenylnitren and measurement of its rate of rearrangement, J. Am. Chem. Soc. 119, №21, pp. 5059-5060 (1997).

34. Jellinek Т., Johns R.B., The mechanismof photochemical addition of cysteine to uracil and formation of dihydrouracil. Photochem. Photobiol. 11, pp. 349359 (1970).

35. Smith P.A.S. A mixed photoproduct of thymine and cysteine:.5-S-6-dihydrothymine Biochem Biophys. Res. Communs. 39, pp. 1011-1016 (1970).

36. Show A.A., Falick A.M.,. Shetlar M.D Photoreactions of thymine and thymidine with N-acetyltyrosine. Biochemistry 31, №45, pp. 10976-10983 (1992).

37. Saito I., Sugiyama H., Matsuura, Isolation and characterizion of a thymine-lysine adduct in UV irradiated nuclei. The role of thymine-lysine photoaddition in photo-cross-linking of proteins to DNA. J. Am. Chem. Soc. 105, №23, pp. 6989-6991 (1983).

38. Бабкина Г.Т., Грачев M.A., Зайчиков Е.Ф., Кнорре Д.Г., Ковригина B.C. Активное фосфорилирующее соединение в реакции нуклеозид-5'-трифосфатов с водоратворимым карбодиимидом. Изв. Сиб. отд. АН СССР, сер. хим. наук. №7, стр. 128-132 (1975).

39. Knorre D.G., .Kurbatov V.A, Samukov V.V., General method for the synthesis of ATP gamma derivatives. FEBS Lett. 70, №1, pp. 105-108 (1976).

40. Бабкина Г.Т., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г., Получение у-амидов нуклеозид-5'-трифосфатов в водном растворе с помощью водорастворимого карбодиимида. Биоорг. химия 1, стр. 611-615 (1975).

41. Baetzold R.C., Tong I.K.J., Kinetics of redox reactions of p-phenylenediamine derivatives. J.Am. Chem. Soc. 93, № 6, pp. 1347-1353 (1971).

42. Галль T.C., Грицан Н.П., Мызина С.Д., Бажин Н.М., Немцова Е.В., п-Бензохинондиимин реакционноспособный промежуточный продукт фотолиза и-азидоанилина в водных растворах. Докл АН 273, №3, стр. 883-887 (1983).

43. Бадашкеева А.Г., Галль Т.С., Кнорре Д.Г., Лебедев А.В., Ефимова Е.В., Мызина С.Д., Изучение продуктов фотопревращения у-п-азидоанилидов нуклеозид-5'-трифосфатов в водных растворах. Биоорг. химия 10, №5, стр. 696-701 (1984).

44. Badashkeyeva A.G., Gall T.S., Efimova E.Y., Knorre D.G., Lebedev A.V., Mysina S.D., Reactive derivative of adenosine-5'-triphosphate formed be irradiation of ATP y-p-azidoanilide. FEBS Letters 155, №2, pp. 263-266 (1983).

45. Годовикова Т.С., Березовский М.В., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификация аминокислоных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе, Биоорг. химия 21, №11, стр. 858-867 (1995).

46. Свердлов Е.Д., Царев С.А,.Модянов Н.Н.,.Липкин В.М., Грачев М.А., Зайчиков Е.Ф.,Плетнев А.Г., Фотоаффинная модификация РНК полимеразы E.coli в транскрипционном комплексе аналогами субстратов. Биоорглим. 4, № 9, стр. 1278-1280 (1978).

47. Свердлов Е.Д., Царев С.А., Субъединицы РНК полимеразы E.coli, контактирующие с 5'-концом РНК на разных стадиях транскипции. Биоорг. хим. 6., №7, стр. 1110-1113 (1980).

48. Ахвердян В.З., Киселев Л.Л., Кнорре Д.Г., Лаврик О.И., Невинский Г. А. Фотоаффинная модификация триптофанил-тРНК синтетазы у-(w-азидоанилидом) АТФ.Доо АН СССР, 226, №3, стр. 698-701 (1976).

49. Akhverdyan V.Z., Kisselev L,L., Knorre D.G., Lavrik O.I. , Nevinsky G.A., Affinity Labelling of Tryptophanyl-Transfer RNA Synthetase. J. Mol. Biol 113, pp. 475-501 (1977).

50. Ankilova V.N., Knorre D.G., Kravchenko V.V., Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Investigation of the phenylalanyl-tRNA synthetase modification with y-(p-azidoanilide)-ATP. FEBSLett. 60, № 1, pp. 172-175 (1975).

51. Budker V.G., Knorre D.G., Kravchenko Y.V., Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Teplova N.M., Photoaffinity reagents for modification of aminoacyl-tRNA synthetases. FEBSLett. 49, №3, pp. 159-162 (1974).

52. Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Phenylalanyl-tRNA synthetase from Escherichia coli. MRE 600. Activation by nucleotides and affinity modification of the effector binding sites. FEBSLett. 109, №1, pp. 13-17 (1989) .

53. Невинский Г.А., Лаврик О.И., Фаворова О.О., Киселев Л.Л., Выявление нуклеотид связывающих участков двух типов втриптофанил-тРНК-синтетазе и их модификация. Биоорг. химия 5, №3, стр. 352-364 (1979).

54. Лаврик О.И., Невинский Г.А., Рязанкин И.А., Влияние структуры фотоактивных аналогов АТР на аффинную Модификацию фениоаланил-тРНК синтетазы. Модификация фермента по двум типам нуклеотидсвязывающих участков. Молек. Биол. 13, №5, стр. 1001-1011 (1979).

55. Krauspe R., Lavrik O.I., Photoaffiity labeling of chloroplastic and cytoplasmic leucyl-tRNA synthetases of Euglena gracilis by the y-(p-azidoanilidate) of ATP. Eur. J. Biochem., 132, pp. 545-550 (1983).

56. Lavrik O.I.,.Moor N.A, Khodyreva S.N., Phenylalanyl-tRNA synthetase from E.coli MRE-600: Localization of the phenylalanine binding sites on the subunits by affinity reagents. Molec. Biol. Rep. 8, pp. 123-126 (1982).

57. Khodyreva S.N., Moor N.A., Avrilova V.N, Lavrik O.I. Phenylalanyl-tRNA synthetase from E.coli MRE-600: analysis of the active site distribution on the enzyme subunits by affinity labelling. Biochim. Biophys. Acta 830, pp. 206-212 (1985).

58. Акопян Ж.И., Газарянц М.Г., Мкртчян 3%C., Нерсесова Л.С., Лаврик О.И., Попов Р. А. Аффинная модификация креатинкиназы из скелетных мышц кролика с помощью у-(я-азидоанилид)-АТР. Биохимия 46, №2, сгр. 262-268 (1981).

59. Lavrik O.I., Nevinsky G.A., Akopyan Zh.I., Analysis of the structure and function of the active sites of creatine kinase by affinity modification. Sov. Sci. Rev. D. Physicochem Biol., Vol. 9, pp. 49-85 (1989).

60. Vandest P. Laabe J.-P., Kassab R., Photofffinity labelling of arginine kinase and creatine kinase with a y-p-substituted arylazido analogue of ATP Eur. J. Biochem. 104, №2, pp. 433-442 (1980).

61. Невинский, А.Ю. Денисов, Синтез фотоактивных аналогов 1,N6этеноаденозин-5'-ди- и трифосфатов . Биоорг. Химия, 7, № 11, стр. 1693-1700 (1981).

62. Денисов А.Ю., Невинский Г.А., Лаврик О.И., Креатинкиназа из скелетных мышц кролика. Исследование активных центров с помощью фотоактивных аналогов -этеноаденозин-5'-ди- и трифосфатов. Биоорг. химия 8, №1, стр. 72-79 (1982).

63. Vlassov V.V., Kobetz N.D., Chernolovskaya E.L., Demidova S.G., Borissov R.G., Ivanova E.M. Sequence specific chemical modification of chromatin DNA with reactive derivatives of oligonucleotides. Molec. Biol .Rep., 48, pp. 11-15 (1998).

64. Власов B.B., Иванова E.M., Кобец Н.Д., Мамаев С.В., Шульженко С.Г., Якубов JI.A. Специфическая химическая реакция 5'-алкилирующего производного олигодезокситимидилата с ДНКхроматина плаценты человека. Доклады АН СССР, 282, №1, стр. 196199 (1985).

65. Кобец Н.Д., Горожанкин A.B., Годовикова Т.С., Сильников В.Н., ДГ.Кнорре.Аффинная модификация хроматина реакционноспособными производными олиготимидилата, Доклады РАН 349, №6, стр. 822-825 (1996)

66. Bozhenok L.N., Khazina Е.В., Chernolovskaya E.L., Kobets N.D., Chromatin Z proteins, surrounding the d(G-T)n repeats as revealed by photoaffinity labeling with reactive pd(A-C)n derivatives. FEBS Letters 440, pp. 38-40 (1998).

67. Adams R., Reifschneider, The synthesis and reactions of quinone mono- and di-imides. Bull. Soc. Chim. France, pp. 23-65 (1958).

68. Willstaetter R. Mayer E., Ueber chinondiimid. Ber. 37, pp. 1494-1507 (1904)

69. Willstaetter, Prannenstiel Ueber die imine des chinons. Ill Ber. 37, pp. 4605-4614(1904).

70. R.Willstaetter, APrannenstiel, Ueber chinon-dimethylimin. Ber. 38, pp. 2244-2251 (1905).

71. Kerrmami F., Cordone В., Neue synthesen in der gruppe der chinonimid-farbstoffe, IV.: Uber die färbe der einfachen chinon-imine. Ber. 56, pp. 2398 -2405 (1923).

72. Adams R., Showwalter K.A., Quinone Imides X. Addition of amines to p-quinonedibenzenesulfonimide J. Am. Chem. Soc. 74, pp. 2597-2602 (1952)

73. Adams R., Elslager E.F., Young Т.Е., Quinone imides. XXV. Addition of mercaptans to />-quinenedibenzenesulfonimide J. Am. Chem. Soc. 75,.pp. 663-666 (1953)

74. Adams R., Eilar K. R. Quinone imides. V. Aluminium cloride-catalyzed arylations of p-quinone dibenzenesulfonimides J.Am. Chem. Soc. 73, pp. 11491152(1951).

75. Adams R., Walter CR, Quinone imides VI. Addition of dienes to /?-quinone sulfonimides. J.Am. Chem. Soc. 73, pp. 1152-1155 (1951).

76. Adams R, Braun B.H., Pomtrantz. S.H. Quinone imides XXX. Addition of primary and secondary aromatic amines. J. Am. Chem. Soc. 75, pp. 4642-4644(1953).

77. Бунева B.H., Кнорре Д.Г., Кудряшова H.B., Аффинная модификация панкреатической рибонуклеазы алкилиругощим производным d(pTpT) фотоактивным аналогом АТР. Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук №2, стр. 122-124 (1982).

78. Mukayama system. Nucleosides and Nucleotides, 17, № 1-3, pp. 397-410 (1998).

79. Лебедев A.B., Резвухин А.И. Закономерности изменений химических сдвигов ядер фосфора в спектрах 31Р ЯМР производных нуклеотидов. Биоорг.химия 9, №2, стр. 149-185 (1983).

80. Кнорре Д.Г., Биченкова Е.В, Коваль В.В.,Алексеев П.В., Кнорре В.Д., Нордхоф Э., Годовикова Т. С., Новый подход к изучению взаимодействия аминокислот по их боковым радикалам с арилазидами. Биоорг. химия 24, №9, стр. 663-669 (1998).

81. Кнорре В.Д., Маркушин Ю.Я., Лабусов В.А,. Попов В.И., Денисов А.Ю. , академик Кнорре Д.Г. Превращение К-(4-азидофенил)-1,2-диаминоэтана в 6-аминохиноксалин при облучении. Динамика процесса. Доклады Академии Наук 368, №4, стр 489-491 (1999).

82. Brignell P.J., Katritzky A.R., Reavill RE. Proton resonance spectra of heterocycles. Part IV. Quinoxaline and monosabstituted quinoxalines. J. Chem. Soc. В. pp. 1241-1243 (1967).

83. Гордон А., Форд P. Спутник химика: Пер. С англ., М.: "Мир" стр. 437444.

84. Godovikova T.S., Knorre V.D., Maksakova G.A., Silnikov V.N. Synthesis of azidoaniline derivatives of olgonucleotides and investigation of their photochemical behavior. Bioconjugate Chem. 7, pp. 343-348 (1996).

85. Chang Т. E., Wu, Y.M., and Chang, C.H. Reduction of aromatic nitro compouns by ethylenediamine. A new selective reagent for synthesis of symmetric azo compounds. J. Org. Chem . 49, pp. 1215-1217 (1984).

86. Berkner, K.L., and Folk, W.R. Polynucleotide kinase exchange reaction. J. Biol. Chem. 252, pp. 3176-3184 (1977).

87. Perlio, I., and Lamdan, S. Synthesis of 1,2-disubstituted 1,4,5,6-tetrahydropyridines. J. Heterocycl. Chem. 10, pp. 915-923 (1973).

88. Perlio, I., Fernandez, В., and Lamdan, S. J. Synthesis and properties of 1,2-diaryl-l,4,5,6,7,8-hexahydro-l,3-diazocines. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 2, pp. 2068-2072 (1977).

89. Добряков М.И., Приходько Т.А., Сафронов И.В., Шишкин Г.В. Синтез и свойства светочувствительных капроновых мембран. Фотоиммобилизация ДНК. Сиб. Хим. журн., №.2, стр. 18-23 (1992)

90. Cantor, C.R and Tinoko, I.,. Absorption and optical rotatory dispersion of seven trinucleoside diphosphate^/. Mol. Biol. 13, pp. 65-77 (1965).

91. Handbook of biochemistry and molecular biology : Nucleic Acids, Fasman, Т.Е., Ed., Cleveland : CRC, p.589 (1975).

92. Pearlman,D.A., Case, D.A., Caldwell, J.C., Seibel,G.L., Singh, U.S., Weiner, P., and Kollman, P.A., Amber 4.0, San-Francisco: Univ. Of California, (1991).

93. Stewart, J.P. MOP AC 7.0, J. Comput. Aided Mol. Des., 4, pp. 1-105 (1990).

94. Sayle, R. And Milner-White,E.J., RASMOL : biomolecular graphics for all. Trends in Biochemical Sciences, (273), 20, № 9 , pp. 374-376 (1995).1. БЛАГОДАРНОСТИ

95. Автор признателен всем, кто оказывал содействие выполнению представленной работы.

96. Искренняя благодарность Тамаре Михайловне Ивановой, благодаря огромному опыту, вниманию и личному вкладу которой осуществлены синтезы соединений и хроматографические исследования.

97. Владимиру Николаевичу Сильникову за помощь в проведении органических синтезов

98. Владимиру Васильевичу Ковалю за огромную помощь в проведении построения стартовых структур, энергетической минимизации и молеклярнодинамической симуляци , освоения программы AMBER 4.0 и проведение компьютерных расчетов.

99. Алексею Юрьевичу Денисову за помощь в записи спектров ядерного магнитного резонанса

100. Юрию Яковлевичу Маркушину за совместную работу по освоению новой специально сконструированной установки для изучения фотохимических превращений "Колибри".

101. Нине Ивановне Комаровой за помощь в проведении хроматографических исследований образцов.

102. Ольге Александровне Миргородской за осуществление регистрации масс-спектров олигонуклеотида GGTATCp и его цистаминового производного GGTATCpNHCH2CH2S-SCH2CH2NH2

103. Галие Атауловне Максаковой за осуществление синтеза олигонуклеотидов.

104. Академику Дмитрию Георгиевичу Кнорре за неоценимую помощь в постановке и обсуждении экспериментов и оформлении результатов. Несомненно, представленная работа осуществлена, главным образом благодаря его идеям и поддержке.